UA124094C2 - Спосіб лікування стану, пов'язаного з masp-2-залежною активацією комплементу - Google Patents

Спосіб лікування стану, пов'язаного з masp-2-залежною активацією комплементу Download PDF

Info

Publication number
UA124094C2
UA124094C2 UAA201806416A UAA201806416A UA124094C2 UA 124094 C2 UA124094 C2 UA 124094C2 UA A201806416 A UAA201806416 A UA A201806416A UA A201806416 A UAA201806416 A UA A201806416A UA 124094 C2 UA124094 C2 UA 124094C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
eat
antibody
complement
subject
mabr
Prior art date
Application number
UAA201806416A
Other languages
English (en)
Inventor
Грегорі А. Демопулос
Грэгори А. Демопулос
Томас Дадлер
Ханс-Вільхельм Швебле
Ханс-Вильхельм ШВЕБЛЕ
Original Assignee
Омерос Корпорейшн
Юніверсіті Оф Лестер
Юниверсити Оф Лестер
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Омерос Корпорейшн, Юніверсіті Оф Лестер, Юниверсити Оф Лестер filed Critical Омерос Корпорейшн
Publication of UA124094C2 publication Critical patent/UA124094C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21104—Mannan-binding lectin-associated serine protease-2 (3.4.21.104)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Power Steering Mechanism (AREA)
  • Exhaust Gas After Treatment (AREA)

Abstract

Винахід належить до способу інгібування ефектів MASP-2-залежної активації комплементу у людини, що страждає від тромботичної мікроангіопатії (ТМА), пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, за якого вводять суб'єкту, що потребує цього, кількості MASP-2-інгібуючого засобу, що ефективно інгібує MASP-2-залежну активацію комплементу.

Description

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
Ця заявка просить пріоритет попередньої заявки на патент США Мо 62/406726, зареєстрованої 11 жовтня 2016 року, і попередньої заявки на патент США Мо 62/252814, зареєстрованої 9 листопада 2015 року, зміст яких включений в даний винахід шляхом посилань на них.
ЗАЯВА СТОСОВНО ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Перелік послідовностей, що стосуються цієї заявки, наданий не у формі паперової копії, а у вигляді файлу в текстовому форматі, і, тому, зміст цього файлу включений в даний винахід шляхом посилання на нього. Файл у текстовому форматі, що містить перелік послідовностей, має наступну назву. МР 1 0248 РСТ бедиепсе І івііпуд аз Бієй 20161109їхі. Текстовий файл розміром 115 кілобайт, створений 8 листопада 2016 року, наданий на сайт для електронної реєстрації заявок ЕЕР5-угер разом з описом патентної заявки.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Система комплементу забезпечує на початковій стадії механізм ініціювання, ампліфікації і спрямування імунної відповіді на мікробну інфекцію і інші гострі ураження (І із2ем5Кі М.К. апа
АКіпзоп ..Р., 1993, іп Рипдатенпіа! Іттипоїіоду, Тпіка Едайіоп, едіїєд Бу МУ.Е. Раш, Намеп Ргезз, да., Мем Хогк) у людей і інших хребетних. Активація комплементу забезпечує перший важливий захисний бар'єр від потенційних патогенів, але активність комплементу, яка промотує захисну імунну відповідь, може також являти потенційну загрозу для організму-хазяїна (Каїї К.М. еї аї.,
Зрііпдег Зетіп. Іттипораїної. 15:417-431, 1994; Могодап В.Р., Єиг. у. Сііпіса! Іпмевіїд. 24:219-228, 1994). Наприклад, продукти протеолізу СЗ і С5 викликають рекрутмент і активацію нейтрофілів.
Нейтрофіли необхідні для захисту організму-хазяїна, але активовані нейтрофіли діють не вибірково при вивільненні ними деструктивних ферментів і можуть викликати ушкодження органа. Крім того, активація комплементу може приводити до відкладення літичних компонентів комплементу на розташованих поруч клітинах організму-хазяїна, а також на мікробах-мішенях, що в результаті викликає лізис клітин організму-хазяїна.
Система комплементу також залучена в патогенез різних гострих і хронічних хворобливих станів, включаючи інфаркт міокарда, інсульт, гострий респіраторний дистрес-синдром (АКО5Б), реперфузійне ушкодження, септичний шок, підвищену проникність капілярів після термічних
Зо опіків, запалення після операції в умовах штучного кровообігу, відторгнення трансплантата, ревматоїний артрит, розсіяний склероз, важку міастенію і хворобу Альцгеймера. Майже при всіх цих станах, сам комплемент не є причиною їх виникнення, але він являє собою один з декількох факторів, що беруть участь у патогенезі. Проте, активація комплементу може бути основним патофізіологічним механізмом і служити ефективною точкою клінічного контролю при багатьох із цих хворобливих станів. Зростаюче визнання тієї важливої ролі, яку відіграє комплімент в ушкодженні тканин при різних хворобливих станах, указує на потребу в лікарських засобах, ефективно інгібуючих комплемент. На даний час, єдиним лікарським засобом, який таргетований на комплемент і дозволений для застосування на людях, є екулізумаб (зоїїгів Ф), що являє собою антитіло проти С5. Крім того, С5 є однією з декількох ефекторних молекул, що діють на наступних стадіях реакції системи комплементу, і блокада С5 не приводить до інгібування активації системи комплементу. Тому, інгібітор стадій ініціювання активації комплементу може давати суттєві переваги в порівнянні з інгібітором на наступних стадіях реакції системи комплементу.
На даний час є загальновизнаним, що система комплементу може бути активована трьома різними шляхами: класичним шляхом, лектиновим шляхом і альтернативним шляхом.
Класичний шлях звичайно запускається комплексом, що складається з антитіл організму- хазяїна, зв'язаних з чужорідною частинкою (тобто з антигеном), і, відповідно, для генерування специфічної гуморальної імунної відповіді потрібний попередній вплив антигену. Оскільки активація класичного шляху залежить від попередньої адаптивної імунної відповіді організму- хазяїна, то такий класичний шлях є частиною набутої імунної системи. На відміну від цього, лектиновий і альтернативний шляхи не залежать від адаптивної імунної відповіді і є частиною вродженої імунної системи.
Активація системи комплементу приводить до наступної активації зимогенів серинпротеазних факторів. Першою стадією активації класичного шляху є зв'язування молекули специфічного розпізнавання Сід з антигеном, зв'язаним з молекулами Ідс і ДМ. Ста асоційована із серинпротеазними проферментами Сіг ії С15 у формі комплексу, позначуваного
С1. Після зв'язування С14 з імунним комплексом, аутопротеолітичне розщеплення Агд-ІПе-сайта
С1г супроводжується С1г-опосередковуваним розщепленням і активацією С15, що надає йому здатність розщеплювати СА і С2. С4 розщеплюється на два фрагменти, позначувані С4а і С4б, і, бо аналогічно, С2 розщеплюється на компоненти Сга і С2Б5. Фрагменти С4р можуть утворювати ковалентні зв'язки з розташованими поруч гідроксильними групами або аміногрупами і генерувати СЗ3-конвертазу (С4р2а) у результаті нековалентної взаємодії з фрагментом С2а активованої С2. СЗ-конвертаза (С4р2а) активує СЗ3 шляхом протеолітичного розщеплення на субкомпоненти СЗа і СЗ3Б, що приводить до утворення С5-конвертази (С4р2азр), яка в результаті розщеплення С5 утворює мембраноатакуючий комплекс (С5Б у комбінації з Сб, С7,
С8 і С9 називають також "МАС"), який може руйнувати клітинні мембрани, викликаючи клітинний лізис. Активовані форми СЗ і С4 (С3Б ії С4Бб) ковалентно осаджуються на поверхнях чужорідних мішеней, які розпізнаються рецепторами комплементу на множині фагоцитів.
Незалежно від цього, першою стадією активації системи комплементу по лектиновому шляху також є зв'язування молекул специфічного розпізнавання, після якої відбувається активація асоційованих серинпротеазних проферментів. Однак, замість зв'язування імунного комплексу за допомогою С14д, молекули розпізнавання в лектиновому шляху включають групу вуглеводзв'язуючих білків (мананзв'язуючий лектин (МВ), Н-фіколін, М-фіколін, І-фіколін і лектин С-типу СІ-11), які в сукупності називають "лектинами". Дивіться публікації и У. еї аї.,
Віоспіт. Віорпуз. Асіа 1572:387-400, (2002); НоІт5Ком сеї аї!., Аппи. Неум. Іттипої. 21:547-578 (2003); Тен еї аї., Іттипоіоду, 101:225-232 (2000)). Дивіться також публікації У. І чеї еї аї.,
Віоспіт Віорпу5 Асіа, 1572:387-400 (2002); НоІт5Ком єї аЇ., Аппи. Нем. Іттипої. 21:547-578 (2003); Теп сеї аї., Іттипоіоаду, 101:225-232 (2000); Напзеп еї аї, 9. Іттипої. 185(10):6096-6104 (2010).
У публікації ІКеда еї аї, 9. Віої Спет. 262:7451-7454, (1987), було вперше продемонстровано, що МВІ., подібно С14д, може активувати систему комплементу С4-залежним способом після зв'язування з еритроцитами, покритими дріжджовим мананом. МВІ, представник сімейства білків колектинів, являє собою кальційзалежний лектин, який зв'язується з вуглеводами по 3- ї 4-гідроксигрупах, орієнтованих в екваторіальній площині піранозного кільця. Тому, основними лігандами для МВІ. є О-маноза і М-ацетил-О-глюкозамін, а вуглеводи, що не задовольняють цю стеричну вимогу, практично не виявляють афінності відносно МВ. (МУвї5 МУ/.І. єї аї., Мате, 360:127-134, 1992). Взаємодія між МВГІ. і одновалентними цукрами є дуже слабкою, і їх константи дисоціації звичайно знаходяться у діапазоні однозначних мілімолярних значень. МВІ. досягає міцного специфічного зв'язування із глікановими лігандами внаслідок авідитету, тобто внаслідок одночасної взаємодії з множиною моносахаридних залишків, розташованих у безпосередній близькості один від одного (ее К.Т. еї аї., Агспйім.
Віоспет. Віорпуб5. 299:129-136, 1992). МВ розпізнає вуглеводні фрагменти, які звичайно декорують поверхню мікроорганізмів, таких як бактерії, дріжджі, паразити і деякі віруси. На відміну від цього, МВІ. не розпізнає О-галактозу і сіалову кислоту, передкінцеві і кінцеві цукри, які звичайно декорують "зрілий" комплекс глікокон'югатів, присутніх на глікопротеїнах плазми і клітинній поверхні у ссавців. Вважають, що така специфічність зв'язування промотує розпізнавання "чужорідних" поверхонь і сприяє захисту від "самоактивації". Однак МВ. не зв'язується з високою афінністю з кластерами "попередників" гліканів з високим вмістом манози на М-зв'язаних глікопротеїнах і гліколіпідах, секвестрованих в ендоплазматичному ретикулумі і в апараті Гольджі клітин ссавців (Маупага У. еї аї., У. Віої. Спет. 257:3788-3794, 1982). Тому ушкоджені клітини є потенційними мішенями для активації по лектиновому шляху за допомогою зв'язування з МВІ..
Фіколіни містять лектиновий домен, що відрізняється від лектинового домену МВІ., який називають фібриногенподібним доменом. Фіколіни зв'язують залишки цукрів Са--незалежним способом. У людей ідентифіковані три види фіколінів (І-фіколін, М-фіколін ії Н-фіколін). Два сироваткові фіколіни, І -фіколін і Н-фіколін, і той, і інший, мають специфічність відносно М- ацетил-О-глюкозаміну, але Н-фіколін також зв'язує і М-ацетил-О-галактозамін. Відмінності в специфічності І -фіколіну, Н-фіколіну, СІ -11 ії МВГІ. відносно цукрів означають, що різні лектини можуть бути комплементарними і по-різному таргетованими, хоча і частково дублюючими один одний, глікокон'югатами. Ця концепція підтверджується нещодавно опублікованими даними наукових досліджень про те, що із усіх відомих лектинів, що беруть участь у лектиновому шляху, тільки Г-фіколін специфічно зв'язується з ліпотейхоєвою кислотою, із глікокон'югатом клітинної оболонки, що виявляється на всіх грампозитивних бактеріях (с упсп М.9. еї аї., 9.
Іттипої. 172:1198-1202, 2004). Амінокислотні послідовності колектинів (тобто МВІ) і фіколінів не мають якої-небудь суттєвої подібності. Однак ці дві групи білків мають аналогічні доменні організації і, подібно С1д, формуються в олігомерні структури, які максимізують їх здатність до мультисайтового зв'язування.
Концентрації МВІ у сироватці крові здорових людей характеризуються високою варіабельністю і генетично регулюються поліморфізмом/мутаціями як у промоторних, так і в бо кодуючих областях гена МВ. Рівень експресії МВІ як білка гострої фази додатково підвищувально регулюється в процесі запалення. І-фіколін присутній у сироватці в концентраціях, аналогічних концентраціям МВ. Тому, ефективність І1-фіколінової гілки лектинового шляху, у принципі, порівнянна з ефективністю МВІ -гілки. МВІ. і фіколіни можуть також діяти як опсоніни, що дозволяє фагоцитам бути таргетованими на МВІ- і фіколін- декоровані поверхні (дивіться Часк еї аї., У. ГеиКос Віої., 77(3):328-36 (2004); МаївивНйа апа
Ешійа, Іттипобіоіоду, 205(4-5):490-7 (2002); Асуаді еї аї., У. Іттипої. 174(1):418-25 (2005)). Така опсонізація вимагає взаємодії цих білків з рецепторами фагоцитів (КипйіІтап М. еї аї.,.). Ехр.
Мей. 169:1733, 1989; Маїзив5нйна М. еї аї., у. Віої. Спет. 271:2448-54, 1996), ідентичність яких поки ще не встановлена.
МВІ людини формує специфічну і високоафінну взаємодію за допомогою його колагенподібного домену з унікальними С1іг/Сб15-подібними сериновими протеазами, називаними МВІ-асоційованими сериновими протеазами (МА5БР). На даний час описані три
МАЗР. Першим був ідентифікований один фермент "МАБР", який був охарактеризований як фермент, відповідальний за ініціювання каскаду реакцій комплементу (тобто реакцій розщеплення С2 і С4) (Маїзизпйа М. 5 Рцйа Т., У. Ехр. Мед. 176(6):1497-1502 (1992), ді У.Н. єї а), У. Іттипої. 150:571-578, 1993). Потім було виявлено, що активність МА5Р фактично являє собою активність суміші двох протеаз МАЗР-1 і МАБР-2 (Тпівї! 5. єї аї!., Маштє, 386:506-510, 1997). Однак було показано, що для активації комплементу достатньо і одного комплексу МВІ -
МАБР-2 (Могир-Уепзеп Т. єї аї., У. Іттипої. 165:2093-2100, 2000). Крім того, тільки МА5Р-2 розщеплювала з високим ступенем перетворення С2 і С4 (Атрги5 0. еї аї., У. Іттипої. 170:1374-1382, 2003). Отже, МАБР-2 являє собою протеазу, відповідальну за активацію С4 їі с2 для генерування СЗ-конвертази, С4рг2а. Це суттєво відрізняється від комплексу С1 класичного шляху, де координована дія двох специфічні серинових протеаз (Сіг і С15) приводить до активації системи комплементу. Крім того, була виділена третя нова протеаза МАБР-З (Бані
М.А. еї аї., Іттипйу, 15:127-35, 2001). МАБР-1 і МАБР-3 являють собою альтернативно сплайсовані продукти одного і того ж гена.
МА5Р мають ті ж самі доменні організації, що і доменні організації у випадку Сїг і С15, ферментних компонентів комплексу С1 (Зіт К.В. еї аї., Віоспет. ос. Тгап5. 25:545, 2000). Ці домени включають М-термінальний домен С1іг/С15/фактора росту ендотелію судин (МЕСБЕ)
Зо морського їжака/кісткового морфогенетичного білка (СОВ); домен, подібний епідермальному фактору росту; другий домен СИВ; тандем доменів регуляторних білків комплементу і домен серинової протеази. Як і в протеазах С1, активація МА5Р-2 здійснюється в результаті розриву зв'язку Аго-МПе, розташованого поруч із доменом серинової протеази, що приводить до розщеплення ферменту на зв'язані з дисульфідом ланцюги А і В, де останній із двох ланцюгів складається з домену серинової протеази.
МВІГ. може також асоціюватися з альтернативно сплайсованою формою МА5БР-2, відомою як
МВІ -асоційований білок розміром 19 кДа (МАр19) або малий МВІ -асоційований білок (5МАР), який не має каталітичну активність МАБР-2 (5Іомег, у. Іттипої. 162:3481-90 (1999); ТаКанНавні єї а!., Тиї. Іттипої. 11:859-863 (1999)). МАр19 включає перші два домени МА5Р-2, за якими іде додаткова послідовність із чотирьох унікальних амінокислот. Гени МАБР-1 і МА5БР-2 розташовуються, відповідно, на хромосомах З і 1 людини (Зспугаебріє МУ. еї аї., Іттипобіоіоду, 205:455-466, 2002).
Ряд одержаних даних свідчить про те, що існують різні комплекси МВІ-МА5Р, ї що велика фракція МА5Р у сироватці не утворює комплексу з МВГ. (Тієї 5. еї аї., У. Іттипої. 165:878-887, 2000). Як Н-фіколін, так і І -фіколін зв'язуються з усіма МА5Р і активують лектиновий шлях комплементу таким же чином, як це робить МВІ (Бай М.К. еї аї., Іптітипйу, 15:127-35, 2001;
Маїзизпіа М. єї аї., У. Іттипої. 165:3502-3506, 2002). Обидва шляхи, лектиновий шлях і класичний шлях, утворюють загальну СЗ-конвертазу (С4рга), і на цій стадії ці два шляхи сходяться.
Загальновизнано, що лектиновий шлях відіграє важливу роль у захисті від інфекції організму-хазяїна, що не піддавався інфікуванню. Переконливі докази участі МВІ. у захисті організму-хазяїна наводяться в дослідженнях пацієнтів зі зниженими рівнями функціонального
МВ. у сироватці (Кіїраїгіск О.С., Віоспіт. Віорпу5. Асіа, 1572:401-413, 2002). У цих пацієнтів спостерігається схильність до рецидивуючих бактеріальних і грибкових інфекцій. Такі симптоми звичайно проявляються в молодому віці протягом чітко вираженого часового інтервалу зниженої опірності організму в міру зниження титрів материнських антитіл, але до розвитку гуморальної відповіді з утворенням повного репертуару антитіл. Цей синдром часто є наслідком мутацій у декількох сайтах колагенової частини МВІ, які перешкоджають нормальному утворення олігомерів МВІ. Однак, оскільки МВІ може функціонувати як опсонін незалежно від бо комплементу, то невідомо, у якому ступені підвищення схильності до інфекції обумовлене порушенням активації комплементу.
На відміну від класичного і лектинового шляхів, не було виявлено яких-небудь ініціаторів альтернативного шляху, які забезпечували б функції розпізнавання, властиві С14 і лектинам у двох інших шляхах. На даний час є загальновизнаним, що альтернативний шлях спонтанно піддається циклічній активації з низьким рівнем, який може легко підсилюватися на чужорідних або інших аномальних поверхнях (бактеріях, дріжджах, інфікованих вірусом клітинах або ушкодженій тканині), що не мають власних молекулярних елементів, які контролюють спонтанну активацію комплементу. Існує чотири білки плазми, що безпосередньо беруть участь в активації альтернативного шляху, а саме С3, фактори В і О і пропердин.
Вже є велика кількість доказів участі класичного і альтернативного шляхів активації комплементу в патогенезі неінфекційних захворювань у людини, але роль лектинового шляху ще тільки має бути з'ясована. Нещодавні дослідження довели, що активація лектинового шляху може викликати активацію комплементу і пов'язане із цим запалення при ішемії/реперфузійному ушкодженні. У публікації СоПага С.О. еї аї.,, Ат. 9. Раїйої. 156:1549-1556, 2000, було показано, що культивовані ендотеліальні клітини, піддані окисному стресу, зв'язують МВІГІ їі виявляють осадження СЗ після впливу на них людської сироватки. Крім того, обробка людської сироватки блокуючими моноклональними антитілами проти МВІ приводила до інгібування зв'язування
МВІ і активації комплементу. Ці висновки були уточнені на експериментальній моделі реперфузії при міокардіальній ішемії на щурах, коли у щурів, підданих обробці блокуючим антитілом проти щурячого МВГ, спостерігалося значне зменшення ушкодження міокарда після оклюзії коронарної артерії, у порівнянні з щурами, підданими обробці контрольним антитілом (Чогаап ..Е. єї аї., Сігсціайоп, 104:1413-1418, 2001). Молекулярний механізм зв'язування МВІ. з ендотелієм судин після окисного стресу залишається поки неясним, однак останні дослідження дозволяють припустити, що активація лектинового шляху після окисного стресу може бути опосередкована зв'язуванням МВІ. із цитокератинами ендотелію судин, а не з глікокон'югатами (СоПага С.О. еї аіІ., Ат. У. Раїйої. 159:1045-1054, 2001). В інших дослідженнях була виявлена роль класичного і альтернативного шляхів в патогенезі ішемії/реперфузійного ушкодження, а роль лектинового шляху при цьому захворюванні поки залишається предметом дискусій (Вівдептапп М.О. єї а!., Ат. у. Раїної. 162:363-367, 2003).
Зо У нещодавніх дослідженнях було показано, що для перетворення фактора 0, тобто ферменту активації альтернативного шляху, з його зимогенної форми у ферментативно активну форму необхідний МА5Р-1 (і, можливо, також МА5Р-3) (дивіться публікацію Такайабхпі М. еї аї.,
У. Ехр. Меа. 207(1):29-37 (2010)). На фізіологічну важливість цього процесу вказує відсутність функціональної активності альтернативного шляху в плазмі дефіцитних по МА5БР-1/3 мишей.
Для функціонування альтернативного шляху необхідне протеолітичне продукування СЗБ з нативного С3. Оскільки СЗ-конвертаза альтернативного шляху (СЗБВБЬ) містить СЗБЬ як основну субодиницю, то питання щодо походження першого СЗ3Б по альтернативному шляху являє собою заплутану проблему і вимагає проведення глибоких досліджень.
СЗ3 належить до сімейства білків (поряд з С4 і з макроглобуліном а-2), які містять рідку посттрансляцину модифікацію, відому як тіоефірний зв'язок. Тіоефірна група складається із глутаміну, у якого кінцева карбонільна група утворює ковалентний тіоефірний зв'язок з сульфгідрильною групою цистеїну без трьох амінокислот. Цей зв'язок є нестабільним, і електрофільний глутаміл-тіоефір може взаємодіяти з нуклеофільними групами, такими як гідроксильні групи або аміногрупи, утворюючи в результаті ковалентний зв'язок з іншими молекулами. Тіоефірний зв'язок є достатньо стабільним при секвестуванні в гідрофобному кармані інтактного СЗ3. Однак протеолітичне розщеплення СЗ на СЗа і СЗБ приводить до впливу високореакційноздатного тіоефірного зв'язку на СЗБ, і після нуклеофільної атаки фрагментів, що знаходяться поряд, які містять гідроксильні групи або аміногрупи, СЗБб стає ковалентно зв'язаною з мішенню. Вважається, що крім добре підтвердженої ролі СЗ-тіоефіру в ковалентному зв'язуванні СЗЬ з мішенями комплементу, СЗ-тіоефір також відіграє головну роль у запуску альтернативного шляху. Відповідно до загальновизнаної "теорії холостої активації", альтернативний шлях ініціюється продукуванням конвертази в рідкій фазі, іСЗВр, яка утворюється з СЗ разом з гідролізованим тіоефіром (123; СЗ(НгО)) і фактором В (Гасптапп Р... еї аі., Зргіпдег бетіп. Іттипораїної. 7:143-162, 1984). СЗр-подібний СЗ(НгО) продукується з нативного ССЗ у результаті повільного мимовільного гідролізу внутрішнього тіоефіру, присутнього в білку (Рапдбигп М.К. еї аї., У. Ехр. Мед. 154:856-867, 1981). Завдяки активності
СЗ(НгО)ВБ-конвертази, молекули СЗЬ осаджуються на поверхні мішені і тим самим ініціюють альтернативний шлях.
Про ініціатори активації альтернативного шляху відомо дуже мало. Вважається, що бо активаторами можуть бути стінки дріжджових клітин (зимозан), багато які чисті полісахариди,
кролячі еритроцити, деякі імуноглобуліни, віруси, гриби, бактерії, пухлинні клітини тварин, паразити і ушкоджені клітини. Єдиною загальною ознакою для цих активаторів є присутність вуглеводу, однак, внаслідок складності і різноманітності вуглеводних структур, важко визначити загальні молекулярні детермінанти для розпізнавання. Загальноприйнятою є думка, що активація альтернативного шляху регулюється за допомогою точного балансу між інгібуючими регуляторними компонентами цього шляху, такими як фактор Н, фактор І, САКЕ ї СК, і пропердином, який є єдиним позитивним регулятором альтернативного шляху (дивіться зЗепмаебріє М/.). апа Неї К.В., Іттипої. Тодау, 20(1):17-21 (1999)).
Крім явно нерегульованого механізму активації, описаного вище, альтернативний шлях може також забезпечувати потужну петльову ампліфікацію для СЗ-конвертази (С4рзга) лектинового/класичного шляху, оскільки будь-який продукований СЗЬ може брати участь разом з фактором В в утворенні додаткової СЗ-конвертази (СЗБВр) альтернативного шляху. С3- конвертаза альтернативного шляху стабілізується за допомогою зв'язування пропердину.
Пропердин збільшує час напівжиття СЗ-конвертази альтернативного шляху в 6-10 разів.
Додавання СЗ3Б до СЗ-конвертази альтернативного шляху приводить до утворення сС5- конвертази альтернативного шляху.
Вважають, що всі три шляхи (тобто класичний, лектиновий і альтернативний) сходяться в
С5, при розщепленні якого утворюються продукти, які мають множину прозапальних ефектів.
Шлях, у якому сходяться всі три шляхи, був названий шляхом кінцевих продуктів активації комплементу. Сб5а являє собою винятково сильний анафілотоксин, індукуючий зміну тонусу гладких м'язів і судин, а також судинної проникності. Він також є сильним хемотаксином і активатором нейтрофілів і моноцитів. Сб5а-опосередковувана клітинна активація може значно підсилювати запальні реакції шляхом індукування вивільнення множини додаткових медіаторів запалення, включаючи цитокіни, гідролітичні ферменти, метаболіти арахідонової кислоти і активні форми кисню. Розщеплення С5 приводить до утворення С5р-9, також відомого як мембраноатакуючий комплекс (МАС). На даний час існують переконливі докази того, що сублітичне осадження МАС, крім його ролі як літичного пороутворювального комплексу, може відігравати важливу роль у запальному процесі.
Система комплементу, крім її важливої ролі в імунному захисті, сприяє ушкодженню тканини
Зо при багатьох клінічних станах. Тому, створення терапевтично ефективних інгібіторів комплементу для запобігання цим побічним ефектам є гострою необхідністю.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Опис суті винаходу призначений для ознайомлення з вибором концепцій у спрощеній формі, які додатково описані нижче в розділі "Докладний опис винаходу". Цей опис суті винаходу не призначений ні для визначення ключових ознак заявленого предмета винаходу, ні для використання як допоміжної інформації при визначенні обсягу заявленого предмета винаходу.
В одному аспекті, даний винахід пропонує спосіб інгібування ушкодження клітин ендотелію капілярів і/або тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від тромботичної мікроангіопатії (ТМА), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МАЗР-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення, суб'єкт страждає від ТМА або має ризик розвитку ТМА, вибраної із групи, що складається з гемолітичного уремічного синдрому (НО5), тромботичної тромбоцитопенічної пурпури («ТТР) ї атипового гемолітичного уремічного синдрому (ани5). У деяких варіантах здійснення, перед введенням композиції, суб'єкта піддають обстеженню на наявність одного або більше симптомів, вибраних із групи, що складається з (ії) анемії, (ії) тромбоцитопенії, (її) ниркової недостатності і (ім) підвищення креатиніну, і композицію вводять в ефективній кількості і протягом періоду часу, достатнього для поліпшення одного або більше зазначених симптомів.
У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб являє собою антитіло проти МА5Р-2 або його фрагмент. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб являє собою моноклональне антитіло проти МАЗР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності зЗЕО ІЮ МО:6. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб інгібує ушкодження клітин ендотелію капілярів.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб інгібування МА5БР-2 залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає від атипового гемолітичного уремічного синдрому або має ризик розвитку атипового гемолітичного уремічного синдрому (аниз), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування
МАБР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, перед введенням композиції, суб'єкта піддають обстеженню на наявність одного або більше симптомів, вибраних із групи, що складається з (Її) анемії, (ії) тромбоцитопенії, (ії) ниркової недостатності і (їм) бо підвищення креатиніну, і композицію вводять в ефективній кількості і протягом періоду часу,
достатнього для поліпшення одного або більше зазначених симптомів. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від ани5, що не залежить від фактора Н, або має ризик розвитку анизв, що не залежить від фактора Н. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від анивб, пов'язаного з фактором І, фактором В або мембранним кофакторним білком СО46. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб являє собою антитіло проти МАБР-2 або його фрагмент, таке як моноклональне антитіло проти МА5Р-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності 5ЕО ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2- інгібуючий засіб інгібує ушкодження клітин ендотелію капілярів. В одному варіанті здійснення,
МА5Р-2-інгібуючий засіб інгібує тромбоутворення.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб зниження ймовірності того, що суб'єкт, який має ризик розвитку атипового гемолітичного уремічного синдрому (аниб5), буде мати клінічні симптоми, пов'язані з аниб5. Спосіб за цим аспектом винаходу включає (а) визначення присутності у суб'єкта генетичного маркера, про який відомо, що він пов'язаний з аниб; (р) періодичне обстеження суб'єкта з метою визначення наявності або відсутності щонайменше одного симптому, вибраного із групи, що складається з анемії, тромбоцитопенії, ниркової недостатності і підвищення креатиніну; і (с) введення суб'єкту композиції, яка містить кількість
МАБР-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МАБР-2-залежної активації комплементу, після визначення наявності щонайменше одного із симптомів, таких як анемія, тромбоцитопенія, ниркова недостатність або підвищення креатиніну, де композицію вводять в ефективній кількості і протягом достатнього періоду часу для поліпшення одного або більше зазначених симптомів. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб являє собою антитіло проти МА5Р-2 або його фрагмент, таке як моноклональне антитіло проти МАБР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності БЕО ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення способу, стадія (а) включає проведення генетичного скринінг-тесту на зразку, узятому у пацієнта, і виявлення присутності щонайменше одного генетичного маркера, пов'язаного з аних, у гені, вибраного із групи, що складається з фактора комплементу Н (СЕН), фактора комплементу І (СЕ), фактора комплементу В (СЕВ), мембранного кофакторного білка сОр46, С3, білка, подібного з комплементом фактора Н (СЕНР'), антикоагулянтного білка тромбодуліну (ТНВО), білка 3, подібного з комплементом фактора Н (СЕНКЗ), і білка 4, подібного з комплементом фактора Н (СЕНКЯ). В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає постійне обстеження суб'єкта на предмет виникнення події, про яку відомо, що вона пов'язана з ініціюванням клінічних симптомів анивб, і введення суб'єкту композиції, яка включає
МАБ5БР-2-інгібуючий засіб, до, під час або після виникнення ініціюючої події. В одному варіанті здійснення, подію, пов'язану з ініціюванням клінічних симптомів анив5, вибирають із групи, що складається з тривалого впливу лікарського засобу, інфекції, злоякісного новоутворення, ушкодження, трансплантації органа або тканини і вагітності. В одному варіанті здійснення, інфекція являє собою бактеріальну інфекцію. В одному варіанті здійснення, композицію вводять підшкірно. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб інгібує ушкодження клітин ендотелію капілярів. В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуючий засіб інгібує тромбоутворення.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб інгібування МАБР-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає на фоні інфекції від атипового гемолітичного уремічного синдрому (аниз) або має ризик розвитку на фоні інфекції атипового гемолітичного уремічного синдрому (аниз5), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р -2- інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МА5БР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає ввід некишкового анивх, пов'язаного із пневмококовою інфекцією, або має ризик розвитку некишкового аниз, пов'язаного із пневмококовою інфекцією. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб являє собою антитіло проти МА5Р-2 або його фрагмент, таке як моноклональне антитіло проти МАБР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності БЕО ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб інгібує ушкодження клітин ендотелію капілярів. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб інгібує тромбоутворення.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта, що страждає від атипового гемолітичного уремічного синдрому (анО5), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАБР-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МАЗР-2-залежної активації комплементу, де введення МАБР-2-інгібуючого засобу здійснюють через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає лікування пацієнта методом плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, композицію, яка включає МАЗБР-2-інгібуючий засіб, вводять без бо застосування методу плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, композицію, яка включає
МА5БР-2-інгібуючий засіб, вводять через катетер протягом першого проміжку часу, потім проводять введення композиції, яка включає МАЗБР-2-інгібуючий засіб, протягом другого проміжку часу, де протягом другого проміжку часу композицію вводять підшкірно. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає періодичне визначення рівня щонайменше одного фактора комплементу, де виявлення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу відносно нормального значення або рівня у здорового суб'єкта служить вказівкою на продовження лікування за допомогою композиції. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2- інгібуючий засіб являє собою антитіло проти МАБР-2 або його фрагмент, таке як моноклональне антитіло проти МАБР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності 5ЕО ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб інгібує ушкодження клітин ендотелію капілярів. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2- інгібуючий засіб інгібує тромбоутворення.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта, що страждає від тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР) або виявляє симптоми, що вказують на діагноз ТТР, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАЗБР-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МА5БР-2-залежної активації комплементу, де введення МА5Р-2- інгібуючого засобу здійснюють через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер. В одному варіанті здійснення, у суб'єкта виявляється щонайменше один або більше симптомів, вибраних із групи, що складається з залучення в патологічний процес центральної нервової системи, тромбоцитопенії, серйозного серцевого порушення, серйозного легеневого порушення, інфаркту шлунково-кишкового тракту і гангрени. В одному варіанті здійснення, у суб'єкта виявляють позитивні результати тесту на присутність інгібітору
АБАМТЗ5І13, і спосіб додатково включає введення імунодепресанту суб'єкту. В одному варіанті здійснення, композицію, яка включає МАБР-2-інгібуючий засіб, вводять протягом першого проміжку часу без застосування методу плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, у суб'єкта виявляють позитивні результати тесту на присутність інгібітору АСАМТ5І13, і спосіб додатково включає введення АБАМТ513. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає лікування пацієнта з використанням методу плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, композицію, яка включає МАБР-2-інгібуючий засіб, вводять з використанням методу
Зо плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, композицію, яка включає МАЗР-2-інгібуючий засіб, вводять через катетер протягом першого проміжку часу, потім проводять введення композиції, яка включає МА5Р-2-інгібуючий засіб, протягом другого проміжку часу, де протягом другого проміжку часу композицію вводять підшкірно. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає періодичне визначення рівня щонайменше одного фактора комплементу, де виявлення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу відносно нормального значення або рівня у здорового суб'єкта служить вказівкою на продовження лікування за допомогою композиції. В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуючий засіб являє собою антитіло проти МА5Р-2 або його фрагмент, таке як моноклональне антитіло проти МАБР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності 56200 ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуючий засіб інгібує ушкодження клітин ендотелію капілярів. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб інгібує тромбоутворення.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта, що страждає від рефрактерної тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, композицію вводять підшкірно. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає періодичне визначення рівня щонайменше одного фактора комплементу, де виявлення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу відносно нормального значення або рівня у здорового суб'єкта служить вказівкою на продовження лікування за допомогою композиції. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2- інгібуючий засіб являє собою антитіло проти МАБЗР-2 або його фрагмент, таке як моноклональне антитіло проти МАБР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності 5ЕО ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб інгібує ушкодження клітин ендотелію капілярів. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2- інгібуючий засіб інгібує тромбоутворення.
В іншому аспекті, даний винахід пропонує спосіб інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає від тромботичної мікроангіопатії (ТМА) або має ризик розвитку тромботичної мікроангіопатії (ТМА), де ТМА являє собою щонайменше одну з () ТМА на фоні раку; (ії) ТМА на фоні хіміотерапії або (ії) ТМА на фоні трансплантації, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАЗР-2-інгібуючого засобу, ефективну для бо інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення, суб'єкт страждає від ТМА на фоні раку або має ризик розвитку ТМА на фоні раку, і МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять системно суб'єкту в кількості, ефективній для зниження ризику розвитку ТМА або зниження тяжкості ТМА. У деяких варіантах здійснення, суб'єкт страждає від ТМА на фоні хіміотерапії або має ризик розвитку ТМА на фоні хіміотерапії, і МАБР -2-інгібуючий засіб вводять системно суб'єкту до, під час або після хіміотерапії в кількості, ефективній для зниження ризику розвитку ТМА або зниження тяжкості ТМА. У деяких варіантах здійснення, суб'єкт страждає від
ТМА на фоні трансплантації або має ризик розвитку ТМА на фоні трансплантації, і МАБР-2- інгібуючий засіб вводять системно суб'єкту до, під час або після процедури трансплантації в кількості, ефективній для зниження ризику розвитку ТМА або зниження тяжкості ТМА. У деяких варіантах здійснення, процедура трансплантації являє собою трансплантацію алогенних гематопоетичних стовбурових клітин. У деяких варіантах здійснення, суб'єкта піддавали раніше або піддають на даний момент лікуванню інгібітором активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає введення суб'єкту інгібітору активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу, такого як гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент, такого як екулізумаб.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб інгібування МАБР-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає від синдрому Апшо-Шульмана або має ризик розвитку синдрому Апшо-Шульмана (055), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МАБР-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає лікування суб'єкта, що має ризик розвитку 55, де спосіб включає введення кількості МА5БР-2-інгібуючого засобу протягом періоду часу, ефективного для полегшення або запобігання одному або більше клінічним симптомам, пов'язаним з ТТР. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає періодичне обстеження суб'єкта і введення МА5Р-2-інгібуючого засобу після виявлення події, про яку відомо, що вона пов'язана з ініціюванням клінічних симптомів ТТР. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає періодичне обстеження суб'єкта і введення МА5Р-2- інгібуючого засобу після виявлення наявності анемії, тромбоцитопенії або підвищеного креатину. У деяких варіантах здійснення, суб'єкта піддавали раніше або піддають на даний
Зо момент лікуванню інгібітором активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає введення суб'єкту інгібітору активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу, такого як гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент, такого як екулізумаб.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб інгібування МАБ5БР-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає від хвороби Дегоса, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МА5Р-2- залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення, суб'єкта піддавали раніше або піддають на даний момент лікуванню інгібітором активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає введення суб'єкту інгібітору активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу, такого як гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент, такого як екулізумаб.
В іншому аспекті, винахід пропонує спосіб інгібування МАБР-2-залежної активації комплементу у суб'єкта що страждає від катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САРБ), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАЗР-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МАЗР-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення, суб'єкта піддавали раніше або піддають на даний момент лікуванню інгібітором активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає введення суб'єкту інгібітору активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу, такого як гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент, такого як екулізумаб.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з розкритих способів за винаходом, МА5Р-2- інгібуючий засіб являє собою МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його фрагмент. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло має знижену ефекторну функцію. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло практично не інгібує класичний шлях. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб являє собою моноклональне антитіло проти МА5Р-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності 5ЕО ІЮ МО:6. У деяких бо варіантах здійснення, антитіло проти МАБР-2 або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла, що має знижену ефекторну функцію, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Раф, Раб", Е(аб)г і Е(аб)». У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу. У деяких варіантах здійснення, МАБР-2- інгібуюче антитіло вибирають із групи, що складається з молекули ІдДО1, молекули Ідса2 і Ід04. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло являє собою молекулу Ідс4, що включає мутацію 5228Р. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло зв'язує людську МА5Р-2 з константою дисоціації Ко 10 нМ або менше. У деяких варіантах здійснення,
МА5БР-2-інгібуюче антитіло зв'язує епітоп в ССРІ-домені МАБР-2. У деяких варіантах здійснення, МАБ5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує відкладення СЗ3Б при аналізі іп мійго в 1 95 сироватці людини з величиною ІСзхо 10 нМ або менше. У деяких варіантах здійснення, МАБР-2- інгібуюче антитіло інгібує відкладення СЗбр в 90 95 сироватці людини з величиною ІСвзо 30 нМ або менше.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з розкритих способів за винаходом, МА5Р-2- інгіібуюче моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент включає: (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності з«ЕО ІЮ МО:67; і і) важкий ланцюг СОК-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності БЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг
СОВ-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67; і (Б) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ії) легсий ланцюг СОК-11, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ХЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-12, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг
СОВ-ІЇЗ3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності ЗЕО ІЮ МО:70. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче моноклональне антитіло включає варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як послідовність зЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, позначувану як послідовність 5ЕО ІЮ МО:70. У деяких варіантах здійснення, МАР -2- інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа, розпізнаваного контрольним антитілом, що включає варіабельну область
Зо важкого ланцюга, позначувану як у послідовності ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, позначувану як у послідовності ЗЕО ІЮ МО:70.
В іншому аспекті винаходу, пропонуються способи інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від атипового гемолітичного уремічного синдрому (анНив), які включають введення суб'єкту кількості МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективної для інгібування МАЗР-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові суб'єкта, що страждає від ани5, щонайменше на 40 95 у порівнянні із сироваткою суб'єкта, що не піддавався лікуванню. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові суб'єкта що страждає від аниб5, на рівні щонайменше на 20 95 більше (наприклад, щонайменше на 30 95 білошому, щонайменше на 40 95 більшому або щонайменше 50 95 більшому), ніж його інгібуюча дія на відкладення С5р-9 у сироватці крові того ж самого суб'єкта. У деяких варіантах здійснення, суб'єкт знаходиться в гострій фазі анО5. У деяких варіантах здійснення, суб'єкт знаходиться у фазі ремісії ани5. У деяких варіантах здійснення,
МА5БР-2-інгібуюче антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з частиною послідовності 5Е0 ІЮ МО:6. У деяких варіантах здійснення,
МАБР-2-інгібуюче антитіло або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла, що має знижену ефекторну функцію, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла. У деяких варіантах здійснення, МАР -2-інгібуюче антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Раб, Рар',
Каб)»: і Р(ар)». У деяких варіантах здійснення, МАБ5БР-2-інгібуюче антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу. У деяких варіантах здійснення, МАЗБР-2-інгібуюче антитіло вибирають із групи, що складається з молекули Ідс1, молекули Ідс2 і Ідс4. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло являє собою молекулу Ідс4, що включає мутацію 5228Р.
У деяких варіантах здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло зв'язує людську МАБР-2 з константою дисоціації Ко 10 нМ або менше. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло зв'язує епітоп в ССРІ-домені МАБР-2. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2- інгібуюче антитіло інгібує відкладення СЗБ при аналізі іп мйго в 1 95 сироватці людини з величиною ІСзо 10 нМ або менше. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 сироватці людини з величиною ІСзо 30 нМ або менше. У деяких бо варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент включає: (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг
СОВ-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності ЗЕО ІЮО МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності 5ЕО ІЮ
МО:67; і (5) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легсий ланцюг СОК-Ї 1, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ЗЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-
Ї2, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності 5ЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-І 3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності з«ЕО І МО:70. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче моноклональне антитіло включає варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як послідовність БЕО ІЮ МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, позначувану як послідовність БЕО ІЮ МО:70. У деяких варіантах здійснення,
МА5БР-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа, розпізнаваного контрольним антитілом, що включає варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як у послідовності 5ЕО ІЮ МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, позначувану як у послідовності ЗЕО ІЮ МО:70.
В іншому аспекті, даний винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта, що страждає резистентним до плазмотерапії аниб5, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МА5бР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, МАЗБР-2-інгібуюче антитіло являє собою моноклональне антитіло проти МА5ЗР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язує людську
МА5БР-2. В одному варіанті здійснення, антитіло або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла, що має знижену ефекторну функцію, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла. В одному варіанті здійснення, суб'єкта піддавали раніше або піддають на даний момент лікуванню інгібітором активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу, де інгібітор активації термінальних компонентів являє собою гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає лікування пацієнта методом плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, композицію, яка включає МАБ5Р-2-інгібуюче антитіло, вводять без застосування
Зо методу плазмаферезу.
В іншому аспекті, даний винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта, що страждає від ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАБР-2-інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МА5БР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2- інгібуюче антитіло являє собою моноклональне антитіло проти МАЗР-2 або його фрагмент, що специфічно зв'язує людську МА5Р-2. В одному варіанті здійснення, антитіло або його фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла, що має знижену ефекторну функцію, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла. В одному варіанті здійснення, суб'єкта піддавали раніше або піддають на даний момент лікуванню інгібітором активації термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, яка резистентна до лікування за допомогою переливання тромбоцитів і/або резистентна до лікування методом плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло вводять у кількості, ефективній для поліпшення щонайменше одного або більше клінічних параметрів, обумовлених ТМА, пов'язаною із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, таких як збільшення кількості тромбоцитів (наприклад, щонайменше у два рази, щонайменше у три рази, щонайменше у чотири рази в порівнянні з кількістю тромбоцитів до лікування), збільшення гаптоглобіну й/або зниження лактатдегідрогенази.
В іншому аспекті, даний винахід пропонує спосіб лікування людини, що страждає від персистуючої ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НОСТ-
ТМА), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для інгібування МА5БР-2- залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає виявлення людини, що має персистуючу ТМА, пов'язану із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, до стадії введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5БР-2- інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для інгібування
МАБР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, МАЗ5Р-2-інгібуюче антитіло являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язує 60 людську МАБР-2. В одному варіанті здійснення, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вибирають із групи, що складається з рекомбінантного антитіла, антитіла, що має знижену ефекторну функцію, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла.
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло практично не інгібує класичний шлях.
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці крові з величиною ІСво 30 нМ або менше. В одному варіанті здійснення,
МА5БР-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає СОК-НІ, СОВ-Н2 ії СОК-НЗ послідовності амінокислот, позначуваної як послідовність 5ЕО ІЮ МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає СОВ-І1, СОВ-І2 ї СОК-ЇЗ послідовності амінокислот, позначуваної як послідовність
ЗЕО ІЮ МО:70. В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло вводять пацієнту без застосування методу плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, суб'єкта піддавали раніше або піддають на даний момент лікуванню гуманізованим антитілом проти С5 або його антигензв'язувальним фрагментом, так що в цьому випадку інгібітором активації термінальних компонентів комплементу є гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент. В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту системно.
В одному варіанті здійснення, МА5БР-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вводять у кількості, ефективній для поліпшення щонайменше одного або більше із наступних клінічних параметрів, обумовлених персистуючою ТМА, пов'язаною (із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин: (ї) збільшення кількості тромбоцитів (наприклад, щонайменше у два рази, щонайменше у три рази, щонайменше у чотири рази в порівнянні з кількістю тромбоцитів до лікування); (її) збільшення гаптоглобіну; (ії) зниження лактатдегідрогенази (ІОН); і/або (ім) зниження креатиніну.
В іншому аспекті, даний винахід пропонує композиції для інгібування негативних наслідків
МАБР-2-залежної активації комплементу, які включають терапевтично ефективну кількість
МА5БР-2-інгібуючого засобу, такого як МА5Р-2-інгібуюче антитіло, і фармацевтично прийнятний носій. Пропонуються також способи виробництва лікарського препарату для застосування для інгібування негативних наслідків МА5Р-2-залежної активації комплементу у живих суб'єктів, що потребують цього, який включає терапевтично ефективну кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу у фармацевтичному носії. Пропонуються також способи виробництва лікарського препарату для
Зо застосування при інгібуванні МАЗР-2-залежної активації комплементу для лікування кожного з описаних у винаході нижче станів, захворювань і порушень.
Способи, композиції і лікарські препарати за винаходом можуть застосовуватися для інгібування негативних наслідків МАЗР-2-залежної активації комплементу іп мімо у ссавців, у тому числі людей, що страждають від тромботичної мікроангіопатії (ТМА) або мають ризик розвитку тромботичної мікроангіопатії (ТМА), як це описано далі у винаході.
ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Викладені вище аспекти і багато які з переваг цього винаходу можна більш легко оцінити, і вони стануть більш зрозумілими в результаті ознайомлення з подальшим докладним описом у комбінації із супровідними кресленнями, де: на фігурі 1 представлена схема, що ілюструє геномну структуру людської МА5Р-2; на фігурі 2А представлена принципова схема, що ілюструє доменну структуру білка МАБР-2 людини; на фігурі 28 представлена принципова схема, що ілюструє доменну структуру білка МАр19 людини; на фігурі З представлена схема, що ілюструє стратегію МА5Р-2 нокауту у мишей; на фігурі 4 представлена схема, що ілюструє мінігенну конструкцію МАБР-2 людини; на фігурі БА представлені результати, які вказують на те, що дефіцит МА5БР-2 приводить до зникнення опосередкованої лектиновим шляхом С4 активації, що вимірюється по відсутності відкладення С4б6 на манані, як це описано в прикладі 2; на фігурі 58 представлені результати, які демонструють, що дефіцит МА5БР-2 приводить до зникнення опосередкованої лектиновим шляхом С4 активації, що вимірюється по відсутності відкладення С4Б6 на зимозані, як це описано в прикладі 2; на фігурі 5С представлені результати, що демонструють відносні рівні активації С4 у зразках сироватки крові, одержані з МАЗР-2-4/-, МАБР-2-/- і немутантних штамів, виміряні по відкладенню С4б на манані і на зимозані, як це описано в прикладі 2; на фігурі б представлені результати, які демонструють, що додавання мишачої рекомбінантної МАЗР-2 до зразків МАЗР-2-/- сироватки відновлює опосередковану лектиновим шляхом С4 активацію залежно від концентрації білка, що вимірюється по відкладенню С4р на манані, як це описано в прикладі 2; бо на фігурі 7 представлені результати, які демонструють, що в штамі МА5Р-2-/- задіяний класичний шлях, як це описано в прикладі 8; на фігурі ВА представлені результати, які демонструють, що фрагмент Рар2 антитіла Мо 11 проти МА5Р-2 інгібує утворення СЗ3-конвертази, як це описано в прикладі 10; на фігурі 88 представлені результати, які демонструють, що фрагмент Рар2 антитіла Мо 11 проти МА5Р-2 зв'язується з нативною МА5БР-2 щура, як це описано в прикладі 10; на фігурі 8С представлені результати, які демонструють, що фрагмент ЕРабра2 антитіла Мо 41 проти МА5Р-2 інгібує розщеплення С4, як це описано в прикладі 10; на фігурі 9 представлені результати, які демонструють, що, як було виявлено, усі досліджувані фрагменти Рабр2 антитіл проти МА5Р-2, які інгібували утворення СЗ-конвертази, також інгібують розщеплення С4, як це описано в прикладі 10; на фігурі 10 представлена схема, що ілюструє рекомбінантні поліпептиди, одержані із щурячої МАБР-2, які використовували для картування епітопа блокуючих фрагментів Рар2 антитіл проти МА5Р-2, як це описано в прикладі 11; на фігурі 11 представлені результати, що демонструють зв'язування фрагмента ЕРар2 антитіл Мо 40 і Мо 60 проти МАБР-2 з щурячими МА5БР-2 поліпептидами, як це описано в прикладі 11; на фігурі 12 представлені результати, що демонструють кліренс азоту сечовини крові для немутантних (ж/5) і МАБР-2 (-/-з мишей через 24 і 48 годин після реперфузії в експериментальній моделі ішемії нирки/реперфузійного ушкодження, як це описано в прикладі 12; на фігурі 13А представлені результати, що показують вихідні рівні білка МЕСЕ у комплексі пігментного епітелію сітківки (КРЕ) і судинної оболонки ока, виділеному з немутантних (/5) і
МА5Р-2 (-/-) мишей, як це описано в прикладі 13; на фігурі 138 представлені результати, що показують вихідні рівні білка МЕСЕ у комплексі пігментного епітелію сітківки (ЕРЕ) і судинної оболонки ока у немутантних (ж/к) і МАБР-2 (-/-) мишей через З дні після викликаного лазером ушкодження в експериментальній моделі дегенерації жовтої плями, як це описано в прикладі 13; на фігурі 14 представлені результати, що показують середній об'єм неоваскуляризації судинної оболонки ока (СММ) через сім днів після викликаного лазером ушкодження у
Зо немутантних (1/5) і МА5Р-2 (-/-) мишей, як це описано в прикладі 13; на фігурах 15А і 158 представлені криві залежності "доза-ефект" для інгібування відкладення С4р (фігура 15А) і інгібування активації тромбіну (фігура 158) після введення фрагмента ЕРар2 антитіла проти МАБР-2 у сироватку здорових щурів, як це описано в прикладі 14; на фігурах 16А і 168 представлена виміряна агрегація тромбоцитів (виражена як площа агрегації) у МА5Р-2 (-/-) мишей (фігура 168) у порівнянні з агрегацією тромбоцитів у не підданих лікуванню немутантних мишей і немутантних мишей, у яких шлях активації комплементу інгібований за допомогою кровопускального засобу на основі фактора з отрути кобри (СМР) і інгібітору активації термінальних компонентів комплементу (Сбав антагоніста) (фігура 16А) в експериментальній моделі локалізованого генералізованого феномена Шварцмана дисемінованої внутрішньосудинної коагуляції, як це описано в прикладі 15; на фігурі 17 графічно представлені рівні азоту сечовини крові (ВОМ), виміряні або у УМТ (з/к) мишей (Вб), або у МА5Р-2 (-/-) мишей, яким трансплантували донорські нирки мишей УМТ (ж/ю), як це описано в прикладі 16; на фігурі 18 графічно представлений відсоток МТ (4/5) мишей і МА5Р-2 (-/-) мишей, що вижили, залежно від числа днів, які пройшли після мікробного інфікування в експериментальній моделі лігування і наступного пунктирування сліпої кишки (СІ Р), як це описано в прикладі 17; на фігурі 19 графічно представлене число бактерій, виміряне у УМТ (1/к) мишей і МА5Р-2 (-/-) мишей після мікробного інфікування в експериментальній моделі лігування і наступного пунктирування сліпої кишки, як це описано в прикладі 17; на фігурі 20 представлена крива Каплана-Мейєра, що ілюструє відсоток виживання УМТ (/) мишей, МА5Р-2 (-/-) мишей ії СЗ (-/-) мишей через шість днів після інтраназального введення їм бактерій синьогнійної палички, як це описано в прикладі 18; на фігурі 21 графічно представлений рівень відкладення С4Б, виміряний як 9о контролю, у зразках, узятих у різні моменти часу після підшкірного введення М/Т мишам дози або 0,3 мг/кг, або 1,0 мг/кг мишачого моноклонального антитіла проти МА5Р-2, як це описано в прикладі 19; на фігурі 22 графічно представлений рівень відкладення С4Б, виміряний як 9о контролю, у зразках, узятих у різні моменти часу після внутрішньоочеревинного введення МУТ мишам дози 0,6 мг/кг мишачого моноклонального антитіла проти МА5Р-2, як це описано в прикладі 19; бо на фігурі 23 графічно представлений середній об'єм неоваскуляризації судинної оболонки ока (СММ) через сім днів після викликаного лазером ушкодження у УМТ (ї/-) мишей, підданих попередньому лікуванню за допомогою разової внутрішньоочеревинної ін'єкції 0,3 мг/кг або 1,0 мг/кг мишачого моноклонального антитіла проти МА5Р-2, як це описано в прикладі 20; на фігурі 24А графічно представлений відсоток виживання МА5Р-2 (-/-) мишей і УМТ (ж/к) мишей після інфікування за допомогою 5х108 КУО/100 мкл менінгокока, як це описано в прикладі 21; на фігурі 2488 графічно представлені значення І0д колонієутворювальні одиниці/мл менінгокока, одержані в різні моменти часу для проб крові, узятих у МАЗР-2 КО (-/-) мишей і МУТ (14/53 мишей, інфікованих за допомогою 5х108 КУО/100 мкл менінгокока, як це описано в прикладі 21; на фігурі 25А графічно представлений відсоток виживання МАЗР-2 КО (-/-) мишей їі УМТ (в/в) мишей після інфікування за допомогою 2х109 КУО/100 мкл менінгокока, як це описано в прикладі 21; на фігурі 258 графічно представлені значення 09 КУО/мл менінгокока, одержані в різні моменти часу для проб крові, узятих у ММТ (1/5) мишей, інфікованих за допомогою 2х108
КУО/Л100 мкл менінгокока, як це описано в прикладі 21; на фігурі 25С графічно представлені значення 0д КУО/мл менінгокока, одержані в різні моменти часу для проб крові, узятих у МА5БР-2 (-/-) мишей, інфікованих за допомогою 2х108
КУО/Л100 мкл менінгокока, як це описано в прикладі 21; на фігурі 26А графічно представлені результати дослідження відкладення СЗБ, які демонструють, що у МАЗР-2 (-/-) мишей зберігається функціональний класичний шлях, як це описано в прикладі 22; на фігурі 268 графічно представлені результати дослідження відкладення СЗБ на покритих зимозаном планшетах, які демонструють, що у МАБР-2 (-/-) мишей зберігається функціональний альтернативний шлях, як це описано в прикладі 22; на фігурі 27А графічно представлена втрата тканини, викликана ішемією міокарда/реперфузійним ушкодженням (МІКІ) після лігування лівої передньої низхідної гілки коронарної артерії (ГАБ) і реперфузії у С4 (-/-) мишей (п-б) і для контролю у одноприплідних УМТ мишей (п--7), що характеризується підданою ризику площею (ААК) і розміром інфаркту (ІМЕ), як це описано в прикладі 22; на фігурі 27В графічно представлена залежність розміру інфаркту (ІМЕ) від підданої ризику площі (ААК) у С4 (-/-) мишей і М/Ї мишей, підданих лікуванню, описаному на фігурі 42А, яка демонструє, що С4 (-/-) миші також чутливі до МІКІ, як ії використовувані для контролю УТ миші (пунктирна лінія), як це описано в прикладі 22; на фігурі 28А графічно представлені результати дослідження відкладення СЗБ при використанні сироватки від М/Т мишей, СА (-/-) мишей і сироватки від С4 (-/-) мишей, попередньо інкубованої з мананом, як це описано в прикладі 22; на фігурі 288 графічно представлені результати дослідження відкладення СЗБ на сироватці від ММ мишей, С4 (-/- мишей і МАБР-2 (-/- мишей, змішаній з різними концентраціями фрагмента тАБб мишачого антитіла проти МАБР-2 (тАБМІ1), як це описано в прикладі 22; на фігурі 28С графічно представлені результати дослідження відкладення СЗБр на сироватці людини від М/Т (достатніх по С4) і дефіцитних по СА суб'єктів, і на сироватці від дефіцитних по
С4 суб'єктів, попередньо інкубованій з мананом, як це описано в прикладі 22; на фігурі 280 графічно представлені результати дослідження відкладення СЗБр на сироватці людини від МУТ (достатніх по С4) і дефіцитних по С4 суб'єктів, змішаній з фрагментом тАр людського антитіла проти МА5Р-2 (тАБНЗ), як це описано в прикладі 22; на фігурі 29А графічно представлений порівняльний аналіз активності СЗ-конвертази в плазмі різних штамів декомплементованих мишей, випробуваній або при специфічних умовах дослідження лектинового шляху активації, або при специфічних умовах дослідження класичного шляху активації, як це описано в прикладі 22; на фігурі 298 графічно представлена кінетика в реальному часі активності СЗ-конвертази в плазмі різних штамів декомплементованих мишей, випробуваній при специфічних умовах дослідження лектинового шляху активації, як це описано в прикладі 22; на фігурі 30 наведені результати вестерн-блотингу, що демонструють активацію СЗ людини, яка доводиться присутністю а'-ланцюга, субстратами тромбіну ЕХіа і ЕХа, як це описано в прикладі 23; на фігурі 31 наведені результати дослідження відкладення СЗ на зразках сироватки, одержаної від МТ, МАБР-2 (-/-), Е11 (-/-), 11 (-/-УС4 (-/-) ії С4 (-/- мишей, як це описано в прикладі 23; бо на фігурі 32А представлена крива Каплана-Мейєра, що ілюструє відсоток виживання з перебігом часу після радіоактивного опромінення дозою 7,0 грей у контрольних мишей і мишей, підданих лікуванню мишачим антитілом проти МАБР-2 (птАБбБМ11) або людським антитілом проти МА5Р-2 (тптАБНВб), як це описано в прикладі 29; на фігурі 328 представлена крива Каплана-Мейєра, що графічно ілюструє відсоток виживання з перебігом часу після радіоактивного опромінення дозою 6,5 грей у контрольних мишей і мишей, підданих лікуванню мишачим антитілом проти МАБР-2 (ТАБМ11) або людським антитілом проти МА5Р-2 (тАБНВб), як це описано в прикладі 29; на фігурі 33 представлена крива Каплана-Мейєра, що графічно ілюструє відсоток виживання
МАБР-2 КО мишей і МУТ мишей після введення інфікуючої дози 2,6х107 КУО менінгокока серологічної групи А 22491, яка демонструє, що дефіцитні по МАБР-2 миші захищені від летальності, що викликається менінгококом, як це описано в прикладі 30; на фігурі 34 представлена крива Каплана-Мейєра, що графічно ілюструє відсоток виживання
МАБР-2 КО мишей і УУ/Т мишей після введення інфікуючої дози бх105 КУО штаму МО58 менінгокока серологічної групи В, яка демонструє, що дефіцитні по МАБР-2 миші захищені від летальності, що викликається штамом МО58 менінгокока серологічної групи В, як це описано в прикладі 30; на фігурі 35 графічно представлені величини 09 КУО/мл штаму МС58 менінгокока серологічної групи В, одержані в різні моменти часу для проб крові, узятих у МА5БР-2 КО мишей і М/Т мишей після внутрішньоочеревинного інфікування бх105 КУО штаму МСО58 менінгокока серологічної групи В (п-З3 у різні моменти часу для обох груп мишей, результати представлені як середні значення-стандартна помилка середнього), які демонструють, що незважаючи на те, що МА5БР-2 КО миші були інфіковані за допомогою тієї ж самої дози штаму МО58 менінгокока серологічної групи В, що і М/УТ миші, проте МАБР-2 КО миші мали підвищений кліренс при бактеріємії в порівнянні з М/Т мишами, як це описано в прикладі 30; на фігурі 36 графічно представлені середні значення бальної оцінки хворобливого стану
МАБ5БР-2 мишей і М/Т мишей через 3, 6, 12 і 24 години після інфікування бх106 КУО/100 мкл штаму МО58 менінгокока серологічної групи В, які демонструють, що дефіцитні по МА5Р-2 миші проявляли високу стійкість до інфекції зі значно більш низькими значеннями бальної оцінки хворобливого стану через 6 годин, як це описано в прикладі 30;
Зо на фігурі 37 представлена крива Каплана-Мейєра, що графічно ілюструє відсоток виживання мишей після введення інфікуючої дози 4х106 КУО/100 мкл штаму МС58 менінгокока серологічної групи В, і потім введення через З години після інфікування або інгібуючого антитіла проти МА5Р-2 (1 мг/кг), або контрольного ізотипного антитіла, яка демонструє, що антитіло проти МАБР-2 є ефективним для лікування і підвищення виживаності суб'єктів, інфікованих менінгококом, як це описано в прикладі 31; на фігурі 38 графічно представлені величини 09 КУО/мл кількості життєздатних мікроорганізмів штаму МО58 менінгокока серологічної групи В, одержані в різні моменти часу в 2095 сироватці людини після внутрішньоочеревинного інфікування за допомогою 6,5х106
КУО/Л1О00 мкл штаму МО58 менінгокока серологічної групи В через 0, 30, 60 їі 90 хвилин після інкубації в присутності: (А) сироватки здорової людини (МН) плюс людське антитіло проти
МА5Р-2; (В) сироватки здорової людини (МН5) плюс ізотипне контрольне антитіло; (С) МВІ -/- сироватки людини; (0) сироватки здорової людини (МН) і (Е) термоінактивованої сироватки здорової людини (МН), які показують, що комплементзалежне знищення менінгокока в сироватці людини значно підсилювалося в результаті додавання людського антитіла проти
МА5БР-2, як це описано в прикладі 32; на фігурі 39 графічно представлені величини 09 КУО/мл кількості життєздатних мікроорганізмів штаму МО58 менінгокока серологічної групи В, одержані в різні моменти часу в зразках сироватки мишей, які демонструють, що сироватки МАБР-2-/- мишей мають більш високий рівень бактерицидної активності відносно менінгокока, ніж сироватки МУТ мишей, як це описано в прикладі 32; на фігурі 40 графічно представлений гемоліз (визначуваний шляхом вивільнення в надосадову рідину гемоглобіну лізованих мишачих еритроцитів (Стгу/С3-/-), який вимірюють фотометрично) покритих мананом мишачих еритроцитів під впливом сироватки людини в діапазоні концентрацій сироватки. Випробувані сироватки включали термоінактивовану (НІ)
МБ, МВІ -/-, МНЗ-.кантитіло проти МА5Р-2 і МН5 для контролю, як це описано в прикладі 33; на фігурі 41 графічно представлений гемоліз (визначуваний шляхом вивільнення гемоглобіну в надосадову рідину лізованих еритроцитів М/Т мишей, який вимірюють фотометрично) не покритих мананом мишачих еритроцитів під впливом сироватки людини в діапазоні концентрацій сироватки. Випробувані сироватки включали термоінактивовану (НІ 60 МБ, МВІ -/-, МНЗ-.кантитіло проти МА5Р-2 і МН5 для контролю, який демонструє, що інгібування
МАБР-2 інгібує опосередкований комплементом лізис несенсибілізованих еритроцитів УУТ мишей, як це описано в прикладі 33; на фігурі 42 графічно представлений гемоліз (визначуваний шляхом вивільнення в надосадову рідину гемоглобіну лізованих мишачих еритроцитів (СО55/59-/-), який вимірюють фотометрично) не покритих мишачих еритроцитів під впливом сироватки людини в діапазоні концентрацій сироватки. Випробувані сироватки включали термоінактивовану (НІ) МН, МВІ -/-,
МНЗ-антитіло проти МА5Р-2 і МН5 для контролю, як це описано в прикладі 33; на фігурі 43 графічно представлений відсоток виживання з перебігом часу (днів) після радіоактивного опромінення дозою 8,0 грей у контрольних мишей і у мишей, підданих лікуванню людським антитілом проти МА5БР-2 (тАБНб), як це описано в прикладі 34; на фігурі 44 графічно представлений час до виникнення оклюзії капілярів після ін'єкції ліпополісахариду (ЛПС) у МАБР-2-/- мишей і УМї мишей, із вказівкою відсотка мишей з тромбоутворенням, виміряним протягом 60 хвилин, який показує, що тромбоутворення у УМТ мишей виявляється через 15 хвилин, а через 60 хвилин тромбоутворення спостерігалося у 80 95
УЛ мишей; на відміну від цього, ні у однієї з МА5Р-2-/- мишей не було виявлено ніяких ознак тромбоутворення протягом 60 хвилин (логарифмічний ранговий критерій: р-0,0005), як це описано в прикладі 35; на фігурі 45 графічно представлений відсоток виживання контрольних мишей (п-5), яким вводили фізіологічний розчин, і мишей (п-5), яким вводили антитіло проти МАБР-2, в експериментальній моделі гемолітичного уремічного синдрому (НИБ), індукованого шигаподібним токсином/ліпополісахаридом (ЗТХ/ЛПС), з перебігом часу (годин), який показує, що всі контрольні миші гинули протягом 42 годин, тоді як, на відміну від цього, 100 95 мишей, яким вводили антитіло проти МА5Р-2, залишалися живими протягом усього часу проведення експерименту, як це описано в прикладі 36; на фігурі 46 графічно представлений відсоток мишей з ооклюзією капілярів в експериментальній моделі флуоресцеїну ізотіоціанат/декстран УФ-випромінювання (РІТС/Оєхігап ОМ) залежно від часу після індукування ушкодження, після введення ізотипного контрольного антитіла або людського антитіла тАбБНбЄ проти МАБ5БР-2 (10 мг/кг) за 16 годин і 1 годину перед ін'єкцією ЕІТС/Оехігап, як це описано в прикладі 37;
Зо на фігурі 47 графічно представлений час оклюзії у хвилинах для мишей, яким вводили людське антитіло проти МА5БР-2 (тАБНВ) і ізотипне контрольне антитіло, де дані наводяться у вигляді розкиду точок із середніми значеннями (горизонтальні лінії) і ліній середньоквадратичної помилки (вертикальні лінії). Статистичним критерієм, використовуваним для аналізу, був критерій Стьюдента для однієї вибірки; де символ """ позначає р-0,0129, як це описано в прикладі 37; і на фігурі 48 графічно представлений час до оклюзії у хвилинах для немутантних мишей,
МАБР-2 КО мишей і немутантних мишей, яким попередньо вводили внутрішньоочеревинно людське антитіло проти МА5БР-2 (тАБНВб) у дозі 10 мг/кг за 16 годин до і знову за 1 годину до індукування тромбозу в експериментальній моделі тромбозу в результаті ушкодження ендотеліальних клітин, викликаного РБІТС-декстран/випромінюванням світла 3 низькою інтенсивністю (800-1500), як це описано в прикладі 37; на фігурі 49 представлена крива Каплана-Мейєра, що показує відсоток мишей з тромбами залежно від часу при індукованій ЕІТС-декстраном тромботичній мікроангіопатії у мишей, яким вводили зростаючі дози людського антитіла, інгібуючого МАБР-2 (тАБНб), або ізотипного контрольного антитіла, як це описано в прикладі 39; на фігурі 50 графічно представлений середній час (у хвилинах) до виникнення тромбоутворення залежно від дози тАбБНнб ("р«0,01 у порівнянні з контролем), як це описано в прикладі 39; на фігурі 51 представлена крива Каплана-Мейєра, що показує відсоток мишей з оклюзією капілярів залежно від часу при індукованій РІТС-декстраном тромботичній мікроангіопатії у мишей, яким вводили зростаючі дози інгібуючого людського антитіла (птАбБНб) проти МА5БР-2 або ізотипне контрольне антитіло, як це описано в прикладі 39; на фігурі 52 графічно представлений середній час до виникнення оклюзії капілярів залежно від дози тАБНб ("р«0,05 у порівнянні з контролем), як це описано в прикладі 39; на фігурі 53ЗА графічно представлений рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності людського моноклонального антитіла (0М5646) проти МАБР-2 у специфічних умовах дослідження лектинового шляху, який показує, що ОМ5646 інгібує відкладення МАС, опосередковане лектиновим шляхом, з величиною ІСхо приблизно 1 нМ, як це описано в прикладі 40; бо на фігурі 538 графічно представлений рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності людського моноклонального антитіла (0М5646) проти МАБР-2 у специфічних умовах дослідження класичного шляху, який показує, що ОМ5646 не інгібує відкладення МАС, опосередковане класичним шляхом, як це описано в прикладі 40; на фігурі 53С графічно представлений рівень відкладення МАС у присутності або за відсутності людського моноклонального антитіла (0М5646) проти МАБР-2 у специфічних умовах дослідження альтернативного шляху, який показує, що ОМ5646 не інгібує відкладення
МАС, опосередковане альтернативним шляхом, як це описано в прикладі 40; на фігурі 54 графічно представлений фармакокінетичний (РК) профіль людського моноклонального антитіла (0М5646) проти МА5БР-2 у мишей, що показує концентрацію ОМ5646 (середнє значення п-З тварин/групи) залежно від часу після введення зазначеної дози, як це описано в прикладі 40; на фігурі 55А графічно представлена фармакодинамічна (РО) відповідь на людське моноклональне антитіло (0М5646) проти МА5Р-2, виміряна як зниження системної активності лектинового шляху у мишей після внутрішньовенного введення, як це описано в прикладі 40; на фігурі 558 графічно представлена фармакодинамічна (РО) відповідь на людське моноклональне антитіло (0М5646) проти МА5Р-2, виміряна як зниження системної активності лектинового шляху у мишей після підшкірного введення, як це описано в прикладі 40; на фігурі 56 графічно представлена інгібуюча дія антитіла проти МАБР-2 (0ОМ5646) у порівнянні з 5ХСК1 на аниз індуковане сироваткою крові відкладення С5р-9 на АОР-активованих клітинах НМЕС-1, як це описано в прикладі 41; на фігурі 57 графічно представлена інгібуюча дія антитіла проти МАБР-2 (0ОМ5646) у порівнянні з 5ХСК1 на аних індуковане сироваткою крові тромбоутворення на АОР-активованих клітинах НМЕС-1, як це описано в прикладі 42; на фігурі 58 графічно представлена середня зміна кількості тромбоцитів від початкового значення з перебігом часу (тижні) у суб'єктів, що страждають від персистуючої тромботичної мікроангіопатії, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НЕСТ-ТМА), після введення інгібуючого антитіла (0ОМ5646) проти МА5Р-2, як це описано в прикладі 46; на фігурі 59 графічно представлена середня зміна лактатдегідрогенази (ОН) від початкового значення з перебігом часу (тижні) у суб'єктів, що страждають від персистуючої
Зо тромботичної мікроангіопатії, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НЕЗСТ-ТМА), після введення інгібуючого антитіла (0М5646) проти МА5Р-2, як це описано в прикладі 46; і на фігурі 60 графічно представлена середня зміна гаптоглобіну від початкового значення з перебігом часу (тижні) у суб'єктів, що страждають ввід персистуючої тромботичної мікроангіопатії, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НЕСТ-ТМА), після введення інгібуючого антитіла (0М5646) проти МА5Р-2, як це описано в прикладі 46.
ОПИС ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗЕО ІЮО МО:1 кКДНК людського МАр19,
ЗЕО ІЮ МО:2 білок людського МАр!119 (з лідерною послідовністю),
ЗЕО ІЮ МО:З білок людського МАрт119 (зрілий),
ЗЕО ІЮ МО:4 кКДНК людської МА5Р-2,
ЗЕО ІЮ МО:5 білок людської МА5Р-2 (з лідерною послідовністю),
ЗЕО ІЮ МО:6 білок людської МА5Р-2 (зрілий),
ЗЕО ІЮ МО:7 геномна ДНК людської МА5Р-2 (екзони 1-6).
АНТИГЕНИ (ЩО НАЛЕЖАТЬ ДО ЗРІЛОГО БІЛКА МА5Р-2)
ЗЕО ІЮ МО:8 послідовність домену СОВІ (аа 1-121),
ЗЕО ІЮ МО:9 послідовність домену СОВЕСЕ (аа 1-166),
ЗЕО ІЮ МО:10 СОВЕСЕСИВІЇ (аа 1-293),
ЗЕО ІЮ МО:11 область ЕСЕ (аа 122-166),
ЗЕО ІЮ МО:12 домен серинпротеази (аа 429-671),
ЗЕО ІЮ МО:13 інактивований домен серинпротеази (аа 610-625 з мутацією Зегб18 в Аа),
ЗЕО ІЮ МО:14 ТРІ ОРКУУРЕРУЕСКІ (пептид домену СОВІ),
ЗЕО ІЮО МО:15 ТАРРСУКІ КІ МЕТНЕОГГ ЕІ ЗНІ СЕМОЄМКІ З5ОАКМІ АТІ СО (пептид домену
СОВІ),
ЗЕО ІЮ МО:16 ТЕКЗОУЗМ (ядро області, що зв'язує МВІ),
ЗЕО ІЮО МО:17 ГУБІ 551 0ІТЕАЗОМ5МЕКРЕТОЕ (ядро області, що зв'язує МВІ),
ЗЕО ІЮ МО:18 ІСЕСОМАРО (пептид ЕСБЕ),
ЗЕО ІЮ МО:19 АММІ САС ЕЗОСКОЗСКООЗОБАЇ М (ядро, що зв'язує серинпротеазу).
ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ бо ЗЕО ІЮ МО:20 повнорозмірна кКДНК МВІ.,
ЗЕО ІЮ МО:21 повнорозмірний білок МВІ.,
ЗЕО І МО:22 ОСК Х ОР (консенсус зв'язування),
ЗЕО Ір МО:23 ОСКІ С,
ЗЕО Ір МО24 18 СаО СРО СКІ СРО С,
ЗЕО ІЮ МО:25 СРО СРО СІ В СО СРО СКІ СРО СРО СРО,
ЗЕО Ір МО26 СКОСВраткаЕКаЕРООСІ НО! ОСРОСКІ РОС,
ЗЕО Ір МО27 СОМ/АОбБОСЕКОСАОСРОСРОСРОСКМОаРКИаЕОС,СОО (Н-фіколін людини),
ЗзБЕО Ір мМО28 асСОсвісовАдоаркКаЕАХаатчМаквсЕваРєОаєОоакКАаРєРОаРєРМаАОсСЕО (фіколін р35 людини),
ЗЕО ІЮ МО:29 ГОРА ЕІ РМКМТІКАМЕКРЕЇГМНІ (сайт розщеплення Са).
ІНГІБІТОРИ ЕКСПРЕСІЇ
5ЗЕО ІЮ МО:30 кКДНК домену СОВІ-ЕСЕ (нуклеотиди 22-680 в ЗЕО ІЮ МО:4),
ЗЕО І МО:З31 в-бапаСАСАССАтТаАлаасСТасСстаАССсСТоСтОасОС-3 нуклеотиди 12-45 в 5ЕО ІЮ МО:4, включаючи сайт ініціації трансляції МАБР-2 (смисловий),
ЗЕО І МО:32 5Б-аАСАТТАССТТССОаСтТоСОАСТОСААСИаАсАдО-3 нуклеотиди 361-396 в 5ЕБО ІЮ МО:4, кодуючі ділянку, що містить сайт зв'язування МА5Р-2 МВІ. (смисловий),
ЗЕО ІЮ МО:З3 5Б-АВйСАаСССтТаААТАСССАСИ,аССОТАТСССАДА-3' нуклеотиди 610-642 в 5ЕО ІЮ МО4, кодуючі ділянку, що містить домен СИВІЇ.
ПРАЙМЕРИ КЛОНУВАННЯ
ЗЕО Ір МО:34 СЙСЧСОАТССАТОАСОССТастаАСсСсто (5-РСЕ для СОВ),
ЗЕО І МО:35 СОПСААТТОСТАСаИстасАТА (3 РСЕ для СИВ),
ЗЕО ІЮ МО:36 ОБААТТССТАСАСОССОСТ (3 РСК для СОВІЕСБЕ),
ЗЕО ІЮ МО:37 ОБААТТССТАСТАСТОСАТ (3 РСК для СОВІЕСЕСИВІЇ),
ЗЕО ІЮ МО:38-47 являють собою праймери клонування для гуманізованих антитіл, 5ЕО ІЮ МО:48 являє собою пептидний зв'язок з 9 амінокислот.
ВЕКТОР ЕКСПРЕСІЇ
Зо ЗЕО ІЮ МО:49 являє собою мінігенну вставку МАЗР-2, 5ЕО ІЮ МО:50 являє собою КДНК МА5БР-2 миші,
ЗЕО ІЮ МО:51 являє собою мишачий білок МА5Р-2 (з лідерною послідовністю),
ЗЕО ІЮ МО:52 являє собою мишачий білок МА5Р-2 (зрілий),
ЗЕО ІЮ МО:53 являє собою КДНК МА5бР-2 щура,
ЗЕО ІЮ МО:54 являє собою щурячий білок МА5Р-2 (з лідерною послідовністю),
ЗЕО ІЮ МО:55 являє собою щурячий білок МА5Р-2 (зрілий),
ЗЕО ІЮ МО:56-59 являють собою олігонуклеотиди для сайтспрямованого мутагенезу МАЗР- 2 людини, які використовуються для одержання МА5БР-2А людини,
ЗЕО Ір МО:60-63 являють собою олігонуклеотиди для сайтспрямованого мутагенезу МАЗР- 2 миші, які використовуються для одержання МА5Р-2А миші,
ЗЕО Ір МО:64-65 являють собою олігонуклеотиди для сайтспрямованого мутагенезу МАЗР- 2 щура, які використовуються для одержання МА5Р-2А щура,
ЗБО 10 МОб66 ДНК, кодуюча варіабельну область важкого ланцюга (МН) 17020 асз5мНн2г1М11Мм. (05646) (без сигнального пептиду),
ЗБО 10 МО:67 поліпептид варіабельної області (МН) важкого ланцюга 17020 асзБумнгт1мМ11МмІ (ОмМ5646),
ЗЕО ІЮ МО:68 поліпептид варіабельної області (МН) важкого ланцюга 17М1бтс,
ЗБО ОО МОб69: ДНК, кодуюча варіабельну область легкого ланцюга (МІ) 17020 асзБумнгт1мМ11МмІ (ОмМ5646),
ЗБО 10 0 МО:70: поліпептид варіабельної області легкого ланцюга (М) 17020 асзБумнгт1мМ11МмІ (ОмМ5646),
ЗЕО ІЮ МО:71: поліпептид варіабельної області легкого ланцюга (МІ) 17М16 ас17М9.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід оснований на зробленому авторами винаходу вражаючому відкритті можливості інгібування опосередкованого МАЗР-2 лектинового шляху, не зачіпаючи при цьому класичний шлях. У даному винаході також описане використання МА5Р-2 як терапевтичної мішені для інгібування ушкодження клітин, пов'язаного з опосередкованим лектином шляхом активації комплементу, не зачіпаючи при цьому компонент класичного (С14д-залежного) шляху імунної системи. (510) Ї. ВИЗНАЧЕННЯ
Якщо у винаході не визначене інакше, то всі використовувані у винаході терміни мають значення, які є загальноприйнятими для звичайних фахівців у тій галузі, до якої належить даний винахід. Нижченаведені визначення представлені для того, щоб прояснити значення термінів, які використовуються в описі і у формулі винаходу для розкриття даного винаходу.
Використовуваний у винаході термін "МАБР-2-залежна активація комплементу" включає
МА5БР-2-залежну активацію лектинового шляху, яка відбувається у фізіологічних умовах (тобто в присутності Са-), що приводить до утворення СЗ-конвертази С4р2а лектинового шляху і, після акумуляції СЗБЮ, продукту розщеплення С3, до утворення С5-конвертази С4р2га(Сзр)п, яка, як було з'ясовано, є головною причиною опсонізації.
Використовуваний у винаході термін "альтернативний шлях" стосується активації комплементу, яка ініціюється, наприклад, зимозаном клітинних стінок грибів і дріжджів, ліпополісахаридом (ЛПС) зовнішніх мембран грамнегативних бактерій і кролячими еритроцитами, а також багатьма чистими полісахаридами, кролячими еритроцитами, вірусами, бактеріями, пухлинними клітинами тварин, паразитами і ушкодженими клітинами, і яка, як прийнято вважати, є результатом спонтанної протеолітичної генерації СЗБ з фактора комплементу С3.
Використовуваний у винаході термін "лектиновий шлях" стосується активації комплементу, яка виникає в результаті специфічного зв'язування сироваткових і несироваткових вуглеводзв'язуючих білків, що включають мананзв'язуючий лектин (МВІ), СІ -11 ї фіколіни (Н- фіколін, М-фіколін або І -фіколін).
Використовуваний у винаході термін "класичний шлях" стосується активації комплементу, яка ініціюється антитілом, зв'язаним із чужорідною частинкою, і для якої потрібне зв'язування молекули розпізнавання С14.
Використовуваний у винаході термін "МАБР-2-інгібуючий засіб" стосується засобу, який зв'язує або безпосередньо взаємодіє з МА5Р-2 і ефективно інгібує МА5БР-2-залежну активацію комплементу і який включає антитіла проти МА5Р-2 і їх фрагменти, що зв'язують МА5Р-2, природні і синтетичні пептиди, низькомолекулярні сполуки, розчинні МА5БР-2 рецептори, інгібітори експресії і виділені природні інгібітори, а також включають пептиди, які конкурують з
МАБР-2 за зв'язування з іншою молекулою розпізнавання (наприклад, МВІ, Н-фіколін, М-
Зо фіколін або І -фіколін) у лектиновому шляху, але не включають антитіла, які зв'язуються з іншими такими молекулами розпізнання. МА5Р-2-інгібуючі засоби, застосовувані в способі винаходу, можуть знижувати МАЗР-2-залежну активацію комплементу більше ніж на 20 95, наприклад більше ніж на 50 95, наприклад більше ніж на 90 95. В одному варіанті здійснення,
МА5БР-2-інгібуючий засіб знижує МА5БР-2-залежну активацію комплементу більше ніж на 90 95 (тобто у результаті МА5Р-2-залежна активація комплементу становить тільки 10 95 або менше).
Використовуваний у винаході термін "антитіло" охоплює антитіла і їх фрагменти, одержані від будь-якого ссавця, продукуючого антитіла (наприклад, миші, щура, кролика і примата, у тому числі людини), або з гібридом, фаговим відбором, рекомбінантною експресією або від трансгенних тварин (або іншими методами продукування антитіл або їх фрагментів), які специфічно зв'язуються з таргетним поліпептидом, таким як, наприклад, МА5Р-2, поліпептиди або з їх частини. Передбачається, що термін "антитіло" не накладає обмеження на джерела походження антитіла або на спосіб його одержання (наприклад, за допомогою гібридоми, фагового відбору, рекомбінантної експресії, трансгенних тварин, пептидного синтезу і так далі).
Приклади антитіл включають поліклональні, моноклональні і рекомбінантні антитіла; поліспецифічні, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, триспецифічні антитіла); гуманізовані антитіла; мишачі антитіла; химерні, мишачо-людські, мишачо-приматові, приматово-людські моноклональні антитіла і антиідіотипічні антитіла, і вони можуть являти собою будь-яке інтактне антитіло або його фрагмент. Використовуваний у винаході термін "антитіло" охоплює не тільки інтактні поліклональні або моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як аАБ, Раб, Раб", Е(абр)», Ем), одноланцюжкові фрагменти (5СЕм), їх синтетичні варіанти, природні варіанти, гібридні білки, що включають частину антитіла з антигензв'язувальним фрагментом з необхідною специфічністю, гуманізовані антитіла, химерні антитіла і будь-яку іншу модифіковану конфігурацію молекули імуноглобуліну, яка включає антигензв'язувальний сайт або фрагмент (епітопрозпізнавальний сайт) з необхідною специфічністю. "Моноклональне антитіло" позначає гомогенну популяцію антитіл, у якій моноклональне антитіло складається з амінокислот (природних і неприродних), що беруть участь у селективному зв'язуванні епітопа. Моноклональні антитіла є високоспецифічними відносно таргетного антигену. Термін "моноклональне антитіло" охоплює не тільки інтактні бо моноклональні антитіла і повнорозмірні моноклональні антитіла, але також їх фрагменти (такі як
Раб, Раб, Р(аб)», Ем), одноланцюжкові фрагменти (ЗсЕм), їх варіанти, гібридні білки, що включають антигензв'язувальну частину, гуманізовані моноклональні антитіла, химерні моноклональні антитіла і будь-яку іншу модифіковану конфігурацію молекули імуноглобуліну, яка включає антигензв'язувальний сайт або фрагмент (епітопрозпізнавальний сайт) з необхідною специфічністю і здатністю зв'язувати епітоп. Передбачається, що термін "моноклональне антитіло" не накладає обмеження на джерела походження антитіла або на спосіб його одержання (наприклад, за допомогою гібридоми, фагового відбору, рекомбінантної експресії, трансгенних тварин і так далі). Термін включає в себе всі імуноглобуліни, а також їх фрагменти і так далі, описані вище для терміна "антитіло".
Використовуваний у винаході термін "фрагмент антитіла" позначає частину, яка одержана з повнорозмірного антитіла або належить до повнорозмірного антитіла, такого як, наприклад, антитіло проти МА5Р-2, і ця частина звичайно включає антигензв'язувальну або варіабельну область антитіла. Ілюстративними прикладами фрагментів антитіл є фрагменти Раб, РарБ;,
Кабр)»2, К(аб'» і Ем, зсЕм-фрагменти, діатіла, лінійні антитіла, одноланцюжкові молекули антитіл і мультиспецифічні антитіла, утворені із фрагментів антитіл.
Використовуваний у винаході термін "одноланцюжковий Ем" або "зсЕм"-фрагмент антитіла включає МнН- і Мі -домени антитіла, де ці домени присутні в одному поліпептидному ланцюзі.
Звичайно, Ем поліпептид додатково включає поліпептидний лінкер між УН- і Мі -доменами, який дозволяє 5сЕм утворювати необхідну структуру для зв'язування антигену.
Використовуване у винаході "химерне антитіло" являє собою рекомбінантний білок, який містить варіабельні домени і ділянки, що визначають комплементарність, одержаний з антитіла видів тварин, що не належать до людського роду (наприклад, гризунів), у той час як іншу частину молекули антитіла одержують із людського антитіла.
Використовуване у винаході "гуманізоване антитіло" являє собою химерне антитіло, яке включає мінімальну послідовність, відповідну специфічним ділянкам, що визначають комплементарність, одержану з нелюдського імуноглобуліну, яку трансплантують у каркас людського антитіла. Гуманізовані антитіла звичайно являють собою рекомбінантні білки, у яких тільки ділянки антитіла, що визначають комплементарність, мають походження не від людини.
Використовуваний у винаході термін "мананзв'язуючий лектин" ("МВІ") є еквівалентним
Зо терміну "мананзв'язуючий білок" ("МВР").
Використовуваний у винаході термін "мембраноатакуючий комплекс" ("МАС") стосується комплексу п'яти кінцевих компонентів комплементу (С5б разом з Сб, С7, С8 ї С9), який впроваджується усередину мембран і руйнує їх (його також позначають С5Б-9).
Використовуваний у винаході термін "суб'єкт" включає всіх ссавців, у тому числі, без обмеження, людей, приматів, собак, кішок, коней, овець, кіз, корів, кроликів, свиней і гризунів.
Використовувані у винаході залишки амінокислот мають наступні позначення: аланін (Аїа;
А), аспарагін (А5п; М), аспарагінова кислота (Ар; 0), аргінін (Агу; К), цистеїн (Сув; С), глутамінова кислота (Сіи; Е), глутамін (Сп; 0), гліцин (Су; С), гістидин (Нів; Н), ізолейцин (Пе; І), лейцин (Гени; І), лізин (Гуз; К), метіонін (Ме; М), фенілаланін (Рпе; Е), пролін (Рго; Р), серин (Зег; 5), треонін (Тпг; Т), триптофан (Тгр; М), тирозин (Туг; У) і валін (мМаї; М).
У найбільш широкому розумінні, природні амінокислоти можуть бути підрозділені на групи на основі хімічних характеристик бічного ланцюга відповідної амінокислоти. Під "гідрофобною" амінокислотою мають на увазі будь-яку з Пе, Гей, Меї, Ре, Тгр, Туг, Маї, Аа, Су або Рго. Під "гідрофільною" амінокислотою мають на увазі будь-яку з Су, Азп, СіІп, Зег, Тпг, Абр, См, ГГ ув,
Аг і Ні5. Цей поділ амінокислот на групи може бути додатково розбитий на підкласи наступним чином. Під "незарядженою гідрофільною" амінокислотою мають на увазі будь-яку з Зег, ТАг, Авп або СіІп. Під "амінокислотою з кислотними властивостями" мають на увазі Сі або Авр. Під "амінокислотою з основними властивостями" мають на увазі І ух, Агуд або Нів.
Використовуваний у винаході термін "консервативне заміщення амінокислоти" може бути проілюстрований заміщенням серед амінокислот усередині кожної з наступних груп: (1) гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин, (2) фенілаланін, тирозин і триптофан, (3) серин і треонін, (4) аспартат і глутамат, (5) глутамін і аспарагін, (6) лізин, аргінін і гістидин.
Використовуваний у винаході термін "олігонуклеотид" стосується олігомеру або полімеру рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або їх міметиків. Цей термін також охоплює олігонуклеїнові основи, що складаються з природних нуклеотидів, цукрів і ковалентних міжнуклеозидних зв'язків (між головними ланцюгами), а також олігонуклеотиди, що мають синтетичні модифікації.
Використовуваний у винаході термін "епітоп" стосується сайта на білку (наприклад, на білку людської МАБР-2), який зв'язується антитілом. "Епітопи, що перекриваються" включають щонайменше один (наприклад, два, три, чотири, п'ять або шість) залишок (залишків) звичайної амінокислоти, що включає лінійний і нелінійний епітопи.
Використовувані у винаході терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" є взаємозамінними і позначають будь-який зв'язаний пептидом ланцюг амінокислот, незалежно від довжини або посттрансляційної модифікації. Описаний у винаході біллк МАЗР-2 може містити немутантні білки або може являти собою немутантні білки, або може бути варіантами, які не мають більше ніж 50 (наприклад, не більше ніж 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 або 50) консервативних заміщень амінокислот. Консервативні заміщення звичайно включають заміщення усередині наступних груп: гліцин їі аланін; валін, ізолейцин і лейцин; аспарагінова кислота і глутамінова кислота; аспарагін, глутамін, серин і треонін; лізин, гістидин і аргінін; і фенілаланін і тирозин.
У деяких варіантах здійснення, білок людської МАБР-2 може мати амінокислотну послідовність, яка тотожна білку людської МАБР-2, що має амінокислотну послідовність, описану в послідовності 560 ІЮ МО:5, на 70 95 або більше ніж на 70 95 (наприклад, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 Об).
У деяких варіантах здійснення, пептидні фрагменти можуть мати довжину, що складає щонайменше 6 (наприклад, щонайменше 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 або 600 або більше) амінокислотних залишків (наприклад, щонайменше 6 залишків замінних амінокислот, описаних у послідовності «ЕО ІЮО МО:5). У деяких варіантах здійснення, фрагмент антигенного пептиду білка людської МАЗР-2 має довжину менше ніж 500 (наприклад, менше ніж 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, Аб, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 або 6) амінокислотних залишків (наприклад, менше ніж 500 залишків замінних амінокислот, описаних у послідовності ЗЕО ІЮ МО:5).
Відсоток (95) тотожності амінокислотної послідовності визначається як відсоток амінокислот у послідовності, що представляє інтерес, які ідентичні амінокислотам в еталонній послідовності, після вирівнювання послідовностей і введення розривів, у випадку необхідності, для досягнення максимального відсотка тотожності послідовності. Вирівнювання з метою визначення відсотка тотожності послідовності може досягатися різними методами, які відомі фахівцю в цій галузі, наприклад шляхом використання загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програмне забезпечення ВІАБТ, ВІ АБТ-2, АПОМ, АПОМ-2 або
Медаїїдп (ОМАЗТАК). Відповідні параметри для вимірювання вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по повній довжині порівнюваних послідовностей, можуть бути визначені добре відомими методами.
І. ЗАГАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Лектини (МВ, М-фіколін, Н-фіколін, І -фіколін ї СІ -11) являють собою специфічні молекули розпізнавання, які ініціюють вроджену систему комплементу, і ця система включає в себе лектиновий шлях ініціації і асоційовану з ним петлю ампліфікації кінцевого шляху, яка ампліфікує ініційовану лектином активацію кінцевих ефекторних молекул. Сід являє собою специфічну молекулу розпізнавання, яка ініціює набуту систему комплементу, і ця система включає класичний шлях ініціації і асоційовану з ним петлю ампліфікації кінцевого шляху, яка ампліфікує С1д-ініційовану активацію кінцевих ефекторних молекул. Автори даного винаходу називають ці дві основні системи активації комплементу лектинзалежною системою комплементу і С1д-залежною системою комплементу, відповідно.
Система комплементу, крім її головної ролі в імунному захисті, сприяє ушкодженню тканини при багатьох клінічних станах. Тому, існує гостра необхідність у створенні терапевтично ефективних інгібіторів комплементу для запобігання цим негативним наслідкам. Виявлення можливості інгібування лектинового шляху, опосередковуваного МАБР-2, без порушення класичного шляху дозволяє зробити висновок про те, що було б дуже бажаним забезпечувати специфічне інгібування тільки системи активації комплементу, яка викликає конкретну патологію, але не пригнічує повністю здатності комплементу до імунного захисту. Наприклад, при патологічних станах, при яких активація комплементу опосередковується переважно лектинзалежною системою комплементу, було б переважно, щоб відбувалося специфічне інгібування тільки цієї системи. Це дозволяло б не зачіпати системи С1ід-залежної активації комплементу, яка регулює процесинг імунного комплексу і сприяє захисту організму-хазяїна від бо інфекції.
Переважним білковим компонентом-мішенню при розробці терапевтичних засобів для специфічного інгібування лектинзалежної системи комплементу є МАБР-2. Із усіх відомих білкових компонентів лектинзалежної системи комплементу (МВІ, Н-фіколіну, М-фіколіну, І - фіколіну, МАЗР-2, Сб2-С9, фактора В, фактора 0 і пропердину), тільки МА5Р-2 є як унікальною, так і необхідною для функціонування лектинзалежної системи комплементу. Лектини (МВ, Н- фіколін, М-фіколін, І -фіколін ії СІ-11) також є унікальними компонентами лектинзалежної системи комплементу. Однак втрата будь-якого одного з лектинових компонентів необов'язково буде приводити до інгібування активації системи, що обумовлено надлишковою кількістю лектину. Для гарантії інгібування активації лектинзалежної системи комплементу необхідно інгібувати всі п'ять лектинів. Крім того, оскільки також відомо, що МВІ і фіколіни мають опсонінову активність, що не залежить від комплементу, то інгібування функції лектину буде приводити до втрати цього цінного механізму захисту організму-хазяїна від інфекції. На відміну від цього, залежна від комплементу опсонінова активність лектину буде зберігатися незачепленою, якщо мішенню для інгібування активації лектинового шляху була МАБ5Р-2.
Додатковою перевагою МАБР-2 як терапевтичної мішені для інгібування активації лектинзалежної системи комплементу є те, що концентрація МА5Р-2 у плазмі, у порівнянні з будь-якими іншими білками комплементу, є найбільш низькою (-500 нг/мл), і, тому, для досягнення повного інгібування будуть достатніми, відповідно, низькі концентрації високоафінних інгібіторів МАБР-2 (Моїег Кгівієпзеп М. еї аї.,.). Іттипої. Меїноав5, 282:159-167, 2003).
І. РОЛЬ МАБЗР-2 ПРИ ТРОМБОТИЧНИХ МІКРОАНГІОПАТІЯХ І ТЕРАПЕВТИЧНІ МЕТОДИ
ЗАСТОСУВАННЯ МАЗР-2-ІНГІБУЮЧИХ ЗАСОБІВ
Загальний опис
Тромботична мікроангіопатія (ТМА) являє собою патологію, що характеризується наявністю тромбів у дрібних кровоносних судинах (Веп? К. еї а!., Си. Оріп. Мерпгої. Нурегієп5. 19(3):242-7 (2010)). Вважають, що стрес або ушкодження основного ендотелію судин є основною причиною розвитку цієї патології. Клінічна картина і дані лабораторних досліджень ТМА включають тромбоцитопенію, анемію, пурпуру і ниркову недостатність. Класичними прикладами ТМА є гемолітичний уремічний синдром (НО) і тромботична тромбоцитопенічна пурпура (ТТР).
Зо Характерною патологічною особливістю, що лежить в основі ТМА, є активація тромбоцитів і утворення мікротромбів у дрібних артеріолах і венулах. Активація комплементу, ініційована, щонайменше частково, у результаті ушкодження або стресу ендотелію мікросудин, також залучена при інших видах ТМА, що включають катастрофічний антифосфоліпідний синдром (САР5Б), системну хворобу Дегоса і ТМА на фоні раку, на фоні протиракової терапії і на фоні трансплантації.
Прямий доказ патологічної ролі комплементу в багатьох випадках нефритів надають дослідження пацієнтів з генетично обумовленою недостатністю специфічних компонентів комплементу. У ряді досліджень був показаний зв'язок ушкодження нирок з дефіцитом регуляторного фактора комплементу Н (Айції В.Н., Мерпгої. 14:1045-1053, 2000; І ему М. еї аї.,
Кідпеу Іпі. 30:949-56, 1986; РісКегіпа М.О. єї а!., Маї. Сепеї. 31:424-68, 2002). Дефіцит фактора Н приводить до низьких рівнів у плазмі фактора В ії СЗ3 внаслідок пов'язаного з активацією витрачання цих компонентів. Циркулюючі в крові рівні С5Б6-9 також підвищені в сироватці цих пацієнтів, непрямо вказуючи на активацію комплементу. Мембранозно-проліферативний гломерулонефрит (МРОМ) ії ідіопатичний гемолітичний уремічний синдром (НИБ) пов'язані з дефіцитом фактора Н або мутаціями фактора Н. Дефіцитні по фактору Н свині (дапзеп .).Н. еї а!., Кідпеу Іпї. 53:331-49, 1998) і нокаутні по фактору Н миші (РісКегіпуд М.С., 2002) демонструють
МРОМ подібні симптоми, що підтверджує важливість фактора Н при регуляції комплементу.
Дефіцит інших компонентів комплементу пов'язаний із захворюванням нирок на фоні розвитку системного червоного вовчака (51 Є) (Маїрогі М.9., баміез еї аї., Апп. М.У. Асай. сі. 815:267-81, 1997). Дефіцит Стд, С4 ії С2 різко провокує розвиток 5ІЕ через механізми, що належать до порушеного виведення імунних комплексів і апоптичного матеріалу. У багатьох із цих 51 Е- пацієнтів виникає вовчаковий нефрит, що характеризується відкладенням імунних комплексів на всій поверхні клубочка. анои5
Атиповий гемолітичний уремічний синдром (ани5) є частиною групи станів, називаних "тромботичними мікроангіопатіями". При атиповій формі НОЗ (ани5), захворювання пов'язане з порушеною регуляцією комплементу і може бути або спорадичним, або спадковим. Спадкові випадки аниИЗ пов'язані з мутаціями в генах, кодуючих активацію комплементу або регуляторні білки комплементу, включаючи фактор комплементу Н, фактор І, фактор В, мембранний 60 кофакторний білок СО46, а також білок 1, подібний з комплементом фактора Н (СЕНКТІ), і білок
3, подібний з комплементом фактора Н (СЕНРЗ) (2ірієї! Р.Р. єї аї., Ріо Сепеїйсв5 З(3):641 (2007)).
Єдиною характерною рисою цього різнотипного масиву генетичних мутацій, пов'язаних з анив, є схильність до підвищеної активації комплементу на поверхні клітин або тканин. Тому, один аспект даного винаходу включає лікування пацієнта, що страждає від ани5, який пов'язаний з дефіцитом фактора Н, шляхом введення ефективної кількості МА5Р-2-інгібуючого засобу. Інший аспект даного винаходу включає лікування пацієнта, що страждає від аниз, який пов'язаний з дефіцитом фактора І, фактора В, мембранного кофакторного білка СО46, СЕНК1 або СЕНЕЗ, шляхом введення ефективної кількості МА5Р-2-інгібуючого засобу.
Нещодавно був досягнутий значний прогрес у розумінні молекулярної патофізіології, що лежить в основі підвищеної активації комплементу при аниз, викликаної різнотипним набором мутантних факторів комплементу. Цей механізм найкраще вивчений для мутацій фактора Н.
Фактор Н являє собою присутній у великій кількості білок сироватки, що включає 20 доменів коротких консенсусних повторів (СК), які діють як негативний регулятор активації комплементу як у розчині, так і на поверхні клітин організму-хазяїна. Він таргетує активовану форму ССЗ і, разом з фактором І і іншими кофакторами, промотує його інактивацію, передбачаючи наступну активацію комплементу. Для ефективного контролю активації комплементу на поверхні клітин організму-хазяїна, необхідна взаємодія фактора Н із клітинами організму-хазяїна, яка опосередковується ЗСК-доменами 16-20. Усі описані до даного часу мутації фактора Н, пов'язані з ани5, групуються в С-термінальній області, що охоплює 5СК-домени 16-20. Ці мутантні білки фактора Н повністю функціональні при контролюванні активації СЗ у розчині, але не здатні взаємодіяти з поверхнею клітин організму-хазяїна і, отже, не можуть контролювати активацію СЗ на поверхні клітин (Ехр. Мей. 204(6):1249-56 (2007)). Таким чином, конкретні мутації фактора Н пов'язані з анив, оскільки мутантний білок фактора Н не може взаємодіяти з поверхнями клітин організму-хазяїна і, тому, не може ефективно модулювати зі зниженням активацію комплементу на поверхнях клітин організму-хазяїна, у тому числі на ендотелії мікросудин. У результаті, після того, як відбулася вихідна активація СЗ3, наступна активація комплементу на поверхні ендотелію капілярів не стає слабкішою у пацієнтів з мутаціями фактора Н. Ця неконтрольована активація комплементу зрештою приводить до прогресуючого ушкодження ендотелію судин, потім до агрегації тромбоцитів і мікроваскулярної коагуляції, і
Зо гемолізу, викликаного прямим тиском при проходженні еритроцитів через частково оклюзовані мікросудини. Таким чином, хворобливі прояви анизвз і його клінічна картина і дані лабораторних досліджень безпосередньо пов'язані з порушенням негативного регулювання комплементу на поверхні ендотелію мікросудин.
Аналогічно, мутації фактора Н, мутації із втратою функції в негативному модуляторі комплементу факторі І і мембранному кофакторному білку (СО046) також пов'язані з аниз.
Протилежне спостерігалося для фактора В, білка С3, у випадку яких було виявлено, що аниз пов'язаний з мутаціями із набуттям нових функцій у цих білках (Реаїаїг. Мерпгої. 25(12):2431-42 (2010)). Таким чином, велика кількість зведених воєдино даних безпосередньо пов'язує активацію комплементу з патогенезом аниз. Цю точку зору найбільш переконливо підтверджує терапевтична ефективність екулізумабу, моноклонального антитіла, яке блокує кінцевий білок комплементу С5 при лікуванні ани5.
У той час як важлива роль комплементу як ефекторного механізму при аНИО5 є загальновизнаною, тригери, що ініціюють активацію комплементу, і залучені в активацію молекулярні сигнальні шляхи залишаються поки невивченими. Не у всіх індивідуумів, що мають описані вище мутації, розвивається аНИ5. У дійсності, дослідження спадкових факторів дозволили зробити висновок, що частота прояву гена аниз становить тільки «50 95 (Апп. Нит.
Сепеї. 74(1):117-26 (2010)) Перебіг захворювання вказує на те, що анизЗ більш часто розвивається після ініціюючої події, такої як спалах інфекції або ушкодження. Добре відомо, що збудники інфекції активують систему комплементу. За відсутності вже існуючого набутого імунітету, активація комплементу збудниками інфекції може бути ініційована, насамперед, по лектиновому шляху. Таким чином, лектиновий шлях активації, що запускається інфекцією, може являти собою ініціювання тригера для наступної патологічної ампліфікації активації комплементу у ани5-схильних індивідуумів, яка може зрештою приводити до розвитку хвороби.
Відповідно, інший аспект даного винаходу включає лікування пацієнта, що страждає від анОз5 на фоні інфекції, шляхом введення ефективної кількості МАЗР-2-інгібуючого засобу.
Активувати комплемент по лектиновому шляху будуть і інші форми ушкодження тканини організму-хазяїна, зокрема ушкодження ендотелію судин. Клітини ендотелію судин людини піддаються окисному стресу, наприклад, у відповідь на експресію поверхневих фрагментів, які зв'язують лектини і активують лектиновий шлях комплементу (Ат у. Раїпої. 156(6):1549-56 бо (2000)). Ушкодження судин після ішемії/реперфузії також активує комплемент по лектиновому шляху іп мімо (Зсапа, у. Іттипої. 61(5):426-34 (2005)). Активація лектинового шляху в цих умовах приводить до патологічних наслідків для організму-хазяїна, і інгібування лектинового шляху шляхом блокування МАБР-2 запобігає наступному ушкодженню тканини організму- хазяїна і несприятливому результату (Зспуаеріе РМАБ, 2011).
Таким чином, добре відомо, що інші процеси, які провокують аниб5, також активують лектиновий шлях комплементу. Тому, лектиновий шлях може, очевидно, представляти механізм вихідної активації комплементу, який невідповідним чином і нерегульовано підсилюється у індивідуумів, генетично схильних до аниз, тим самим ініціюючи патогенез ани5. Виходячи із цього, можна очікувати, що засоби, які блокують активацію комплементу по лектиновому шляху, у тому числі антитіла проти МА5Р-2, повинні запобігати розвитку захворювання або зменшувати загострення у індивідуумів, схильних до виникнення аНИЗ5.
На підтвердження цієї концепції, у нещодавніх дослідженнях був ідентифікований пневмокок як важливий етіологічний фактор при педіатричних випадках аНИ5 (МерпгоїІоду (Сатшоп), 17:48- 52 (2012); Реадіаї Іпїесї Оів У. 30(9):736-9 (2011)). Очевидно, ця особлива етіологія має несприятливий прогноз із високою смертністю і тривалим перебігом хвороби. Причому, ці випадки включали некишкові інфекції, що приводять до проявів мікроангіопатії, уремії і гемолізу без доказу супутніх мутацій у генах комплементу, про які відомо, що вони провокують 2Н!И5.
Важливо відзначити, що пневмокок є особливо ефективним при активації комплементу і діє таким чином переважно через лектиновий шлях. Тому, передбачається, що у випадках некишкового НИБ5, пов'язаного із пневмококовою інфекцією, прояви мікроангіопатії, уремії і гемолізу будуть обумовлені переважно активацією лектинового шляху, і можна очікувати, що засоби, які блокують лектиновий шлях, у тому числі антитіла проти МА5Р-2, будуть запобігати розвитку аниз і зменшувати тяжкість захворювання у цих пацієнтів. Відповідно, інший аспект даного винаходу включає лікування пацієнта, що страждає від некишкового анНив5, який пов'язаний із пневмококовою інфекцією, шляхом введення ефективної кількості МА5Р-2- інгібуючого засобу.
Відповідно до вищевикладеного, у деяких варіантах здійснення, у випадку суб'єкта, що має ризик розвитку ниркової недостатності, пов'язаної з аниб5, пропонується спосіб зниження ймовірності розвитку аНнОЗ або розвитку ниркової недостатності, пов'язаної з аниб5, який
Зо включає введення кількості МА5Р-2-інгібуючого засобу протягом періоду часу, ефективного для полегшення або запобігання нирковій недостатності у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає стадію визначення, чи має суб'єкт ризик розвитку ани5 до прояву будь-яких симптомів, пов'язаних з анНи5. В інших варіантах здійснення, спосіб включає визначення, чи має суб'єкт ризик розвитку аниз після прояву щонайменше одного або більше симптомів, що вказують на аниз (наприклад, наявність анемії, тромбоцитопенії й/або ниркової недостатності) і/або наявність тромботичної мікроангіопатії в біоптаті, взятому у суб'єкта.
Визначення, чи має суб'єкт ризик розвитку аниз5, включає визначення, чи має суб'єкт генетичну схильність до розвитку анИО5, яке може проводитися шляхом оцінки генетичної інформації (наприклад, з бази даних, що містить генотип суб'єкта) або шляхом проведення щонайменше одного генетичного скринінгу суб'єкта для визначення присутності або відсутності генетичного маркера, пов'язаного з аниз (тобто визначення присутності або відсутності генетичної мутації, пов'язаної з аниз, у генах, кодуючих фактор комплементу Н (СЕН), фактор І (СЕ), фактор В (СЕВ), мембранний кофакторний білок СО46, С3, білок 1, подібний з комплементом фактора Н (СЕНК'Т), або ТНВО (кодуючий антикоагулянтний білок тромбодулін), або білок 3, подібний з комплементом фактора Н (СЕНЕКЗ), або білок 4, подібний з комплементом фактора Н (СЕНКЯ)), або шляхом секвенування геному або ген-специфічного аналізу (наприклад, аналізу методом полімеразної ланцюгової реакції (РСК)), іли або шляхом визначення, чи має суб'єкт випадки ани5 у родині. Методи генетичного скринінгу присутності або відсутності генетичної мутації, пов'язаної з ани5, добре відомі і описані, наприклад, у публікації Могі5 М. еї аї. "Агурісаї!
Нетоїуїс-Огетіс Зупаготе", 2007, Мом 16 (Орадаїей 2011 Маг 10). Іп: Радоп В.А., Віга Т.О., боїап
С.В. єї аї., єдіюгв. Ссепегемівемув'м, Зеаше (МА): Опімегейу ої Мазпіпдюп, Зеаше.
Наприклад, загальна частота прояву гена при захворюванні, при якому відбуваються мутації фактора комплементу Н (СЕН), становить 48 95, а прояв гена для мутацій в СО46 становить 53 96, для мутацій в СЕРІЇ становить 50 905, для мутацій в СЗ становить 56 95 і для мутацій в ТНВО становить 64 95 (Саргіоїї У. еї аї., Віоса, 108:1267-79 (2006); Могів евї аї!., Сііп. У. Ат. ос. Мернго). 5:1844-59 (2010)). Як описано в згаданій вище публікації Саргіоїї еї аї. (2006), у значного числа індивідуумів з мутацією у факторі комплементу Н (СЕН) ніколи не розвивається ани»х, і висловлене припущення, що субоптимальна активність СЕН у цих індивідуумів є достатньою для захисту організму-хазяїна від ефектів активації комплементу у фізіологічних умовах, однак, 60 субоптимальна активність СЕН є недостатньою для запобігання відкладенню СЗ3Б на клітинах ендотелію судин при впливі засобу, який активує комплемент, продукуючий більш високі кількості СЗБ, ніж нормальні.
Відповідно, в одному варіанті здійснення, пропонується спосіб інгібування МАЗР-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає від атипового гемолітичного уремічного синдрому, що не залежить від фактора Н, або має ризик розвитку атипового гемолітичного уремічного синдрому, що не залежить від фактора Н, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, ефективну для інгібування МА5Р-2- залежної активації комплементу. В іншому варіанті здійснення, пропонується спосіб інгібування
МА5Р-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що має ризик розвитку фактор Н-залежного атипового гемолітичного уремічного синдрому, який включає періодичне обстеження суб'єкта з метою визначення наявності або відсутності у нього анемії, тромбоцитопенії або підвищення креатиніну, і лікування за допомогою МА5Р-2-інгібуючого засобу після визначення наявності анемії, тромбоцитопенії або підвищення креатиніну. В іншому варіанті здійснення, пропонується спосіб зниження ймовірності того, що суб'єкт, що має ризик розвитку фактор Н-залежного 28Н!И5, буде страждати від клінічних симптомів, пов'язаних з аниб5, який включає введення МА5Р-2- інгібуючого засобу до або під час, або після події, про яку відомо, що вона пов'язана з інціюванням анизЗ клінічних симптомів, наприклад тривалого впливу лікарського засобу (наприклад, хіміотерапії), інфекції (наприклад, бактеріальної інфекції), злоякісного новоутворення, ушкодження, трансплантації органа або тканини і вагітності.
В одному варіанті здійснення, пропонується спосіб зниження ймовірності того, що суб'єкт, який має ризик розвитку анивб, буде страждати від клінічних симптомів, пов'язаних з анив, який включає періодичне обстеження суб'єкта з метою визначення наявності або відсутності у нього анемії, тромбоцитопенії або підвищення креатиніну, і лікування за допомогою МА5БР-2- інгібуючого засобу після визначення наявності анемії, тромбоцитопенії або підвищення креатиніну.
В іншому варіанті здійснення, пропонується спосіб зниження ймовірності того, що суб'єкт, який має ризик розвитку анивб, буде страждати від клінічних симптомів, пов'язаних з анив, який включає введення МА5Р-2-інгібуючого засобу до або під час, або після події, про яку відомо, що вона пов'язана з ініціюванням клінічних симптомів аниОЗз, наприклад тривалого впливу
Зо лікарського засобу (наприклад, хіміотерапії), інфекції (наприклад, бактеріальної інфекції), злоякісного новоутворення, ушкодження, трансплантації органа або тканини або вагітності.
У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять протягом щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох днів або більше до, під час, або після події, пов'язаної з ініціюванням клінічних симптомів ани5, і введення може бути повторене за рішенням лікаря
З5 доти, поки хворобливий стан не буде усунутий або не буде знаходитися під контролем. В умовах, що передують виникненню аниз5, МА5Р-2-інгібуючий засіб може бути введений суб'єкту системно, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення.
У деяких варіантах здійснення, на фоні первинного діагнозу аниз або у випадку суб'єкта, що проявляє один або більше симптомів, відповідних діагнозу 8НО5 (наприклад, наявність анемії, тромбоцитопенії й/або ниркової недостатності), суб'єкта піддають лікуванню за допомогою ефективної кількості МАЗР-2-інгібуючого засобу (наприклад, антитіла проти МАЗР-2) як терапії першої лінії без застосування методу плазмаферезу або в комбінації з плазмаферезом. Як терапія першої лінії, МА5Р-2-інгібуючий засіб може бути введений суб'єкту системно, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять суб'єкту як терапію першої лінії без застосування методу плазмаферезу для того, щоб уникнути можливих ускладнень, що виникають при плазмаферезі, які включають геморагію, інфекцію і схильність до впливу порушень і/або алергії, властивих донору плазми, або ж коли у суб'єкта є протипоказання до використання плазмаферезу, або в умовах, коли плазмаферез недоступний.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАБ5БР-2-інгібуючого засобу суб'єкту, що страждає від аниз5, через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, щонайменше протягом від одного дня до одного тижня або двох тижнів), потім введення МАЗР-2-інгібуючого засобу суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, протягом тривалого часу, щонайменше протягом двох тижнів або більше). У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий період часу проводять без застосування методу плазмаферезу. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає визначення рівня щонайменше одного фактора комплементу (наприклад, С3, С5) у суб'єкта до 60 лікування, і, необов'язково, під час лікування, де виявлення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу в порівнянні зі стандартним значенням або в порівнянні зі здоровим суб'єктом, узятим для контролю, є вказівкою на необхідність продовження лікування за допомогою МА5Р-2-інгібуючого засобу.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МА5бР-2-інгібуючого засобу, такого як антитіло проти МА5Р-2, суб'єкту, що страждає від ани5 або має ризик розвитку аниз, або внутрішньовенно, внутрішньом'язово, або переважно підшкірно. Лікування може бути тривалим, і введення може проводиться від одного разу за добу до одного разу на місяць, але переважно раз на два тижні. Антитіло проти МА5Р-2 може бути введене як монотерапія або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
НОВ
Так само, як у випадку атипового НО5, типова форма НИЗ проявляється у вигляді клінічної картини і даних лабораторних досліджень, характерних для тромботичної мікроангіопатії (ТМА).
Однак, типова форма НИЗ часто є педіатричним захворюванням і звичайно не має спадкового компонента або прямого зв'язку з мутаціями в генах комплементу. Етіологія типової форми НО5 тісно пов'язана з інфікуванням конкретними кишковими патогенними мікроорганізмами. У пацієнтів звичайно виявляється гостра ниркова недостатність, гемоглобінурія |і тромбоцитопенія, які звичайно супроводжує напад геморагічної діареї. Цей стан викликається кишковим інфікуванням дизентерійною паличкою, сальмонелою або токсином Шига, продукуючим ентерогеморагічні штампи кишкової палички, такі як Е. соїї 0157:Н7. Патогени потрапляють із забруднених продуктів харчування або джерел води. НОЗ є станом, що представляє небезпеку для життя, летальність при якому становить 5-10 95. У значної частини пацієнтів, що вижили, розвивається хронічне захворювання нирок (Соіїтідап апа Воіпеаи, Реадіаїг
Вему. 22 (11):365-9 (2011)), і може виникати необхідність у пересадженні нирки.
Мікросудинна коагуляція при типовій формі НОЗ виникає переважно, хоча і не винятково, у мікроциркуляторному руслі нирок. Патофізіологія, що лежить в основі, опосередкована токсином Шига (ЗТХ). 5ТХ, що виділяється ентеропатичними мікробами в просвіт кишечнику, долає кишковий бар'єр, проникає в кровотік і зв'язується з клітинами ендотелію судин через блоботриозилцерамідний рецептор СО77 (Воуй апа Гіпдожоод Мерпгоп 51:207 (1989)), який переважно експресується на гломерулярному ендотелії і опосередковує токсичну дію 51ТХ.
Після зв'язування з ендотелієм, З5ІХ індукує ряд подій, які ушкоджують ендотелій судин, активують лейкоцити і викликають УМ/Е-залежне тромбоутворення (Рогзуїй еї аї., І апсеї, 2:411- 414 (1989); 2одіа єї аї., Кідпеу Іпі. 62:846-856 (2002); 7апсні еї аї., У. Іттипої. 181:1460-1469 (2008); Мотгіді еї аї., Віоса 98:1828-1835 (2001); Сцевзвзоим еї аї., ІптТесії. Іттип., 73:8306-8316 (2005)). Ці мікротромби приводять до обструкції або оклюзії артеріол і капілярів нирок і інших органів. Обструкція течії крові в артеріолах і капілярах мікротромбами підвищує силу зсуву, що діє на еритроцити при їх проходженні через звужені кровоносні судини. Це може приводити до руйнування еритроцитів під дією сили зсуву і до утворення фрагментів еритроцитів, називаних шизоцитами. Присутність шизоцитів є характерним показником при НО5. Цей механізм відомий як мікроангіопатичний гемоліз. Крім того, обструкція течії крові приводить до ішемії, що ініціює опосередковану комплементом запальну відповідь, яка викликає додаткове ушкодження ураженого органа.
Лектиновий шлях комплементу сприяє патогенезу НОЗ на основі двох основних механізмів: 1) МА5БР-2-опосередкована пряма активація коагулюючої системи, викликана ушкодженням ендотелію, і 2) опосередкована лектином наступна активація комплементу, індукована ішемією, що є результатом початкової оклюзії мікроваскулярного кровотоку.
ЗТХ ушкоджує мікроклітини ендотелію судин, і відомо, що ушкоджені ендотеліальні клітини активують систему комплементу. Як вже докладно обговорювалося вище, активація комплементу після ушкодження ендотеліальних клітин обумовлена переважно лектиновим шляхом. Клітини ендотелію судин людини, піддані окисному стресу, відповідають експресуванням поверхневих фрагментів, які зв'язують лектини і активують лектиновий шлях комплементу (Соїага еї аїЇ.,, Ат. 9. РаїпоїЇ. 156(5):1549-56 (2000)). Васкулярне ушкодження в результаті ішемії/реперфузії також активує комплемент по лектиновому шляху іп мімо (зсапа. «).
Ітітипої. 61(5):426-34 (2005)). Активація лектинового шляху в цих умовах має патологічні наслідки для організму-хазяїна, і інгібування лектинового шляху в результаті блокування МА5Р- 2 запобігає наступному ушкодженню тканини організму-хазяїна і несприятливим результатам (Зспуаебрієе єї аІ., РМАЗ (2011)). Було показано, що, крім активації комплементу, лектинзалежна активація МАБР-2 приводить до розщеплення протромбіну з утворенням тромбіну і до промотування коагуляції. Таким чином, активація лектинового шляху комплементу ушкодженими ендотеліальними клітинами може безпосередньо активувати коагулюючу бо систему. Тому, лектиновий шлях комплементу за допомогою МА5Р-2-опосередкованої активації протромбіну є, очевидно, домінантним молекулярним шляхом, що зв'язує вихідне ендотеліальне ушкодження, викликане 5ТХ, з коагуляцією і мікроваскулярним тромбозом, що виникає при НО5. У зв'язку з цим, можна очікувати, що інгібітори лектинового шляху, які включають, але цим не обмежуючи, антитіла, які блокують функцію МА5Р-2, будуть запобігати або зменшувати мікросудинну коагуляцію, тромбоз і гемоліз у пацієнтів, що страждають від
НОВ. | дійсно, введення антитіла проти МАБР-2 ефективно захищає мишей в експериментальній моделі типової форми НИ5. Як описано в прикладі 36 і показано на фігурі 45, у всіх контрольних мишей, що піддалися впливу 5ТХ і ЛПС, розвивалася важка форма НиИ5, і у мишей наставала агонія або вони вмирали протягом 48 годин. З іншого боку, як далі показано на фігурі 45, усі миші, які були піддані лікуванню антитілом проти МА5Р-2 і потім піддані впливу 5ТХ і ЛПС, виживали (точний критерій Фішера р«0,01; М-5). Таким чином, анти-
МА5БР-2-терапія забезпечує ефективний захист мишам у цій експериментальній моделі НиБ.
Передбачається, що введення МА5бР-2-інгібуючого засобу, такого як антитіло проти МАБ5бР-2, буде ефективним при лікуванні пацієнтів з НО і забезпечить захист від мікросудинної коагуляції, тромбозу і гемолізу, викликаного інфікуванням ентеропатичною кишковою паличкою або іншими ЗТХ-продукуючими патогенами.
Поряд з тим, що проілюстровано у винаході відносно НИЗ, викликаного 5ТХ, передбачається, що анти-МА5Р-2-терапія буде також давати позитивні результати у випадку
Ни5-подібних синдромів, обумовлених ендотеліальним ушкодженням, викликаним іншими токсичними засобами. Вони включають такі засоби як мітоміцин, тиклопідин, цисплатин, хінін, циклоспорин, блеоміцин, а також інші хіміотерапевтичні лікарські засоби і імуносупресивні лікарські засоби. Таким чином, передбачається, що терапія із застосуванням антитіла проти
МА5Р-2 або інших способів впливу, які інгібують активність МАЗР-2, буде ефективно запобігати або обмежувати коагуляцію, тромбоутворення і руйнування еритроцитів і запобігати нирковій недостатності при НОЗ і при інших споріднених з ТМА захворюваннях (тобто аноиз і ТТР).
У пацієнтів, що страждають від НО5З, часто проявляється діарея і блювання, кількість тромбоцитів у них звичайно знижена (тромбоцитопенія), також знижена і кількість еритроцитів (анемія). Фаза діареї, що передує НО, звичайно триває протягом приблизно чотирьох днів, під час якої у суб'єктів, що мають ризик розвитку НО5, звичайно проявляються один або більше з
Зо наступних симптомів крім важкої форми діареї: рівень гематокриту нижче 3095 з доказом інтраваскулярного руйнування еритроцитів при дослідженні мазка, тромбоцитопенія (кількість тромбоцитів «150х103/мм3У) і/або наявність порушеної функції нирок (концентрація креатиніну в сироватці вище верхньої межі референсного діапазону для даного віку). Наявність олігоанурії (діурез «0,5 мл/кг/годину протягом »1 дня) може бути використана як міра оцінки прогресу розвитку НОЗ (дивіться НісКеу С. еї аї., Агоп. Редіаїг. АдоїІезс. Мей. 165(10):384-889 (2011)).
Звичайно проводять дослідження на наявність інфікування бактеріями кишкової палички (Е. соїї 0157:Н7) або представниками шигел або сальмонел. Для суб'єкта з позитивним результатом дослідження на інфікування ентерогенною кишковою паличкою (наприклад, Е. соїї 0157:Н7) протипоказане застосування антибіотиків, оскільки використання антибіотиків може підвищувати ризик розвитку НОЗ у результаті підвищеної продукції 5ТХ (дивіться УМопа С. еї аї.,
М. Епаї. У. Мед. 342:1930-1936 (2000)). Для суб'єктів з позитивним результатом дослідження на присутність шигел або сальмонел, антибіотики звичайно застосовують для усунення інфекції.
Інша загальноприйнята терапія першої лінії для НОЗ включає розширення об'єму, діаліз і плазмаферез.
Відповідно до вищевикладеного, у деяких варіантах здійснення, у випадку суб'єкта, що страждає від одного або більше симптомів, пов'язаних з фазою, що передує НИЗ, і має ризик розвитку НОЗ (тобто у суб'єкта проявляються один або більше з наступних симптомів: діарея, рівень гематокриту нижче 3095 з доказом інтраваскулярного руйнування еритроцитів при дослідженні мазка, тромбоцитопенія (кількість тромбоцитів «150х103/мм") і/або наявність порушеної функції нирок (концентрація креатиніну в сироватці вище верхньої межі референсного діапазону для даного віку)), пропонується спосіб зниження ризику розвитку НО5 або зниження ймовірності розвитку ниркової недостатності у суб'єкта, який включає введення кількості МА5Р-2-інгібуючого засобу протягом періоду часу, ефективного для поліпшення або запобігання порушенню функції нирок. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять протягом періоду часу, щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох або більше днів, і введення може бути повторене за рішенням лікаря доти, поки хворобливий стан не буде усунутий або не буде знаходитися під контролем. У випадку фази, що передує НО5, МА5Р-2- інгібуючий засіб може бути введений суб'єкту системно, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, назально, підшкірно або іншим способом 60 парентерального введення.
Лікування інфекції Е. соїї 0157:Н7 за допомогою бактерицидних антибіотиків, зокрема В- лактамів, було пов'язане з підвищеним ризиком розвитку НОЗ (тій еї а!., Редіаїг. Іптесі. рів. у. 31(1):37-41 (2012)). У деяких варіантах здійснення, у випадку суб'єкта, що страждає від симптомів, пов'язаних з фазою, що передує НИЗ, коли про суб'єкта відомо, що він інфікований ентерогенною кишковою паличкою і застосування антибіотиків протипоказане (наприклад, Е. соїї 0157:Н7), пропонується спосіб зниження ризику розвитку НОЗ або зниження ймовірності розвитку ниркової недостатності у суб'єкта, який включає введення кількості МАЗР-2-інгібуючого засобу протягом першого періоду часу, ефективного для інгібування або запобігання виникненню олігоанурії у суб'єкта (наприклад, щонайменше протягом одного, двох, трьох або чотирьох днів), де введення МАБР-2-інгібуючого засобу протягом першого періоду часу здійснюють за відсутності антибіотика. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає введення МА5Р-2-інгібуючого засобу суб'єкту в комбінації з антибіотиком протягом другого періоду часу (наприклад, щонайменше протягом від одного до двох тижнів).
В інших варіантах здійснення, у випадку суб'єкта, що страждає від симптомів, пов'язаних з фазою, що передує НИ, коли про суб'єкта відомо, що він інфікований шигелою або сальмонелою, пропонується спосіб зниження ризику розвитку НИЗ або зниження ймовірності розвитку ниркової недостатності у суб'єкта, який включає введення кількості МАЗР-2-інгібуючого засобу протягом періоду часу, ефективного для інгібування або запобігання виникненню олігоанурії у суб'єкта, де введення МА5бР-2-інгібуючого засобу здійснюють або в присутності, або за відсутності придатного антибіотика.
У деяких варіантах здійснення, у випадку первинного діагнозу НО5 або у випадку прояву у суб'єкта одного або більше симптомів, що вказують на діагноз НОЗ (наприклад, наявність ниркової недостатності або мікроангіопатичної гемолітичної анемії за відсутності низького фібриногену або тромбоцитопенії), суб'єкта піддають лікуванню ефективною кількістю МА5Р-2- інгібуючого засобу (наприклад, антитіло проти МА5Р-2) як терапії першої лінії без застосування методу плазмаферезу або в комбінації з плазмаферезом. Як терапія першої лінії, МА5Р-2- інгібуючий засіб може бути введений суб'єкту системно, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять
Зо суб'єкту як терапію першої лінії без застосування методу плазмаферезу для того, щоб уникнути можливих ускладнень, що виникають при плазмаферезі, які включають геморагію, інфекцію і схильність до впливу порушень і/або алергії, властивих донору плазми, або ж коли у суб'єкта є протипоказання до використання плазмаферезу, або в умовах, коли плазмаферез недоступний.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАБ5БР-2-інгібуючого засобу суб'єкту, що страждає від НОЗ5, через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, протягом гострої фази, що триває щонайменше від одного дня до тижня або двох тижнів), потім введення МА5Р-2-інгібуючого засобу суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, протягом тривалого часу, щонайменше протягом двох тижнів або більше). У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий період часу проводять без застосування методу плазмаферезу. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає визначення рівня щонайменше одного фактора комплементу (наприклад,
С3, С5) у суб'єкта до лікування, і, необов'язково, під час лікування, де виявлення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу в порівнянні зі стандартним значенням або в порівнянні зі здоровим суб'єктом, узятим для контролю, є вказівкою на необхідність лікування, і де виявлення нормального рівня вказує на поліпшення.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МА5бР-2-інгібуючого засобу, такого як антитіло проти МАБР-2, суб'єкту, що страждає від НО5 або має ризик розвитку НО5, або підшкірно, або внутрішньовенно. Лікування переважно проводити щоденно, але воно також може проводитися із частотою один раз на тиждень або один раз місяць. Лікування може тривати протягом щонайменше від одного тижня до З місяців. Антитіло проти МАБР-2 може бути введене як монотерапія або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
ПР
Тромботична тромбоцитопенічна пурпура (ТТР) є небезпечним для життя захворюванням коагулюючої системи крові, що викликається аутоїмунними або спадковими порушеннями, які активують коагулюючу систему або систему комплементу (Сеогде .).М., М. ЕпоїЇ. У. Меа.; 354:1927-35 (2006)). Це приводить до утворення численних мікроскопічних тромбів або до тромбозів у дрібних кровоносних судинах по всьому організму. Еритроцити піддаються впливу напруження зсуву, що руйнує їх мембрани, приводячи до внутрішньосудинного гемолізу.
Обумовлені цим зниження кровотоку і ендотеліальне ушкодження викликають ушкодження бо органа, включаючи головний мозок, серце і нирки. ТТР клінічно характеризується тромбоцитопенією, мікроангіопатичною гемолітичною анемією, неврологічними змінами, нирковою недостатністю і пропасницею. У часи, коли ще не застосовувалося заміщення плазми, частота фатальних кінців при гострих нападах становила 90 95. Навіть із застосуванням заміщення плазми виживаність у перші шість місяців становить приблизно 80 95.
ТТР виникає в результаті генетичного і набутого інгібування ферменту АБАМТЗ5І13, металопротеази, відповідальної за розщеплення великих мультимерів фактора фон Вілебранда (МАЛЕ) на більш дрібні фрагменти. Інгібування або дефіцит АСАМТ513 в остаточному підсумку приводить до підвищеної коагуляції (Т5заі Н. у. Ат. ос. МерпгоїЇ. 14:1072-1081, (2003).
АБАМТ513 регулює активність МЛ/Е; за його відсутності, МЛ/Е утворює великі мультимери, які, найімовірніше, зв'язують тромбоцити і провокують у пацієнтів агрегацію тромбоцитів і тромбоз у мікроциркуляторному руслі.
Синдром Апшо-Шульмана (Ш55, також описуваний як вроджена ТТР) являє собою вроджену недостатність активності АБАМТ513 внаслідок генних мутацій АСАМТ513 (Зспцітап еї аї.,
Віосй, 16(1):943-57, 1960; Ор5Нпам/ еї аї., Мем/ Епді. У. Мей. 298 (24):1350-2, 1978). Численні мутації в АБАМТ513 були виявлені у індивідуумів з вродженою ТТР (Кіпозйпйа еї аї., Іптегпайопаї! доштаї ої Нетаїйоіоду, 74:101-108 (2001); І ему єї аї., Маїиге, 413 (6855):488-494 (2001); Кокате еї аі., РМАБ5, 99(18):11902-11907 (2002); Замазап еї аї., Віосд, 101:4449-4451 (2003); Маївитою еї а!., Віосд, 103:1305-1310 (2004), і Рціїтига еї аї!., Вії. У. Наетаї. 144:742-754 (2008)). Суб'єкти з 055 звичайно мають активність 5-10 95 від нормальної активності АСАМТ513 (КоКате еї аї.,
РМАБ5, 99(18):11902-11907, 2002). Незважаючи на те, що набуті ТТР і 055 мають деякі подібності, 055 має деякі важливі відмінності в клінічних ознаках. 055 звичайно проявляється у віці немовля або дитячому віці і характеризується важкою формою гіпербілірубінемії з негативним результатом тесту Кумбса незабаром після народження, клінічним поліпшенням при інфузії свіжої плазми і частими рецидивами (Замазап еї аї., Віооа, 101:4449-4451, 2003). У деяких випадках, пацієнти із цією вродженою недостатністю АБАМТ513 мають слабовиражений фенотип при народженні, і у них тільки розвиваються симптоми, пов'язані з ТТР, у клінічних ситуаціях з підвищеними рівнями фактора фон Вілебранда, таких як інфекція або вагітність.
Наприклад, у публікації Еціїтига еї аї., Вії. У. Наетаї. 144:742-754, 2008, повідомлялося про 9 японських жінок з б родин з генетично підтвердженим 55, у яких було діагностоване це
Зо порушення під час їх першої вагітності. Тромбоцитопенія виникала в період від другого до третього триместрів у кожній із цих 15 вагітностей, часто після ТТР. Було виявлено, що всі ці жінки характеризуються значною недостатністю активності АСАМТ513.
Відповідно до вищевикладеного, у деяких варіантах здійснення, у випадку суб'єкта із синдромом Апшо-Шульмана (55) (тобто у випадку суб'єкта, про якого відомо, що у нього виявлена недостатність активності АСАМТ513, і/або суб'єкта, про якого відомо, що у нього виявлені одна або більше генних мутацій АБАМТ513), пропонується спосіб зниження ймовірності розвитку клінічних симптомів, пов'язаних з вродженою ТТР (наприклад, тромбоцитопенії, анемії, пропасниці і/або ниркової недостатності), який включає введення кількості МА5Р-2-інгібуючого засобу (наприклад, антитіла проти МА5Р-2) протягом періоду часу, ефективного для полегшення або запобігання одному або більше клінічним симптомам, пов'язаним з ТТР. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає стадію визначення, чи має суб'єкт ризик розвитку симптомів, пов'язаних з вродженою ТТР, до початку прояву будь- яких симптомів, пов'язаних з ТТР, або після початку прояву щонайменше одного або більше симптомів, що вказують на наявність ТТР (наприклад, наявність анемії, тромбоцитопенії й/або ниркової недостатності). Визначення схильності суб'єкта до ризику розвитку симптомів, пов'язаних з вродженою ТТР (тобто наявності у суб'єкта 055), включає визначення, чи має суб'єкт мутацію в гені, коюдуючому АСАМТ5І13, і/або визначення, чи має суб'єкт недостатність активності АСАМТ513, і/або визначення, чи має суб'єкт випадки захворювання 055 у родині.
Методи генетичного скринінгу на присутність або відсутність генетичної мутації, пов'язаної з
О55, є добре відомими, наприклад, дивіться публікації Кіпо5пйа еї аї., Іпіегпайопаї! доигпаї! ої
Нетаїйоіоду, 74:101-108 (2001); І ему еї аї., Мате, 413 (6855):4188-494 (2001); КоКате еї аї.,
РМАБ5 99(18):11902-11907 (2002); Замазап еї аї!., Віосд, 101:4449-4451 (2003); Маїзитоїо 6ї аї.,
Віоса, 103:1305-1310 (2004), та Еціітига еї а!., Вгії. У. Наетаї 144:742-754 (2008).
В одному варіанті здійснення, пропонується спосіб зниження ймовірності того, що суб'єкт, у якого діагностований 55, буде страждати від клінічних симптомів, пов'язаних з ТТР, який включає періодичне обстеження суб'єкта з метою визначення наявності або відсутності у нього анемії, тромбоцитопенії або підвищення креатиніну, і лікування за допомогою МА5БР-2- інгібуючого засобу (наприклад, антитіла проти МАБР-2) після виявлення наявності анемії, тромбоцитопенії або підвищення креатиніну, або після події, про яку відомо, що вона пов'язана бо з ініцюванням клінічних симптомів ТТР, наприклад тривалого впливу лікарського засобу
(наприклад, хіміотерапії), інфекції (наприклад, бактеріальної інфекції), злоякісного новоутворення, ушкодження, трансплантації або вагітності.
В іншому варіанті здійснення, пропонується спосіб лікування суб'єкта, що має 055 і страждає від клінічних симптомів, пов'язаних з ТТР, який включає введення кількості МАЗР-2- інгібуючого засобу (наприклад, антитіла проти МАЗР-2) протягом періоду часу, ефективного для полегшення або запобігання одному або більше клінічним симптомам, пов'язаним з ТТР.
Розвиток ТТР може бути також викликаний аутоантитілом проти АСАМТ513. Крім того, ТР може виникати при раку молочної залози, раку шлунково-кишкового тракту або раку передміхурової залози (Сеогде У.М., ОпсоЇоду (МЛІЇЇюпП Рагк). 25:908-14 (2011)), при вагітності (у другому триместрі або після пологів) (сСеогде 9.М., Сцит. Оріп. Нептаїйої!. 10:339-344 (2003)), або може бути пов'язана із захворюваннями, такими як СНІД, або аутоїмунними захворюваннями, такими як системний червоний вовчак (Натазвакі К. єї аї., Сіп. Кпешиптаїййо!. 22:355-8 (2003)). ТР може бути також викликана застосуванням конкретних лікарських засобів, у тому числі гепарину, хініну, імуноопосередкованого інгредієнта, хіміотерапевтичних протиракових засобів (блеоміцину, цисплатину, цитозину арабінозиду, дауноміцину, гемцитабіну, мітоміцину С і тамоксифену), циклоспорину А, пероральних контрацептивів, пеніциліну, рифампіну і антиагрегантних лікарських засобів, у тому числі тиклопідину і клопідогрелу (Агагт Т. еї аї.,..
Вез. Мед. 5сі., 16:353-357 (2011)). Інші фактори або стани, пов'язані з ТТР, являють собою токсини, такі як бджолина отрута, сепсис, секвестрацію селезінки, трансплантацію, васкуліт, судинну хірургію і інфекції, такі як стрептококові пневмонії і генералізована цитомегалія (МоакКе
У... М. Епаї. у. Мей., 347:589-600 (2002)). ТТР, обумовлена транзиторною функціональною недостатністю АБАМТ513, може виникати в результаті ушкодження ендотеліальних клітин, пов'язаного із пневмококовою інфекцією (Реаіаїг Мерпгої!., 26:631-5 (2011)).
Заміщення плазми є стандартним підходом при лікуванні ТТР (КосКк О.А. еї аї., М. Епої. 5.
Меа. 325:393-397 (1991)). Заміщення плазми відновлює активність АСАМТ513 у пацієнтів з генетичними дефектами і видаляє АЮАМТ513 аутоантитіла у пацієнтів із набутою аутоїмунною
ТР (Тваї Н.-М., Нетаїйо!. Опсої. Сіїй. Мойй. Ат., 21(4):609-м (2007)). Звичайно при цій терапії використовують додаткові лікарські засоби, такі як імунодепресанти (Сеогде ..М., М. Епаї. 9.
Меа., 354:1927-35 (2006)). Однак, заміщення плазми не дає позитивного результату у 20 96
Зо пацієнтів, рецидив виникає у більше ніж третини пацієнтів, і плазмаферез є дорогим лікуванням і вимагає спеціального обладнання. Крім того, багато які пацієнти не можуть переносити заміщення плазми. Тому, зберігається гостра потреба в додаткових і вдосконалених методах лікування ТТР.
Оскільки ТТР являє собою порушення системи коагуляції крові, лікування за допомогою антагоністів системи комплементу може сприяти стабілізації і корекції захворювання. У той час як патологічна активація альтернативного шляху комплементу пов'язана з анизх, роль активації комплементу при ТТР є менш очевидною. Функціональна недостатність АОАМТ513 має велике значення з точки зору схильності до ТТР, однак вона не пояснює причину виникнення гострих нападів. Фактори впливу навколишнього середовища й/або інші генетичні зміни можуть сприяти прояву ТТР. Наприклад, гени, кодуючі білки, залучені в регуляцію системи коагуляції, мУУЕ, тромбоцитарної функції, компонентів поверхні ендотелію судин або системи комплементу, можуть бути безпосередньо пов'язані з розвитком гострої тромботичної мікроангіопатії (СаІризега М. єї аї., Наєтайіодіса, 94:166-170 (2009)). Зокрема, було показано, що важливу роль відіграє активація комплементу; було показано, що сироватка при тромботичній мікроангіопатії, пов'язаній з недостатністю АБАМТ513, викликає відкладення ССЗ і МАС і наступну активацію нейтрофілів, яка могла б бути припинена шляхом інактивації комплементу (Виї2-Тотез М.Р. вї аі., Тптоть Наетозі, 93:443-52 (2005)). Крім того, нещодавно було показано, що під час гострих нападів ТТР підвищуються рівні С4а, СЗЬВЬР їі СЗа (Кеїї М. еї аї., У. Тиготр.
Наєтові. Бер 28. (2012) аої: 10.1111/.1538-7836.2012.04674.х. |скоро вийде електронна публікація|), що відповідає активації класичного/лектинового і альтернативного шляхів. Ця підвищена кількість активації комплементу при гострих нападах може ініціювати кінцевий шлях активації і може бути відповідальною за наступне загострення ТТР.
Очевидно, що роль АБАМТ513 і МЕ при ТТР полягає в активації і агрегації тромбоцитів і їх наступній участі в напруженні зсуву і відкладенні при мікроангіопатіях. Активовані тромбоцити взаємодіють як з класичним, так і з альтернативним шляхами комплементу і ініціюють їх.
Опосередкована тромбоцитами активація комплементу збільшує кількість медіаторів запалення
СЗа і Сба (РеєгзспкКе Е. еї аї., Мої. Іттипої., 47:2170-5 (2010)). Таким чином, тромбоцити можуть служити як мішені класичної активації комплементу при спадковій або аутоїмунній ТТР.
Як описано вище, лектиновий шлях комплементу за допомогою МА5Р-2-опосередкованої бо активації протромбіну є домінантним молекулярним шляхом, що зв'язує ендотеліальне ушкодження з коагуляцією і мікроваскулярним тромбозом, який виникає при Ни5. Аналогічно, активація лектинового шляху комплементу може безпосередньо запускати коагулюючу систему при ТТР. Активація лектинового шляху може бути ініційована у відповідь на вихідне ушкодження ендотелію, викликане недостатністю АСАМТ513 при ТТР. Тому, можна очікувати, що інгібітори лектинового шляху, які включають, але цим не обмежуючи, антитіла, що блокують функцію
МАБР-2, будуть полегшувати стани мікроангіопатії, пов'язані з мікросудинною коагуляцією, тромбозом і гемолізом у пацієнтів, що страждають від ТТР.
Пацієнти, що страждають від ТТР, звичайно знаходяться у відділенні екстреної медичної допомоги з одним або більше з наступних діагнозів: пурпура, ниркова недостатність, низькі тромбоцити, анемія й/або тромбоз, включаючи інсульт. Сучасний стандартний спосіб лікування
ТТР включає доставку через катетер (наприклад, через внутрішньовенний або інші форми катетера) підданої плазмаферезу плазми протягом двох тижнів або більше, звичайно три рази на тиждень, але аж до разу на добу. Якщо результати дослідження суб'єкта вказують на присутність інгібітору АБАМТ513 (тобто ендогенного антитіла проти АБАМТ513), тоді плазмаферез може проводитися в комбінації з імуносупресивною терапією (наприклад, з кортикостероїдами, ритуксаном або циклоспорином). У випадку суб'єктів з рефракторною ТТР (приблизно 20 95 пацієнтів з ТТР), лікування щонайменше протягом двох тижнів методом плазмаферезу не дає позитивних результатів.
Відповідно до вищевикладеного, в одному варіанті здійснення, у випадку первинного діагнозу ТТР у суб'єкта або прояву у нього одного або більше симптомів, що вказують на ТТР (наприклад, ураження центральної нервової системи, важка форма тромбоцитопенії (кількість тромбоцитів менше ніж або дорівнює 5000/мкл без приймання аспірину, менше ніж або дорівнює 20000/мкл при прийманні аспірину), важка форма ураження серця, важка форма ураження легенів, інфаркт шлунково-кишкового тракту або гангрена), пропонується спосіб лікування суб'єкта за допомогою ефективної кількості МА5Р-2-інгібуючого засобу (наприклад, антитіла проти МА5Р-2) як терапії першої лінії без застосування методу плазмаферезу або в комбінації з плазмаферезом. Як терапія першої лінії, МА5Р-2-інгібуючий засіб може бути введений суб'єкту системно, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, назально, підшкірно або іншим способом парентерального введення. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять суб'єкту як терапію першої лінії без застосування методу плазмаферезу для того, щоб уникнути можливих ускладнень, що виникають при плазмаферезі, які включають геморагію, інфекцію і схильність до впливу порушень і/або алергії властивих донору плазми, або ж коли у суб'єкта є протипоказання до використання плазмаферезу, або в умовах, коли плазмаферез недоступний.
У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять суб'єкту, що страждає від ТТР, у комбінації (у тому числі при спільному введенні) з імунодепресантом (наприклад, з кортикостероїдами, ритуксаном або циклоспорином) і/або в комбінації з концентрованою
АРАМТ513.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАБ5БР-2-інгібуючого засобу суб'єкту, що страждає від ТТР, через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, у період гострої фази, що триває щонайменше від одного дня до тижня або двох тижнів), потім введення МА5Р-2-інгібуючого засобу суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, у період хронічної фази, щонайменше два тижні або більше).
У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий період часу проводять без застосування методу плазмаферезу. У деяких варіантах здійснення, спосіб застосовують для підтримання суб'єкта для того, щоб не допустити страждання суб'єкта від одного або більше симптомів, пов'язаних з ТТР.
В іншому варіанті здійснення, пропонується спосіб лікування суб'єкта, що страждає від рефракторної ТТР (тобто суб'єкта, лікування якого протягом щонайменше двох тижнів методом плазмаферезу не дало позитивних результатів), шляхом введення кількості інгібітору МАЗР-2, ефективної для полегшення одного або більше симптомів ТТР. В одному варіанті здійснення, інгібітор МА5БР-2 (наприклад, антитіло проти МАБР-2) вводять суб'єкту з рефракторною ТТР на тривалій основі протягом періоду часу, щонайменше два тижні або більше, підшкірно або іншим способом парентерального введення. Введення може бути проведене повторно за рішенням лікаря доти, поки хворобливий стан не буде усунутий або не буде знаходитися під контролем.
У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає визначення рівня щонайменше одного фактора комплементу (наприклад, С3, С5) у суб'єкта до лікування і, необов'язково, під час лікування, де виявлення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу в порівнянні зі стандартним значенням або в порівнянні зі здоровим суб'єктом, узятим для 60 контролю, є вказівкою на необхідність продовження лікування за допомогою МА5Р-2-інгібуючого
Зо засобу.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МА5Р-2-інгібуючого засобу, такого як антитіло проти МАБР-2, суб'єкту, що страждає від ТТР або має ризик розвитку ТТР, або підшкірно, або внутрішньовенно. Лікування переважно проводити щоденно, але воно може проводитися і з частотою один раз на два тижні. Лікування продовжують доти, поки кількість тромбоцитів у суб'єкта не досягне більше 150000/мл протягом щонайменше двох наступних днів. Антитіло проти МАБР-2 може бути введене як монотерапія або в комбінації з інгібітором
С5, таким як екулізумаб.
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МА5Р-2 з величиною Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у ССР1-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в іп міго дослідженні в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 нм або менше, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці при величині
ІСво ЗО нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Раб, Раб", Е(аб)» і Е(аб)», де антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло є молекулою Ід532, де зазначене антитіло є молекулою Ідс1, де зазначене антитіло є молекулою Ідое4, де молекула Ідс4 включає мутацію 5228Р, і/або де антитіло практично не інгібує класичний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МАБР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує альтернативний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях або альтернативний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, але не зачіпає класичного і альтернативного шляхів комплементу).
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від ТТР, щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 95, наприклад щонайменше на 50 9565, наприклад щонайменше на 60 965, наприклад щонайменше на 70 95, наприклад щонайменше на 80 95, наприклад щонайменше на 85 96, наприклад щонайменше на 90 95, наприклад щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-
Зо інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від
ТТР, на рівні щонайменше на 20 відсотків або більше (наприклад, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95) більше, ніж інгібуюча дія на відкладення С5р-9 у сироватці крові.
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у пацієнта з ТТР, щонайменше на 30905, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 965, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер.
В одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від ТТР, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість
МА5БР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності з«ЕО ІЮ МО:67; і і) важкий ланцюг СОК-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності БЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг
СОВ-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності 5ЕО ІЮ МО:67, ії Б) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ії) легсий ланцюг СОК-11, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ХЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-12, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг
СОВ-ІЇЗ3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності 5ХЕО ІЮ МО:70, або (І) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 92 9о, щонайменше з 93 965, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 9565, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 956, щонайменше з 99 95 тотожністю з ЗЕО ІЮО МО:67), і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 9295, щонайменше з 93 95, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 9565, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ФЗЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає бо кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції яка включає кількість МАЗР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5Р-2, розпізнаваній контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ
МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ МО:70.
Хвороба Дегоса
Хвороба Дегоса, відома також як злоякісний атрофічний папульоз, є дуже рідкою ТМА, що уражує ендотелій дрібних судин шкіри, шлунково-кишкового тракту і центральної нервової системи. Ця васкулопатія викликає оклюзію венул і артеріол, що приводить до ушкодження шкіри, ішемії кишечнику і порушень центральної нервової системи, включаючи інсульти, епілепсію і когнітивні розлади. У випадку шкіри, некроз сполучної тканини обумовлений тромботичною оклюзією дрібних артерій. Однак, причина хвороби Дегоса невідома. З нею пов'язували васкуліт, коагулопатію або первинну дисфункцію ендотеліальних клітин. Хвороба
Дегоса характеризується 50 95 виживаністю протягом від двох до трьох років. Ефективного лікування для хвороби Дегоса не існує, але для полегшення симптомів використовують антиагрегантні лікарські засоби, антикоагулянти і імунодепресанти.
Незважаючи на те, що механізм хвороби Дегоса невідомий, проте її пов'язували зі шляхом активації комплементу. У публікації Магдо еї аїЇ., Ат. У. Сііп. РаїйоїЇ. 135(4):599-610, 2011) повідомлялося про ідентифікацію виражених відкладень С5Б-9 у шкірі, шлунково-кишковому тракті і судинах головного мозку у чотирьох хворих із хворобою Дегоса в термінальній стадії.
Експерименти по лікуванню екулізумабом давали ефект на початковому етапі при лікуванні шкірних і кишкових ушкоджень, але не запобігали розвитку системного захворювання (дивіться публікації Сагтен-ВакКеїтап РЕ. еї а!., "С5Б-9 із а роїепійа! емесіог іп Шїе раїйорнузіоіоду ої Оедов дізеазе; а сазе герої ої ігєаїтепі м/п есції2итар" (Арзігасі), дегизаІет: Іпіегпайопа! босіеїу ої
Нетацо!оду; 2010, Розіег 2156; і Роїйо .). еї аІ., "Еапу аеїесіоп ої зубвіетіс Оедоз дізеазе (00) ог таїїдпапі аморніс раршовів (МАР) тау іпсгеазе зигміма!" (Абвзігас), зап Апіопіо, ТХ: Атегісап
СоІеде ої СавігоєпіегоЇоду; 2010, Ровієї Я1205).
Багато які пацієнти, що страждають від хвороби Дегоса, мають порушення коагуляції крові.
Для цієї хвороби характерна тромботична оклюзія дрібних артерій шкіри. У зв'язку з тим, що при цьому захворюванні залучений шлях комплементу, як це описано для інших ТМА, передбачається, що інгібітори лектинового шляху, що включають, але цим не обмежуючи, антитіла, які блокують функцію МАБР-2, можуть приводити до позитивних результатів при лікуванні пацієнтів, що страждають від хвороби Дегоса.
Відповідно, в іншому варіанті здійснення, у винаході пропонуються способи лікування хвороби Дегоса шляхом введення композиції, яка включає терапевтично ефективну кількість
МА5БР-2-інгібуючого засобу, такого як антитіла проти МАБР-2, у фармацевтичному носії, суб'єкту, що страждає від хвороби Дегоса або стану, що виникає внаслідок хвороби Дегоса.
МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять системно суб'єкту, що страждає від хвороби Дегоса або стану, що виникає внаслідок хвороби Дегоса, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, можливо, шляхом перорального введення у випадку непептидергічних лікарських засобів.
Антитіло проти МАЗР-2 може бути введене як монотерапія або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МА5Р-2 з величиною Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у ССР1-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в іп міго дослідженні в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 нм або менше, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці при величині
ІСво 30 нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Раб, Раб", Е(аб)» і Е(аб)», де антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло є молекулою Ід532, де зазначене антитіло є молекулою Ідс1, де зазначене антитіло є молекулою Ідое4, де молекула Ідс4 включає мутацію 5228Р, і/або де антитіло практично не інгібує класичний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МАБР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує бо альтернативний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях або альтернативний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, але не зачіпає класичного і альтернативного шляхів комплементу).
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від хвороби Дегоса, щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 95, наприклад щонайменше на 50 95, наприклад щонайменше на 6096, наприклад щонайменше на 7095, наприклад щонайменше на 8095, наприклад щонайменше на 85 96, наприклад щонайменше на 90 956, наприклад щонайменше на величину від 95 до 99595, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від хвороби Дегоса, на рівні щонайменше на 20 відсотків або більше (наприклад, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95) більше, ніж інгібуюча дія на відкладення С5р-9 у сироватці крові.
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у пацієнта з хворобою Дегоса, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 956, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер.
В одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від хвороби Дегоса, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності зЗЕО ІЮ МО:67; і її) важкий ланцюг
СОВ-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності зЕО ІЮ МО:67, і р) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легкий ланцюг СОБ-Ї1, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ХЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-12, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг
СОВ-ІЇЗ3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності 5ХЕО ІЮ МО:70, або (І) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 92 9о, щонайменше з 93 965, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 9565, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 956, щонайменше з 99 95 тотожністю з ЗЕО ІЮО МО:67), і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 9295, щонайменше з 93 95, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 9565, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ФЗЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції яка включає кількість МАЗР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5Р-2, розпізнаваній контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ
МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО 10 МО:70.
Катастрофічний антифосфоліпідний синдром (САРБ)
Катастрофічний антифосфоліпідний синдром (САРБ) є екстремальним варіантом синдрому антифосфоліпідних антитіл (АРГА)М. САРБЗ характеризується венозним і артеріальним тромбозом, обумовленим патогенними антитілами. САР5 являє собою ТМА з множинним тромбозом, ішемією органа і функціональною недостатністю органа. Так само, як і у випадку інших ТМА, для цього захворювання характерна оклюзія дрібних судин у різних органах.
Смертність при САР5 досягає високого рівня порядку 50 905, і часто він пов'язаний з інфекцією або травмою. Пацієнти мають антифосфоліпідні антитіла, звичайно дже.
Клінічно, САР5 залучає в патологічний процес щонайменше три органи або тканини з бо гістопатологічним доказом оклюзії дрібних судин. Периферичний тромбоз може охоплювати вени і артерії в центральній нервовій системі, серцево-судинній, нирковій або легеневій системах. Пацієнта піддають лікуванню антибіотиками, антикоагулянтами, кортикостероїдами, заміщенням плазми і внутрішньовенним імуноглобуліном. Проте, смерть може наставати в результаті множинної функціональної недостатності органів.
При САРБ5 залучений шлях комплементу. Наприклад, дослідження на експериментальних моделях на тваринах указують на те, що інгібування комплементу може бути ефективним способом запобігання тромбозу, пов'язаному з САРБЗ (ЗПпаріга |. еї аї., Агійгй5 КПпеит. 64(8):2719-23, 2012). Більше того, як було додатково повідомлено в згаданій вище публікації, введення екулізумабу суб'єкту, що страждає від САРБ5, у дозах, які блокують шлях комплементу, запобігало гострим прогресуючим тромботичним ускладненням і викликало зворотний розвиток тромбоцитопенії (дивіться також іт МУМ., Сигг. Оріп. Нетаїої!. 18(5):361-5, 2011). Тому, як описано у винаході для інших ТМА, передбачається, що інгібітори лектинового шляху, які включають, але цим не обмежуючи, антитіла, які блокують функцію МА5Р-2, можуть приводити до позитивних результатів при лікуванні пацієнтів, що страждають від САР5.
Відповідно, в іншому варіанті здійснення, у винаході пропонуються способи лікування САР5 шляхом введення композиції, яка включає терапевтично ефективну кількість МАБР-2- інгібуючого засобу, такого як антитіла проти МАБР-2, у фармацевтичному носії, суб'єкту, що страждає від САР5 або стану, що виникає внаслідок САРБ5. МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять системно суб'єкту, що страждає від САРЗ або стану, що виникає внаслідок САР5, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, можливо, шляхом перорального введення у випадку непептидергічних лікарських засобів. Антитіло проти МАБР-2 може бути введене як монотерапія або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МА5Р-2 з величиною Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у ССР1-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в іп міго дослідженні в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 нм або менше, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці при величині
ІСво 30 нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що
Ко) складається з Ем, Рабр, Рар", К(аб)» і Е(ар)», де антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло є молекулою Ід532, де зазначене антитіло є молекулою Ідс1, де зазначене антитіло є молекулою Ідое4, де молекула Ідс4 включає мутацію 5228Р, і/або де антитіло практично не інгібує класичний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МАБР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує альтернативний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях або альтернативний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, але не зачіпає класичного і альтернативного шляхів комплементу).
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від САР5, щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 95, наприклад щонайменше на 50 9565, наприклад щонайменше на 60 965, наприклад щонайменше на 70 95, наприклад щонайменше на 80 95, наприклад щонайменше на 85 956, наприклад щонайменше на 90 95, наприклад щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2- інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від
САРБ, на рівні щонайменше на 20 відсотків або більше (наприклад, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95) більше, ніж інгібуюча дія на відкладення С5р-9 у сироватці крові.
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у пацієнта з САР5, щонайменше на 3095, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 965, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер.
В одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від САР5, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОБ-НІ, що 60 включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності 5620 ІЮ МО:67; і її) важкий ланцюг
СОВ-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності зЕО ІЮ МО:67, і р) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легкий ланцюг СОБ-Ї1, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ХЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-12, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг
СОВ-ІЇЗ3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності 5ХЕО ІЮ МО:70, або (І) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 92 9о, щонайменше з 93 965, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 9565, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 956, щонайменше з 99 95 тотожністю з ЗЕО ІЮО МО:67), і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 9295, щонайменше з 93 95, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 9565, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ФЗЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції яка включає кількість МАЗР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5Р-2, розпізнаваній контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ
МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ МО:70.
ТМА на фоні раку
Системні злоякісні новоутворення будь-якого типу можуть приводити до клінічних і патологічних проявів ТМА (дивіться, наприклад, Вайз апа І а7аги5, Вопе Магтом/ Тгап5ріапіайіоп, 40:709-719, 2007). ТМА на фоні раку часто виявляють у легенях, і, очевидно, вона пов'язана з
Зо пухлинними емболами (Егапсів5 К.К. еї аЇ., Соттип. Опсої. 2:339-43, 2005). Пухлинні емболи можуть знижувати кровотік і, отже, приводити до стану гіпоперфузії в уражених артеріолах і венулах. Передбачається, що виникаючий у зв'язку із цим стрес і ушкодження тканини локалізовано активує лектиновий шлях комплементу. Активований лектиновий шлях, у свою чергу, може активувати систему коагуляції за допомогою МА5БР-2-залежного розщеплення протромбіну до тромбіну, що приводить до протромбічного стану, характерного для ТМА.
Передбачається, що інгібування МАБР-2 у цих умовах понизить локалізовану активацію тромбіну і тим самим полегшить протромбічний стан.
Тому, як описано у винаході для інших ТМА, передбачається, що інгібітори лектинового шляху, що включають, але цим не обмежуючи, антитіла, які блокують функцію МА5Р-2, можуть приводити до позитивних результатів при лікуванні пацієнтів, що страждають від ТМА на фоні раку.
Відповідно, в іншому варіанті здійснення, у винаході пропонуються способи лікування або запобігання ТМА на фоні раку шляхом введення композиції, яка включає терапевтично ефективну кількість МАБР-2-інгібуючого засобу, такого як антитіла проти МАБР-2, у фармацевтичному носії, суб'єкту, що страждає від ТМА на фоні раку або має ризик розвитку
ТМА на фоні раку. МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять системно суб'єкту, що страждає від ТМА на фоні раку або має ризик розвитку ТМА на фоні раку, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, можливо, шляхом перорального введення у випадку непептидергічних лікарських засобів. Антитіло проти МАЗР-2 може бути введене як монотерапія або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МА5Р-2 з величиною Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у ССР1-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в іп міго дослідженні в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 нм або менше, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці при величині
ІСво ЗО нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Раб, Раб", Е(аб)» і Е(аб)», де антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло є молекулою Ід532, де зазначене антитіло є молекулою Ідс1, де бо зазначене антитіло є молекулою Ід54, де молекула Ідс4 включає мутацію 5228Р, і/або де антитіло практично не інгібує класичний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МАБР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує альтернативний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях або альтернативний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, але не зачіпає класичного і альтернативного шляхів комплементу).
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від ТМА на фоні раку, щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 95, наприклад щонайменше на 50 95, наприклад щонайменше на 6096, наприклад щонайменше на 7095, наприклад щонайменше на 8095, наприклад щонайменше на 85 95, наприклад щонайменше на 90 95, наприклад щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у пацієнта, що страждає від ТМА на фоні раку, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 956, щонайменше на 60 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 9565, щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер.
В одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від ТМА на фоні раку, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності зЗЕО ІЮ МО:67; і її) важкий ланцюг
СОВ-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності зЕО ІЮ МО:67, і р) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легкий ланцюг СОБ-Ї1, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ХЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-12, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг
Ко) СОВ-ІЇЗ3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності 5ХЕО ІЮ МО:70, або (І) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 9095 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 92 9о, щонайменше з 93 965, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 9565, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 956, щонайменше з 99 95 тотожністю з ЗЕО ІЮО МО:67), і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 9о, щонайменше з 9295, щонайменше з 93 95, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 9565, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ФЗЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції яка включає кількість МАЗР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5Р-2, розпізнаваній контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ
МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ МО:70.
ТМА на фоні протиракової хіміотерапії
ТМА, пов'язана з хіміотерапією, являє собою стан, що включає тромбоцитопенію, мікроангіопатичну гемолітичну анемію і ниркову дисфункцію, який розвивається у 2-10 95 пацієнтів з анамнезом злоякісних новоутворень, що піддаються лікуванню хіміотерапевтичними засобами, такими як гемцитабін, мітоміцин, оксаліплатин і інші подібні засоби. ТМА, пов'язана з хіміотерапією, характеризується незадовільними клінічними результатами з високою смертністю (дивіться, наприклад, ВіаКе-НахкКіпз еї а!., Сііп. Сапсег Вев. 17(18):5858-5866, 2011).
Вважають, що етіологія пов'язаної з хіміотерапією ТМА включає в себе неспецифічне токсичне ушкодження ендотелію мікросудин. На експериментальній моделі індукованої мітоміцином ТМА на тваринах було продемонстровано пряме ушкодження ендотеліальних бо клітин (Сіой У. еї аїЇ.,, Тег. Арпег. Юа). 8:102-11, 2004). Було показано, що ушкодження
Зб ендотеліальних клітин за допомогою ряду механізмів активує лектиновий шлях комплементу.
Наприклад, у публікації гай еї аІ. було показано, що ендотеліальні клітини, які піддаються впливу окисного стресу, активують лектиновий шлях комплементу як іп міїго, так і іп мімо (СоПага еї аї,, Ат. 9. Раїпої. 156(5):1549-56, 2000; Іа Вопгіе 6ї аї, у. Іттипої!. 15; 188(2):885-91, 2012). Іп мімо, цей процес приводить до тромбозу, і було показано, що інгібування лектинового шляху запобігає тромбозу (а Вопіе еї аїЇ. 9. Іттипої. 15; 188(2):885-91, 2012). Крім того, як проілюстровано у винаході в прикладах 37-39, на експериментальній моделі ТМА на мишах, у якій використовували локалізоване фотозбудження РІТС-Оех для індукування локалізованого ушкодження мікроциркуляторного русла з наступним розвитком реакції відповіді у формі ТМА, автори даного винаходу показали, що інгібування МА5Р-2 може запобігати ТМА. Таким чином, ушкодження ендотелію мікросудин хіміотерапевтичними лікарськими засобами може активувати лектиновий шлях комплементу, який потім приводить до локалізованого протромботичного стану і сприяє розвитку реакції відповіді у формі ТМА. Оскільки активація лектинового шляху і виникнення протромботичного стану залежать від МАБР-2, то передбачається, що інгібітори
МАБР-2, що включають, але цим не обмежуючи, антитіла, які блокують функцію МАБ5БР-2, можуть зменшувати розвиток реакції відповіді у формі ТМА ї знижувати ризик виникнення ТМА на фоні протиракової хіміотерапії.
Відповідно, в іншому варіанті здійснення, у винаході пропонуються способи лікування або запобігання ТМА на фоні протиракової хіміотерапії шляхом введення композиції, яка включає терапевтично ефективну кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, такого як антитіла проти МА5Р-2, у фармацевтичному носії, суб'єкту, що страждає від ТМА на фоні протиракової хіміотерапії або має ризик розвитку ТМА на фоні протиракової хіміотерапії. МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять системно суб'єкту, який був підданий, піддається на даний момент або буде піддаватися хіміотерапії наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, можливо, шляхом перорального введення у випадку непептидергічних лікарських засобів. Антитіло проти МАБР-2 може бути введене як монотерапія або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МА5Р-2 з величиною Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у ССР1-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в іп міго дослідженні в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 нм або менше, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці при величині
ІСво ЗО нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Раб, Раб", Е(аб)» і Е(аб)», де антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло є молекулою Ід532, де зазначене антитіло є молекулою Ідс1, де зазначене антитіло є молекулою Ідое4, де молекула Ідс4 включає мутацію 5228Р, і/або де антитіло практично не інгібує класичний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МАБР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує альтернативний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях або альтернативний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, але не зачіпає класичного і альтернативного шляхів комплементу).
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від ТМА на фоні протиракової хіміотерапії, щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 9565, наприклад щонайменше на 50 965, наприклад щонайменше на 60 95, наприклад щонайменше на 70 9о, наприклад щонайменше на 80956, наприклад щонайменше на 8595, наприклад щонайменше на 9095, наприклад щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у пацієнта, що страждає від ТМА на фоні протиракової хіміотерапії, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 956, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 965, щонайменше на 7095, щонайменше на 80 956, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер.
В одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від ТМА на фоні протиракової хіміотерапії, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАБР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що 60 включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності
ЗБЕО ІЮО МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності 5ЕО ІЮО МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності 5ЕО ІЮО МО:67, і В) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легкий ланцюг СОК-Ї1, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ЗЕО ІЮ
МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-І/ 2, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності
ЗБО ІЮ МО:70; ії ії) легсий ланцюг СОК-ІЗ3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності «ЕС ІЮ МО:70, або (ІІ) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 906 тотожністю з 5ЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 9ро, щонайменше з 9295, щонайменше з 9395, щонайменше з 9495, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 96, щонайменше з 97 96, щонайменше з 98 96, щонайменше з 99 95 тотожністю з ЗЕО ІЮ МО:67), і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 956, щонайменше з 92 95, щонайменше з 93 9565, щонайменше з 94 9565, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 96, щонайменше з 97 96, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ЗЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції яка включає кількість МАЗР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5Р-2, розпізнаваній контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ
МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ МО:70.
ТМА на фоні трансплантації
ТМА, пов'язана із трансплантацією (ТА-ТМА), являє собою виснажливий симптом, який може виникати у пацієнтів, яким проводять трансплантацію, наприклад у пацієнтів, яким
Зо проводять трансплантацію алогенних гематопоетичних стовбурових клітин (дивіться, наприклад, Вайв5 апа І агаги5, Вопе Маїтом/ Тгап5ріапіайоп, 40:709-719, 2007). Патогенез цього стану практично не вивчений, але, очевидно, він включає в себе злиття реакцій відповіді, які досягають кульмінації при ушкодженні ендотеліальних клітин (ГабзКіп В.Ї. еї аї., Віоса, 118(6):1452-62, 2011). Як було описано вище, ушкодження ендотеліальних клітин є прототипним стимулом активації лектинового шляху і генерації протромботичних навколишніх умов.
Одержані нещодавно дані додатково підтверджують роль активації комплементу по лектиновому шляху в патогенезі ТА-ТМА. У публікації І абКіп В.Г. еї аї., Тгап5ріапіацйіоп, 27; 96(2):217-23, 2013, було показано, що відкладення С44 у ренальних артеріолах у значно більшому ступені виявлялося у суб'єктів з гістологічною ТА-ТМА (75 95), ніж в контрольних групах (8 95). Тому, С4а може бути маркером патології ТА-ТМА, що вказує на локалізовану фіксацію активації комплементу по лектиновому або класичному шляху.
Оскільки активація лектинового шляху і виникнення протромботичного стану залежать від
МАБ5Р-2, то передбачається, що інгібітори МАБР-2, що включають, але цим не обмежуючи, антитіла, які блокують функцію МА5Р-2, можуть зменшувати розвиток реакції відповіді у формі
ТМА і знижувати ризик виникнення пов'язаної із трансплантацією ТМА (ТА-ТМА).
Відповідно, в іншому варіанті здійснення, у винаході пропонуються способи лікування або запобігання ТМА на фоні трансплантації шляхом введення композиції, яка включає терапевтично ефективну кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, такого як антитіла проти МА5Р-2, у фармацевтичному носії, суб'єкту, що страждає від ТМА на фоні протиракової хіміотерапії або має ризик розвитку ТМА на фоні трансплантації. МАБР-2-інгібуючий засіб вводять системно суб'єкту, який був підданий, піддається на даний момент або буде піддаватися процедурі трансплантації, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно, підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, можливо, шляхом перорального введення у випадку непептидергічних лікарських засобів. Антитіло проти МАБР-2 може бути введене як монотерапія або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб. У деяких варіантах здійснення, У винаході пропонуються способи лікування або запобігання ТМА на фоні трансплантації алогенних стовбурових клітин, які включають введення композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, такого як МА5Р-2-інгібуюче антитіло, суб'єкту до, під час або після проведення трансплантації алогенних стовбурових клітин. бо В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МА5Р-2 з величиною Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп у ССР1-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в іп міго дослідженні в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 нм або менше, зазначене антитіло інгібує відкладення СЗБ в 90 95 людській сироватці при величині
ІСво 30 нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Раб, Раб", Е(аб)» і Е(аб)», де антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло є молекулою Ід532, де зазначене антитіло є молекулою ІдС1, де зазначене антитіло є молекулою Ідое4, де молекула Ідс4 включає мутацію 5228Р, і/або де антитіло практично не інгібує класичний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МАБЗР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує альтернативний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях або альтернативний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, але не зачіпає класичного і альтернативного шляхів комплементу).
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у суб'єкта, що страждає від ТМА на фоні трансплантації, щонайменше на
З0 95, наприклад щонайменше на 4095, наприклад щонайменше на 5095, наприклад щонайменше на 60 95, наприклад щонайменше на 7095, наприклад щонайменше на 80 95, наприклад щонайменше на 85 95, наприклад щонайменше на 90 95, наприклад щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові, узятої у пацієнта, що страждає від ТМА на фоні трансплантації, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70956, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на величину від 95 до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не підданою лікуванню.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер.
В одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від ТМА на фоні трансплантації, який включає введення суб'єкту
Зо композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності зЗЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності БЕО ІЮ
МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67, і 5) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: Її) легкий ланцюг СОК-Ї 1, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності 5ЕО ІЮО МО:70; і її) легкий ланцюг СОК-12, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності ЗЕО ІЮ
МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-І З, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності
ЗБЕО ІЮ МО:70, або (І) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 9о, щонайменше з 9295, щонайменше з 93 95, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 9565, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67), і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 9195, щонайменше з 92 95, щонайменше з 93 956, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 95, щонайменше з 9695, щонайменше з 97956, щонайменше з 98950, щонайменше з 99 95 тотожністю) з «ЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану
БО як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції яка включає кількість МАБЗР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5Р-2, розпізнаваній контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ
МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, описану в послідовності ЗЕО ІЮ МО:70.
ІМ. РОЛЬ МАБР-2 ПРИ ІНШИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ І СТАНАХ І ТЕРАПЕВТИЧНІ МЕТОДИ, У 60 ЯКИХ ВИКОРИСТОВУЮТЬСЯ МАЗР-2-ІНГІБУЮЧІ ЗАСОБИ
ЗАХВОРЮВАННЯ НИРОК
Система активації комплементу залучена в патогенез широкого спектра захворювань нирок, включаючи мембранозно-проліферативний гломерулонефрит (ІдА-нефропатію, хворобу Берже) (Епадо М. еї аї., Сіїй. Мернгоіоду, 55:185-191, 2001), мембранозний гломерулонефрит (Кегіазнкі р., Агеі В Сеї| Раїної. 58:253-71, 1990; Вгепспіеу В.Е. єї а!., Кідпеу Іпі., 41:933-7, 1992; Заїапі 0... ей а. Кідпеу Ійпї 35:976-84, 1989), мембранозно-проліреративний гломерулонефрит (мезангіокапілярний гломерулонефрит) (Вапіом В.С. єї аї. Кідпеу Іпї. 15:294-300, 1979; Меті 5. єї а. У. Ехр. Мей. 175:939-50, 1992), гострий постінфекційний гломерулонефрит (постстрептококовий гломерулонефрит), кріоглобулінемічний гломерулонефрит (Обпзаула І. еї аї.,
Сіїп. Іттипої. 101:59-66, 2001), вовчаковий нефрит (Саїепру Р.А, Ашоіттипку, 11:61-6, 1991) і нефрит на фоні пурпури Шенлейн-Геноха (Епао М. еї а!., Ат. У. Кідпеу Оі5. 35:401-407, 2000).
Залучення комплементу при захворюванні нирок визнається вже протягом декількох десятиліть, однак до даного часу його точна роль у виникненні, розвитку і кінцевій фазі захворювання нирок усе ще є предметом широких дискусій. У нормальних умовах, участь комплементу надає позитивний вплив на організм-хазяїн, але неадекватна активація і відкладення комплементу можуть приводити до ушкодження тканин.
Є суттєвий доказ, що гломерулонефрит, запалення клубочка, часто ініціюється відкладенням імунних комплексів у гломерулярних або тубулярних структурах, яке потім ініціює активацію комплементу, запалення і ушкодження тканин. У публікації Капп Т.М. еї аї., Нібіорай. 26:351-6, 1995, було продемонстровано збільшене відкладення С5р-9 у базальних мембранах канальців при біопсіях, узятих у пацієнтів, що страждають різними формами гломерулонефриту.
У дослідженні пацієнтів з ІдА-нефрологією (АІехорошо5 А. еї аї., Мерпгої. ОіаІ. Тгапе5ріапі. 10:1166-1172, 1995) відкладення С5Б5Б-9 у тубулярних епітеліальних/базальних мембранних структурах корелювало з рівнем креатиніну в плазмі. В іншому дослідженні мембранної нефропатії був продемонстрований взаємозв'язок між клінічними результатами і рівнями 5005р0-9 у сечі (Коп 5.Р. еї аї., Кідпеу Іпі. 48:1953-58, 1995). Підвищені рівні 505Б6-9 мали позитивну кореляцію з несприятливим прогнозом. У публікації Г емо т. еї аї., Кідпеу Іпі. 47:1403-11, 1995, наведені дані по вимірюванню підвищених рівнів СО59, регуляторного фактора комплементу, який інгібує мембраноатакуючий комплекс у цитоплазматичних мембранах, а також С56-9 у сечі
Зо пацієнтів, що страждають мембранозним гломерулонефритом. Гістопатологічний аналіз зразків біопсії, узятих у тих же пацієнтів, показав відкладення білків СЗ і СОУ у клубочках, у той час як експресія СО59 у цих тканинах була зниженою в порівнянні з експресією в тканинах нирок у нормі. Ці різні дослідження дозволяють припустити, що тривалий опосередкований комплементом гломерулонефрит приводить до виведення білків комплементу із сечею, що корелює зі ступенем ураження тканини і із прогнозом захворювання.
Інгібування активації комплементу в різних експериментальних моделях гломерулонефриту на тваринах також показало важливість активації комплементу в етіології захворювання. У моделі мембранозно-проліферативного гломерулонефриту (МРОМ), інфузія антисироватки проти Ту! щурам з Сб-недостатністю (які не здатні синтезувати С5рБ-9) приводило до зменшення гломерулярної клітинної проліферації на 90 95, зниження інфільтрації тромбоцитів і макрофагів на 80 95, зменшення синтезу колагену ІМ типу (маркера експансії мезангіальних матриць) і зниження протеїнурії на 50 95 у порівнянні з немутантними тваринами (Вгапаї .. еї аї.,
Кідпеу Іпії. 49:335-343, 1996). Ці результати вказують на те, що С5Б6Б-9 виконує функцію основного медіатора при ушкодженні тканини комплементом у цій моделі антитимоцитарної сироватки на щурах. В іншій моделі гломерулонефриту, інфузія зростаючих доз кролячої антисироватки до щурячої клубочкової базальної мембрани продукувала залежну від дози міграцію поліморфноядерних лейкоцитів (РММ), яку попередньо ослабляли обробкою фактором отрути кобри (для витрачання комплементу) (Зсапагеїї А.І еї аї!., Ат. у). Рпузіої. 268:г256-Е265, 1995). Щури, яких піддавали обробці фактором отрути кобри, також характеризувалися зменшеною гістопатологією, скороченням тривалої протеїнурії і більш низькими рівнями креатиніну в порівнянні з контрольними тваринами. У публікації Соизег УМ... еї аї., У. Ат. 5об.
Мернгої. 5:1888-94, 1995, при використанні трьох моделей гломерулонефриту (СМ) на щурах (антитимоцитарна сироватка, конкавалін А, анти-конкавалін А і пасивний нефрит Хейманна) була продемонстрована потенційна терапевтична ефективність підходів по інгібуванню комплементу шляхом застосування рекомбінантного білка 5СКІ. Щури, яких піддали обробці 5СКІ, характеризувалися значним зменшенням міграції поліморфноядерних лейкоцитів, тромбоцитів і макрофагів, зниженням мезангіолізу і протеїнурії в порівнянні з контрольними тваринами. Додатковий доказ важливості активації комплементу при гломерулонефриті був одержаний при використанні антитіла МоАБб проти С5 у моделі на мишах МАВЛЛ/ Е1. Антитіла бо МоОАЬ проти С5 інгібують розщеплення С5, тим самим блокуючи генерацію С5а і С5Б-9. Тривала терапія за допомогою антитілам МоАб проти С5 протягом 6 місяців давала в результаті значне поліпшення протікання гломерулонефриту. Гуманізоване моноклональне антитіло МоАб проти
С5 (501.1), яке запобігає розщепленню компонента С5 комплементу людини на його прозапальні компоненти, зараз знаходиться в стадії розробки компанією АїЇехіоп
Рпагтасецшісаї!5, Іпс., (Мем Намеп, Соппесіїси) як перспективний лікарський засіб для лікування гломерулонефриту.
Прямий доказ патологічної ролі комплементу при ушкодженні нирок одержаний при дослідженні пацієнтів з генетично обумовленою недостатністю специфічних компонентів комплементу. У ряді публікацій був документально підтверджений зв'язок захворювання нирок з недостатністю регуляторного фактора комплементу Н (Айії В.Н., Мерпгої. 14:1045-1053, 2000;
Ї ему М. еї аї., Кідпеу Іпі. 30:949-56, 1986; РісКегіпу М.О. єї аї., Маї. Сепеї. 31:424-8, 2002).
Недостатність фактора Н приводить до низьких рівнів фактора В і СЗ у плазмі і витрачання С5р- 9. Атиповий мембранозно-проліферативний гломерулонефрит (МРОМ) і ідіопатичний гемолітичний уремічний синдром (НИЗ) пов'язані з недостатністю фактора Н. Свині з недостатністю фактора Н (дапзеп .У.Н. еї а!., Кідпеу Іпі. 53:331-49, 1998) і нокаутні по фактору Н миші (Ріскегіпд М.С., 2002) проявляють МРОМ-подібні симптоми, що підтверджує важливість фактора Н у регуляції комплементу. Недостатність інших компонентів комплементу пов'язана із захворюванням нирок на фоні розвитку системного червоного вовчака (5ІЕ) (УМаїрогі М...
Рамієз єї аї., Апп. М.У. Асай. 5сі 815:261-81, 1997). Недостатність по С1д, С4 і С2 інтенсивно провокує розвиток 5 Е за допомогою механізмів, що належать до порушеного виведення імунних комплексів і апоптичного матеріалу. У багатьох з пацієнтів, що страждають 5ІЕ, виникає вовчаковий нефрит, що характеризується відкладенням імунних комплексів по всьому клубочку.
Додаткові докази, що вказують на зв'язок активації комплементу із захворюванням нирок, були одержані при ідентифікації у пацієнтів аутоантитіл, спрямованих проти компонентів комплементу, деякі з яких були безпосередньо пов'язані із захворюванням нирок (Тгоцму І.А. еї а!., Мої. Іттипої. 38: 199-206, 2001). Число цих аутоантитіл корелює з захворюванням нирок з настільки високим ступенем, що для позначення даної активності був введений термін "нефритогенний фактор (Мет) ". У клінічних дослідженнях, приблизно у 50 95 пацієнтів з
Зо позитивними нефритогенними факторами розвивався МРОМ (Зріїег К.Е. еї аї., Сііп. Іттипо).
Іттипораїної. 64:177-83, 1992). СЗМеБ являє собою аутоантитіло, спрямоване проти С3- конвертази (СЗЬВЬ) альтернативного шляху, і воно стабілізує цю конвертазу, тим самим сприяючи активації альтернативного шляху (Оайа М.К. еї аї.,». Іттипої. 116:1-7, 1976). Таким же чином, аутоантитіло зі специфічністю до СЗ-конвертази (С4рга) класичного шляху, називане сС4мМеРн, стабілізує цю конвертазу і у результаті промотує активацію класичного шляху (Юайа
М.Н. еїаї.,». Іттипої. 125:2051-2054, 1980; НаІржаснз І. еї аї., 9. Сіїп. Іпмеві. 65:1249-56, 1980).
Було описано, що аутоантитіла проти С14 пов'язані з нефритом у пацієнтів, що страждають 5 Е (Номаїн І. єї а)ї., Сіїп. Ехр. Впєитацй)!. 19:667-72, 2001; Зіедегі С. еї аї., У. КПпештацої. 18:230-34, 1991; біедеп С. еї аї., Сіп. Ехр. ВНештаїй!. 10:19-23, 1992), і повідомлялося, що підвищення титру цих аутоантитіл проти С1д може використовуватися як прогностичний фактор раптового загострення нефриту (Согетап5 І.Е. еї аїЇ.,, Ат. У). Кідпеу Оі5. 26:595-601, 1995). Імунні відкладення, витягнуті із нирок померлих пацієнтів, що страждали від 5ІЕ, виявляли акумуляцію в них цих аутоантитіл проти С14д (МаппіскК М. еї а!., Агійгйі5 Кпешитагйої. 40:1504-11, 1997). Усі ці факти вказують на патологічну роль даних аутоантитіл. Однак не у всіх пацієнтів з аутоантитілами проти Ст14 розвивається захворювання нирок, і, крім того, деякі здорові індивідууми також мають низький титр аутоантитіл проти С14 (Зіедегі С.Е. еї аї., СіІїп. Іттипої.
Іттипораїйної. 67:204-9, 1993).
Крім альтернативного і класичного шляхів активації комплементу, у захворюванні нирок може також відіграти важливу патологічну роль лектиновий шлях активації комплементу.
Підвищені рівні МВІ, МВІ--асоційованої серинової протеази і продуктів активації комплементу були виявлені імуногістохімічними методами в біоптатах нирок, узятих у пацієнтів, що страждають рядом різних захворювань нирок, включаючи нефрит на фоні пурпури Шенлейн-
Геноха (Епоо М. еї а!., Ат. 9. Кіайпеу рів. 35:401-407, 2000), кріоглобулемічний гломерулонефрит (Онзама . єї аї., Сіїй. Іттипої. 101:59-66, 2001) і ІдДА-нейропатію (Епао М. еї аї., Сіїп. Мерпгоїоду, 55:185-191, 2001). Тому, незважаючи на той факт, що зв'язок між комплементом і захворюванням нирок відомий вже протягом декількох десятиліть, дослідження того, як конкретно комплемент впливає на ці захворювання нирок, ще далекі від свого завершення.
ЗАХВОРЮВАННЯ КРОВІ
Сепсис обумовлений генералізованою реакцією пацієнта на інвазію мікроорганізмів. бо Основною функцією системи комплементу є керування запальною реакцією на інвазивні бактерії та інші патогени. У численних дослідженнях було показано, що активація комплементу займає центральне місце в патогенезі сепсису, що узгоджується з фізіологічною роллю комплементу (Вопе К.С., Аппаї5. Іпіегпа!. Мед. 115:457-469, 1991). Визначення клінічних проявів сепсису знаходиться ще в стадії розвитку. Сепсис звичайно описують як системну відповідь організму-хазяїна на інфекцію. Однак у багатьох випадках у пацієнтів із симптомами сепсису не виявляють очевидних клінічних ознак інфекції (наприклад, позитивних бактеріальних гемокультур). Це протиріччя вперше було винесене на обговорення на Конференції по досягненню консенсусу в 1992, на якій був введений термін "синдром системної запальної відповіді" (зубівтіс іпПаттайюгу гезропбоє зупаготе, 5ІК5), для якого не було потрібне виявлення наявності бактеріальної інфекції (Вопе Е.С. еї аї.,, Ст. Саге Меа. 20:724-726, 1992).
На даний час існує загальна думка, що сепсис і 5ІК5 супроводжуються нездатністю регулювати запальну реакцію. Застосовно до цілей цього короткого огляду, автори винаходу вважають, що клінічне визначення сепсису також включає в себе важку форму сепсису, септичний шок і 5ІКЗ.
До кінця 1980 років домінуючим джерелом інфекції у пацієнтів, що страждають від сепсису, були грамнегативні бактерії. Було відомо, що ін'єкція тваринам ліпополісахариду (ЛПС), основного компонента клітинної стінки грамнегативних бактерій, стимулює вивільнення медіаторів запалення із клітин різного типу і викликає симптоми гострого інфекційного захворювання (Наєпеу М.В. еї аї., Апіїтістобіа! Спетоїпегару 41 (Зиррі. А):41-6, 1998). Цікаво відзначити, що спектр відповідальних за розвиток захворювання мікроорганізмів через невідомі поки причини явно змістився від переважно грамнегативних бактерій наприкінці 1970-х і 1980-х років до переважно грампозитивних бактерій на даний час (Мапіп С.5. еї аіІ., М. Епд. У. Мей. 348:1546-54, 2003).
У численних дослідженнях була продемонстрована важлива роль активації комплементу в опосередкуванні запалення і у внеску в характерні особливості шоку, зокрема септичного і геморагічного шоку. Септичний шок звичайно провокують як грамнегативні, так і грампозитивні мікроорганізми. ЛІС є потенційним активатором комплементу переважно по альтернативному шляху, хоча також виникає і класичний шлях активації, опосередкований антитілами (ЕРеагоп
О.Т. еї аї., М. Епді. У. Меа. 292:937-400, 1975). Основними компонентами клітинних стінок грампозитивних бактерій є пептидоглікан і ліпотейхоєва кислота, і обидва компоненти є
Зо потенційними активаторами альтернативного шляху активації комплементу, хоча при наявності специфічних антитіл вони також можуть активувати і класичний шлях активації комплементу (Чоїпег К.А. еї а!., Апп. Нем. Іттипої. 2:461-2, 1984).
Спочатку патогенез сепсису пов'язували з системою комплементу, коли дослідниками було відзначено, що анафілатоксини СЗа і Сба опосередковують цілий ряд запальних реакцій, які також можуть виникати при сепсисі. Ці анафілатоксини індукують вазодилатацію і підвищення мікроваскулярної проникності, ускладнення, які відіграють центральну роль при септичному шоку (Зспитаспег УУ.А. еї аї., Адепіб5 Асіоп5 34:345-349, 1991). Крім того, анафілатоксини індукують бронхоспазм, вивільнення гістаміну з мастоцитів і агрегацію тромбоцитів. Більше того, вони виявляють численні впливи на гранулоцити, такі як хемотаксис, агрегація, адгезія, вивільнення лізосомальних ферментів, генерація токсичного супероксид-аніона і утворення лейкотриєнів (Зпіп Н.5. еї аї., 5сіепсе 162:361-363, 1968; Моді М., Сотріетенпі, 3177-86, 1986).
Вважають, що ці біологічні впливи відіграють деяку роль у розвитку ускладнень при сепсисі, таких як шок або синдром гострої дихальної недостатності (АКО5) (Натітегесптійї О.Е. еї аї.,
І апсеї, 1:947-949, 1980; Біоїтап С... єї аїІ., Зигдегу, 99:744-50, 1986). Більше того, підвищені рівні анафілатоксину СЗа пов'язані з летальним кінцем при сепсисі (Наск С.БЕ. еї аІ., Ат. У. Меа. 86:20-26, 1989). У деяких експериментальних моделях шоку на тваринах, визначені штами з недостатністю комплементу (наприклад, штами з недостатністю С5) є більш стійкими до ефектів, що викликаються інфузією ЛПС (Нзеийй УМ. еї а1ї., Іттипої. 70:309-14, 1990).
Було показано, що блокування генерації Сба за допомогою антитіл на початку розвитку сепсису у гризунів приводить до значного підвищення виживаності (Сгептак В. 5. еї аї., маї.
Меа. 5:788-792, 1999). Аналогічні висновки були зроблені при блокуванні рецептора С5а (С5ак) як за допомогою антитіл, так і за допомогою низькомолекулярного інгібітору (Нибег-ІГапд М.5. єї аІ,, ЕАБЕВ 3). 16:1567-74, 2002; Вівдетапп М.С. еї аї., 9. Сііп. Іпмеві, 110:101-8, 2002). Проведені раніше експериментальні дослідження на мавпах дозволили зробити припущення про те, що блокада Сб5а за допомогою антитіл полегшувала септичний шок, викликаний кишковою паличкою, і синдром дихальної недостатності у дорослих (Напдеп О.Н. еї аї., 9. Зигу. Кев. 46:195-9, 1989; бібємепзв У.Н. єї аї., уУ. Сіїп. Іпмеві. 77:1812-16, 1986). У людей, що страждають сепсисом, був підвищений рівень С5а, що пов'язували зі значним зниженням рівня виживаності разом з мультиорганною недостатністю в порівнянні їз цими показниками у пацієнтів з менш бо важкою формою сепсису і пацієнтами, що вижили (Макає Н. еї аіІ., Ке5. Соттип. Спет. РаїноЇ.
Ріпаптасої. 84:189-95, 1994; МакКає еї аї., 5йиг9у. Тодау, 26:225-29, 1996; Вепдізоп А. еї аї.,Агтсн.
Зиг9. 123:645-649, 1988). Механізми, за допомогою яких Сба виявляє свої шкідливі впливи при сепсисі, потребують більш докладного дослідження, однак нещодавно одержані дані дозволяють припустити, що генерація С5а при сепсисі значною мірою порушує вроджені імунні функції нейтрофілів крові (Нирег-Гапд М.5. еї аї., У. Іттипої. 169:3223-31, 2002), їх здатність викликати ріст дихальної активності і генерувати цитокіни (Кіедетапп М.С. еї аї., Іттипкйу, 19:193-202, 2003). Крім того, генерація Сба при сепсисі, очевидно, виявляє прокоагулюючий ефект (І ацадез І... еї аї., Ат. У. Раїйої. 160:1867-75, 2002). Модулюючий комплемент білок СІ
ІМН також продемонстрував свою ефективність в експериментальних моделях сепсису і АКО5 на тваринах (бісКпейе 0., Вейгіпд Іпв. МІН. 93:299-305, 1993).
Лектиновий шлях також може відіграти деяку роль у патогенезі сепсису. Було показано, що
МВІ може зв'язуватися з цілим рядом клінічно важливих мікроорганізмів, включаючи як грамнегативні, так і грампозитивні бактерії, і активувати лектиновий шлях (Меїй 0. еї аї., Іптесі.
Ітітип. 55:688, 2000). Ліпотейхоєву кислоту (І ТА) останнім часом усе частіше розглядають як грампозитивний аналог ЛПС. Вона є потенційним імуностимулятором, який індукує вивільнення цитокінів з мононуклеарних фагоцитів і цільної крові (Могаїйй 5. еї аї., У. Ехр.Меай. 195:1635, 2002;
Могагп 5. еї аї., Іптесї. Іттип. 70:938, 2002). Нещодавно було показано, що І1 -фіколін специфічно зв'язується з ІГТА, виділеною із численних видів грампозитивних бактерій, включаючи золотистий стафілокок, і активує лектиновий шлях (Гупсп М.9. еї аї., У. Іттипої. 172:1198-02, 2004), Крім того, було показано, що МВІ зв'язується з ГТА фекального стрептокока, у якій полігліцерофосфатний ланцюг заміщений глікозильними групами, але не з
І ТА дев'яти інших видів, що включають золотистий стафілокок (Роіої5Ку М.У. еї а). Іптесії. Іттип. 64:380, 1996).
Таким чином, один аспект даного винаходу пропонує спосіб лікування сепсису або стану, що виник у результаті сепсису, шляхом введення композиції, яка включає терапевтично ефективну кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу у фармацевтично прийнятному носії, суб'єкту, що страждає від сепсису або стану, що виник у результаті сепсису, включаючи, без обмеження, важку форму сепсису, септичний шок, синдром гострої дихальної недостатності, що виникла на фоні сепсису, і синдром системної запальної реакції. Пропонуються споріднені способи для лікування інших
Зо захворювань крові, включаючи геморагічний шок, гемолітичну анемію, аутоїмунну тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (ТТР), гемолітичний уремічний синдром (НИ5) або інші деструктивні захворювання кісткового мозку/крові, шляхом введення композиції, яка включає терапевтично ефективну кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу у фармацевтично прийнятному носії, суб'єкту, що страждає від такого стану. МА5Р-2-інгібуючий засіб вводять суб'єкту системно, наприклад, внутрішньоартеріально, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інгаляційно (зокрема, у випадку
АКО5), підшкірно або іншим способом парентерального введення, або, можливо, шляхом перорального введення у випадку непептидергічних лікарських засобів. Композиція МА5Р-2- інгібуючого засобу може бути об'єднана з одним або більше додатковими терапевтичними засобами для боротьби з ускладненнями сепсису й/або шоку. У випадку прогресуючої стадії сепсису або шоку, або порушення, що виникло у результаті цих захворювань, інгібуюча МАБР-2 композиція може бути відповідним чином введена у вигляді лікарської форми швидкої дії, наприклад шляхом внутрішньовенної або внутрішньоартеріальної доставки болюсу розчину, що містить композицію МА5Р-2-інгібуючого засобу. Введення може бути проведене повторно за рішенням лікаря доти, поки хворобливий стан не буде усунутий.
КОАГУЛОПАТІЇ
Був представлений доказ ролі системи комплементу в дисемінованій внутрішньосудинній коагуляції (ОІС), такій як СІС на фоні серйозного тілесного ушкодження.
Попередні дослідження показали, що С4-/- миші не захищені від реперфузійного ушкодження нирок (2пои МУ. еї а!., "Ргєдотіпапі гоЇе Тог С5р-9 іп гепаї! ізспетіа/герепиивіоп іпішгу",
У. Сіїп. Іпмезі. 105:1363-1371 (2000)). З метою вивчення здатності С4-/- мишей активувати комплемент по класичному або лектиновому шляху, вимірювали оборот СЗ у плазмі С4-/- мишей методами аналізу, специфічними до спрямування активації по класичному або лектиновому шляху. Незважаючи на те, що при ініціації активації по класичному шляху не спостерігалося розщеплення С3, проте спостерігалася високоефективна залежна від лектинового шляху активація СЗ у дефіцитній по С4 сироватці (фігура 30). Очевидно, що у
МАБР-2-/- мишей відкладення СЗ3БбБ на манані і зимозані серйозно порушене навіть при експериментальних умовах, що, відповідно до багатьох раніше опублікованих даних по активації альтернативного шляху, повинно спостерігатися і для всіх трьох шляхів. При використанні однакової сироватки в ямках, покритих імуноглобуліновими комплексами замість бо манану або зимозану, відкладення СЗБ і розщеплення фактора В спостерігаються в сироватці
МАБР-2-/- мишей і в сироватці МА5ЗР-2-/- мишей, але не в сироватці, збідненій по Сід. Це вказує на те, що активація альтернативного шляху полегшується в МА5Р-2-/- сироватці, коли вихідний СЗ3Б забезпечується за допомогою класичної активності. На фігурі З0С графічно проілюстровані несподівано одержані дані про те, що СЗ3 може бути ефективно активований залежним від лектинового шляху способом у плазмі, дефіцитній по С4.
Цей "обхідний шлях активації С4" усувається інгібуванням активації лектинового шляху шляхом попередньої інкубацію плазми з розчинним мананом або манозою.
Аберантна неімунна активація системи комплементу представляє потенційну небезпеку для людини, а також може відігравати важливу роль в активації гематологічного шляху, особливо у випадках серйозних ушкоджень, при яких активуються запальний і гематологічний шляхи. У здорових людей, конверсія СЗ становить «5 95 від загального СЗ білка плазми. При сильно розповсюдженій інфекції, що включає зараження крові і хворобу імунних комплексів, конверсія
С3 відновлюється сама по собі приблизно до 30 95 з рівнями комплементу звичайно більш низькими, ніж нормальні, внаслідок підвищеного використання і змін у розподілі пулу. Негайна активація шляху СЗ більше 30 95 звичайно надає безсумнівний клінічний доказ вазодилатації і втрати рідини в тканинах. При конверсії ССЗ понад 30 95, ініціюючі механізми є переважно неімунними, і обумовлені ними клінічні прояви захворювань становлять небезпеку для пацієнта.
Рівні комплементу С5 у здорових людей і при контрольованому захворюванні є більш стійкими, ніж С3. Суттєві зниження і або конверсія рівнів С5 пов'язані з реакцією пацієнта на атипову політравму (наприклад, дорожньо-транспортні випадки) і ймовірним розвитком синдромів шокової легені Таким чином, будь-який доказ активації комплементу ССЗ вище 30 95 васкулярного пулу або будь-якої участі С5, або і того, і іншого, може розглядатися як ймовірний провісник небезпечної патологічної зміни у пацієнта.
С ії С5 вивільняють анафілатоксини (СЗа і С5а), які впливають на тучні клітини і базофіли, вивільняючи судинорозширювальні хімічні речовини. Вони встановлюють хемотаксичні градієнти для спрямування поліморфноядерних клітин (РММ) у центр імунологічних порушень (лікувальна реакція), але тут вони відрізняються, оскільки Сб5а виявляє специфічний ефект грудкоутворення (агрегації) на ці фагоцити, запобігаючи їх випадковому віддаленню від місця реакції. При нормальній боротьбі з інфекцією, СЗ активує С5. Однак при політравмі, С5,
Зо очевидно, значною мірою активується, системно генеруючи анафілатоксини Сба. Ця неконтрольована активність змушує поліморфи утворювати грудки в судинній системі, потім ці грудки захоплюються в капіляри легенів, які вони закупорюють і викликають локальні ушкоджуючі впливи в результаті вивільнення супероксиду. Не включаючи як доказ яку-небудь теорію, проте, можна припустити, що цей механізм є важливим у патогенезі синдрому гострої дихальної недостатності (АКО5), хоча ця точка зору нещодавно піддавалася сумніву. Може бути продемонстровано, що анафілатоксини СЗа іп мйго є потужними агрегаторами тромбоцитів, але їх участь іп мімо менш очевидна, і вивільнення тромбоцитарних речовин і плазміну при загоєнні рани може тільки вдруге залучати комплемент С3. Можливо, що необхідний тривалий підйом активації СЗ для генерації ОІС.
Крім клітинних і судинних ефектів вищеописаного активованого компонента комплементу, які можуть пояснити зв'язок між травмою і ОІС, нові наукові відкриття виявили прямі молекулярні зв'язки і різку функціональну реакцію між комплементом і коагулюючими системами. Підтверджуючі дані були одержані при дослідженнях дефіцитних по СЗ3 мишей.
Оскільки СЗ є загальним компонентом для кожного зі шляхів комплементу, то очікується, що у дефіцитних по СЗ мишей відсутня повна функція комплементу. Однак, дивно, але дефіцитні по
СЗ миші здатні повністю активувати термінальні компоненти комплементу (Нибег-І апд М. еї аї., "Сепегайоп ої Сба іп Ше арзепсе ої С3: а пем/у сотріетепі асіїмайоп раїпулау, " Маї. Меєеї, 12:682-687 (2006)). При проведенні глибоких досліджень було виявлено, що СЗ-незалежна активація термінальних компонентів комплементу опосередкована тромбіном, ферментом, що обмежує швидкість коагуляційного каскаду (Нибег еї аїІ., 2006). Молекулярні компоненти, опосередковуючі активацію тромбіну після початкової активації комплементу, залишилися нез'ясованими.
Автори даного винаходу пояснили, що слід вважати молекулярним базисом для різкої реакції між комплементом і коагуляційними каскадами і ідентифікували МА5Р-2 як центральну контрольну точку, що зв'язує дві системи. Біохімічні дослідження субстратної специфічності
МА5БР-2 дозволили ідентифікувати протромбін як можливий субстрат на доповнення до широко відомих білків комплементу С2 і С4. МАБР-2 специфічно розщеплює протромбін у функціонально релевантних місцях, генеруючи тромбін, фермент, що лімітує швидкість коагуляційного каскаду (Ктагир А. еї аї., "бітинапеоив Асіїмайоп ої Сотрієтепі апа Соадиіайоп 60 ру МВІ -аззосіаїей 5егіпе Ргоїєазе 2", Ріо5. ОМЕ. 2:е623 (2007)). Тромбін, генерований МА5Р-2,
здатний промотувати відкладення фібрину у визначеній відновленій системі іп міїго, демонструючи функціональну релевантність МАБР-2 розщеплення (Кгагир еї аї., 2007). Як це обговорюється в наведених нижче в цьому винаході прикладах, автори даного винаходу додатково підтвердили фізіологічну значимість даного відкриття шляхом документованого підтвердження активації тромбіну в сироватці здорових гризунів після активації лектинового шляху, і також продемонстрували, що цей процес блокується за допомогою моноклональних антитіл, що нейтралізують МА5Р-2.
МА5БР-2 може представляти центральну точку розгалуження в лектиновому шляху, здатну промотувати активацію обох систем комплементу і коагуляції. Оскільки активація лектинового шляху являє собою фізіологічну реакцію відповіді на багато які види травматичних ушкоджень, автори даного винаходу вважають, що супутнє системне запалення (опосередковане компонентами комплементу) і дисеміновану коагуляцію (опосередковану через коагуляційний шлях) можна пояснити здатністю МА5Р-2 активувати обидва шляхи. Ці висновки чітко вказують на роль МА5Р-2 у виникненні 0ІС і на позитивний терапевтичний ефект інгібування МА5Р-2 при лікуванні або запобіганні БІС. МАБР-2 може забезпечити молекулярний зв'язок між комплементом і коагулюючою системою, і активація лектинового шляху, що виникає при різних травмах, може безпосередньо ініціювати активацію коагулюючої системи через вісь МАБР-2- тромбін, забезпечуючи механізм зв'язку між травмою і БІС. Відповідно до аспекту даного винаходу, інгібування МА5Р-2 повинно інгібувати активацію лектинового шляху і зменшувати генерацію обох анафілатоксинів СЗа і Сба. Вважаються, що необхідний тривалий підйом активації СЗ для генерації ОІС.
Мікроциркуляторна коагуляція (тромби в капілярах і дрібних кровоносних судинах) виникає в умовах септичного шоку. Роль лектинового шляху при септичному шоку встановлена і підтверджена на експериментальних моделях сепсису на мишах із захищеним фенотипом
МА5Р-2 (-/-), описаних у прикладі 17 і на фігурах 18 і 19. Більше того, як продемонстровано в прикладі 15 і на фігурах 16А і 168, МА5Р-2 (-/-) миші захищені в експериментальній моделі локалізованої реакції Шварцмана дисемінованої внутрішньосудинної коагуляції (ОІС), у моделі локалізованої коагуляції в мікросудинах.
М. МАБР-2-ІНГІБУЮЧІ ЗАСОБИ
Зо В одному аспекті, даний винахід пропонує способи інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає від тромботичної мікроангіопатії або має ризик розвитку тромботичної мікроангіопатії. МА5Р-2-інгібуючі засоби вводять у кількості, ефективній для інгібування МА5БР-2-залежної активації комплементу в живих організмах. При здійсненні на практиці цього аспекту винаходу, типові МА5Р-2-інгібуючі засоби включають молекули, які інгібують біологічну активність МА5Р-2 (такі як низькомолекулярні інгібітори, антитіла проти
МАБ5БР-2 або блокуючі пептиди, які взаємодіють із МА5Р-2 або перешкоджають білок-білковій взаємодії), і молекули, які знижують експресію МАБР-2 (такі як МАБ5БР-2-молекули антисмислових нуклеїнових кислот, МА5Р-2-специфічні молекули КМАЇї і МАЗР-2-рибозими), за допомогою яких попереджується МАБР-2-активація лектинового шляху комплементу. МАЗР-2- інгібуючі засоби можуть бути використані як первинна монотерапія або в комбінації з іншими терапевтичними засобами як допоміжна терапія для посилення позитивних терапевтичних ефектів інших терапевтичних способів лікування.
Інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу характеризується щонайменше однією з наступних змін у компоненті системи комплементу, які виникають у результаті введення
МАБР-2-інгібуючого засобу згідно зі способами винаходу: інгібування генерації або продукування продуктів С46, СЗа, Сба й/або С55-9 (МАС) МА5Р-2-залежної активації системи комплементу (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 2), зниження активації комплементу, визначуване в гемолітичному дослідженні з використанням несенсибілізованих еритроцитів кроликів або морських свинок (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 33), зниження розщеплення С4 і відкладення С4Бб (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 2) або зниження розщеплення СЗЗ і відкладення СЗБ (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 2).
Відповідно до даного винаходу застосовуються ті МА5Р-2-інгібуючі засоби, які ефективно інгібують МАБР-2-залежну активацію системи комплементу. МАБР-2-інгібуючі засоби, застосовувані при здійсненні на практиці цього аспекту за винаходом, включають антитіла проти
МАБР-2 і їх фрагменти, інгібуючі МАБЗР-2 пептиди, низькомолекулярні речовини, МА5Р-2 розчинні рецептори і інгібітори експресії. МАЗР-2-інгібуючі засоби можуть інгібувати МА5Р-2- залежну активацію системи комплементу шляхом блокування біологічної функції МА5Р-2.
Наприклад, інгібуючий засіб може ефективно блокувати МАБР-2 білок-білкові взаємодії, перешкоджати димеризації або збиранню МАБР-2, блокувати Саг-зв'язування, зачіпати 60 активний сайт МА5Р-2 серинпротеази або знижувати експресію білка МАБР-2.
У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючі засоби селективно інгібують МА5Р-2- активацію комплементу, не зачіпаючи С14 залежної активації системи комплементу.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуючий засіб, застосовуваний в способах за винаходом, являє собою специфічний МА5Р-2-інгібуючий засіб, який специфічно зв'язується з поліпептидом, що включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:6, з афінністю щонайменше вдесятеро більш високою, ніж з іншими антигенами в системі комплементу. В іншому варіанті здійснення,
МА5Р-2-інгібуючий засіб специфічно зв'язується з поліпептидом, що включає послідовність ЗЕО
ІО МО:6, з афінністю зв'язування щонайменше в 100 разів більшою, ніж з іншими антигенами в системі комплементу. Афінність зв'язування МА5Р-2-інгібуючого засобу може бути визначена, використовуючи придатний метод аналізу зв'язування.
МАБР-2 поліпептид характеризується молекулярною структурою, аналогічною структурі
МАБР-1, МАБР-3, і Сіг і С15 протеаз С1 системи комплементу. Молекула кКДНК, описана в послідовності з«ЕО ІЮ МО:4, кодує типовий приклад МА5Р-2 (що складається з амінокислотної послідовності, описаної в послідовності зЕО ІЮО МО:5) і продукує людський МА5Р-2 поліпептид з лідерною послідовністю (аа 1-15), який розщеплюється після секреції, даючи в результаті зрілу форму людської МА5Р-2 (З5ЕО ІО МО:6). Як показано на фігурі 2, ген людської МАБР-2 охоплює дванадцять екзонів. МА5Р-2 КкДНК людини кодується екзонами В, С, О, ГЕ, 0, Н, І, У, Кі.
Альтернативне сплайсування дає в результаті білок з молекулярною масою 20 кДа, називаний
МВІ -асоційованим білком 19 ("МАр19", також називаним "ЗМАР") (ЗЕО ІЮ МО:2), кодований послідовністю ЗЕО ІЮ МО-1, що виникає з екзонів В, С, О і Е, як показано на фігурі 2. Молекула
КДНК, описана в послідовності 5ЕО ІЮ МО:50, кодує мишачу МА5БР-2 (що складається з амінокислотної послідовності, описаної в 5ЕО ІЮ МО:51) і дає мишачий МА5Р-2 поліпептид з лідерною послідовністю, який розщеплюється після секреції, приводячи в результаті до зрілої форми мишачої МА5ЗР-2 (5ЕО ІЮ МО:52). Молекула кКДНК, описана в послідовності ЗЕО ІЮ
МО:53, кодує щурячу МА5Р-2 (що складається з амінокислотної послідовності, описаної в ЗЕО
ІО МО:54) і дає щурячий МАБР-2 поліпептид з лідерною послідовністю, який розщеплюється після секреції, приводячи в результаті до зрілої форми щурячої МАБР-2 (З5ЕО ІЮО МО:55).
Для фахівців у цій галузі є очевидним, що послідовності, описані в ЗЕО ІЮ МО:4, 5ЕО І
МО:50 ї БЕО ІЮ МО:53, представляють одиничні алелі людської, мишачої і щурячої МА5Р-2,
Зо відповідно, і що передбачається виникнення алельної варіації і альтернативного сплайсування.
Алельні варіації нуклеотидних послідовностей, описаних в 5ЕО ІЮ МО:4, ЗЕО ІЮ МО:50 і ЗЕО ІЮ
МО:53, у тому числі ті, які містять мовчазні мутації, і ті, у яких мутації приводять до змін амінокислотної послідовності, входять в обсяг даного винаходу. Алельні варіації МА5БР-2 послідовності можуть бути клоновані за допомогою зондуючої кКДНК або банків генів від різних індивідуумів згідно зі стандартними методиками.
Домени білка людської МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6) показані на фігурі 1 ії 2А і включають М- термінальний домен Сіг/С15/фактора росту ендотелію судин (Мед) морського їжака/морфогенного білка кісток (СОВІ) (аа 1-121 послідовності БЗЕО ІЮ МО:6), домен, подібний епідермальному фактору росту (аа 122-166), другий домен СИВІ (аа 167-293), а також тандемні домени білків, що контролюють активність комплементу, і домен серинпротеази. Альтернативне сплайсування гена МА5Р-2 дає в результаті МАр19, показаний на фігурі 1. МАр19 являє собою неферментний білок, що містить М-термінальну СОВІ ЕСЕ область МА5БР-2 із чотирма додатковими залишками (ЕОЗІ), одержаними з екзона Е, показаного на фігурі 1.
Було показано, що різні білки зв'язуються або взаємодіють з МА5Р-2 у результаті білок- білкових взаємодій. Наприклад, відомо, що МАБР-2 зв'язується і утворює Саг-залежні комплекси з лектиновими білками МВ, Н-фіколіну і І -фіколіну. Було показано, що кожний комплекс МА5БР-2/лектин активує комплемент через МА5БР-2-залежне розщеплення білків С4 і
Сг (Ікеда К. еї аї!., у. Віої. Снет. 262:7451 7454, 1987; Маївивніа М. еї аї., У. Ехр. Мед. 176:1497 2284, 2000; Маїзизпйа М. еї аї., У. Іттипої. 168:3502 3506, 2002). Дослідження показали, що домени СОВ1-ЕСЕ МАБР-2 мають велике значення при асоціації МАБР-2 з МВІ. (Тпівієп5 М.М. еїг а, У. Іттипої. 166:5068, 2001). Було також показано, що домени СИОВТ'ЕСЕСИВІЇ опосередковують димеризацію МА5Р-2, яка потрібна для утворення активного комплексу МВІ. (Умаїїїв Є. еї аї., 9. Віої. Спет. 275:30962 30969, 2000). Тому, можуть бути ідентифіковані МАЗР- 2-інгібуючі засоби, які зв'язуються або взаємодіють із МА5Р-2 таргетними областями, про які відомо, що вони є важливими для МА5Р-2-залежної активації комплементу.
АНТИТІЛА ПРОТИ МА5БР-2
У деяких варіантах здійснення цього аспекту винаходу, МА5Р-2-інгібуючий засіб включає антитіло проти МАБ5БР-2, яке інгібує МА5БР-2-залежну активацію системи комплементу. Антитіла проти МАБР-2, застосовувані в цьому аспекті винаходу, включають поліклональні, 60 моноклональні або рекомбінантні антитіла, одержані з будь-якого антитіла, продукованого ссавцем, і вони можуть являти собою поліспецифічні, химерні, гуманізовані, антиідіотипічні антитіла і фрагменти антитіл. Фрагменти антитіл включають фрагменти Раб, Раб", Е(аб)2, Нав)»,
Ем, зсЕм-фрагменти і одноланцюжкові антитіла, описані у винаході далі.
У літературі описані різні антитіла проти МА5Р-2, деякі з яких наведені нижче в таблиці 1. Ці раніше описані антитіла проти МА5Р-2 можуть бути піддані скринінгу на їх здатність інгібувати
МА5БР-2-залежну активацію системи комплементу, використовуючи описані у винаході методи досліджень. Наприклад, були ідентифіковані Гар2 щурячі антитіла проти МА5Р-2, які блокують
МА5БР-2-залежну активацію комплементу, як це більш докладно описано у винаході в прикладах ї 11. Після того, як ідентифіковане антитіло проти МАБР-2, яке діє як МА5Р-2-інгібуючий 10 засіб, воно може бути використане для продукування антиідіотипічних антитіл і використане для ідентифікації інших МА5Р-2-зв'язуючих молекул, описаних нижче.
Таблиця 1
Мазр-2-специфічні антитіла, описані в науковій літературі
Іттипої. 37:803 811, 2000
Рекомбінантний людський МоїІег-Кгівівєпзеп М. еїаї.,».
ССРІ/2 5Р фрагмент (МоАБ | Щуряче МоАБ (субклас ІдС1) ої Іттипої. Меїпоав5, 282:159 885 167, 2003
МАМ Моїег-Кгібїепзеп М. еї аї. У. (перехресні реакції з МА5Р- Щуряче МоАБ (субклас ІдС1) "У Іттипої. Меїпоав, 282:159 2 67, 2003
Мишаче МоАЬБ (5/Р)
М-термінальне) бат м, Лр
Щуряче МоАбБ:
ПМАБР-2 (ССРІ-ССР2- ВР Мітоаь 101, продуковане клітинами | МО 2004/106384 домен) лінії гібридоми 03050904 (ЕСАСС)
Мишачі Модбз:
Мітоаб 104, продуковане клітинами лінії гібридоми МО545УМО35 (05М2) й - Мітоаб 108, продуковане клітинами
ПМАЗР-2 (повнорозмірний- | її гібридоми МОБА5УМО29 (05М2)| МО 2004/106384 мічений гістидином) . .
Мітоаб 109, продуковане клітинами лінії гібридоми МО545УМО046 (05М2)
Мітоаб 110, продуковане клітинами лінії гібридоми МО545УМО048 (05М2)
АНТИТІЛА ПРОТИ МА5БР-2 ЗІ ЗНИЖЕНОЮ ЕФЕКТОРНОЮ ФУНКЦІЄЮ
У деяких варіантах здійснення цього аспекту винаходу, антитіла проти МАБР-2 мають знижену ефекторну функцію для того, щоб зменшувати запалення, яке може виникати в результаті активації класичного шляху комплементу. Було показано, що здатність молекул Іо ініціювати класичний шлях комплементу властива внутрішній Ес-частині молекули (Юипсап А.К. еї аї., Маїшге, 332:738-740, 1988). Молекули дос, у яких Ес-ч-астина молекули була видалена шляхом ферментативного розщеплення, позбавлена цієї ефекторної функції (дивіться Нагіому,
Апііродіе5: А І абогаїогу Мапиаї!ї, Соїй 5ргіпд Нагрог ІГарогаїогу, Мем мок, 1988). Відповідно, антитіла зі зниженою ефекторною функцією можуть бути утворені в результаті недостатності
Ес-частини молекули за рахунок наявності генетично сконструйованої Ес-послідовності, яка мінімізує ефекторну функцію або є ізотипом людського Ідо2 або Ідс4.
Антитіла зі зниженою ефекторною функцією можуть бути продуковані шляхом стандартної молекулярної біологічної маніпуляції з Есе-частиною важких ланцюгів Ід, як описано у винаході в прикладі 9, а також описано в публікації Уоїйте еї аї., ІпгІ Кем. Іттипої. 10:241 250, 1993, і
Коагіднез еї аї.,.). Іттипої. 1516954 6961, 1998. Антитіла зі зниженою ефекторною функцією також включають ізотипи людських Ідс2 і Ідс4, які мають знижену здатність активувати
Зо комплемент і/або взаємодіяти з Ес-рецепторами (Камеїсі .).М. еї аІ., Аппи. Кем. Іттипої. 9:457- 492, 1991; Ізаасз 4.0. єї аї., У. Іттипої. 148:3062-3071, 1992; мап де М/іпкКкеї УС. еї а!., Іттипо).
Тодау 14:215-221, 1993). Гуманізовані або повністю людські антитіла, специфічні до людської
МА5Р-2, що складаються із ізотипів (952 або Ід04, можуть бути продуковані одним з декількох методів, відомих будь-якому звичайному фахівцю в цій галузі, які описані в публікації Машдпап
Т.У. ега!ї., Маїшге Віоїтесппісаї, 16:535-539, 1998.
ПРОДУКЦІЯ АНТИТІЛ ПРОТИ МА5БР-2
Антитіла проти МАБР-2 можуть бути продуковані шляхом використання МАБР-2 поліпептидів (наприклад, повнорозмірної МАБР-2) або шляхом використання антигенних пептидів, що несуть МАБР-2 епітоп (наприклад, частину МА5Р-2 поліпептиду). Імуногенні пептиди можуть мати розміри в межах п'яти амінокислотних залишків. Наприклад, МАБР-2 поліпептид, що включає повну амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:б, може бути використаний для індукування антитіла проти МА5Р-2, застосовуваного в способі за винаходом.
Конкретні домени МА5БР-2, про які відомо, що вони залучені в білок-білкові взаємодії, такі як домени СИВІ їі СОВІЕСЕ, так само, як область, що охоплює активний сайт серинпротеази, можуть бути експресовані у формі рекомбінантних поліпептидів, як описано в прикладі 3, і використовуватися як антигени. Крім того, пептиди, що включають частину щонайменше 6 амінокислот МА5Р-2 поліпептиду (ЗЕО ІЮ МО:б) також використовують для індукування МАБР-2 антитіл. Додаткові приклади одержаних з МА5Р-2 антигенів, використовуваних для індукування
МА5БР-2 антитіл, наводяться нижче в таблиці 2. МАБР-2 пептиди і поліпептиди, використовувані для індукування антитіл, можуть бути виділені у формі натуральних поліпептидів або рекомбінантних або синтетичних пептидів і каталітично неактивних рекомбінантних поліпептидів, таких як МА5Р-2А, описаних далі в прикладах 5-7. У деяких варіантах здійснення цього аспекту винаходу, антитіла проти МАБР-2 одержують, використовуючи штам трансгенних мишей, як описано в прикладах 8 і 9 і додатково описано нижче.
Антигени, використовувані для продукування антитіл проти МАБР-2, також включають рекомбінантні поліпептиди, такі як рекомбінанти МАБР-2 або її частини з поліпептидом імуноглобуліну або з білком, що зв'язує мальтозу. Поліпептидний імуноген може являти собою повнорозмірну молекулу або її частину. Якщо поліпептидна частина подібна гаптену, то така частина може бути успішно об'єднана або зв'язана з макромолекулярним носієм (таким як гемоціанін лімфи равлика (КІН), альбумін бичачої сироватки (В5А) або правцевий токсин) для
Зо імунізації.
Таблиця 2
Антигени, одержані з тазр-2 о Домен СИВІ людської МА5Р-2 аа 1-166 послідовності БЕО ІЮ МО:б) о Домени СОВІЕСЕСИОВІЇ людської МАБР-2 о Домени ЕСЕ людської МАБР-2 , Домен серинпротеази людської МА5Р-2
І аа 610-625 послідовності 5ЕО ІЮ МО:6 з мутованим з5ег 618)
ШО СВІ пептид домені СОВІ серинпротеази
ПОЛІКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА
Поліклональні антитіла проти МА5БР-2 можуть бути одержані шляхом імунізації тварини за допомогою МАБР-2 поліпептиду або його імуногенної частини, використовуючи методи, які добре відомі звичайним фахівцям у цій галузі. Дивіться, наприклад, Сгееп еї аї., "Ргодисійоп ої
Роїусіопа! Апіїзега", іп Іттпипоспетіса! Ргоїосої5 (Мапзоп, ед.), раде 105, і методи, описані далі в прикладі 6. Імуногенність МАБР-2 поліпептиду може бути підвищена шляхом використання ад'юванту, що включає мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію або ад'ювант Фрейнда (повний або неповний), поверхнево-активні речовини, такі як лізолецитин, поліетиленполіпропіленоксидні поліоли, поліаніони, масляні емульсії, гемоціанін лімфи равлика і динітрофенол. Поліклональні антитіла звичайно продукуються у тварин, таких як коні, корови, собаки, курчата, щури, миші, кролики, морські свинки, кози або вівці. Як варіант, антитіло проти
МАБР-2, застосовуване в даному винаході, може також бути одержане від людиноподібних мавп. Загальні методи продукування діагностичних і терапевтичних антитіл у бабуїнів можна знайти, наприклад, у патентному документі СоЇІдепбего еї аї., Іпсегпайопа! Раїепі Рибіїсайоп Мо
МО 91/11465, і в публікації І о5тап М... еї аї., Іл. У. Сапсег, 46:310, 1990. Сироватки, що містять імунологчно активні антитіла, потім продукуються із крові таких імунізованих тварин, використовуючи добре відомі стандартні методи.
МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА
У деяких варіантах здійснення, МА5БР-2-інгібуючий засіб являє собою моноклональне антитіло проти МАБР-2. Моноклональні антитіла проти МАБР-2 є високоспецифічними, спрямованими проти єдиного МАБР-2 епітопа. Використовуване у винаході визначення "моноклональне" указує на те, що характерною особливістю антитіла є його одержання із практично гомогенної популяції антитіл, але це визначення не має на увазі необхідності продукування антитіла яким-небудь конкретним методом. Моноклональні антитіла можуть бути одержані будь-яким методом, який забезпечує продукування молекул антитіла стабільними клітинними лініями при культивуванні, таким як гібридомний метод, описаний у публікації Копіег, б., еї аї., Майиге, 256:495, 1975, або вони можуть бути одержані методами рекомбінантної ДНК (дивіться, наприклад, патентний документ Ш.5. Раїепі Мо 4816567, то СаршШу). Моноклональні антитіла можуть бути також виділені з бібліотек фагових антитіл, використовуючи методи, описані в публікації Сіаскхоп Т. еї аї., Майиге, 352:624-628, 1991, і в публікації Магкз» 9.0. еї аї., 9.
МОЇ. Вісі. 222:581-597, 1991. Такі антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи Ідс, ІЮДМ, Іде, ІдА, дО і будь-який їх субклас.
Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані шляхом ін'єкції придатному ссавцю (наприклад, мишам ВАЇ В/с) композиції, що включає МАБР-2 поліпептид або його частину. Після заданого періоду часу, у мишей видаляють спленоцити і суспендують їх у середовищі клітинної культури. Спленоцити потім гібридизують з імморталізованою лінією клітин з утворенням гібридоми. Утворені гібридоми вирощують у клітинній культурі і піддають скринінгу на їх здатність продукувати моноклональне антитіло проти МА5Р-2. Приклад, у якому докладно описане продукування моноклональних антитіл проти МА5Р-2, наводиться в прикладі 7. Дивіться також Сшигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, Мої. 1., допйп У/йїеу б 5оп5, радев 2.5.1-2.6.7, 1991.
Людські моноклональні антитіла можуть бути одержані шляхом використання трансгенних мишей, які були створені для продукування специфічних людських антитіл у відповідь на антигенний стимул. У цьому методі, елементи локусу важкого і легкого ланцюгів людського імуноглобуліну вводять у штами мишей, одержані з ліній ембріональних стовбурових клітин, які містять таргетні ушкоджені локуси важкого і легкого ланцюгів ендогенного імуноглобуліну.
Трансгенні миші можуть синтезувати людські антитіла, специфічні до людських антигенів, таких, як описані у винаході антигени МАБР-2, і миші можуть бути використані для продукування людського МА5Р-2 антитіла, шляхом виділення гібридом у результаті гібридизації В-клітин від таких тварин з придатними лініями мієломних клітин, використовуючи традиційну гібридомну технологію Колера-Мільштейна, описану далі в прикладі 7. Трансгенні миші з геном людського імуноглобуліну можуть бути придбані у фірм-виробників (наприклад, у фірми Абрдепіх, Іпс.,
Егетопі, СА, і фірми Медагех, Іпс., Аппапаае, М.У.). Методи одержання людських антитіл від трансгенних мишей описані, наприклад, у публікаціях сгееп І.Г. еї аїЇ., Маїшге Сепеї. 7:13, 1994;
Гопрего М. еї аї., Маїиге, 368:856, 1994; і Тауїог І.О. еї аї., Ії. Іттип. 6:579, 1994.
Моноклональні антитіла можуть бути виділені з гібридомних культур і очищені за допомогою ряду добре відомих методів. Такі методи виділення включають афінну хроматографію з білком
А на сефарозі, гель-проникну хроматографію і іонообмінну хроматографію (дивіться, наприклад,
Соїїдап аї радев 2.7.1-2.7.12 апа радез 2.9.1-2.9.3; Ваїпез еї аї., "Ринітісайоп ої Іттиподіориїйп с (510) (да) ", іп Меїнод3з іп Моіесціаг Віоїоду, Те Нитапа Ргев5, Іпс., Мої. 10, радез 79-104, 1992).
Після продукування, поліклональні, моноклональні або одержані з фагів антитіла спочатку піддають дослідженню на специфічність зв'язування з МАБР-2. Може бути використаний ряд досліджень, які добре відомі фахівцям у цій галузі, для виявлення антитіл, які специфічно зв'язуються з МАБР-2. Приклади досліджень включають вестерн-блотинг або аналіз імунопреципітації стандартними методами (наприклад, описаними в публікації А!5ибеї еї аї.), імуноелектрофорез, імуносорбентні аналізи з ферментною міткою, дот-блотинг, дослідження інгібування або конкуренції і сендвіч-аналізи (описані в Нагіом/ апа І апа, Апііродієв: А І арогафогу
Мапиаї, Сода Зргіпд Нагбог І арогаїогу Ргез5, 1988). Після ідентифікації антитіл, які специфічно зв'язуються з МАБР-2, антитіла проти МАБЗР-2 випробовують на здатність діяти як МА5Р-2- інгібуючий засіб в одному з декількох досліджень, таких як, наприклад, дослідження лектин- специфічного розщеплення СА (описане в прикладі 2), дослідження відкладення СЗБ (описане в прикладі 2) або дослідження відкладення С4Б (описане в прикладі 2).
Афінність моноклональних антитіл проти МАБР-2 може бути легко визначена звичайним фахівцем у цій галузі (дивіться, наприклад, 5саїснага А., МУ Асай. зсі. 51:660-672, 1949). В одному варіанті здійснення, моноклональні антитіла проти МА5Р-2, застосовувані в способах за винаходом, зв'язуються з МА5Р-2 з величиною афінності зв'язування «100 нМ, переважно «10
НМ і найбільше переважно «2 нМ. У деяких варіантах здійснення, інгібуюче МА5БР-2 моноклональне антитіло, застосовуване в способах за винаходом, являє собою інгібуюче
МА5БР-2 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що включає (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності з«ЕО ІЮ МО:67; і і) важкий ланцюг СОК-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності БЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг
СОВ-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності 5ЕО ІЮ МО:67, ії Б) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: і) легсий ланцюг СОБК-11, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ХЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-12, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг
СОВ-ІЗ3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності 5ХЕО ІЮ МО:70, або (І) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 92 9о, щонайменше з 93 965, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 965, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю з 5ЕО ІЮ МО:67) і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 9295, щонайменше з 93 95, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 9565, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ФЗЕО ІЮ МО:70.
ХИМЕРНІ/ГУМАНІЗОВАНІ АНТИТІЛА
Моноклональні антитіла, застосовувані в способі за винаходом, включають химерні антитіла, у яких частина важкого й/або легкого ланцюга тотожна або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, які одержані з конкретних видів або належать до конкретного класу або субкласу антитіл, а інша частина ланцюга (ланцюгів) тотожна або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, які одержані з інших видів або належать до іншого класу або субкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл (0.5. Раїепі Мо 4816567, то Саву; і Моїгтізоп
ЗІ. ега|., Ргос. Маг! Асад. бсі. ОБА, 81:6851-6855, 1984).
Однією з форм химерного антитіла, застосовуваною у винаході, є гуманізоване моноклональне антитіло проти МА5Р-2. Гуманізовані форми нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл являють собою химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, одержану з нелюдського імуноглобуліну. Гуманізовані моноклональні антитіла продукуються шляхом перенесення нелюдських (наприклад, мишачих) ділянок, що визначають комплементарність (СОК), з важких і легких варіабельних ланцюгів мишачого імуноглобуліну в людський варіабельний домен. Звичайно, залишки людського антитіла потім заміняють у каркасних областях нелюдських аналогів. Крім того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не виявляються в реципієнтному антитілі або в донорному антитілі. Ці модифікації одержують для наступного проведення очищення антитіл. Звичайно, гуманізоване антитіло може включати практично весь, щонайменше один і, звичайно, два варіабельні домени, у яких усі або практично всі гіперваріабельні петльові фрагменти відповідають гіперваріабельним петльовим фрагментам нелюдського імуноглобуліну, і всі або практично всі каркасні області Ем є каркасними областями Ем послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло необов'язково може також включати щонайменше частину константної області (Ес) імуноглобуліну, яка звичайно є частиною людського імуноглобуліну. Більш докладну інформацію можна знайти в публікаціях Цопез Р.Т. еї аї., Маїшге, 321:522-525, 1986; Веісптапп 60 Г. ега., Маїшге, 332:323-329, 1988; і Ргезіа, Сигт. Ор. 5ігисі. Віої. 2:593-596, 1992. 5О0
Гуманізовані антитіла, застосовувані у винаході включають людські моноклональні антитіла, що містять щонайменше МАБР-2-зв'язуючу СОКЗ-ділянку. Крім того, частини Ес можуть бути замінені так, щоб продукуватися ІдА або ІдДМ, а також людські до антитіла. Такі гуманізовані антитіла можуть мати особливе клінічне застосування, оскільки вони можуть специфічно розпізнавати людську МА5Р-2, але не провокувати імунну відповідь у людей проти антитіла самого по собі. Отже, вони краще придатні для іп мімо введення людям, особливо, коли необхідне повторне або тривале введення.
Приклад генерування гуманізованого антитіла проти МА5БР-2 з мишачого моноклонального антитіла проти МАБР-2 наводиться в прикладі 6. Методи продукування гуманізованих моноклональних антитіл також описані, наприклад, у публікаціях ЦУопеб5 Р.Т. еї аї., Майиге, 321:522, 1986; Сапег Р. єї аї., Ргос. Маг. Асад. сі. ОБА, 89:4285, 1992; бЗапапи 9.5. Стії. Веух.
Віоїесн. 12:437, 1992; біподег І.І. єї аї., У. Іттип. 150:2844, 1993; Зцанпіг (єд.), Апіїроду Епдіпеегіпд
РгоїосоЇ5, Нитапа Ргев5, Іпс., 1995; КеїПеу, "Епдіпеегіпд ТНегарешіс Апііїродієв", іп Ругоївїп
Епаіпеетгіпд: Ргіпсіріє5 апа Ргасіїсе, СіІвіапа еї аї. (вдв.), дуопп У/йеу б 5опв5, Іпс., раде5 399-434, 1996; і в патентному документі О.5. Раїепі Мо 5693762, то Оцееп, 1997. Крім того, існують комерційні організації, які можуть синтезувати гуманізовані антитіла зі специфічних ділянок мишачих антитіл, такі як Ргоївіп Оезідп Г арх (Мошипіаїп Міем/у, СА).
РЕКОМБІНАНТНІ АНТИТІЛА
Антитіла проти МА5Р-2 можуть бути також одержані шляхом використання рекомбінантних методів. Наприклад, людські антитіла можуть бути одержані шляхом використання бібліотеки експресованих послідовностей людського імуноглобуліну (що постачається, наприклад, фірмою зігаїадепе, Согр., І а доза, СА) для продукування фрагментів людських антитіл (УН, МІ, Ем, га,
Еар або Е(ав)г). Ці фрагменти потім використовують для конструювання людського антитіла в цілому, використовуючи методи, аналогічні методам продукування химерних антитіл.
АНТИІДІОТИПІЧНІ АНТИТІЛА
Після ідентифікації антитіл проти МА5Р-2 з необхідною інгібуючою активністю, ці антитіла можуть бути використані для генерації антиідіотипічних антитіл, які мають подібність з частиною
МАБ5БР-2, використовуючи добре відомі методи. Дивіться, наприклад, публікацію Сгеепзрап М.5. еї аІ,, ЕАБЕВ у. 7437, 1993. Наприклад, антитіла, які зв'язуються з МА5БР-2 і конкуруючо
Ко) інгібують взаємодію білка МА5БР-2, яка необхідна для активації комплементу, можуть бути використані для генерації антиідіотипів, мають подібність з МВІ -зв'язуючим сайтом на білку
МАБ5Р-2 і, тому, зв'язують і нейтралізують зв'язуючий ліганд МА5Р-2, такий як, наприклад, МВІ..
ФРАГМЕНТИ ІМУНОГЛОБУЛІНУ
МАБ5БР-2-інгібуючі засоби, застосовувані в способі винаходу, охоплюють не тільки інтактні молекули імуноглобуліну, але також добре відомі фрагменти, що включають фрагменти Раб,
Раб", Е(аб)», К(ар)» ії Ем, зсЕм-фрагменти, діатіла, лінійні антитіла, молекули одноланцюжкових антитіл і поліспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл.
Добре відомо, що тільки невелика частина молекули антитіла, антигензв'язувальний центр, залучена у зв'язування антитіла з його епітопом (дивіться, наприклад, Сіаг(к УМ.К., Те
Ехрегітепіа! Роипаайоп5 ої Модегп Іттипоїіоду, Уміеу 5 5опв5, Іпс., МУ, 1986). Ділянки антитіла рес ї Ес є ефекторами класичного шляху комплементу, але вони не залучені у зв'язування антигену. Антитіло, у якому була ферментативно розщеплена ділянка рЕс,, або антитіло, яке було продуковане без ділянки рЕс, позначають як Е(аб')25-фрагмент, і воно зберігає обидві ділянки зв'язування антигену інтактного антитіла. Виділений Е(ар')»-фрагмент називають двовалентним моноклональним фрагментом, внаслідок його двох ділянок зв'язування антигену.
Аналогічно, антитіло, у якому була ферментативно розщеплена ділянка Ес, або антитіло, яке було продуковане без ділянки Ес, позначають як Раб-фрагмент, і воно зберігає одну з ділянок зв'язування антигену молекули інтактного антитіла.
Фрагменти антитіл можуть бути одержані традиційними методами протеолітичного гідролізу, такими як гідроліз повних антитіл при впливі пепсину або папаїну. Наприклад, фрагменти антитіла можуть бути продуковані ферментативним розщепленням антитіл пепсином з одержанням 55-фрагмента, позначуваного як Е(ар)г5. Цей фрагмент може бути розщеплений далі з використанням реагенту, що відновлює тіол, із продукуванням моновалентних фрагментів 3.55 Рар' Необов'язково, реакція розщеплення може бути проведена з використанням групи, що блокує сульфгідрильні групи, які виникають внаслідок розщеплення дисульфідних зв'язків. Як варіант, ферментативне розщеплення з використанням пепсину безпосередньо продукує два моновалентних Рар-фрагменти і Ес-фрагмент безпосередньо. Ці методи описані, наприклад, у патентному документі 0.5. Раїепі Мо 4331647, то сСоЇІдепрего; у публікаціях Мізопоїї А. еї аї., Агсй.
Віоспет. Віорпух. 89:230, 1960; Ропег В.В., Віоспет. .). 73:119, 1959; Едеїтап еї а!., іп Мешоа5 бо іп Епгуто!Поду, 1:422, Асадетіс Ргез5, 1967; і Соїїдап аї радез 2.8.1-2.8.10 апа 2.10.-2.10..4.
У деяких варіантах здійснення, переважним є використання фрагментів антитіл, що не мають ділянку Ес, для того, щоб запобігти активації класичного шляху комплементу, який ініціюється після зв'язування Ес з Есу рецептором. Відомі декілька методів продукування МоАб, які запобігають взаємодіям Есу рецептора. Наприклад, Ес-ділянка моноклонального антитіла може бути видалена хімічним шляхом, використовуючи неповне ферментативне розщеплення під дією протеолітичних ферментів (таке як ферментативне розщеплення під дією фіцину), генеруючи внаслідок цього, наприклад, антигензв'язувальні фрагменти антитіла, такі як фрагменти Раб або К(аб)г (Маїапі М. еї аї!., Мої. Іттипої. 28:69-71, 1991). Як варіант, людський у4 дос ізотип, який не зв'язує Есу рецептори, може бути використаний при конструюванні описаного у винаході гуманізованого антитіла. Антитіла, одноланцюжкові антитіла і антигензв'язувальні домени, які не мають Ес-домен, можуть також бути сконструйовані, використовуючи описані у винаході рекомбінантні методи.
ОДНОЛАНЦЮЖКОВІ ФРАГМЕНТИ АНТИТІЛ
Як варіант, можна створити одноланцюжковий пептид, що зв'язує молекули, специфічні відносно МА5Р-2, у якому з'єднані Ем-ділянки важкого і легкого ланцюгів. Ем-фрагменти можуть бути з'єднані за допомогою пептидного лінкера з утворенням одноланцюжкового антигензв'язувального білка (5сЕм). Ці одноланцюжкові антигензв'язувальні білюи одержують шляхом конструювання структурного гена, що включає послідовності ДНК, кодуючі МН- ї Мі - домени, які з'єднані за допомогою олігонуклеотиду. Структурний ген вставляють в експресуючий вектор, який потім вводять у клітину-хазяїна, таку як кишкова паличка.
Рекомбінантні клітини-хазяїни синтезують одноланцюжковий поліпептид з пептидним лінкером, що з'єднує містком два М-домени. Методи продукування 5сЕу5 описані, наприклад, у публікаціях
МУпПоОму, еї аї., "Меїйоаз. А Сотрапіоп (о Меїнодвз іп Епгутоіоаду", 2:97, 1991; Віга єї аї., бсіепсе, 242:423, 1988; у патентному документі Ш.5. Раїепі Мо 4946778, 10 І адпег; у публікації Раск Р. еї а!., Віо/ГесппоІоду, 1171271, 1993.
Як ілюстративний приклад, МАЗР-2-специфічний 5сЕм може бути одержаний шляхом впливу на лімфоцити поліпептидом МА5Р-2 іп міго і вибору дисплея бібліотеки антитіл у фагу або в аналогічних векторах (наприклад, шляхом використання іммобілізованого або міченого білка або пептиду МАБР-2). Гени, кодуючі поліпептиди, що мають потенційні домени зв'язування
Зо поліпептиду МАБР-2, можуть бути одержані шляхом скринінгу рандомізованих бібліотек пептидів на дисплеї фага або на дисплеї бактерії, такої як кишкова паличка. Ці рандомізовані дисплейні бібліотеки пептидів можуть бути використані для скринінгу пептидів, які взаємодіють із МАБР-2. Методи створення і скринінгу таких рандомізованих дисплейних бібліотек пептидів добре відомі (патентні документи Ш.5. Раїепі Мо 5223409, 10 І агапег; 0.5. Раїепі Мо 4946778, 10
І адпег; 0.5. Раїепі Мо 5403484, (0 І агапег; 0.5. Раїепі Мо 5571698, 0 І агапег; і публікація Кау єї аІ.,, Рпаде Оізріау ої Реріідез апа Ргоївіп5, Асадетіс Ргез5, Іпс., 1996), і рандомізовані дисплейні бібліотеки пептидів і набори для скринінгу таких бібліотек можуть бути придбані у відповідних фірм, наприклад у фірм СІ ОМТЕСН І арогайгіє5, Іпс. (Раю АКо, Саїїй.), Іпмігодеп Іпс. (Зап Оіедо,
Саїї.), Мем Епдіапа Віоїабв», Іпс. (Вемегіу, Ма55.) і Рпагтасіа І КВ Віотесппо!поду Іпс. (Різсагаулау,
М..).
Іншою формою фрагмента антитіла проти МАБР-2, застосовуваною в цьому аспекті винаходу, є пептид, кодуючий єдину гіперваріабельну ділянку (СОК), яка зв'язується з епітопом на антигені МА5Р-2 і інгібує МАЗР-2-залежну активацію комплементу. СОК-пептиди ("мінімальні розпізнавальні компоненти") можуть бути одержані шляхом конструювання генів, коюодуючих СОК відповідного антитіла. Такі гени одержують, наприклад, шляхом використання полімеразної ланцюгової реакції для синтезу варіабельної області із РНК антитіла, продукуючого клітини (дивіться, наприклад, і агтіск еї аІ., МемШоав5. А Сотрапіоп о Метоавз іп Епутоїіоду 2:106, 1991;
Соцпепау ГСК, "Сепеїйс Мапіршіайоп ої Мопосіопа! Апііродієв", іп Мопосіопа! Апіібодієв:
Ргодисійп, Епаіпеегіпу апа Сіїпіса! Арріїсайіоп, Вінег еї а!. (еадв5.), раде 166, Сатьгідде Опіметейу
Ргез5, 1995; і Умага еї аї., "Сепеїйс Мапіршіайоп апа Ехргеввзіоп ої Апіїродіевв", іп Мопосіопаї
Апііродієв: Ргіпсіріє5 апа Арріїсаїййоп5, Вікси еї а!. (едз.), раде 137, УМіеу І ів5, Іпс., 1995).
Описані у винаході МАБ5Р-2 антитіла вводять суб'єкту, що потребує цього, для інгібування
МА5БР-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення, МАЗР-2-інгібуючий засіб являє собою високоафінне людське або гуманізоване моноклональне антитіло проти
МА5Р-2 зі зниженою ефекторною функцією.
ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ
У деяких варіантах здійснення цього аспекту винаходу, МА5Р-2-інгібуючий засіб включає виділені пептидні інгібітори МАБР-2, у тому числі виділені природні пептидні інгібітори і синтетичні пептидні інгібітори, які інгібують МА5БР-2-залежну активацію системи комплементу. бо Використовуваний у винаході термін "виділені пептидні інгібітори МА5Р-2" стосується пептидів,
інгібуючих МА5БР-2-залежну активацію комплементу, шляхом зв'язування з МАБР-2, шляхом конкуренції з МА5БР-2 за зв'язування з іншою молекулою розпізнавання (наприклад, МВІ., Н- фіколіном, М-фіколіном або І-фіколіном), по лектиновому шляху і/або шляхом безпосередньої взаємодії з МА5БР-2 для інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу, які є практично чистими і фактично не містять інших речовин, з якими вони можуть виявлятися в природі, у ступені, який забезпечує на практиці їх передбачуване застосування і відповідає їх передбачуваному застосуванню.
Пептидні інгібітори успішно використовувалися іп мімо для запобігання білок-білковим взаємодіям і негативному впливу на каталітичні сайти. Наприклад, пептиди, інгібуючі адгезивні молекули, структурно споріднені з І ЕА-1, нещодавно були дозволені до застосування в клінічній практиці при лікуванні коагулопатій (Оптап Е.М. еї аїІ., Еигореап Неагі 9. 16:50-55, 1995). Було описано, що короткі лінійні пептиди («30 амінокислот) запобігають або негативно впливають на інтегринзалежну адгезію (Мигауата 0. еї аї., 9. Віоспет. 120:445-51, 1996). Більш довгі пептиди, з довжиною в діапазоні від 25 до 200 амінокислотних залишків, були успішно використані для блокування інтегринзалежної адгезії (папу |. еї аї., 9У. ВіоїЇ. Спет. 271(47):29953-57, 1996).
Звичайно, більш довгі пептидні інгібітори мають більші величини афінності й/або більш низькі швидкості дисоціації, ніж короткі пептиди, і, тому, вони можуть бути більш активними інгібіторами. Було також показано, що циклічні пептидні інгібітори є ефективними інгібіторами інтегринів іп мімо при лікуванні запальних захворювань у людини (даскхоп О.У. еї аї., У. Меа.
Спет. 40:3359-68, 1997). Один метод продукування циклічних пептидів здійснюється шляхом синтезу пептидів, у яких термінальні амінокислоти пептиду є цистеїнами, які дозволяють пептиду існувати в циклічній формі в результаті утворення дисульфідного зв'язку між термінальними амінокислотами, що, як було показано, підвищує афінність і період напіввиведення іп мімо при лікуванні гематопоетичних неоплазій (дивіться, наприклад, патентний документ Ц.5. Раїепі Мо 6649592, 0 І аг5оп).
СИНТЕТИЧНІ ПЕПТИДНІ ІНГІБІТОРИ МА5Р-2
МАБР-2-інгібуючі пептиди, застосовувані в способах цього аспекту винаходу, характеризуються амінокислотними послідовностями, які імітують таргетні ділянки, важливі для функціонування МА5Р-2. Інгібуючі пептиди, застосовувані при здійсненні на практиці способів за винаходом, мають розмір у діапазоні від приблизно 5 амінокислот до приблизно 300 амінокислот. У таблиці З наведений список типових інгібуючих пептидів, які можуть застосовуватися при здійсненні на практиці цього аспекту даного винаходу. МА5Р-2-інгібуючий пептид, що представляє інтерес, може бути підданий випробуванню на його здатність діяти як
МАБР-2-інгібуючий засіб в одному з декількох досліджень, які включають, наприклад, дослідження специфічного розщеплення С4 лектином (описане в прикладі 2) і дослідження відкладення СЗБ (описане в прикладі 2).
У деяких варіантах здійснення, МАБР-2-інгібуючі пептиди одержують із МАЗБР-2 поліпептидів, і вибирають їх з повнорозмірного зрілого білла МАБР-2 (ЗЕБЕО ІЮ МО:6) або з конкретного домену білка МА5Р-2, такого як, наприклад, домен СОВІ (ЗЕО ІЮО МО:8), домен
СОВІЕСЕ (5ЕО І МО:9), домен ЕСЕ (5ЕО ІЮ МО:11) і домен серинпротеази (ЗЕО ІЮ МО:12). Як описано вище, було показано, що ділянки СИВЕСЕСИВІЇ необхідні для димеризації і зв'язування з МВІ (ТпівеЇїеп5 еї аї., взирга). Зокрема, у дослідженні, у якому ідентифікували наявності у людини гомозиготної мутації А5р1і05 в СІуТО5, було показано, що пептидна послідовність ТЕКБОМУМ (5ЕО ІО МО:16) у домені СОВІ МА5Р-2 залучена у зв'язування з МВІ, що приводить до втрати МА5Р-2 в МВІ-комплексі (5іепдаага Редегзеп К. еї аї., Мем Епдіапа У.
Меа. 349:554-560, 2003).
У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуючі пептиди одержують із білків лектину, які зв'язуються з МА5Р-2 і залучені в лектиновий шлях комплементу. Було ідентифіковано декілька різних лектинів, які залучені в цей шлях, включаючи мананзв'язуючий лектин (МВ), І -фіколін,
М-фіколін і Н-фіколін. (Ікеда К. еї аї.,». ВіоїЇ. Спет. 262:7451-7454, 1987; Маївивпйа М. еї аї.,..
Ехр. Мед. 176:1497-2284, 2000; Маївивнйа М. еї аї.,.). Іттипої. 168:3502-3506, 2002). Ці лектини присутні в сироватці крові у вигляді олігомерів гомотримерних субодиниць, кожна з яких має М- термінальні колагеноподібні волокна з доменами розпізнавання вуглеводів. Було показано, що ці різні лектини зв'язуються з МА5Р-2, і комплекс лектин/мА5Р-2 активує комплемент через розщеплення білків С4 і С2. Н-фіколін має амінотермінальну ділянку з 24 амінокислот, колагеноподібний домен з 11 Сіу-Хаа-Маа повторами, шийковий домен з 12 амінокислот і фібриногеноподібний домен з 207 амінокислот (Маїзи5пйа М. еї аї., 9. Іттипої. 168:3502-3506, 2002). Н-фіколін зв'язується з СІСМАс і аглютинує еритроцити людини, покриті ЛПС, одержаним з підвидів сальмонел 5. їурпітигішт, 5. Міппезоїа і кишкової палички Е. соїї. Було показано, що бо Н-фіколін зв'язаний з МА5Р-2 і МАр19 і активує лектиновий шлях (у тій же публікації). І1-
фіколін/Р35 також зв'язується з СІСМАс, і, як було показано, асоціюється з МАБР-2 і МАр19 у сироватці людини, і цей комплекс, як було продемонстровано, активує лектиновий шлях (Маїзизпйа М. еї аї., 9У. Іттипої. 164:2281, 2000). Відповідно, МА5Р-2-інгібуючі пептиди, застосовувані в даному винаході, можуть включати ділянку щонайменше з 5 амінокислот, вибраних з білка МВІ. (ЗЕО ІО МО:21), білка Н-фіколіну (номер доступу в базі даних сепрапк
ММ 173452), М-фіколіну (номер доступу в базі даних зепрапк 000602) і білка І -фіколіну (номер доступу в базі даних зСепрапк ММ 015838).
Більш конкретно, вченими був ідентифікований сайт зв'язування МАБЗР-2 на МВІ, що знаходиться усередині 12 СІу-Х-Ж триплетів "ЯКО ВО ТК СЕК СЕР СС І ВО ГО РОС КІС
РОС МОсСі Ра БОС РКа Ока рода ко" (5ЕО ІЮО МО:26), які лежать між шарніром і шийкою в
С-термінальній частині колагеноподібного домену МВР (Умаїї» К. еї аї.,.). Віої. Спет. 279:14065, 2004). Ця ділянка сайта зв'язування МАБР-2 є також висококонсервативною у людському Н- фіколіні і людському І-фіколіні. Був описаний консенсусний сайт зв'язування, який присутній у всіх трьох лектинових білках, що включає амінокислотну послідовність "ОСК-Х-аР" (5ЕО І
МО:22), де буква "О" позначає гідроксипролін, а буква "Х" позначає гідрофобний залишок (умаїїв еї аЇ.,, 2004, наведена вище публікація). Відповідно, у деяких варіантах здійснення,
МА5БР-2-інгібуючі пептиди, застосовувані в цьому аспекті винаходу, мають щонайменше довжину з 6 амінокислот і включають послідовність БЕО ІЮ МО:22. Було показано, що пептиди, одержані з МВІ,, які включають амінокислотну послідовність "СІ В СГ ОО СРО СОКІ СРО С" (5ЕО
ІЮ МО:24), зв'язують МАБР-2 іп мійго (Умаїй5 еї аіЇ.,, 2004, наведена вище публікація). Для посилення зв'язування з МАБР-2, можуть бути синтезовані пептиди, які фланковані двома триплетами СРО на кожному кінці ("«ЯРО СРО СІ А СО РО ЯКІ СРО БОР ОСР О" 5ЕО Ір
МО:25), з метою посилення утворення потрійних спіралей, що виявляються в нативному білку
МВІ. (як це більш докладно описано в публікації Умаїїї К. еї аї., 9. Віої. Спет. 279:14065, 2004).
МАБР-2-інгібуючі пептиди можуть бути також одержані з людського Н-фіколіну, вони включають послідовність "ЗАО 450 СЕК САО СРО СРО СРО КМ ОРК СЕО аро" (5ЕО Ір
МО:27) з консенсусної ділянки зв'язування МА5Р-2 в Н-фіколіні. Крім того, до них належать пептиди, одержані з людського І-фіколіну, які включають послідовність "Я4СбО ГО пАО СОК
СЕА ТМ КА ПЕВ СРО СРО СКА СРО ЯРМ САО СЕО" (5ЕО ІЮ МО:28) з консенсусної
Зо ділянки зв'язування МА5Р-2 в І -фіколіні.
МА5БР-2-інгібуючі пептиди можуть бути також одержані із сайта розщеплення С4, такого як " ОВАГЕІ РМАМТІКАМАРЕЇ МР" (ЗЕО ІЮ МО:29), який є сайтом розщеплення С4, зв'язаним з
С-термінальною частиною антитромбіну ПІ! (СіІомег О.І. еї аї., Мої. Ітітипої. 25:1261 (1988)).
Таблиця З
Приклади пептидів, інгібуючих тавр-2 о Білок людської
Домен СИВІ
МАБР-2 (аа 1-
ЗЕО ІЮ МО:8 121 послідовності
ЗЕО ІЮ МО:6
Домен
СОВІЕСЕ
5ЕО ІО МО: МАБР-2 (ва 1- 166 послідовності
ЗЕО ІЮ МО:6
Домени
СОВІЕСЕСИВІЇ
МАБ5БР-2
ЗЕО ІЮ МО:10 (аа 1-293 послідовності
ЗЕО ІЮ МО:6
Домен ЕСЕ
ЗЕО ІЮ МО:11 МА5БР-2 (аа 122-166
Домен , серинпротеази
ЗЕО І МО:12 МАБР-2 (аа 429-671
МВІ -ділянка
ЗЕО ІЮ МО:16 зв'язування в
МАБ5БР-2 о Людський
Білок
ЗЕО ІЮ МО:21 людського
МВІ.
Консенсусний сайт зв'язування
ЗЕО ІЮ МОс22 синтетичного рак-хХ-аР, пептиду з де "О"-гідроксипролін, і "Х" позначає гідрофобний амінокислотний залишок людського
МВІ і людських фіколінів
Основний 5ЗЕО І МО23 а обКІ в людського
МВІ.
Триплети 6-10 людського
ЗЕО І МО:24 МВР, що аваГго РО СаКІ СРО С демонструють зв'язування з
МАБ5БР-2
Триплети з аРО людського
ЗЕО ІЮ МОС25 МВР, додані сРєРОоСсСРОІ На ОСРОСКІ ааРОСаРОСРО для посилення утворення потрійних спіралей
ЗО О МО:26 Триплети 1-17
СКООВОаткоОЕКСЕРСОСІ ВСІ ОСРОСКІ ОРОСМОСРІСБОСРКООКОрОСКВ МЕТ
ЗЕО І МО227 одський Н-
САОСЗОСЕКОАОСРОСРОСРОСКМОРКОЕОСОО болів ссоаг г ОсАдоаркаЕчлаТМакАвсаЕНаРОСРОСКАаРОСРМИаАдОСЕО фіколін РЗ35
Сайт
ЗЕО Ір МО:29 людського С4
Примітка: буква "О" позначає гідроксипролін, буква "Х" позначає гідрофобний залишок.
Пептиди, одержані із сайта розщеплення С4, а також інші пептиди, які інгібують сайт серинпротеази МАБР-2, можуть бути хімічно модифіковані для того, щоб вони стали необоротно діючими інгібіторами протеази. Наприклад, відповідні модифікації можуть включати, але цим не обмежуючи, галогенметилкетони (ВГ, СІ, І, Е) на С-кінці, А5р або Сім, або приєднані до функціональних бічних ланцюгів; галогенацетильні (або інші с-галогенацетильні) групи на аміногрупах або інших функціональних бічних ланцюгах; епоксидні або імінвмісні групи на амінному або на карбоксильному кінці або на функціональних бічних ланцюгах; або імідатні ефіри на амінному або на карбоксильному кінці або на функціональних бічних ланцюгах. Такі модифікації можуть давати переваги, що полягають у постійному інгібуванні ферменту за рахунок ковалентного приєднання пептиду. Це дає можливість зменшувати ефективні дози й/або знижувати частоту введення пептидного інгібітору.
Крім описаних вище інгібуючих пептидів, МАЗР-2-інгібуючі пептиди, застосовувані в способі за винаходом, включають пептиди, що містять МА5БР-2-зв'язуючу СОКЗ-ділянку анти-МАБР-2
Мор, одержувану, як описано у винаході. Послідовність СОК-ділянок для використання в синтезі пептидів може бути визначена за допомогою добре відомих методів. Варіабельна область важкого ланцюга являє собою пептид, довжина якого звичайно знаходиться в діапазоні від 100 до 150 амінокислот. Варіабельна область легкого ланцюга являє собою пептид, довжина якого звичайно знаходиться в діапазоні від 80 до 130 амінокислот. Послідовності СО у варіабельних областях важкого і легкого ланцюгів включають приблизно тільки 3-25 амінокислотних послідовностей, які можуть бути легко секвеновані будь-яким фахівцем у цій галузі.
Для фахівців у цій галузі є очевидним, що практично гомологічні варіації описаних вище
МА5БР-2-інгібуючих пептидів також повинні проявляти МА5Р-2-інгібуючу активність. Приклади варіацій включають, але цим не обмежуючи, пептиди, що мають вставки, делеції, заміни й/або додаткові амінокислоти на карбоксильних або амінних кінцевих частинах зазначених пептидів або їх сумішей. Відповідно, вважається, що гомологічні пептиди, які мають МА5Р-2-інгібуючу активність, можуть застосовуватися в способах за цим винаходом. Описані пептиди можуть також включати дупліковані мотиви та інші модифікації з консервативними замінами.
Консервативні варіанти описані в інших місцях винаходу, і вони включають обмін амінокислоти на іншу амінокислоту з подібним зарядом, розміром або гідрофобністю і іншими подібними властивостями.
Зо МА5Р-2-інгібуючі пептиди можуть бути модифіковані з метою збільшення розчинності й/або максимізації позитивного або негативного заряду для того, щоб вони якомога більш точно нагадували сегмент в інтактному білку. Похідне може мати або може не мати точної структури первинної амінокислоти розкритого у винаході пептиду, за умови, що похідне функціонально зберігає необхідну властивість інгібувати МАБР-2. Модифікації можуть включати заміну амінокислоти на одну із двадцяти загальновідомих амінокислот або на іншу амінокислоту, на дериватизовану або заміщену амінокислоту з додатковими необхідними характеристиками, такими як стійкість до ферментативного розщеплення, або на ЮО-амінокислоту, або заміну на іншу молекулу або сполуку, таку як вуглевод, що імітує природну конформацію і функцію амінокислоти, амінокислот або пептиду; делецію амінокислоти; вставку амінокислоти, використовуючи одну з двадцяти загальновідомих амінокислот або іншу амінокислоту, дериватизовану або заміщену амінокислоту з додатковими необхідними характеристиками, такими як стійкість до ферментативного розщеплення, або О-амінокислоту, або заміну на іншу молекулу або сполуку, таку як вуглевод, що імітує природну конформацію і функцію амінокислоти, амінокислот або пептиду; або заміну на іншу молекулу або сполуку, таку як вуглевод або мономер нуклеїнової кислоти, що імітує природну конформацію і функцію амінокислоти, амінокислот або пептиду. Пептиди можуть бути також модифіковані шляхом ацетилювання або амідування.
Синтез похідних інгібуючих пептидів може основуватися на відомих методах біосинтезу пептидів, біосинтезу вуглеводів і інших подібних методах. Як відправний пункт, фахівець може використовувати придатну комп'ютерну програму для визначення конформації досліджуваного пептиду. Після з'ясування конформації розкритого у винаході пептиду, фахівець може визначити за допомогою раціонального способу проектування, який вид заміщень може бути здійснений в одному або більше сайтах для одержання похідного, яке зберігає основну конформацію і розподіл заряду вихідного пептиду, але яке може мати характеристики, які не присутні або які поліпшуються в порівнянні з характеристиками, що виявляються у вихідному пептиді. Після ідентифікації молекул перспективних похідних, ці похідні можуть бути піддані випробуванням для визначення можливості їх застосування як МА5Р-2-інгібуючих засобів, використовуючи описані у винаході методи дослідження.
СКРИНІНГ ПЕПТИДІВ, ІНГІБУЮЧИХ МА5Р-2 бо Можна також використовувати моделювання на молекулярному рівні і раціональний молекулярний дизайн для утворення і скринінгу пептидів, які імітують молекулярні структури ключових зв'язуючих ділянок МА5Р-2 і інгібують МА5Р-2-залежну активність комплементу.
Молекулярні структури, використовувані для моделювання, включають СОК-ділянки моноклональних антитіл проти МА5Р-2, а також таргетні ділянки, про які відомо, що вони є важливими для функціонування МА5БР-2, у тому числі ділянка, необхідна для димеризації, ділянка, залучена у зв'язування з МВІ, і раніше описаний активний сайт серинпротеази. Методи ідентифікації пептидів, які зв'язуються з конкретною мішенню, добре відомі. Наприклад, для знову конструйованих макромолекулярних структур, таких як пептиди, які зв'язуються з конкретною молекулою, може бути використаний молекулярний імпринтинг. Дивіться, наприклад, публікацію Зпеа К.У., "МоіІесшіаг Ітргіпійтуд ої Зупіпеїйс Меїймогк Роїутегтв: Те Ое
Момо зупіпевзі5 ої Мастотоїесціаг Віпаїпа апа Саїа|уііс ев", ТВІР 2(5) 1994.
Як ілюстративний приклад, один метод одержання імітаторів МАБР-2-зв'язуючих пептидів полягає в наступному. Полімеризують функціональні мономери відомого МА5Р-2-зв'язуючого пептиду або зв'язуючої ділянки антитіла проти МАБР-2, що інгібує МА5Р-2 (темплат). Потім темплат видаляють і проводять полімеризацію другого класу мономерів у порожньому просторі, що залишився після видалення темплату, з одержанням нової молекули, яка має одну або більше бажаних властивостей, які аналогічні властивостям темплату. Крім одержання пептидів, таким методом можуть бути також одержані інші МА5БР-2-зв'язуючі молекули, які є МА5Р-2- інгібуючими засобами, такі як полісахариди, нуклеозиди, лікарські засоби, нуклеопротеїни, ліпопротеїни, вуглеводи, глікопротеїни, стероїди, ліпіди і інші біологічно активні матеріали. Цей метод застосовують для конструювання великої кількості біологічних імітаторів, які є більш стабільними, ніж їх природні аналоги, оскільки їх звичайно одержують вільнорадикальною полімеризацією функціональних мономерів, що приводить до утворення сполуки з головним ланцюгом, що не підданий біохімічному розкладанню.
СИНТЕЗ ПЕПТИДІВ
МАБ5БР-2-інгібуючі пептиди можуть бути одержані добре відомими методами, такими як метод твердофазного синтезу, уперше описаний у публікації Меггійеїд, в У. Атег. Спет. бос. 85:2149- 2154, 1963. Може бути здійснений автоматизований синтез, використовуючи, наприклад, пептидний синтезатор Аррієй Віозубіет5 431А Рерійде Зупіпевзігег (Бо5іег Сйу, саїїй.),
Зо відповідно до інструкцій фірми-виробника. Опис інших методів можна знайти, наприклад, у монографії Водап52КуУ М. еї аї., Рерііде Зупіпевзі5, зесопа ейайіоп, дойп УМіеу 5 5оп5, 1976, а також в інших довідкових виданнях, відомих фахівцям у цій галузі.
Пептиди також можуть бути одержані з використанням стандартних методів генної інженерії, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, пептид може бути одержаний ферментативним методом шляхом вставки нуклеїнової кислоти, яка кодує пептид, в експресійний вектор, експресуючий ДНК, і трансляції ДНК у пептид у присутності необхідних амінокислот. Потім пептид очищають хроматографічним методом або методом електрофорезу, або за допомогою білка-носія, який може бути злитий з пептидом, а потім відщеплений від пептиду шляхом вставки в експресуючий вектор синхронно з кодуючою пептид послідовністю, послідовністю нуклеїнової кислоти, кодуючою білок-носій. Злитий білок пептиду може бути виділений хроматографічними, електрофоретичними або імунологічними методами (такими як зв'язування зі смолою через антитіло проти білка-носія). Пептид може бути розщеплений хімічно або ферментативно, наприклад за допомогою гідролаз.
МА5БР-2-інгібуючі пептиди, які застосовують у способі за винаходом, можуть бути також продуковані в рекомбінантних клітинах-хазяїнах відповідно до традиційних методів. Для експресії послідовності, кодуючої МА5Р-2-інгібуючий пептид, молекула нуклеїнової кислоти, кодуючої пептид, повинна бути операційно зв'язана з регуляторними послідовностями, які контролюють транскрипційну експресію в експресуючому векторі, і потім введена в клітину- хазяїна. Крім транскрипційних регулюючих послідовностей, таких як промотори і енхансери, експресуючі вектори можуть включати трансляційні регуляторні послідовності і маркерний ген, які використовуються для відбору клітин, здатних нести експресуючі вектори.
Молекули нуклеїнових кислот, які кодують МАБР-2-інгібуючий пептид, можуть бути синтезовані за допомогою "генних машин", використовуючи такі протоколи як фосфорамідитний метод. Якщо потрібне застосування хімічно синтезованої дволанцюжкової ДНК, наприклад при синтезі гена або його фрагмента, то кожний комплементарний ланцюг одержують окремо.
Одержання коротких генів (від 60 до 80 пар основ) у технічному відношенні швидко розвивається і може бути здійснене шляхом синтезу комплементарних ланцюгів і потім їх ренатурації. Для одержання більш довгих генів, синтетичні гени (дволанцюжкові) збирають у модульну форму з одноланцюжкових Фрагментів, які мають довжину від 20 до 100 нуклеотидів. 60 Огляди по синтезу полінуклеотидів можна знайти, наприклад, у монографії сіїсК апа Разіегпак,
Моїесшіаг Віоїесппоіоду, Ргіпсіріе5 апа Арріїсайоп5 ої Несотріпапі ОМА, АЗМ Ргезз, 1994; у публікаціях Макига К. еї аї., Аппи. Кем. Віоспет. 53:323, 1984; і Сіїтіє 5. еї аї., Ргос. Маг! Асай.
Зсі ОБА 87:633, 1990.
НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНІ ІНГІБІТОРИ
У деяких варіантах здійснення, МАЗР-2-інгібуючі засоби являють собою низькомолекулярні інгібітори, що включають природні і синтетичні речовини, які мають низьку молекулярну масу, такі, наприклад, як пептиди, пептидоміметики і непептидні інгібітори (включаючи олігонуклеотиди і органічні речовини). Низькомолекулярні інгібітори МАБР-2 можуть бути одержані на основі молекулярної структури варіабельних ділянок антитіл проти МА5Р -2.
Низькомолекулярні інгібітори можуть бути сконструйовані і одержані на основі кристалічної структури МА5БР-2, використовуючи метод комп'ютеризованої розробки і створення лікарських засобів (Кипія І.О. еї аІ., Зсіепсе, 257:1078, 1992). Була описана кристалічна структура МА5БР-2 щура (Реїіпрегоу Н. еї аІ., ЕМВО 3. 22:2348-2359, 2003). При застосуванні методу, описаного в публікації Кипі» еї аї., вводять координати кристалічної структури МАБР-2 у комп'ютерну програму, таку як ЮОСК, яка на виході видає список низькомолекулярних структур з передбачуваною здатністю зв'язування з МАБР-2. Використання таких комп'ютерних програм добре відоме фахівцям у цій галузі. Наприклад, кристалічну структуру інгібітору протеази НІМ-1 використовували для ідентифікації унікальних непептидних лігандів, які є інгібіторами протеази
НІМ-1, шляхом оцінки відповідності сполук із бази даних Сатьгідде СгузіаПодгарпіс дагаразе сайта зв'язування ферменту, використовуючи програму СОСК (Кипі Г.О. еї аї., У. Мої. Віої.
Му:269-288, 1982; Оезіапаїв В.Г... вії а!І., РМАБ5, 87:6644-6648, 1990).
Список низькомолекулярних структур, ідентифікованих за допомогою комп'ютеризованого методу як потенційні інгібітори МА5Р-2, піддають скринінгу, використовуючи аналіз зв'язування
МА5БР-2, як описано в прикладі 10. Низькомолекулярні сполуки, відносно яких було виявлено, що вони зв'язуються з МАЗР-2, потім випробовують у функціональному дослідженні, як це описано в прикладі 2, з метою визначення їх здатності інгібувати МА5БР-2-залежну активацію комплементу.
МА5БР-2-РОЗЧИННІ РЕЦЕПТОРИ
Вважають, що до інших придатних МА5Р-2-інгібуючих засобів також належать розчинні
Зо рецептори МА5Р-2, які можуть бути одержані методами, добре відомими звичайному фахівцю в цій галузі.
ІНГІБІТОРИ ЕКСПРЕСІЇ МА5Р-2
В іншому варіанті здійснення цього аспекту винаходу, МА5БР-2-інгібуючий засіб являє собою інгібітор експресії МА5Р-2, здатний інгібувати МА5БР-2-залежну активацію комплементу. При практичному здійсненні цього аспекту винаходу, типові інгібітори експресії МАБЗР-2 включають молекули антисмислової нуклеїнової кислоти МАБР-2 (такі як антисмислова мРНК, антисмислова ДНК або антисмислові олігонуклеотиди), рибозими МАБР-2 і молекули РНК- інтерференції МАБР-2.
Молекули антисмислових РНК і ДНК безпосередньо блокують трансляцію МРНК МА5Р-2 за допомогою гібридизації із мРНК МАЗР-2 і запобігання трансляції білка МАБР-2. Молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може бути сконструйована за допомогою цілого ряду методів, але за умови, що вона повинна мати здатність перешкоджати експресії МА5Р-2.
Наприклад, молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може бути сконструйована шляхом інвертування кодуючої ділянки (або її частини) КДНК МАБР-2 (5ЕБО ІЮ МО:4) відносно її нормальної орієнтації при транскрипції, що дозволяє здійснити транскрипцію її комплементу.
Звичайно, молекула антисмислової нуклеїнової кислоти є практично тотожною щонайменше частині таргетного гена або таргетних генів. Однак, для того, щоб інгібувати експресію, нуклеїнова кислота не обов'язково повинна бути абсолютно тотожною. Звичайно, може використовуватися більш висока гомологія для того, щоб компенсувати застосування молекули антисмислової нуклеїнової кислоти з більш короткою послідовністю. Мінімальний відсоток тотожності звичайно становить не менше 65 95, але більш високий відсоток тотожності може характеризуватися більш ефективним пригніченням експресії ендогенної послідовності.
Переважним є відсоток тотожності, що суттєво перевищує 80 90, і все-таки тотожність від 95 Фо до абсолютної тотожності є найбільш переважною.
Молекула антисмислової нуклеїнової кислоти може не мати такий же патерн інтрона або екзона, як у таргетного гена, і некодуючі сегменти таргетного гена можуть бути так само ефективні в досягненні антисмислового пригнічення таргетного гена, як і кодуючи сегменти.
Послідовність ДНК щонайменше з 8 або більше нуклеотидів може бути використана як молекула антисмислової нуклеїнової кислоти, хоча переважною є більш довга послідовність. У бо даному винаході, типовим прикладом застосовуваного МА5Р-2-інгібуючого засобу є молекула антисмислової нуклеїнової кислоти МА5Р-2, яка щонайменше на дев'яносто відсотків тотожна комплементарній КДНК МА5Р-2, що складається з послідовності нуклеїнової кислоти, описаної в
ЗЕО ІО МО:4. Послідовність нуклеїнової кислоти, описана в 5ЕО ІО МО:4, кодує білок МАБ5Р-2, що складається з амінокислотної послідовності, описаної в з«ЕО ІЮ МО:5.
Таргетування антисмислових олігонуклеотидів на зв'язування з МРНК МА5Р-2 являє собою інший механізм, який може бути використаний для зниження рівня синтезу білка МА5Р-2.
Наприклад, синтез полігалактуронази і ацетилхолінового мускаринового рецептора другого типу інгібується антисмисловими олігонуклеотидами, спрямованими на їх відповідні послідовності
МРНК (патентні документи О.5. Раїепі Мо 5739119, то Спепд, апа 0.5. Раїепі Мо 5759829, 10
ЗпеултпакКег). Крім того, були продемонстровані приклади антисмислового інгібування за допомогою ядерного білка цикліну, гена множинної лікарської резистентності (МОСТІ), ІСАМ-1,
Е-селектину, ЗТК-1, стріарного рецептора САВАА ії ЕСЕ людини (дивіться, наприклад, патентні документи Ш.5. Раїепі Мо 5801154, о Вагасспіпі; 0.5. Раїепі Мо 5789573, 10 ВакКег; 0.5. Раїепі Мо 5718709, то Сопвіадіпе; і 0.5. Раїепі Мо 5610288, то Кепирепзвівіп).
Описана система, яка дозволяє звичайному фахівцю визначити, які олігонуклеотиди можуть застосовуватися у винаході, що включає зондування придатних сайтів у таргетній мРНК, використовуючи розщеплення рибонуклеази Н як індикатора доступності послідовностей усередині транскриптів. Зспегт М. еї аї., Мисівїс Асід5 Кевз. 26:5079-5085, 1998; Поуй еї аї.,
Мисієїс Асід5 АНев5. 29:3665-3673, 2001. Суміш антисмислових олігонуклеотидів, які є комплементарними відносно конкретних ділянок транскрипту МАБР-2, додають до екстрактів клітин, експресуючих МАБР-2, таких як гепатоцити, і піддають гібридизації для створення сприйнятливих до рибонуклеази Н сайтів. Цей спосіб може бути об'єднаний з вибором послідовностей за допомогою комп'ютерної програми, яка може прогнозувати оптимальний вибір послідовності для антисмислових композицій на основі їх відносної здатності утворювати димери, "шпильки" або інші вторинні структури, які можуть зменшувати або запобігати специфічному зв'язуванню з таргетною мРНК у клітині-хазяїні. Аналіз цих вторинних структур і рекомендації з вибору таргетних сайтів можуть бути здійснені за допомогою програмного забезпечення ОГІСО для аналізу праймерів (Куспіїк І., 1997) і комп'ютерного алгоритму ВІ АЗТМ 2.0.5 (Айвспиці 5.Р. еї аї., Мисі. Асіаб5 Рез. 25:3389-3402, 1997). Переважно, щоб антисмислові сполуки, спрямовані на таргетну послідовність, включали приблизно від 8 до 50 нуклеотидів.
Антисмислові олігонуклеотиди, що включають приблизно від 9 до 35 нуклеотидів або близько до цього, є особливо переважними. Автори винаходу припускають, що всі олігонуклеотидні композиції в діапазоні від 9 до 35 нуклеотидів (тобто ті, які включають 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 або 35 або близько до цього) є найбільш переважними для практичного використання способів за винаходом, основаних на антисмислових олігонуклеотидах. Найбільш переважними таргетними ділянками мРНК МА5бР-2 є ті, які розташовані в безпосередній близькості від кодону, що ініціює трансляції АОС, і ті послідовності, які є фактично комплементарними з 5'-ділянками мРНК, наприклад між -10 їі -10 ділянками нуклеотидної послідовності гена МАБР-2 (5ЕБЕО ІЮ МО:4). Приклади інгібіторів експресії МАБ5Р-2 представлені в таблиці 4.
Таблиця 4
Приклади інгібіторів експресії тазр-2
ЗЕО ІЮ МО:А МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:4), кодуюча СОВІЕСЕ го Іо МОВ Нуклеотиди 12-45 послідовності ЗХЕО 10
МО:4, включаючи стартовий сайт доваслодосатодосстостолоостостовово трансляції МАБР-2 (смисловий)
ЗЕО ІЮО МО:32 Нуклеотиди 361-396 послідовності ХЕО ІЮ 5-ВАСАТТАССТТОСастоСаАСТОСААСОСАСАДаИ- | МО:4, кодуючої ділянку, яка містить
З зв'язуючий сайт МВІ МА5Р-2 (смисловий)
ЗЕО ІЮ МО:ЗЗ Нуклеотиди 610-642 послідовності ХЕО ІЮ 5-АаСсАаСССтТаААТАСССАСОСасССатАТОССАДА-| МО:4, кодуючої ділянку, яка містить домен
З' СОВІЇ
Як було відзначено вище, використовуваний у винаході термін "олігонуклеотид" стосується будь-якого олігомеру або полімеру рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або їх імітаторів. Цей термін також охоплює олігонуклеотидні основи, що складаються з природних нуклеотидів, цукрів і ковалентних міжнуклеозидних (каркасних) зв'язків, а також олігонуклеотиди з неприродними модифікаціями. Ці модифікації дозволяють надавати олігонуклеотидам визначені бажані властивості, які не мають природні олігонуклеотиди, такі як знижені токсичні властивості, підвищена стійкість до деградації нуклеази і підвищене поглинання клітинами. В ілюстративних варіантах здійснення, антисмислові сполуки за винаходом відрізняються від нативної ДНК модифікацією фосфодіефірного каркаса для збільшення терміну служби антисмислового олігонуклеотиду, у якому фосфатні замісники замінені на фосфоротіоатні. Аналогічним чином, один або обидва кінці олігонуклеотиду можуть бути заміщені одним або більше похідними акридину, які інтеркалюють між сусідніми парами нуклеотидів у ланцюзі нуклеїнової кислоти.
Іншою альтернативою антисмисловій є використання "РНК-інтерференції" (АМАЇ).
Дволанцюжкові РНК (а5КМА) можуть провокувати сайленсинг гена у ссавців іп мімо. Очевидно, природною функцією РЕМАЇї і косупресії є захист геному від інвазії мобільними генетичними елементами, такими як ретротранспозони і віруси, які продукують аберантні РНК або а5ЕМА у клітині-хазяїні, коли вони стають активними (дивіться, наприклад, Уепзеп .. еї аї., маї. Сепеї. 21:209-12, 1999). Молекула дволанцюжкової РНК може бути одержана синтезом двох ланцюгів
РНК, здатних до формування молекули дволанцюжкової РНК, кожний з яких має довжину приблизно від 19 до 25 нуклеотидів (наприклад, 19-23 нуклеотидів). Наприклад, молекула а5зКМА, застосовувана в способах за винаходом, може включати РНК, відповідну послідовності і її комплементу, наведеним у таблиці 4. Переважно, щоб щонайменше один ланцюг РНК мав 3' "липкий" кінець з 1-5 нуклеотидів. Синтезовані ланцюги РНК об'єднують в умовах, при яких утворюють дволанцюжкову молекулу. Послідовність РНК може включати щонайменше восьминуклеотидну частину з послідовності ЗЕО ІЮ МО:4 з загальною довжиною в 25 нуклеотидів або менше. Конструювання послідовностей 5ікМА для даної мішені добре відоме звичайному фахівцю в цій галузі. Існують комерційні організації що займаються конструюванням послідовностей 5ікМА і гарантуючі щонайменше 70 95 нокдаун експресії гена (Оіадеп, МаІепсіа, Саїїйю. а5зКМА може бути введена у формі фармацевтичної композиції і відомими методами, за
Зо допомогою яких нуклеїнову кислоту вводять у необхідну клітину-мішень. Загальноприйняті способи перенесення гена включають фосфат кальцію, ЮЕАЕ-декстран, електропорацію, мікроін'єкцію і вірусні методи. Такі методи описані в публікації А!,5ибеї еї аї., Сиггепі Ргоїосої5 іп
Моїесшіаг Віоіоду, Ччонпп Уміїєу б 5опв, Іпс., 1993.
Рибозими, такі як рибозими, які таргетують МРНК МА5Р-2, можуть бути також використані для зниження кількості й/або біологічної активності МАБР-2. Рибозими являють собою каталітичні молекули РНК, здатні розщеплювати молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю, яка повністю або частково гомологічна послідовності рибозиму. Існує можливість конструювання рибозимних трансгенів, кодуючих рибозими РНК, які специфічно утворюють пари з таргетною РНК і розщеплюють фосфодіефірний каркас у специфічній ділянці, внаслідок чого відбувається функціональна інактивація таргетної РНК. При проведенні цього розщеплення, рибозим сам по собі не змінюється, у результаті чого він зберігає здатність до рециклінгу і розщеплення інших молекул. Включення рибозимних послідовностей в антисмислові РНК забезпечує їм активність розщеплення РНК, у результаті чого підвищується активність антисмислових конструкцій.
Рибозими, використовувані при практичному здійсненні винаходу, звичайно включають ділянку, що гібридизується, щонайменше з дев'яти нуклеотидів, яка є в нуклеотидній послідовності комплементарною щонайменше до частини таргетної МРНК МА5Р-2, і каталітичну ділянку, яка призначена для розщеплення таргетної МРНК МА5Р-2 (дивіться, у цілому, патентні документи ЕРА Мо 0321201; УМО 88/04300; публікації Назейоїй .). еї аі., Макиге, 334:585-591, 1988;
Еєедог М... еї аї., Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА, 87:1668-1672, 1990; Сесі Т.В. єї аї., Апп. Веу.
Віоспет. 55:599-629, 1986).
Рибозими також можуть бути безпосередньо таргетовані на клітини у формі олігонуклеотидів РНК, які інкорпорують послідовності РНК або вводяться в клітину як експресуючий вектор, кодуючий необхідну рибозимальну РНК. Рибозими можуть використовуватися і застосовуватися майже таким же способом, як спосіб, описаний для антисмислових полінуклеотидів.
Антисмислові РНК і ДНК, рибозими і молекули КМАЇї, застосовувані в способах за винаходом, можуть бути одержані будь-яким відомим методом синтезу молекул ДНК і РНК.
Вони включають добре відомі методи хімічного синтезу олігодезоксирибонуклеотидів і бо олігорибонуклеотидів, такі як, наприклад, твердофазний фосфорамідитний хімічний синтез. Як бо варіант, молекули РНК можуть бути утворені шляхом транскрипції іп омйго і іпомімо послідовностей ДНК, кодуючих молекулу антисмислової РНК. Такі послідовності ДНК можуть бути інкорпоровані в широкий спектр векторів, які інкорпорують придатні промотори полімерази
РНК, такі як промотори полімерази Т7 або 5Рб. Як варіант, конструкції антисмислової кКДНК, які синтезують антисмислову РНК постійно або індуцибельно, залежно від використовуваного промотору, можуть стабільно вводитися в клітинні лінії.
Добре відомі різні модифікації молекул ДНК можуть бути введені для підвищення стабільності і періоду напіввиведення. Застосовувані модифікації включають, але цим не обмежуючи, додавання фланкуючих послідовностей рибонуклеотидів або дезоксирибонуклеотидів до 5'- і/або 3"-кінців молекули або використання фосфотіоату або 2'-0- метилу замість фосфодіефірних зв'язків з олігодезоксирибонуклеотидним каркасом.
МІ. ФАРМАЦЕВТИЧНІ КОМПОЗИЦІЇ ії СПОСОБИ ДОСТАВКИ. ДОЗУВАННЯ
В іншому аспекті, у винаході пропонуються композиції для інгібування негативних наслідків
МА5БР-2-залежної активації комплементу у суб'єкта, що страждає від описаного у винаході захворювання або стану, включаючи введення суб'єкту композиції, яка містить терапевтично ефективну кількість МАЗР-2-інгібуючого засобу і фармацевтично прийнятний носій. МАБР-2- інгібуючі засоби можуть бути введені суб'єкту, що потребує цього, у терапевтично ефективних дозах для лікування або полегшення станів, пов'язаних з МА5БР-2-залежною активацією комплементу. Терапевтично ефективна доза належить до кількості МА5Р-2-інгібуючого засобу, достатньої для досягнення полегшення симптомів, пов'язаних із захворюванням або станом.
Токсичність і терапевтична ефективність МА5Р-2-інгібуючих засобів можуть бути визначені стандартними фармацевтичними методами з використанням експериментальних тваринних моделей, таких як експериментальна модель на МАБР-2-/- мишах, експресуючих людський трансген МА5БР-2, як описано в прикладі 1. Використовуючи такі експериментальні моделі на тваринах, можна визначити стандартними методами рівень відсутності спостережуваних небажаних ефектів (МОАЕЇ) і мінімальну ефективну дозу (МЕС). Відношення доз, якими характеризуються МОАЕЇ і МЕО, являє собою терапевтичний індекс, який виражається як відношення МОАЕГ/МЕО. МАБ5БР-2-інгібуючі засоби, які мають високі терапевтичні індекси, є найбільш переважними. Дані, одержані в результаті вивчення клітинних культур і досліджень на тваринах, можуть бути використані для визначення діапазону доз для людини. Переважно, щоб дози МАБР-2-інгібуючого засобу знаходилися в діапазоні циркулюючих концентрацій, які включають МЕЮО при мінімальному рівні токсичності або без неї. Доза може варіюватися усередині цього діапазону залежно від лікарської форми або використовуваного способу введення.
Для будь-якої лікарської форми сполуки, терапевтично ефективна доза може бути визначена на експериментальних моделях на тваринах. Наприклад, на експериментальній моделі на тварині може бути визначена доза, при якій досягається діапазон циркулюючої концентрації в плазмі, який включає в себе МЕО. Кількісні рівні МА5Р-2-інгібуючого засобу в плазмі можуть також бути визначені, наприклад, методом високоефективної рідинної хроматографії.
На доповнення до токсикологічних досліджень, ефективна доза також може бути оцінена по кількості біль»а МАБР-2, присутній в живому організмі, і по афінності зв'язування МА5Р-2- інгібуючого засобу. Було показано, що рівні МАБР-2 присутні у сироватці здорових людей у невеликих кількостях у межах 500 нг/мл, і рівні МАБР-2 у конкретних суб'єктів можуть бути визначені методом кількісного аналізу МАЗР-2, описаним у публікації МоППег-Кгізіїепзеп М. еї аї.,
У. Іттипої. Меїйодв, 282:159-167, 2003.
Звичайно, доза композицій, що вводяться, які включають МАБ5Р-2-інгібуючі засоби, варіює залежно від таких факторів як вік, маса тіла, ріст, стать суб'єкта, його загальний стан здоров'я і анамнез. Як ілюстрація, МА5Р-2-інгібуючі засоби, такі як антитіла проти МАБР-2, можуть бути введені в дозі приблизно від 0,010 до 10,0 мг/кг, переважно від 0,010 до 1,0 мг/кг, більш переважно від 0,010 до 0,1 мг/кг маси тіла суб'єкта. У деяких варіантах здійснення, композиція включає комбінацію антитіла проти МАБР-2 і МА5БР-2-інгібуючих пептидів.
Терапевтична ефективність МА5Р-2-інгібуючих композицій і способів за даним винаходом для даного суб'єкта і відповідні дози можуть бути визначені шляхом досліджень комплементу, які добре відомі фахівцям у цій галузі. Комплемент генерує множину специфічних продуктів.
Протягом останніх десяти років були розроблені чутливі і специфічні методи аналізу, які є комерційно доступними для більшості із цих продуктів активації, у тому числі малих фрагментів активації СЗа, Сда і Сба і великих фрагментів активації ІСЗр, С44, Вр і 5С50-9. У більшості із цих досліджень використовуються моноклональні антитіла, які реагують із новими антигенами бо (неоантигенами), доступними на фрагменті, але не на нативних білках, з яких вони утворюються, що робить ці методи аналізу дуже простими і специфічними. Найчастіше застосовують твердофазний імуноферментний аналіз (ЕЇГІЗА), хоча іноді усе ще використовують радіоїмунологічний аналіз для СЗа і Сба. У цьому останньому методі вимірюють як непроцесовані фрагменти, так і їх фрагменти "дезАга", які є основними формами, що виявляються в кровотоку. Непроцесовані фрагменти і СбадезАгд швидко виводяться за рахунок зв'язування з рецепторами клітинної поверхні і, тому, присутні в дуже низьких концентраціях, тоді як СЗадеб5Агу не зв'язується з клітинами і акумулюється в плазмі.
Вимірювання СЗа є чутливим, не залежним від шляху активації комплементу індикатором активації комплементу. Альтернативний шлях активації комплементу може бути оцінений шляхом вимірювання фрагмента ВЬ. Виявлення рідкофазового продукту мембраноатакуючого шляху активації, 5С50-9, є доказом того, що комплемент активований повністю. Оскільки обидва шляхи активації, і лектиновий, і класичний, генерують одні і ті ж продукти активації, С4а і С44, вимірювання цих двох фрагментів не дає ніякої інформації стосовно того, який із цих двох шляхів активації комплементу привів до утворення продуктів активації.
Інгібування МАЗР-2-залежної активації комплементу характеризується щонайменше однією з наступних змін компонента системи комплементу, що виникає в результаті введення МА5Р-2- інгібуючого засобу способами за винаходом: інгібування утворення або продукування продуктів
МА5Р-2-залежної активації системи комплементу С4Б, СЗа, Сба і/або С5р-9 (МАС) (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 2), зменшення розщеплення СА і відкладення С4Б (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 10) або зменшення розщеплення ССЗ і відкладення СЗ3р (виміряне, наприклад, як описано в прикладі 10).
ДОДАТКОВІ ЛІКАРСЬКІ ЗАСОБИ
Композиції і способи, що включають МАБР-2-інгібуючі засоби, можуть необов'язково включати один або більше додаткових терапевтичних засобів, які можуть підвищувати активність МА5Р-2-інгібуючого засобу або які виявляють близькі терапевтичні впливи адитивно або з синергізмом. Наприклад, у випадку лікування суб'єкта, що страждає від ТТР, коли у суб'єкта досягається позитивна відповідь на лікування інгібітором АСАМТ513, один або більше
МА5Р-2-інгібуючих засобів можуть бути введені в комбінації (у тому числі спільно) з одним або більше імунодепресивними засобами. Придатні імунодепресивні засоби включають
Зо кортикостероїди, ритуксан, циклоспорин і інші подібні імунодепресанти. У випадку лікування суб'єкта, що страждає від НО5 або аниз або має ризик розвитку НО5 або ани5, один або більше МА5БР-2-інгібуючих засобів можуть бути введені в комбінації (у тому числі спільно) з придатним антибіотиком. У випадку лікування суб'єкта, що страждає від аниз або має ризик розвитку анив, один або більше МА5Р-2-інгібуючих засобів можуть бути введені в комбінації (у тому числі спільно) з іншими інгібуючими комплемент засобами, такими як екулізумаб (5оїїгів5),
ТТ-30, антитіло до фактора В, або іншими засобами, які інгібують термінальні компоненти комплементу або ампліфікацію альтернативного шляху.
Для досягнення необхідного терапевтичного результату слід визначитися з включенням і вибором додаткового засобу (додаткових засобів). У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2- інгібуючий засіб може бути введений в комбінації з одним або більше протизапальними й/або болезаспокійливими засобами. Придатні протизапальні й/або болезаспокійливі засоби включають антагоністи серотонінового рецептора; агоністи серотонінового рецептора; антагоністи гістамінового рецептора; антагоністи брадикінінового рецептора; інгібітори калікреїну; антагоністи тахікінінового рецептора, включаючи антагоністи підтипу рецепторів нейрокініну-1 і нейрокініну-2; антагоністи рецептора кальцитонін-ген-зв'язаного пептиду (СОКР); антагоністи інтерлейкінового рецептора; інгібітори ферментів, активних при синтетичному шляху активації для метаболітів арахідонової кислоти, включаючи інгібітори фосфоліпази, включаючи інгібітори ізоформи РІА2 і інгібітори ізоформи РісСу, інгібітори циклооксигенази (СОХ) (які можуть являти собою або СОХ-1, СОХ-2, або неселективні інгібітори СОХ-1 і СОХ-2), інгібітори ліпооксигенази; антагоністи простаноїдних рецепторів, включаючи антагоністи підтипу рецепторів ейкозаноїдів ЕР-1 і ЕР-4 і антагоністи підтипу рецепторів тромбоксану; антагоністи рецептора лейкотриєну, включаючи антагоністи підтипу рецепторів лейкотриєну В4 і лейкотриєну 04; агоністи опіоїдного рецептора, включаючи агоністи підтипу рецепторів р- опіоїду, б-опіоїду і к-опіоїду; агоністи і антагоністи пуринергічного рецептора, включаючи антагоністи рецептора РО2Х і агоністи рецептора Р2У; чутливі до аденозинтрифосфату (АТР) речовини, що відкривають калієві канали; інгібітори МАР-кінази; інгібітори холіноміметичного ацетилхоліну; і агоністи альфа-адренергічного рецептора (включаючи альфа-1, альфа-2 і неселективні альфа-1 і альфа-2 агоністи).
МАБ5БР-2-інгібуючі засоби за даним винаходом можуть бути введені в комбінації з одним або 60 більше іншими інгібіторами комплементу, такими як інгібітор С5. На даний час, екулізумаб
(Боїагіз5Ф), антитіло проти С5, є єдиним комплемент-таргетованим лікарським засобом, який був схвалений для застосування на людях. Однак, було показано, що фармакологічні засоби блокують комплемент іп мімо. К/6ЄСООН і нафамстату мезилат являють собою два лікарські засоби, які продемонстрували визначену ефективність в експериментальних моделях трансплантації на тваринах (Міуадамжма 5. єї а!., Тгап5ріапі Ргос. 24:483-484, 1992). Було також показано, що низькомолекулярні гепарини є ефективними при регуляції активації комплементу (Едеп5 В.Е. єї аЇ., Сотрієтепі Тодау, рр.96-120, Вазе!ї: Кагдег, 1993). Вважають, що ці низькомолекулярні інгібітори можуть застосовуватися як лікарські засоби при використанні в комбінації з МА5Р-2-інгібуючими засобами за даним винаходом.
У комбінації з МАЗР-2-інгібуючими засобами за даним винаходом можуть застосовуватися і інші природні інгібітори комплементу. Біологічні інгібітори комплементу включають розчинний фактор комплементу 1 (5СК1). Він являє собою природний інгібітор, який виявляється в зовнішній мембрані людських клітин. Інші мембранні інгібітори включають мембранні інгібітори рАРЕ, МОР і СО59. Рекомбінантні форми були піддані випробуванням на їх антикомплементарну активність іп міїго і іп мімо. Було показано, що 5СК1 є ефективним при ксенотрансплантації, коли система комплементу (як альтернативна, так і класична) ініціює виникнення синдрому гіперактивного відторгнення протягом лічених хвилин перфузії крові в нещодавно пересадженому органі (Ріай .С. еї аї., Іттипої. Тодау 11:450-6, 1990; Магіпо І.А. єї аї.,
Тгаперіапі Ргос. 1071:6, 1990; доппвіопе Р.5. евї а!., Тгапзріапіайоп 54:573-6, 1992). Застосування 5СКІ захищає і збільшує час життєздатності трансплантованого органа, залучаючи шлях активації комплементу в патогенез виживання органа (І емепійаї! У.К. еї аї., Тгапзріапіайоп, 55:857-66, 1993; Ргиїй 5.К. еї аІ., Ттапзріапіайоп, 57:363-70, 1994).
Придатні додаткові інгібітори комплементу для використання в комбінації з композиціями за даним винаходом також включають, наприклад, МоАб»5, такі як антитіло проти С5 (наприклад, екулізумаб), розроблене фірмою Аїехіоп Рпагтасеціїса!5, Іпс., Мем Намеп, Соппесіїсції, і МоАб5 проти пропердину.
ФАРМАЦЕВТИЧНІ НОСІЇ і СИСТЕМИ ДОСТАВКИ
Звичайно, композиції МА5Р-2-інгібуючих засобів за даним винаходом, об'єднані з будь- якими іншими вибраними терапевтичними засобами, відповідно поміщені у фармацевтично
Зо прийнятний носій. Носій є нетоксичним, біосумісним, і його вибирають так, щоб він негативно не впливав на біологічну активність МА5Р-2-інгібуючого засобу (і будь-яких інших терапевтичних засобів, об'єднаних з ним). Приклади фармацевтично прийнятних носіїв для пептидів описані в патентному документі О.5. Раїепі Мо 5211657 юю МУатада. З антитіл проти МА5Р-2 і інгібуючих пептидів, застосовуваних у винаході, можуть бути приготовлені тверді, напівтверді, гелеподібні, рідкі і газоподібні лікарські форми, такі як таблетки, капсули, порошки, гранули, мазі, розчини, супозиторії, інгаляційні форми і ін'єкції для перорального, парентерального або хірургічного введення. Винахід також включає місцеве введення композицій у результаті нанесення покриття з лікарського засобу на медичні пристрої і інші подібні інструменти.
Придатні носії для парентеральної доставки шляхом ін'єкції, інфузії або промивання і місцевої доставки включають дистильовану воду, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, нормальний або лактований розчин Рінгера, розчин декстрози, розчин Хенкса або пропандіол. Крім того, як розчинник або суспендуюче середовище можуть бути використані стерильні нелеткі масла. Для цієї мети може використовуватися будь-яке біосумісне масло, у тому числі синтетичні моно- або дигліцериди. Крім того, в ін'єктованих препаратах знаходять застосування жирні кислоти, такі як олеїнова кислота. Носій і засіб можуть бути компаундовані у формі рідини, суспензії, гелю, що полімеризується або не полімеризується, пасти або крему.
Носій може також включати засіб доставки для того, щоб підтримувати режим доставки, що встановився (тобто пролонгований, уповільнений або регульований), лікарського засобу (лікарських засобів), або для того, щоб інтенсифікувати доставку, засвоєння, підвищити стабільність або поліпшити фармакокінетику терапевтичного засобу (терапевтичних засобів).
Така система доставки може включати, але цим не обмежуючи, мікрочастинки, мікросфери, наносфери або наночастинки, сформовані з білків, ліпосом, вуглеводів, синтетичних органічних сполук, неорганічних сполук, полімерних або співполімерних гідрогелів і полімерних міцел.
Придатні гідрогельні і міцелярні системи доставки включають співполімери РЕО:РНВ:ІРЕО (поліетиленоксид'полігідроксибутират:поліетиленоксид) і комплекси співполімер/циклодекстрин, розкриті в патентному документі ММО 2004/009664 А2, і РЕО їі комплекси РЕО/циклодекстрин, розкриті в патентному документі 0.5. Раїепі Арріїсайоп Рибіїсайоп Мо 2002/0019369 А1. Такі гідрогелі можуть бути ін'єктовані місцево в область передбачуваного впливу або підшкірно або внутрішньом'язово для утворення депо з пролонгованим вивільненням лікарського засобу. 60 У випадку внутрішньосуглобової доставки, МА5Р-2-інгібуючий засіб може бути перенесений в описаних вище ін'єктованих рідких або гелевих носіях, в описаних вище ін'єктованих засобах доставки із пролонгованим вивільненням лікарського засобу або в гіалуроновій кислоті або в похідному гіалуронової кислоти.
У випадку перорального введення непептидергічних засобів, МА5Р-2-інгібуючий засіб може бути перенесений в інертному наповнювачі або розріджувачі, такому як сахароза, кукурудзяний крохмаль або целюлоза.
У випадку місцевого введення, МА5Р-2-інгібуючий засіб може бути перенесений в мазі, лосьйоні, кремі, гелі, краплях, супозиторії, спреї, рідині або порошку або в гелевих або мікрокапсулярних системах доставки за допомогою трансдермального пластиру.
На даний час розробляються різні системи назальної і інгаляційної доставки, що включають аерозолі, дозуючі інгалятори, порошкові інгалятори і небулайзери, і вони можуть бути відповідним чином пристосовані для доставки за даним винаходом при аерозольному, інгаляційному або розпилювальному засобі доставки, відповідно.
У випадку інтратекальної (ІТ) або інтрацеребровентрикулярної (ІСМ) доставки, для введення композиції за даним винаходом можуть бути використані відповідним чином стерилізовані системи доставки (наприклад, рідини, гелі, суспензії і так далі).
Композиції за даним винаходом можуть також включати біосумісні допоміжні речовини, такі як диспергуючі або змочувальні речовини, суспендуючі речовини, розріджувачі, буфери, речовини, що сприяють проникненню, емульгатори, зв'язуючі речовини, загусники, ароматизуючі речовини (для перорального введення).
ФАРМАЦЕВТИЧНІ НОСІЇ ДЛЯ АНТИТІЛ І ПЕПТИДІВ
Більш конкретно, застосовно до антитіл проти МАБ5Р-2 і інгібуючих пептидів, пропонуються приклади лікарських форм, які можуть бути парентерально введені у вигляді ін'єктованих доз розчину або суспензії сполуки у фізіологічно прийнятному розріджувачі з фармацевтичним носієм, який може являти собою стерильну рідину, таку як вода, масла, фізіологічний розчин, гліцерин або етанол. Крім того, у композиціях, що включають антитіла проти МА5Р-2 і інгібуючі пептиди, можуть бути присутні допоміжні речовини, такі як змочувальні речовини або емульгатори, поверхнево-активні речовини, буферні речовини і інші подібні допоміжні речовини.
Додаткові компоненти фармацевтичних композицій включають вазелінове масло (тваринного,
Зо рослинного або синтетичного походження), наприклад соєву олію і мінеральне масло.
Звичайно, переважними рідкими носіями для ін'єктованих розчинів Є гліколі, такі як пропіленгліколь або поліетиленгліколь.
Антитіла проти МА5Р-2 і інгібуючі пептиди можуть бути також введені у формі ін'єктованого депо або імплантованого препарату, які можуть бути приготовлені так, що вони забезпечують пролонговане або пульсуюче вивільнення діючих засобів.
ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЙНЯТНІ НОСІЇ ДЛЯ ІНГІБІТОРІВ ЕКСПРЕСІЇ
Більш конкретно, застосовно до інгібіторів експресії, застосовуваних у способах за винаходом, пропонуються композиції, які включають описаний вище інгібітор експресії і фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. Композиція може додатково включати колоїдно-дисперсну систему.
Фармацевтичні композиції, які включають інгібітори експресії, можуть включати, але цим не обмежуючи, розчини, емульсії і склади, що містять ліпосоми. Ці композиції можуть бути приготовлені з різних компонентів, які включають, але цим не обмежуючи, попередньо підготовлені рідини, самоемульговані тверді речовини і самоемульговані напівтверді речовини.
Приготування таких композицій звичайно включає змішування інгібітору експресії з однією або більше з наступних речовин: буферами, антиоксидантами, низькомолекулярними поліпептидами, білками, амінокислотами, вуглеводами, включаючи глюкозу, сахаразу або декстрини, хелатоутворюючими реагентами, такими як ЕЮОТА, глутатіоном і іншими стабілізаторами і допоміжними речовинами. Прикладами придатних розріджувачів є нейтральний забуферений фізіологічний розчин або фізіологічний розчин, змішаний з неспецифічним сироватковим альбуміном.
У деяких варіантах здійснення, композиції можуть бути складені і приготовлені у формі емульсій, які звичайно являють собою гетерогенні системи однієї рідини, диспергованої в іншій рідині у формі крапель (дивіться, Ід50п, іп Рпаптасешіса! Юозаде Еопт5, Мої. 1, Вівдег апа
ВапКег (еаз.), Магсек ОекКег, Іпс., М.М., 1988). Приклади природних емульгаторів, використовуваних в емульсійних лікарських формах, включають аравійську камедь, бджолиний віск, ланолін, лецитин і фосфатиди.
В одному варіанті здійснення, композиції, що включають нуклеїнові кислоти, можуть бути приготовлені у формі мікроемульсій. Мікроемульсія, використовувана у винаході, належить до бо системи води, масла і амфіфільної речовини, яка являє собою простий оптично ізотропний і термодинамічно стабільний рідкий розчин (дивіться Козої іп Рпагтасешіса! бозаде Еогтв, Мої. 1). У способі за винаходом можуть також використовуватися ліпосоми для перенесення і доставки антисмислових олігонуклеотидів у необхідне місце.
Фармацевтичні композиції і лікарські форми інгібіторів експресії для місцевого введення можуть включати трансдермальні пластири, мазі, лосьйони, креми, гелі, краплі, супозиторії, спреї, рідини і порошки. Можуть бути використані традиційні фармацевтичні носії, а також водні, порошкові або масляні основи і загусники і інші подібні речовини.
СПОСОБИ ВВЕДЕННЯ
Фармацевтичні композиції, які включають МА5Р-2-інгібуючі засоби, можуть бути введені різними способами, залежно від того, який спосіб введення, місцевий або системний, найбільшою мірою відповідає стану, що піддається лікуванню. Крім того, як описано у винаході вище стосовно методів екстракорпоральної реперфузії, МА5Р-2-інгібуючі засоби можуть бути введені шляхом введення композицій за даним винаходом в циркулюючу кров або плазму. Крім того, композиції за даним винаходом можуть бути доставлені шляхом нанесення покриття на імплантований медичний пристрій або шляхом введення композицій усередину імплантованого медичного пристрою.
СИСТЕМНА ДОСТАВКА
Передбачається, що використовувані у винаході терміни "системна доставка" і "системне введення" включають, але цим не обмежуючи, пероральні і парентеральні способи, у тому числі внутрішньом'язовий (ІМ), підшкірний, внутрішньовенний (ІМ), внутрішньоартеріальний, інгаляційний, сублінгвальний, букальний, місцевий, трансдермальний, назальний, ректальний, вагінальний і інші способи введення, які дозволяють досягати ефективного диспергування засобу, що доставляється, в одному або декількох місцях передбачуваної терапевтичної дії.
Переважні способи системної доставки композицій за даним винаходом включають внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний і інгаляційний способи. Слід мати на увазі, що відповідний спосіб системного введення для вибраних засобів, використовуваних у конкретних композиціях за даним винаходом, повинен визначатися, у тому числі, з урахуванням схильності лікарського засобу до шляхів метаболічних трансформацій, пов'язаних з даним способом введення. Наприклад, пептидергічні засоби найбільш зручно вводити
Зо непероральними способами.
МА5БР-2-інгібуючі антитіла і поліпептиди можуть бути доставлені суб'єкту, що потребує цього, будь-якими придатними способами. Способи доставки МА5БР-2 антитіл і поліпептидів включають введення пероральним, пульмональним, парентеральним (наприклад, внутрішньом'язовою, інтраперитонеальною, внутрішньовенною (ІМ) або підшкірною ін'єкцією), інгаляційним (наприклад, у формі тонкодисперсного порошку), трансдермальним, назальним, вагінальним, ректальним або сублінгвальним способами введення, і з них можуть бути приготовлені лікарські форми, що відповідають кожному зі способів введення.
Як типовий приклад, МАБ5бР-2-інгібуючі антитіла і пептиди можуть бути введені в живий організм шляхом нанесення на мембрану організму, здатну абсорбувати поліпептиди, наприклад на назальні, гастроінтестинальні і ректальні мембрани. Поліпептиди звичайно наносять на абсорбуючу мембрану в комбінації з посилюючою проникнення речовиною (дивіться, наприклад, ее М.Н.Г., Ст. Кем. Тег. Огид Саггіег Зуб5. 5:69, 1988; І єє М.НІЇ., у.
Сопігоїїєд Реїєазе 13:213, 1990; І ее М.Н.Г.., Ед., Рерііде апа Ргоївїп Огид Оеєїїмегу, Магсе! Оеккег",
Мем ХогКк (1991); Оероеєг А.О. еї аї., У. СопігоПей Кеїеазе, 13:241, 1990). Наприклад, ЗТОНЕ є синтетичним похідним фусидової кислоти, стероїдної поверхнево-активної речовини, яка аналогічна за структурою солям жовчних кислот, і це похідне було використане як посилююча проникнення речовина для назальної доставки (І ее М/.А., Віорпагіт. 22, Мом./Оєс. 1990).
МА5Р-2-інгібуючі антитіла і поліпептиди можуть бути введені разом з іншою молекулою, такою як ліпід, для захисту поліпептидів від ферментативної деградації. Наприклад, ковалентне приєднання полімерів, зокрема полієтиленгліколю (РЕС), використовували для захисту конкретних білків від ферментативного гідролізу в організмі і таким чином збільшували тривалість періоду напіввиведення (ЕБиегпде5 Р. еї аї., У. СопігоПей Кеїеазе 11:139, 1990).
Повідомлялося про багато полімерних систем для доставки білка (Ває У.Н. еї аї.,У. СопігоЇПей
Веїієазе 9:271, 1989; Нотгі В. еї аї., Рнапт. Рез. 6:813, 1989; МатакКауа !. єї а!., У. Рнат. 5сі. 79:505, 1990; Мозпініго І. еї а!., У. СопітоїІєд Реїіеазе 10:195, 1989; Азапо М. еї аї.,.). Сопігоїїєй
Веїеазе 9:111, 1989; Возепбіай .. еї а!., У. СопігоПей Веїєазе 9:195, 1989; Макіпо К., У). СопігоїІєй
Веїєазе 12:235, 1990; Такакига У. еї аї., У. Рнатт. 5сі. 78:117, 1989; ТаКкакига У. єї аї.,»У. Рнагт. осі. 78:219, 1989).
Нещодавно, були створені ліпосоми з підвищеною сироватковою стабільністю і бо підвищеними півперіодами циркуляції (дивіться, наприклад, патентний документ О.5. Раїепі Мо
5741516, то М/ербр). Крім того, були опубліковані огляди різних методів одержання ліпосомних і ліпосомоподібних препаратів, використовуваних як перспективні носії лікарських засобів (дивіться, наприклад, патентні документи 0.5. Райепі Мо 5567434, 10 570оКа; О.5. Раїепі Мо 5552157, о Маді; 0.5. Раїепі Мо 5565213, то МаКатогі; 0.5. Рагепі Мо 5738868, то ЗПіпКагепко; і и.5. Раїепі Мо 5795587, 10 баб).
У випадку трансдермального застосування, МА5Р-2-інгібуючі антитіла і поліпептиди можуть бути об'єднані з іншими придатними інгредієнтами, такими як носії й/або допоміжні речовини.
На властивості таких інших інгредієнтів не накладають яких-небудь обмежень, за винятком того, що вони повинні бути фармацевтично прийнятними для їх передбачуваного введення, і вони не здатні ослабляти дію активних інгредієнтів композиції. Приклади придатних середовищ включають мазі, креми, гелі або суспензії в присутності або за відсутності очищеного колагену.
МА5БР-2-інгібуючими антитілами і поліпептидами, переважно, у рідкій або напіврідкій формі, можуть бути також просочені трансдермальні пластири, наклейки і пов'язки.
Композиції за даним винаходом можуть періодично системно вводитися з визначеними інтервалами для підтримання необхідного рівня терапевтичного ефекту. Наприклад, композиції можуть бути введені шляхом підшкірної ін'єкції, один раз на два або чотири тижні, або з менш частими інтервалами. Режим дозування повинен визначати лікар з урахуванням різних факторів, які можуть впливати на дію комбінації лікарських засобів. Ці фактори можуть включати ступінь прогресування стану, що піддається лікуванню, вік, стать і масу тіла пацієнта, і інші клінічні фактори. Доза для кожного індивідуального лікарського засобу може варіювати залежно від МА5Р-2-інгібуючого засобу, який включений у композицію, а також від наявності і природи носія для доставки лікарського засобу (наприклад, носія для доставки із пролонгованим вивільненням лікарського засобу). Крім того, величина дози може бути скоректована з урахуванням зміни частоти введення і фармакокінетичних властивостей лікарського засобу (лікарських засобів), що доставляється.
МІСЦЕВА ДОСТАВКА
Використовуваний у винаході термін "місцеве" включає в себе застосування лікарського засобу в місці або поблизу місця передбачуваної локалізованої дії, і цей термін може включати, наприклад, місцеву доставку в шкіру або в інші уражені тканини, офтальмічну доставку,
Зо інтратекальне (ІТ), інтрацеребровентрикулярне (ІСМ), інтраартикулярне, внутрішньопорожнинне, інтракраніальне або внутрішньоміхурове введення, внесення або промивання. Місцеве введення може бути переважним у випадках, коли потрібне введення низької дози, запобігання системним побічним ефектам і більш точне регулювання інтервалів доставки доз і концентрації діючих лікарських засобів у місці доставки. Місцеве введення забезпечує створення заданої концентрації в таргетному місці, незалежно від відмінностей між пацієнтами у метаболізмі, кровотоку і так далі. Спосіб прямої доставки також дозволяє краще регулювати дозування.
Місцева доставка МА5Р-2-інгібуючого засобу може бути здійснена в процесі використання хірургічних методів лікування захворювання або стану, наприклад, у процесі проведення таких процедур як артеріальне шунтування, атеректомія, лазерні процедури, ультразвукові процедури, балонна ангіопластика і установлення стента. Наприклад, інгібітор МА5БР-2 може бути введений суб'єкту одночасно з проведенням балонної ангіопластики. Балонна ангіопластика включає введення катетера зі спущеним балоном в артерію. Спущений балон установлюють у безпосередній близькості від атеросклеротичної бляшки і надувають його для того, щоб притиснути бляшку впритул до стінки судини. У результаті, поверхня балона стикається з шаром клітин ендотелію судин на поверхні кровоносної судини. МА5Р-2-інгібуючий засіб може бути прикріплений до катетера балонної ангіопластики таким способом, який забезпечує вивільнення лікарського засобу в місці знаходження атеросклеротичної бляшки.
Лікарський засіб може бути прикріплений до балонного катетера добре відомими стандартними методами. Наприклад, засіб може зберігатися у внутрішньому просторі балонного катетера доти, поки балон не починають надувати, у результаті чого засіб вивільняється в місцеве навколишнє середовище. Як варіант, поверхня балона може бути імпрегнована лікарським засобом, у результаті чого лікарський засіб контактує із клітинами стінки артерії при надуванні балона. Засіб може бути також доставлений в перфорованому балонному катетері, такому, як описаний у публікації Ріидеїтап М.М. еї аї., Сіксціайоп 85:1110-1117, 1992. Дивіться також опублікований патентний документ РСТ Арріїсайоп УМО 95/23161 як приклад прикріплення терапевтичного білка до катетера балонної ангіопластики. Аналогічно, МА5Р-2-інгібуючий засіб може бути введений в гель або полімерне покриття, що наноситься на стент, або може бути введений в матеріал стента, внаслідок чого стент виділяє МАЗБР-2-інгібуючий засіб після 60 установлення в судинах.
МА5Р-2-інгібуючі композиції, застосовувані при лікуванні артритів і інших скелетно-м'язових порушень, можуть бути місцево доставлені шляхом внутрішньосуглобової ін'єкції. Зручно, якщо такі композиції можуть включати носій доставки із пролонгованим вивільненням. Як додатковий приклад випадків, при яких може знадобитися місцева доставка, є випадки, коли МА5БР-2- інгібуючі композиції, застосовувані при лікуванні урогенітальних станів, можуть бути відповідним чином інстильовані в сечовий міхур або усередину іншої урогенітальної структури.
НАНЕСЕННЯ ПОКРИТТІВ НА МЕДИЧНИЙ ПРИСТРІЙ
МА5Р-2-інгібуючі засоби, такі як антитіла і інгібуючі пептиди, можуть бути іммобілізовані на (або усередині) поверхні імплантованого або прикріплюваного медичного пристрою.
Модифікована поверхня звичайно знаходиться в контакті з живою тканиною після імплантації в організм тварини. Під "Іімплантованим або прикріплюваним медичним пристроєм" мається на увазі будь-який пристрій, який імплантують усередину тканини або прикріплюють до тканини організму тварини, при нормальній роботі пристрою (наприклад, стентів і імплантованих пристроїв доставки лікарських засобів). Такі імплантовані або прикріплювані медичні пристрої можуть бути виготовлені, наприклад, з нітроцелюлози, діазоцелюлози, скла, полістиролу, полівінілхлориду, поліпропілену, поліетилену, декстрану, сефарози, агару, крохмалю, нейлону, нержавіючої сталі, титану і біорозкладаних і/або біосумісних полімерів. Зв'язок білка з пристроєм може бути здійснений будь-яким методом, який не порушує біологічної активності зв'язаного білка, наприклад шляхом приєднання одного або обох М-термінальних і сС- термінальних залишків білка до пристрою. Приєднання може бути також здійснене в одній або більше внутрішніх ділянках у білку. Можуть бути також використані множинні приєднання (як внутрішні, так і на кінцях білка). Поверхня імплантованого або прикріплюваного медичного пристрою може бути модифікована з метою введення функціональних груп (наприклад, карбоксильної, амідної, амінної, ефірної, гідроксильної, ціанідної, нітридної, сульфаніламідної, ацетилінової, епоксидної, силанової, ангідридної, сукцинімідної, азидної) для іммобілізації на ній білка. Методи хімічної взаємодії включають, але цим не обмежуючи, утворення похідних складних ефірів, простих ефірів, амідів, азидних і сульфаніламідних похідних, ціанатних і інших зв'язків з функціональними групами, доступними на МА5Р-2 антитілах або інгібуючих пептидах.
МА5Р-2 антитіла або інгібуючі фрагменти можуть бути також нековалентно приєднані шляхом додавання до білка послідовності афінної мітки, такої як 5 (тій О.В. апа доппзоп К.5.,
Сепе, 67:31, 1988), полігістидини (Носпциії Е. еї аї., У. Спготаїйод. 411:77, 1987) або біотин. Такі афінні мітки можуть бути використані для оборотного приєднання білка до пристрою.
Білки можуть бути також ковалентно приєднані до поверхні корпуса пристрою, наприклад шляхом ковалентної активації поверхні медичного пристрою. Як типовий приклад, матриксно- клітинний білок (білки) може бути приєднаний до корпуса пристрою за допомогою будь-якої з наступних пар реакційноздатних груп (при цьому один представник пари присутній на поверхні корпуса пристрою, а другий представник пари присутній на матриксно-клітинному білку (білках)): гідроксильна група/група карбонової кислоти з утворенням ефірного зв'язку; гідроксильна група/ангідридна група з утворенням ефірного зв'язку; гідроксильна група/зоціанатна група з утворенням уретанового зв'язку. Поверхня корпуса пристрою, яка не має придатні реакційноздатні групи, може бути оброблена шляхом травлення плазмою, утворюваною високочастотним розрядом (КЕСО), для утворення реакційноздатних груп для того, щоб зробити можливим відкладення матриксно-клітинного білка (білків) (наприклад, обробкою за допомогою кисневої плазми для введення кисневмісних груп; обробкою за допомогою пропіламінної плазми для введення аміногруп).
МА5Р-2-інгібуючі засоби, що включають молекули нуклеїнової кислот, такі як антисмислові
ВМАЇ- або ДНК-кодуючі пептидні інгібітори, можуть бути поміщені в пористі матриці, приєднані до корпуса пристрою. Типовими пористими матрицями, використовуваними для створення поверхневого шару, є матриці, приготовлені з колагену сухожиль або шкіри, що виробляються і постачаються рядом фірм (наприклад, фірмою Зідта апа СоіМадеп Согрогайіоп), або колагенові матриці, одержані, як описано в патентних документах 0.5. Рагепі МоМо 4394370, 10 УеПегіє5, і 4975527, то Коелика. Один колагеновий матеріал має назву Опгагіре!" М, і він виробляється фірмою Могіап Согр. (Мошипіаїп Міему, Саїїогпіа).
При бажанні, можуть бути також використані конкретні полімерні матриці, які включають полімери акрилового ефіру і полімери молочної кислоти, описані, наприклад, у патентних документах Ш.5. Раїепі МоМо 4526909 і 4563489, то Шгібї. Конкретними прикладами придатних полімерів є полімери ортоефірів, ангідридів, співполімери пропілену з фумаратом або полімер одного або більше мономерів а-гідроксикарбонової кислоти (наприклад, а-гідроксіоцтової кислоти (гліколевої кислоти) і/або а-гідроксипропіонової кислоти (молочної кислоти)). 60 СХЕМИ ЛІКУВАННЯ
При профілактичному застосуванні, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, що має стан, пов'язаний з МАЗР-2-залежною активацією комплементу, або має ризик виникнення стану, пов'язаного з МАЗР-2-залежною активацією комплементу, у кількості, достатній для виключення або зниження ризику розвитку симптомів стану. При терапевтичному застосуванні, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, стосовно якого є підозри в наявності у нього стану, пов'язаного з МА5Р-2-залежною активацією комплементу, або який уже страждає від стану, пов'язаного з МАЗР-2-залежною активацією комплементу, у терапевтично ефективній кількості, достатній для полегшення або щонайменше часткового полегшення симптомів стану. У випадку як профілактичних, так і терапевтичних схем лікування, композиції, що включають МА5Р-2- інгібуючі засоби, можуть вводитися декількома дозами доти, поки у суб'єкта не буде досягнутий відповідний терапевтичний результат. Застосування МА5Р-2-інгібуючих композицій за даним винаходом може бути здійснене шляхом однократного введення композиції або обмеженої кількості послідовних введень для лікування гострого стану, наприклад реперфузійного ушкодження або іншого травматичного ушкодження. Як варіант, композиція може вводитися у визначені періоди часу протягом тривалого періоду для лікування хронічних станів, наприклад артритів або псоріазу.
Способи і композиції за даним винаходом можуть застосовуватися для інгібування запалення і споріднених процесів, які звичайно виникають у результаті діагностичних і терапевтичних лікувальних і хірургічних процедур. Для інгібування таких процесів, МА5Р-2- інгіібуюча композиція за даним винаходом може застосовуватися перипроцедурально.
Використовуваний у винаході термін "перипроцедурально" стосується введення |інгібуючої композиції до процедури й/або під час процедури, й/або після процедури, тобто до процедури, до і під час процедури, до і після процедури, до, під час і після процедури або після процедури.
Перипроцедуральне застосування може здійснюватися шляхом місцевого введення композиції в місце хірургічного втручання або місце проведення процедури, наприклад, шляхом ін'єкції або безперервного, або періодичного промивання місця або шляхом системного введення. Придатні методи для місцевої періопераційної доставки розчинів МА5Р-2-інгібуючого засобу описані в патентних документах О5 Раїепі МоМо 6420432, 10 ЮОеторшиов5, і 6645168, 10 Оеторшо5. Придатні методи для місцевої доставки хондропротекторних композицій, що включають МАБР-2-
Зо інгібуючий засіб (засоби), описані в патентному документі Іпіегпайопа! РСТ Раїепі Арріїсайоп
МО 01/07067 А2. Придатні методи і композиції для таргетної системної доставки хондропротекторних композицій, що включають МАЗБР-2-інгібуючий засіб (засоби), описані в патентному документі Іпіегпайопаї! РСТ Раїепі Арріїсайоп УМО 03/063799 А2.
В одному аспекті винаходу, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, що страждає від тромботичної мікроангіопатії (ТМА) або має ризик розвитку тромботичної мікроангіопатії (ТМА).
В одному варіанті здійснення, ТМА вибирають із групи, що складається з гемолітичного уремічного синдрому (НИ5), тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР) і атипового гемолітичного уремічного синдрому (ан). В одному варіанті здійснення, ТМА являє собою анизв. В одному варіанті здійснення, композицію вводять пацієнту з аниз під час гострої фази захворювання. В одному варіанті здійснення, композицію вводять пацієнту з аниз під час фази ремісії (тобто у суб'єкта, який видужав або частково відновився після нападу гострої фази аниз5, така ремісія підтверджується, наприклад, підвищенням кількості тромбоцитів і/або зниженням концентрацій І ОН у сироватці, наприклад, як це описано в публікації І оігаї С. еї аї.,
Огрпапеї дошигпа! ої Каге Оізеазев, 6:60, 2011, зміст якої включений в даний винахід шляхом посилання на неї. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від ТМА або має ризик розвитку ТМА, яка являє собою (ї) ТМА на фоні раку; (ії) ТМА на фоні хіміотерапії; або (ії) ТМА на фоні трансплантації (наприклад, трансплантації органа, такої як трансплантація нирки або трансплантація алогенних гематопоетичних стовбурових клітин). В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від синдрому Апшо-Шульмана (055) або має ризик розвитку синдрому Апшо-
Шульмана (055). В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від хвороби Дегоса або має ризик розвитку хвороби Дегоса. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САР5) або має ризик розвитку катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САРБ). При терапевтичному застосуванні, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, що страждає від ТМА або має ризик розвитку ТМА, у терапевтично ефективній кількості, достатній для інгібування тромбоутворення, полегшення або щонайменше часткового полегшення симптомів стану.
Як при профілактичних, так і при терапевтичних схемах лікування, композиції, що включають
МАБ5БР-2-інгібуючі засоби, можуть бути введені декількома дозами доти, поки не буде досягнутий відповідний терапевтичний результат у суб'єкта. В одному варіанті здійснення винаходу, МАЗР- 60 2-інгібуючий засіб включає антитіло проти МАБР-2, яке може бути введене відповідним способом дорослому пацієнту (наприклад, дорослому пацієнту з середньою масою тіла 70 кг) у дозі від 0,1 мг до 10000 мг, більш придатно від 1,0 мг до 5000 мг, більш придатно від 10,0 мг до 2000 мг, більш придатно від 10,0 мг до 1000 мг і ще більш придатно від 50,0 мг до 500 мг. У випадку педіатричних пацієнтів, доза може бути скоректована пропорційно масі тіла пацієнта.
Застосування МА5Р-2-інгібуючих композицій за даним винаходом може бути здійснене шляхом однократного введення композиції або обмеженої кількості послідовних введень для лікування
ТМА. Як варіант, композиція може бути введена у визначені періоди часу, раз на добу, два рази на тиждень, один раз на тиждень, раз на два тижні, раз на місяць, два рази на місяць, протягом тривалого періоду часу для лікування ТМА.
У деяких варіантах здійснення, суб'єкт, що страждає від ТМА або має ризик розвитку ТМА, раніше піддавався або піддається на даний момент лікуванню за допомогою інгібітору термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції за винаходом, яка включає інгібітор МА5Р-2, і додаткове введення суб'єкту інгібітору термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою екулізумаб.
В одному аспекті винаходу, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, що має аниз або ж має ризик розвитку аниб, у кількості, достатній для виключення або зниження ризику розвитку симптомів стану. При терапевтичному застосуванні, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, стосовно якого є підозри в наявності у нього анОЗ або який уже страждає від ани»5, у терапевтично ефективній кількості, достатній для полегшення або щонайменше часткового полегшення симптомів стану. В одному аспекті винаходу, перед введенням, суб'єкт може бути підданий обстеженню для визначення наявності у нього прояву одного або більше симптомів анизв, що включають (ії) анемію, (ії) тромбоцитопенію (ії) ниркову недостатність і (ім) підвищення креатиніну, і потім вводять композицію за даним винаходом в ефективній кількості і протягом достатнього періоду часу для полегшення цих симптомів.
В іншому аспекті винаходу, МА5Р-2-інгібуючі композиції за даним винаходом можуть
Зо застосовуватися для профілактичного лікування суб'єкта з підвищеним ризиком розвитку аниз і, внаслідок цього, для зниження ймовірності того, що у суб'єкта може виникнути анНИЗ5.
Спочатку визначають присутність у суб'єкта генетичного маркера, про який відомо, що він асоціюється з ани5, шляхом проведення генетичного скринінг-тесту на зразку, узятому у пацієнта, і ідентифікації присутності щонайменше одного генетичного маркера, асоційованого з аниз, фактора комплементу Н (СЕН), фактора І (СЕ), фактора В (СЕВ), мембранного кофакторного білка СО46, С3, білка, подібного з комплементом фактора Н (СЕНРІ), антикоагулянтного білка тромбодуліну (ТНВО), білка 3, подібного з комплементом фактора Н (СЕНКЗ), або білка 4, подібного з комплементом фактора Н (СЕНКЯ). Потім суб'єкта періодично піддають моніторингу (наприклад, один раз на місяць, один раз на три місяці, два рази на рік або один раз на рік) для визначення присутності або відсутності щонайменше одного симптому анив, такого як анемія, тромбоцитопенія, ниркова недостатність і підвищення креатиніну. Після визначення присутності щонайменше одного із цих симптомів, суб'єкту може бути введена кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, ефективного для інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу, в ефективній кількості і протягом достатнього періоду часу для поліпшення одного або більше зазначених симптомів. У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт із підвищеним ризиком розвитку 28НО5, обумовленим тим, що у нього в процесі проведення скринінгу була виявлена наявність одного з генетичних маркерів, асоційованих з аниб5, може бути підданий моніторингу на виникнення події, пов'язаної з ініціюванням клінічних симптомів ани5, що включає тривалий вплив лікарського засобу, інфекцію (наприклад, бактеріальну інфекцію), злоякісне новоутворення, ушкодження, трансплантацію органа або тканини і вагітність.
У ще одному аспекті даного винаходу, композиція, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого засобу, ефективного для інгібування МА5БР-2-залежної активації комплементу, може бути введена суб'єкту, що страждає від атипового гемолітичного уремічного синдрому (аниз) або має ризик розвитку атипового гемолітичного уремічного синдрому (ани5) на фоні інфекції.
Наприклад, пацієнт, що страждає від некишкового аниз або має ризик розвитку некишкового анизв, пов'язаного з пневмококовою інфекцією, може бути підданий лікуванню за допомогою композицій за даним винаходом.
У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, що страждає від ани5, може бути спочатку 60 підданий лікуванню за допомогою МАБР-2-інгібуючої композиції за даним винаходом, яку вводять через лінію катетера, таку як лінія внутрішньовенного катетера або лінія підшкірного катетера, протягом першого періоду часу, наприклад протягом однієї години, дванадцяти годин, одного дня, двох днів або трьох днів. Потім суб'єкт може бути підданий лікуванню протягом другого періоду часу за допомогою МАБР-2-інгібуючої композиції, що вводиться шляхом регулярних підшкірних ін'єкцій, наприклад ін'єкцій один раз на добу, два рази на тиждень, один раз на тиждень, один раз на два тижні, один раз на місяць або два рази на місяць.
У ще одному аспекті даного винаходу, МА5Р-2-інгібуюча композиція за даним винаходом може бути введена суб'єкту, що страждає від аниз5, без застосування методу плазмаферезу (тобто суб'єкту, у якого симптоми аниз не піддавали лікуванню за допомогою плазмаферезу і не піддають лікуванню за допомогою плазмаферезу в період лікування за допомогою МА5Р-2- інгібуючої композиції), 3 метою запобігання потенційним ускладненням, що виникають при плазмаферезі, включаючи геморагію, інфекцію і схильність до порушень і/або алергії, наявних у донора плазми, або ж суб'єкту, який відмовляється від використання плазмаферезу, або в умовах, коли використання плазмаферезу недоступне.
У ще одному аспекті даного винаходу, МА5Р-2-інгібуюча композиція за даним винаходом може бути введена суб'єкту, що страждає від ани5, одночасно з лікуванням пацієнта методом плазмаферезу. Наприклад, суб'єкту, що піддається лікуванню плазмаферезом, може бути введена МАЗБР-2-інгібуюча композиція після заміщення плазми або при чергуванні із заміщенням плазми.
У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, що страждає від анОЗ або має ризик розвитку анОЗ і піддається на даний момент лікуванню за допомогою МАЗ5Р-2-інгібуючої композиції за даним винаходом, може бути підданий моніторингу шляхом періодичного визначення, наприклад кожні дванадцять годин або один раз на добу, рівня щонайменше одного фактора комплементу, де визначення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу в порівнянні зі стандартним значенням зі здоровим суб'єктом указує на необхідність продовження лікування за допомогою композиції.
Як у випадку профілактичної, так і у випадку терапевтичної схеми лікування, композиції, що включають МА5Р-2-інгібуючі засоби, можуть вводитися декількома дозами доти, поки не буде досягнутий відповідний терапевтичний результат у суб'єкта. В одному варіанті здійснення
Ко) винаходу, МА5Р-2-інгібуючий засіб включає антитіло проти МА5БР-2, яке може бути відповідним способом введене дорослому пацієнту (наприклад, дорослому пацієнту із середньою масою тіла 70 кг) у дозі від 0,1 мг до 10000 мг, більш придатно від 1,0 мг до 5000 мг, більш придатно від 10,0 мг до 2000 мг, більш придатно від 10,0 мг до 1000 мг і ще більш придатно від 50,0 мг до 500 мг. У випадку педіатричних пацієнтів, доза може бути скоректована пропорційно масі тіла пацієнта. Застосування МАЗР-2-інгібуючих композицій за даним винаходом може бути здійснене шляхом однократного введення композиції або шляхом обмеженого числа послідовних введень для лікування анНи5. Як варіант, композиція може бути введена у визначені періоди часу, наприклад один раз на день, один раз на два тижні, один раз на тиждень, кожний другий тиждень, один раз на місяць або два рази на місяць, протягом тривалого періоду часу для лікування аниз.
У деяких варіантах здійснення, суб'єкт, що страждає від аниз, був раніше підданий або піддається на даний момент лікуванню за допомогою інгібітору термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції за винаходом, яка включає інгібітор МА5Р-2, і додаткове введення суб'єкту інгібітору термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою екулізумаб.
В одному аспекті винаходу, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, що має НОЗ або ж має ризик виникнення НИХ, у кількості, достатній для виключення або зниження ризику розвитку симптомів стану. При терапевтичному застосуванні, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, стосовно якого існує підозра про наявність у нього НО або який уже страждає від НО5, у терапевтично ефективній кількості, достатній для полегшення, або щонайменше часткового полегшення, симптомів стану.
В іншому аспекті за даним винаходом, може бути зменшена ймовірність розвитку порушення функції нирок у суб'єкта, що має ризик розвитку НО5, шляхом введення суб'єкту МА5БР-2- інгібуючої композиції за даним винаходом в кількості, ефективній для інгібування МА5Р-2- залежної активації комплементу. Наприклад, суб'єкт, що має ризик розвитку НОЗ і піддається 60 лікуванню за допомогою МА5Р-2-інгібуючої композиції за даним винаходом, може проявляти один або більше симптомів, пов'язаних з НО5, включаючи діарею, рівень гематокриту нижче 3095 з виявленням у мазку внутрішньосудинної деструкції еритроцитів, тромбоцитопенію і підвищення рівнів креатиніну. Як додатковий приклад, суб'єкт, що має ризику розвитку НОЗ і піддається лікуванню за допомогою МА5Р-2-інгібуючої композиції за даним винаходом, може бути інфікований кишковою паличкою, шигелою або сальмонелою. Такі суб'єкти, інфіковані кишковою паличкою, шигелою або сальмонелою, можуть бути піддані лікуванню за допомогою
МАБ5БР-2-інгібуючої композиції за даним винаходом одночасно з лікуванням антибіотиком, або, як варіант, можуть бути піддані лікуванню за допомогою МАБР-2-інгібуючої композиції без одночасного лікування за допомогою антибіотика, зокрема у випадку ентерогенної кишкової палички, для якої лікування антибіотиком протипоказане. Суб'єкт, інфікований ентерогенною кишковою паличкою, який був підданий лікуванню антибіотиком, може мати підвищений ризик розвитку НО і може бути відповідним чином підданий лікуванню за допомогою МАБ5БР-2- інгібуючої композиції за даним винаходом для зниження ступеня ризику. Суб'єкт, інфікований ентерогенною кишковою паличкою, може бути підданий лікуванню протягом першого періоду часу за допомогою МА5Р-2-інгібуючої композиції за даним винаходом за відсутності антибіотика і потім, протягом другого періоду часу, бути підданий лікуванню як за допомогою МАБ5бР-2- інгібуючої композиції за даним винаходом, так і за допомогою антибіотика.
У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, що страждає від НО5, може бути спочатку підданий лікуванню за допомогою МАБР-2-інгібуючої композиції за даним винаходом, яку вводять через лінію катетера, наприклад лінію внутрішньовенного катетера або лінію підшкірного катетера, протягом першого періоду часу, наприклад протягом однієї години, дванадцяти годин, одного дня, двох днів або трьох днів. Потім суб'єкт може бути підданий лікуванню протягом другого періоду часу за допомогою МАЗР-2-інгібуючої композиції, що вводиться шляхом регулярних підшкірних ін'єкцій, наприклад ін'єкцій один раз на день, один раз на два тижні, один раз на тиждень, кожний другий тиждень, один раз на місяць або два рази на місяць.
У ще одному аспекті даного винаходу, МА5Р-2-інгібуюча композиція за даним винаходом може бути введена суб'єкту, що страждає від НО5, без застосування методу плазмаферезу (тобто суб'єкту, у якого симптоми НИЗ не піддавали лікуванню за допомогою плазмаферезу і
Зо якого не піддають лікуванню за допомогою плазмаферезу в період лікування за допомогою
МА5БР-2-інгібуючої композиції), для запобігання виникненню потенційних ускладнень при плазмаферезі, що включають геморагію, інфекцію і схильність до впливу порушень і/або алергії, властивих донору плазми, або ж коли у суб'єкта є протипоказання до використання плазмаферезу, або в умовах, коли плазмаферез недоступний.
У ще одному аспекті даного винаходу, МА5Р-2-інгібуюча композиція за даним винаходом може бути введена суб'єкту, що страждає від НОБ5, одночасно з лікуванням пацієнта методом плазмаферезу. Наприклад, суб'єкту, що піддається лікуванню плазмаферезом, потім може бути введена МА5Р-2-інгібуюча композиція після заміщення плазми або з чергуванням із заміщенням плазми.
У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, що страждає від НОЗ або має ризик розвитку
Низ ії піддається лікуванню за допомогою МА5Р-2-інгібуючої композиції за даним винаходом, може бути підданий моніторингу шляхом періодичного визначення, наприклад кожні дванадцять годин або один раз на день, рівня щонайменше одного фактора комплементу, де визначення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу в порівнянні зі стандартним значенням або зі здоровим суб'єктом указує на необхідність продовження лікування за допомогою композиції.
Як у випадку профілактичної, так і у випадку терапевтичної схеми лікування, композиції, що включають МА5Р-2-інгібуючі засоби, можуть вводитися декількома дозами доти, поки не буде досягнутий відповідний терапевтичний результат у суб'єкта. В одному варіанті здійснення
БО винаходу, МА5Р-2-інгібуючий засіб включає антитіло проти МА5БР-2, яке може бути відповідним способом введене дорослому пацієнту (наприклад, дорослому пацієнту з середньою масою тіла 70 кг) у дозі від 0,1 мг до 10000 мг, більш придатно від 1,0 мг до 5000 мг, більш придатно від 10,0 мг до 2000 мг, більш придатно від 10,0 мг до 1000 мг і ще більш придатно від 50,0 мг до 500 мг. У випадку педіатричних пацієнтів, доза може бути скоректована пропорційно масі тіла пацієнта. Застосування МАЗР-2-інгібуючих композицій за даним винаходом може бути здійснене шляхом однократного введення композиції або шляхом обмеженого числа послідовних введень для лікування НО5. Як варіант, композиція може бути введена у визначені періоди часу, наприклад один раз на день, один раз на два тижні, один раз на тиждень, кожний другий тиждень, один раз на місяць або два рази на місяць, протягом тривалого періоду часу 60 для лікування НИ5Б.
У деяких варіантах здійснення, суб'єкт, що страждає від НО5, був раніше підданий або піддається на даний момент лікуванню за допомогою |інгібітору термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції за винаходом, яка включає інгібітор МА5Р-2, і додаткове введення суб'єкту інгібітору термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою екулізумаб.
В одному аспекті винаходу, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, що має ТТР або ж має ризик виникнення ТТР, у кількості, достатній для виключення або зниження ризику розвитку симптомів стану. При терапевтичному застосуванні, фармацевтичні композиції вводять суб'єкту, стосовно якого існує підозра про наявність у нього ТТР або який уже страждає від ТТР, у терапевтично ефективній кількості, достатній для полегшення, або щонайменше часткового полегшення, симптомів стану.
В іншому аспекті за даним винаходом, суб'єкт, що проявляє один або більше симптомів ТТР, які включають залучення в патологічний процес центральної нервової системи, тромбоцитопенію, важке ураження серця, важке ураження легенів, інфаркт шлунково-кишкового тракту і гангрену, може бути підданий лікуванню за допомогою МА5Р-2-інгібуючої композиції за даним винаходом. В іншому аспекті за даним винаходом, суб'єкт, у якого виявлене пригнічення рівня АЮБАМТ5З13 і у якого проведення тесту на присутність інгібітору (тобто антитіла)
АБАМТ513 також дало позитивний результат, може бути підданий лікуванню за допомогою
МАБ5БР-2-інгібуючої композиції за даним винаходом. У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, у якого проведення тесту на присутність інгібітору АРАМТ513 дало позитивний результат, може бути підданий лікуванню за допомогою імунодепресанту (наприклад, за допомогою кортикостероїдів, ритуксану або циклоспорину) одночасно з лікуванням МА5Р-2- інгібуючою композицією за даним винаходом. У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, у якого виявлене зниження рівня АБАМТ513 і у якого проведення тесту на присутність інгібітору
АБАМТ5З13 дало позитивний результат, може бути підданий лікуванню за допомогою
АБАМТ5З13 одночасно з лікуванням за допомогою МАЗР-2-інгібуючої композиції за даним винаходом.
У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, що страждає від ТТР, може бути спочатку підданий лікуванню за допомогою МАБР-2-інгібуючої композиції за даним винаходом, яку вводять через лінію катетера, наприклад лінію внутрішньовенного катетера або лінію підшкірного катетера, протягом першого періоду часу, наприклад протягом однієї години, дванадцяти годин, одного дня, двох днів або трьох днів. Потім суб'єкт може бути підданий лікуванню протягом другого періоду часу за допомогою МАЗР-2-інгібуючої композиції, що вводиться шляхом регулярних підшкірних ін'єкцій, наприклад ін'єкцій один раз на день, один раз на два тижні, один раз на тиждень, кожний другий тиждень, один раз на місяць або два рази на місяць.
МА5Р-2-інгібуюча композиція за даним винаходом може бути введена суб'єкту, що страждає від ТТР, без застосування методу плазмаферезу (тобто суб'єкту, у якого симптоми ТТР не піддавали лікуванню за допомогою плазмаферезу і якого не піддають лікуванню за допомогою плазмаферезу в період лікування за допомогою МА5Р-2-інгібуючої композиції), для запобігання виникненню потенційних ускладнень при плазмаферезі, що включають геморагію, інфекцію і схильність до впливу порушень і/або алергії, властивих донору плазми, або ж коли у суб'єкта є протипоказання до використання плазмаферезу, або в умовах, коли плазмаферез недоступний.
У ще одному аспекті даного винаходу, МА5Р-2-інгібуюча композиція за даним винаходом може бути введена суб'єкту, що страждає від ТТР, одночасно з лікуванням пацієнта методом плазмаферезу. Наприклад, суб'єкту, що піддається лікуванню плазмаферезом, потім може бути введена МА5Р-2-інгібуюча композиція після заміщення плазми або з чергуванням із заміщенням плазми.
У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, що страждає від рефракторної ТТР, тобто від симптомів ТТР, які не відповідають адекватно на інше лікування, таке як плазмаферез, може бути підданий лікуванню за допомогою МАБР-2-інгібуючої композиції за даним винаходом з застосуванням або без застосування додаткового плазмаферезу.
У ще одному аспекті даного винаходу, суб'єкт, що страждає від ТТР або має ризик розвитку
ТТР ї піддається лікуванню за допомогою МА5Р-2-інгібуючої композиції за даним винаходом, може бути підданий моніторингу шляхом періодичного визначення, наприклад кожні дванадцять 60 годин або один раз на день, рівня щонайменше одного фактора комплементу, де визначення зниженого рівня щонайменше одного фактора комплементу в порівнянні зі стандартним значенням або зі здоровим суб'єктом указує на необхідність продовження лікування за допомогою композиції.
Як у випадку профілактичної, так і у випадку терапевтичної схеми лікування, композиції, що включають МА5Р-2-інгібуючі засоби, можуть вводитися декількома дозами доти, поки не буде досягнутий відповідний терапевтичний результат у суб'єкта. В одному варіанті здійснення винаходу, МА5Р-2-інгібуючий засіб включає антитіло проти МА5БР-2, яке може бути відповідним способом введене дорослому пацієнту (наприклад, дорослому пацієнту із середньою масою тіла 70 кг) у дозі від 0,1 мг до 10000 мг, більш придатно від 1,0 мг до 5000 мг, більш придатно від 10,0 мг до 2000 мг, більш придатно від 10,0 мг до 1000 мг і ще більш придатно від 50,0 мг до 500 мг. У випадку педіатричних пацієнтів, доза може бути скоректована пропорційно масі тіла пацієнта. Застосування МАБР-2-інгібуючих композицій за даним винаходом може бути здійснене шляхом однократного введення композиції або шляхом обмеженого числа послідовних введень для лікування ТТР. Як варіант, композиція може бути введена у визначені періоди часу, наприклад один раз на день, один раз на два тижні, один раз на тиждень, кожний другий тиждень, один раз на місяць або два рази на місяць, протягом тривалого періоду часу для лікування ТТР.
У деяких варіантах здійснення, суб'єкт, що страждає від ТТР, був раніше підданий або піддається на даний момент лікуванню за допомогою інгібітору термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції за винаходом, що включає інгібітор МАБ5Р-2, і додаткове введення суб'єкту інгібітору термінальних компонентів комплементу, який інгібує розщеплення білка С5 комплементу. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою гуманізоване антитіло проти С5 або його антигензв'язувальний фрагмент. У деяких варіантах здійснення, інгібітор термінальних компонентів комплементу являє собою екулізумаб.
МІ. ПРИКЛАДИ
Зо Представлені далі приклади тільки ілюструють пропонований на даний момент найкращий спосіб застосування винаходу на практиці, але їх жодним чином не слід розглядати як обмеження для винаходу. Зміст усіх цитованих літературних джерел наводиться у винаході шляхом посилань на ці джерела.
ПРИКЛАД 1
У цьому прикладі описується генерація штаму дефіцитних по МАБР-2 мишей (МА5Р-2-/-), але достатніх по МАр19 (МАр19-/ч).
Матеріали і методи
Конструювали таргетуючий вектор РКО МТКМ 1901 для руйнування трьох екзонів, що кодують С-термінальний кінець мишачої МАБР-2, у тому числі екзон, який кодує домен серинпротеази, показаний на фігурі 3. РКО МТКМ 1901 використовували для трансфекції мишачих ембріональних стовбурових (Е5) клітин лінії Е14.1а (5М129 ОІа). Вибирали клони, стійкі до неоміцину і чутливі до тимідинкінази. Піддавали 600 клонів ЕЗ скринінгу, і з них ідентифікували і верифікували чотири різні клони методом саузерн-блотингу, що містять бажане селективне таргетування і явище рекомбінації, як показано на фігурі 3. Із цих чотирьох позитивних клонів генерували химери методом трансплантації ембріона. Потім химери піддавали поворотному схрещуванню в генетичному оточенні С57/ВІб зі створенням трансгенних самців. Потім трансгенних самців схрещували із самками для генерації Е15 з 50 Фо потомства, що проявляє гетерозиготність по зруйнованому гену МА5Р-2. Гетерозиготних мишей піддавали взаємному схрещуванню з генеруванням гомозиготного дефіцитного по МА5Р-2 потомства, одержуючи в результаті гетерозиготних і немутантних мишей, при співвідношенні 1:2:1, відповідно.
Результати і фенотип. Було виявлено, що одержані гомозиготні дефіцитні по МАБР-2-/- миші є життєздатними і фертильними, і їх піддавали перевірці на дефіцитність по МАБР-2 методом саузерн-блотингу для підтвердження коректної таргетуючої події, методом нозерн-блотингу для підтвердження відсутності мРНК МАБР-2 і методом вестерн-блотингу для підтвердження відсутності білка МАБР-2 (дані не показані). Потім підтверджували присутність МРНК Март9 і відсутність МРНК МА5Р-2 методом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією (ВТ-РСЕК) у масштабі реального часу, використовуючи прилад І ідніСусіег. Як і очікувалося,
МА5БР-2-/- миші дійсно продовжували експресувати МАр19, МА5Р-1 і мРНК і білок МА5Р-3 (дані бо не показані). Оцінювали присутність і надлишок у МАБР-2-/- мишей мРНК для пропердину,
фактора В, фактора 0, С4, С2, і СЗ методом аналізу І ідпіСусіег, і було виявлено, що ці дані ідентичні з тими, які одержують у випадку контрольних одноприплідних немутантних мишей (дані не показані). Плазма гомозиготних МА5Р-2-/- мишей характеризується повним дефіцитом активації комплементу, опосередкованої лектиновим шляхом, як це описано далі в прикладі 2.
Генерація штаму МА5Р-2-/- в чистому генетичному оточенні С57/ВІ 6
МАБ5БР-2-/- мишей піддавали зворотному схрещуванню із чистою лінією С57ВІ 6 протягом дев'яти поколінь, перед тим як використовувати штам МА5Р-2-/- як експериментальну модель на тварині.
Штам трансгенних мишей, який являє собою мишачу МА5Р-2-/-, МАр19--/- і який експресує трансген людської МАБР-2 (мишачої МА5БР-2 нокаутної і людської МАБР-2 нокаутної) також генерували наступним чином.
Матеріали і методи
Конструювали міні-ен, що кодує людську МА5БР-2, називаний "мінійМА5БР-2" (5ЕО І
МО:49), показаний на фігурі 4, який включає промоторну область гена людської МА5БР-2, у тому числі перших З екзони (екзон 1 - екзон 3), за якою іде КДНК-послідовність, яка представляє кодуючу послідовність наступних 8 екзонів, внаслідок чого кодується повнорозмірний білок
МАБР-2 під впливом його ендогенного промотору. Конструкцію міні-пмМАБР-2 ін'єктували в запліднені яйцеклітини МАБР-2-/- мишей для того, щоб замінити дефіцитний ген мишачої
МА5БР-2 на трансгенно експресовану людську МАЗР-2.
ПРИКЛАД 2
У цьому прикладі продемонстровано, що для активації комплементу по лектиновому шляху потрібна МА5Р-2.
Методи і матеріали
Дослідження специфічного розщеплення С4 при лектиновому шляху активації комплементу
Дослідження розщеплення С4 було описане в публікації Реїегзеп еї аї. У. Іттипої. МеїйоаФв, 257:107 (2001), у якому вимірювали активацію лектинового шляху, обумовлену ліпотейхоєвою кислотою (СТА) із золотистого стафілокока, яка зв'язує І-фіколін. Дослідження, описане в публікації Реїегзхеп еї аї. (2001), адаптували для вимірювання активація лектинового шляху за допомогою МВІ. шляхом нанесення покриття на планшет з ЛПС і манану або зимозану перед додаванням сироватки МАБР-2-/- мишей, як описано нижче. Дослідження було також модифіковане з метою виключення можливості розщеплення С4 по класичному шляху. Це досягалося шляхом використання буфера для розведення зразка, що містить 1М Масі, який дозволяє високоафінне зв'язування компонентів розпізнавання лектинового шляху з їх лігандами, але запобігає активації ендогенного С4, тим самим виключаючи участь класичного шляху в результаті дисоціації комплексу С1. Описуючи коротко, у модифікованому дослідженні, зразки сироватки (розведені в буфері з високим вмістом солі (1М МасіЇ)) додають у планшети з нанесеним шаром ліганду, потім додають постійну кількість очищеного С4 у буфері з фізіологічною концентрацією солі. Зв'язані комплекси розпізнавання, що містять МА5БР-2, розщеплюють С4, що приводить до відкладення С4р.
Методи дослідження 1) У титраційні мікропланшети Мипс Махізогр (Махібого, Мипс, Мо за каталогом 442404,
Еі5пег бсієепійіс) наносили шар 1 мкг/мл манану (М7504 Зідта) або будь-якого іншого ліганду (наприклад, такого як ліганди, перераховані нижче), розведеного в покривному буфері (15 мМ
МагСО», 35 мМ МанНсо»з, рН 9,6).
У дослідженні були використані наступні реагенти: а) манан (1 мкг на ямку манану (М7504 5ідіта) в 100 мкл покривного буфера); р) зимозан (1 мкг на ямку зимозану (Зідта) в 100 мкл покривного буфера); с) ліпотейхоєва кислота (І ТА) (1 мкг на ямку в 100 мкл покривного буфера або 2 мкг на ямку в 20 мкл метанолу); а) 1 мкг Н-фіколін специфічного Маб 4Н5 у покривному буфері; е) РБА з аерококів виду Аегососсизх мігідап5 (2 мкг на ямку в 100 мкл покривного буфера); 7 100 мкл на ямку зафіксованого у формаліні золотистого стафілокока 0Ю5М20233 (ОО55о-0,5) у покривному буфері. 2) Планшети піддали інкубації протягом ночі при 4 2С. 3) Після інкубації протягом ночі, насичували залишкові ділянки зв'язування білків шляхом інкубації планшетів з 0,1 95 НБА-ТВ5 блокувальним буфером (0,1 95 (маса на одиниці об'єму)
Н5А в 10 мМ Тті5-СІ, 140 мМ Масі, 1,5 мМ МаМз», рН 7,4) протягом 1-3 годин, промиваючи потім планшети З рази за допомогою ТВ5Лугееп/Сає: (ТВ5 з 0,05 95 Тмеєеп 20 і 5 мМ Сасіг, 1 мМ
Масіг, рН 74). бо 4) Зразки сироватки, які піддають тестуванню, розбавляли в МВІ. зв'язувальному буфері (1 М масі), і розведені зразки додавали в планшети і інкубували протягом ночі при 4 2С. Ямки, у які додавали тільки буфер, використовували як негативний контроль. 5) Після інкубації протягом ночі при 4 "С, планшети три рази промивали за допомогою
ТВБ5лмееп/Сагє:. Потім у планшети додавали людський С4 (100 мкл/ямку 1 мкг/мл, розведеного в ВВ5 (4 мМ барбітал, 145 мм Масі, 2 мМ Сасбсі», 1 мМ Масі», рН 7.,4)) і інкубували протягом 90 хвилин при 37 "С. Планшети знову промивали З рази за допомогою ТВ5Луееп/Саг», 6) Відкладення С4р виявляли за допомогою кон'югованого з лужною фосфатазою курячого антитіла проти людського С4с (розведеного 1:1000 в ТВв5Лугееп/Са?"), яке додавали в планшети і інкубували протягом 90 хвилин при кімнатній температурі. Потім планшети знову три рази промили за допомогою ТВ5Лмееп/Саг, 7) Лужну фосфатазу визначали шляхом додавання 100 мкл субстратного розчину п- нітрофенілфосфату, інкубуючи при кімнатній температурі протягом 20 хвилин і зчитуючи ОЮгло5 на спектрофотометрі для зчитування титраційних мікропланшетів.
Результати
На фігурах 5А-В показана кількість відкладення С46 на манані (фігура 5А) і зимозані (фігура 58) у розведеннях сироватки крові МАБР-2-/- (хрестики), МА5Р-2-/- (затушовані кружки) і
МАБР-2-/- (затушовані трикутники) мишей. На фігурі 5С показана відносна активність С4- конвертази на планшетах з нанесеним шаром зимозану (білі стовпчики) або манану (заштриховані стовпчики) МАБР-2-/- мишей (п-5) і МАБР-2-/- мишей (п-4) відносно немутантних мишей (п-5), одержана шляхом вимірювання кількості відкладення Са4б, нормалізованого до сироватки мишей немутантного типу. Стовпчики погрішностей представляють стандартне відхилення. Як показано на фігурах 5БА-С, плазма МАБР-2-/- мишей є абсолютно дефіцитною по активації комплементу, опосередкованої лектиновим шляхом, на планшетах з нанесеним шаром манану і зимозану. Ці результати однозначно показують, що
МА5БР-2 є ефекторним компонентом лектинового шляху.
Рекомбінантне МА5Р-2 відновлює залежну від лектинового шляху активацію С4 у сироватці крові МАБР-2-/- мишей
Для того, щоб установити, що відсутність МАЗР-2 була безпосередньою причиною зниження залежної від лектинового шляху активації С4 у МАБР-2-/- мишей, вивчали ефект додавання
Зо рекомбінантного білка МА5Р-2 у зразки сироватки в описаному вище дослідженні розщеплення
С4. Продукували і очищали функціонально активні рекомбінантні білюи мишачої МАБ5Р-2 і каталітично неактивної мишачої МАБР-2А (де активний сайт залишку серину в домені серинпротеази був заміщений залишком аланіну), як описано в прикладі 3. Змішану сироватку чотирьох МА5Р-2-/- мишей інкубували зі зростаючими концентраціями рекомбінантного білка мишачої МА5БР-2 або неактивної мишачої МА5Р-2А, і визначали активність С4-конвертази, як описано вище.
Результати
Як показано на фігурі 6, додавання функціонально активного рекомбінантного білка мишачої
МАБР-2 (показано незатушованими трикутниками) до сироватки МАБР-2-/- мишей відновлювало залежну від лектинового шляху активацію С4 залежно від концентрації білка, у той час як білок каталітично неактивної мишачої МА5Р-2А (показано зірочками) не відновлював активацію С4. Результати, показані на фігурі 6, нормалізовані до активації С4, спостережуваної в змішаній сироватці немутантних мишей (показано пунктирною лінією).
ПРИКЛАД З
У цьому прикладі описується рекомбінантна експресія і продукування білка рекомбінантної повнорозмірної людської, щурячої і мишачої МАБР-2, поліпептидів, одержаних з МА5Р-2, і каталітично інактивованих мутантних форм МА5Р-2.
Експресія повнорозмірної людської, щурячої і мишачої МАБР-2
Повнорозмірну послідовність КДНК людської МА5Р-2 (ЗЕО ІЮО МО:4) також субклонували в експресуючий вектор рСІ-Мео ссавців (Рготеда), який керує еукаріотичною експресією під контролем СММ енхансерної/промоторної області (як описано в публікаціях Кашйтап К..). еї аї.,
Мисівїс Асіа5 Незеагсі, 19:4485-90, 1991; Каштап, Меїштоавз іп Епгутоїіоду, 185:531-66 (1991)).
Повнорозмірну мишачу кКДНК (5ЕО ІЮО МО:50) і щурячу КДНК МАБР-2 (5ЕО ІО МО:53), кожну, субклонували в експресуючий вектор рЕЮ. Експресуючі вектори МА5Р-2 потім трансфікували в лінію адгезивних клітин ЮХВІ яєчників китайського хом'ячка, використовуючи стандартний метод трансфекції з фосфатом кальцію, описаний у публікації Мапіайі5 еї аїЇ., 1989. Клітини, трансфіковані за допомогою таких конструкцій, росли дуже повільно, що пояснюється цитотоксичністю кодованої протеази.
При іншому підході, конструкцію міні-гена (5ЕО ІЮ МО:49), що містить людську КДНК МА5Р- бо 2, керовану її ендогенним промотором, транзієнтно трансфікують у клітини яєчників китайського хом'ячка (СНО). Білок людської МА5Р-2 секретують у культуральному середовищі і виділяють, як описано нижче.
Експресія повнорозмірної каталітично неактивної МАЗР-2
Актуальність
МА5БР-2 активується шляхом аутокаталітичного розщеплення після того, як субкомпоненти розпізнавання МВІ або фіколіни (або І-фіколін, Н-фіколін або М-фіколін) зв'язуються з їх відповідним вуглеводним патерном. Аутокаталітичне розщеплення, викликане активацією
МАБ5Р-2, часто відбувається під час процедури виділення МА5бР-2 із сироватки або під час очищення після рекомбінантної експресії. Для того, щоб одержати більш стабільний препарат білка, використовуваного як антиген, створювали каталітично неактивну форму МАЗР-2, конструктивно виконану у вигляді МА5Р-2А, шляхом заміщення залишку серину, який присутній у каталітичній тріаді домену протеази, на залишок аланіну у щурів (ЗЕО ІЮ МО:55 бег617 на
АІіаб17), у мишей (5ЕО І МО:52 Зегб17 на АІаб17) або у людини (ЗЕО ІЮ МО:З3 Зегб18 на
Ааб18).
Для генерування каталітично неактивних білків людської і мишачої МА5Р-2А, проводили сайт-спрямований мутагенез, використовуючи олігонуклеотиди, представлені в таблиці 5.
Олігонуклеотиди в таблиці 5 були призначені для з'єднання з ділянкою людської і мишачої
КДНК, кодуючої ферментативно активний серин, і олігонуклеотиди містили порушення комплементарності для того, щоб перетворити кодон серину в кодон аланіну. Наприклад, використовували полімеразну ланцюгову реакцію (РСК) олігонуклеотидів 5Е0 ІЮ МО5:56-59 у комбінації із КДНК людської МАЗР-2 (5ЕО ІО МО:4) для ампліфікації ділянки від ініціюючого кодону до ферментативно активного серину і від серину до термінуючого кодону з метою генерування повного відкритого зчитування з мутованої МА5Р-2А, що містить мутацію Зегб18 в
АІаб18. Після електрофорезу в агарозному гелі, продукти РСК очищали, і генерували препарат диска хромосом і одиничні аденозинові перекриття, використовуючи стандартний метод нарощування. Потім одержану з аденозином на кінці МАБР-2А клонували в простий вектор раєМ-Т, трансформований у кишкову паличку.
Генерували білок каталітично неактивної щурячої МАБР-2А шляхом кіназування і ренатурування ЗЕО ІЮ МО:64 і ЗЕО ІЮ МО:65, проводячи об'єднання цих двох олігонуклеотидів
Зо у рівних молярних кількостях, нагрівання при температурі 100 С протягом 2 хвилин і повільне охолодження до кімнатної температури. Одержаний у результаті ренатурування фрагмент містив сумісні з РИ ії Хваї кінці, і його вставляли замість РЕИ-Хра!ї фрагмента КкКДНК МА5Р-2 немутантного щура (ЗЕО ІЮ МО:53) з одержанням щурячої МА5Р-2А. в-алдсстаАдСа,асАаа,аавАасайСАТТАСТаТттт-3 (5ЕО І МО:64);
Б-СТАБАААСАСТААТОССССТОоСтТасСсатСАССТОСТОасА-З (5ЕО ІЮ МО:65).
Людську, мишачу і щурячу МАБР-2А, далі кожну, субклонували в експресуючі вектори ссавців РЕО або ресіІ-Мео і трансфікували в лінії клітин ЮОХВІ яєчників китайських хом'ячків, як описано нижче.
При іншому підході, конструювали каталітично неактивну форму МАБР-2, використовуючи метод, описаний у публікації Спеп еї аї., 9. Віої. Спет., 276(28);25894-25902, 2001. Коротко, плазміду, що містить повноланцюжкову людську КДНК МА5Р-2 (описану в публікації Тієї еї аї.
Маїштге, 386:506, 1997), розрізали рестриктазами Хпої1 і ЕсоК!, і кКДНК МА5БР-2 (описана у винаході як 5ЕО І МО:4) клонували у відповідні сайти рестрикції бакуловірусного трансферного вектора рЕазіВаа (Сіте ТесппоЇодіе5, МУ). Активний сайт МА5Р-2 серинпротеази в зегб18 потім заміняли на АіІаб18 шляхом заміни дволанцюжкових олігонуклеотидів, кодуючих область пептиду від 610 по 625 амінокислоти (5ЕО ІЮ МО:13), на природну ділянку від 610 по 625 амінокислоти, з метою створення повнорозмірного поліпептиду МА5БР-2 з неактивним протеазним доменом.
Конструювання експресуючих плазмід, що містять поліпептидні області, утворені з людської
МАБР-2
Для секретування різних доменів МАБР-2, продукуються наступні конструкції, використовуючи сигнальний пептид МАБР-2 (залишки 1-15 послідовності ЗЕО ІЮО МО:5).
Конструкцію, експресуючу домен СОВІ людської МАБР-2 (ЗЕО ІО МО:8), одержують методом
РСВ-ампліфікації області, кодуючої залишки 1-121 МАБР-2 (5ЕО ІЮ МО:6) (що відповідає М- термінальному домену СИВІ). Конструкцію, експресуючу домен СОВІЄСОЕ людської МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:9), одержують методом РСК-ампліфікації області, кодуючої залишки 1-166 МА5Р-2 (ЗЕБЕО ІЮ МО:6) (що відповідає М-термінальному домену СОВІЕСЕ). Конструкцію, експресуючу домен СОВІЕСЕСИиВІЇ людської МАБР-2 (ЗЕО ІО МО:10), одержують методом РСК-ампліфікації області, кодуючої залишки 1-293 МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:6) (що відповідає М-термінальному бо домену СОВІЕСЕСИВІЇ). Згадані вище домени ампліфікують методом РСК, використовуючи
Мепік полімерази і рВр5-МА5Р-2 як темплат, відповідно до загальноприйнятих методів РСЕ.
Послідовність праймера 5' смислового праймера (5-СсСЧСаАТОСАТОАаСОаСсТастаАСССтТО-3"
ЗБО ІЮ МО:34) вводить Ватні сайт рестрикції (підкреслений) на кінці 5 продукту РОК.
Антисмислові праймери для кожного домену МАБР-2, наведені нижче в таблиці 5, сконструйовані для введення термінуючого кодону (виділений напівжирним шрифтом), після сайта ЕсокКІ (підкреслений) на кінці кожного продукту РОК. Після ампліфікації, фрагменти ДНК розрізають рестриктазами Ватні і ЕсоКІ і клонують у відповідні сайти вектора рЕазіВас!1.
Одержані конструкції характеризують рестрикційним картуванням і підтверджують шляхом секвенування 850МА.
Таблиця 5
Праймери тазхр-2 для рог
Домен МА5Р-2 5'-праймер для РСК З3З'і-праймер для РСК
ЗЕО ІЮ МО:8 в'-
СиВІ (аа 17121 СОССАТССАТСАСССТОСТОАССС 5-СБААТТОСТАВОСТОСАТА З (ЗЕО І послідовності ТО-3(8ЕО 10 МО:34) МО:З35)
ЗЕО ІЮ МО:6 І
ЗЕО І МО:9
СОВІЕСЕ (аа (|5- ' ' 1-166 ССССАТССАТОАСОСТОСТОАССС Мо (ЗБ о послідовності |Т0-3' (5ЕО ІЮ МО:34) І
ЗЕО ІЮ МО:6
ЗЕО ІЮ МО:10
СОВІЕСЕСИВІ 5'- ' ' (аа 1-293 СООСАТССАТСАСОСТОСТСАССС Мо (ЗО о послідовності |Т0-3' (5ЕО ІЮ МО:34) І
ЗЕО ІЮ МО:6 " 5- '
ЗЕО І МО4 АТСАСОСТОСТСАСССТССТОСОС 5-ТТААААТСАСТААТТАТОТТСТОСАТО- людська СТТО-3'(5ЕО 10 МО:5Б) З'ЇЗЕО ІЮ МО:59) Й
МАБР-2 ИМАБР-2 прямий ПМАБ5БР-2 зворотний . 5- ' '
ЗЕО І МО4 | САСАССТОАСОСАССАСОСССАС- 5"тесоостостасатсАССТоТО З
КДНК людської 3 (ЗЕО ІО МО:58) (ЗЕО ІЮ МО:57)
МАБР-2 ИМАБР-2 діа прямий ПМАБ5БР-2 Аа зворотний . ' ' 5-
ЗЕО І МО:50 5"АТОАСОСТАСТСАТСТТОСТОаС-З ТТАСАААТТАСТТАТТАТСТТСТСААТСС-
КДНК мишачої /|(5ЕО 10 МО:60) ' ,
МАБР-2 тМАБР-2. прямий З (5ЕО 1 МО:63) - тптМАБР-2 зворотний
ЗЕО І МО:50 СССССССТОеССтТСАССТСТОСАС-З 5 СстоСАСАОСТОАСОСАОСООвОС З
КДНК мишачої (50 10 МО:62) (ЗЕО ІЮ МО:61)
МАБР-2 ТМАР-2 Да прямий тпМАБР-2 Аа зворотний
Еукаріотична експресія рекомбінантної МАБР-2 і одержання білків ферментативно неактивної мишачої, щурячої і людської МАЗР-2А
Описані вище експресуючі конструкції МАБР-2 і МАЗР-2А трансфікували в клітини ОХВІ1, використовуючи стандартний метод трансфекції з фосфатом кальцію (Мапіаїйіз еї а!., 1989).
МА5БР-2А одержували в культуральному середовищі, що не містить сироватку, щоб виключити забруднення препаратів іншими сироватковими білками. Кожний другий день збирали культуральне середовище від конфлюентних клітин (сумарно чотири рази). Рівень рекомбінантної МАБР-2А становив у середньому 1,5 мг/літр культурального середовища для кожного із трьох видів.
Очищення білка МА5Р-2А
МА5БР-2А (описану вище мутантну форму Зег-АІа) очищали методом афінної хроматографії на колонках з МВР-А-агарозою. Цей підхід дозволяв проводити швидке очищення без використання сторонніх маркерів. МАБР-2А (100-200 мл культурального середовища, розведеного рівним об'ємом завантажувального буфера (50 ммоль Тгтгів5-СІ, рН 7,5, з вмістом 150 ммоль Масі ї 25 ммоль Сасіг) завантажували в колонку для афінної хроматографії на МВР- агарозі (4 мл), попередньо приведену в рівновагу з 10 мл завантажувального буфера. Після промивання за допомогою додаткових 10 мл завантажувального буфера, білок елюювали у фракції об'ємом 1 мл за допомогою 50 ммоль Ттгіб5-СІ, рН 7,5, що містить 1,25 моль Масі ії 10 ммоль ЕЮОТА. Фракції, що містять МАБР-2А, ідентифікували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію. При необхідності, МАБР-2А додатково очищали методом іонообмінної хроматографії на колонці Мопос (НЕК 5/5). Білок діалізували за допомогою 50 ммоль Тгі5-СІ, рН 7,5, що містить 50 ммоль Масі, і завантажували в колонку, приведену в рівновагу з тим же буфером. Після промивання, зв'язану МАБР-2А елюювали за допомогою розчину із градієнтом 0,05-1 Масі в 10 мл.
Результати
Вихід білка МАБР-2А становив 0,25-0,5 мг на 200 мл культурального середовища.
Молекулярна маса, визначувана методом мас-спектрометрії з матрично-активованою лазерною десорбцією/онізацією (МАГОІ М5), становила величину 77,5 кДа, що більше, ніж розрахункова величина для немодифікованого поліпептиду (73,5 кДа), що обумовлено глікозилуванням.
Спостережуване збільшення маси пояснюється приєднанням гліканів до кожного із сайтів М- глікозилування. МАБР-2А мігрує у формі одиночної смуги в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію, що свідчить про те, що в процесі біосинтезу вона не піддається протеолітичному розкладанню. Середньовагова молекулярна маса, визначена методом рівноважного ультрацентрифугування, узгоджується з розрахунковим значенням для гомодимерів глікозилованого поліпептиду.
ПРОДУКУВАННЯ ПОЛІПЕПТИДІВ РЕКОМБІНАНТНОЇ ЛЮДСЬКОЇ МАБР-2
Інший спосіб продукування поліпептидів з рекомбінантних МАБР-2 і МАЗР-2А, описаний у публікації Тпієїеп5 М.М. еї аїЇ., У. Іттипої. 166:5068-5077, 2001. Коротко, клітини комахи зроаорієга Ігидірегда (клітини Кеаду-Ріадие 519, одержані від фірми Момадеп, Мадізоп, УМІ) вирощують і зберігають у безсироватковому культуральному середовищі 590О01Ї (І їїте
Тесппоїодіе5), доповненому 50 МО/мл пеніциліну і 50 мг/мл стрептоміцину (Ге Тесппоїіодіев).
Клітини комахи Тгіспоріибхіа пі (Нідпй Рїме), надані дайміда СпгорослекК, Іпбійші де Віоіодіе
Бігисіигаіє, Сгепоріє, Егапсе, зберігають у культуральному середовищі ТС100 (І іїе
Зо Тесппоодієв), що містить 10 95 ЕС5 (Оотіпідое Юшїзспег, Вгитайй, Егапсе), доповненому 50
МО/мл пеніциліну і 50 мг/мл стрептоміцину. Рекомбінантні бакуловіруси генерують, використовуючи систему Вас-о-Вас (Пе ТесппоІодіе5) Бакмідну ДНК очищають, використовуючи систему для мідіпрепаративного очищення Оіадеп (Оіадеп), і застосовують для трансфекції клітин комах 519 при використанні селфектину в культуральному середовищі 51900
ПІ ЗЕМ (їїе Тесппоіодіе5), як описано в протоколі фірми-виробника. Рекомбінантні вірусні частинки збирають через 4 дні, титрують за допомогою вірусологічного тесту на бляшкоутворення і ампліфікують, як описано в керівництві Кіпд апі Роб5еє, Те Васиоміги5
Ехргезвіоп бЗувієт: А І арогаюгу Сціде, Спартап апа Наї! І ю)., І опадоп, рр.111-114, 1992.
Клітини Нідп Рїме (1,75х107 клітин у колбі об'ємом 175 см для вирощування тканинних культур) інфікували рекомбінантними вірусами, що містять поліпептиди МАБР-2, при множинності зараження 2 у середовищі 51900 ІЇ БЕМ при 28 "С протягом 96 годин. Надосадові рідини центрифугували і додавали діїззопропілфосфорофлуоридат до кінцевої концентрації 1 ммоль.
Поліпептиди МАБР-2 секретують у культуральне середовище. Культуральні надосадові рідини піддають діалізу проти 50 ммоль МасСіІ, 1 ммоль СасСі», 50 ммоль гідрохлориду триетаноламіну, при рн 8,1, і завантажують при витраті 1,5 мл/хв. у колонку з швидкопроточною
О-сефарозою (Атеге5пат РПагтасіа Віоїесп) (2,8х12 см), приведену в рівновагу з тим же буфером. Елюювання проводять за допомогою 1,2 літра цього ж буфера з лінійним градієнтом до 350 ммоль Масі. Фракції, що містять рекомбінантні поліпептиди МА5бР-2, ідентифікують
БО методом вестерн-блотингу, осаджують шляхом додавання (МН4і)2505 до 60 95 (маса до об'єму), і витримують протягом ночі при 4 "С. Осади ресуспендують в 145 ммоль Масі, 1 ммоль Сасі», 50 ммоль гідрохлориду триетаноламіну, при рН 7,4, і наносять на колонку Т5К 53000 5УУОС (7,5х600 мм) (Тозопааз, Мопідотегуміе, РА), приведену в рівновагу з тим же буфером. Потім очищені поліпептиди концентрують до 0,3 мг/мл методом ультрафільтрації в мікроконцентраторах Місгозер (відрізувана молекулярна маса-10000) (Рійгоп, Кагівіеїп,
Сетптапу).
ПРИКЛАД 4
У цьому прикладі описується спосіб продукування поліклонального антитіла проти поліпептидів МА5Р-2. 60 Матеріали і методи
Антигени МА5Р-2
Поліклональну антисироватку проти людської МАБР-2 продукують шляхом імунізації кроликів за допомогою наступних виділених поліпептидів МА5БР-2: виділена із сироватки людська МА5Р-2 (ЗЕО ІО МО:6), рекомбінантна людська МАБР-2 (ЗЕО ІЮ МО:б6), МАБР-2А, що містить домен неактивної протеази (ЗЕО ІЮО МО:13), описана в прикладі 3, і рекомбінантні СОВІ (ЗЕО Ір МО:8), СОВЕСРІ (5ЕО ІЮ МО:9) і СОВЕСЕСИОВІЇ (ЗЕО ІЮ МО:10), експресовані, як описано вище в прикладі 3.
Поліклональні антитіла. Кроликів у віці шести тижнів, що одержали первинну вакцинацію за допомогою бацили Кальметта-Герена (ВСС), імунізують шляхом ін'єкції 100 мкг поліпептиду
МАБР-2 в 100 мкг/мл стерильного фізіологічного розчину. Ін'єкції здійснюють кожні 4 тижні з моніторингом титру антитіл методом ЕГІЗА (методом твердофазного імуноферментного аналізу), як описано в прикладі 7. Збирають культуральні надосадові рідини для очищення антитіл методом афінної хроматографії на основі зв'язування з білком А.
ПРИКЛАД 5
У цьому прикладі описується спосіб продукування мишачих моноклональних антитіл проти поліпептидів щурячої або людської МА5Р-2.
Матеріали і методи
Самцям мишей лінії А/У (Нагіап, Ноивіоп, Тех.) у віці 8-12 тижнів підшкірно ін'єктують 100 мкг поліпептидів людських або щурячих гГМАЗР-2 або "МА5Р-2А (одержаних, як описано в прикладі 3) у повному ад'юванті Фрейнда Оіїсо І арогафогіе5, Юеїгоїй, Місп.) в 200 мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5) з рН 7,4. Із двотижневими інтервалами мишам двічі підшкірно ін'єктгують 50 мкг поліпептиду людської або щурячої "г«МА5Р-2 або пМАЗР-2А у неповному ад'юванті Фрейнда. На четвертому тижні, мишам ін'єктують 50 мкг поліпептиду людської або щурячої гМА5Р-2 або гМА5Р-2А в РВЗ5 і через 4 дні мишей об'єднують.
Для кожного випадку об'єднання, приготовляють суспензії окремих клітин із селезінки імунізованої миші і використовують для об'єднання із клітинами мієломи 5р2/0. 5х108 клітин
Зрг/0 і 5х108 клітин селезінки об'єднують у середовищі, що містить 50 95 поліетиленгліколю (молекулярна маса 1450) (Кодак, Коспевзіег, М.М.) ії 5 96 диметилсульфоксиду (Зідта Спетісаї
Со., БІ. І оці5, Мо.). Потім концентрацію клітин коректують до 1,5х105 клітин селезінки в 200 мкл
Зо суспензії в середовищі Іскова (сірсо, Сгапа Ізіапа, М.М.), доповненому 10 95 фетальною сироваткою, 100 одиниць/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 0,1 ммоль гіпоксантину, 0,4 мкмоль аміноптерину і 16 мкмоль тимідину. Двісті мікролітрів клітинної суспензії додають у кожну ямку із приблизно двадцяти ямок 96-ямкових планшетів для мікрокультур. Приблизно через десять днів, відбирають надосадові культуральні рідини для скринінгу на предмет їх реакційної здатності до взаємодії з очищеним фактором МА5БР-2 методом аналізу ЕГІЗА.
Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА)О. У ямки планшетів для мікроаналізу
Іттітипої 2 (Оупаїесії І арогагіе5, Спапійу, Ма.) наносять покриття шляхом додавання 50 мкл очищеної ПМАБР-2 з концентрацією 50 нг/мл або щурячої ГМАБбР-2 (або гМА5Р-2А) протягом ночі при кімнатній температурі. Низька концентрація МА5Р-2 для нанесення покриття дозволяє відбирати високоафінні антитіла. Після нанесення покриття, видаляють розчин шляхом струшування планшета, і додають у кожну ямку протягом однієї години 200 мкл препарату
ВГОТТО (знежирене сухе молоко) в РВ5 для блокування неспецифічних сайтів. Через годину, ямки промивають буфером РВ5Т (РВ5 з вмістом 0,05 95 Тмеєп 20). Відбирають п'ятдесят мікролітрів культуральних надосадових рідин з кожної ямки об'єднання і змішують із 50 мкл препарату ВГОТТО і потім додають в індивідуальні ямки планшетів для мікроаналізу. Після однієї години інкубації, ямки промивають за допомогою РВ5Т. Потім визначають зв'язані мишачі антитіла шляхом проведення реакції з пероксидазою хрону (НЕР), кон'югованою козячим антимишачим дО (Ес-специфічним) (аскзоп Іттипогезеагсі І арогаїогіе5, УМе5і Сгоме, Ра.) і розбавляють у співвідношенні 1:2000 в ВГОТТО. Субстратний розчин пероксидази, що містить 0,1 Зо 3,3,5,5-тетраметилбензидину (Зідта, 5. Гоці5, Мо.) і 0,0003 95 перекису водню (5ідта), додають у ямки для проявлення забарвлення протягом 30 хвилин. Реакцію переривають шляхом додавання в кожну ямку 50 мкл 2М розчину Не50О»4. Зчитують оптичну густину реакційної суміші при 450 нм на планшет-рідері Віоїек ЕГІЗА Кеадег (Віотек Іпзігитепів, Уміпоо5кКі, МІ.).
Аналіз зв'язування МА5Р-2
Культуральні надосадові рідини, які дали позитивний результат при дослідженні МА5Р-2 описаним вище методом аналізу ЕГІ5А, можуть бути досліджені методом аналізу зв'язування для визначення афінності зв'язування МА5бР-2-інгібуючих засобів, яку вони мають відносно
МА5БР-2. Аналогічний аналіз може бути також використаний для визначення того, чи можуть інгібуючі засоби зв'язуватися з іншими антигенами в системі комплементу. бо На ямки полістирольного мікропланшета (96-ямкові планшети середнього зв'язування,
Согтпіпд Совіаг, Сатбргідде, МА) наносять шар МАБР-2 (20 нг/100 мкл/на ямку, Ааймапсей
Кезеагсп ТесппоЇоду, Зап Оіедо, СА) у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВБ) з рН 7,4 протягом ночі при 4 "С. Після видалення розчину МА5Р-2, ямки блокують за допомогою
РВ5, що містить 1 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВБА, бідта Спетісаї), протягом 2 годин при кімнатній температурі. Ямки без нанесеного покриття МАЗР-2 використовуються як контроль. У ямки додають аліквоти надосадових рідин гібридоми або очищених МоАБб проти
МА5БР-2 з варіюючими концентраціями в блокувальному розчині. Після двогодинної інкубації при кімнатній температурі, ямки ретельно промивають за допомогою РВ5. МА5Р-2-зв'язане
МОАБ проти МАБР-2 виявляють шляхом додавання кон'югованого з пероксидазою козячого антимишачого Ід (5ідта Спетісаї) у блокувальному розчині і інкубують протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшет знову ретельно промивають за допомогою РВ5 і додають 100 мкл субстрату 3,3,5,5'-тетраметилбензидину (ТМВ) (КіїКедаага ап Реїту І аБрогайгієв,
Сайпегериго, МО). Реакцію ТМВ переривають шляхом додавання 100 мкл 1М розчину фосфорної кислоти, і планшет зчитують при довжині хвилі 450 нм за допомогою планшет-рідера
ЗРЕСТВА МАХ 250 (5РЕСТВА МАХ 250, МоїІесшаг Оемісе5, Зиппумаїє, СА).
Культуральні надосадові рідини з позитивних ямок потім випробовують на їх здатність інгібувати активацію комплементу у функціональному дослідженні, такому як аналіз розщеплення С4, описаному в прикладі 2. Потім клітини з позитивних ямок клонують методом граничного розведення. Моноклональні антитіла МоАб знову тестують на їх реакційну здатність при взаємодії з ПМАБР-2 описаним вище методом ЕГІЗА. Відібрані гібридоми вирощують в обертових колбах, і відпрацьовану культуральну надосадову рідину збирають для очищення антитіл методом афінної хроматографії на основі зв'язування з білком А.
ПРИКЛАД 6
У цьому прикладі описується генерація і продукування гуманізованих мишачих антитіл проти
МА5Р-2 і фрагментів антитіл.
Мишаче моноклональне антитіло проти МАБР-2 генерують у самців мишей лінії А//, як описано в прикладі 5. Потім мишаче антитіло гуманізують, як описано нижче, для зниження його імуногенності шляхом заміни мишачих константних областей на їх людські аналоги для генерації химерного до і фрагмента Раб антитіла, які можуть застосовуватися відповідно до даного винаходу у людей для інгібування негативних наслідків МАБР-2 залежної активації комплементу. 1. Клонування генів варіабельних областей проти МА5Р-2 із клітин мишачої гібридоми
Тотальну РНК виділяють із клітин гібридоми, секретуючих МОоАБб проти МА5Р-2 (одержаних, як описано в прикладі 7), використовуючи КМА?л70! відповідно до протоколу фірми-виробника (Віотесіп, Ноизіоп, Тех.). Перший ланцюг кКДНК синтезують із тотальної РНК, використовуючи як праймер синтетичний гомополімерний олігодезоксирибонуклеотид (оїЇїдо-4Г). РСК проводили з використанням 3'-праймерів, одержаних з константної С-області імуноглобуліну, і наборів вироджених праймерів, одержаних з лідерного пептиду або першої каркасної області мишачих генів МН або МК як 5'-праймерів. Якірну РОК проводять, як описано в публікації Спеп Р.Р,
Зсапа. у. Іттипої. 35:539-549, 1992. Для клонування гена УК, одержують дволанцюжкову КДНК з використанням праймера Мой-МАКІ (5-ТаОСсССсСсСобСсастатааатастатсттт-3 5ЕО І
МО:38). Ренатуровані адаптери АБІТ (5-єсААТТСАСТОСТТАТТСТОСОСА-3 ЗЕО ІЮ МО:39) і
Арг2г (5-ТССОАСААТААСОСАСТИа-3 ЗЕО І МО:40) зв'язують із лігандами на обох 5'- і 3-кінцях дволанцюжкової КкКДНК. Адаптери на 3'-кінцях видаляють за допомогою розщеплення МОЙ.
Потім продукт розщеплення використовують як матрицю в РОК з олігонуклеотидом АО1 як 5'- праймером і МАК2 (5-САТТФАААХдаСтттасастТАпААатТТатТо-3 БО ІЮ МО:41) як 3- праймером. Фрагменти ДНК, із приблизно 500 парами основ, клонують у вектор рисС19.
Вибирають декілька клонів для аналізу послідовності з метою підтвердження того, що клонована послідовність охоплює очікувану константну область мишачого імуноглобуліну.
Олігонуклеотиди Мой -МАК'! і МАК2 одержують із області МК, і вони знаходяться на 182 і 84 парі основ, відповідно, після першої пари основ гена С-Карра. Вибирають клони, які включають закінчену МК і лідерний пептид.
Для клонування гена УН, одержували дволанцюжкову кКДНК, використовуючи праймер Мом мадат (5-саСссаббасдасТасСстоАсАсаТатАсА-3 ЗЕО ІЮ МО:42). Ренатуровані адаптери
АРІ і АБ2 зв'язують із лігандами на обох 5'- і 3'-кінцях дволанцюжкової кКДНК. Адаптери на 3'- кінцях видаляються шляхом розщеплення МОМ. Потім продукт розщеплення використовують як матрицю в РОК з олігонуклеотидом АОІ ії МАС2 (5-СССТААдаСсТтсАСТааСтТоАсСацйАААТА-З!
ЗЕО ІЮ МО:43) як праймерами. Фрагменти ДНК від 500 до 600 пар основ у довжину клонують в рОсС19. Олігонуклеотиди Мої1-МАС1 і МАС2 одержують із області Су.7.1 миші, ї вони 60 знаходяться на 180 і 93 парі основ, відповідно, нижче від першої пари основ у гені мишачого
Су.7.1. Вибирають клони, які включають закінчену УН і лідерний пептид. 2. Конструювання експресуючих векторів для химерного МА5Р-2 Ід і Бар
Використовують описані вище клоновані гени МН і МК як темплати у реакції РСК для додавання консенсусної послідовності Козака до 5'-кінця і донора сплайсованого фрагмента до
З-кінця нуклеотидної послідовності. Потім послідовності аналізують на відсутність РСК- помилок, гени МН і МК вставляють у касети експресуючих векторів, що містять людський С.У! і С.
Карра, відповідно, з одержанням ремМ2пеоУН-писуі і роеМ2пеоУ-пиСу. Очищені в градієнті С5СІ плазміди ДНК векторів важкого і легкого ланцюгів використовують для трансфекції клітин СО5 шляхом електропорації. Після 48 годин інкубації, культуральну надосадову рідину аналізують методом ЕГІЗА для підтвердження наявності приблизно 200 нг/мл химерного Ід. Клітини збирають і одержують тотальну РНК. Перший ланцюг кДНК синтезують із тотальної РНК, використовуючи як праймер оїЇїщо-4Ї. Цю кДНК використовують як темплат в РСК для генерування ДНК-фрагментів Ба і Карра. Для гена Ба, проводять РСК, використовуючи 5'-
ААпчААХасттасСасСАССАТОааАТтТааСтТатасААСТ-3 (ЗЕБО ІЮ МО:44) як 5'і-праймер і 3- праймер (5-СЧаСАТОСТСАААСТТТСТТаТатсСАССТТОИс-3 ЗЕО ІЮ МО:45), одержаний з СНІ.
Підтверджують, що послідовність ДНК містить повноцінні УН і домен СНІ людського ІдОе1. Після проведення розщеплення відповідними ферментами, фрагменти Ба ДНК вставляють у сайти рестрикції Ніпацп ії Ватні у касету експресуючого вектора реугапіт-ТО5 з одержанням роуУгантва. Плазміду реМ2 виробляють комерційні організації, і вона складається із сегментів
ДНК, узятих з різних джерел: рВЕ322 ДНК (зображена тонкою лінією) містить плазміду РВЕ322 початку реплікації ДНК (рВК огі) і ген резистентності лактамази до ампіциліну (Атр); 540 ДНК, яка зображена широкими штрихами і маркуванням, містить плазміду 5М40 початку реплікації
ДНК (5М40 оті), ранній промотор (від 5' до апії ї неогенів) і сигнал поліаденілювання (від З' до апіт ї неогенів). Одержаний від 5М40 сигнал поліаденілювання (рА) також поміщений на 3'-кінці гена Га.
У випадку гена Карра, проводять РСЕ, використовуючи 5-
ААСААДОаСсТТасСсСасСАССАТИаТТСТСАСТАССТОСТ-3 (ЗЕБО ІЮ МО:46) як 5-праймер і 3- праймер (5-СсССсСОсССпСАТСОСТТСТОССТСТААСАСТСТ-3 ЗЕБЕО ІЮ МО:47) одержаний з СК.
Підтверджують, що послідовність ДНК містить ділянки повнорозмірного МК і людського СК.
Зо Після розщеплення відповідними ферментами рестрикції, ДНК-фрагменти Карра вставляють у сайти рестрикції Ніпапй ї Ватні касети роеМ2пео-ТО5 експресуючого вектора з одержанням роМ2пеоК. Експресія обох генів Ба і Карра керується одержаними з НСММ елементами енхансера і промотору. Оскільки ген Ба не включає в себе залишок цистеїнової амінокислоти, що брав участь в утворенні дисульфідного зв'язку між ланцюгами, цей рекомбінантний химерний Бар містить нековалентно зв'язані важкі і легкі ланцюги. Цей химерний Еар позначений як сЕаб.
Для одержання рекомбінантного Бар з дисульфідним зв'язком між важким і легким ланцюгами, зазначений вище ген Бай може бути подовжений з метою включення послідовності, кодуючої 9 додаткових амінокислот (ЕРКЗСОКТН ЗЕО ІЮ МО:48), із шарнірної області людського ІДО1. Сегмент ДНК Ве(ЕЇІ-Ватні, кодуючий 30 амінокислот на 3'-кінці гена Га, може бути заміщений сегментами ДНК, кодуючими подовжений Ба, що в результаті дає роУгаптва/З9аа. 3. Експресія і очищення химерного анти-МА5Р-2 ІДС
Для генерації клітинних ліній, секретуючих химерний анти-МАБР-2 Ідс, клітини МО трансфікують за допомогою очищеної плазмідної ДНК роМ2пеомМН-пиб.у! і реМ2пеоМу-пиС-
Карра шляхом електропорації. Трансфіковані клітини відбирають у присутності 0,7 мг/мл 418.
Клітини вирощують в обертовій колбі об'ємом 250 мл у культуральному середовищі, що містить сироватку.
Культуральну надосадову рідину з обертової пробірки з культурою об'ємом 100 мл завантажують у колонку РКО5БЕР-А (Віоргосеззіпод, Іпс., Ргіпсеїоп, М.) об'ємом 10 мл. Колонку промивають об'ємом РВ5, що дорівнює 10 об'ємам шару колонки. Зв'язане антитілло елююють за допомогою 50 ммоль цитратного буфера з рН 3,0. До фракції, що містить очищене антитіло, додають рівний об'єм 1 моль Нерез з рН 8,0 для доведення величини рнН до 7,0. Залишкові солі видаляють шляхом заміни буфера на РВ5 шляхом ультрафільтрації через мембрану МійПіроге (відрізувана молекулярна маса 3000). Визначають концентрацію білка очищеного антитіла методом з біцинхоніновою кислотою (ВСА) (Ріегсе). 4. Експресія і очищення химерного анти-МА5Р-2 Раб
Для генерування клітинних ліній, секретуючих химерні Баб проти МА5бР-2, клітини СНО трансфікують за допомогою очищеної плазмідної ДНК реуУганпнтва (або роуУгантга/аа) і бо роМгпеоКарра шляхом електропорації. Трансфіковані клітини відбирають у присутності 418 і метотрексату. Вибрані клітинні лінії ампліфікують при зростаючих концентраціях метотрексату.
Клітини являють собою одиночну клітину, субклоновану методом граничного розведення.
Високопродуктивні клітинні лінії, субклоновані з одиночних клітин, потім вирощують в обертовій пробірці об'ємом 100 мл у культуральному середовищі, що не містить сироватки.
Химерне анти-МАБР-2 Раб очищають методом афінної хроматографії, використовуючи мишаче антиідіотипічне МоАбБ до МАБР-2 МоОАБ. Антиідіотипічне МАБР-2 МоАр може бути одержане шляхом імунізації миші за допомогою мишачого МоАБб проти МА5Р-2, кон'югованого з гемоціаніном лімфи равлика (КІН), і потім скринінгу на специфічне зв'язування з МоАб, яке може конкурувати з людською МА5Р-2. Для очищення, 100 мл надосадової рідини з культури клітин СНО, продукуючих сЕар або сЕар/9аа, завантажують у колонку для афінної хроматографії разом з антиідіотипічним МАБР-2 МоАБ. Потім колонку ретельно промивають за допомогою РВ5 перед тим, як зв'язаний Бар елююють за допомогою 50 ммоль дієтиламіну з рн 11,5. Залишкові солі видаляють шляхом заміни буфера, як описано вище. Концентрацію білка очищеного Рар визначають методом з біцинхоніновою кислотою (ВСА) (Ріегсе).
Здатність химерних МАБ5Р-2 ІдС, сРаб і сгар/Заа інгібувати МАЗР-2-залежні шляхи активації комплементу може бути визначена шляхом проведення дослідження інгібування, описаного в прикладі 2 або прикладі 7.
ПРИКЛАД 7
У цьому прикладі описується дослідження розщеплення С4 іп міго, використовуване як функціональний скринінг для ідентифікації МАЗР-2-інгібуючих засобів, здатних блокувати
МА5БР-2-залежну активацію комплементу через І -фіколін/?35, Н-фіколін, М-фіколін або манан.
Дослідження розщеплення С4
Дослідження розщеплення С4 описане в публікації Реїегзеп 5.У. еї аї., у. Іттипої. Меїйпод5, 257:107, 2001, при якому вимірюють активацію лектинового шляху, що викликається ліпотейхоєвою кислотою (І ТА) із золотистого стафілокока, яка зв'язує І -фіколін.
Реагенти
Фіксований у формаліні препарат золотистого стафілокока (05М20233) приготовляють наступним чином: вирощують бактерії протягом ночі при 37 "С у живильному середовищі на основі триптон-соєвого кров'яного агару, потім три рази промивають за допомогою РВ5, потім
Зо фіксують протягом 1 години при кімнатній температурі в суміші РВБ5/0,5 96 формаліну, і три рази додатково промивають за допомогою РВ5, і потім ресуспендують у покривному буфері (15 ммоль МагСОз, 35 ммоль МаНсо», рН 9,6).
Дослідження
Ямки титраційного мікропланшета Мипс Махізого (Маїдепе Мипс Іпіегпайопаї, Коспевег, МУ) покривають 100 мкл фіксованого у формаліні препарату золотистого стафілокока О5БМ20233 (ОО55о-0,5) у покривному буфері з 1 мкг І -фіколіну. Після інкубації протягом ночі, ямки блокують за допомогою 0,1 95 розчину сироваткового альбуміну людини (НБ5А) в ТВ5 (10 ммоль Ттгі5-НОЇ, 140 ммоль Масі, рН 7,4), потім промивають за допомогою ТВ5, що містить 0,05 95 Тжееп 20 їі 5 ммоль Сасі» (промивальний буфер). Зразки людської сироватки розбавляють в 20 ммоль Ттгів-
НСЇ, 1 моль Масі, 10 ммоль Сасіг, 0,05 95 Топ Х-100, 0,1 95 Н5А, рн 7,4, що запобігає активації ендогенного С4 і приводить до дисоціації комплексу С1 (що складається з С1д4, Стіг і С15).
Додавали до зразків сироватки в різних концентраціях МА5Р-2-інгібуючі засоби, що включають
МоАр проти МАБР-2 і інгібуючі пептиди. Розведені зразки додають у планшет і інкубують протягом ночі при 4 С. Через 24 години, планшети ретельно промивають за допомогою промивального буфера, потім додають у кожну ямку 0,1 мкг очищеного людського С4 (одержаного, як описано в публікації бодаз АЛМУ, МеїШйоа» Епгутої. 223:46, 1993) в 100 мкл 4 мМ барбіталу, 145 ммоль Масі, 2 ммоль СасСі», 1 ммоль МасСі», рН 7,4. Після витримування протягом 1,5 години при 37 "С, планшети знову промивають, і виявляють відкладення С4б, використовуючи кон'югований з лужною фосфатазою курячий антилюдський С4с (одержаний від фірми Іттипзуєіет, Оррзаїа, Змедеп), і роблять вимірювання, використовуючи для колориметричного визначення субстрат п-нітрофенілфосфату.
Дослідження С4 на манані
Описане вище дослідження адаптують для вимірювання активації лектинового шляху за допомогою МВІ шляхом нанесення на планшет шару манану і Ї5Р перед додаванням сироватки, змішаної з різними МА5Р-2-інгібуючими засобами.
Дослідження С4 на Н-фіколіні (антиген Накаїа). Описане вище дослідження адаптують для вимірювання активації лектинового шляху за допомогою Н-фіколіну шляхом нанесення на планшет шару Н-фіколіну і ЛПС перед додаванням сироватки, змішаної з різними МА5Р-2- інгібуючими засобами. (510) ПРИКЛАД 8
В описаному далі дослідженні продемонстрована наявність класичного шляху активації у немутантних мишей і МА5Р-2-/- мишей.
Методи
Імунні комплекси генерували іп 5йи шляхом нанесення на титраційні мікропланшети (Махібого, Мипс, Мо за каталогом 442404, Різпег Зсіепійіс) шару 0,1 95 розчину сироваткового альбуміну людини в 10 ммоль Тті5, 140 ммоль масі, рН 7,4, протягом 1 години при кімнатній температурі з наступною інкубацією протягом ночі при 4 "С з овечою антисироваткою проти цільної сироватки (ЗсоНізп Апіроду Ргодисіоп Опії, Сапике, ЗсоПЦапа), що розведена у співвідношенні 1:1000 в ТвВ5лЛм'ееп/Са?". Одержували зразки сироватки від немутантних мишей і
МАБР-2-/- мишей і додавали їх у планшети з нанесеним шаром. Приготовляли контрольні зразки, які містили зразки сироватки немутантних мишей і МАБР-2-/- мишей з різко зниженим рівнем СтТд. Мишачу сироватку з різко зниженим рівнем С14 приготовляли, використовуючи білок А, зв'язаний з магнітними частинками (Оупабеад5 Юупа! Віоїесп, О5іІо, Могмау), з нанесеним на них кролячими антилюдськими С14 до (бСако, Сіозігир, Оептагк), відповідно до інструкцій фірми-виробника. Планшети інкубували протягом 90 хвилин при 37 "С. Зв'язаний СЗр виявляли за допомогою поліклонального антитіла проти людського СЗс (ОаКко А 062), розведеного в ТВБ5ИМ/Сає у співвідношенні 1:1000. Вторинним антитілом є козячий антикролячий Ід.
Результати
На фігурі 7 показані відносні рівні відкладення СЗр на планшетах, покритих Ідс, у сироватці немутантних мишей, сироватці МАБР-2-/- мишей, сироватці немутантних мишей з різко зниженим Ст14 і сироватці МА5Р-2-/- мишей з різко зниженим Ст14. Ці результати демонструють, що класичний шлях залишається незачепленим у МА5Р-2-/- мишей.
ПРИКЛАД 9
В описаному далі дослідженні проводиться аналіз здатності МА5Р-2-інгібуючого засобу блокувати класичний шлях активації шляхом вивчення дії МА5Р-2-інгібуючого засобу в умовах, при яких класичний шлях ініціюється імунними комплексами.
Методи
Для дослідження дії МАБ5БР-2-інгібуючого засобу в умовах, при яких класичний шлях
Зо ініціюється імунними комплексами, три екземпляри сироватки по 50 мкл, що містять 90 95 МН5, інкубують при 37 "С у присутності 10 мкг/мл імунного комплексу (ІС) або РВ5, і, паралельно, інкубують при 37 "С ще три екземпляри зразка (чж/-ІС), які містять 200 нмоль моноклонального антитіл проти пропердину. Після інкубації протягом двох годин при 37 С, в усі зразки додають 13 ммоль ЕОТА з метою припинити подальшу активацію комплементу, після чого всі зразки негайно охолоджують до 5 С. Потім зразки зберігають при температурі -70 "С до моменту їх використання в аналізі продуктів активації комплементу (СЗа і 5С05р-9), використовуючи набори
ЕПЗА (Оціадеї, номери за каталогом АО15 і АОО9) згідно з інструкціями фірми-виробника.
ПРИКЛАД 10
У цьому прикладі описується ідентифікація високоафінних фрагментів антитіл Рар2 проти
МА5БР-2, які блокують активність МА5Р-2.
Рівень вивченості проблеми і актуальність
МАБР-2 являє собою складний білок з множиною окремих функціональних доменів, що включає сайт (сайти) зв'язування для МВІ. і фіколінів, каталітичний сайт серинпротеази, сайт зв'язування для протеолітичного субстрату С2, сайт зв'язування для протеолітичного субстрату
С4, сайт розщеплення МА5Р-2 для самоактивації зимогену МА5Р-2 і два зв'язуючі сайти Са.
Були ідентифіковані фрагменти Рабра2 антитіл, які зв'язуються з високою афінністю з МА5Р-2, і ідентифіковані фрагменти Рар2 випробовували у функціональному дослідженні для визначення їх здатності блокувати функціональну активність МА Р-2.
Для блокування функціональної активності МА5Р-2, антитіло або фрагмент ЕРабр2 антитіла повинні зв'язувати і негативно впливати на структурний епітоп на МА5Р-2, який необхідний для функціональної активності МА5Р-2. Тому багато які або всі високоафінні зв'язуючі фрагменти
Еар2 антитіл проти МА5Р-2 можуть не інгібувати функціональну активність МА5Р-2, якщо вони не зв'язуються зі структурними епітопами на МАБР-2, які безпосередньо обумовлюють функціональну активність МА5Р-2.
Функціональне дослідження, у якому вимірюють інгібування СЗ-конвертази лектинового шляху, використовували для оцінки "бСлокуючої активності" фрагмента Рар2 антитіла проти
МАБР-2. Відомо, що основною фізіологічною функцією МАБЗР-2 у лектиновому шляху є генерування наступного функціонального компонента шляху комплементу, опосередкованого лектином, а саме СЗ-конвертази лектинового шляху. СЗ-конвертаза лектинового шляху являє 60 собою особливо важливий ферментний комплекс (С4рСга), який протеолітично розщеплює СЗ на СЗа і С3Б0Б. МАБР-2 не є структурним компонентом СЗ-конвертази лектинового шляху (Сб4рСга); однак функціональна активність МАЗР-2 необхідна для генерації двох білкових компонентів (С4Б, С2а), які включають СЗ-конвертазу лектинового шляху. Крім того, виявляється, що всі перераховані вище окремі види функціональної активності МАБР-2 є необхідними для того, щоб МАБР-2 генерувала СЗ-конвертазу лектинового шляху. Із цих причин, вважають, що переважним дослідженням з метою оцінки "блокуючої активності" фрагмента Рар2 антитіла проти МАБР-2 є функціональне дослідження, у якому вимірюють інгібування утворення СЗ-конвертази лектинового шляху.
Генерування високоафінних фрагментів Бар2
Для створення високоафінних фрагментів Раб2 до білка щурячої МАБР-2 (З5ЕО ІЮ МО:55), використовували фаговий дисплей бібліотеки послідовностей легких і важких ланцюгів людських антитіл і метод автоматизованої селекції антитіл для ідентифікації Еар2, які взаємодіють з вибраними лігандами, що представляють інтерес. Для скринінгу антитіл використовували відому кількість білел«а щурячої МАБР-2 (1 мг, »85 95 чистоти). Для відбору антитіл з найкращою афінністю було проведено три раунди ампліфікації. Приблизно 250 різних хітів, експресуючих фрагменти антитіл, були відібрані для скринінгу методом ЕГІЗА.
Високоафінні хіти потім секвенували для визначення унікальності різних антитіл.
Очищали п'ятдесят унікальних антитіл проти МА5Р-2, і 250 мкг кожного очищеного антитіла
Бар2 використовували для визначення характеристик афінності зв'язування з МА5БР-2 і функціонального тестування шляху активації комплементу, як це більш докладно описано.
Дослідження, проведені з метою оцінки інгібуючої (блокуючої) активності фрагментів Гар2 антитіл проти МАБР-2 1. Дослідження з вимірювання інгібування утворення СЗ-конвертази лектинового шляху
Рівень вивченості проблеми
СЗ-конвертаза лектинового шляху являє собою ферментний комплекс (С4БС2а), який протеолітично розщеплює СЗ на два потенційні прозапальні фрагменти, анафілотоксин СЗа і опсонін СЗ3Б. Очевидно, утворення СЗ-конвертази є ключовою стадією лектинового шляху з точки зору опосередкування запалення. МА5Р-2 не є структурним компонентом СЗ-конвертази лектинового шляху (С4рС2а), тому антитіла проти МА5Р-2 (або Рарг) не будуть безпосередньо
Зо інгібувати активність вже існуючої СЗ-конвертази. Однак активність серинпротеази МА5Р-2 необхідна для генерації двох білкових компонентів (С46, С2а), які включають в себе С3- конвертазу лектинового шляху. Тому, фрагмент Бар2 антитіла проти МА5БР-2, інгібуючий функціональну активність МАБР-2 (тобто блокуючий анти-МАБР-2 Рарг), буде інгібувати із самого початку утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. СЗ містить як частину своєї 35 структури незвичайну і дуже реакційноздатну тіоефірну групу. Після розщеплення ССЗ за допомогою СЗ-конвертази, тіоефірна група в СЗ3Б може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами макромолекул, іммобілізованих на дні пластмасових ямок, за допомогою ефірних або амідних зв'язків, що полегшує визначення СЗ3Б при використанні методу аналізу ЕГІЗА. 40 Дріжджовий манан є відомим активатором лектинового шляху. В описаному нижче методі вимірювання утворення СЗ3-конвертази, пластикові ямки, покриті мананом, інкубували протягом хвилин при 37 "С з розведеною щурячою сироваткою з метою активації лектинового шляху.
Потім ямки промивали і визначали СЗБ, іммобілізований у ямках, використовуючи стандартні методи ЕГІЗА. Кількість генерованого в даному дослідженні СЗЬ є прямим відображенням С3- конвертази лектинового шляху, що утворилася із самого початку. У цьому дослідженні випробовували фрагменти ЕРар2 антитіл проти МАБР-2 при вибраних концентраціях на їх здатність інгібувати утворення СЗ3-конвертази і наступну генерацію СЗр.
Методи 96-Ямкові планшети з середнім ступенем зв'язування Собвіаг інкубували протягом ночі при 5 ес з мананом, розведеним в 50 ммоль карбонатного буфера з рН 9,5, при 1 мкг манану в 50 мкл буфера на ямку. Після інкубації протягом ночі, кожну ямку три рази промивали за допомогою 200 мкл РВ5. Потім ямки блокували 1 95 розчином бичачого сироваткового альбуміну в РВ5 у кількості 100 мкл на ямку і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при обережному перемішуванні. Потім кожну ямку три рази промивали за допомогою 200 мкл РВ5.
Зразки Бар2 проти МАБР-2 розбавляли до вибраних концентрацій в буфері СМВ, що містить
Са-з і Мд- (4,0 ммоль барбіталу, 141 ммоль Масі, 1,0 ммоль МОСІі, 2,0 ммоль Сасі», 0,1 95 желатину, рН 7,4), при 5 "С. Додавали 0,5 95 щурячої сироватки в кожний зразок при 5 2С, ії переносили 100 мкл в кожну ямку. Планшети накривали кришками і інкубували протягом 30 хвилин на водяній бані при 37 С із метою ініціювання активації комплементу. Реакцію зупиняли бо шляхом перенесення планшетів з водяної бані з температурою 37 "С у контейнер, що містить суміш льоду і води. Кожну ямку промивали п'ять разів за допомогою 200 мкл розчину РВ5-
Тмееп 20 (0,05 90 Тмеєп 20 в РВ5), потім промивали два рази за допомогою 200 мкл РВ5.
Розчин первинних антитіл з розведенням 1:10000 (кролячі проти людського СЗЗ, ПОАКО АО0062) в об'ємі 100 мкл на ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з обережним перемішуванням. Кожну ямку промивали 5 разів за допомогою 200 мкл РВ5. Розчин вторинних антитіл з розведенням 1:10000 (кон'югат пероксидази з козячим проти кролячого до, Атегісап
Оцаієх АТО2РІИ) в об'ємі 100 мкл на ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з обережним помішуванням на апараті для струшування. Кожну ямку промивали п'ять разів за допомогою 200 мкл РВ5. Додавали 100 мкл на ямку субстрату пероксидази ТМВ (Кігткедаага 8
Регту Гарогаюгієвз) і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0М розчину НзРОз у кількості 100 мкл на ямку і вимірювали ОЮг50. 2. Дослідження з вимірювання інгібування МАЗР-2-залежного розщеплення С4
Рівень вивченості проблеми
Активність серинпротеази МА5Р-2 є високоспецифічною, і були ідентифіковані тільки два білкові субстрати МА5Р-2, а саме С2 і С4. Розщеплення С4 приводить до утворення Са і С4р.
Еар2 проти МА5БР-2 може зв'язуватися зі структурними епітопами на МА5Р-2, які безпосередньо беруть участь у розщеплення С4 (наприклад, зв'язуючий сайт МАБР-2 для С4; каталітичний сайт серинпротеази МА5Р-2), і внаслідок цього інгібує функціональну активність МАЗР-2 по розщепленню Са.
Дріжджовий манан є відомим активатором лектинового шляху. В описаному нижче методі вимірювання активності МАБР-2 по розщепленню С4, пластикові ямки, покриті мананом, інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С з розведеною щурячою сироваткою з метою активації лектинового шляху. Оскільки первинні антитіла, використовувані в цьому методі ЕГІ5А, розпізнають тільки людський С4, то розведену щурячу сироватку доповнювали також людським
С4 (1,0 мкг/мл). Потім ямки промивали і аналізували на людський С4Бб, іммобілізований у ямках, використовуючи стандартні методи ЕГІЗА. Кількість С4р, генерована в цьому дослідженні, є
Зо мірою МАБР-2-залежної активності розщеплення С4. У цьому дослідженні випробовували фрагменти Рар2 антитіл проти МА5БР-2 при вибраних концентраціях на їх здатність інгібувати розщеплення Са.
Методи 96-Ямкові планшети з середнім ступенем зв'язування Собвіаг інкубували протягом ночі при 5 ес з мананом, розведеним в 50 ммоль карбонатного буфера з рН 9,5, при 1 мкг манану в 50 мкл буфера на ямку. Кожну ямку три рази промивали за допомогою 200 мкл РВ5. Потім ямки блокували 1 95 розчином бичачого сироваткового альбуміну в РВ5 у кількості 100 мкл на ямку і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при обережному перемішуванні.
Кожну ямку три рази промивали за допомогою 200 мкл РВ5. Зразки Бар2 проти МА5БР-2 розбавляли до вибраних концентрацій в буфері МВ, що містить Саєз і Мд-е (4,0 ммоль барбіталу, 141 ммоль Масі, 1,0 ммоль МОСІ, 2,0 ммоль Сасі», 0,1 95 желатину, рН 7,4), при 5 2С.
У ці зразки також вводили 1,0 мкг/мл людського С4 (Сціде!). В описані вище зразки додавали 0,5 96 щурячої сироватки при 5 "С, і переносили 100 мкл у кожну ямку. Планшети накривали кришками і інкубували протягом 30 хвилин на водяній бані при 37 "С з метою ініціювання активації комплементу. Реакцію зупиняли шляхом перенесення планшетів з водяної бані з температурою 37 "С у контейнер, що містить суміш льоду і води. Кожну ямку промивали п'ять разів за допомогою 200 мкл розчину РВ5-Тмшеєп 20 (0,05 95 Тмееп 20 в РВ5), потім промивали два рази за допомогою 200 мкл РВ5. Розчин кон'югованого з біотином курячого проти людського С4 (Іттипвзузіет АВ, Оррзаїа, Зм/єдеп) з розведенням 1:700 в об'ємі 100 мкл на ямку додавали в РВ5, що містить 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з обережним перемішуванням. Потім кожну ямку промивали п'ять разів за допомогою 200 мкл РВ5. Додавали 100 мкл на ямку кон'югованого з пероксидазою стрептавідину з концентрацією 0,1 мкг/мл (Ріетсе Спетіса! 221126) в РВ5, що містить 2,0 мг/мл
В5А, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з обережним помішуванням на апараті для струшування. Кожну ямку промивали п'ять разів за допомогою 200 мкл РВ5.
Додавали 100 мкл на ямку субстрату пероксидази ТМВ (КігКедаага 4 Реїту І арогаїйогієв5) і інкубували при кімнатній температурі протягом 16 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0М розчину НзРоОх у кількості 100 мкл на ямку і вимірювали ОЮг-во.
З. Аналіз зв'язування фрагмента Бар2 щурячого антитіла проти МА5БР-2 з "нативною" бо щурячою МА5Р-2
Рівень вивченості проблеми
МА5БР-2 звичайно присутній у плазмі у формі димерного комплексу МАЗР-2, який також включає специфічні лектинові молекули (манозозв'язувальний білок (МВІ) і фіколіни). Тому, якщо виникає інтерес до дослідження зв'язування фрагмента Бар2 антитіла проти МА5Р-2 з фізіологічно релевантною формою МАЗБР-2, важливо розробити аналіз зв'язування, у якому використовується взаємодія в плазмі між Баб2 і "нативною" МАБбР-2, а не з очищеним рекомбінантним МАБР-2. У цьому аналізі зв'язування, спочатку іммобілізували на ямках, покритих мананом, комплекс "нативної" МАБР-2 з МВІ з 10 95-ної щурячої сироватки. Потім досліджували афінність зв'язування різних фрагментів Бар? антитіл проти МАБЗР-2 з іммобілізованою "нативною" МА5Р-2, використовуючи стандартний метод аналізу ЕГІЗА.
Методи 96-Ямкові планшети з високим ступенем зв'язування Совіаг інкубували протягом ночі при 5 ес з мананом, розведеним в 50 ммоль карбонатного буфера, рн 9,5, у кількості 1 мкг/50 мкл на ямку. Кожну ямку три рази промивали за допомогою 200 мкл РВ5. Потім ямки блокували 0,5 95 знежиреним сухим молоком в РВ5Т (РВЗ з 0,05 95 Тмеєп 20) у кількості 100 мкл на ямку і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при обережному перемішуванні.
Кожну ямку три рази промивали за допомогою 200 мкл промивального буфера ТВ5/Гмееп/Са (забуферений Тіз фізіологічний розчин, 0,5 95 Тмееп 20, що містить 5,0 ммоль Сасі», рН 7,4).
Приготовляли на льоду 10 95 щурячу сироватку в зв'язувальному буфері з високим вмістом солей (20 ммоль Тгі5, 1,0 моль Масі, 10 ммоль Сасі», 0,05 96 Ти йоп Х-100, 0,1 95 (маса в одиниці об'єму) бичачого сироваткового альбуміну з рН 7,4). Додали 100 мкл на ямку ії інкубували протягом ночі при 5 "С. Потім ямки три рази промивали за допомогою 200 мкл промивального буфера ТВ5/Тмеєеп/Са"-. Потім ямки промивали два рази за допомогою 200 мкл РВ5. Додавали в ямки 100 мкл на ямку вибрану концентрацію фрагмента Рар2 антитіла проти МА5Р-2, розведену в буфері ЗУВ, що містить Са-є і Мур (4,0 ммоль барбіталу, 141 ммоль Масі, 1,0 ммоль МОСІ, 2,0 ммоль Сасі», 0,1 95 желатину, рН 7,4), і інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі при обережному перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів за допомогою 200 мкл РВ5. Додавали 100 мкл на ямку кон'югованого з НКР фрагмента ЕРар2 козячого антитіла (Віодепезіз номер за каталогом 0500-0099), розведеного у співвідношенні
Зо 1:5000 в 2,0 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну в РВ2, і інкубували протягом години при кімнатній температурі при обережному перемішуванні. Кожну ямку промивали п'ять разів за допомогою 200 мкл РВ5. Додавали 100 мкл на ямку пероксидазного субстрату ТМВ (Кіжкеадаага 8 Регту І абогаютієв) і інкубували при кімнатній температурі протягом 70 хвилин. Пероксидазну реакцію зупиняли шляхом додавання 1,0 моль НзРОї у кількості 100 мкл на ямку і потім вимірювали ОЮг50.
Результати
Для проведення скринінгу методом аналізу ЕГІЗА були відібрані приблизно 250 різних фрагментів Рабр2г, які реагують з високою афінністю з білюоом щурячої МА5Р-2. Ці високоафінні
Еабр2 секвенували з метою визначення унікальності різних антитіл, і 50 унікальних антитіл проти
МАБР-2 піддавали очищенню для додаткового дослідження. 250 мкг кожного очищеного фрагмента Рар2 антитіла використовували для визначення характеристик афінності зв'язування
МАБР-2 їі функціонального тестування шляху активації комплементу. Результати цього дослідження наведені в таблиці 6.
Таблиця 6
Фрагменти Тар2 антитіл проти тахр-2, які блокують лектиновий шлях активації комплементу
Мо ІСво (НМ) З ІСво (НМ) 71171786 77717171717171053 77777177 14 невизначали.//7/7/7/: 7771717171766 | ..юЮюЮюр7л092....77717171717171717171/1745 невизначали.///: 71760771 Ї77171717171717171776177117171711711717171717171711134 1 невизначали./77/7/:
Мо ІСво (НМ) Й ІСво (НМ) 71171763 77717171717120 777 17171717171717171/1766 1 невизначали.///7/7/: 89777111 Ї711717171717801111717171717171171717171717171711125 о невизначали./7/7/: 10208717 Ї7717171717171717160777....7.17171717171717171р25 о невизначали./77/7/:
Як показано вище в таблиці 6, з 50 підданих випробуванню фрагментів Рар2 антитіл проти
МАБ5БР-2, сімнадцять Рар2 були ідентифіковані як Бар2, блокуючі МА5бР-2, які потенційно інгібують утворення СЗ-конвертази з величиною ІСво, що дорівнює або менше ніж 10 нмоль
ЕРабрг (34 95 позитивних результатів пошуку). Вісім із сімнадцяти ідентифікованих БГар2 мають величину ІСво у діапазоні субнаномолярних значень. Крім того, усі наведені в таблиці 6 сімнадцять Рар2, блокуючих МА5Р-2, забезпечують практично повне інгібування утворення С3- конвертази при дослідженні СЗ-конвертази лектинового шляху. На фігурі 8А графічно представлені результати дослідження утворення СЗ-конвертази для фрагмента Рабр2 антитіла
Мо 11, який є типовим представником серед інших фрагментів ЕБар2 антитіл, підданих випробуванням, результати яких наведені в таблиці б. Це є важливим чинником, оскільки теоретично можливо, що "бСлокуючий" фрагмент Рар2 може тільки частково інгібувати функцію
МА5Р-2 навіть у тому випадку, коли кожна молекула МА5Р-2 зв'язується з Раб2.
Незважаючи на те, що манан є добре вивченим активатором лектинового шляху, проте існує теоретична можливість того, що присутність антитіл проти манану в щурячій сироватці може також активувати класичний шлях і генерувати СЗр за допомогою СЗ-конвертази класичного шляху. Однак кожний із сімнадцяти блокуючих фрагментів Бар2 антитіл проти МАБ5Р-2, перерахованих у цьому прикладі, потенційно інгібує генерування СЗ3Б (295 95), таким чином демонструючи специфічність даного дослідження для СЗ-конвертази лектинового шляху.
Для всіх сімнадцяти блокуючих Бабр2 також проводили аналіз зв'язування з метою підрахунку уявної Ка для кожного. Результати досліджень по зв'язуванню фрагментів Рар2 щурячих антитіл проти МАБР-2 з нативною щурячою МА5БР-2 для шести із блокуючих ЕБар2 також наведені в таблиці б. На фігурі 88 графічно представлені результати дослідження зв'язування з фрагментом ЕБар2 антитіла Мо 11. Аналогічні дослідження зі зв'язування також проводили для інших Раб2, їх результати представлені в таблиці 6. У цілому, величини Ка, одержані для зв'язування кожного із шести Бар2 з "нативною" МАБР-2, досить точно відповідають величинам ІСвсо для Бар2 у функціональному дослідженні конвертази С3. Існує доказ того, що МА5Р-2 піддається конформаційній зміні від "неактивної" форми до "активної"
Зо форми після ініціації протеазної активності (Реіпбегоу еї аІ., ЕМВО .-). 22:2348-59 (2003); Са! еї аї.,
У. Віої. Сет. 280:33435-44 (2005). У нормальній щурячій плазмі, використовуваній в дослідженні утворення СЗ-конвертази, МАБР-2 присутній спочатку у формі "неактивної" конформації зимогену. На відміну від цього, при аналізі зв'язування, МАБР-2 присутній як частина комплексу з МВІ.,, зв'язаним з іммобілізованим мананом; тому МА5Р-2, очевидно, буде знаходитися в "активній" конформації (Реїегзеп еї аї.,). Іттипої. Меїфйоаз, 257:107-16, 2001).
Отже, не слід очікувати точної відповідності між величинами ІСбзо і Ка для кожного із сімнадцяти блокуючих Рабр2, підданих випробуванню в цих двох функціональних дослідженнях, оскільки в кожному дослідженні Рабра2 міг зв'язувати різні конформаційні форми МА5Р-2. Проте, очевидно, що, за винятком ЕРабра2 Мо 88, є досить точна відповідність між величиною ІСво і величиною уявної
Ка для кожного з інших шістнадцяти Еар2, підданих випробуванню у двох дослідженнях (дивіться таблицю 6).
Деякі із блокуючих Рабр2 оцінювали на їх здатність інгібувати МА5Р-2-залежне розщеплення
С4. На фігурі 8С графічно представлені результати дослідження розщеплення сС4, які демонструють інгібування за допомогою Бар2 Мо 41 з величиною ІС5о-0,81 нмоль (дивіться таблицю 6). Як показано на фігурі 9, було виявлено, що всі піддані випробуванню Еар2 інгібували розщепленню С4 з величиною ІСво, аналогічною величинам, одержаним у дослідженні СЗ-конвертази (дивіться таблицю 6).
Незважаючи на те, що манан є добре вивченим активатором лектинового шляху, проте існує теоретична можливість того, що присутність антитіл проти манану в щурячій сироватці може також активувати класичний шлях і генерувати С4Бб у результаті С15-опосередкованого розщеплення С4. Однак були ідентифіковані декілька фрагментів Рар2 антитіл проти МА5Р-2,
які потенційно інгібують генерацію С46Б (295 95), таким чином демонструючи специфічність цього дослідження розщеплення С4, опосередкованого МАБР-2. С4, так само, як і С3З, містить незвичайну і високореакційноздатну тіоефірну групу як частину структури. Після розщеплення
С4 під впливом МАБР-2 у цьому дослідженні, тіоефірна група на С45б може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами на макромолекулах, іммобілізованих на дні пластикових ямок за допомогою ефірних або амідних зв'язків, таким чином полегшуючи визначення С4бр при проведенні аналізу ЕГІЗА.
У цих дослідженнях однозначно продемонстровано, що створені ЕАВ2 мають високу афінністю відносно білка МАБР-2 і блокують функціональну активність С4 і СЗ-конвертази, у результаті чого попереджується активація лектинового шляху.
ПРИКЛАД 11
У цьому прикладі описується картування епітопів деяких із блокуючих фрагментів Рарг2 щурячих антитіл проти МАБ5Р-2, які були генеровані, як описано в прикладі 10.
Методи
Як показано на фігурі 10, експресували в клітинах СНО, використовуючи вектор рЕБА4, наступні білки, усі з М-термінальними бх Нів-мітками (гістаміновими мітками): щуряча МА5БР-2А, повнорозмірний білок МА5Р-2, інактивований шляхом заміни серину в активному центрі на аланін (5613А); щуряча МА5Р-2К, повнорозмірний білок МА5Р-2, змінений з метою зниження самоактивації (8424К);
СОВІ-І, М-термінальний фрагмент щурячої МАЗР-2, який містить тільки домени СОВІ, ЕСЕ- подібний і СОВІЇ; і
СОВІ/ЕСЕЕ-подібний, М-термінальний фрагмент щурячої МАЗР-2, який містить тільки домени
СИиВІ ї ЕСЕ-подібний.
Ці білки очищали від культуральних надосадових рідин методом нікель-афінної хроматографії, описаної раніше (Спеп еї аї!., у. ВіоїЇ. Спет. 276:25894-02 (2001)).
С-термінальний поліпептид (ССРІІ-5Р), що містить ССРІЇ і домен серинпротеази щурячої
МА5БР-2, експресували в кишковій паличці як злитий з тиоредоксином білок, використовуючи рТтхЕиз (Іпмігодеп). Білок був очищали від клітинних лізатів, використовуючи смолу для афінної
Зо хроматографії Тпіоропа. Злитий з тиоредоксином білок експресували з порожнього рТгхЕив5 як негативний контроль.
Усі рекомбінантні білки піддавали діалізу в буфері ТВ, і їх концентрації визначали шляхом вимірювання оптичної густини при 280 нм.
Дот-блот-аналіз
На нітроцелюлозну мембрану наносили у формі плям послідовні розведення п'яти рекомбінантних поліпептидів МАЗР-2, описаних вище і показаних на фігурі 10 (ії поліпептид тиоредоксину як негативний контроль для поліпептиду ССРІЇІ-серинпротеази). Кількість нанесеного у формі плям білка змінювалася в діапазоні від 100 нг до 6,4 пкг при кожному наступному розведенні в п'ять разів. У наступних експериментах, кількість нанесеного у формі плям білка змінювалося в діапазоні від 50 нг до 16 пкг, також при кожному наступному розведенні в п'ять разів. Мембрани блокували за допомогою 5 95 знежиреного сухого молока в
ТВ (блокувальний буфер), потім інкубували з 1,0 мкг/мл фрагмента Рар2 антитіла проти
МАБР-2 у блокувальному буфері (що містить 5,0 нмоль Сагх). Зв'язані фрагменти ЕРар2 визначали, використовуючи НЕКР-кон'югований фрагмент Бар людського антитіла (АБО/Зегоїес; розведений у співвідношенні 1/10000) і набір для визначення ЕСІ. (Атег5пат). Одну мембрану інкубували з поліклональним кролячим антитілом проти людської МАЗР-2 (описаним в 5іомег єї аІ., У. Іттипої. 163:6848-59 (1999)) як позитивним контролем. У цьому випадку, зв'язане антитіло визначали, використовуючи НКР-кон'юговане козяче антитіло проти кролячого дО (бако; розведене в співвідношенні 1/2000).
Аналіз зв'язування МАБР-2
На планшети для проведення аналізу методом ЕГІ5ЗА наносили шар рекомбінантного МА5Р- 2А або СИВІ-ІЇ поліпептиду в карбонатному буфері (рН 9,0) у кількості 1,0 мкг на ямку протягом ночі при 4 "Сб. Ямки блокували 195 В5А в ТВ5, потім додавали послідовні розведення фрагментів Рар2 антитіл проти МА5Р-2 в ТВ5, що містить 5,0 нмоль Са". Планшети інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Після потрійного промивання в
ТВв5/мееп/Са, додавали НЕР-кон'югований фрагмент Бар людського антитіла (АБО/Зегоїес), розведений у співвідношенні 1/10000 в ТВ5/Саг", і планшети знову інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Зв'язане антитіло виявляли, використовуючи набір субстрату пероксидази ТМВ (Віогад). бо Результати
Результати дот-блот-аналізу, що демонструють реакційну здатність Гар2 при взаємодії з різними поліпептидами МА5Р-2, представлені нижче в таблиці 7. Числові значення, наведені в таблиці 7, позначають кількість нанесеного у формі плям білка, необхідну для подачі сигналу із приблизно половиною його максимальної інтенсивності. Як показано, усі поліпептиди (за винятком партнера по злиттю тиоредоксину) розпізнавали за допомогою антитіла позитивного контролю (сироватка поліклонального людського антитіла проти МАБР-2, продукована в кроликах).
Таблиця 7
Реакційна здатність відносно різних рекомбінантних поліпептидів щурячого ітазр-2 у дот-блот- аналізі
Фрагмент Баб2 СОвуєан- 60 | оО4н | О4н | Ма | ма | м РЯЖМ. 66 | О4н | ма | ма | 2бн | м Я 786 | О4ні | ма | ма | Он | м вЯЩК У|Д контроль
Реєстрували активність лектинового шляху протягом другого і третього тижня, повне відновлення лектинового шляху у мишей відбувалося на 17 день після введення моноклонального антитіла проти МАБР-2. МК-відсутність реакції. Антитіло для позитивного контролю являє собою сироваткове поліклональне антитіло проти людської МАБР-2, продуковане в кроликах.
Усі фрагменти Рабр2 антитіл взаємодіяли з МА5Р-2А, а також з МА5Р-2К (дані не показані).
Більшість фрагментів Равра2 розпізнавали поліпептид ССРІІ-5Р, але не М-термінальні фрагменти.
Двома виключеннями є Бар2 Мо 60 і Бар2 Мо 57. Бар2 Мо 60 розпізнає МАБР-2А і фрагмент
СИВІ-І, але не СИВІ/ЕСЕ-подібний поліпептид або ССРІЇ-5Р поліпептид, що дозволяє припустити, що він зв'язується з епітопом в СОВІЇ, або перекриває домен СШВІЇ ії ЕСЕ-подібний домен. Бар2 Мо 57 розпізнає МА5БР-2А, але жоден з підданих випробуванням фрагментів МА5Р- 2, що вказує на те, що цей фрагмент Рар2 антитіла розпізнає епітоп в ССРІ. Бар2 Мо 40 і Мо 49 зв'язувалися тільки з повною МА5Р-2А. В аналізі зв'язування методом ЕГІ5А, зображеному на фігурі 11, Бар2 Мо 60 також зв'язувався з поліпептидом СИВІ-ЇЇ, хоча при цьому рівень уявної афінності був незначно нижче.
Ці результати демонструють виявлення унікальних блокуючих фрагментів Рар2 антитіл, що діють відносно численних областей білка МА5Р-2.
ПРИКЛАД 12
У цьому прикладі описується дослідження МАБР-2-/- мишей в експериментальній моделі ішемії/реперфузії нирки на мишах.
Зо Рівень вивченості проблеми і актуальність
Ураження нирки в результаті ішемії/реперфузії (1/К) при температурі тіла має відношення до ряду клінічних станів, що включають гіповолемічний шок, оклюзію ниркової артерії і процедури перетиснення.
Ішемія-реперфузія (1/К) нирки є важливою причиною гострої ниркової недостатності, що приводить до смертності в 50 9о випадків (І ему еї аї., "АМА, 275:1489-94, 1996; Тнаднапі еї аї.,
М. Епої. У. Мей. 334:1448-60, 1996). Посттрансплантаційна ниркова недостатність являє собою загальне і небезпечне для життя ускладнення після трансплантації нирок (Міспоїбзоп еї аї.,
Кідпеу Іпі. 58:2585-91, 2000). На даний час не існує ефективного методу лікування /К-ураження нирок, єдиною формою лікування є гемодіаліз. Патофізіологія К-ураження нирок є досить складною. У нещодавніх дослідженнях було показано, що лектиновий шлях активації комплементу може відігравати важливу роль у патогенезі /К-ураження нирок (демгієз еї а!., Ат.
У. Ра. 165:1677-88, 2004).
Методи
Створили МА5БР-2(-/-) мишу, як описано в прикладі 1, і проводили її зворотне схрещування протягом щонайменше 10 поколінь із мишами лінії С57В1/6. Шести самцям МА5Р-2(-/-) мишей і шести немутантним мишам (ж/к) з масою тіла 22-25 г вводили шляхом інтраперитонеальних ін'єкцій Нурпоме! (6,64 мг/кг; Коспе ргодисів (а. Муемуп Сагдеп Сйпйу, ОК), а потім їх анестезували шляхом інгаляції ізофлюрану (Арбої І абогагогіех Ц., Кепі, ОК). Ізофлюран був вибраний тому, що він є м'яким інгаляційним анестезуючим засобом з мінімальною гепатотоксичністю; його концентрації продукуються з високою точністю, і тварини швидко відновлюються навіть після тривалої анестезії. НурпомеІ вводили у зв'язку з тим, що він викликає стан нейролептаналгезії у тварин, що має на увазі можливість введення меншої дози ізофлюрану. Тварин розміщали на теплих підстилках з метою підтримання постійної температури тіла. Потім робили розріз по середній лінії черевної стінки, і черевну порожнину залишали відкритою, використовуючи пару ретракторів. Зачищали сполучну тканину вище і нижче ниркової вени і артерії правої і лівої нирок, і ниркову ніжку перетискали шляхом накладення затискачів, використовуваних при мікроаневризмі, на 55 хвилин. Цей період ішемії спочатку був обгрунтований у результаті попереднього дослідження, проведеного в цій лабораторії (2пои еї аї., 9. Сііп. Іпмеб5і. 105:1363-71 (2000)). Крім того, стандартний час тривалості ішемії, що становить 55 хвилин, вибирали після проведення дослідження ішемії методом титрування, і було виявлено, що час 55 хвилин провокує стійке ураження, яке є також оборотним, з низьким рівнем смертності, що становить менше 5 95. Після оклюзії, у черевну порожнину вводили 0,4 мл теплого фізіологічного розчину (37 2С), і потім черевну порожнину закривали на період ішемії. Після видалення затискачів, використовуваних при мікроаневризмі, проводили спостереження за нирками доти, поки не відбувалася зміна їх забарвлення, що
Зо вказувало на відновлення кровообігу в нирках. У черевну порожнину додатково вводили 0,4 мл теплого фізіологічного розчину, і на розріз накладали шви, після чого тварин повертали в їх клітки. Відбирали зразки крові із хвостів тварин через 24 години після видалення затискачів, і через 48 годин мишей умертвляли і збирали додаткові зразки крові.
Оцінка ушкодження нирок
Оцінювали функцію нирок у шести самців МА5Р-2(-/-) мишей і шести немутантних мишей (1/5) через 24 і через 48 годин після реперфузії. Визначення креатиніну в крові проводили методом мас-спектрометрії який забезпечує одержання відтворюваних результатів при визначенні індексу функції нирок (чутливість «1,0 мкмоль/л). На фігурі 12 графічно представлені дані по кліренсу азоту сечовини крові для контрольної групи немутантних мишей лінії С57В1/6 і групи МАБР-2(-/-) мишей через 24 години і через 48 годин після реперфузії. Як показано на фігурі 12, у МАБР-2(-/-) мишей виявлялося значне зниження кількості сечовини крові через 24 і через 48 годин у порівнянні з контрольними немутантними мишами, що вказує на захисний ефект функціонального характеру від ушкодження нирок у моделі ішемічного реперфузійного ураження.
У цілому, підвищений рівень сечовини в крові спостерігався як у немутантних мишей (ж/тк), так і у МАБР-2(-/-) мишей через 24 і через 48 годин після хірургічної процедури і ішемічного інсульту. Рівень сечовини в крові у неішемічної прооперованої немутантної тварини (ж/к) визначали окремо, і він становив 5,8 ммоль/л. На доповнення до даних, представлених на фігурі 12, у однієї МАБР-2(-/-т тварини виявляли практично повний захист від ішемічного інсульту, з показниками 6,8 і 9,6 ммоль/л через 24 години і через 48 годин, відповідно. Цю тварину виключали з досліджуваної групи як тварину, що різко відрізняється від інших, у якої не може виникати ішемічного ушкодження. Тому, остаточні результати дослідження, представлені на фігурі 12, включали результати для 5 МА5Р-2(-/-) мишей і для б немутантних мишей (/»), і було виявлено статистично значиме зменшення сечовини в крові через 24 години і через 48 годин у МА5Р-2(-/-) мишей (І-критерій Стьюдента р«0,05). Можна припустити, що ці результати вказують на те, що інгібування активності МА5Р-2 виявляє захисну або терапевтичну дію від ушкодження нирок, обумовленого ішемією.
ПРИКЛАД 13
У цьому прикладі описуються результати, одержані при дослідженні, проведеному на бо експериментальній моделі дегенерації жовтої плями на МА5Р-2-/- мишах.
Рівень вивченості проблеми і актуальність
Вікова дегенерація жовтої плями "(АМО) є основною причиною виникнення сліпоти у віці після 55 років у промислово розвинених країнах. АМО виникає у двох основних формах: у формі неоваскулярної (вологої) АМО і у формі атрофічної (сухої) АМО. Неоваскулярна (волога) форма становить 90 о важких форм втрати зору, пов'язаної з АМО, хоча волога форма АМО розвивається тільки у приблизно 20 95 індивідуумів. Клінічні ознаки АМО включають множинні друзи, географічну атрофію і хоріоїдальну неоваскуляризацію (СММ). У грудні 2004, Управління по контролю якості харчових продуктів і ліків США (ЕБА) схвалило застосування лікарського препарату макугену (пегаптанібу), нового класу офтальмічних лікарських засобів для специфічного впливу і блокування ефектів фактора росту ендотелію судин (МЕСБЕ), для лікування вологої (неоваскулярної) форми АМО (МО еї а!., Маї Кем. Огид Оізсом, 5:123-32 (2006)).
Незважаючи на те, що макуген являє собою новий перспективний терапевтичний засіб для лікування підгрупи пацієнтів з АМО, проте залишається настійна потреба в розробці додаткових методів цього комплексного захворювання. Численні дослідження, проведені по незалежних напрямках, указують на центральну роль активації комплементу в патогенезі АМО. Патогенез хоріоїдальної неоваскуляризації (СММ), найбільш серйозної форми АМО, може включати активацію шляхів комплементу.
Більше двадцяти п'яти років тому в публікації Куап 5.9). Тг. Ат. Орій. бос. І ХХМПО7-745, 1979, була описана експериментальна модель хоріоїдальної неоваскуляризації (СММ) на тваринах, викликаної лазерним ушкодженням (Куап 5..)., Тг. Ат. Орій. 5об. І ХХМПО07-745, 1979).
Початково модель була розроблена для використання на макаках-резус, однак така ж технологія вже використовується тривалий час для розробки аналогічних моделей СММ на цілому ряді лабораторних тварин, включаючи мишей (Тобе еї аї., Ат. У. Раїйої. 153:1641-46, 1998). У цій моделі використовують лазерну фотокоагуляцію для руйнування мембрани Бруха, результатом чого є утворення СММ-подібних мембран. Індукована лазером модель охоплює множину важливих проявів цього захворювання людини (дивіться нещодавно опублікований огляд АтрБбаї; єї а!., зигмеу ОрпіПпаІто!оду, 48:257-293, 2003). На даний час, індукована лазером модель на мишах добре обгрунтована, і її широко використовують як експериментальну основу у великій і постійно зростаючій кількості наукових досліджень. Існує загальновизнана думка, що індукована лазером модель має достатню біологічну подібність з хоріоїдальною неоваскуляризацією (СММ) у людини, і що доклінічні дослідження патогенезу і інгібування за допомогою лікарських препаратів, при яких використовують цю модель, є релевантними застосовно до СММ у людини.
Методи
Створили МА5БР-2(-/-) мишу, як описано в прикладі 1, і проводили її зворотне схрещування протягом щонайменше 10 поколінь із мишами лінії С57В1/6. У даному дослідженні проводили порівняння результатів, одержаних для самців МА5Р-2(-/-)у мишей і МАБР-2(ї/-) мишей після лазерного ушкодження в процесі протікання індукованої лазером СММ, прискореної моделі неоваскулярної АМО, приділяючи особливу увагу об'єму індукованої лазером СММ, методом конфокальної лазерної скануючої мікроскопії як метод для вимірювання ушкодження тканини, і методом аналізу ЕГІЗА для визначення рівнів МЕСЕ, потенційного ангіогенного фактора, залученого в СММ, у ретинальному пігментному епітелії (КРЕ)/у судинній оболонці ока.
Індукування хоріоїдальної неоваскуляризації (СММ)
Лазерну фотокоагуляцію (532 нм, 200 мВт, 100 мілісекунд, 75 мкм; Осиідні с, Ігідех,
Моипіаїп Міем/, СА) проводив на обох очах кожної тварини на нульовий день один співробітник, якому було невідомо, якій групі тварин було призначене введення лікарських препаратів.
Лазерні плями наносили стандартизованим чином навколо оптичного нерва, використовуючи систему для установлення щілинної лампи і покривного скла як контактної лінзи.
Морфологічною кінцевою точкою лазерного ушкодження вважалася поява кавітаційного пузирчика, ознаки, яку пов'язували з ушкодженням мембрани Бруха. Деталізація методів і оцінка одержаних результатів виглядають таким чином.
Флуоресцентна ангіографія
Флуоресцентну ангіографію проводили за допомогою камери і системи формування зображень (камера ТКС 50 14А; система ІтадемМеї 2.01; Торсоп, Рагатив, МУ) через 1 тиждень після лазерної фотокоагуляції. Фотографії одержували з використанням лінз 20-О, що стикаються з лінзами фундус-камери, після інтраперитонеальної ін'єкції 0,1 мл 2,595 флуоресцеїну натрію. Фахівець по сітківці ока, що не брав участі у лазерній фотокоагуляції або ангіографії, оцінював флуоресцентні ангіограми протягом одного сеансу, не маючи інформації про попередню маніпуляцію із тваринами. бо Об'єм хоріоїдальної неоваскуляризації (СММ)
Через один тиждень після лазерного ушкодження, очі енуклюювали і фіксували 4 95 параформальдегідом протягом 30 хвилин при 4 "С. Одержували очні келихи шляхом видалення передніх сегментів і промивали їх три рази в РВ5, потім дегідратували і регідратували шляхом використання метанолу. Після двох разів блокування буфером (РВЗ з вмістом 1 95 бичачого сироваткового альбуміну і 0,5 95 ТиИйоп Х-100) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, очні келихи інкубували протягом ночі при 4 С з 0,5 95 флуоресцеїнізотіоціанатізолектину В4 (уУесіог Іарогайогіез, Вигпіпдате, СА), розведеного за допомогою РВ5, що містить 0,2 95 В5А і 0,1 95 Тийоп Х-100, який зв'язує термінальні залишки В-О-галактози на поверхні ендотеліальних клітин і селективно мітить судинну мережу мишей. Після двох промивань за допомогою РВ5, що містить 0,1 95 Піюп Х-100, обережно відшаровували і відділяли нейросенсорну частину сітківки від оптичного нерва. Робили чотири розслаблюючі радіальні надрізи і комплекс ВРЕ- хоріоїдальна склера, що залишився, поміщали в середовище, що перешкоджає знебарвленню препарату (Ітти Мошпі Месіазпісїй Мошипіїпд Меадішт; Месіог І арогайогіе5), і видаляли покривне скло.
Поміщені в середовище зразки досліджували за допомогою лазерного конфокального скануючого мікроскопа (ТС5 5Р; І еіса, НеїдеІрегуо, Септапу). Судини візуалізували шляхом збудження за допомогою довжини хвилі 488 нм блакитної області видимого спектра аргону і реєстрації емісії між 515 і 545 нм. У всіх дослідженнях зображень використовували об'єктив для масляної імерсії з 40-кратним збільшенням. Одержували горизонтальні оптичні зрізи (із кроком 1 мкм) з поверхні комплексу ВРЕ-хоріоїдальна склера. Було з'ясовано, що найглибшою фокальною площиною, у якій може бути визначена оточуюча хоріоїдальна васкулярна мережа, пов'язана з ураженням, було дно осередку ураження. Будь-яку судину, яка знаходиться в області, на яку був націлений лазер, і яка розташована на поверхні зазначеної вище області, оцінювали як СММ. Зображення кожного зрізу зберігали в цифровому вигляді. Вимірювали площу СММ-зв'язаної флуоресценції, використовуючи комп'ютеризований аналіз зображень за допомогою програмного забезпечення, прикладеного до мікроскопа (ТС5 О9Р; І еїса).
Підсумовування всієї області флуоресценції в кожному горизонтальному зрізі використовували як показник, що характеризує об'єм СММ. Одержання зображень здійснював оператор, якому було невідомо, якій групі тварин було призначене введення лікарських препаратів.
Зо Оскільки на можливість кожного лазерного ушкодження, що приводить до розвитку СММ, впливає його приналежність до тієї або іншій групі (миша, око і лазерна пляма), порівнювали середні об'єми ураження, використовуючи лінійну змішану модель з розщепленими ділянками з повторюваними вимірюваннями. Повним фактором ділянки була генетична група, до якої належали тварини, у той час як фактором розщепленого ділянки було око. Статистична значимість була визначено на рівні 0,05. Проводили апостеріорні порівняння середніх значень за допомогою поправки Бонферроні для множинних порівнянь.
Аналіз фактора росту ендотелію судин (МЕСЕ) методом ЕГІЗА
Через три дні після ушкодження за допомогою 12 лазерних плям, комплекс ВРЕ-хоріоіїдея руйнували ультразвуком у лізисному буфері (20 ммоль імідазол'НСІ, 10 ммоль КСІ, 1 ммоль
Масіг, 10 ммоль ЕСТА, 1 95 Піп Х-100, 10 ммоль Мак, 1 ммоль молібдату натрію і 1 ммоль
ЕОТА з інгібітором протеази) на льоду протягом 15 хвилин. Визначали рівні більа МЕСЕ у надосадовій рідині з використанням набору для аналізу методом ЕГІЗА (К80О 5узіет»в;,
Міппеароїї5, ММ), який дозволяє розпізнати всі сплайс-варіанти при довжині хвилі від 450 до 570 нм (Етах; МоЇесшаг ЮОемісе5, Зиппумаіє, СА), і нормалізували до величини сумарного білка.
Дублюючі вимірювання виконував оператор, який не брав участі у проведенні фотокоагуляції, одержанні зображень або в проведенні ангіографії. Кількості МЕСЕ представляли як середнє значенняжстандартна помилка середнього значення щонайменше у трьох незалежних експериментах і порівнювали, використовуючи ИМ-критерій Манна-Уїтні. Нульову гіпотезу відхиляли при Р«е0,05.
Результати
Оцінка рівнів МЕСЕ
На фігурі 13А графічно представлені рівні білків МЕСЕ у комплексі ВАРЕ-хоріоідея, виділеному у мишей немутантного типу лінії С57В16 і у МА5Р-2(-/-) мишей у нульовий день. Як показано на фігурі 13А, оцінка рівнів МЕСЕ указує на зниження базових рівнів МЕСЕ у мишей
МАБР-2(-/-) у порівнянні з контрольними немутантними мишами лінії С57Б1. На фігурі 138 графічно представлені рівні білків МЕСЕ, виміряні на третій день після індукованого лазером ушкодження. Як показано на фігурі 13В, рівні МЕСЕ значно підвищувалися у немутантних мишей (ж/-) через три дні після індукованого лазером ушкодження, що узгоджується з результатами опублікованих досліджень (Молакі еї аї., Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА, 103:2328-33 бо (2006)). Однак у мишей МА5БР-2(-/-) спостерігалися несподівано дуже низькі рівні МЕСЕ.
Оцінка хоріоїдальної неоваскуляризації (СММ)
Крім зниження рівнів МЕСЕ після індукованої лазером дегенерації жовтої плями, визначали площу СММ до і після лазерного ураження. На фігурі 14 графічно представлений об'єм СММ, виміряний у немутантних мишей лінії С5701 і у МАБР-2(-/-з) мишей на сьомий день після індукованого лазером ушкодження. Як показано на фігурі 14, на сьомий день після індукованого лазером ушкодження у МАЗР-2(-/-) мишей виявлялося приблизно 30 95 зменшення площі СММ у порівнянні з контрольною групою немутантних мишей.
Ці дані вказують на зниження рівнів МЕСЕ і площі СММ, що спостерігаються у МА5Р'(-/-) мишей, у порівнянні з контрольними немутантними мишами (-/х), а також на те, що блокування
МАБР-2 за допомогою інгібітору може виявляти профілактичну або терапевтичну дію при лікуванні дегенерації жовтої плями.
ПРИКЛАД 14
У цьому прикладі показано, що активація тромбіну може виникати після активації лектинового шляху при фізіологічних умовах, і охарактеризований ступінь залучення в патологічний процес МАБР-2. У сироватці здорового щура, активація лектинового шляху приводить до активації тромбіну (оцінюваної по відкладенню тромбіну) одночасно з активацією комплементу (оцінюваною по відкладенню С4). Як можна побачити на фігурах 15А і 158, активація тромбіну в цій системі інгібується блокуючим МА5Р-2 антитілом (у форматі Бар2), що характеризується кривою концентрація-ефект інгібування активації тромбіну (фігура 158), яка проходить паралельно кривій концентрація-ефект інгібування активації комплементу (фігурах 28А). Ці дані дозволяють припустити, що активація лектинового шляху, що виникає при травмі, повинна приводити до активації як системи комплементу, так і коагулюючої системи, у результаті процесу, який повністю залежить від МА5Р-2. У зв'язку із цим можна припустити, що
МАБР-2-блокуючі антитіла можуть виявитися ефективними для зниження частоти випадків виникнення надлишкової системної коагуляції, наприклад дисемінованого внутрішньосудинного згортання, яке є однією з ознак, що приводять до смертності в більшості випадків травм.
ПРИКЛАД 15
У цьому прикладі наводяться результати, одержані при використанні моделі локальної реакції Шварцмана дисемінованої внутрішньосудинної коагуляції (01С) у дефіцитних по МА5Р-
Зо 2-/- мишей і достатніх по МА5БР-2 (4/5) мишей з метою оцінки ролі пектинового шляху при ОІС.
Рівень вивченості проблеми і актуальність
Як описано вище, блокада МАБ5Р-2 інгібує активацію лектинового шляху і знижує генерацію анафілатоксинів СЗа і Сба. Може бути показано, що анафілатоксини СЗа є потужними агрегаторами тромбоцитів іп міїго, але їх участь іп мімо менш вивчена, і вивільнення тромбоцитів і плазміну при загоєнні рани може залучати комплемент ССЗ тільки в другу чергу. У цьому прикладі, вивчали роль лектинового шляху на МА5Р-2(-/-) мишах і немутантних мишах (ж/к) для того, щоб з'ясувати, чи є необхідним тривалий ріст активації СЗ3 для генерації дисемінованої внутрішньосудинної коагуляції.
Методи
Використовуваних у цьому дослідженні МАБР-2(-/-- мишей створювали, як описано в прикладі 1, і проводили їх зворотне схрещування протягом щонайменше 10 поколінь з мишами лінії С57В1/6. У цьому експерименті використовували модель локальної реакції Шварцмана.
Локальна реакція Шварцмана (І 5К) являє собою індуковану ліпополісахаридом (ЛПС) реакцію з добре вивченою участю клітинних і гуморальних елементів вродженої імунної системи. Добре обгрунтована залежність І 5Е від комплементу (Роїак І. еї аї., Маїшге, 223:738-739 (1969); Гопа
У.5. єї аї., У. Ехр. Мед. 134:642-655 (1971)). У моделі І 5Е, вакцинували мишей протягом 4 годин за допомогою фактора некрозу пухлин альфа (500 нг, усередину мошонки), потім мишей анестезували і готовили для прижиттєвої мікроскопії м'яза, що піднімає яєчко. Для спостереження вибирали мережі посткапілярних венул (діаметром 15-60 мкм) з гарним кровотоком (1-4 мм/с). Тварин обробляли флуоресціюючими антитілами для того, щоб селективно позначити нейтрофіли або тромбоцити. Послідовно сканували мережу судин, і зображення всіх судин при останньому аналізі записали в цифровій формі. Після запису базального стану мікроциркуляції мишам вводили ЛПС шляхом разової внутрішньовенної ін'єкції (100 мкг) або окремо, або з перерахованими нижче засобами. Потім цю ж мережу судин сканували кожні 10 хвилин протягом 1 години. Ідентифікували специфічну акумуляцію флуорофорів шляхом віднімання фонової флуоресценції і посилення шляхом порогового представлення яскравості зображення. По записаних зображеннях вимірювали інтенсивність реакцій. Первинною кількісною оцінкою реакцій Шварцмана були зведені дані.
У дослідженнях, порівнювали достатніх по МАБР-2(14/-) мишей або немутантних мишей, що 60 піддавалися впливу або відомої речовини, що ослабляє активацію шляху комплементу,
фактора з отрути кобри (СМР), або інгібітору активації термінальних компонентів комплементу (антагоніста С5ак). Результати (фігура 16А) показують, що СМЕ, також як і антагоніст С5ак, запобігали появі агрегатів у судинній мережі. Крім того, дефіцитні по МАЗР-2(-/-)миші (фігура 168) також характеризувалися повним інгібуванням локальної реакції Шварцмана, що підтверджувало залучення лектинового шляху. Ці результати чітко показують роль МА5Р-2 у генерації БІС ії підтверджують можливість застосування інгібіторів МА5Р-2 для лікування і запобігання БІС.
ПРИКЛАД 16
У цьому прикладі описується дослідження МА5Р-2(-/-) мишей на експериментальній моделі трансплантації нирки на мишах.
Рівень вивченості проблеми і актуальність
Оцінювали роль МА5БР-2 у функціональному результаті трансплантації, використовуючи експериментальну модель на мишах.
Методи
Оцінювали функціональний результат трансплантації нирки, використовуючи ізографт однієї нирки, односторонньо нефректомізованим мишам-реципієнтам, серед яких реципієнтами трансплантата були шість немутантних мишей (/) (Вб) і шість МАЗР-2(-/-) мишей. Для оцінки функції трансплантованої нирки, через 5 днів після пересадження у реципієнта видаляли нативну нирку, що залишилася, і через 24 години оцінювали функцію нирки шляхом вимірювання рівнів азоту сечовини крові (ВОМ).
Результати
На фігурі 17 графічно представлені рівні азоту сечовини крові (ВОМ) нирки у немутантних реципієнтів (ж/к) і МА5Р-2(-/-) реципієнтів на 6 день після трансплантації нирки. Як показано на фігурі 17, сильно підвищені рівні ВОМ спостерігалися у немутантних мишей (7-3 (В6)-реципієнтів трансплантата (нормальні рівні ВОМ у мишей становлять «5 ммоль), що вказувало на ниркову недостатність. На відміну від цього, МА5Р-2(-/-) миші-реципієнти ізографта характеризувалися суттєво більш низькими рівнями ВИМ, що вказувало на поліпшену функцію нирки. Слід зазначити, що ці результати були одержані при використанні графтів від немутантних мишей (14/4)-донорів нирок, що дозволяє припустити, що відсутність тільки функціонального
Зо лектинового шляху у реципієнта трансплантата є достатньою для досягнення позитивного терапевтичного ефекту.
У сукупності ці результати вказують на те, що транзиторне інгібування лектинового шляху через інгібування МАБР-2 являє собою спосіб зниження частоти захворювань і функцію відстроченого трансплантата при трансплантації нирки, і що цей підхід, очевидно, може застосовуватися і в інших випадках трансплантації.
ПРИКЛАД 17
У цьому прикладі показано, що МАБР-2(-/- миші є стійкими до септичного шоку в експериментальній моделі септичного полімікробного перитоніту на мишах.
Рівень вивченості проблеми і актуальність
Для оцінки потенційних ефектів МА5Р-2(-/-) при інфекції, проводили дослідження на моделі лігування і пункції сліпої кишки (СІР), моделі полімікробного септичного перитоніту.
Вважається, що ця модель найбільш точно імітує перебіг септичного перитоніту у людини.
Модель лігування і пункції сліпої кишки (СІ Р) являє собою модель, у якій лігують сліпу кишку і пунктирують голкою, що приводить до постійного проникнення в черевну порожнину бактерій, які через лімфодренаж потрапляють у кров і потім розносяться в усі органи черевної порожнини, викликаючи мультиорганну недостатність і септичної шок (ЕзКапаагі еї аї., 9.
Іттипої. 148(9):2724-2730 (1992)). Модель СІ Р імітує спостережуваний у пацієнтів перебіг сепсису і індукує ранню гіперзапальну реакцію з наступною яскраво вираженою гіпозапальною фазою. Під час цієї фази тварини проявляють високу чутливість до бактеріальних заражень (Міспіептанп егїаї!., у). 5ига. Вев. 29(2); 189-201 (1980)).
Методи
Вимірювали смертність від полімікробної інфекції при використанні моделі лігування і пункції сліпої кишки (СІ Р) на немутантних (ї/-) мишах (п-18) і мишах МАБР-2 (-/-) (п-16). Коротко, дефіцитних по МА5Р-2 мишей і одноприплідних немутантних мишей анестезували, і тимчасово виводити сліпу кишку на поверхню тіла і лігували вище дистального кінчика на 30 95. Після цього, один раз пунктирували сліпу кишку голкою діаметром 0,4 мм. Потім сліпу кишку повертали в черевну порожнину, і шкіру стягували затискачами. Протягом 14 днів після СІ Р, проводили безперервний моніторинг виживаності мишей, підданих СІ Р. Через 16 годин після
СІ Р, у мишей збирали перитонеальний змив для вимірювання бактеріального навантаження. бо Приготовляли послідовні розведення перитонеального змиву в РВ5З і інокулювали в чашках з середовищем Мюллера-Хінтона і потім інкубували при температурі 37 "С у анаеробних умовах протягом 24 годин, після чого визначали бактеріальне навантаження.
Через 16 годин після СІ Р, також вимірювали цитокінову відповідь фактора некрозу пухлини альфа на бактеріальну інфекцію в легенях і селезінці немутантних мишей (ж/ю) і МАБР-2(-/-) мишей методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції в масштабі реального часу (а8т-
РСВ). Крім того, через 16 годин після СІ Р, кількісно визначали методом аналізу "запам/сп
ЕПІЗА" рівень фактора некрозу пухлини альфа в сироватці немутантних мишей (ж/к) і МАЗР-2(- /-у мишей.
Результати
На фігурі 18 графічно представлений відсоток виживаності тварин, підданих СІ Р, залежно від кількості днів, що пройшли після процедури СІ Р. Як показано на фігурі 18, недостатність лектинового шляху у МАБР-2(-/- мишей не підвищує смертність мишей після полімікробної інфекції при використанні моделі лігування і пункції сліпої кишки в порівнянні з немутантними мишами (/5). Однак, як показано на фігурі 19, після СІ Р, у перитонеальному змиві МА5Р-2(-/-) мишей виявляли значно більш високе бактеріальне навантаження (кількість бактерій була приблизно в 1000 разів більше), ніж у одноприплідних немутантних мишей (/к). Ці результати вказують на те, що дефіцитні по МАБР-2(-/-у миші проявляють стійкість до септичного шоку.
Знижене виведення бактерій у дефіцитних по МАбБР-2 мишей у цій моделі може бути обумовлене порушенням СЗБр-опосередкованого фагоцитозу, як це було продемонстровано тим, що відкладення СЗ є МА5Р-2-залежним.
Було виявлено, що цитокінова відповідь фактора некрозу пухлини альфа на бактеріальну інфекцію не підвищувалася у МАБР-2(-/-) мишей у порівнянні з контрольними немутантними мишами (ж-/-) (дані не показані). Також було виявлено, що концентрація фактора некрозу пухлини альфа в сироватці у немутантних мишей (--/-) через 16 годин після СІ Р є значно більш високою в порівнянні з МА5Р-2(-/- мишами, у яких рівень фактора некрозу пухлини альфа в сироватці залишився практично незмінним. Ці результати підтверджують, що інтенсивна запальна відповідь на стан бактеріальної інфекції була ослаблена у МА5ЗР-2(-/-) мишей, що дозволяло тваринам вижити в присутності більш високої кількості бактерій.
У сукупності, ці результати демонструють потенційні негативні впливи лектинового шляху
Зо активації комплементу у випадку загального зараження і підвищену смертність пацієнтів з генералізованим сепсисом. Крім того, ці результати показують, що недостатність МАБР-2 модулює запальну імунну відповідь і знижує рівні експресії медіаторів запалення при сепсисі.
Тому, можна припустити, що інгібування МАБР-2(-/-3 шляхом введення інгібуючих моноклональних антитіл проти МА5БР-2 буде ефективним методом ослаблення запальної відповіді у суб'єкта, що страждає від септичного шоку.
ПРИКЛАД 18
У цьому прикладі описується дослідження МА5Р-2(-/-) мишей на експериментальній моделі інтраназальної інфекції на мишах.
Рівень вивченості проблеми і актуальність
Синьогнійна паличка (Рзеийидотопах аєегидіпоза) являє собою грамнегативний бактеріальний патоген опортуністичної інфекції у людини, який викликає широкий спектр інфекцій, особливо у людей з порушеним імунітетом. Синьогнійна паличка є основним джерелом набутих нозокоміальних інфекцій, зокрема внутрішньолікарняної пневмонії. Вона також обумовлює суттєву захворюваність і смертність пацієнтів з кістозним фіброзом (СЕ). Легенева інфекція синьогнійною паличкою характеризується інтенсивним рекрутингом нейтрофілів і значним запаленням легенів, що приводять до великого ушкодження тканин (РаїапкКі М.5. еї аї., у. Мед.
Спет 51:1546-1559 (2008)).
У цьому прикладі проводили дослідження з метою визначення, чи підвищує видалення лектинового шляху у МАЗР-2(-/-) мишей сприйнятливість до бактеріальних інфекцій.
Методи
Двадцяти двом немутантним мишам (1/5), двадцяти двом МАБР-2(-/-) мишам і одинадцяти
С3(/-) мишам вводили інтраназально бактеріальний штам синьогнійної палички. За мишами постійно спостерігали протягом шести днів після інфікування і будували криві Каплана-Мейєра, що показують відсоток виживаності.
Результати
На фігурі 20 представлена крива відсотка виживання Каплана-Мейєра для немутантних мишей (ж/ю), МАБР-2(-/- мишей або С3(-/- мишей через шість днів після інфікування. Як показано на фігурі 20, не виявлялося ніяких відмінностей при порівнянні МА5Р-2(-/-) мишей з немутантними мишами (жї/5). Однак видалення класичного шляху (С14) у С3(-/-) мишей бо приводило до важкої форми сприйнятливості до бактеріальної інфекції. Ці результати показують, що інгібування МА5БР-2 не підвищує сприйнятливість до бактеріальної інфекції, що вказує на можливість зниження частоти виникнення небажаних запальних ускладнень у травматологічних хворих шляхом інгібування МАБР-2 без погіршення здатності пацієнта протистояти інфекціям, використовуючи класичний шлях комплементу.
ПРИКЛАД 19
У цьому прикладі описується дослідження фармакодинаміки для типових високоафінних фрагментів Рар2 антитіл проти МА5Р-2, які ідентифікували, як описано в прикладі 10.
Рівень вивченості проблеми і актуальність
Як описано в прикладі 10, для ідентифікації антитіл з високою афінністю, які блокують лектиновий шлях у щурів, використовували білок щурячої МАЗР-2 для пошуку у фаговому дисплеї бібліотек антитіл. Ця бібліотека була призначена для забезпечення великої імунологічної різноманітності і була створена з використанням тільки послідовності генів імуноглобулінів людини. Як показано в прикладі 10, у результаті скринінгу методом аналізу
ЕГІЗА було ідентифіковано приблизно 250 індивідуальних клонів фагів, які зв'язуються з білком щурячої МА5Р-2 з високою афінністю. Секвенування цих клонів дозволило ідентифікувати 50 унікальних фагів, кодуючих антитіло МАР5Б-2. Із цих клонів експресували білок Рар2, очищали його і досліджували на предмет афінності зв'язування МА5Р-2 і функціонального інгібування лектинового шляху комплементу.
Як показано в таблиці 6 прикладу 10, у результаті цього аналізу було ідентифіковано 17 фрагментів РабБ2 антитіл проти МАБР-2 з функціональною блокуючою активністю (з коефіцієнтом ефективності пошуку блокуючих антитіл 34 95). Функціональне інгібування лектинового шляху комплементу за допомогою Еара2 виявляли за рівнем відкладення С4, який є прямим показником розщеплення С4 при впливі МАБР-2. Важливо відзначити, що інгібування однаковою мірою підтверджувалося і при оцінці активності СЗ-конвертази, що обгрунтовувало функціональну блокаду лектинового шляху комплементу. 17 Бар2, блокуючих МАЗР-2, ідентифікованих, як описано в прикладі 10, ефективно інгібують утворення СЗ-конвертази з величинами ІСзо, що дорівнюють або менше ніж 10 нмоль. Вісім з 17 ідентифікованих Бар2 характеризуються величиною ІСвто у субнаномолярному діапазоні значень. Крім того, усі 17
ЕБар2, блокуючих МАБР-2, демонстрували практично повне інгібування утворення С3-
Зо конвертази при дослідженні лектинового шляху СЗ-конвертази, як показано на фігурах 8А-С і представлено в таблиці 6 прикладу 10. Більше того, кожний з 17 Рар2, блокуючих анти-МА5Р-2, наведених у таблиці 6, ефективно інгібує генерацію СЗр (295 95), демонструючи, тим самим, специфічність цього аналізу для лектинового шляху СЗ-конвертази.
Варіанти щурячих Ідс2с і мишачих ІдОС2а повнорозмірних ізотипів антитіл одержували з
Бар2 Мо 11. У цьому прикладі описується визначення іп мімо характеристик цих ізотипів для фармакодинамічних параметрів.
Методи
Як описано в прикладі 10, використовували білок щурячої МАБР-2 для пошуку Рар у фаговому дисплеї бібліотек антитіл, з якого був ідентифікований Бар2 Мо 11. Одержували з
Еабр2 Ме 11 варіанти щурячих ІдОо2с і мишачих ІдсСга повнорозмірних ізотипів антитіл. Визначали характеристики щурячих Ідс2с і мишачих Іде2а повнорозмірних ізотипів антитіл іп мімо для фармакодинамічних параметрів, як описано далі.
Дослідження іп мімо на мишах
Для вивчення впливу дозування антитіла проти МА5БР-2 на активність лектинового шляху в плазмі іп мімо, проводили фармакодинамічне дослідження на мишах. У цьому дослідженні, вимірювали відкладення С4 ех мімо при аналізі лектинового шляху в різні моменти часу після підшкірного (5с) і інтраперитонеального (ір) введення 0,3 мг/кг або 1,0 мг/кг мишачого моноклонального антитіла (МоАБ) проти МА5Р-2 (мишачого Ідс2а повнорозмірного ізотипу антитіла, одержаного з Бар2 Мо 11).
На фігурі 21 графічно зображений лектиновий шлях специфічного відкладення С4, виміряний ех мімо у нерозбавлених зразках сироватки, узятих у мишей (п-З3 миші/групу) у різні моменти часу після підшкірного дозування 0,3 мг/кг або 1,0 мг/кг мишачого моноклонального антитіла (МОАБ) проти МА5БР-2. Зразки сироватки мишей, зібрані перед дозуванням антитіла, використовували як негативний контроль (100 95 активність), а сироватку, доповнену іп міго 100 нмоль того ж блокуючого антитіла проти МА5БР-2, використовували як позитивний контроль (0 95 активність).
Результати, наведені на фігурі 21, демонструють швидке і повне інгібування відкладення
С4р після підшкірного введення дози 1,0 мг/кг мишачого моноклонального антитіла (МоАбБ) проти МАБ5Р-2. Часткове інгібування відкладення С4 спостерігалося після підшкірного введення бо дози 0,3 мг/кг мишачого моноклонального антитіла (МоАбБ) проти МА5Р-2.
Відновлення лектинового шляху відбувалося протягом трьох тижнів після однократного інтраперитонеального введення мишачого моноклонального антитіла (МоАБ) проти МАБР-2 мишам у дозі 0,6 мг/кг. Як показано на фігурі 22, різке зниження активності лектинового шляху відбувалося після дозування антитіла з наступним повним інгібуванням лектинового шляху, яке тривало приблизно протягом 7 днів після інтраперитонеального введення. Повільне відновлення активності лектинового шляху спостерігалося протягом другого і третього тижнів з повним відновленням лектинового шляху у мишей через 17 днів після введення мишачого моноклонального антитіла (МоАб) проти МА5Р-2.
Ці результати показують, що мишаче моноклональне антитіло (МоАБ) проти МАБР-2, одержане з Рар2 Мо 11, інгібує лектиновий шлях мишей залежно від дози при системному введенні.
ПРИКЛАД 20
У цьому прикладі описується аналіз ефективності мишачого моноклонального антитіла (МоАБ) проти МАБР-2, одержаного з Бар2 Мо 11, на експериментальній моделі вікової дегенерації жовтої плями на мишах.
Рівень вивченості проблеми і актуальність
Як описано в прикладі 10, використовували білок щурячої МАБР-2 для пошуку Рар у фаговому дисплеї бібліотек антитіл, з якого був ідентифікований Бар2 Мо 11 як функціонально активне антитіло. Генерували з Бар2 Мо 11 ізотипи повнорозмірних антитіл щурячого Ідс2с і мишачого Ідо2а. Визначали характеристики ізотипу повнорозмірного антитіла проти МА5Р-2 мишачого Ід02а для фармакодинамічних параметрів, як описано в прикладі 19. У цьому прикладі, досліджували повнорозмірне антитіло проти мишачої МА5БР-2, одержане з Бар2 Мо 11, на експериментальній моделі вікової дегенерації жовтої плями (АМО) на мишах, яка описана в публікації Вога Р.5. еї аї., У. Іттипої. 174:491-497 (2005).
Методи
Ізотип повнорозмірного антитіла мишачого Ідс2га, одержаний з Бар2 Мо 11, як описано в прикладі 19, досліджували на експериментальній моделі вікової дегенерації жовтої плями (АМО) на мишах, як описано в прикладі 13, з наступними модифікаціями.
Введення моноклональних антитіл (МОоАБ) проти мишачої МА5Р-2
Зо Дві різні дози (0,3 мг/кг і 1,0 мг/кг) моноклональних антитіл (МоАбБ) проти мишачої МА5Р-2, поряд з обробкою моноклональним антитілом (МоАбБ) для ізотипічного контролю, вводили інтраперитонеально немутантним мишам (7/5) (п-8 мишей на групу) за 16 годин до індукування
СМ.
Індукування неоваскуляризації хоріоїдеї (СММ)
Індукування неоваскуляризації хоріоїдеї (СММ) і вимірювання об'єму СММ проводили з використанням лазерної фотокоагуляції, як описано в прикладі 13.
Результати
На фігурі 23 графічно представлена площа СММ, виміряна через 7 днів після лазерного ушкодження у мишей, оброблених моноклональним антитілом (МоОоАбБ) для ізотипічного контролю або моноклональним антитілом (МоАбБ) проти мишачої МАБР-2 (0,3 мг/кг ії 1,0 мг/кг).
Як показано на фігурі 23, у мишей, попередньо оброблених моноклональним антитілом (МоАб) проти МА5Р-2 з дозою 1,0 мг/кг, спостерігалося статистично значиме (р«0,01) приблизно 50 95 зниження СММ через сім днів після впливу лазером. Як далі показано на фігурі 23, було виявлено, що доза 0,3 мг/кг моноклонального антитіла (МоАБ) проти МАБР-2 не виявляла ефективного впливу на зменшення СММ. Слід зазначити, що було виявлено, що доза 0,3 мг/кг моноклонального антитіла (МОАБ) проти МА5Р-2 виявляє часткову і транзиторну інгібуючу дію відносно відкладення С46 після підшкірного введення, як описано в прикладі 19 і показано на фігурі 21.
Результати, описані в цьому прикладі, показують, що блокада МА5БР-2 за допомогою інгібітору, такого як моноклональне антитіло (МоАБ) проти МАБР-2, виявляє профілактичну й/або терапевтичну дію при лікуванні дегенерації жовтої плями. Слід зазначити, що ці результати узгоджуються з результатами, одержаними в дослідженні на МА5Р-2(-/-) мишах, описаному в прикладі 13, у якому через 7 днів після впливу лазером спостерігали 30 95 зниження СММ у МАЗР-2(-/-) мишей у порівнянні з контрольними немутантними мишами. Більше того, результати в цьому прикладі додатково демонструють, що системна доставка антитіла проти МАБР-2 забезпечує місцевий позитивний терапевтичний ефект в оці, підкреслюючи тим самим ефективність системного способу введення при лікуванні пацієнтів з АМО. Таким чином, ці результати є доказом можливості застосування моноклональних антитіл (МоАбБ) проти МАБР- 2 при лікуванні АМО. (510) ПРИКЛАД 21
У цьому прикладі показано, що дефіцитні по МА5Р-2 миші після інфікування менінгококом захищені від смертності, що викликається менінгококом, і характеризуються підвищеним кліренсом при бактеріємії в порівнянні з контрольними немутантними мишами.
Актуальність
Менінгокок являє собою гетеротрофну грамнегативну диплококову бактерію, відому своєю роллю у виникненні менінгіту і інших форм менінгококових захворювань, таких як менінгококемія. Менінгокок є основною причиною захворюваності і смертності в дитячому віці.
Серйозні ускладнення включають септицемію, синдром Уотерхауса-Фрідериксена, недостатність надниркових залоз і дисеміновану внутрішньосудинну коагуляцію (0ІС). Дивіться, наприклад, публікацію Кіпіаіа Е. еї аї., Стйіса! Саге Медісіпе, 28(7):2373-2378 (2000). У цьому прикладі, досліджували роль лектинового шляху на МА5БР-2(-/-) мишах і немутантних мишах (4/5) для того, щоб з'ясувати, чи схильні дефіцитні по МАБР-2 миші до летального кінця, викликаного менінгококом.
Методи
Створювали МА5БР-2 нокаутних мишей, як описано в прикладі 1, і проводили їх зворотне схрещування протягом щонайменше 10 поколінь з мишами лінії С57В1/6. МАБР-2 КО мишей (п-10) ії немутантних мишей С57/86 (п-10) у віці 10 тижнів інокулювали шляхом внутрішньовенної ін'єкції з дозою 5х108 КУО/100 мкл, 2х108 КУО/100 мкл або З3Зх107 КУО/100 мкл менінгокока серогрупи А 22491 в 400 мг/кг декстрану заліза. Постійно спостерігали за виживаністю мишей після інфікування протягом 72 годин. У мишей брали зразки крові через одну годину після інфікування і проводили аналіз з метою визначення рівня менінгокока в сироватки (09 КУО/мл) для підтвердження інфікування і визначення швидкості виведення бактерій із сироватки.
Результати
На фігурі 24А графічно представлений відсоток виживаності МАБР-2 КО мишей і немутантних мишей після введення інфікуючої дози менінгокока 5х108 КУО/ЛО0 мкл. Як показано на фігурі 24А, після інфікування за допомогою найвищої дози менінгокока 5х108
КУО/ЛО0 мкл, виживало 10095 МА5Р-2 КО мишей протягом 72-годин після інфікування. На відміну від цього, тільки 20 956 немутантних мишей залишалися всі живими через 24 години після
Зо інфікування. Ці результати показують, що дефіцитні по МАБР-2 миші захищені від летального кінця, пов'язаного з інфікуванням менінгококом.
На фігурі 248 графічно представлена величина Ід КУО/мл менінгокока, визначена в різні моменти часу в зразках крові, узятих у МАБР-2 КО мишей і немутантних мишей, інфікованих менінгококом 5х108 КУО/100 мкл. Як показано на фігурі 248, у немутантних мишей рівень менінгокока в крові досягав максимального значення, що дорівнює приблизно Ід КУО/мл 6,5, через 24 години після інфікування і знижувався до нуля через 48 годин після інфікування. На відміну від цього, у МАБР-2 КО мишей рівень менінгокока досягав максимального значення, що дорівнює приблизно Ібд КУО/мл 3,5, через 6 годин після інфікування і знижувався до нуля через 36 годин після інфікування.
На фігурі 25А графічно представлений відсоток виживаності МАБР-2 КО мишей і немутантних мишей після інфікування дозою менінгокока 2х108 КУО/100 мкл. Як показано на фігурі 25А, після інфікування дозою менінгокока 2х108 КУО/100 мкл, виживало 100 95 МА5Р-2
КО мишей протягом 72 годин періоду після інфікування. На відміну від цього, тільки 80 9о немутантних мишей залишалися живими через 24 години після інфікування. Відповідно до результатів, показаних на фігурі 24А, ці результати додатково показують, що дефіцитні по
МА5БР-2 миші захищені від летального кінця, що викликається менінгококом.
На фігурі 258 графічно представлена величина Ід КУО/мл менінгокока, визначена в різні моменти часу в зразках крові, узятих у немутантних мишей, інфікованих менінгококом 2х108
КУО/1О00 мкл. Як показано на фігурі 258, рівень менінгокока в крові немутантних мишей, інфікованих 2х108 КУО/100 мкл, досягав максимального значення, що дорівнює приблизно Ід
КУО/мл 4, через 12 годин після інфікування і знижувався до нуля через 24 години після інфікування. На фігурі 25С графічно представлена величина І0д КУО/мл менінгокока, визначена в різні моменти часу в зразках крові, узятих у МА5Р-2 КО мишей, інфікованих менінгококом 2х108 КУО/100 мкл. Як показано на фігурі 25С, рівень менінгокока в крові МАЗР-2 КО мишей, інфікованих 2х108 КУО/100 мкл, досягав максимального значення, що дорівнює приблизно Ід
КУО/мл 3,5, через 2 години після інфікування і знижувався до нуля через З години після інфікування. Відповідно до результатів, показаних на фігурі 24В, незважаючи на те, що МАБР-2
КО мишей інфікували такою ж дозою менінгокока, як і немутантних мишей, МАЗР-2 КО миші мають підвищений кліренс при бактеріємії в порівнянні з немутантними мишами. бо Відсоток виживаності МАБР-2 КО мишей і немутантних мишей після інфікування найнижчою дозою менінгокока З3х107 КУО/100 мкл становив 100 95 протягом 72 годин після інфікування (дані не показані).
Обговорення
Ці результати показують, що дефіцитні по МАБР-2 миші захищені від летального кінця, пов'язаного з менінгококом, і мають підвищений кліренс при бактеріємії в порівнянні з немутантними мишами. Тому, беручи до уваги ці результати, можна очікувати, що терапевтичне застосування інгібіторів МА5Р-2, таких як моноклональне антитіло МАБР-2, буде ефективним при лікуванні, запобіганні або ослабленні інфікування бактеріями менінгокока (тобто сепсису і ріІС). Крім того, ці результати показують, що терапевтичне застосування інгібіторів МА5Р-2, таких як моноклональне антитіло МА5Р-2, не провокує у суб'єкта підвищення ризику зараження менінгококом.
ПРИКЛАД 22
У цьому прикладі описується відкриття нового лектинового шляху, опосередкованого |і
МА5БР-2-залежного альтернативного шляху активації С4 комплементу С3.
Актуальність
Головний позитивний терапевтичний ефект використання інгібіторів активації комплементу для обмеження ушкодження міокарда в результаті ішемії/реперфузії (МІКІ) був переконливо продемонстрований на експериментальній моделі інфаркту міокарда на щурах двадцять років тому. Рекомбінантний 5САК1, розчинне усічене похідне рецептора комплементу типу-1 клітинної поверхні (СК1), вводили внутрішньовенно і оцінювали його дію в експериментальній моделі
МІКІ на щурах. Лікування за допомогою 5СК1 зменшувало обсяг інфаркту більше ніж на 40 95 (МУєївтап, Н.Р. єї аїЇ., Зсіепсє, 249:146-151 (1990)). Терапевтичні можливості цього рекомбінантного інгібітору були потім продемонстровані в клінічному випробуванні, яке показало, що введення 5СК1 пацієнтам з МІ запобігало недостатності скорочувальної функції серця після ішемії (Зпапаєїуа 5. єї аї., Сігсціайоп, 87:536-546 (1993)). Однак, первинний механізм, що приводить до активації комплементу в ішемізованій тканині, остаточно з'ясований не був, в основному, внаслідок відсутності відповідних експериментальних моделей, недостатнього розуміння молекулярних процесів, які приводили до активації комплементу збіднених киснем клітин, і взаємного впливу і синергетичних ефектів між різними шляхами
Зо активації комплементу.
Як основний компонент імунної відповіді, система комплементу забезпечує захист проти уражуючих мікроорганізмів за допомогою як антитілозалежних, так і незалежних механізмів.
Вона керує багатьма клітинними і гуморальними взаємодіями в імунній відповіді, що включають хемотаксис, фагоцитоз, адгезію клітин і диференціювання В-клітин. Три різні шляхи ініціюють каскад реакцій комплементу: класичний шлях, альтернативний шлях і лектиновий шлях.
Субкомпонент розпізнавання Сід класичного шляху зв'язується з цілим рядом мішеней - найбільш важливими імунними комплексами - для ініціювання поетапної активації асоційованих серинпротеаз, Сіг і С15, забезпечуючи головний механізм виведення патогену і імунного комплексу після початку дії адаптивної імунної системи. Зв'язування С14д з імунними комплексами перетворює димер зимогену С1г у його активну форму для розщеплення і, у силу цього, активації С15. С15 транслює зв'язування С14д в активацію комплементу за допомогою двох стадій розщеплення: спочатку відбувається перетворення С4 в С4а і С4р, і потім розщеплення С4р-зв'язаного С2 з утворенням СЗ-конвертази С4рг2а. Цей комплекс перетворює присутній у достатній кількості у плазмі компонент СЗ в СЗа і С3р. Акумуляція СЗр у безпосередній близькості від комплексу С4р2а змінює субстратну специфічність для СЗ на С5 з утворенням С5-конвертази С4р2а(С3Б)п. Комплекси С3- і С5-конвертази, генеровані в результаті активації класичного шляху, ідентичні комплексам, генерованим у результаті активації лектинового шляху. В альтернативному шляху, мимовільний незначний гідроліз компонента СЗ3 приводить до відкладення фрагментів білка на поверхнях клітин, ініціюючи активацію комплементу на сторонніх клітинах, у той час як зв'язані із клітинами регуляторні білки на тканинах організму-хазяїна запобігають активації тим самим запобігаючи самоушкодженню. Так само, як у випадку альтернативного шляху, лектиновий шлях може бути активований за відсутності імунних комплексів. Активація ініціюється шляхом зв'язування мультимолекулярного комплексу активації лектинового шляху з патоген-асоційованими молекулярними патернами (РАМР), в основному з вуглеводними структурами, присутніми на бактеріальних, грибкових або вірусних патогенах, або з патернами аберантного глікозилування на апоптозних, некротичних, злоякісних або збіднених киснем клітинах (Соїага С.О. еї аї., Ат. у.
Раїної. 156:1549-1556 (2000); УММаІрой М.)., М. Епаї. У. Мед. 344:1058-1066 (2001); Зспугаєбрівє М. еї а!., Іттипобіоіоду, 205:455-466 (2002); і Рційа Т., Маї. Кем. Іттипої. 2:346-353 (2002)). бо Мананзв'язуючий лектин (МВІ) був першим субкомпонентом розпізнавання вуглеводів,
відносно якого було показано, що він утворює комплекси з групою нових серинпротеаз, названих МВІ -асоційовані серинпротеази (МА5Р) і пронумерованих відповідно до черговості їх відкриття (тобто МАБР-1, МАБР-2 і МА5Р-3). У людей, комплекси активації лектинового шляху можуть утворюватися з чотирма субкомпонентами альтернативного розпізнавання вуглеводів з різною специфічністю при зв'язуванні вуглеводів, тобто з МВІ-2, і із трьома різними представниками сімейства фіколінів, а саме І -фіколіном, Н-фіколіном і М-фіколіном, і МА5Р. Дві форми МВ, МВІГ. А ї МВІ. С, ї фіколін-А утворюють комплекси активації лектинового шляху з
МА5Р у плазмі мишей і щурів. Авторами винаходу раніше були клоновані і охарактеризовані
МА5Р-2 і додатковий продукт усіченого гена МА5ЗР-2 з масою 19 кДа, позначуваний як МАр19 або 5МАР, у людей, мишей і щурів (Те! 5. еї аІ., Маїшге, 386:506-510 (1997); Біомег С.М. еї аї.,).
Іттипої. 162:3481-3490 (1999); ТаКапнабвні М. еї аї., Ії. Іттипої. 11:859-863 (1999); ії (омег С.М. еї аї., у. Іттипої. 163:6848-6859 (1999)). МАр19/5МАР позбавлений протеазної активності, але може регулювати активацію лектинового шляху шляхом конкуренції з комплексами розпізнавання вуглеводів за зв'язування МАБР (Імакі 0. еї аї., У. Іттипої. 17 7:8626-8632 (2006)).
Існує доказ, який підтверджує, що із трьох МА5БР, тільки МА5Р-2 необхідна для трансляції зв'язування комплексів розпізнавання лектинового шляху в активації комплементу (Тієї 5. еї аї. (1997); Могир-Уепзеп Т. єї аї., У. Іттипої. 165:2093-2100 (2000); ТНіє!ї 5. еї аї., у. Іттипої. 165:878-887 (2000); Вовві М. єї аї., 9У. Віої. Спет. 276:40880-40887 (2001)). Цей висновок підтверджується фенотипом зовсім нещодавно описаного штаму мишей, дефіцитних по МА5Р-1 і МА5БР-3. Якщо не брати до уваги відстрочку початку лектинового шляху, опосередкованого активацією комплементу іп мійго, то дефіцитні по МАБР-1/3 миші зберігають функціональну активність лектинового шляху. Реконструкція дефіцитної по МАБР-1 і МАБР-З3 сироватки за допомогою рекомбінантної МА5Р-1 дозволяє подолати цю відстрочку при активації лектинового шляху, побічно вказуючи на те, що МАБР-1 може сприяти МА5Р-2-активації (Такапабхпі М. еї аї.,
У. Іттипої. 180:6132-6138 (2008)). У останньому дослідженні було показано, що МАБ5Р-1 і також можливо МАБР-3 необхідні для перетворення ферментного фактора 0 активації альтернативного шляху з його зимогенної форми в його ферментативно активну форму (Такапахні М. еї аї., 9). Ехр. Мей. 207:29-37 (2010)). Фізіологічну значимість цього процесу підтверджує відсутність функціональної активності альтернативного шляху в плазмі дефіцитних
Зо по МА5Р-1/3 мишей.
Нещодавно генеровані штами мишей з комбінованими таргетними дефіцитами субкомпонентів розпізнавання вуглеводів лектинового шляху МВІ А і МВІ С усе ще здатні ініціювати активацію лектинового шляху за рахунок мишачого субкомпонента розпізнавання фіколіну А лектинового шляху, що залишився (ТакКапаєзні К. еї аї., Місгобез ІпТесї. 4:773-784 (2002)). Відсутність якої-небудь залишкової функціональної активності лектинового шляху у дефіцитних по МА5БР-2 мишей дозволяє створити обгрунтовану модель для дослідження ролі цієї ефекторної групи вродженого гуморального імунітету в нормі і при патології.
Доступність дефіцитних по С4 і МАБР-2 штамів мишей дає можливість визначення нового лектинового шляху, специфічного, але МА5Р-2-залежного альтернативного шляху активації С4 комплементу СЗ3. Найважливіший внесок цього нового лектинового шляху, опосередкованого альтернативним шляхом активації С4, у втрату тканини після ішемії підтверджується яскраво вираженим захисним фенотипом дефіциту МАБР-2 при ушкодженні міокарда в результаті ішемії/реперфузії (МІКІ), у той час як у дефіцитних по С4 мишей, випробовуваних у цій же моделі, не виявляли цей захист.
У цьому прикладі, описується новий лектиновий шлях, опосередкований і МА5Р-2-залежний альтернативний шлях активації С4 комплементу С3. Фізіологічна значимість цього нового шляху активації встановлена на основі захисного фенотипу дефіциту МА5БР-2 в експериментальній моделі ушкодження міокарда в результаті ішемії/реперфузії (МІКІ), у якій дефіцитні по С4 тварини не були захищені.
Методи
У дефіцитних по МАБР-2 мишей не виявляються важкі форми порушень. Дефіцитних по
МА5Р-2 мишей створювали, як описано в прикладі 1. Як гетерозиготні (ж/-), так і гомозиготні (-/-) дефіцитні по МАБР-2 миші є здоровими і фертильними, і вони не виявляють важких форм порушень. Їх середня тривалість життя аналогічна середній тривалості життя їх одноприплідних немутантних мишей (218 місяців). Перед дослідженням фенотипу цих мишей в експериментальних моделях захворювання, мишей лінії МА5БР-2-/- піддавали поворотному схрещуванню протягом одинадцяти поколінь з мишами лінії С57ВІ /6. Повну відсутність МРНК
МА5БР-2 підтверджували методом нозерн-блотингу препаратів полі (Аж) вибраних РНК печінки, при цьому 1,2 КЬ (тисяча пар нуклеотидів) мРНК, кодуюча МАр19 або 5МАР (усічений продукт бо альтернативного сплайсингу гена МА5БР-2), експресується в надлишку.
Аналіз методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції в масштабі реального часу (98т-
РСРЕ) з використанням пари праймерів, специфічних відносно або кодуючої послідовності для домену серинпротеази МА5БР-2 (В-ланцюг), або залишку кодуючої послідовності для А-ланцюга, показав, що В-ланцюг, кодуючий мРНК, не виявляється у МАБР-2-/- мишей, при цьому надлишок розірваного А-ланцюга мРНК-транскрипту значно збільшувався. Аналогічним чином, надлишок МАр19/5МАР, кодуючого мРНК, збільшується у МА5Р-2-/- мишей і МА5БР-2-/- мишей.
Рівні МА5Р-2 у плазмі, визначені методом ЕГІЗА для 5 тварин кожного генотипу, становили 300 нг/мл для контрольних немутантних мишей (діапазон 260-330 нг/мл), 360 нг/мл для гетерозиготних мишей (діапазон 330-395 нг/мл) і не виявлялися у МАБР-2-/- мишей.
Використовуючи ФАТ-РСЕВ, визначали профілі експресії мРНК, які показували, що МА5Р-2-/- миші експресують мРНК для МВІ А, МВІ С, фіколіну А, МАБР-1, МАБР-З3, Ста, СтТга, С15А, фактора В, фактора 0, С4 ії СЗ3 у надлишку, аналогічному надлишку у випадку достатніх по
МАБ5Р-2 одноприплідних мишей (дані не показані).
Вимірювали рівні СЗ у плазмі МА5Р-2-/- (п-:8) і МАБР-2-/-- (п-:7) одноприплідних мишей, використовуючи комерційно доступний набір тоцизе СЗ ЕГ ІЗА (Капіуа, Віотеаіса!, Зеаше, УМА).
Рівні СЗ3 дефіцитних по МА5Р-2 мишей (середнє значення 0,84 мг/мл - 0,34) були аналогічні рівням контрольних немутантних мишей (середнє значення 0,92--0,37).
Результати
МА5БР-2 має важливе значення для функціональної активності лектинового шляху.
Як описано в прикладі 2 і показано на фігурі 5, іп міго аналізи МА5Р-2-/- у плазмі показали повну відсутність функціональної активності лектинового шляху на активованих покритих мананом і зимозаном поверхнях для активації С4. Аналогічним чином, не виявляли ні залежний від лектинового шляху С4, ні розщеплення СЗ3, в МА5Р-2-/- плазми на поверхнях, покритих М- ацетилглюкозаміном, який зв'язує і ініціює активацію за допомогою МВ А, МВ. С і фіколіну А (дані не показані).
Аналізи сироватки і плазми МА5Р-2-/- мишей однозначно показували, що МА5Р-2 суттєво необхідна для активації комплементу по лектиновому шляху. Однак загальний дефіцит функціональної активності лектинового шляху не зачіпає активації комплементу по інших шляхах. МА5Р-2-/- плазма може все ж таки активувати комплемент по класичному (фігура 26А) і
Зо по альтернативному шляхах (фігура 26В). На фігурі 26А і 268, символ "" позначає сироватку немутантних мишей (МАБР-2 (ї/ю)); символ "ее" позначає сироватку немутантних мишей (виснажених по С14); символ "с" позначає сироватку МА5Р-2 (-/-) мишей і символ "Д" позначає сироватку МАБР-2 (-/-) мишей (виснажених по С14).
На фігурі 26А графічно показано, що у МА5БР-2-/- мишей зберігається функціональний класичний шлях. Відкладення СЗОБ вивчали на титраційних мікропланшетах, з нанесеними імунними комплексами (генерованими іп 5йи шляхом нанесення В5А, потім додавання козячого
Ід проти ВБА). На фігурі 268 графічно показано, що у дефіцитних по МА5Р-2 мишей зберігається функціональний альтернативний шлях. Відкладення СЗЬ вивчали на титраційних мікропланшетах з нанесеним зимозаном в умовах, які роблять можливою тільки активацію альтернативного шляху (буфер, що містить Мд і ЕСТА). Результати, показані на фігурі 26А і фігурі 268, є середніми величинами двох вимірювань і звичайно одержані в трьох незалежних експериментах. На всіх фігурах використовували одні і ті ж символи для позначення даних для плазми. Ці результати показують, що у дефіцитних по МАБР-2 мишей присутній функціональний альтернативний шлях, про що свідчать результати, показані на фігурі 268, при експериментальних умовах, призначених для безпосереднього ініціювання альтернативного шляху, при інактивації як класичного шляху, так і лектинового шляху.
Лектиновий шлях активації комплементу у високому ступені сприяє втраті тканини при запаленні при ушкодженні міокарда в результаті ішемії/реперфузії (МІК).
Для дослідження внеску функціональної активності лектинового шляху в ушкодження міокарда в результаті ішемії/реперфузії (МІКІ), проводили порівняння МАБР-2-/- мишей і контрольних одноприплідних немутантних мишей в експериментальній моделі МІКІ після транзієнтного лігування і реперфузії лівої передньої низхідної гілки коронарної артерії ((ГАБ).
Присутність або відсутність комплементу С4 не відображується на ступені втрати ішемізованої тканини при МІКІ. Проводили оцінку впливу дефіциту С4 на розміри інфаркту після експериментального ушкодження міокарда в результаті ішемії/реперфузії (МІКІ). Як показано на фігурі 27А і фігурі 27В, ідентичні розміри інфаркту виявляли як у дефіцитних по С4 мишей, так і у одноприплідних немутантних мишей. На фігурі 27А графічно представлені дані по МІНВІ- індукованій втраті тканини після лігування і реперфузії ГАО у С4-/- мишей (п-б) і у відповідних їм контрольних одноприплідних немутантних мишей (п-7). На фігурі 278 графічно представлена бо залежність площі інфаркту (ІМЕ) від площі в зоні ризику (ААК), що чітко демонструє, що С4-/-
миші також мають схильність до МІКІ, як і їх контрольні немутантні миші (пунктирна лінія).
Ці результати показують, що дефіцитні по С4 миші не захищені від МІКІ. Такий результат був несподіваним, оскільки він суперечить широко прийнятій точці зору, що головний фрагмент активації С4, С4р, є необхідним компонентом класичного і лектинового шляху СЗ-конвертази
С4рга. Тому, досліджували можливість виявлення залишкової специфічної активації комплементу СЗ по лектиновому шляху в плазмі дефіцитної по С4 миші і людини.
Лектиновий шлях може активувати комплемент СЗ за відсутності С4 за допомогою нового
МА5БР-2-залежного альтернативного шляху активації С4.
Грунтуючись на результатах наукових досліджень минулих років, які вказують на існування альтернативної активації С4 у сироватці дефіцитних по С4 морських свинок (Мау 9.Е. апа Егапк
М., у. Іттипої. 111:1671-1677 (1973)), проводили дослідження наявності у дефіцитних по С4 мишей залишкової функціональної активності класичного або лектинового шляху і постійно реєстрували активацію ССЗ при специфічних до шляху активації умовах дослідження, які виключають внесок альтернативного шляху.
Відкладення СЗБ досліджували на титраційних мікропланшетах з нанесеним мананом, використовуючи декальцифіковану плазму при концентраціях плазми, що перешкоджають альтернативному шляху активації (1,25 95 і нижче). Незважаючи на те, що розщеплення ССЗ не виявлялося в дефіцитній по С4 плазмі, що піддавалася випробуванню на активацію класичного шляху (дані не показані), проте спостерігалася сильна залишкова активність розщеплення С3З у плазмі дефіцитних по С4 мишей при ініціюванні активації комплементу по лектиновому шляху.
Залежність від лектинового шляху демонструється шляхом конкуруючого інгібування розщеплення С3З після попередньої інкубації розведень дефіцитної по С4 плазми з розчинним мананом (дивіться фігуру 28А). Як показано на фігурах 28А-О, виявляли МА5БР-2-залежну активацію ССЗ за відсутності С4. На фігурі 28А графічно представлене відкладення СЗБ під впливом С4-/- (хрестики) і С4-/- (незафарбовані кружки) мишачої плазми. Попереднє інкубування С4-/- плазми з надлишком (1 мкг/мл) манану в рідкій фазі перед дослідженням приводило до повного інгібування відкладення СЗ (зафарбовані кружки). Результати одержані в трьох незалежних експериментах. На фігурі 2888 графічно представлені результати експерименту, у якому плазму (1 95) немутантних, дефіцитних по МА5БР-2 (незафарбовані
Зо квадрати) і С4-/- мишей змішували з різними концентраціями тАБбБМ11 проти щурячої МА5БР-2 (вісь абсцис), і досліджували відкладення СЗБЬ на планшетах з нанесеним мананом. Результати являють собою середні значення (4503) 4 досліджень (два паралельні експерименти для 2 з кожного типу плазми). На фігурі 28С графічно представлені результати експерименту, у якому плазму людини, об'єднану з МН5 (хрестики), С4-/- плазму (незафарбовані кружки) і С4-/- плазму попередньо інкубували з 1 мкг/мл манану (зафарбовані кружки). Результати представляють три незалежні експерименти. На фігурі 280 графічно показане інгібування відкладення СЗБ в достатній по С4 і дефіцитній по С4 плазмі людини (1 95) за допомогою тАбБНЗ проти людської
МА5Р-2 (середні значення-50 трьох паралельних експериментів). Як показано на фігурі 288, не виявляли залежну від лектинового шляху активацію СЗ3 в МАБР-2-/- плазмі, аналізованій паралельно, що означає, що ця С4-альтернативна активація СЗ є МАЗР-2-залежною.
Для додаткового підтвердження цих висновків, був створений ряд рекомбінантних інгібуючих моноклональних антитіл (тАб5), виділених їз фагового дисплея бібліотек антитіл шляхом скринінгу афінності відносно рекомбінантної людської і щурячої МА5БР-2А (де сериновий залишок активного домену протеази заміняли на аланіновий залишок шляхом сайт- спрямованого мутагенезу для запобігання аутолітичній деградації антигену). Рекомбінантні антитіла проти МА5Р-2 (АБВНЗ і АБМ11) виділяли з комбінаторних бібліотек антитіл (Кпаррік А. еї а|., У. Мої. Віо!. 296:57-86 (2000)), використовуючи рекомбінантні людську і щурячу МАЗР-2А як антигени (Спеп С.В. апа Умаїйїв5, 9. Віої. Спет. 276:25894-25902 (2001)). Антищурячий фрагмент
Еар2, який ефективно інгібував опосередковану лектиновим шляхом активацію С4 і С3 у мишачій плазмі (ІСво-1 НМ), перетворювали в повнорозмірне Ідб2а антитіло. Поліклональну антисироватку проти мишачої МАБР-2А індукували в щурах. Ці інструменти дозволяли підтвердити МАБР-2-залежність цього нового лектинового шляху, специфічного до сСа4- альтернативного шляху активації СЗ, додатково описаного нижче.
Як показано на фігурі 288, М211, інгібуюче моноклональне антитіло, яке селективно зв'язується з мишачою і щурячою МАБР-2, інгібувало С4-альтернативну активацію СЗ3 у дефіцитних по С4 мишей, а також активацію ССЗ у плазмі немутантних мишей по лектиновому шляху, залежно від концентрації з аналогічними величинами ІСвхо. Усі дослідження проводили при високих розведеннях плазми, роблячи альтернативний шлях активації дисфункціональним (при цьому найвища концентрація плазми становила 1,25 95). бо Для дослідження присутності аналогічного лектинового шляху, специфічного до сСа4-
альтернативної активації СЗ3 у людини, була проаналізована плазма донора з вродженим дефіцитом обох генів людського С4 (тобто С4А і С4В), що приводить до повної відсутності С4 (Уапд У. еї аї., уУ. Іттипої. 173:2803-2814 (2004)). На фігурі 28С показано, що плазма цього пацієнта ефективно активує СЗ у високих розведеннях плазми (роблячи альтернативний шлях активації дисфункціональним). Особливий метод активації СЗ3 по лектиновому шляху на планшетах з нанесеним мананом продемонстрований в дефіцитній по С4 плазмі мишей (фігура 28А) і в дефіцитній по С4 плазмі людини (фігура 287) шляхом додавання надлишкових концентрацій манану в рідкій фазі. МА5Р-2-залежність механізму цієї активації СЗ в дефіцитній по С4 плазмі людини оцінювали за допомогою АБНЗ, моноклонального антитіла, яке специфічно зв'язує людську МА5Р-2 і пригнічує функціональну активність МА5Р-2. Як показано на фігурі 280, АБНЗ інгібувало відкладення СЗБ (і СЗад) як в достатній по С4, так і в дефіцитній по С4 плазмі людини з порівнянною активністю.
Для оцінки можливої ролі інших компонентів комплементу в С4-альтернативній активації С3З, проводили випробування плазми МА5Р-1/3-/- і ВИС2-/- мишей, поряд з МАЗР-2-/-, б4-/- і С14-/- плазмою (як контролем) при специфічних умовах дослідження як для лектинового шляху, так і для класичного шляху. Будували графічну залежність відносної величини розщеплення С3З від кількості відкладення СЗ при використанні плазми немутантних мишей.
На фігурі 29А графічно представлений порівняльний аналіз активності СЗ-конвертази в плазмі різних штамів комплемент-дефіцитних мишей, що піддавалася випробуванням при специфічних умовах дослідження як для лектинового шляху, так і для класичного шляху. Зразки розведеної плазми (1 9о) немутантних мишей (п-6), МАБР-2-/- мишей (п--4), МАБР-1/3-/- мишей (п-2), С4-/- мишей (п-8), С4/МАБР-1/3-/- мишей (п-8), ВИС2-/- (п-2) і С14д-/- мишей (п-2) піддавали випробуванням паралельно. Реконструкція ВІ/С2-/- плазми за допомогою 2,5 мкг/мл рекомбінантного С2 щура (В/С2-/--С2) відновлювала відкладення СЗ3р. Результати являють собою середні значення (-50), ""р«0,01 (у порівнянні з плазмою немутантних мишей). Як показано на фігурі 29А, спостерігається суттєве відкладення ССЗ в С4-/- плазмі, випробовуваній при специфічних умовах дослідження для лектинового шляху, але при специфічних умовах дослідження для класичного шляху. І в цьому випадку, не спостерігали відкладення СЗ в дефіцитній по МА5Р-2 плазмі в результаті активації лектинового шляху, у той час як у цій же плазмі відбувалося відкладення СЗ по класичному шляху. В МА5Р-1/3-/- плазмі, відкладення СЗ3 відбувається як при специфічних умовах дослідження лектинового шляху, так і при специфічних умовах дослідження класичного шляху. Не виявлялося відкладення ССЗ у плазмі з дефіцитом С4 і МА5БР-1/3, як при використанні специфічних умов дослідження лектинового шляху, так і при використанні специфічних умов дослідження класичного шляху. Не виявляється відкладення СЗ в С2/ВІ-/- плазмі, як по лектиновому шляху, так і по класичному шляху. Однак, реконструкція плазми С2/ВІ-/- мишей за допомогою рекомбінантного С2 відновлювала розщеплення С3, опосередковане як лектиновим шляхом, так і класичним шляхом. Умови дослідження валідизували, використовуючи С14-/- плазму.
На фігурі 298 графічно представлені дані кінетичного дослідження з розрізненням за часом активності СЗ-конвертази в плазмі різних штамів комплемент-дефіцитних немутантних, Ві-/-, С4- /-, МАБР-1/3-/- і МАБР-2-/- мишей, випробовуваній при специфічних умовах дослідження активації лектинового шляху (1 95 плазма, результати звичайно одержують у трьох незалежних експериментах). Як показано на фігурі 298, у той час як розщеплення СЗ у плазмі МА5Р-2-/- не виявлялося, ВІ-/- плазма розщеплювала С3З з кінетикою, аналогічною кінетиці у випадку плазми немутантних мишей. Значне відстрочення в залежному від лектинового шляху перетворенні СЗ в СЗБ (і Сзад) спостерігали в С4-/- плазмі, а також в дефіцитній по МА5Р-1/3 плазмі. Нещодавно було показано, що це відстрочення активації СЗ3 в МА5Р-1/3-/- плазмі повинно бути МАЗР-1- залежним, а не МА5Р-3-залежним (ТакКапазФзнпі М. еї аї., У. Іттипої. 180:6132-6138 (2008)).
Обговорення
Результати, описані в цьому прикладі, дають вагомі підстави припускати, що функціональна активність МАБР-2 є необхідною для активації СЗ по лектиновому шляху як у присутності, так і за відсутності С4. Крім того, С2 і МА5Р-1 є необхідними для того, щоб функціонував цей новий специфічний до лектиновому шляху С4-альтернативний шлях активації С3. Порівняльний аналіз функціональної активності лектинового шляху в МА5Р-2-/- плазмі, а також в С4-/- плазмі виявив існування раніше нерозпізнаного С4-незалежного, але МАБР-2-залежного шляху активації комплементу СЗ і показав, що СЗ3 може бути активований залежним від лектинового шляху способом при повній відсутності С4. Незважаючи на те, що детальні молекулярні композиції і послідовність подій активації цієї нової МАБР-2-залежної СЗ3-конвертази залишаються нез'ясованими, представлені результати означають, що ця С4-альтернативна бо активація вимагає присутності комплементу С2, а також МА5Р-1. Втрата активації розщеплення
С3, опосередкованої лектиновим шляхом, у плазмі мишей з комбінованим дефіцитом СА і
МА5БР-1/3 може бути пояснена зовсім нещодавно описаною роллю МА5БР-1 у посиленні МА5Р- 2-залежної активації комплементу шляхом прямого розщеплення і активації МАБР-2 (ТаКанавні
М. єї аї., уУ. Іттипої. 180:6132-6138 (2008)). Подібним чином, МА5БР-1 може підсилювати функціональну активність МА5Р-2 завдяки її здатності розщеплювати С2 (МоїППег-Кгібіепзеп єї аі., Іпї. Іттипої. 19:141-149 (2007)). Обидві ці активності можуть бути пояснені зниженою швидкістю, з якою дефіцитна по МАБР-1/3 плазма розщеплює ССЗ через активацію по лектиновому шляху, і тим, що для підтримання перетворення СЗ по С4-альтернативному шляху активації може вимагатися МА5Р-1.
Було показано, що нездатність С2/ВІ-/- плазми активувати СЗ по лектиновому шляху є С2- залежною, оскільки додавання рекомбінантного щурячого С2 до С2/ВІі-/- плазми відновлювало здатність реконструйованої плазми активувати СЗ на планшетах з нанесеним мананом.
Висновок про те, що дефіцит С4 специфічно руйнує класичний шлях активації комплементу, у той час як лектиновий шлях підтримує фізіологічно дуже важливий рівень активності С3- конвертази через МАБР-2-залежний С4-альтернативний шлях активації, вимагає переоцінки ролі лектинового шляху в різних експериментальних моделях захворювань, включаючи експериментальну модель пневмококової інфекції (Вгом/п 9. 5. еї аї., Ргос. Маї!. Асайд. зсі. 0. 5.
А. 99:16969-16974 (2002); Ехреї тепіа! Аїегдіс Епсерпаіотуєеїїїв (Вооз Г.А. єї аї., Са 49:158-160 (2005)); і моделі СЗ-залежної регенерації печінки на мишах (Сіагк А. єї аї., Мої. Іттипо). 45:3125-3132 (2008)). Згадана останньою група показала, що дефіцитні по С4 миші можуть незалежним способом активувати СЗ3 по альтернативному шляху, оскільки іп мімо інгібування альтернативного шляху в результаті опосередкованого антитілом виснаження функціональної активності фактора В не виявляла дію на залежну від розщеплення СЗ регенерацію печінки у
С4-/- мишей (СіагкК А. еї аї. (2008)). Цей опосередкований за допомогою лектинового шляху С4- альтернативний шлях активації СЗ може також пояснювати втрату захисного фенотипу дефіциту С4 в моделі МІКІ, а також у раніше описаній моделі відторгнення алотрансплантата нирки (Сіп Т. еї аіІ., Ат. У. Раїйої. 168:1241-1248 (2006)). На відміну від цього, нещодавно одержані результати незалежно продемонстрували важливий захисний фенотип МА5БР-2-/- мишей у моделях трансплантації нирки (Раїтаг С.А. еї аї., Мої. Іттипої. 46:2832 (2009)).
Зо Таким чином, результати цього прикладу підтверджують точку зору, що МА5Р-2-залежна
С4-альтернативна активація СЗ є фізіологічно релевантним механізмом, який може відігравати важливу роль в умовах, коли доступність С4 лімітується активацією С3.
ПРИКЛАД 23
У цьому прикладі описується активація СЗ тромбіновими субстратами і відкладення С3 на манані у немутантних (7/5), МАБР-2 (-/-), Е11 (-/-3, Е11/б4 (-/-) і С4 (-/-у мишей.
Актуальність
Як описано в прикладі 14, було виявлено, що активація тромбіном може виникати після активації лектинового шляху при фізіологічних умовах, і вона характеризує ступінь залучення
МА5БР-2 у патологічний процес. СЗ відіграє центральну роль в активації системи комплементу.
СЗ-активація необхідна для активації комплементу як по класичному, так і по альтернативному шляху. Експеримент проводили з метою з'ясування, чи активується ССЗ тромбіновими субстратами.
Методи
Активація СЗ тромбіновими субстратами
Активацію ССЗ вимірювали в присутності наступних активованих форм тромбінових субстратів: людський ЕСХіа, людський ЕМПа, бичачий ЕХа, людський ЕХа, людський активований білок С і людський тромбін. СЗ3 інкубували з різними тромбіновими субстратами, потім розділяли у відновлювальних умовах на поліакриламідних гелях у присутності 10 Фо додецилсульфату натрію. Після електрофоретичного перенесення з використанням целюлозної мембрани, мембрану інкубували з щурячим моноклональним біотинзв'язаним антитілом проти мишачого С3, визначуваним за допомогою набору стрептавідин-пероксидаза хрону, і проявляли, використовуючи реагент ентерохромафін (ЕСІ).
Результати
Активація СЗ включає розщеплення інтактного а-ланцюга на усічений а'-ланцюг і розчинний
СЗа (не показано на фігурі 30). На фігурі 30 представлені результати аналізу методом вестерн- блотингу активації людського СЗ тромбіновими субстратами, де нерозщеплений альфа-ланцюг
СЗ і продукт активації а'--ланцюг зображені стрілками. Як показано на фігурі 30, інкубування ССЗ з активованими формами людського фактора згортання крові ХІ і фактора Х, а також з активованим бичачим фактора згортання Х, може розщеплювати С3З іп міїго за відсутності яких- 60 небудь протеаз комплементу.
Відкладення СЗ на манані
Дослідження відкладення СЗ проводили на зразках сироватки, одержаної від немутантних,
МАБР-2 (-/-), 11 (-), 11 (/-УС4 (-/) ії Сб4 (7) мишей. Е11 є геном, кодуючим коагуляцію фактора ХІ. Для вимірювання СЗ3-активації, на титраційні мікропланшети наносили шар манану (1 мкг/ямку), потім додавали овечу антисироватку проти НЗА (2 мкг/мл) в ТВ5/мееп/Саг».
Планшети блокували за допомогою 0,1 95 Н5БА в ТВ5 і промивали, як описано вище. Зразки плазми розбавляли в 4 мМ барбіталу, 145 мМ Масі, 2 мМ Сасбсі», 1 мМ Маосі», рН 7,4, додавали в планшети і інкубували протягом 1,5 години при 37 "С. Після промивання, визначали зв'язаний
СЗр, використовуючи кроляче антитіло проти людського СЗс (Бако), потім кон'юговане з лужною фосфатазою козяче антитіло проти кролячого дос і рМРР.
Результати
На фігурі 31 наведені результати дослідження відкладення ССЗ на зразках сироватки, одержаної від немутантних, МАБР-2 (-/-), Е11 (-/-), 11 (-/-уС4 (-/-) і С4 (-/-) мишей. Як показано на фігурі 31, функціональний лектиновий шлях існує навіть при повній відсутності С4. Як далі показано на фігурі 31, для цієї активації комплементу, залежної від нового лектинового шляху, потрібен фактор коагуляції ХІ.
Обговорення
До того, як були одержані результати в цьому експерименті, фахівці в цій галузі вважали, що для активації С4 потрібен лектиновий шлях активації комплементу. Внаслідок цього, дані, одержані на С4 нокаутних мишах (і на дефіцитних по С4 людях), інтерпретували із припущенням, що такі організми є дефіцитними по лектиновому шляху (крім дефіциту класичного шляху). Ці результати показують, що ця думка є помилковою. Так, наприклад, можуть бути помилковими висновки минулих досліджень, що припускають, що лектиновий шлях не є важливим у випадках конкретних захворювань, основаних на фенотипі дефіцитних по С4 тварин. Описані в цьому прикладі дані також показують, що у фізіологічному контексті цільної сироватки, лектиновий шлях може активувати компоненти системи коагуляції. Таким чином, показано, що існує взаємозв'язок між комплементом і коагуляцією за участі МАБР-2.
ПРИКЛАД 24
У цьому прикладі описуються методи оцінки впливу антитіла проти МА5Р-2 на лізис
Зо еритроцитів у зразках крові пацієнтів з пароксизмальною нічною гемоглобінурією (РМН).
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Пароксизмальна нічна гемоглобінурія (РМН), також називана синдромом Маркіафави-Мікелі, являє собою набуте потенційно небезпечне для життя захворювання крові, що характеризується індукованою комплементом внутрішньосудинною гемолітичною анемією.
Відмітною ознакою РМН є хронічний внутрішньосудинний гемоліз, який є наслідком неконтрольованої активації комплементу по альтернативному шляху (І іпдоїТег М.А. еї а!., Віоса 115111) (2010)). Анемія при РМН обумовлена руйнуванням еритроцитів у кровотоку. Симптоми
РМН включають червону сечу внаслідок появи гемоглобіну в сечі і тромбоз. РМН може розвиватися сама по собі, у цьому випадку її називають "первинною РМН", або може бути пов'язана з іншими розладами кісткового мозку, такими як апластична анемія, і в цьому випадку її називають "вторинною РМН". Лікування РМН включає переливання крові у випадку анемії, антикоагуляцію у випадку тромбозу і застосування моноклонального антитіла екулізумабу (Зоїїгі5), яке захищає клітини від імунного ушкодження шляхом інгібування системи комплементу (Ніїтенп Р. єї аї., М. Епаї. У. Мей. 350(6):552-9 (2004)). Однак, у значної частини пацієнтів з РМН, підданих лікуванню екулізумабом, залишаються клінічні прояви імунно-опосередкованої гемолітичної анемії, оскільки антитіло не блокує активацію комплементу по альтернативному шляху.
У цьому прикладі описуються методи оцінки впливу антитіла проти МА5Р-2 на лізис еритроцитів у зразках крові пацієнтів з РМН (що не піддавалися лікуванню за допомогою зоїїгів5), де еритроцити інкубують зі співпадаючою по групі крові підкисленою сироваткою здорової людини.
Методи
Реагенти
Еритроцити здорових донорів і пацієнтів, що страждають від РМН (що не піддавалися лікуванню за допомогою З5оїїгіз), одержують шляхом венопункції і приготовляють, як описано в публікації УмМісох Г.А. єї аї., Віоод 78:820-829 (1991), зміст якої включений в даний винахід шляхом посилання на неї. Антитіла проти МАБР-2 з функціональною блокуючою активністю відносно лектинового шляху можуть бути продуковані, як описано в прикладі 10.
Аналіз гемолізу бо Визначення здатності антитіл проти МАБР-2 блокувати гемоліз еритроцитів у пацієнтів з
РМН проводять, використовуючи методи, описані в публікаціях І іпдопег М.А. еї аї., Віосад, 15(11):2283-91 (2010), ії УМісох Г.А. еї аї., Віоса, 78:820-829 (1991), зміст яких включений в даний винахід шляхом посилання на них. Як описано в публікації І іпаогтег еї а, еритроцити пацієнтів з
РМН центрифугують, лейкоцитарну плівку аспірують і клітини промивають у желатин- вероналовому буфері (ЗМВ) перед кожним експериментом. Еритроцити випробовують на сприйнятливість до АРС-опосередкованого лізису наступним чином. Співпадаючу по групі крові сироватку здорової людини розбавляють за допомогою СМВ, що містить 0,15 мМ Сасіг і 0,5 мМ
МасСіг (2МВ:2), і підкисляють до рН 6,4 (підкислена МН, амнНв) і використовують для відновлення еритроцитів до гематокриту 1,6 95 в 50 95 аМмнНб. Потім суміші інкубують при 37 С, Її, через 1 годину, еритроцити осаджують центрифугуванням. Вимірюють при 405 нм оптичну густину аліквоти витягнутої надосадової рідини і використовують ці дані для розрахунків відсотка лізису. Зразки, відновлені в підкисленій суміші сироватка-ЕОТА, піддають аналогічній обробці і використовують для визначення супутнього не опосередкованого комплементом лізису (звичайно менше З 95). Повний лізис (100 95) визначають після інкубування еритроцитів у дистильованій воді.
Для визначення впливу антитіл проти МА5Р-2 на гемоліз еритроцитів при РМН, еритроцити пацієнтів 3 РМН інкубують в аМмНо5 у присутності поступово зростаючих концентрацій антитіл проти МА5Р-2, і потім кількісно визначають присутність/величину гемолізу.
Беручи до уваги той факт, що було виявлено, що антитіла проти МАБР-2 блокують подальшу активацію комплементу по альтернативному шляху, передбачається, що антитіла проти МАБР-2 можуть ефективно блокувати гемоліз еритроцитів при РМН, опосередкований альтернативним шляхом, і можуть застосовуватися як терапевтичний засіб для лікування пацієнтів, що страждають від РМН.
ПРИКЛАД 25
У цьому прикладі описуються методи оцінки впливу блокуючого антитіла проти МА5Р-2 на активацію комплементу кріоглобулінами в зразках крові пацієнтів, що страждають від кріоглобулінемії.
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Кріоглобулінемія характеризується присутністю кріоглобулінів у сироватці. Кріоглобуліни
Зо являють собою індивідуальні або змішані імуноглобуліни (звичайно ІДМ антитіла), які піддані оборотній агрегації при низьких температурах. Агрегація приводить до активації класичного шляху комплементу і запалення в мережі судин, зокрема на периферії. Клінічні прояви кріоглобулінемії включають васкуліти і гломерулонефрит.
Кріоглобулінемія може бути класифікована на основі композиції кріоглобуліну наступним чином: кріоглобулінемія типу І або проста кріоглобулінемія, обумовлена моноклональним імуноглобуліном, звичайно імуноглобуліном М (І9М); кріоглобулінемія типу Ії ї типу ЇЇ (змішана кріоглобулінемія) включає ревматоїдні фактори (КЕ), які являють собою звичайно ДМ у комплексах з Ес-частиною поліклонального Ідс.
Стани, пов'язані із кріоглобулінемією, включають інфікування вірусом гепатиту С, лімфопроліферативні розлади і інші аутоїмунні захворювання. Кріоглобулінвмісні імунні комплекси викликають клінічний синдром системного запалення, очевидно, внаслідок їх здатності активувати комплемент. Незважаючи на те, що в нормі дсС імунні комплекси активують класичний шлях комплементу, проте ІДМ-вмісні комплекси можуть також активувати комплемент по лектиновому шляху (2папа М. еї аї., Мої. Іттипої. 44(1-3):103-110 (2007), і папд
М. еї аї., У. Іттипої. 177(7):4727-34 (2006)).
Імуногістохімічні дослідження додатково продемонстрували, що імунні комплекси кріоглобуліну містять компоненти лектинового шляху, і біоптати пацієнтів з кріоглобулінемічним гломерулонефритом надали імуногістохімічний доказ активації лектинового шляху іп віш (Онзама І. єї аї., Сіїп. Іттипої. 101(1):59-66 (2001)). Ці результати дозволяють припустити, що лектиновий шлях може сприяти запаленню і несприятливим результатам при кріоглобулінемічних захворюваннях.
Методи
Визначення здатності антитіл проти МА5Р-2 блокувати негативні наслідки кріоглобулінемії проводять із використанням дослідження перетворення СЗ у рідкій фазі, як описано в публікації
Ма У.С. еї а!., АйНтйіз апа ВНештаїївт, 31(1):99-107 (1988), зміст якої включений в даний винахід шляхом посилання на неї. Як описано в публікації Му еї аї., при есенційній кріоглобулінемії змішаного типу (ЕМС), моноклональний ревматоїний фактор (пт), звичайно ІДМ, комплексує поліклональний дб з утворенням характерного кріопреципітату імунних комплексів (ІС) (кріоглобулін типу ІЇ). Імуноглобуліни і СЗ були виявлені на стінках судин в уражених тканинах, 60 таких як шкіра, нервове волокно і тканини нирок. Як описано в публікації Му еї аї., 125І-мічений тЕКЕ додають до сироватки (до сироватки здорової людини і до сироватки пацієнтів, що страждають від кріоглобулінемії), інкубують при 37 2С і вимірюють зв'язування з еритроцитами.
Визначають перетворення С3З у рідкій фазі в сироватці крові (до сироватки здорової людини і до сироватки пацієнтів, що страждають від кріоглобулінемії) у присутності або за відсутності наступних кріопреципітатів імунних комплексів (ІС): В5А-анти ВЗА, те, те плюс Ід або кріоглобуліни, у присутності або за відсутності антитіл проти МА5БР-2. Вимірюють фіксацію СЗ і
С4 із кріопреципітатом імунних комплексів, використовуючи дослідження співосадження з Е(аб')2 анти-СЗ і Каб)» анти-С4.
Беручи до уваги той факт, що було показано, що антитіла проти МАБР-2 блокують активацію лектинового шляху, передбачається, що антитіла проти МА5БР-2 можуть ефективно блокувати опосередковані комплементом негативні наслідки, пов'язані із кріоглобулінемією, і можуть застосовуватися як терапевтичний засіб для лікування пацієнтів, що страждають від кріоглобулінемії.
ПРИКЛАД 26
У цьому прикладі описується методи для оцінки впливу антитіла проти МА5Р-2 на зразки крові пацієнтів із хворобою холодових аглютинінів, яка проявляється у формі анемії.
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Хвороба холодових аглютинінів (САЮ) є типом аутоїмунної гемолітичної анемії. Антитіла холодових аглютинінів (звичайно ІМ) активують при низьких температурах і зв'язують і агрегують з еритроцитами. Антитіла холодових аглютинінів зв'язують із комплементом і впливають на антиген на поверхні еритроцитів. Це приводить до опсонізації еритроцитів (до гемолізу), яка ініціює їх виведення ретикулоендотеліальною системою. Температура, при якій відбувається аглютинація, варіює від пацієнта до пацієнта.
САЮО проявляється у формі анемії. Анемія виникає тоді, коли швидкість руйнування еритроцитів перевищує здатність кісткового мозку продукувати адекватну кількість клітин, що несуть кисень. САЮ може бути викликана основним захворюванням або розладом (у цьому випадку її називають "вторинною САЮ"), таким як інфекційне захворювання (мікоплазма пневмонії, інфекційний паротит, мононуклеоз), лімфопроліферативне захворювання (лімфома, хронічний лімфолейкоз) або порушення сполучної тканини. Вважається, що пацієнти з
Зо первинною САЮ мають незначне лімфопроліферативне ураження кісткового мозку. Як первинна, так і вторинна САО є набутими станами.
Методи
Реагенти
Еритроцити здорових донорів і пацієнтів, що страждають від САЮ, одержують венопункцією.
Антитіла проти МА5Р-2, блокуючі функціональну активність лектинового шляху, можуть бути продуковані, як описано в прикладі 10.
Здатність антитіла проти МАБР-2 блокувати активацію лектинового шляху, опосередковану холодовими аглютинінами, може бути визначена наступним чином. Еритроцити пацієнтів з першою групою крові з позитивним резус-фактором сенсибілізують за допомогою холодових аглютинінів (тобто ІДМ антитіл) у присутності або за відсутності антитіл проти МА5БР-2. Потім еритроцити випробовують на здатність активувати лектиновий шлях шляхом вимірювання зв'язування С3.
Беручи до уваги той факт, що було показано, що антитіла проти МА5Р-2 блокують активації лектинового шляху, передбачається, що антитіла проти МАБР-2 можуть бути ефективними при блокуванні опосередкованих комплементом негативних наслідків, пов'язаних із хворобою холодових аглютинінів, і можуть застосовуватися як терапевтичний засіб для лікування пацієнтів, що страждають від хвороби холодових аглютинінів.
ПРИКЛАД 27
У цьому прикладі описуються методи оцінки впливу антитіла проти МА5Р-2 на лізис еритроцитів у зразках крові мишей з атиповим гемолітичним уремічним синдромом (анНиб).
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Атиповий гемолітичний уремічний синдром (анизх) характеризується гемолітичною анемією, тромбоцитопенією і нирковою недостатністю, що викликаються тромбоцитарними тромбами в капілярах нирки і інших органах. аниз пов'язаний з порушенням регуляції комплементу і може бути або спорадичним, або спадковим. анОЗ пов'язаний з мутаціями в генах, кодуючих активацію комплементу, включаючи фактор комплементу Н, мембранний кофакторний білок В і фактор І, а також фактор комплементу Н-зв'язаний білок 1 (СЕНРК1) і фактор комплементу Н- зв'язаний білок З (СЕНКЗ) (2ірієї Р.Р. еї аї., Ріо5 Сепеїїс5 3(3):е41 (2007)). У цьому прикладі описуються методи оцінки впливу антитіла проти МА5Р-2 на лізис еритроцитів у зразках крові бо мишей з аНнИ5.
Методи
Дія антитіл проти МА5БР-2 при лікуванні ани5 може бути визначена в експериментальній моделі цього захворювання на мишах, у яких ендогенний мишачий ІН ген був замінений на людський гомолог, кодуючий мутантну форму ТН, що часто виявляється у пацієнтів з а8НОБ.
Дивіться публікацію РісКегіпуд М.С. еї аїЇ., у. Ехр. Мей. 204(6):1249-1256 (2007), зміст якої включений в даний винахід шляхом посилання на неї. Як описано в публікації РісКегіпду еї аї., у таких мишей розвивається патологія, подібна ани5. Для оцінки дії антитіл проти МАБР-2 при лікуванні ан, антитіла проти МА5Р-2 вводять мутантним мишам з аниз ії порівнюють лізис еритроцитів, що виникає у мишей, підданих лікуванню антитілами проти МА5Р-2, з лізисом еритроцитів у контрольних не підданих лікуванню мишей. Беручи до уваги той факт, що було показано, що антитіла проти МА5БР-2 блокують активацію лектинового шляху, передбачається, що антитіла проти МАБР-2 можуть бути ефективними при блокуванні лізису еритроцитів у ссавців, що страждають від анив.
ПРИКЛАД 28
У цьому прикладі описуються методи оцінки дії антитіла проти МАБР-2 при лікуванні глаукоми.
Актуальність/рівень вивченості проблеми
Було показано, що неконтрольована активація комплементу сприяє розвитку дегенеративного ушкодження гангліонарних клітин сітківки ока (КОС5), їх синапсів і аксонів при глаукомі (дивіться Тееї 0. єї а!., Іпме5і. ОрпійаїЇтої. Мі5. Зсі. 51:5071-5082 (2010)). Наприклад, гістопатологічні дослідження тканин людини і іп мімо дослідження з використанням різних експериментальних моделей на тваринах показали, що синтезуються компоненти комплементу, включаючи Ст і ССЗ, і в глаукоматозній сітківці утворюється термінальний комплекс комплементу (дивіться 5іаві К. еї а!., Іпме5і. Орпїпа!тої. Мі5. зЗсі. 47:1024-1029 (2006), Киепп
М.Н. еї а!., Ехр. Еуе Вез. 83:620-628 (2006)). Як пізніше описано в публікації Киейп М.Н. еї аї.,
Ехрегпітепіа! Еує Незеагсі, 87:89-95 (2008), синтез і відкладення комплементу індукуються ішемією/реперфузією сітківки, і переривання каскаду реакцій комплементу припиняє дегенеративне ушкодження гангліонарних клітин сітківки ока. У цьому дослідженні, було виявлено, що у мишей з таргетним порушенням компонента комплементу СЗ проявляється
Зо відстрочення дегенеративного ушкодження гангліонарних клітин сітківки ока (КОС) після транзієнтної ішемії/реперфузії сітківки в порівнянні з нормальними тваринами.
Методи
Проводять визначення впливу антитіл проти МАБР-2 на дегенеративне ушкодження гангліонарних клітин сітківки ока (КОС) в експериментальній моделі ішемії/реперфузії сітківки ока на тваринах, як описано в публікації Киейпп М.Н. еї аї., Ехрегітепіаї! Еуе Кезеагсі, 87:89-95 (2008), зміст якої включений в даний винахід шляхом посилання на неї. Як описано в публікації
Киепп еї аї., ішемію сітківки індукують шляхом анестезії тварин, потім введення голки з розміром 30, з'єднаної з резервуаром, що містить забуферений фосфатом фізіологічний розчин, через рогівку в передню камеру ока. Резервуар з фізіологічним розчином потім піднімають вверх для створення внутрішньоочного тиску 104 мм рт.ст., достатнього для повного припинення циркуляції крові через судинну мережу сітківки. Підвищену внутрішньоочну ішемію підтверджують по зблідненню райдужної оболонки, і ішемію сітківки підтримують протягом 45 хвилин тільки в лівому оці; праве око служить як контроль і відносно нього не проводять катетеризації. Потім мишей умертвляють або через 1 тиждень, або через З тижні після ішемічного інсульту. Для оцінки впливу антитіла проти МА5Р, що вводиться до ішемічного інсульту, антитіла проти МА5Р-2 вводять мишам або місцево в око, або системно.
Проводять імуногістохімічні дослідження очей, використовуючи антитіла проти С14 і С3, для виявлення відкладення комплементу. Може бути також оцінене ушкодження зорового нерва, використовуючи стандартні методи електронної мікроскопії. Кількісне визначення гангліонарних клітин сітківки ока (КОС), що вижили, проводять з використанням мітки з гамма-синуклеїну.
Результати
Як описано в публікації Киейп еї аіІ., у контрольних нормальних мишей, транзієнтна ішемія сітківки приводить до дегенеративних змін зорового нерва і до відкладень С14 і СЗ на сітківці, які визначають імуногістохімічним методом. На відміну від цього, дефіцитні по ССЗ миші проявляли помітне зменшення аксональної дегенерації, що характеризується тільки несуттєвими рівнями ушкодження зорового нерва через 1 тиждень після індукування. На основі цих результатів, передбачається, що аналогічні результати можуть бути одержані при проведенні цього дослідження на МА5Р-2 нокаутних мишах, і при введенні антитіл проти МА5Р- 2 нормальним мишам перед індукуванням ішемічного інсульту. (510) ПРИКЛАД 29
У цьому прикладі було показано, що інгібітор МА5Р-2, такий як антитіло проти МА5Р-2, є ефективним для лікування станів після радіоактивного опромінення й/або лікування, полегшення або попередження гострого променевого синдрому.
Актуальність
Опромінення високими дозами іонізуючого випромінювання приводить до летального кінця по наступних двох основних механізмах: токсична дія на кістковий мозок і розвиток шлунково- кишкового синдрому. Токсична дія на кістковий мозок приводить до зниження кількості всіх гематологічних клітин, провокуючи летальний кінець у результаті інфекції і крововиливу.
Шлунково-кишковий синдром являє собою більш важку форму і викликається втратою функції кишкового бар'єра, обумовленою дезінтеграцією епітеліального шару кишечнику, і втратою ендокринних функцій кишечнику. Це призводить до сепсису і пов'язаного з ним синдрому системної запальної відповіді, яка може призводити до смерті.
Лектиновий шлях комплементу являє собою вроджений імунний механізм, який ініціює запалення у відповідь на ушкодження тканини і вплив чужорідних поверхонь (тобто бактерій).
Блокада цього шляху приводить до поліпшення результатів лікування у мишей у моделі ішемічного ушкодження тканини кишечнику або септичного шоку. Висловлене припущення, що лектиновий шлях може ініціювати надмірне і небезпечне запалення у відповідь на ушкодження тканини, викликане радіоактивним випромінюванням. Тому, блокада лектинового шляху може ослабляти вторинне ушкодження і підвищувати виживаність після гострого радіаційного впливу.
Метою проведеного дослідження, описаного в цьому прикладі, є оцінка впливу блокади лектинового шляху на виживаність мишей в експериментальній моделі променевого ураження на мишах шляхом введення антитіл проти мишачої МА5Р-2.
Методи і матеріали
Матеріали
У цьому дослідженні використовували наступні матеріали для випробувань: (ї) високоафінне антитіло проти мишачої МАБР-2 (тАБМІ! 1) і (ії) високоафінне антитіло проти людської МАЗР-2 (птАБНб), які блокують компонент білка МАБР-2 лектинового шляху комплементу, продукованого в трансфікованих клітинах ссавців. Дозовані концентрації становили 1 мг/кг антитіла проти мишачої МАБР-2 (птАБМ!11), 5 мг/кг антитіла проти людської МАБР-2 (тАБНб)
Зо або стерильного фізіологічного розчину. Для кожної процедури дозування приготовляли відповідний об'єм свіжих розчинів для дозування.
Тварини
Молодих дорослих самців мишей лінії Зм/із5-УМереїег одержували з лабораторії Нагіап
І арогаггіез (Ноивіоп, ТХ). Тварин поміщали в клітки з твердим дном з підстилкою АїІрпа-Огі і забезпечували їх сертифікованим кормом для гризунів РМІ 5002 (Апіта! Зресіаціев5, Іпс.,
Нирбага ОК) і водою без обмеження. У клітках для утримання тварин постійно контролювали температуру і установлювали цикл висвітлення 12 годин день/12 годин ніч.
Опромінення
Після акліматизації протягом 2 тижнів у спеціальному приміщенні, проводили опромінення всієї площі поверхні тіла мишей при дозах 6,5 і 7,0 грей у групах по 10 тварин з інтенсивністю дози 0,78 грей/хвилину, використовуючи систему ТПпегарах Х-КАО 320, забезпечену генератором рентгенівського випромінювання з високою стабільністю, металокерамічною рентгенівською трубкою, що працює при 320 кВ, коліматором з варійованою подачею рентгенівського випромінювання і фільтром (Ргесізіоп Х-гау Іпсогрогаїєд, Еавзі Намеп, СТ).
Приготування і введення лікарських засобів
Відповідно до протоколу, визначений об'єм концентрованих вихідних розчинів розбавляли охолодженим на льоду фізіологічним розчином з одержанням розчинів з дозами 0,2 мг/мл антитіла проти мишачої МАБР-2 (птАБМ11) або 0,5 мг/мл антитіла проти людської МА5Р-2 (птАБНб). Введення антитіл проти МАБР-2 тАБМ11 і тАБНб здійснювали за допомогою інтраперитонеальної ін'єкції голкою 25 розміру, виходячи з маси тварини, для доставки 1 мг/кг тАБМІ1, 5 мг/кг тАБНб або фізіологічного розчину, використовуваного як плацебо.
Протокол дослідження
Мишей випадковим чином розподіляли по групах, як зазначено в таблиці 8. Один раз на день вимірювали і реєстрували масу тіла і температуру. Мишей у групах 7, 11 ії 13 умертвляли на 7 день після опромінення, і збирали кров шляхом серцевої пункції під глибокою анестезією.
Тварин, що вижили на 30 день після опромінення, умертвляли тим же способом і збирали кров.
З узятих проб крові приготовляли плазму відповідно до протоколу і повертали її замовнику клінічного дослідження для проведення аналізу.
Таблиця 8
Досліджувані групи
Кількість мишей Рівень
Номер : : . у групі опромінення Лікування Режим дозування ен | ленно | пеня за 18 годин до опромінення, через 2 1 20 6,5 Плацебо години після опромінення, щотижнева бустер-доза
Антитіло проти тільки за 18 годин до 2 20 6,5 мишачої МА5Р-2 опромінення тАБМІ 1
Антитіло проти за 18 годин до 2
З 20 6,5 мишачої МА5Р-2 опромінення, через години після опромінення, (птАБМ'11) щотижнева бустер-доза
Антитіло проти через 2 години після 4 20 6,5 мишачої МАБР-2 опромінення, щотижнева тАБМІ 1 бустер-доза
Антитіло проти за 18 годин до 2 20 6,5 мишачої МА5Р-2 опромінення, через (тАБНВ) години після опромінення, щотижнева бустер-доза за 18 годин до 20 70 Плацебо опромінення, через 2 години після опромінення, щотижнева бустер-доза опромінення
Антитіло проти тільки за 18 годин до 20 7,0 мишачої МАБР-2 опромінення тАБМІ 1
Антитіло проти за 18 годин до 2 20 7,0 мишачої МА5Р-2 опромінення, через години після опромінення, (птАБМ'11) щотижнева бустер-доза
Антитіло проти через 2 години після 7,0 мишачої МА5Р-2 опромінення тАБМІ 1
Антитіло проти тільки через 2 години після 11 5 7,0 мишачої МАБР-2 опромінення тАБМІ 1 за 18 годин до 12 20 70 Антитіло проти МА5Р- | опромінення, через 2 " 2 людини (тАБНб) години після опромінення, щотижнева бустер-доза
Статистичний аналіз
Будували криві виживаності Каплана-Мейєра, і використовували їх для порівняння 5 середнього часу виживання для груп, підданих лікуванню, застосовуючи логарифмічний ранговий критерій і критерій Уїлкоксона. Наводяться середні величини зі стандартними відхиленнями або середні величини зі стандартною величиною помилки середнього. Проводили статистичні порівняння з використанням двостороннього критерію Стьюдента для однієї вибірки між опроміненими тваринами контрольної групи і окремими групами, що піддавалися лікуванню. 10 Результати
Криві виживаності Каплана-Мейєра для груп, опромінених дозами 7,0 і 6,5 грей, представлені на фіг. З2А і 32В, відповідно, і узагальнені в таблиці 9 нижче. Загалом, лікування за допомогою антитіл проти мишачої МАБР-2 (птАБбБМ11) перед опроміненням приводило до підвищення виживаності опромінених мишей у порівнянні з виживаністю опромінених контрольних тварин, яким вводили плацебо, при дозах опромінення 6,5 грей (підвищення на 20 Фо) і 7,0 грей (підвищення на 30 95). При дозі опромінення 6,5 грей, введення антитіла проти мишачої МА5Р-2 після опромінення приводило до помірного підвищення виживаності (на 15 95) у порівнянні з виживаністю контрольних опромінених тварин, яким вводили плацебо.
У порівнянні, у всіх підданих лікуванню тварин при дозі опромінення 7,0 грей спостерігалося підвищення виживаності в порівнянні з виживаністю опромінених контрольних тварин, яким вводили плацебо. Найбільша зміна виживаності спостерігалася у тварин, яким вводили тАбБНнб, а саме підвищення виживаності на 45 95 у порівнянні з контрольними тваринами. Крім того, при дозі опромінення 7,0 грей, перші випадки смертності спостерігалися на 15-й день після опромінення в групах, яким вводили тАбБНб, і на 8-й день після опромінення в групах опромінених контрольних тварин, яким вводили плацебо, тобто виживаність у групі, підданій лікуванню, на 7 днів перевищувала виживаність контрольних тварин. Середній час до загибелі мишей, яким вводили тАрНб (27,3-1,3 дні), був значне вище (р-0,0087) у порівнянні з контрольними тваринами (20,72 дні) при дозі опромінення 7,0 грей.
Протягом усього дослідження реєстрували відсоток зміни маси тіла в порівнянні з масою тіла за день до опромінення (день -1). Тимчасове зниження маси тіла спостерігалося у всіх опромінених тварин, при цьому якої-небудь відмінності в змінах маси тіла у груп, яким вводили тАБМ11 або тАБНб, у порівнянні з контролем, не спостерігалося (дані не показані). Після закінчення дослідження, у всіх тварин, що вижили, спостерігалося збільшення маси тіла в порівнянні з масою тіла до проведення дослідження (день -1).
Таблиця 9
Рівні виживаності випробуваних тварин, підданих опроміненню
Час до загибелі Кількість
Випробувана Рівень опромінення| Виживаність (95) (середнє днів до першого група ЗЕМ) випадку/ останнього днів випадку смерті
Контрольне -
Введення тАБМ'І11 до 6,5 грей 85 90 27,7-4,5 13/17 опромінення
Введення тва до 6,5 грей 65 9 24,042,0 9/15 опромінення
Введення тАБМІ1 після 6,5 грей 80 до 26,3--1,9 9лз опромінення
Введення тАбНнб до і після 6,5 грей 65 96 24,6-1,9 9/19 опромінення
Контрольне -
Введення тАБМ'І11 до 7,0 грей 65 до 23,0-2,3 7/3 опромінення
Введення
РАМ до і 7,0 грей 5Б 9 21,82,2 7/6 після опромінення
Введення тАБМІ1 після 7,0 грей 70 96 243-211 9/14 опромінення
Час до загибелі Кількість
Випробувана Рівень опромінення| Виживаність (95) (середнє днів до першого група ЗЕМ) випадку/ останнього днів випадку смерті
Введення тАбНнб до і після 7,0 грей 80 до 27,31,3" 15/20 опромінення "р-0,0087 за двостороннім критерієм Стьюдента для однієї вибірки для опромінених контрольних тварин і групи опромінених тварин, підданих лікуванню, при одній і тій же дозі опромінення.
Обговорення
Гострий променевий синдром складається із трьох визначених субсиндромів: гематопоетичного, шлунково-кишкового і цереброваскулярного. Спостережуваний синдром залежить від дози опромінення, при цьому гематопоетичні ефекти спостерігаються у людини при значному частковому або повному опроміненні всієї поверхні тіла в дозі, що перевищує 1 грей. Гематопоетичний синдром характеризується сильним пригніченням функції кісткового мозку, що приводить до панцитопенії зі змінами формули крові, кількості еритроцитів, лейкоцитів і тромбоцитів, що супроводжується ураженням імунної системи. У цьому випадку, як мінімум, спостерігаються низькі кількості нейтрофілів і тромбоцитів у периферичній крові, нейтропенія, висока температура і, як ускладнення, сепсис і неконтрольована кровотеча, що приводить до летального кінця.
У даному дослідженні було виявлено, що введення тАбБНб приводить до підвищення виживаності самців мишей лінії Зм/і55-Ууереіег, опромінених по всій площі поверхні тіла рентгенівським випромінюванням у дозі 7,0 грей. Слід зазначити, що при дозі опромінення 7,0 грей у 80 95 тварин, яким вводили тАБНб, тривалість життя становила до 30 днів, тоді як така тривалість життя спостерігалася тільки у 35 95 контрольних опромінених тварин, яким вводили плацебо. Важливо відзначити, що перший випадок загибелі тварин у цій групі, підданій лікуванню, стався тільки на 15-й день після опромінення, тобто на 7 днів пізніше, ніж це спостерігалося у контрольних опромінених тварин, яким вводили плацебо. Цікаво, що при більш низькій дозі рентгенівського опромінення (6,5 грей), введення тАБбНЄ не виявляло якого-небудь впливу на виживаність або не давало якого-небудь відстрочення летального кінця в порівнянні з контрольними опроміненими тваринами, яким вводили плацебо. Така відмінність у реакціях відповіді на різні дози опромінення може бути пов'язана з багатьма причинами, хоча для перевірки будь-якої гіпотези може знадобитися проведення додаткових досліджень, включаючи попереднє збирання проб для аналізу мікробіологічних культур і для оцінки гематологічних параметрів. Одне із простих пояснень може полягати в тому, що число тварин, що належать до зазначених груп, не дозволяє виявити які-небудь незначні відмінності, пов'язані з лікуванням.
Зо Наприклад, у групі з числом тварин, що дорівнює двадцяти (п-:20), у З тварин спостерігалися відмінності у виживаності в інтервалі від 65 95 (тАБНб, при дозі опромінення 6,5 грей) до 80 95 (тптАБНВб, при дозі опромінення 7,0 грей). З іншого боку, у 9 тварин спостерігалися відмінності в інтервалі від 35 95 (плацебо як контроль при дозі опромінення 7,0 грей) до 80 95 (тАБНнб, при дозі опромінення 7,0 грей), що явно свідчить про відмінність результатів, які стосуються груп тварин, що піддавалися лікуванню.
Одержані результати показують, що антитіла проти МАБР-2 є ефективними при лікуванні ссавця, що має ризик виникнення шкідливих впливів гострого променевого синдрому або страждає від шкідливих впливів гострого променевого синдрому.
ПРИКЛАД 30
У цьому прикладі показано, що дефіцитні по МА5Р-2 миші захищені від летального кінця, що викликається менінгококом (Меїі55егіа тепіпойідів) після інфікування або менінгококом серогрупи
А, або менінгококом серогрупи В.
Методи
Нокаутних МА5Р-2 мишей (МА5БР-2 КО мишей) створювали, як описано в прикладі 1. МА5Р- 2 КО мишей у віці 10 тижнів (п-10) і немутантних мишей лінії С57/ВІ 6 (п-10) інокулювали шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції дози 2,6х107 КУО менінгокока серогрупи А 22491 в об'ємі 100 мкл. Інфікуючу дозу вводили мишам у комбінації з декстраном заліза при кінцевій концентрації 400 мг/кг. Спостереження за виживаністю мишей після інфікування проводили протягом 72 годин.
В окремому експерименті, МАБР-2 КО мишей у віці 10 тижнів (п-10) і немутантних мишей лінії С57/ВІ6 (п-10) інокулювали шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції дози бх106 КУО менінгокока серогрупи В штаму МСОС58 в об'ємі 100 мкл. Інфікуючу дозу вводили мишам у комбінації з декстраном заліза при кінцевій концентрації 400 мг/кг. Спостереження за виживаністю мишей після інфікування проводили протягом 72 годин. Для немутантних мишей і
МА5БР-2 КО мишей також проводили оцінку розвитку захворювання в балах протягом 72 годин після інфікування, використовуючи параметри бальної оцінки захворювання, описані нижче в таблиці 10, які основані на схемі, описаній в публікації Егапзеп еї аї. (2010), але з невеликими змінами.
Таблиця 10
Оцінка розвитку захворювання в балах, пов'язана з клінічними ознаками у інфікованих мишей (Нермальні///////711111111110
У мишей брали зразки крові з інтервалами 1 година після інфікування і визначали в них рівень менінгокока в сироватці (09 КУО/мл) для підтвердження наявності інфекції і визначення швидкості виведення бактерій із сироватки.
Результати
На фігурі 33 представлена крива Каплана-Мейєра, що графічно ілюструє відсоток виживання МАБР-2 КО мишей і немутантних мишей після введення інфікуючої дози 2,6х107
КУО менінгокока серогрупи А 22491. Як показано на фігурі 33, 100 95 МАБР-2 КО мишей виживали протягом 72 годин після інфікування. На відміну від цього, тільки 80 95 немутантних мишей (р-0,012) були ще живі через 24 години після інфікування, і тільки 50 95 немутантних мишей були усе ще живі через 72 години після інфікування. Ці результати показують, що дефіцитні по МАБР-2 миші захищені від летального кінця, що викликається інфікуванням менінгококом серогрупи А 22491.
На фігурі 34 представлена крива Каплана-Мейєра, що графічно ілюструє відсоток виживання МА5Р-2 КО мишей і немутантних мишей після введення інфікуючої дози бх105 КУО менінгокока серогрупи В штаму МОС58. Як показано на фігурі 34, 90 95 МАБР-2 КО мишей виживали протягом 72 годин після інфікування. На відміну від цього, тільки 20 95 немутантних мишей (р-0,0022) були усе ще живі через 24 години після інфікування. Ці результати показують,
Зо що дефіцитні по МА5БР-2 миші захищені від летального кінця, що викликається інфікуванням менінгококом серогрупи В штаму МО58.
На фігурі 35 графічно представлена величина 09 КУО/мл менінгокока серогрупи В штаму
МСОС58, визначена в різні моменти часу в зразках крові, узятих у МАБР-2 КО мишей і немутантних мишей після внутрішньоочеревинного інфікування бх105 КУО менінгокока серогрупи В штаму МСОС58 (п-3 у різні моменти часу для обох груп мишей). Результати представлені як середні значення-5ЕМ. Як показано на фігурі 35, у немутантних мишей рівень менінгокока в крові досягав максимального значення приблизно І0д КУО/мл 6,0 через 24 години після інфікування і знижувався до Ід КУО/мл 4,0 через 36 годин після інфікування. На відміну від цього, у МАБР-2 КО мишей рівень менінгокока в крові досягав максимального значення приблизно юд КУО/мл 4,0 через 12 годин після інфікування і знижувався до сд КУО/мл 1,0 через 36 годин після інфікування (символ """ позначає р«0,05, символ """" позначає р-0,0043).
Ці результати показують, що незважаючи на те, що МА5БР-2 КО миші були інфіковані тією ж дозою менінгокока серогрупи В МСОС58, що і немутантні миші, проте МАБР-2 КО миші характеризуються поліпшеним кліренсом бактеріємії в порівнянні з немутантними мишами.
На фігурі 36 графічно представлене середнє значення оцінки розвитку захворювання в балах для МАБР-2 КО мишей і немутантних мишей через 3, 6, 12 і 24 години після інфікування бх105 КУО менінгокока серогрупи В штаму МО58. Як показано на фігурі 36, дефіцитні по МАБР-2 миші характеризувалися високою стійкістю до інфекції з набагато більш низькими бальними оцінками розвитку захворювання через б годин (символ """ позначає р-0,0411), 12 годин
(символ "7" означає р-0,0049) і 24 години (символ "7" позначає р-0,0049) після інфікування в порівнянні з немутантними мишами. Результати на фігурі 36 представлені як середні значення-5ЕМ.
Таким чином, результати цього прикладу демонструють, що дефіцитні по МАБР-2 миші захищені від летального кінця, що викликається менінгококом, після інфікування або менінгококом серогрупи А, або менінгококом серогрупи В.
ПРИКЛАД 31
У цьому прикладі показано, що введення антитіла проти МА5БР-2 після інфікування менінгококом збільшує виживаність мишей, інфікованих менінгококом.
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Як описано в прикладі 10, білок щурячої МА5Р-2 використовували для відбору з фагового дисплея бібліотеки Раб, з якої був ідентифікований Бар? Мо 11 як функціонально активне антитіло. З Бар2 Мо 11 генерували повнорозмірні антитіла проти ізотипів щурячих Ідс2с і мишачих ІдсСга. Повнорозмірне антитіло проти МА5Р-2 ізотипу (Дс52а миші характеризували фармакодинамічними параметрами (як описано в прикладі 19).
У цьому прикладі, повнорозмірне антитіло проти мишачої МА5Р-2, одержане з Рар2 Мо 11, аналізували в експериментальній моделі менінгококової інфекції на мишах.
Методи
Ізотип Їд2а повнорозмірного антитіла проти мишачої МАБР-2, одержаний з Бар2 Мо 11, генерований, як описано вище, випробовували в експериментальній моделі менінгококової інфекції на мишах наступним чином.
Введення моноклонального антитіла (МоАБ) проти мишачої МА5Р-2 після інфікування
Мишам лінії С57/ВІ 6 Спагієз Кімег у віці 9 тижнів вводили інгібуюче антитіло проти мишачої
МАБР-2 (1,0 мг/кг) (п-12) або контрольне ізотипне антитіла (п-10) через З години після внутрішньоочеревинної ін'єкції високої дози (4х105 КУС) менінгокока серогрупи В штаму МО58.
Результати
На фігурі 37 представлена крива Каплана-Мейєра, що графічно ілюструє відсоток виживання мишей після введення інфікуючої дози 4х106 КУО менінгокока серогрупи В штаму
МСО58 з наступним введенням через З години після інфікування або інгібуючого антитіла проти
Зо МА5Р-2 (1,0 мг/кг), або контрольного ізотипного антитіла. Як показано на фігурі 37, 90 95 мишей, яким вводили антитіло проти МА5БР-2, виживали протягом 72 годин після інфікування. На відміну від цього, тільки 50 96 мишей, яким вводили ізотипне контрольне антитіло, виживали протягом 72 годин після інфікування. Символ """ позначає значення р-0,0301, яке визначать шляхом порівняння двох кривих виживання.
Ці результати показують, що введення антитіла проти МАБР-2 дозволяє ефективно проводити лікування і підвищує виживаність суб'єктів, інфікованих менінгококом.
Як показано у винаході, застосування антитіла проти МАБР-2 при лікуванні суб'єкта, інфікованого менінгококом, є ефективним при введенні через З години після інфікування, і передбачається, що його дія буде ефективною протягом від 24 годин до 48 годин після інфікування. Менінгококова інфекція (менінгококемія або менінгіт) являє собою стан, що представляє небезпеку для життя і потребуюче термінової медичної допомоги, і терапію звичайно починають застосовувати негайно, якщо підозрюється наявність менінгококової інфекції (тобто до того, як менінгокок надійно ідентифікований як етіологічний фактор).
На основі результатів для МАБР-2 КО мишей, наведених у прикладі ЗО, вважають, що введення антитіла проти МАБР-2 до інфікування менінгококом також може бути ефективним для запобігання або зменшення негативного впливу інфекції.
ПРИКЛАД 32
У цьому прикладі показано, що введення антитіла проти МАБР-2 ефективне для лікування менінгококової інфекції в людській сироватці.
Актуальність
Пацієнти зі зниженим рівнем функціонального МВІ у сироватці характеризуються підвищеною сприйнятливістю до рецидивуючих бактеріальних і грибкових інфекцій (Кіїраїгіск еї а!І., Віоспіт. Віорпуз. Асіа, 1572: 401-413 (2002)). Відомо, що МВГ. розпізнає менінгокок, і було показано, що дефіцитні по МВГ. сироватки не викликаю лізис менінгокока.
На основі результатів, описаних у прикладах 30 і 31, була проведена серія експериментів для визначення ефективності введення антитіла проти МА5БР-2 при лікуванні менінгококової інфекції в комплемент-дефіцитних сироватках і контрольних сироватках людини. Експерименти проводили при високій концентрації сироватки (20 95) з метою збереження шляху активації комплементу. 60 Методи
1. Бактерицидна активність сироватки в різних комплемент-дефіцитних сироватках людини і у сироватках людини, підданих обробці антитілом проти людської МА5Р-2.
У цьому експерименті використовували наступні комплемент-дефіцитні сироватки людини і контрольні сироватки людини.
Таблиця 11
Зразки сироваток людини, що піддавалися випробуванням (показані на фігурі 38)
Сироватка здорової людини (МН) антитіло (АБ) проти людської МАБЗР-2
В 00001011 |МНОзізотипнеконтрольнеАв.у//:///////:(/«43ии//7777////:/33//-///СсС(С.Ї п Тк: ВО
З комбінаторної бібліотеки антитіл виділяли рекомбінантне антитіло проти людської МА5Р-2 (Кпаррік А. еї аї.,.). Мої. Віоі!., 296:57-86 (2000)), використовуючи рекомбінантне людське МА5Р- 2А як антиген (Спеп С.В. апа Умаїйї5, У. Віої. Спет. 276:25894-25902 (2001)). Ідентифікували одноланцюжковий фрагмент 5сЕм антитіла людини, який ефективно інгібував опосередковану лектиновим шляхом активацію С4 і ССЗ у плазмі людини (ІСво-20 нМ), і перетворювали його в повнорозмірне антитіло проти людського Ідса4.
Інкубували менінгокок серогрупи В-МСО58 з різними сироватками, наведеними в таблиці 11, концентрація кожної з яких становила 2095, з додаванням або без додавання інгібуючого антитіла проти людської МАБР-2 (3 мкг в 100 мкл загального об'єму) при 37 С при перемішуванні. Зразки відбирали в моменти часу через 0, 30, 60 і 90 хвилин, виділяли їх і потім визначали кількість життєздатних мікроорганізмів. Як негативний контроль використовували термоінактивовану сироватку людини.
Результати
На фігурі 38 графічно представлена величина Ід КУО/мл кількості життєздатних менінгококів серогрупи В-МО58, визначена в різні моменти часу в зразках сироватки людини, наведених у таблиці 11. У таблиці 12 наведені результати застосування параметричного 1- критерію Стьюдента для даних, наведених на фігурі 38.
Таблиця 12
Результати застосування параметричного І-критерію Стьюдента для даних, наведених на фігурі 38 (час 60 хвилин) свиня ШИ нтениєтнння
І оо Р.-0,057
Як показано на фігурі 38 і в таблиці 12, комплементзалежна загибель менінгокока в 20 95 сироватці людини значно збільшувалася при додаванні інгібуючого антитіла проти людської
МА5БР-2. 2. Комплементзалежна загибель менінгокока в 20 95 (за об'ємом) мишачих сироватках,
Зо дефіцитних по МА5Р-2.
У цьому експерименті використовували наступні комплемент-дефіцитні мишачі сироватки і контрольні мишачі сироватки.
Таблиця 13
Зразки сироватки миші (показані на фігурі 39) сим СТ хх ким 9 71111111 |Немутантнатермоіїнактивована(НІЄ)Ї/-/:///: С:
Інкубували менінгокок серогрупи В-МО58 з різними комплемент-дефіцитними сироватками миші, концентрація кожної з яких становила 2095, при 37 "С при перемішуванні. Зразки відбирали в моменти часу через 0, 15, 30, 60, 90 і 120 хвилин, виділяли їх і потім визначали кількість життєздатних мікроорганізмів. Як негативний контроль використовували термоінактивовану сироватку людини.
Результати
На фігурі 39 графічно представлена величина Ід КУО/мл кількості життєздатних менінгококів серогрупи В-МСОС58, визначена в різні моменти часу в зразках сироватки миші, показаних у таблиці 13. Як показано на фігурі 39, сироватки МАБР-2-/- мишей мають більш високий рівень бактерицидної активності відносно менінгокока, ніж сироватки немутантних мишей. Символ """" позначає значення р-0,0058, символ "7" позначає значення р-0,001. У таблиці 14 наведені результати застосування параметричного І-критерію Стьюдента для даних, наведених на фігурі 39.
Таблиця 14
Результати застосування параметричного І-критерію Стьюдента для даних, наведених на фігурі 39 дання Ден не нені ви
Порівняння Момент часу) . різниця (04) | значима? Р«0,0572 значень
Таким чином, результати цього прикладу показують, що МАЗР-2-/- сироватка має більш високий рівень бактерицидної активності відносно менінгокока, ніж сироватка немутантних мишей.
ПРИКЛАД 33
У цьому прикладі проілюстрована інгібуюча дія дефіциту МАБР-2 на лізис еритроцитів зразків крові, одержаних в експериментальній моделі пароксизмальної нічної гемоглобінурії (РМН) на мишах.
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Пароксизмальна нічна гемоглобінурія (РМН), також називана синдромом Маркіафави-Мікелі, є набутим, потенційно небезпечним для життя захворюванням крові, що характеризуються індукованою комплементом внутрішньосудинною гемолітичною анемією. Відмітною ознакою
РМН є хронічний опосередкований комплементом внутрішньосудинний гемоліз, який виникає
Зо внаслідок нерегульованої активації комплементу по альтернативному шляху, обумовленої відсутністю регуляторів комплементу СО55 і СО59 на еритроцитах РМН, з наступною гемоглобінурією і анемією (І іпаогег М.А. еї аї., Віоса, 115 (11) (2010), Вівіапо А.М. Міпі-Веміємв іп Медісіпа! Спетівігу, 11:528-535 (2011)). Анемія при РМН викликана руйнуванням еритроцитів у кровотоку. Симптоми РМН включають червону сечу, внаслідок появи гемоглобіну в сечі, болі в спині, утому, задишку і тромбоз. РМН може розвиватися сама по собі, у цьому випадку її називають "первинною РМН", або може бути пов'язана з іншими розладами кісткового мозку, такими як апластична анемія, і в цьому випадку її називають "вторинною РМН". Лікування РМН включає переливання крові у випадку анемії, антикоагуляцію у випадку тромбозу і застосування моноклонального антитіла екулізумабу (5оїїгіє), що захищає клітини від імунного ушкодження шляхом інгібування системи комплементу (НіПтеп Р. еї аї., М. Епої. У Мей. 350(6):552-9 (2004)).
Екулізумаб (ЗоїїгієФ) являє собою гуманізоване моноклональне антитіло, яке таргетоване на компонент комплементу С5 і блокує його розщеплення за допомогою С5-конвертаз, тим самим запобігаючи утворенню Сба і збиранню МАС. Лікування пацієнтів з РМН за допомогою екулізумабу приводить до зменшення внутрішньосудинного гемолізу, вимірюваного лактатдегідрогеназою (ЛДГ), і в наслідок цього до стабілізації гемоглобіну і незалежності від трансфузії приблизно у половини пацієнтів (НіПтеп Р. еї аї., Міпі-Вемієму5 іп Медісіпа! Спетівігу, том 11 (6) (2011). Незважаючи на те, що майже всі пацієнти, що піддаються терапії з екулізумабом, досягають нормальних або майже нормальних рівнів ЛДГ (внаслідок регулювання внутрішньосудинного гемолізу), проте тільки у близько однієї третини пацієнтів рівень гемоглобіну досягає значення вище 11 г/дл, а у інших пацієнтів при лікуванні екулізумабом продовжує з'являтися анемія від помірної до важкої форми (тобто залежної від переливання крові), приблизно в рівному співвідношенні (Кізйапо А.М. еї аї., Віосід, 113:4094- 100 (2009)). Як описано в публікації Кіхйапо еї аї!., Міпі-Вемієм5 іп Медісіпа! Спетівігу, 11:528- 535 (2011), було виявлено, що пацієнти з РМН при лікуванні екулізумабом містили С3- фрагменти, зв'язані зі значною частиною їх еритроцитів РМН (у той час як пацієнти, що не піддавалися лікуванню, їх не містили), що дозволяє зробити висновок про те, що зв'язані з мембраною фрагменти СЗ виконують функцію опсонінів на еритроцитах РМН, що приводить до їх захоплення в ретикулоендотеліальних клітинах через специфічні СЗ-рецептори і наступного позасудинного гемолізу. Тому, для тих пацієнтів, у яких розвивається СЗ-опосередкований позасудинний гемоліз, крім застосування екулізумабу необхідні і інші терапевтичні стратегії, оскільки вони продовжують потребувати переливань еритроцитів.
У цьому прикладі описується метод оцінки впливу дефіцитної по МА5Р-2 сироватки і сироватки, підданої обробці МА5Р-2-інгібуючим засобом, на лізис еритроцитів зразків крові, одержаних в експериментальній моделі РМН на мишах, і продемонстрована ефективність інгібування МА5Р-2 для лікування суб'єктів, що страждають від РМН, а також підтверджується можливість застосування інгібіторів МА5Р-2 для поліпшення стану, пов'язаного з негативними наслідками позасудинного гемолізу, опосередкованого фрагментом С3, у суб'єктів з РМН, що піддаються терапії інгібітором С5, таким як екулізумаб.
Методи
Експериментальна модель РМН на тваринах
Брали зразки крові у ген-таргетиованих мишей з дефіцитами Стгу і С3 (Сіту/С3-/-) ї у
Зо дефіцитних по СО55/СО059 мишей. У цих мишей відсутні відповідні регулятори поверхні комплементу, і, тому, їх еритроцити сприйнятливі до спонтанного автолізу комплементу, як і клітини крові людини з РМН.
Для того, щоб ще більше сенсибілізувати ці еритроцити, ці клітини використовували з нанесенням покриття з манану і без нанесення покриття з манану, і потім тестували їх на гемоліз у плазмі МТ С56/ВІ б, МВ! нульовій плазмі, МА5Р-2-/- плазмі, сироватці здорової людини, МВІ--/- плазмі людини і в сироватці здорової людини, підданій обробці за допомогою антитіла проти людської МАБР-2. 1. Дослідження гемолізу еритроцитів двічі дефіцитних по Сіту/С3З ії СО55/С059 мишей в
МА5Р-2-дефіцитних/виснажених сироватках і контрольних сироватках.
День 1. Приготування мишачих еритроцитів («нанесення покриття з манану)
Матеріали включали: свіжу мишачу кров, ВВ5/Мд2/Саг" (4,4 мМ барбітурової кислоти, 1,8
ММ барбітолу натрію, 145 мм Масі, рН 7,4, 5 мМ Мао?, 5 мМ Са), хлорид хрому, СтСіз-'6НгО (0,5 мг/мл в ВВ5/Ма2:/Саг») і манан, 100 мкг/мл в ВВ5/Мд2:/Саг».
Цільну кров (2 мл) центрифугували протягом 1-2 хв. при 2000х9 у охолоджуваній центрифузі при 4 "С. Плазму і лейкоцитарну плівку відсмоктували. Зразок потім промивали три рази шляхом ресуспендування осаду еритроцитів в 2 мл охолодженому льодом
ВВ5/желатин/Ма2 /Саг: і повторення стадії центрифугування. Після третього промивання, осад ресуспендували в 4 мл ВВ5/Мд/Са?. Аліквоту в об'ємі 2 мл еритроцитів резервували як контроль без нанесеного покриття. До 2 мл, що залишилися, додавали 2 мл СтгСіз і 2 мл манану, і зразок інкубували при обережному перемішуванні при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Реакцію переривали шляхом додавання 7,5 мл ВВ5Б/желатин/Мд2/Са. Зразок центрифугували, як зазначено вище, ресуспендували в 2 мл ВВбБ/желатин/Ма»/Са" і промивали ще два рази, як зазначено вище, потім зберігали при 4 2С.
День 2. Дослідження гемолізу
Матеріали включали ВВ5/желатин/Мд2/Са?: (як зазначено вище), сироватки, що піддаються випробуванням, 96б-ямкові круглодонні і плоскодонні планшети і спектрофотометр, на якому зчитують 96-ямкові планшети при 410-414 нм.
Спочатку визначали концентрацію еритроцитів, і концентрацію клітин доводили до 109/мл і зберігали їх при цій концентрації. Перед використанням, буфер для аналізу розбавляли до бо 108/мл, і потім використовували по 100 мкл на ямку. Гемоліз вимірювали при 410-414 нм (що дозволяло досягати більшої чутливості, ніж при 541 нм). Розведення сироваток, що піддаються випробуванням, приготовляли в льодяному ВВбБ/желатин/Ма2/Са. 100 мкл кожного розведення сироватки розкапували в ямки круглодонного планшета (дивіться макет планшета).
Додавали 100 мкл відповідно розведеного препарату еритроцитів (тобто 108/мл) (дивіться макет планшета), інкубували при 37 "С протягом приблизно 1 години і спостерігали за протіканням лізису. У цей момент планшети можуть бути сфотографовані. Потім планшет центрифугували з максимальною швидкістю протягом 5 хвилин. З рідкої фази відсмоктували 100 мкл, переносили на планшети з плоским дном, і реєстрували оптичну густину (00) при 410-414 нм. Осади еритроцитів зберігали (потім їх можна піддавати лізуванню водою, щоб одержати зворотний результаті).
Експеримент Мо 1
Свіжу кров одержували від СО55/СО59 двічі дефіцитних мишей, а кров двічі дефіцитних мишей Сіту/СЗ3 і еритроцити одержували, як докладно описано у вищевказаному протоколі.
Клітини розділяли, і на половину клітин наносили шар манану, іншу половину залишали необробленою, доводячи кінцеву концентрацію до 1х109 на мл, по 100 мкл із яких використовували в дослідженні гемолізу, яке проводили, як описано вище.
Результати експерименту Мо 1
Лектиновий шлях бере участь у лізисі еритроцитів в експериментальній моделі РМН на тваринах
У початковому експерименті було з'ясовано, що не покриті мананом еритроцити немутантних мишей не піддаються лізису в жодній мишачій сироватці. Далі було виявлено, що мишачі еритроцити, покриті мананом, піддавалися повільному лізису (протягом більше З годин при 37 С) у сироватці немутантних мишей, але не піддавалися лізису в МВІ. нульовій сироватці (дані не показані).
Було встановлено, що покриті мананом еритроцити Стггу-/- мишей швидко лізуються в сироватці людини, але не в інактивованій нагріванням сироватці здорової людини (МН5Б).
Важливо відзначити, що покриті мананом еритроцити Стггу-/- мишей лізувалися в МН5, розведеному до 1/640 (тобто лізис відбувався у всіх розведеннях 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 і 1/640) (дані не показані). При цьому розведенні, альтернативний шлях не функціонує (функціональна
Зо активність альтернативного шляху значно знижується при концентрації сироватки нижче 8 95).
Висновки з експерименту Мо 1
Покриті мананом еритроцити Стггу-/- мишей дуже добре лізуються в сильно розведеній людській сироватці з МВІ, але не в сироватці без МВІ. Ефективний лізис при кожній випробуваній концентрації сироватки означає, що альтернативний шлях не бере участі або не потрібний для цього лізису. Нездатність дефіцитної по МВІ мишачої сироватки і людської сироватки лізувати покриті мананом еритроцити Стгу-/- мишей указує на те, що класичний шлях також не має ніякого відношення до спостережуваного лізису. Оскільки потрібний лектиновий шлях розпізнавання молекул (таких як МВІ), то цей лізис опосередковується лектиновим шляхом.
Експеримент Мо 2
Свіжу кров одержували від Сіту/СЗ3 і СО55/СО059 двічі дефіцитних мишей, і аналізували покриті мананом еритроцити Стгту-/- мишей при дослідженні гемолізу, як описано вище, у присутності наступної людської сироватки: нуль МВІ; немутантна; МН5, попередньо оброблена антитілом проти людської МА5Р-2 і термоіїнактивована МН5 як контроль.
Результати експерименту Мо 2
Інгібітор МАБР-2 запобігає лізису еритроцитів в експериментальній моделі РМН на тваринах
Сироватку здорової людини (МН) з покритими мананом еритроцитами Сігтгу-/- миші інкубували в розведеннях, доведених до 1/640 (тобто 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 і 1/640), МВІ -/- сироватки людини, сироватки здорової людини (МН5), попередньо обробленої моноклональним антитілом проти людської МАБР-2, і термоінактивованої сироватки здорової людини як контролю.
Титраційний мікропланшет ЕГІЗА піддавали центрифугуванню, і нелізовані еритроцити збирали з дна круглодонного планшета. Збирали надосадову рідину з кожної ямки, і вимірювали кількість гемоглобіну, що вивільняється з лізованих еритроцитів, шляхом зчитування оптичної густини при 415 нм (Оба5) у планшет-рідері ЕГІЗА.
У контрольній термоінактивованій МН (негативний контроль), як і очікувалося, лізис не спостерігався. МВІ-/- людська сироватка лізувала покриті мананом еритроцити миші при розведеннях 1/8 і 1/16. Сироватка здорової людини (МН), попередньо оброблена антитілом проти МА5Р-2, лізувала покриті мананом мишачі еритроцити при розведеннях 1/8 і 1/16, тоді як 60 немутантна людська сироватка лізувала покриті мананом мишачі еритроцити до розведення
1/32.
На фігурі 40 графічно представлений гемоліз (фотометрично виміряний по вивільненню гемоглобіну з лізованих мишачих еритроцитів (Стгуу/С3-/-) у надосадову рідину) покритих мананом мишачих еритроцитів при впливі людської сироватки в діапазоні різних концентрацій у випадку термоінактивованої (НІ) сироватки здорової людини (МН), МВІ--/- сироватки, сироватки здорової людини (МН), попередньо обробленої антитілом проти МАЗБР-2, і контрольної сироватки здорової людини (МН5Б).
Результати, зображені на фігурі 40, показують, що інгібування МА5БР-2 за допомогою антитіла проти МАБР-2 значно змінювало величину СНзо і інгібувало опосередкований комплементом лізис сенсибілізованих еритроцитів з недостатнім захистом від аутологічної активації комплементу.
Експеримент Мо З
Свіжу кров одержували від Сіту/СЗ3 і СО55/СО059 двічі дефіцитних мишей, і аналізували еритроцити Сігту-/- мишей, не покриті мананом, при дослідженні гемолізу, як описано вище, у присутності наступної людської сироватки: МВІ/--/- сироватки, немутантної сироватки, сироватки здорової людини, попередньо обробленої антитілом проти МАБР-2, і контрольної термоінактивованої сироватки здорової людини.
Результати
На фігурі 41 графічно представлений гемоліз (фотометрично виміряний по вивільненню гемоглобіну з лізованих еритроцитів немутантної миші в надосадову рідину) не покритих мананом мишачих еритроцитів при впливі людської сироватки в діапазоні різних концентрацій у випадку термоінактивованої (НІ) сироватки здорової людини (МН), МВІ--/- сироватки, сироватки здорової людини (МН), попередньо обробленої антитілом проти МАЗБР-2, і контрольної сироватки здорової людини (МН5). Результати, представлені на фігурі 41, показують, що інгібування МАБР-2 приводить до інгібування опосередкованого комплементом лізису еритроцитів несенсибілізованих немутантних мишей.
На фігурі 42 графічно представлений гемоліз (фотометрично виміряний по вивільненню гемоглобіну з лізованих мишачих еритроцитів (СО55/59-/-у у надосадову рідину) не покритих мананом мишачих еритроцитів при впливі людської сироватки в діапазоні різних концентрацій у
Зо випадку термоінактивованої (НІ) сироватки здорової людини (МН5Б), МВІ--/- сироватки, сироватки здорової людини (МН), попередньо обробленої антитілом проти МАЗБР-2, і контрольної сироватки здорової людини (МН5Б).
Таблиця 12
Значення СНбо залежно від концентрацій сироватки
Примітка: "СНеьо" являє собою значення, при якому опосередкований комплементом гемоліз досягає 50 965.
Таким чином, результати цього прикладу показують, що інгібування МА5Р-2 приводить до інгібування опосередкованого комплементом лізису сенсибілізованих і несенсибілізованих еритроцитів з недостатнім захистом від аутологічної активації комплементу. Тому, інгібітор
МАБ5Р-2 може застосовуватися для лікування суб'єктів, що страждають від РМН, а також може застосовуватися для полегшення (тобто інгібування, запобігання або зменшення тяжкості) позасудинного гемолізу у пацієнтів з РМН, що піддаються лікуванню за допомогою інгібітору С5, такого як екулізумаб (Зоїїгі5Ф).
ПРИКЛАД 34
У цьому прикладі описується додаткове клінічне дослідження до дослідження, описаного вище в прикладі 29, що представляє додатковий доказ того, що інгібітор МА5БР-2, такий як антитіло проти МА5Р-2, є ефективним при лікування радіаційного впливу й/або для лікування, полегшення або запобігання гострому променевому синдрому.
Актуальність
У вихідному дослідженні, описаному в прикладі 29, було показано, що введення мишам до опромінення антитіла проти МА5Р-2 підвищувало виживаність опромінених мишей у порівнянні з опроміненими контрольними тваринами, яким вводили плацебо, при рівнях опромінення 6,5 грей і 7,0 грей. Крім того, у прикладі 29 було продемонстровано, що при рівні опромінення 6,5 грей, введення антитіла проти МА5БР-2 після опромінення приводить до помірного збільшення виживаності в порівнянні з опроміненими контрольними тваринами, яким вводили плацебо. У цьому прикладі описується друге дослідження наслідків у результаті опромінення, яке проводили з метою підтвердження результатів першого дослідження.
Методи
Дизайн дослідження А
Мишей лінії Зм/із5 Ууереег (п-50) піддавали впливу радіаційного випромінювання (8,0 грей).
Оцінювали вплив на смертність терапевтичної дії антитіла проти МАБР-2 (тАБНб 5 мг/кг), що вводиться через 18 годин до опромінення і через 2 години після опромінення, і після цього один раз на тиждень.
Результати дослідження А
Як показано на фігурі 43, було встановлено, що введення антитіла проти МАЗР-2 тАБНб збільшило виживаність у мишей, що піддавалися впливу випромінювання 8,0 грей, при цьому скоректована середня виживаність збільшувалася з 4 до 6 днів у порівнянні з контрольними мишами, яким вводили плацебо, і смертність зменшувалася на 1295 у порівнянні з контрольними мишами, яким вводили плацебо (логарифмічний ранговий критерій, р-0,040).
Дизайн дослідження В
Мишей лінії Зм/і55 Ууеретег (п-50) піддавали впливу радіаційного випромінювання (8,0 грей) у наступних контрольних групах (І: з плацебо) фізіологічний розчин як контроль; (ІЇ: з низьким дозуванням) антитіло проти МАБР-2 тАбБнНЄб (5 мг/кг), що вводиться за 18 годин до опромінення і через 2 години після опромінення; (ІІ: з високим дозуванням) тдАбБнб (10 мг/кг), що вводиться за 18 годин до опромінення і через 2 години після опромінення; і (ІМ: з високим дозуванням після випромінювання) тан (10 мг/кг), що вводиться тільки через 2 години після опромінення.
Результати дослідження В
Введення антитіла проти МАБР-2 до і після опромінення приводило до середньої виживаності від 4 до 5 днів у порівнянні з контрольними тваринами, яким вводили плацебо.
Зо Смертність у мишей, яким вводили антитіла проти МА5Р-2, знижувалася на 6-12 95 у порівнянні з контрольними мишами, яким вводили плацебо. Крім того, було відзначено, що не спостерігалося ніяких суттєвих негативних ефектів при лікуванні (дані не показані).
Таким чином, результати, наведені в цьому прикладі, узгоджуються з результатами, наведеними в прикладі 29, і вони, крім того, демонструють, що антитіла проти МА5БР-2 ефективні при лікуванні ссавця, що має ризик або страждає від негативних наслідків гострого променевого синдрому.
ПРИКЛАД 35
У цьому дослідженні вивчається ефект дефіциту МАБР-2 в експериментальній моделі індукованого ліпополісахаридом (ЛПС) тромбозу на мишах.
Актуальність
Гемолітичний уремічний синдром (НИ5), який викликаний кишковою паличкою, продукуючою шига-токсин, є основною причиною гострої ниркової недостатності у дітей. У цьому прикладі, для визначення ефективності інгібування МАБР-2 з метою інгібування або запобігання утворенню внутрішньосудинних тромбів, використовували експериментальну модель
Шварцмана індукованого за допомогою ЛПС тромбозу (мікросудинної коагуляції) на МАЗР-2-/- (КО) мишах.
Методи
Мишей МАБР-2-/- (п-9) і немутантних мишей (п-10) досліджували в експериментальній моделі Шварцмана індукованого за допомогою ЛПС тромбозу (мікросудинної коагуляції).
Мишам вводили ліпосахарид (ЛПС) бактерії сератія (Зеїтайа) і проводили безперервне спостереження тромбоутворення з перебігом часу. Проводили порівняння частоти виникнення мікротромбів і мікросудинної коагуляції, індукованої за допомогою ЛПС.
Результати
Примітно, що у всіх випробуваних МАЗР-2-/- мишей (9/9) після введення ліпосахариду (ЛПС) бактерії сератія (Зеггайа) внутрішньосудинні тромби не утворювалися. На відміну від цього, мікротромби були виявлені у 7 з 10 тестованих немутантних мишей (р-0,0031, точний тест
Фішера). Як показано на фігурі 44, після інфікування за допомогою ЛПС вимірювали час виникнення мікросудинної оклюзії у МАБР-2-/- мишей і немутантних мишей, виражаючи результати у вигляді відсоткової кількості немутантних мишей з тромбоутворенням, виміряної бо протягом 60 хвилин, причому тромбоутворення виявлялося вже приблизно через 15 хвилин.
Через 60 хвилин тромбоутворення виявлялося аж до у 80 95 немутантних мишей. На відміну від цього, як показано на фігурі 44, через 60 хвилин ні у однієї з МАБ5Р-2-/- мишей тромбоутворення виявлене не було (логарифмічний ранговий критерій: р-0,0005).
Ці результати показують, що інгібування МА5Р-2 захищає від розвитку внутрішньосудинних тромбів у моделі НОБ.
ПРИКЛАД 36
У цьому прикладі описується дія антитіла проти МА5Р-2 в експериментальній моделі НО5 на мишах з використанням внутрішньоочеревинної ін'єкції очищеного токсину Шига 2 (5ТХ2) і лПс.
Рівень вивченості проблеми
Була розроблена експериментальна модель НИЗ она мишах з використанням внутрішньоочеревинної ін'єкції очищеного токсину Шига 2 (5Т1Х2) і ЛПС. Біохімічний і мікроматричний аналіз нирок мишей показав, що вплив 5І1Х2 плюс ЛПС відрізняється від впливу кожного із цих засобів окремо. Аналіз крові і сироватки цих мишей виявив нейтрофілію, тромбоцитопенію, гемоліз еритроцитів і підвищені вмісти креатиніну в сироватці і азот сечовини в крові. Крім того, гістологічний аналіз і електронна мікроскопія нирок миші виявили осадження фібрину в клубочках, конгестію еритроцитів, утворення мікротромбів і зміни ультраструктури клубочків. Було встановлено, що ця експериментальна модель НО5З на тваринах викликає у мишей лінії С57ВІ /6 усі клінічні симптоми людської НО5-патології, включаючи тромбоцитопенію, гемолітичну анемію і ниркову недостатність, які визначають хворобу людини (у. Іттипої. 187(11):172-80 (2011)).
Методи
Самки мишей лінії С57ВІ /6, які важили від 18 до 20 г, були придбані у фірми Спагіеє5 Кімег
І арогайогієз і розділені на 2 групи (по 5 мишей у кожній групі). Одній групі мишей попередньо внутрішньоочеревинно вводили рекомбінантне антитіло проти МАБР-2 тАБМ11 (100 мкг на мишу, що відповідає кінцевій концентрації 5 мг/кг маси тіла), розведеного в загальному об'ємі 150 мкл фізіологічного розчину. Контрольній групі вводили фізіологічний розчин без якого- небудь антитіла. Через шість годин після ін'єкції антитіла проти МА5Р-2 тАБМ!11, усім мишам комбіновано внутрішньоочеревинно вводили сублетальну дозу (3 мкг/тварину, що відповідає 150 мкг/кг маси тіла) ЛІС Зеїтайца тагсезсепз (16136, 5Бідта-Аїйагісп, 2. Гоці5, МО) і дозу 4,5 нг на тварину (що відповідає 225 нг/кг) ЗТХ2 (у два рази вище І О5о) у загальному об'ємі 150 мкл.
Введення фізіологічного розчину використовували для контролю.
Після дозування, проводили спостереження за виживанням мишей кожні б годин.
Вибраковували мишей, як тільки вони досягали летаргічної стадії патології НО5. Через 36 годин, усіх мишей вибраковували і видаляли у них обидві нирки для імуногістохімічного аналізу і скануючої електронної мікроскопії. Зразки крові відбирали наприкінці експерименту шляхом пункції серця. Сироватку відділяли і зберігали замороженою при -80 "С для вимірювання рівнів азоту сечовини в крові і креатиніну в сироватці як у групах, які були піддані обробці, такі в контрольних групах.
Імуногістохімічний аналіз
Одну третину кожної нирки миші фіксували в 4 95 параформальдегіді протягом 24 годин, піддавали процесу обробки і заливали парафіном. Приготовляли гістологічні зрізи товщиною три мікрони і поміщали їх на підготовлені стекла для наступного забарвлення за допомогою гематоксиліну і еозину.
Електронна мікроскопія
Середню частину нирок розрізали на блоки розміром приблизно від 1 до 2 мм3 і фіксували протягом ночі при 4 С у 2,5 95 глутаральдегіді в їхРВ5. Потім фіксовану тканину досліджували на установці електронної мікроскопії Опімегеу ої І еісехіег ЕІесігоп Місгозсору Расіїйу.
Кріостатні зрізи
Іншу одну третину нирок розрізали на блоки з розміром приблизно 1-2 мм3 і заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80 "С для кріостатних зрізів і аналізу мРНК.
Результати
На фігурі 45 графічно представлений відсоток виживання мишей, яким вводили фізіологічний розчин (п-5), і мишей, яким вводили антитіло проти МА5Р-2 (п-5), у моделі, індукованій за допомогою ЗТХ/ЛПС, з перебігом часу (годин). Примітно, що, як показано на фігурі 45, усі контрольні миші гинули через 42 години. На відміну від цього, 100 95 мишей, яким вводили антитіло проти МА5Р-2, були живі протягом усього часу експерименту. Відповідно до результатів, показаних на фігурі 45, було виявлено, що всі миші, яким не вводили антитіло проти МАБР-2, або гинули, або були вибракувані з ознаками важкого захворювання, бо характеризувалися значними ушкодженнями клубочків, тоді як клубочки всіх мишей, яким вводили антитіло проти МАБР-2, виглядали нормально (дані не показані). Ці результати показують, що інгібітор МА5Р-2, такий як антитіла проти МА5БР-2, може застосовуватися для лікування суб'єктів, що страждають тромботичною мікроангіопатією (ТМА) або мають ризик розвитку тромботичної мікроангіопатії (ТМА), такої як гемолітичний уремічний синдром (НИБ), атиповий НИЗ (аНниб) або тромботична тромбоцитопенічна пурпура (ТТР).
ПРИКЛАД 37
У цьому прикладі описується ефект дефіциту МАБР-2 і інгібування МАБР-2 в експериментальній моделі тромбозу на мишах у результаті ушкодження ендотеліальних клітин, індукованого РІТС-декстраном/світлом.
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Як показано в прикладах 35 і 36, дефіцит МАЗР-2 (МАБР-2 КО) і інгібування МА5Р-2 (шляхом введення інгібуючого антитіла МАБР-2) захищає мишей у моделі типового НО5, у якій у всі контрольних мишей, що піддавалися впливу 5ТХ і ЛПС, розвивалася важка форма НИХ, і миші починали агонізувати або гинути протягом 48 годин. Наприклад, як показано на фігурі 54, виживали всі миші, яким вводили МА5Р-2-інгібуюче антитіло і яких потім піддавали впливу 51Х і
ЛПС (точний критерій Фішера р«0,01; М-5). Таким чином, анти-МА5Р-2-терапія захищає мишей у цій моделі НОВ.
Були проведені наступні експерименти по аналізу ефекту дефіциту МА5Р-2 і інгібування
МА5БР-2 в експериментальній моделі тромботичної мікроангіопатії (ТМА) на мишах у результаті ушкодження ендотеліальних клітин, індукованого флуоресцеїном ізотіоціанату (РІТС)- декстраном, щоб ще раз продемонструвати перевагу інгібіторів МА5БР-2 при лікуванні НОБ, анизв, ТР і ТМА з іншими етіологіями.
Методи
Прижиттєва мікроскопія
Мишей готували для прижиттєвої мікроскопії, як описано у публікації Еготтпвоїа еї аіІ.,, ВМС
Ітітипоїоду, 12:56-68, 2011. Коротко, мишей анестезували шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції кетаміну (125 мг/кг маси тіла, Кеїапевзі, Рійлег зтрнН, Кагізгипйе, Септапу) і ксилазину (12,5 мг/кг маси тіла, Котрип, Вауег, І емегкизхеп, Септапу), і поміщали їх на підстилку з підігрівом для підтримання температури тіла на рівні 37 "С. Прижиттєву мікроскопію проводили
Зо на прямому мікроскопі (І еіса, УУеїлаг, сегтапу) з імерсійним (фізіологічний розчин) об'єктивом (збільшення 40/0,75 числова апертура, 2еїі55, Уепа, Сегтапу). Для полегшення дихання мишей інтубували з використанням трубки з поліетилену РЕ 90 (Весіоп біскбзоп апа Сотрапу, 5рагкв,
МО, О5А). Ліву сонну артерію канюлювали за допомогою трубки з РЕ 10 (Весіоп ріскзоп апа
Сотрапу, Зрагк5, МО, О5А) для відбору проб крові і системного введення моноклонального антитіла (тАБбБ).
Приготування препарату м'яза, що піднімає яєчко
Хірургічне препарування м'яза, що піднімає яєчко, для прижиттєвої мікроскопії проводили, як описано в публікації б5регапаїйо еї аї., Віоса, 97:3812-3819, 2001. Коротко, розрізали мошонку, і робили рухливим м'яз, що піднімає яєчко. Після поздовжнього розрізу і розподілу м'яза на покривному склі, епідидиміс і яєчка переміщали у бік і закріплювали для повного доступу мікроскопа до капілярного кровообігу в м'язі, що піднімає яєчко. Венули м'яза, що піднімає яєчко, реєстрували за допомогою відеокамери на основі пристрою з зарядовим зв'язком (СЕ8/1;
Карра, СіІвіспеп, Септапу) на реєструючому пристрої Рапазопіс 5-МН5. М'яз, що піднімає яєчко, оббризкували терморегульованим (35 С) забуференим бікарбонатом фізіологічним розчином, як раніше описано в публікації Еготтпвоїа еї а!І., ВМС Іттипоїіоду, 12:56-68, 2011.
Фотозбудження моделі ушкодження, викликаного РІТС-Декстраном
Викликали контрольоване залежне від дози опромінення світла судинне ушкодження ендотелію венул і артеріол м'яза, що піднімає яєчко, шляхом збудження фототоксичної дії РІТС- декстрану (Мо за каталогом ЕО1505, Бідта Аїйгісй, РооЇе, 0О.К.). Ця процедура ініціює локалізований тромбоз. Як фототоксичний реагент вводили 60 мкл 10 95 (маса на одиниці об'єму) розчину РІТС-декстран через доступ до лівої сонної артерії і дозволяли йому гомогенно поширитися в циркулюючій крові протягом 10 хвилин. Після вибору добре перфузованої венули, фокусували світло галогенної лампи з інтенсивністю від низької до середньої (800-1500) на досліджуваній судині з метою індукування флуоресценції РІТС-декстрану і фототоксичності, від низької до помірної, для ендотеліальної поверхні для стимулювання відтворюваного контрольованого тромбозу. Необхідну фототоксичну інтенсивність світла для збудження РІТС- декстрану генерували за допомогою галогенної лампи (12 В, 100 Вт, 2еї55, ОБрекоспеп,
Септапу). Фототоксичність, що виникає в результаті індукованого світлом збудження флуорохрому, залежить від порога інтенсивності світлового потоку й/або тривалості освітлення і 60 обумовлена або безпосереднім нагріванням ендотеліальної поверхні, або утворенням реакційноздатних кисневих радикалів, як описано в публікації 5іеіпрацег еї аї., І апдепреск5
Агсн. Бига. 385:290-298, 2000.
Вимірювали інтенсивність світла, сфокусованого на кожній судині, з метою коректування, використовуючи змінюючий довжину хвилі діодний детектор для вимірювань низької потужності (Гартавієг І М-2, Сопегепі, Аибигп, ОЗА). Проводили офлайновий аналіз відеозображень за допомогою комп'ютеризованої системи аналізу циркуляції крові в капілярних судинах (САМА5,
Ог. 2еїпіі, НеїідеІрего), і вимірювали швидкості еритроцитів, як описано в публікації 2еїпі! еї аї.,
Ійї. У. Містгосігс. Сііп. Ехр., 8(3):293-302, 2000.
Застосування інгібуючого моноклонального антитіла (птАбБНб) проти людської МА5Р-2 і контроль за допомогою плацебо перед індукуванням тромбозу
Використовуючи протокол сліпого дослідження, самцям одноприплідних немутантних мишей лінії С57ВІ /6 у віці 9 тижнів вводили внутрішньоочеревинно або рекомбінантне моноклональне антитіло проти людської МАБР-2 (тАБНб), інгібітор функціональної активності МА5Р-2 (що вводиться при кінцевій концентрації 10 мг/кг маси тіла), або таку ж кількість ізотипного антитіла як контролю (без інгібуючої активності відносно МАБР-2) за 16 годин до фототоксичного індукування тромбозу в експериментальній моделі прижиттєвої мікроскопії м'яза, що піднімає яєчко. За годину до індукування тромбозу, вводили другу дозу або тАбБНнб, або контрольного антитіла. У цій моделі також оцінювали МА5Р-2 нокаутних (КО) мишей.
Моноклональне антитіло тАБбНб (створене проти рекомбінантної людської МАБР-2) є потужним інгібітором функціональної активності людської МАБР-2, який дає перехресну реакцію, зв'язується з МА5Р-2 і інгібує мишачу МА5БР-2, але з більш низькою афінністю через його видоспецифічність (дані не показані). Щоб компенсувати низьку спорідненість тАБбНЄ до мишачої МА5БР-2, тАБбБНб вводили при високій концентрації (10 мг/кг маси тіла) з метою подолання різниці у видовій специфічності і меншої спорідненості до мишачої МА5Р-2, щоб забезпечити ефективну блокаду функціональної активності мишачої МА5Р-2 в умовах іп мімо.
У цьому сліпому дослідженні, реєстрували час, необхідний для повної оклюзії кожної окремо випробуваної венули (критеріями відбору були порівнянні діаметри і швидкості кровотоку).
Оцінювали відсоток мишей з мікросудинною оклюзією, час виникнення оклюзії і час, що пройшов до виникнення оклюзії, при спостереженні протягом 60 хвилин, використовуючи відеозапис результатів дослідження методом прижиттєвої мікроскопії.
Результати
На фігурі 46 графічно представлений у формі функції від часу, що пройшов після індукування ушкодження, відсоток мишей з мікросудинною оклюзією в моделі РІТС/декстран
Уф-випромінювання після введення ізотипного контрольного антитіла або антитіла таАбНб проти людської МАБР-2 (10 мг/кг), дозованих за 16 годин і за 1 годину до ін'єкції
ЕІТГС/декстраном. Як показано на фігурі 46, у 8595 немутантних мишей, що одержували контрольне ізотипне антитіло, виникала оклюзія протягом 30 хвилин або менше, тоді як тільки у 19 956 немутантних мишей, яким попередньо вводили антитіло проти людської МАБР-2 (тАБНб), виникала оклюзія протягом того ж періоду часу, і відбувалося відстрочення часу виникнення оклюзії у мишей, у яких з часом все ж виникала оклюзія, у групі, у якій вводили антитіло проти людської МА5Р-2. Слід також зазначити, що у трьох мишей, яким вводили тАбНбЄ проти МА5Р- 2, взагалі не виникала оклюзія протягом 60 хвилин періоду спостереження (тобто вони були захищені від тромботичної оклюзії).
На фігурі 47 графічно представлений час оклюзії у хвилинах для мишей, яким вводили антитіло проти людської МАБР-2 (тптАБНВб) і контрольне ізотипне антитіло. Дані представлені у вигляді розкиду точок із середніми значеннями (горизонтальні лінії) і лініями стандартними помилок (вертикальні лінії). На цій фігурі показаний час оклюзії у мишей, у випадку, якщо оклюзія виявлялася. Тому, три миші, яким вводили МА5БР-2 і у яких не виявляли оклюзію протягом 60 хвилин спостереження, не враховували при цьому аналізі (не було ні однієї контрольної миші, у якої б не виникала оклюзія). Як статистичний критерій при аналізі використовували критерій Стьюдента для однієї вибірки, де """ позначає значення р-0,0129. Як показано на фігурі 47, у чотирьох мишей, яким вводили антитіло проти МА5Р-2 (тАБНВ) і у яких виникала оклюзія, введення антитіла проти МАБ5Р-2 значно збільшувало час венозної оклюзії в моделі тромбозу, внаслідок індукованого за допомогою РГІТС-декстрану/світла ушкодження клітин ендотелію при низькій інтенсивності світла (800-1500) у порівнянні з мишами, яким вводили контрольне ізотипне антитіло. Середній час повної оклюзії для контрольного ізотипного антитіла становив 19,75 хвилини, тоді як середній час повної оклюзії для групи мишей, яким вводили антитіло проти МА5Р-2, становив 32,5 хвилини.
На фігурі 48 графічно представлений час до виникнення оклюзії у хвилинах для 60 немутантних мишей, МА5БР-2 КО мишей і немутантних мишей, яким попередньо внутрішньоочеревинно вводили антитіло проти людської МАБР-2 (тАБНб) при 10 мг/кг за 16 годин, а потім знову за 1 годину до індукування тромбозу в моделі тромбозу, індукованого за допомогою РІТС-декстрану/світла ушкодження клітин ендотелію при низькій інтенсивності світла (800-1500). На фігурі 48 наведені дані тільки для тварин, у яких виникала оклюзія, п-2 для немутантних мишей, яким вводили контрольне ізотипне антитіло, п-2 для МАБР-2 КО мишей і п-4 для немутантних мишей, яким вводили антитіло проти людської МАБР-2 (тАБНб). Символ "«" позначає значення ре0,01. Як показано на фігурі 48, дефіцит МАБ5Р-2 і інгібування МА5Р-2 (птАБНб при 10 мг/кг) збільшували час венозної оклюзії в експериментальній моделі тромбозу, індукованого за допомогою ЕІТС-декстрану/світла ушкодження клітин ендотелію при низькій інтенсивності світла (800-1500).
Висновки
Результати цього прикладу додатково показують, що МА5Р-2-інгібуючий засіб, який блокує лектиновий шлях (наприклад, антитіла, блокуючі функцію МА5Р-2), інгібує в експериментальній моделі ТМА на мишах мікросудинну коагуляцію і тромбоз, які є відмітними ознаки багатьох мікроангіопатичних розладів. Тому, передбачається, що введення МА5бР-2-інгібуючого засобу, такого як інгібуюче антитіло проти МА5Р-2, може стати ефективною терапією для пацієнтів, що страждають НИ5, анив, ТТР або іншими мікроангіопатичними розладами, і може забезпечувати захист від мікросудинної коагуляції і тромбозу.
ПРИКЛАД 38
У цьому прикладі описується дослідження, яке демонструє, що антитіло (тАбБНб), інгібуюче людське МАБР-2, не впливає на функцію тромбоцитів у збагаченій тромбоцитами людській плазмі.
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Як показано в прикладі 37, виявлено, що інгібування МА5Р-2 за допомогою інгібуючого антитіла проти людської МАБЗР-2 (тАБНб) збільшувало час венозної оклюзії в експериментальній моделі тромбозу, індукованого за допомогою РІТС-декстрану/світла ушкодження клітин ендотелію. Проводили наступний експеримент з метою визначення, чи впливає МА5Р-2-інгібуюче антитіло (тАбБнб) на функцію тромбоцитів.
Методи
Зо Вивчали вплив антитіла тАБбБНб проти людської МАБР-2 на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів наступним чином. Додавали 40 мкл розчину антитіла тАбБНб проти людської
МАБ5БР-2 з концентрацією або 1 мкг/мл, або 0,1 мкг/мл до 360 мкл свіжоприготовленої плазми, збагаченої тромбоцитами. Як негативний контроль використовували контрольне ізотипне антитіло. Після додавання антитіла в плазму, індукували активацію тромбоцитів шляхом додавання АДФ (аденозиндифосфату) при кінцевій концентрації 2 мкМ. Починали дослідження шляхом перемішування розчинів за допомогою маленького магніту в кюветі об'ємом 1 мл.
Агрегацію тромбоцитів вимірювали на двоканальному оптичному люмінесцентному агрегометрі для тромбоцитів цільної крові моделі 700 фірми Спгопо-109.
Результати
Відсоток агрегації в розчинах вимірювали протягом п'яти хвилин. Результати показані нижче в таблиці 13.
Таблиця 13
Агрегація тромбоцитів протягом п'яти хвилин
Антитіло й й . не (відсоток агрегації) (відсоток агрегації від часу) мкг/мл) мкг/мл) нний (0,1 мкг/мл) мкг/мл)
Як показано вище в таблиці 13, не спостерігалося значимої різниці між агрегацією індукованих за допомогою АДФ тромбоцитів, оброблених контрольним антитілом або антитілом тАБНб проти МА5БР-2. Ці результати показують, що антитіло проти людської МА5Р-2 (тАБНб) не впливає на функцію тромбоцитів. Тому результати, описані в прикладі 37, які показували, що інгібування МА5БР-2-інгібуючим антитілом проти людської МАБР-2 (тАБНб) збільшує час венозної оклюзії в моделі тромбозу, внаслідок індукованого за допомогою РІТС- декстрану/світла ушкодження клітин ендотелію, не були викликані впливом тАБНЄ на функцію тромбоцитів. Таким чином, інгібування МАБР-2 запобігає тромбозу без прямого впливу на функцію тромбоцитів, виявляючи терапевтичний механізм, відмінний від існуючих антитромботичних засобів.
ПРИКЛАД 39
У цьому прикладі описується вплив інгібування МА5Р-2 на тромбоутворення і оклюзію судин в експериментальній моделі ТМА на мишах
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Лектиновий шлях відіграє домінуючу роль в активації системи комплементу в умовах стресу або ушкодження ендотеліальних клітин. Ця активація швидко підсилюється по альтернативному шляху, який дисрегульований у багатьох пацієнтів із проявом аНИиЗ. Виходячи із цього, передбачається, що запобігання активації МА5БР-2 і лектинового шляху може переривати послідовність ферментативних реакцій, які приводять до утворення мембраноатакуючого комплексу, активації тромбоцитів і рекрутменту лейкоцитів. Цей ефект обмежує ушкодження тканини.
Крім того, МАБР-2 має фактор Ха-подібну активність і розщеплює протромбін з утворенням тромбіну. Ця активація коагулюючої системи, керована МА5Р-2, може привести до дисбалансу гемостазу і до патології ТМА. Таким чином, передбачається, що інгібування МА5БР-2 з використанням інгібітору МАБР-2, такого як МА5Р-2-інгібуюче антитіло, що блокує активацію комплементу і коагулюючих систем, поліпшить клінічні результати у випадку НИЗ ії інших пов'язаних з ТМА станів.
Як показано в прикладі 37, було виявлено, що інгібування МА5Р-2 за допомогою інгібуючого антитіла проти людської МА5Р-2 (тАБНб) збільшувало час венозної оклюзії в моделі тромбозу, внаслідок індукованого за допомогою РІТС-декстрану/світла ушкодження клітин ендотелію. У цій моделі ТМА, мишей сенсибілізували шляхом внутрішньовенного введення РІТС-декстрану з
Зо наступною локалізованою фотоактивацією РІТС-декстрану в мікроциркуляторному руслі м'яза, що піднімає яєчко (Тпопасієиз Н. еї аї., Єиг. 9. Сіїп. Іпме5і. 30(9):804-10, 2000, Адего еї а!., Тохісоп, 50(5):698-706, 2007).
Для того, щоб визначити, чи виявляє МА5Р-2-інгібуюче антитіло (тАБНб) залежний від дози вплив на тромбоутворення і оклюзію судини в експериментальній моделі ТМА на мишах, проведений наступний експеримент.
Методи
Індукували локалізований тромбоз шляхом фотоактивації декстраном, міченим флуоресцеїну ізотіоціанатом (РІТС)-декстраном у мікроциркуляторному руслі м'яза, що піднімає яєчко, мишей лінії С57ВІ/б, і використовували метод прижиттєвої мікроскопії для визначення початку тромбоутворення і оклюзії судини за допомогою методів, описаних у прикладі 37, з наступними змінами. Групам мишей внутрішньовенно вводили тАБнНб (2 мг/кг, 10 мг/кг або 20 мг/кг) або контрольне ізотипне антитіло (20 мг/кг) за одну годину до індукування ТМА.
Реєстрували час початку тромбоутворення і час завершення оклюзії судин. Для оцінки розміру судини, швидкості кровотоку, інтенсивності світла, швидкості початку тромбоутворення як еквівалента адгезії тромбоцитів, часу до початку тромбоутворення, швидкості повної оклюзії судини і часу до повної оклюзії судини використовували аналіз відтворюваних відеозаписів зображень прижиттєвої мікроскопії, записаних протягом від 30 до 60 хвилин. Для статистичного аналізу використовували програмне забезпечення бідтаРіої м12.0.
Результати
Ініціювання тромбоутворення
На фігурі 49 представлена крива Каплана-Мейєра, що показує відсоток мишей із тромбами як функцію від часу при індукованій за допомогою РІТС-декстрану тромботичній мікроангіопатії у мишей, яким вводили зростаючі дози інгібуючого антитіла проти людської МАБР-2 (тАБНб при 2 мг/кг, 10 мг/кг або 20 мг/кг) або контрольне ізотипне антитіло. Як показано на фігурі 49, спостерігалася залежне від дози відстрочення ініціювання тромбоутворення у мишей, яким вводили тАбБНб, у порівнянні з мишами, яким вводили контрольне антитіло.
На фігурі 50 графічно представлений середній час (у хвилинах) до початку тромбоутворення залежно від дози тАБНб ("р«0,01 у порівнянні з контролем). Як показано на фігурі 50, середній час до початку тромбоутворення збільшувався зі збільшенням дози тАрНб з 6,8 хвилини у бо контрольній групі до 17,7 хвилини у групі, у якій вводили 20 мг/кг тАбБНб (р«0,01). Основні експериментальні дані і статистичний аналіз наведені в таблицях 14 і 15.
Час початку тромбоутворення у окремих мишей, записаний на основі оцінки відеозапису, докладно описаний нижче в таблиці 14.
Таблиця 14
Час початку тромбоутворення після ушкодження, індукованого барвником і світлом
Введення антитіла тАрНб 12,75 10,00 10,33 14,00 21,00
Час почат 1182 11 Бо промбочтво рення 12.75 8.00 (хвилини) 12,53 10,37 400 | ффбІ| 15,83 22,65 783 | | 11,70 16,37 683 | | 50,67 21,75" 1500 ЇЇ 77777711 32,25" 1567 ЇЇ 11 "У судинах не виявляли початку тромбоутворення протягом зазначеного періоду часу спостереження.
Статистичний аналіз порівняння часу початку оклюзії серед тварин, яким вводили контрольне антитіло і антитіло тАБбБНб, наведений нижче в таблиці 15.
Таблиця 15
Час до виникнення оклюзії. Дані дослідження залежності доза-ефект при індукуванні за допомогою РІТС-декстрози тАБНб тАБНб тАБНб
Сміє | бомію 000 соми
Число подій/ 11/11 6/6 9/9 вло число тварин (95) 100 95 100 Фо 100 95 80,0 95
Середній час 6,8 10,4 11,7 17,7 (хвилини) (95 95 СІ 2,4, 8,5 5,9, 12,8 2,5,15,8 10,0, 22,7
Критерій Утлкоксона ШИ 02364 01963 0,0016 р-значення
Подія-спостережуваний час до початку.
Середній час (хвилини) і його 95 95 СІ були основані на оцінці Каплана-Мейєра.
МЕ-не оцінювали. "р-значення обчислювали за допомогою критерію порівняння биппен-Нзги.
Мікросудинна оклюзія
На фігурі 51 представлена крива Каплана-Мейєра, на якій показаний відсоток мишей з мікросудинною оклюзією залежно від часу при індукованій за допомогою РІТС-декстрану тромботичній мікроангіопатії у мишей, яким вводили зростаючі дози інгібуючого антитіла проти людської МА5Р-2 (тАбБНЄ при 2 мг/кг, 10 мг/кг або 20 мг/кг) або контрольне ізотипне антитіло. Як показано на фігурі 51, спостерігалося відстрочення виникнення повної мікросудинної оклюзії в групах мишей, яким вводили тАбнНб, у порівнянні з контрольними мишами.
На фігурі 52 графічно представлений середній час до виникнення мікросудинної оклюзії залежно від дози тАБбНнб ("р«е0,05 у порівнянні з контролем). Як показано на фігурі 52, середній час для виникнення повної мікросудинної оклюзії збільшився з 23,3 хвилини у контрольній групі до 38,6 хвилини у групі, у якій вводили 2 мг/кг тАБНб (р«е0,05). Дози 10 мг/кг або 20 мг/кг тАБНнб виявляли таку ж дію (середній час повної мікросудинної оклюзії становив, відповідно, 40,3 і 38 хвилин), як у групі, у якій вводили 2 мг/кг тАбБНб. Основні експериментальні дані і їх статистичний аналіз представлені в таблицях 16 і 17.
Час виникнення повної оклюзії судини у окремих мишей, зареєстрований на основі первинної оцінки відеографічних записів, докладно описаний нижче в таблиці 16.
Таблиця 16
Час виникнення оклюзії після ушкодження, індукованого при впливі світла і барвника
Введення антитіла тАрНб 37,50 30,92 38,00 29,07 21,91 17,53 28,00 2742 51,38 40,58 19,38 31,38 36,88 33,00
Час початку оклюзії 19,55 61,17" 26,83 39,10 (хвилини) 18,00 61,55" 40,28 32,03 1650 | г Щ | 55,83 38,53 23,0833 17777717 171117195 21,75" 1483 | (| ве 32,25" шили по ПО 3317" пи: ЗІ ПОООООНЯ ПОООООН НОХ "У судинах не відбувалося повної оклюзії протягом зазначеного часу спостереження.
Статистичний аналіз порівняння часу виникнення повної оклюзії серед тварин, яким вводили контрольне антитіло і антитіло тАБбБНб, наведений нижче в таблиці 17.
Таблиця 17
Час до виникнення мікросудинної оклюзії. Дані дослідження залежності доза-ефект при індукуванні за допомогою РІТС-ЮОех тАБНб тАБНб тАБНб
Сміє | омлю | сомп)
Число подій/ 9/11 4/6 7/9 тло число тварин (95) 81,8 95 66,7 90 717,8 90 70,0 90
Середній час 23,3 36,8 40,3 38,0 (хвилини) (95 95 СІ 16,5, 37,5 21,9, МЕ 17,5, МЕ 28,0, 40,6
Критерій
Уїлкоксона 0,0456 0,0285 0,0260 р-значення"
Подія-час до початку оклюзії.
Середній час (хвилини) і його 95 95 СІ були основані на оцінці Каплана-Мейєра.
МЕ-не оцінювали. "р-значення обчислювали за допомогою критерію порівняння Оиппен-Нзги.
Короткі висновки
Як в узагальненому вигляді наведено в таблиці 18, спостерігалося залежне від дози відстрочення ініціювання тромбоутворення у мишей, яким вводили ІтАбБНб, у порівнянні з мишами, яким вводили контрольне антитіло (середній час до виникнення тромбозу від 10,4 до 17,7 хвилини проти 6,8 хвилини). Середній час виникнення повної оклюзії характеризувався значним відстроченням у всіх групах, у яких вводили тАбБНб, у порівнянні із групами, у яких вводили контрольне антитіло (таблиця 18).
Таблиця 18
Середній час до виникнення тромбоутворення і повної оклюзії сшятини Це | Б | ШО | ак (2 мг/кг) (10 мг/кг) (20 мг/кг) пенні! 16 м тромбоутворення (хвилини)
Средній? час до виникнення повної мікросудинної оклюзії 23,3 36,87 40,37 38,0" (хвилини)
Середні значення основані на оцінці Каплана-Мейєра. "р-0,05 у порівнянні з контролем (критерій Уїлкоксона, скоректований за допомогою критерію
ВБиппей-Нзи для множинних порівнянь).
Ці результати показують, що тАБбНб, людське моноклональне антитіло, яке зв'язується з
МАБР-2 і блокує лектиновий шлях системи комплементу, зменшує мікросудинний тромбоз залежно від дози в експериментальній моделі ТМА на мишах. Тому, передбачається, що введення МАБР-2-інгібуючого засобу, такого як МАБР-2-інгібуюче антитіло, може стати ефективною терапією для пацієнтів, що страждають НИб5, аниб5, ТТР або іншими мікроангіопатичними розладами, такими як інші форми ТМА, включаючи катастрофічний антифосфоліпідний синдром (САР5), системну хворобу Дегоса і ТМА на фоні раку, хіміотерапії раку і трансплантації, і може забезпечувати захист від мікросудинної коагуляції і тромбозу.
ПРИКЛАД 40
У цьому прикладі описується ідентифікація за допомогою фагового дисплея бібліотеки повністю людських 5сСЕм антитіл, які зв'язуються з МА5Р-2 і інгібують опосередковану лектином активацію комплементу, залишаючи при цьому незачепленими класичний (С1д-залежний) шлях і компоненти альтернативного шляху імунної системи.
Загальний опис
Повністю людські високоафінні антитіла МА5Р-2 ідентифікували шляхом скринінгу фагового дисплея бібліотеки. Варіабельні фрагменти легких і важких фрагментів антитіл виділяли як у форматі 5сЕм, так і в повнорозмірному форматі дб. Людські антитіла проти МА5БР-2 застосовуються для інгібування клітинного ушкодження, пов'язаного з активацією альтернативного шляху комплементу, опосередкованою лектиновим шляхом, залишаючи незачепленим компонент класичного (С1д-залежного) шляху імунної системи. У деяких варіантах здійснення, випробувані МА5Р-2-інгібуючі антитіла мають наступні характеристики: (а) високу афінність до людської МАЗР-2 (наприклад, Ко 10 нМ або менше) і (Б) інгібування
МАБ5БР-2-залежної активності комплементу в 90 95 людській сироватці з величиною ІСво 30 нМ або менше.
Методи
Експресія повнорозмірної каталітично неактивної МАЗР-2
Повнорозмірну послідовність КДНК людської МАБР-2 (ЗЕО ІЮО МО:4), кодуючу поліпептид
Зо людської МАБР-2 з лідерною послідовністю (ЗЕО ІЮ МО:5), субклонували в експресуючий вектор ссавців рСІ-Мео (Рготеда), який запускає еукаріотичну експресію під контролем області енхансера/промотору СММ (описаної в публікації Кашйтап К..). еї аї., Мисіеіс Асіах5 Кезеагсі, 19:4485-90, 1991; Каштап, Меїподз іп Епгутоїіоду, 185:537-66 (1991)).
Для генерування каталітично неактивного білка людської МАБР-2А, проводили сайт- спрямований мутагенез, як описано в патентному документі 5 2007/0172483, зміст якого включений в даний винахід шляхом посилання на нього. Після електрофорезу в агарозному гелі, продукти РСК очищали, і генерували препарат диска хромосом і одиничні аденозинові перекриття, використовуючи стандартний метод нарощування. Потім одержану з аденозином на кінці МА5Р-2А клонували в простий вектор РЕЕМ-Т, трансформований у кишкову паличку.
Людську МАЗР-2А додатково субклонували в будь-який з експресуючих векторів ссавців РЕЮ або рСІ-Мео.
Описану вище експресійну конструкцію МАБР-2А трансфікували в клітини ОХВІ1, використовуючи стандартну процедуру трансфекції фосфатом кальцію (Мапіаїй5 еї аї., 1989).
МА5Р-2А продукували в середовищі, що не містить сироватку, для гарантії того, що препарати не забруднені іншими сироватковими білками. Збирали середовище з конфлюентних клітин через день (загалом чотири рази). Рівень рекомбінантної МАЗР-2А становив у середньому близько 1,5 мг/л культурального середовища. МАБР-2А (мутант Зег-АІа, описаний вище) очищали методом афінної хроматографії на колонках з МВР-А-агарозою.
Аналіз МАБР-2А методом ЕїпІЗБА она оклонах СЕМ, що представляють інтерес, ідентифікованих шляхом пенінгу/перетворення 5сЕм і фільтруючого скринінгу
Фаговий дисплей бібліотеки варіабельної області легких і важких ланцюгів послідовностей людського імуноглобуліну піддавали антигенному пенінгу з наступним автоматизованим скринінгом і селекцією антитіл для виявлення високоафінних 5сЕм антитіл до білка МАБ5Р-2 людини. Були проведені три раунди пенінгу бібліотеки фагів 5сЕм проти НІ5б-міченої або біотин- міченої МАТР-2А. Третій раунд пенінгу спочатку елюювали за допомогою МВ, а потім за допомогою ТЕА (лужний). Для моніторингу специфічного збагачення фагів, що зображують фрагменти 5сЕм проти таргетної МАБР-2А, проводили аналіз поліклонального фага проти іммобілізованого МАЗР-2А методом ЕГІЗА. Клонували гени 5сЕм із третього раунду пенінгу в експресуючий вектор рРНОа і проводили дрібномасштабний фільтруючий скринінг для пошуку специфічних клонів проти МА5Р-2А.
Бактеріальні колонії, що містять плазміди, кодуючі фрагменти 5сЕм із третього раунду пенінгу, відбирали, поміщали на нітроцелюлозні мембрани і вирощували протягом ночі на неіндукуючому середовищі з одержанням шаблонів. Загалом були відібрані і проаналізовані 18000 колоній із третього раунду пенінгу, половина з конкурентного елюювання і половина з наступного елюювання за допомогою ТЕА. Пенінг фагмідної бібліотеки зсЕм проти МА5БР-2А з наступним перетворенням 5сЕм і фільтруючим скринінгом давав 137 позитивних клонів. Клони 108/137 давали позитивний результат в аналізі зв'язування МА5БР-2 методом ЕГІ5ЗА (дані не показані), з яких 45 клонів піддавали додатковому аналізу на здатність блокувати активність
МА5Р-2 у сироватці здорової людини.
Дослідження з вимірювання інгібування утворення СЗ3-конвертази лектинового шляху
Функціональне дослідження, у якому вимірюють інгібування утворення СЗ3-конвертази лектинового шляху, використовували для оцінки "блокуючої активності" клонів хсСгм МАБР-2, що представляють інтерес. МАБР-2 серинпротеаза потрібна для генерації двох білкових
Зо компонентів (С460, Сга), які включають СЗ-конвертазу лектинового шляху. Тому, фрагмент Бар2 антитіла проти МАБР-2, який інгібує функціональну активність МАБР-2 (тобто МАБР-2- блокуючий 5сЕм), буде інгібувати із самого початку утворення СЗ-конвертази лектинового шляху. СЗ містить як частину своєї структури незвичайну і дуже реакційноздатну тіоефірну групу. Після розщеплення СЗ3 за допомогою СЗ-конвертази, тіоефірна група в СЗЗ може утворювати ковалентний зв'язок з гідроксильними групами або аміногрупами макромолекул, іммобілізованих на дні пластмасових ямок, за допомогою ефірних або амідних зв'язків, що полегшує визначення СЗБр при використанні методу аналізу ЕГІ5А.
Дріжджовий манан є відомим активатором лектинового шляху. В описаному нижче методі вимірювання утворення СЗ-конвертази, пластикові ямки, покриті мананом, інкубували з розведеною людською сироваткою для активації лектинового шляху. Потім ямки промивали і визначали СЗБ, іммобілізований у ямках, використовуючи стандартні методи ЕГІЗА. Кількість
СЗБ, генерована в цьому аналізі, є прямим відображенням утворення із самого початку С3- конвертази лектинового шляху. У цьому дослідженні, випробовували клони фрагментів 5сЕм проти МА5Р-2 при вибраних концентраціях на їх здатність інгібувати утворення СЗ-конвертази і наступну генерацію СЗр.
Методи 45 клонів, що представляють інтерес, ідентифікованих, як описано вище, експресували, очищали і розбавляли до однієї і тієї ж вихідної концентрації, яку знову розбавляли в буфері
СМВ, що містить Са» і Мд": (4,0 мМ барбіталу, 141 мМ Масі, 1,0 мМ Масі», 2,0 мМ Сасіг, 0,1 95 желатину, рН 7,4), для гарантії того, що всі клони мають однакову кількість буфера. Кожний із клонів 5сЕм тестували по три рази при концентрації 2 мкг/мл. Як позитивний контроль використовували ОМ5100 Рабр2, який піддавали випробуванням при концентрації 0,4 мкг/мл.
Постійно проводили спостереження утворення СЗс у присутності і за відсутності клонів 5сЕмМ/Іда.
Маннан розбавляли до концентрації 20 мкг/мл (1 мкг/ямку) в 50 мМ карбонатному буфері (15
ММ МагбОз-35 мМ МансСоза1,5 мМ Мам»), рН 9,5, і наносили на планшет ЕГІ5А протягом ночі при 4 "С. Наступного дня покриті мананом планшети промивали З рази за допомогою 200 мкл
РВ5З. Потім у ямки додавали 100 мкл 1 95 інгібуючого НБЗА розчину і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети три рази промивали за допомогою 200 мкл РВЕ: і 60 зберігали на льоду з 200 мкл РВ5 до додавання зразків.
Сироватку здорової людини розбавляли до 0,595 у буфері СамдосувВ, і клони 5сЕм або позитивний контроль ОМ5100 Рабр2 додавали в трьох екземплярах у цей буфер у концентрації 0,01 мкг/мл; 1 мкг/мл (тільки контроль ОМ5100) і 10 мкг/мл, і попередньо інкубували 45 хвилин на льоду перед додаванням до заблокованого планшета ЕГІ5А. Реакцію ініціювали інкубацією протягом однієї години при 37 С, і її припиняли шляхом перенесення планшетів на льодяну баню. Відкладення СЗБ визначали за допомогою кролячого антитіла проти а-мишачого Сзс, за яким ішло додавання козячої а-кролячої НЕР. Негативним контролем служив буфер без антитіл (без антитіл-максимальне осадження СЗБ), а позитивним контролем служив буфер з ЕОТА (без осадження СЗБ). Фон визначали шляхом проведення цього ж дослідження, за винятком того, що ямки не містили манану. Фоновий сигнал планшетів без манану віднімали із сигналів ямок, що містять манан. Як граничний критерій приймали половину активності нерелевантного 5сЕм- клону (МАМ) і одного буфера.
Результати
Грунтуючись на граничному критерії, було виявлено, що загалом 13 клонів блокують активність МАБР-2. Вибирали всі 13 клонів, продукуючих пригнічення »50 95 шляху, і секвенували їх з одержанням 10 унікальних клонів. Було виявлено, що всі десять клонів мають один і той же підклас легкого ланцюга АЗ, але три різні підкласи важкого ланцюга: МН2, МНЗ і
МНб. У функціональному дослідженні, п'ять із десяти клонів 5СЕм, що представляють інтерес, характеризувалися меншими значеннями ІСво, ніж цільові критерії 25 нМ, при використанні 0,5 956 людської сироватки.
Для ідентифікації антитіл з підвищеною активністю, три материнські клони 5сЕм, ідентифіковані, як описано вище, піддавали перетасовуванню легкого ланцюга. Цей процес включав генерування комбінаторної бібліотеки, що складається з МН кожного з материнських клонів, об'єднаної в пару з бібліотекою інтактних лямбда легких ланцюгів (МІ) людини, одержаних від шести здорових донорів. Потім цю бібліотеку піддавали скринінгу на клони 5сСЕм з підвищеною афінністю зв'язування й/або функціональністю.
Таблиця 19
Порівняння функціональної активності по величині ІСво (НМ) основних дочірніх клонів і їх відповідних материнських клонів (усі у форматі 5сЕм)
Дослідження СЗ в Дослідження СЗ в Дослідження СА в
Клон зсбм 1 95 сироватці людини |90 95 сироватці людини |90 9о сироватці людини
ІСво НМ) ІСво НМ) ІСво НМ) 17020тс 17020т аЗ521М11 »1000 17М16тс ши: пи Ге по ЕТ по 17М16т а17М9
Нижче представлені послідовності варіабельних областей важкого ланцюга (МН) для
Зо материнських клонів і дочірніх клонів, наведених вище в таблиці 19.
Гіперваріабельні ділянки (СОК) Караї (31-35 (НІ), 50-65 (Н2) і 95-107 (НЗ)) виділені напівжирним шрифтом, а гіперваріабельні ділянки (СОК) Споїіа (26-32 (НІ), 52-56 (Н2) і 95-101 (НЗ)) підкреслені. і17р2о з5ЗУн-сІіМі1У васідбельна область важкого панцюга (мні (ЗЕ 0 МОЄЇ, кодована за допоморою ЗБ 10 МО: сб
ЗУТІКЕЖСВУБУКРТЕТЬТЬ СТУК ЗВОКМОУМІКОРЕСКАКЕМНБАНІКЕЗБОЕК
ЗУБТЗОКЗВТІЗКОТЗКЕМОУУСТМТММОКУОТАТЕСАВІННОСІВУХООСТЬУТМаВ, 17 варіабельна сбласть важкого ланцюга (МЯР (ЗЕ ІБ
Ше БООБсвСМУБЕВоТЬаОТоАТоОБУЗБІЗААНММІВОСРОРСЬЕНЬСА КІ ЕВОКИ
ЗБ ЖУМПУАУЗУКОЗВІТІМРОТЗККОКВІОТ МІУ ТРЕОТАМУХУСАВОРЕОУРЕОІтТМООЗТМУТУВВ.
Нижче представлені послідовності варіабельних областей легкого ланцюга (МІ) для материнських клонів і дочірніх клонів.
Гіперваріабельні ділянки (СОР) Караї (24-34 (11), 50-56 (12) і 89-97 (13)) виділені напівжирним шрифтом, а гіперваріабельні ділянки (СОМ) Споїйіа (24-34 (11), 50-56 (12) і 89-97 (І3)) підкреслені. Ці ділянки однакові, незалежно від того, пронумеровані вони по системі Кабаї або Споїпіа. іЗБО ІБ МО:73, кодована за допомогою ЗБО ІБ МО: З тїш оЩО:71
ВЕСАБМЕСЖТАТЕТІТВСЕАООСКАЛУТСОУМНОСАТЮНУУК ОІВ ТУ ТАЛА ХВО.
Антитіла ОМ5100 і Модб а3521М11МІ. проти МА5БР-2 (що включають варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як послідовність зЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:70, називані також як "ОМ5646" і "тАБНб"), про які було виявлено, що вони зв'язуються з людською МА5Р-2 з високою спорідненістю і мають здатність блокувати функціональну активність комплементу, піддавали аналізу відносно зв'язування епітопа за допомогою дот-блот-аналізу. Результати показують, що антитіла
ОМ5646 і ОМ5100 є високоспецифічними відносно МАБР-2 і не зв'язуються з МАБР-1/3.
Антитіло не зв'язувалося ні з МАр19, ні з фрагментами МА5Р-2, які не містили ССР1-домен
МА5Р-2, що дозволяє зробити висновок, що сайти зв'язування включають ССРІ1.
Було з'ясовано, що антитіло ОМ5646 проти МА5Р-2 активно зв'язується з рекомбінантною
МА5БР-2 (Ка 60-250 мкМ) з селективністю вище в 5000 разів у порівнянні з С15, С1г або МА5БР-1 (дивіться таблицю 20 нижче).
Таблиця 20
Афінність і специфічність антитіла ОМ5646 проти МА5Р-2 при взаємодії з МА5Р-2, оцінені методом твердофазного аналізу ЕГІЗА
Ко (РМ)
МАБР-1 »500000
МАБР-2 б223"
МАБР-З »500000
Очищений людський С1г »500000
Очищений людський С15 -500000 "Середнє значення:-середньоквадратичне відхилення; п-12.
ОМ5646 специфічно блокує лектинзалежну активацію кінцевих компонентів комплементу
Методи
Вплив ОМ5646 на осадження мембраноатакуючого комплексу (МАС) досліджували при використанні специфічних умови для лектинового шляху, класичного шляху і альтернативного шляху. Для цієї мети використовували набір для скринінгу комплементу М/евіар Сотр300
Зо (У/езіаб, І ипа, Зугедеп), відповідно до інструкцій фірми-виробника.
Результати
На фігурі 53А графічно представлений рівень осадження МАС у присутності або за відсутності антитіла проти МАБР-2 (0М5646) при умовах дослідження, специфічних до лектинового шляху. На фігурі 53В графічно представлений рівень осадження МАС у присутності або за відсутності антитіла проти МАБР-2 (0М5646) при умовах дослідження, специфічних до класичного шляху. На фігурі 53С графічно представлений рівень осадження МАС у присутності або за відсутності антитіла проти МАБР-2 (0М5646) при умовах дослідження, специфічних до альтернативного шляху.
Як показано на фігурі 53А, антитіло ОМ5646 блокує опосередковану лектиновим шляхом активацію осадження МАС з величиною ІСвзо приблизно 1 нМ. Однак антитілло ОМ5646 не впливало на осадження МАС, генероване в результаті активації, опосередкованої класичним шляхом (фігура 53В), або в результаті активації, опосередкованої альтернативним шляхом (фігура 535).
Дослідження фармакокінетики і фармакодинаміки для антитіла ОМ5646 після його внутрішньовенного або підшкірного введення мишам
Фармакокінетику і фармакодинаміку для антитіла ОМ5646 вивчали у мишей після однократного дозування антитіла протягом 28 днів. Для дослідження використовували дози 5 мг/кг і 15 мг/кг ОМ5646 підшкірно, а також дози 5 мг/кг ОМ5646 внутрішньовенно.
Що стосується фармакокінетичного профілю 0М5646, то на фігурі 54 графічно представлена залежність концентрації ОМ5646 (у середньому п-З3 тварини у групі) від часу після введення ОМ5646 у зазначеній дозі. Як показано на фігурі 54, при дозі 5 мг/кг підшкірно, максимальна концентрація ОМ5646 досягала в плазмі 5-6 мкг/мл приблизно через 1-2 дні після дозування. Біодоступність ОМ5646 при дозі 5 мг/кг підшкірно становила приблизно 60 95. Як додатково показано на фігурі 54, при дозі 15 мг/кг підшкірно, максимальна концентрація
ОМ5646 у плазмі досягла 10-12 мкг/мл приблизно через 1-2 дні після дозування. Для всіх груп,
ОМ5646 повільно виводилося з системного кровообігу з кінцевим періодом напіввиведення приблизно 8-10 днів. Профіль ОМ5646 є типовим при введенні людського антитіла мишам.
Фармакодинамічна активність ОМ5646 графічно проілюстрована на фігурах 55А і 558. На фігурах 55А і 558 показана фармакодинамічна відповідь (зниження системної активності лектинового шляху) для кожної миші в групах з дозуванням 5 мг/кг внутрішньовенно (фігура
Б5БА) і 5 мг/кг підшкірно (фігура 558). Пунктирною лінією позначений вихідний рівень при дослідженні (максимальне інгібування, сироватка інтактної миші, якій перед дослідженням введений іп міго надлишок ОМ5646). Як показано на фігурі 55А, після внутрішньовенного введення 5 мг/кг 0М5646, системна активність лектинового шляху відразу знижувалася до майже невиявлюваних рівнів, а активності лектинового шляху характеризувалися лише помірним відновленням протягом 28 днів спостереження. Як показано на фігурі 558, у мишей, яким вводили дозу 5 мг/кг ОМ5646 підшкірно, спостерігалося залежне від часу інгібування активності лектинового шляху. Активність лектинового шляху знижувалася до майже невиявлюваних рівнів протягом 24 годин після введення лікарського засобу і залишалася на низькому рівні протягом щонайменше 7 днів. Активність лектинового шляху поступово підвищувалася з часом, але протягом 28 днів спостереження не досягала рівня, який був до дозування. Профіль активності лектинового шляху залежно від часу, спостережуваний після введення дози 15 мг/кг підшкірно, був аналогічний профілю при дозі 5 мг/кг підшкірно (дані не показані), що вказує на досягнення максимально можливого фармакодинамічного ефекту. Крім того, ці дані показали, що внутрішньовенне або підшкірне введення один раз на тиждень дози 5 мг/кг 0М5646 достатнє для забезпечення безперервного пригнічення системної активності лектинового шляху у мишей.
ПРИКЛАД 41
У цьому прикладі показано, що МАБ5Р-2-інгібуюче антитіло (0М5646) інгібує індуковане сироваткою аниз відкладення С5р-9 на поверхні активованих мікроклітин ендотелію судин (НМЕС-1) людини після впливу сироватки, одержаної від пацієнтів з атиповим гемолітичним уремічним синдром (анив), узятої під час гострої фази і фази ремісії захворювання.
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Наступне дослідження проводили для вивчення індукованого анОз-сироваткою осадження
С5р-9 на поверхні активованих клітин НМЕС-1 після впливу сироватки пацієнтів з анизв, одержаної (1) під час гострої фази, і (2) під час фази ремісії захворювання, у присутності або за відсутності ОМ5646, антитіла проти МАБР-2, яке специфічно зв'язується з МАБ5Р-2 і інгібує активацію лектинового шляху.
Методи
Пацієнти
Для цього дослідження відбирали чотирьох пацієнтів з аниз5, яких обстежували як під час гострої фази захворювання, так і в стані ремісії, серед тих, які включені до Міжнародного реєстру НОЗЛТР (Іпіегпайопа! Кедізігу ої НОБ/ТТР) і генотиповані в Лабораторії імунології і бо генетики трансплантації і рідких захворювань Інституту Маріо Негрі (І арогайїюгу ої ІттипоЇоду апа Сепеїййсв ої Тгапзріапіайноп апа Каге Різеазез ої Те Магіо Меодгі Іпбійше). Один пацієнт анив мав гетерозиготну мутацію р.К1210С фактора комплементу Н (СЕН), а один пацієнт мав аутоантитіла проти СЕН, у той час як у двох інших пацієнтів мутації або антитіла до СЕН не були виявлені.
У таблицях 21 і 22 узагальнені результати скринінгу мутацій гена комплементу і аутоантитіл проти СЕН у чотирьох пацієнтів, обстежуваних у цьому дослідженні, поряд із клінічними і біохімічними даними, одержаними або під час гострої фази, або при ремісії.
Таблиця 21
Клінічні параметри чотирьох пацієнтів з аниз у цьому дослідженні й Тромбоцити Іон . в-креатинин
Випадок Ме Мутація або лураза захворю" (150-. (266-5ОО пав ід) (0,55-1,25 й 400х103/мкл МО/л) д мг/дл)
Немає 31000 1396 я мутацій, немає Ар ремісія 267000 п.а. 11,5 3,76 проти СЕН й 46000 1962 йо сптАтАтос 268000 яз 0000 Аопротисен іст. С 40000 3362 й о проти СПН 271000
Немає 83000 1219 1. 78 | 68 на мутацій, немає АБ ремісія 222000 495 122 13 проти СЕН
Примітка: п.а.-дані відсутні.
Таблиця 22
Параметри комплементу чотирьох пацієнтів з аниз у цьому дослідженні
Мутація або АБ проти Сироватка СЗ Ріазта 5050-9
Випадок Мо СЕН Фаза захворювання 83-180 мг/дл) 127-400 нг/мл) я Немає мутацій немає|гостра.д 17777751 11111691
АБ проти СЕН й йо сптАтАтос й до проти СПА яа Немає мутацій, немає
АБ проти СЕН
Експериментальні методи
Клітини лінії мікроклітин ендотелію судин (НМЕС-1) людини дермального походження висівали на предметних стеклах і використовували після їх конфлюенції. Конфлюентні клітини
НМЕС-1 активували 10 мкм АДФ (аденозиндифосфату) протягом 10 хвилин, і потім інкубували протягом чотирьох годин із сироваткою чотирьох пацієнтів з аниб5, описаних вище в таблицях 23 і 24, зібраною або під час гострої фази захворювання, або при ремісії, або із сироваткою 4 здорових суб'єктів, використовуваною які контроль. Сироватку розбавляли 1:2 контрольним середовищем (НВ5З5 з 0,5 95 В5А) у присутності або за відсутності МА5Р-2-інгібуючого антитіла
ОМ5646 (100 мкг/мл), генерованого, як описано вище в прикладі 40, або в присутності розчинного рецептора комплементу 1 (5СКІ) (150 мкг/мл), як позитивного контролю при інгібуванні комплементу. Наприкінці стадії інкубації, клітини НМЕС-1 обробляли кролячим антитілом проти людського комплементу С5р-9, потім ЕІТС-кон'югованим вторинним антитілом.
У кожному експерименті, сироватку від одного контрольного здорового суб'єкта випробовували паралельно із сироваткою пацієнта анивз (у гострій фазі і ремісії). Для реєстрації флуоресцентного забарвлення на поверхні ендотеліальних клітин використовували конфокальний інвертований лазерний мікроскоп. Реєстрували 15 полів у кожному зразку, і оцінювали площу флуоресцентного забарвлення за допомогою автоматичного виявлення границь, використовуючи вбудовані специфічні функції програмного забезпечення Ітаде у, і результати виражали як піксель? на аналізоване поле. Поля, що характеризуються найнижчим і найвищим значенням, не використовували для розрахунків.
Для статистичного аналізу (однофакторного дисперсійного аналізу АМОМА з наступним випробуванням на критерій Тьюкі для множинних порівнянь) використовували результати в піксель? для 13 полів, одержані для кожного пацієнта і контрольного суб'єкта при кожній умові експерименту.
Результати
Результати аналізу осадження комплементу за допомогою сироваток чотирьох пацієнтів з анНиз наведені нижче в таблиці 23А, а результати із сироваткою чотирьох здорові суб'єктів наведені нижче в таблиці 238.
Таблиця 23а
Вплив інгібіторів комплементу на осадження С5р-9 на АДфФ-активованих клітинах НМЕС-1, індуковане сироваткою пацієнтів з ан;
Пацієнт з аниз т вл фаза аниз риє т ремісії аниз вання вання
Пацієнт Мо 1 5078 (немає мутації, немає во. 551-807 | 3312-4227) 4507-5332 1598--101| 1650- 223 аб проти СЕН)
Пацієнт Мо 2 о я я о
СЕН-В1210С 5103- 6482 | 497-677" | 24354 3947 | 3705-5702 | 420-651 2151- 250
Пацієнт Мо З о « о (аб проти СЕН) 3322-4212 | 353-647 | 2582--479 | 6790-9012 | 660-833 | 2077- 353
Пацієнт Мо 4 (немає мутації, немає | 4267-4882 | 205-347 | 2369-2657 | 5032-5942 182 -29| 3290- 552 аб проти СЕН)
Таблиця 23р
Вплив інгібіторів комплементу на осадження С5р-9 на АДфФ-активованих клітинах НМЕС-1, індуковане сироваткою чотирьох контрольні здорові суб'єктів (що не страждають 2НИ5)
Контрольний здоровий . суб'єкт Мо Без лікування 581 -ОомМ5646
Контрольний суб'єкт Мо 4 (досліджуваний паралельно з анив- 481-66 375-43 213-557 пацієнтом
Мо 1)
Контрольний суб'єкт Мо 2 (досліджуваний паралельно з анив- 651--61 240-33 490-69 пацієнтом
Мо 2)
Контрольний суб'єкт Мо
З
(досліджуваний паралельно з анив- 602-43 234-35 717-109 пацієнтом
Мо 3)
Контрольний суб'єкт Мо
А ралельно з аНОБ- 370453 144420 313536 пацієнтом
Мо 4)
Для таблиць 23А і 23В: дані є середніми значеннями-5Е. "Р-0,001 відносно контролю; "р«0,001, Р«0,01 відносно гострої фази анизЗ без лікування; Р«0,001, Р«е0,01, Р«0,05 відносно фази ремісії аниз без лікування.
На фігурі 56 графічно представлена інгібуюча дія антитіла проти МАБР-2 (0М5646) і 5САК1 на осадження С5р-9 на АДф-активованих клітинах НМЕС-1, індуковане сироваткою. На фігурі 56 дані є середніми значеннями-5Е. "Р«0,0001 відносно контролю; "Р«0,0001 відносно гострої фази ани5; Р«0,0001 відносно гострої фази анО5а5сСкКІ1; Р«0,0001 відносно фази ремісії анО5 без лікування і 2Р.«0,0001 відносно фази ремісії анО5-5СА1.
Як показано в таблицях 23А, 23В і на фігурі 56, АДфФ-активовані клітини НМЕС-1, що піддалися впливу сироватки пацієнтів з аниз (зібраних або в гострій фазі, або в стані ремісії) протягом чотирьох годин у статичних умовах, характеризувалися інтенсивним осадженням С5бр- 9 на клітинній поверхні, що виявляється конфокальною мікроскопією. При вимірюванні площі, покритої С5р-9, була виявлена значно більша кількість осадженого С5р-9 на клітинах, що піддалися впливу сироватки пацієнтів з ани»х, ніж на клітинах, що піддалися впливу сироватки контрольних здорових суб'єктів, незалежно від того, чи була сироватка аниз зібрана в гострій фазі або у фазі ремісії. Не виявлялося ніякої різниці у відкладеннях С5р-9 на ендотелії, індукованих сироваткою, зібраною в період гострої фази і фази ремісії аниз.
Крім того, як показано в таблицях 23А, 238 і на фігурі 56, додавання антитіла ОМ5646 проти
ММ5Р-2 до сироватки аниз (одержаної у пацієнта або під час гострої фази, або у фазі ремісії) приводило до значного зменшення осадження С5р-9 на поверхні ендотеліальних клітин у порівнянні з необробленою сироваткою аниз. Однак інгібуюча дія ОМ5646 на осадження С5р-9 була менш глибокою, ніж ефект, що надається інгібітором комплементу широкої дії 5СК. І, дійсно, спостерігалося статистично значима відмінність між С5Б-9-відкладеннями під впливом аниз сироватки в присутності ОМ5646 у порівнянні із присутністю 5СК1 (фігура 56 і таблиці 23ЗА і 238).
При розрахунках середнього значення для чотирьох пацієнтів з ани5, спостережувані в присутності інгібіторів комплементу відсотки зменшення відкладень С5Б5-9 (у порівнянні з відкладеннями С5Б0-9, індукованими необробленою сироваткою тих же пацієнтів, що приймаються за 100 95), були наступними: гостра фаза:
СК (150 мкг/мл): 91 95 зменшення відкладень С5р-9,
ОМ5646 (100 мкг/мл): 40 95 зменшення відкладень С5Б-9, фаза ремісії: 5СКІ1 (150 мкг/мл): 91 95 зменшення відкладень С5р-9,
ОМ5646 (100 мкг/мл): 54 95 зменшення відкладень С5Б-9.
Висновки
Результати, представлені в цьому прикладі, показують, що лектиновий шлях комплементу стимулюється активованими мікроклітинами ендотелію судин, і що ця стимуляція є важливим сигналом для відповідної надлишкової активації комплементу, характерної для ани5. Також показано, що ця стимуляція лектинового шляху і, як наслідок, відповідна надлишкова активація комплементу виникає як під час гострої фази, так і у фазі клінічної ремісії анив5. Більше того, очевидно, що цей висновок не обмежується тільки яким-небудь конкретним дефектом комплементу, пов'язаним з анизЗ. Крім того, як показано в цьому прикладі, селективне інгібування лектинового шляху за допомогою МА5Р-2-інгібуючого антитіла, такого як ОМ5646, зменшує осадження комплементу у пацієнтів аниз з різною етіологією.
ПРИКЛАД 42
У цьому прикладі показано, що МАЗР-2-інгібуюче антитіло (0М5646) інгібує індуковану сироваткою агрегацію тромбоцитів і тромбоутворення на поверхні активованих людських мікроклітин ендотелію судин (НМЕС-1) після впливу сироватки пацієнта аниз, одержаної (1) під час гострої фази і (2) під час фази ремісії анивз.
Методи
Пацієнти
Обстежували трьох пацієнтів (пацієнти Мо 1, Мо 2 і Мо 4, описані в таблицях 21, 22, 23А і 23В в прикладі 41), що страждають аниз (у одного пацієнта була виявлена гетерозиготна мутація р.К1210С СЕН, у двох інших пацієнтів були виявлені мутація або антитіла проти СЕН), як під час гострої фази захворювання, так і у фазі ремісії. Для цього дослідження відбирали чотирьох пацієнтів серед тих, які включені до Міжнародного реєстру НОЗ/ЛТР (Іпіегпайопа! Кедівігу ої
НИБЛТТР) і генотиповані в Лабораторії імунології і генетики трансплантації і рідких захворювань
Інституту Маріо Негрі (Гарогаїогу ої Іттипоіюду апа Сепеїййс5 ої Тгапзріапіайоп апа Каге різеазез ої Пе Магіо Меодгі Іпбійше). Як донори крові для перфузійних експериментів були також відібрані п'ять здорових суб'єктів.
Методи
Конфлюентні клітини НМЕС-1 активували за допомогою 10 мкМ АДФ протягом 10 хвилин, і потім інкубували протягом трьох годин із сироваткою трьох пацієнтів з аниз (пацієнти Мо 1, Мо 2 і Мо 4, описані в прикладі 41), зібраною або під час гострої фази захворювання, або при ремісії, або з контрольною сироваткою здорових суб'єктів. Сироватку розбавляли 1:22 контрольним середовищем (НВ5З5 з 0,5 95 В5А) у присутності або за відсутності МА5Р-2-інгібуючого антитіла
ОМ5646 (100 мкг/мл), генерованого, як описано вище в прикладі 40, або в присутності 5СК1 (150 мкг/мл) як позитивного контролю при інгібуванні комплементу. У випадку пацієнтів Мо 1 ії Мо 2, додаткові ямки інкубували з сироваткою (гострої фази і ремісії), розведеною 1:2 контрольним середовищем, що містить 100 мкг/мл нерелевантного ізотипного контрольного антитіла або 20 мкг/мл ОМ5646 (для останнього антитіла, у випадку пацієнта Мо 1 випробування проводили з сироваткою тільки у фазі ремісії, а у випадку Мо 2 - як під час гострої фази, так і у фазі ремісії).
Наприкінці стадії інкубації, клітини НМЕС-1 перфузували в проточній камері за допомогою цільної гепаринізованої крові (10 МО/мл), одержаної від здорових суб'єктів (що містить флуоресцентний барвник мекакрин, який мітить тромбоцити), при напруженні зсуву, характерному для мікроциркуляції (60 дин/см?7, три хвилини). Після трьох хвилин перфузії, моношари клітин ендотелію фіксували в ацетоні. Реєстрували п'ятнадцять зображень для
Зо кожного зразка тромбоцитарного тромбу на поверхні ендотеліальних клітин за допомогою конфокального інвертованого лазерного мікроскопа, і оцінювали області, зайняті тромбами, з використанням програмного забезпечення Ітаде У. Поля, що характеризуються найнижчим і найвищим значенням, не використовували для розрахунків.
Для статистичного аналізу (однофакторного дисперсійного аналізу АМОМА з наступним випробуванням на критерій Тьюкі для множинних порівнянь) використовували результати в піксель? для 13 полів, одержані для кожного пацієнта і контрольного суб'єкта при кожній умові експерименту.
Результати
Результати експериментів по тромбоутворенню із сироватками трьох пацієнтів з анО5 наведені нижче в таблиці 24А, а результати із сироватками п'яти здорових суб'єктів наведені нижче в таблиці 248.
Таблиця 24а
Вплив інгібіторів комплементу на тромбоутворення (піксель?-5Е), індуковане сироваткою аНИ5, на клітинах НМЕС-1, активованих АДФ
Випадок Ко 1 ан Випадок Ме 2 ани5 Випадок Мо З анО5 . тромбоутворення тромбоутворення
Умови експери- Стадія й 2 тромбоутворення й 2 менту захворювання (піксель ЗЕ) (піксель? ЗЕ) (піксель БЕ) (не мутації, немає ар (СЕН-В1210С) (не мутації, немає ар проти СЕН) проти СЕН) (150 мкг/мл) тоМ5646 (20 мкг/мл)
Випадок Мо 1 анО5 Випадок Ме 2 ани5 Випадок Мо З анО5 . тромбоутворення тромбоутворення
Умови експери- Стадія й 2 тромбоутворення й 2 менту захворювання (піксель ЗЕ) (піксель? ЗЕ) (піксель БЕ) (не мутації, немає ар (СЕН-В1210С) (не мутації, немає ар проти СЕН) проти СЕН) (100 мкг/мл) янереле-вантневостра | 5995-4725 / 18655-41699 | невизначали ізотипне мкг/мл)
Таблиця 24р
Вплив інгібіторів комплементу на сироватку п'яти контрольних здорових суб'єктів (що не страждають від НОЗ) при дослідженні тромбоутворення (піксель--5Е) на клітинах НМЕС-1, активованих АДФ
Контроль Мо 1 | Контроль Мо 2 Контроль Мо 4 Контроль
Умови експери- Тромбо- тромбо- Контроль Ме З тромбо- Ме 5 менту утворення утворення тромбоутворен" утворення тромосутворен" (піксель?--5Е) | (піксель?--5Е) ня (піксель-яЗЕ) (піксель? БЕ) ня Се ль тнереле-вантне ізотипне контрольне 6325-6697 1024-2335 399-82 45269 не визначали антитіло (100 мкг/мл)
Досліджене й5 (сиро-ватка паралельно з Я (сиро-ватка| Я! (сиро-ватка| 22 (сиро-ватка |й22 (сиро-ватка гострої фази і сироваткою гострої фази) | фази ремісії) |гострої фази) |/|фази ремісії) ст ' фази ремісії) суб'єкта з аниз
Для таблиць 24А і 24В: дані є середніми значеннями-5Е. "Р«0,001 відносно контролю; "р«0,001, ихР«О,05 відносно гострої фази аниз без обробки; Р«е0,001, Р«0,05 відносно фази ремісії аниз без обробки.
На фігурі 57 графічно представлений вплив антитіла проти МАБР-2 (0М5646) і 5СК1 на індуковане сироваткою тромбоутворення на АДФ-активованих клітинах НМЕС-1. На фігурі 57, наведені дані являють собою середні значення-5Е. "Р 0,0001, сеР«0,01 відносно контролю; "р-«0,0001, Р«0О,01 відносно гострої фази НОЗ без обробки; Р«0,0001 відносно фази ремісії анНиз без обробки.
Як показано в таблиці 24А і на фігурі 57, помітне збільшення площі, що покривається тромбами, спостерігалося на клітинах НМЕС-1, оброблених сироваткою анНиЗ, зібраною або під час гострої фази, або при ремісії, у порівнянні із клітинами, підданими впливу сироватки контрольних здорових суб'єктів (таблиця 248 і фігура 57). Як показано на фігурі 57 і в таблиці 24А, антитіло ОМ5646 (при 100 мкг/мл і 20 мкг/мл) виявляло часткове інгібування тромбоутворення на клітинах, попередньо підданих впливу сироватки аниб5, узятої під час гострої фази. Антитромбогений ефект був порівнянний для двох різних доз ОМ5646 і не відрізнявся від ефекту 5СКІ1 (фігура 57 і таблиця 24А). Додавання нерелевантного ізотипного контрольного антитіла не виявляло інгібуючої дії на тромбоутворення, індуковане аниз.
Крім того, як показано на фігурі 57 і в таблиці 24А, інгібуюча дія ОМ5646 була ще більш очевидною у випадку сироватки аниб5, зібраної під час фази ремісії. | дійсно, додавання
ОМ5646 у дозах 100 мкг/мл і 20 мкг/мл до сироватки пацієнта ани5, зібраної у фазі ремісії, приводило до майже повного інгібування тромбоутворення, аналогічного інгібуванню, спостережуваному при додаванні 5СК1!. Нерелевантне ізотипне контрольне антитіло не проявляло суттєвого інгібуючого ефекту.
При розрахунках середнього значення для трьох пацієнтів з ани5, спостережувані в присутності інгібіторів комплементу відсотки зменшення площі поверхні клітин НМЕС-1, покритої відкладеннями тромбів (у порівнянні із площею, покритою відкладеннями тромбів, викликаними необробленою сироваткою тих же пацієнтів, що приймається за 100 95), були наступними: гостра фаза: 5СКІ1 (150 мкг/мл): 60 95 зменшення,
ОМ5646 (100 мкг/мл): 57 95 зменшення,
ОМ5646 (20 мкг/мл): 45 95 зменшення, етап ремісії: 5СК1 (150 мкг/мл): 85 95 зменшення,
ОМ5646 (100 мкг/мл): 79 95 зменшення,
ОМ5646 (20 мкг/мл): 89 95 зменшення.
Обговорення результатів
Одержані в цьому прикладі результати показують, що МА5Р-2-інгібуюче антитіло, таке як
ОМ5646 (генероване, як описано в прикладі 40), виявляє сильну інгібуючу дію на індуковане сироваткою тромбоутворення на НМЕС-1. Дивно, але інгібуюча дія антитіла ОМ5646 на тромбоутворення була більшою, ніж його вплив на відкладення С5р-9, індуковані на НМЕС-1 (як описано в прикладі 41). Також дивно, що додавання ОМ5646 у дозах 100 мкг/мл і 20 мкг/мл до сироватки пацієнта з аниз5, зібраної при ремісії приводило до майже повного інгібування тромбоутворення. Іншим несподіваним результатом є спостереження того, що ОМ5646 як у гострій фазі, так і в фазі ремісії, був також ефективний, як позитивний контроль 5СК1, який є інгібітором широкої дії і майже повним інгібітором системи комплементу (УУеізтап Н. еї аї.,
Зсіепсе, 249:146-151, 1990; І агаг Н. єї аї., Сігсшайоп 100:1438-1442, 1999).
Слід зазначити, що контрольна сироватка здорових суб'єктів також викликала помірне тромбоутворення на клітинах НМЕС-1. Не було виявлено стійкого інгібуючого ефекту на тромбоутворення, індуковане контрольною сироваткою, ні у випадку ОМ5646, ні у випадку 5СА1. Не приводячи для підтвердження якої-небудь конкретної теорії, проте, можна припустити, що індуковані контрольною сироваткою тромби не залежать від комплементу, що підтверджується дуже низькими рівнями відкладень С5р-9, які виявляються на клітинах НМЕС- 1, інкубованих з контрольною сироваткою (дивіться приклад 41).
Висновки
На закінчення необхідно відзначити, що спостережувана антитромботична дія МА5Р-2- інгібуючого антитіла, такого як ОМ5646, виявляється значно більш високою, ніж можна було очікувати, основуючись на інгібуючій дії ОМ5646 на осадження С5рБ-9, спостережуваній в цій експериментальній системі (як описано в прикладі 41 і показано на фігурі 56). Наприклад, у публікації Сабвіоїді еї аї., Іттипобіоіоду, 217:1129-1222 Арвігасі 48 (2012), озаглавленій "Сба/СбБавВ-взаємодія опосередковує активацію комплементу і тромбоз на ендотеліальних клітинах при атиповому гемолітичному уремічному синдромі (аниб) ", було встановлено, що додавання антитіла проти С5, інгібуючого відкладення С5р-9 (зменшення на 60 95), обмежувало тромбоутворення на клітинах НМЕС-1 у порівнянному ступені (зменшення на 60 95). На відміну від цього, МАБ5Р-2-інгібуюче антитіло (0М5646 при 100 мкг/мл) інгібувало відкладення С56Б-9 з достатньо середніми значеннями (гостра фаза-зменшення на 40 95, фаза ремісії-зменшення на 5495) і інгібувало тромбоутворення при суттєво більш високому відсотку (гостра фаза-зменшення на 57 95, фаза ремісії-зменшення на 79 95). Для порівняння, антитіло ОМ5646 інгібувало осадження комплементу з більш низьким відсотком, ніж інгібітор комплементу для позитивного контролю (5СК1 при 150 мкг/мл, інгібування осадження С5Б-9 у гострій фазі-91 Об, у фазі ремісії-91 95), але воно було також ефективне, як і 5СА1-позитивний контроль при інгібуванні тромбоутворення (5СКІ при 150 мкг/мл, гостра фаза-зменшення на 60 95, фаза ремісії-зменшення на 85595). Ці результати показують, що МАБ5БР-2-інгібуюче антитіло (наприклад, ОМ5646) проявляє несподівану ефективність при інгібуванні тромбоутворення в сироватці крові, одержаної від суб'єктів з аних, як у гострій фазі, так і у фазі ремісії.
Відповідно до вищевикладеного, в одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від тромботичної мікроангіопатії (ТМА) або підданого ризику розвитку, тромботичної мікроангіопатії (ТМА), який включає введення бо суб'єкту композиції, що містить кількість МАБР-2-інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МАБР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, ТМА вибирають із групи, що складається з гемолітичного уремічного синдрому (НОБ), тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР) і атипового гемолітичного уремічного синдрому (аниз). В одному варіанті здійснення, ТМА являє собою анизв. В одному варіанті здійснення, композицію вводять пацієнту з ани»5 під час гострої фази захворювання. В одному варіанті здійснення, композицію вводять пацієнту з аних під час фази ремісії (тобто у суб'єкта, який відновився або частково відновився після епізоду гострої фази анизх, така ремісія підтверджується, наприклад, збільшенням кількості тромбоцитів і/або зниженими концентраціями лактатдегідрогенази (ОН) у сироватці, наприклад, як описано в публікації І оігаї С. єї а)., Огрпапеї дошттаї ої Ваге Оізєазев, 6:60, 2011, зміст якої включений в даний винахід шляхом посилання на неї).
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло характеризується щонайменше однією або більше із наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МА5Р-2 з величиною Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп в ССР1-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБ у дослідженні іп міго в 1 96 людській сироватці при величині ІСво 10 нМ або менше, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБ в 90 95 людській сироватці при величині ІСзо 30 нМ або менше, де антитіло являє собою фрагмент антитіла, вибраний із групи, що складається з Ем, Бар, Раб", Е(ар)» і Е(аб)г2, де антитіло являє собою одноланцюжкову молекулу, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідо2, де зазначене антитіло являє собою молекулу ІдДО1, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс4ї, де молекула Ідс4 містить мутацію 5228Р, і/або де антитіло практично не інгібує класичний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5Р-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує альтернативний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях або альтернативний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, залишаючи незачепленим класичний і альтернативний шляхи комплементу).
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові суб'єкта, що страждає від ТМА, такої як аниз (у гострій фазі або у фазі ремісії), щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 40 9565, наприклад щонайменше на 50 965, наприклад щонайменше на 60 95, наприклад щонайменше на 70 95, наприклад щонайменше на 80 96, наприклад щонайменше на 8595, наприклад щонайменше на 9095 і аж до 99595, у порівнянні з необробленою сироваткою. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові суб'єкта, що страждає від ани», на рівні, який щонайменше на 20 відсотків або більше (наприклад, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95) перевищує інгібуючу дію на осадження С5р-9 у сироватці крові.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові пацієнта з аниз у фазі ремісії щонайменше на 30 95, наприклад щонайменше на 4095, наприклад щонайменше на 50595, наприклад щонайменше на 6095, наприклад щонайменше на 70 95, наприклад щонайменше на 80 9565, наприклад щонайменше на 85 965, наприклад щонайменше на 90 95, наприклад щонайменше на 95 95 і аж до 99 95, у порівнянні із сироваткою, не обробленою антитілом. У деяких варіантах здійснення, МАБ5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові пацієнта з ани5 у фазі ремісії на рівні щонайменше на 20 відсотків або вище (наприклад, щонайменше на 30 95, щонайменше на 4095, щонайменше на 50 95) більше, ніж інгібуючий ефект відносно осадження С5Б5-9 у сироватці крові.
В одному варіанті здійснення, МАЗР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер.
В одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від ТМА, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість
МА5БР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що включає послідовність амінокислот з 31-35 послідовності з«ЕО ІЮ МО:67; і і) важкий ланцюг СОК-Н2, що включає послідовність амінокислот з 50-65 послідовності БЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг
СОВ-НЗ, що включає послідовність амінокислот з 95-102 послідовності 5ЕО ІЮ МО:67, ії Б) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ії) легсий ланцюг СОК-11, що включає послідовність амінокислот з 24-34 послідовності ХЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-12, що включає послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг
СОВ-ІЇЗ3, що включає послідовність амінокислот з 89-97 послідовності 5ХЕО ІЮ МО:70, або (ІІ) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 92 9о, щонайменше 60 з 93 965, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 9565, щонайменше з 97 95,
щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю з 5ЕО ІЮ МО:67) і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 95, щонайменше з 9295, щонайменше з 93 95, щонайменше з 94 95, щонайменше з 95 9565, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ФЗЕО ІЮ МО:70.
В одному варіанті виконання, ТМА вибирають із групи, що складається з атипового гемолітичного уремічного синдрому (аниз) (або в гострій фазі, або у фазі ремісії), НОЗ і ТТР. В одному варіанті здійснення, суб'єкт знаходиться в гострій фазі анО5. В одному варіанті здійснення, суб'єкт знаходиться в стадії ремісії анив.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає в себе амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5БР-2, розпізнаваного контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як послідовність ЗЕО
ІО МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, позначувану як послідовність зЗЕО ІЮ МО:70.
Конкуренцію між учасниками зв'язування можна легко досліджувати іп мійго, наприклад, використовуючи метод аналізу ЕГІЗА і/або шляхом введення мітки у вигляді специфічної репортерної групи в одного з учасників зв'язування, який може бути виявлений у присутності іншого неміченого учасника (учасників) зв'язування, для того, щоб забезпечити можливість ідентифікації специфічних учасників зв'язування, які зв'язують один і той же епітоп або епітоп, що перекривається. Таким чином, у даному винаході пропонується специфічне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які включають антигензв'язувальний сайт людського антитіла, який конкурує з контрольним антитілом ОМ5646 при зв'язуванні з лодською МАЗР-2.
ПРИКЛАД 43
Зо У цьому прикладі показано, що МАЗР-2-інгібуюче антитіло людини (0М5646) здатне інгібувати у ТМА-пацієнтів опосередковане плазмою індукування апоптозу в первинних людських мікроклітинах ендотелію судин (ММЕС) дермального походження.
Рівень вивченості проблеми/актуальність
Відомо, що патофізіологія ТМА включає ушкодження ендотеліальних клітин, викликане різними факторами, за яким ідуть оклюзія дрібних судин (наприклад, дрібних артеріол і капілярів) тромбоцитними пробками й/або фібриновими тромбами (Нігй-МіпкКом/5К Р. еї аї.,
Мернгоп Сіїп Ргасіїсе 114:с219-с235, 2010; Соїдрега В.9. єї аІ., Ат. у). Кідпеу Оів. 56(6):1168- 1174, 2010). Було показано, що мікроклітини ендотелію судин (МУЕС) піддаються апоптозному ушкодженню при іп міго впливі на них плазми пацієнтів з пов'язаними з ТМА порушеннями (дивіться 5іеїапезси еї аї., Віооа Мої. 112(2):340-349, 2008; Міга 0. еї а!., Віоса, 89:1224-1234, 1997). Пов'язане із ТМА апоптозне ушкодження було виявлене в мікроклітинах ендотелію судин (ММЕС), одержаних з біоптатів тканини (шкіри, кісток, кісткового мозку, селезінки, нирок, клубової кишки) таких пацієнтів. Було також показано, що апоптозні ураження ММЕС знижують рівні пов'язаних з мембранами регуляторних білків комплементу в мікроклітинах ендотелію судин (МУЕС) (дивіться, наприклад, Моїй 8. Могті5, Іттипоіоду, 102:359-364, 2001; Спгізітаз єї а!., Іттипоіоду, 119:522, 2006).
Вважається, що цикл позитивного зворотного зв'язку, що включає термінальні компоненти комплементу, залучений у патофізіологію ТМА, яка включає атиповий гемолітико-уремічний синдром (анНиз), і ТМА, пов'язані з катастрофічним антифосфоліпідним синдромом (САРБ), хворобою Дегоса і ТМА на фоні раку, протиракової хіміотерапії, аутоїмунної реакції і трансплантації, причому відомо або вважається, що кожен із цих станів сприйнятливий до анти-
Сб-терапії з використанням моноклонального антитіла (птАБ) екулізумабу (Спаріп .. еї а/ї., Вгії. 9.
Нетаїйо!. 157:772-774, 2012; Тваї еї аї!., Вг. 9). Наєтаїйо!. 162(4):558-559, 2013); Мадго С.М. еї аї.,
Уоитаї! ої Раге Різеазез, 8:185, 2013).
Проводили описаний далі експеримент по дослідженню здатності інгібуючого антитіла проти людської МАБР-2 (0М5646) блокувати у пацієнтів, що страждають від ТМА, індукований плазмою апоптоз у первинних людських дермальних мікроклітинах ендотелію судин (ММЕС) у зразках плазми, одержаних від пацієнтів, що страждають від НО5, від пов'язаної з дефіцитом
АБАМТ5З13 тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР), від катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САРБ) і системної хвороби Дегоса, а також від ТМА на фоні раку, трансплантації, аутоїмунного захворювання і хіміотерапії.
Методи
Проводили іп міго дослідження ефективності МА5Р-2-інгібуючого антитіла (0М5646) при блокуванні у пацієнтів з ТМА опосередкованого плазмою індукування апоптозу в первинних людських мікроклітинах ендотелію судин (ММЕС) дермального походження, як описано в публікації ЗіеГапезси К. еї аї., Віоса Мої. 112(2):340-349, 2008, зміст якої включений в даний винахід шляхом посилання на неї. Використовувані в цьому дослідженні зразки плазми одержували з колекції плазми контрольних здорових суб'єктів і пацієнтів з тромботичною мікроангіопатією, або в гострій фазі, або у фазі видужання. Присутність мікроангіопатії у пацієнтів 3 ТМА оцінювали шляхом виявлення шистоцитів у мазку периферичної крові. Крім того, тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (ТТР) діагностували, як описано в публікації
Зіетапезси В. еї аї., Віоса Мої. 112(2):340-349, 2008.
Культура ендотеліальних клітин (ЕС)
Описані в публікації Зіетапезси еї а. первинні людські мікроклітини ендотелію судин (ММЕС) дермального походження були надані фірмою ЗсіепСеї! Везеагсй І арз (Зап Оівєдо, СА). ММЕС експресували СОЗ4 з використанням пасажів 5 і 6 (Віоса, 89:1224-1234, 1997). ММЕС тримали в полістирольних матрацах, покритих 0,1 96 желатином у воді, у середовищі ЕСМ1001 (ЗсіепСеїЇ
Кезеагс! І арх), що містить добавку для росту ендотеліальні клітин, пеніцилін, стрептоміцин і 15 95 фетальну бичачу сироватку. Усі мікроклітини ендотелію судин (МУЕС) використовували в пасажах з 2 по 6. Пасажі включали вплив 0,25 95 трипсин-ЕОТА протягом від 5 до 10 хвилин.
Апоптоз
Типові первинні людські мікроклітини ендотелію судин (МУЕС) шкірного походження, про які було відомо, що вони сприйнятливі до апоптозу, індукованого ТТР/НОЗ-плазмою, промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином (РВ5) і висівали в 12-ямкових планшетах, покритих 0,1 95 желатином у воді при 0,15х109 життєздатних клітин/мл. Посіяні клітини ММЕС витримували в повному середовищі протягом 24 годин, і потім піддавали впливу різних концентрацій (від 2 до 20 95 за об'ємом) зразків плазми пацієнтів з ТМА або здорової донорської плазми протягом 18 годин у присутності або за відсутності моноклонального антитіла (тАбБ)
Зо проти МАБР-2 ОМ5646 (150 мкг/мл), і клітини потім збирали шляхом обробки трипсином.
Кожний зразок плазми пацієнта з ТМА досліджували у двох паралельних експериментах.
Ступінь апоптозу, опосередкованого плазмою, оцінювали шляхом забарвлення пропідіумиодидом (РІ), аналізу »5х103 клітин у цитофлуорографі і по піках АО, визначуваних за допомогою програмного забезпечення (МСусіє Ам, РіПоепіх Ріомж/ бЗузієт5, Зап Оієдо, СА).
Проводили також кількісне визначення в клітинному лізаті фрагментів ДНК, зв'язаних з цитоплазматичним гістоном, за допомогою фермент-зв'язаного імуносорбентного дослідження (ЕГІЗА) відповідно до інструкцій фірми-виробника (Коспе Оіадповіїс5, Мапппеїт, Септапу).
Результати
Результати дослідження апоптозу мікроклітин ендотелію судин (ММЕС), індукованого плазмою пацієнта з ТМА, у присутності моноклонального антитіла (птАБ) проти МА5БР-2 (ОМ5646) наведені нижче в таблиці 25.
Таблиця 25
Плазма пацієнта з ТМА, піддана випробуванням на первинних людських мікроклітинах ендотелію судин (ММЕС) дермального походження в присутності моноклонального антитіла (тАбБ) проти
МАБР-2 (0М5646)
Діагноз
Су- . Клінічний Діагноз на На | Захистза ' Вік/ діагноз МА5БР-2 . АРБАМО- | основі б'єкт Стать КТМА) іінші| нг/мл основі Са 5С5рЗ активність) ДРАМ5- допомогою
Мо Сте/ ОН ОомМ5646 стани актив- ності ефекту ефекту
Діагноз
Су- Клінічний Діагноз на на Захист за , Вік/ діагноз | МАБР-2 : АРАМЗ5- | основі б'єкт Стать КТМА) іінші| нг/мл ОСНОВІ Са 505р-9 активністьї) АСАМ5- допомогою
Мо Сте/ ОН ОоМ5646 стани актив- ності ефекту ребус )т | евоне вх не ду 13 49Л |рак, 142,8 | ТТР 48,6 3843 8695 |аниз ефекту
ТР
ТР, хвороба 46 25 Дегоса, 2251 |ПР 53,9 3426 |МО МО ефект
ЗЕ
ТР,
ЗЕ, нефрит 48 БЗ/Л |після 788,5 ІанО5 31,2 1066 ббз5 |анивз |ефект транс- план-тації нирки
ТР, 43 бал |АРІ А5, 494,5 35,4 2100 МО МО ефект
СУМА
АРІ А5 ' ' анив, о немає аниз ТР о немає
Умовні скорочені позначення, використовувані в таблиці 25: "АРІ Аз"-антифосфоліпідні антитіла, пов'язані з катастрофічним антифосфоліпідним синдромом (САРБ); "БІ Е"«системний червоний вовчак; "СМА"-гостре порушення мозкового кровообігу (інсульт).
Відповідно до результатів, опублікованих у публікації біегапеб5си К. еї аї., Віоой Мої. 112(2):340-349, 2008, спостерігався значний апоптоз первинних мікроклітин ендотелію судин (МУЕС) дермального походження в присутності тринадцяти зразків плазми пацієнтів з ТМА за відсутності антитіла проти МАЗР-2. Проходили паралельні випробування контрольних зразків плазми здорових людей, і вони не викликали апоптозу первинних мікроклітин ендотелію судин (ММУЕС) (дані не показані). Як показано в таблиці 25, МА5Р-2-інгібуюче моноклональне антитіло тАб (0М5646) інгібувало опосередкований плазмою пацієнтів з ТМА апоптоз первинних мікроклітин ендотелію судин (ММЕС) ("ефект" у таблиці 25) в б з 13 випробуваних зразків плазми пацієнта (46 95). Зокрема, слід зазначити, що МА5Р-2-інгібуюче моноклональне антитіло тА (0М5646) інгібувало апоптоз у плазмі, одержаній від пацієнтів, що страждають від НОБ,
ТТР, хвороби Дегоса, 5 Е, трансплантата і АРІ Аз (САРБ). Беручи до уваги той факт, що в семи зразках плазми пацієнтів, підданих цьому дослідженню, моноклональне антитіло (тАбБ) проти
МА5БР-2 не блокувало апоптоз ("немає ефекту" у таблиці 25), слід зазначити, що апоптоз може індукуватися по декількох шляхах, не всі з яких є залежними від комплементу. Наприклад, як відзначено в публікації Зіетапезси В. єї аїЇ., Віоой Мої. 112(2):340-349, 2008, апоптоз при дослідженні ендотеліальних клітин (ЕС) залежить від базального стану активації ЕС, на який впливають плазматичні фактори, які можуть відіграти деяку роль у визначенні рівня ушкодження, необхідного для індукування апоптозу. Крім того, як відзначено в публікації
ЗіеГапезси К. еї а!., у плазмі пацієнта з ТМА можуть бути присутні додаткові фактори, здатні модулювати апоптоз, такі як цитокіни і різні компоненти системи комплементу. Тому, внаслідок цих ускладнюючих факторів, не є несподіваним той факт, що антитіло проти МАБР-2 не виявляло блокуючої дії у всіх зразках плазми, у яких проявлявся апоптоз, індукований плазмою пацієнтів з ТМА.
Крім того, у зв'язку з цим необхідно відзначити, що проводилося аналогічне дослідження апоптозу, індукованого плазмою пацієнтів з ТМА, у присутності антитіла проти С5 екулізумабу, і були одержані дуже схожі результати (дивіться СПпаріп еї аїЇ., Вісоа (АЗН Аппиа! Мееїіпд
Арзігасів): Арзігасі Ж3342, 120: 2012). Клінічна ефективність екулізумабу, дуже успішного комерційного продукту, виявляється вище, ніж ефективність, продемонстрована в цій моделі, що дозволяє припустити, що в цій моделі іп міго може недооцінюватися клінічна ефективність лікарських засобів, інгібуючих комплемент.
Ці результати показують, що МА5Р-2-інгібуюче антитіло, таке як ОМ5646, ефективно інгібує апоптоз, індукований плазмою, одержаною від пацієнтів, що страждають ТМА, такими як анив,
ТТР, хвороба Дегоса, 5І Е, трансплантат і АРІ Аз (САРБ). Відомо, що ушкодження ендотелію і апоптоз відіграють ключову роль у патології ТМА, такій як ідіопатична ТТР і спорадичний НО5 (Кіт еї а!., Містомазсшаг Везвєагсі мої. 62(2):83-93, 2001). Як описано в публікації бапод еї аї.,
Віоса, 93(4):1264-1270, 1999, апоптоз виявлявся в червоній пульпі селезінки пацієнтів із ТР, але не у здорових контрольних суб'єктів. Докази апоптозу також виявлялися в клітинах ниркових клубочків ММЕС-походження у пацієнта з НО5 (Агепаз М. у. еї аІ., Нит. Рашої. 20:89, 1989).
Отже, можна припускати, що введення МА5Р-2-інгібуючого засобу, такого як МА5Р-2-інгібуюче антитіло (наприклад, ОМ5646), може стати ефективною терапією для пацієнтів, що страждають від ТМА, таких як анив5, ТТР або інший мікроангіопатичний розлад, такий як інша форма ТМА, що включає САР5, системну хворобу Дегоса і ТМА на фоні раку, ТМА на фоні хіміотерапії або
ТМА на фоні трансплантації.
Відповідно до вищевикладеного, в одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування ушкодження ендотеліальних клітин і/або апоптозу ендотеліальних клітин, і/або тромбоутворення у суб'єкта, що страждає від тромботичної мікроангіопатії (ТМА) або має ризик розвитку тромботичної мікроангіопатії (ТМА), який включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МА5ЗР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, ТМА вибирають із групи, що складається
Зо з атипового гемолітичного уремічного синдрому (аниз), тромботичної тромбоцитопенічної пурпури (ТТР) їі гемолітичного уремічного синдрому (НИБ5). В одному варіанті здійснення, ТМА являє собою анив5. В одному варіанті здійснення, композицію вводять пацієнту з аниз під час гострої фази захворювання. В одному варіанті здійснення, композицію вводять пацієнту з аниз під час фази ремісії (тобто суб'єкту, який відновився або частково відновився після епізоду гострої фази анивз, і така ремісія підтверджується, наприклад, збільшенням кількості тромбоцитів і/або зниженням вмісту ІОН у сироватці, наприклад, як описано в публікації І оігаї
С. еї аІ., Огрпапеї дошигпаї! ої Каге Оізхеазев, 6:60, 2011, зміст якої включений в даний винахід шляхом посилання на неї).
В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від ТМА або має ризик розвитку ТМА, яка є () ТМА на фоні раку; (ї) ТМА на фоні хіміотерапії; або (ії) ТМА на фоні трансплантації (наприклад, трансплантації органів, такої як трансплантація нирки або трансплантація алогенних гематопоетичних стовбурових клітин). В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від синдрому Апшо-Шульмана (055) або має ризик розвитку синдрому Апшо-Шульмана (55).
В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від хвороби Дегоса або має ризик розвитку хвороби Дегоса. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САР5) або має ризик розвитку катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САРБ).
Відповідно до будь-якого з розкритих у винаході варіантів здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло характеризується щонайменше однією або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МАЗР-2 з Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп в ССР1-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБ в аналізі іп міго в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 нМ або менше, зазначене антитіло інгібує осадження
СЗЬ в 90 95 людській сироватці при величині ІСво 30 нМ або менше, де антитіло є фрагментом антитіла, вибраним із групи, що складається з Ем, Раб, Рар', Е(аб)2» і К(аб)», де антитіло є одноланцюжковою молекулою, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс2, де зазначене антитіло являє собою молекулу ІДС, де зазначене антитіло являє собою молекулу
Ід904, де молекула Ідо4 містить мутацію 5228Р, і/або де антитіло практично не інгібує класичний шлях. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МАБР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує альтернативний шлях. В одному варіанті здійснення, бо антитіло зв'язується з МАБР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, залишаючи незачепленим класичний шлях комплементу).
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує індукований плазмою апоптоз мікроклітин ендотелію судин (ММЕС) у сироватці крові суб'єкта, що страждає від ТМА, такої як аниз (у гострій фазі або у фазі ремісії), гемолітичний уремічний синдром (НИБ), тромботична тромбоцитопенічна пурпура (ТТР), ТМА на фоні раку, ТМА на фоні хіміотерапії;
ТМА на фоні трансплантації (наприклад, трансплантації органів, наприклад трансплантації нирок або трансплантації гематопоетичних стовбурових клітин), або в сироватці крові суб'єкта, що страждає від синдрому Апшо-Шульмана (055), або в сироватці крові суб'єкта, що страждає від хвороби Дегоса, або суб'єкта, що страждає від катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САРБ5), де індукований плазмою апоптоз мікроклітин ендотелію судин (ММЕС) інгібується щонайменше на 5 95, наприклад щонайменше на 10 95, наприклад щонайменше на 20956, наприклад щонайменше на 3095, наприклад щонайменше на 4095, наприклад щонайменше на 60 95, наприклад щонайменше на 7095, наприклад щонайменше на 80 95, наприклад щонайменше на 85 95, наприклад щонайменше на 90 95, наприклад щонайменше від 95 до 9995, у порівнянні із сироваткою, не обробленою антитілом. У деяких варіантах здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує тромбоутворення в сироватці крові суб'єкта, що страждає від ТМА, наприклад, такої як аниз (у гострій фазі або фазі ремісії), гемолітичний уремічний синдром (НИ5), тромботична тромбоцитопенічна пурпура (ТТР), ТМА на фоні раку,
ТМА на фоні хіміотерапії, ТМА на фоні трансплантації (наприклад, трансплантації органів, такої як трансплантація нирки або трансплантація алогенних гематопоетичних стовбурових клітин), або у сироватці крові суб'єкта, що страждає від синдрому Апшо-Шульмана (055), або в сироватці крові суб'єкта, що страждає від хвороби Дегоса, або у суб'єкта, що страждає від катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САР5Б), на рівні щонайменше на 20 відсотків або більше (наприклад, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95) вище, ніж інгібуюча дія на осадження С5р-9 у сироватці крові.
В одному варіанті здійснення, МАБР-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту через внутрішньовенний катетер або іншим методом доставки через катетер.
В одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб інгібування тромбоутворення у
Зо суб'єкта, що страждає від ТМА (наприклад, анОзЗ (у гострій фазі або у фазі ремісії), гемолітичного уремічного синдрому (НИБ), тромботичної тромбоцитопенічної пурпури («ТТР),
ТМА на фоні раку, ТМА на фоні хіміотерапії ТМА на фоні трансплантації (наприклад, трансплантації органів, такої як трансплантація нирок або трансплантація гематопоетичних стовбурових клітин), або в сироватці крові суб'єкта, що страждає від синдрому Апшо-Шульмана (055), або в сироватці крові суб'єкта, що страждає від хвороби Дегоса, або у суб'єкта, що страждає від катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САРБ)), який включає введення суб'єкту композиції яка включає кількість МАЗР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що містить послідовність амінокислот з 31-35 послідовності
ЗБО ІО МО:67; і її) важкий ланцюг СОК-Н2г, що містить послідовність амінокислот з 50-65 послідовності зЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-НЗ, що містить послідовність амінокислот з 95-102 послідовності 5ЕО ІЮО МО:67, і В) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легкий ланцюг СОК-Ї1, що містить послідовність амінокислот з 24-34 послідовності 5ЕО ІЮ
МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-1 2, що містить послідовність амінокислот з 50-56 послідовності
ЗБО ІО МО:70; і ії) легсий ланцюг СОК-ЇЗ, що містить послідовність амінокислот з 89-97 послідовності «ЕС ІЮ МО:70, або (ІІ) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 906 тотожністю з 5ЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 9ро, щонайменше з 9295, щонайменше з 9395, щонайменше з 9495, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 96, щонайменше з 97 96, щонайменше з 98 96, щонайменше з 99 95 тотожністю з 5ЕО ІЮ МО:67) і варіабельну область легксого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 956, щонайменше з 92 95, щонайменше з 93 9565, щонайменше з 94 9565, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 96, щонайменше з 97 96, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ЗЕО ІЮ МО:70.
В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від ТМА, вибраної із групи, що складається з
ТМА на фоні раку, ТМА на фоні хіміотерапії ТМА на фоні трансплантації (наприклад, трансплантації органів, такої як трансплантація нирок або трансплантація алогенних гематопоетичних стовбурових клітин), синдрому Апшо-Шульмана (055), хвороби Дегоса і катастрофічного антифосфоліпідного синдрому (САР5Б).
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає бо кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає в себе амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67. У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає варіабельну область легкого ланцюга, що включає в себе амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зХЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5БР-2, розпізнаваного контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як послідовність ЗЕО
ІО МО:67, і варіабельну області легкого ланцюга, позначувану як послідовність 5ЕО ІЮ МО:70.
ПРИКЛАД 44
У цьому прикладі описуються початкові результати проведеного клінічного випробування у фазі 2 з метою оцінки безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального інгібуючого антитіла проти МА5БР-2 у дорослих пацієнтів із тромботичними мікроангіопатіями (ТМА).
Рівень вивченості проблеми
Тромботичні мікроангіопатії (ТМА) являють собою сімейство рідких, виснажливих і небезпечних для життя порушень, що характеризуються утворенням надмірної кількості тромбів (згустків) - агрегатів тромбоцитів - у капілярному кровообігу органів тіла, звичайно в нирках і головному мозку.
Методи
Перший етап відкритого клінічного випробування фази 2 проводили на пацієнтах з первинним атиповим гемолітичним уремічним синдром (анНиб), з резистентним до плазмотерапії аниз і з тромботичною тромбоцитопенічною пурпурою (ТТР). У цьому клінічному випробуванні другої фази не застосовують плацебо, враховуючи небезпечний для життя характер захворювання.
Піддавали скринінгу суб'єктів у віці »18 років, і в це дослідження включали тільки тих суб'єктів, у яких була діагностована одна з наступних ТМА. 1) Первинний анНи5, який діагностований клінічно і має активність АОАМТ513 »10 965 у
Зо плазмі. Придатними є пацієнти з документованою мутацією в комплементі або без мутації, або з наявністю антитіла проти СЕН. Пацієнтів класифікують відповідно до їх реакції відповіді на плазмотерапію (заміщення плазми або інфузію плазми): о резистентні до плазмотерапії пацієнти з анНиз, для цілей даного дослідження задовольняють усім наступним вимогам: (а) скринінг кількості тромбоцитів «150000/мкл, незважаючи на те, що до скринінгу проводилося чотири сеанси плазмотерапії; (б) докази мікроангіопатичного гемолізу (присутність шизоцитів, вміст лактатдегідрогенази (ОН) у сироватці вище верхньої межі норми (ШІ-М), гаптоглобін «І ІМ); і (с) вміст креатиніну в сироватці гі М; о пацієнти з анив, сприйнятливі до тривалої плазмотерагпії (чутливі до плазмотерапії), яким може бути потрібне щонайменше застосування плазмотерапії один раз на тиждень протягом чотирьох тижнів до введення першої дози ОМ5646 при вмісті креатину в сироватці »ЦІ М. 2) ТТР визначається всіма наступними показниками: о кількість тромбоцитів «150000/мкл; о докази мікроангіопатичного гемолізу (присутність шизоцитів, вміст лактатдегідрогенази (ОН) у сироватці »ЦІ-М, гаптоглобін «І І М)); і о активність АСАМТ513 «10 95 під час поточного нападу ТТР або постійно.
Примітка: суб'єктів виключали з дослідження, якщо їх піддавали терапії з екулізумабом протягом трьох місяців до скринінгу. Критерії для пацієнта, класифікованого як резистентний до плазмотерапії, використовували для визначення прийнятності його участі в цьому дослідженні.
У додаткових аспектах винаходу, пацієнт, резистентний до плазмотерапії, який повинен бути підданий лікуванню інгібітором МАБЗР-2, попередньо піддавався плазмотерапії щонайменше один раз, і, після такого лікування за допомогою плазмотерапії, у нього виявляли один або більше клінічних маркерів анивх, які адекватно не зменшилися або не були усунені в результаті такої плазмотерапії.
Використовуване в цьому дослідженні моноклональне антитіло ОМ5646 є повністю людським ІдД054 моноклональним антитілом проти людської МА5Р-2. Як показано в прикладі 40,
ОМ5646 міцно зв'язується з рекомбінантною МАБР-2 (з гаданою рівноважною константою дисоціації в діапазоні 100 пМ) і проявляє селективність більше ніж в 5000 разів вище в бо порівнянні зі зв'язуванням з гомологічним білком С15, Сіг і МАБР-1. У функціональних дослідженнях, ОМ5646 інгібує лектиновий шлях у людини з активністю в наномолярному діапазоні концентрацій (концентрація, що приводить до інгібування 50 95 (ІСво|, приблизно дорівнює З НМ), але не виявляє суттєвого впливу на класичний шлях. Внутрішньовенне або підшкірне введення ОМ5646 мишам, приматам і людям приводило до високих концентрацій у плазмі, які були пов'язані із пригніченням активації лектинового шляху при дослідженні ех мімо.
Як додатково описано в прикладі 42, введення ОМ5646 зменшувало осадження С56р-9 і тромбоутворення в експериментальних моделях ТМА і тромбоутворення іп міго на мишах, тим самим демонструючи можливість терапевтичного застосування ОМ5646.
У цьому дослідженні, лікарський засіб ОМ5646 приготовляли з концентрацією 100 мг/мл, яку потім розбавляли у випадку внутрішньовенного введення. Відповідний розрахований об'єм розчину ОМ5646 100 мг/мл для ін'єкцій відбирали із флакона шприцом для приготування дози.
Мішок для інфузії застосовували протягом чотирьох годин після приготування.
На першій стадії дослідження, ОМ5646 вводили в зростаючій дозі в групах, кожна з яких включала трьох пацієнтів. Кожному суб'єкту на стадії 1 вводили дозу ОМ5646 один раз на тиждень протягом чотирьох тижнів, як показано нижче в таблиці 26.
Таблиця 26
Схема дозування на стадії 1
Етап 1. Схема дизайну дослідження
Період лікування скомніне. І Дозай! Й Доза й? Й Дозай З Її Доза женнк ніеля родео Р де | ідДеей (День 5 7 День 223 ПОЗІ,
Розведений досліджуваний лікарський засіб вводили внутрішньовенно протягом 30 хвилин.
Первинні кінцеві точки
Супутніми первинними кінцевими точками були: " безпека, яка оцінюється по побічних ефектах, основні показники стану організму, ЕКГ і клінічні лабораторні випробування, " клінічна активність, визначувана по зміні кількості тромбоцитів.
Вторинні кінцеві точки
Вторинними кінцевими точками були:
Зо " клінічна активність ТМА о ІОН у сироватці, о гаптоглобін у сироватці, о гемоглобін, о креатинін у сироватці, о симптоми, пов'язані з ТМА, о потреба в плазмотерагпії (у заміщенні плазми або в інфузії плазми), о потреба в діалізі.
Дозволені супутні терапії: " резистентний до плазмотерапії ани5 - плазмотерапія під час лікування за допомогою
ОМ5646 дозволялася, якщо дослідник уважає, що вона показана з медичної точки зору; " сприйнятливий до тривалої плазмотерапії анО5 - досліднику було рекомендовано продовжити застосування плазмотерапії доти, поки не виявляться ознаки поліпшення ТМА, наприклад збільшення кількості тромбоцитів, зниження ОН, збільшення гаптоглобіну, збільшення гемоглобіну, зниження креатиніну, після чого досліднику було рекомендовано розглянути можливість відмови від плазмотерапії і проводити постійний контроль параметрів
ТМА для оцінки можливості відмови від застосування плазмо терапії;
"- ТТР - застосування плазмотерапії дозволяли, якщо дослідник вважав, що вона показана з медичної точки зору; " досліднику було рекомендовано, щоб гемодіаліз проводився згідно зі стандартом лікування; " екулізумаб не вводили під час дослідження.
Результати
Перша група суб'єктів складалася із трьох пацієнтів анО5, що одержували найнижчу дозу
ОМ5646. Спостерігалися поліпшення маркерів ТМА у всіх пацієнтів у цій групі дослідження. Як маркери активності хвороби визначали кількість тромбоцитів, вміст лактатдегідрогенази (ІОН) у сироватці і вміст гаптоглобіну в сироватці У порівнянні з вихідними рівнями, кількість тромбоцитів поліпшувалася у всіх пацієнтів. Рівні ОН у сироватці залишалися нормальними у одного пацієнта, суттєво зменшувалися до близького до нормального діапазону у другого пацієнта і залишалися підвищеними у третього пацієнта. Гаптоглобін поліпшувався у двох пацієнтів, нормалізувався у одного пацієнта. У одного пацієнта з незалежною функцією нирок також поліпшувалися рівні креатиніну.
Згідно з дизайном дослідження, трьох пацієнтів піддавали лікуванню за допомогою середньої дози в другій групі цього клінічного випробування. Два пацієнти з аНнНО5 мають резистентність до плазмотерапії, і один пацієнт страждає тромботичною тромбоцитопенічною пурпурою (ТТР). Обом пацієнтам з анО5 проводили гемодіаліз до і під час дослідження. У другій групі або в групі із середньою дозою, пацієнти з аниз з резистентністю до плазмотерапії характеризувалися: "- 47 9У5 збільшенням середньої кількості тромбоцитів, що приводило до того, що обидва пацієнти мали кількість тромбоцитів у діапазоні нормальних значень, - 86 96 зниження середнього числа шизоцитів, при цьому у одного пацієнта шизоцити зникли, "71 95 збільшення середнього рівня гаптоглобіну, при цьому у двох пацієнтів він досягав діапазону нормальних значень під час лікування, у одного пацієнта він опускався трохи нижче норми протягом одного тижня після останнього дозування, - 595 зниження середніх рівнів ГОН, при цьому рівні у двох пацієнтів залишалися трохи підвищеними відносно діапазону нормальних значень.
Зо Пацієнту з ТТР із групи з середньою дозою було потрібне повторення інфузії плазми перед участю в дослідженні. Лабораторні параметри не показали стійкого поліпшення, але при лікуванні за допомогою ОМ5646, а також на момент завершення лікування, пацієнту не було потрібне застосування плазмотерапії.
Препарат добре переносився всіма пацієнтами протягом усього періоду лікування.
Основуючись на позитивних результатах для другої групи або групи з середньою дозою, були початі дослідження в третій групі або групі з високою дозою, а дослідження пацієнта з аниОз5 вже були закінчені. Дані, що стосуються всіх пацієнтів, включають вимірювання протягом одного тижня після введення останньої дози.
Було також завершене лікування за допомогою ОМ5646 першого пацієнта в третій групі (у групі з високою дозою), пацієнта з анОб, який був резистентний до плазмотерапії і мав додаткові ускладнення, включаючи гепатит С, кріоглобулінемію і лімфому. До лікування за допомогою ОМ5646, пацієнту був потрібний повторний діаліз. Протягом лікування і після завершення курсу за допомогою ОМ5646 і до даного часу пацієнт не потребував діалізу.
Гематологічні і ниркові параметри показали: поліпшення на 63 95 кількості тромбоцитів, повернення до нормальних рівнів, зниження на 100 95 шистоцитів, гаптоглобін збільшився з невизначуваного рівня і нормалізувався, зниження на 43 95 І ОН, у результаті чого встановився рівень трохи вище норми, зниження на 24 95 рівня креатиніну.
Лікарський засіб добре переносився як в першій групі, так і другий групі.
Первинною кінцевою точкою в цьому відкритому клінічному дослідженні фази 2 є зміна кількості тромбоцитів. Кількість тромбоцитів у всіх трьох пацієнтів з аних у групах з середньою і високою дозою (два пацієнти в групі з середньою дозою і один пацієнт у групі 3 високою дозою) повернулася до норми, зі статистично значимим середнім збільшенням від вихідного рівня приблизно 68000 тромбоцитів/мл (р-0,0055).
Таким чином, дані, одержані перед фазою 2 цього клінічного дослідження, демонструють ефективність впливу ОМ5646 на пацієнтів з первинним аниз, на пацієнтів з анив, резистентних до плазмотерапії, і на пацієнтів з ТТР.
Відповідно до вищевикладеного, в одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб бо лікування суб'єкта, що страждає від резистентного до плазмотерапії анО5, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МА5БР-2-залежної активації комплементу. У деяких варіантах здійснення, спосіб додатково включає стадію ідентифікації суб'єкта, що страждає від резистентного до плазмотерапії ани5, перед введенням суб'єкту композиції що включає МАЗ5Р-2-інгібуюче антитіло.
Відповідно до будь-якого з розкритих у винаході варіантів здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше із наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людський МА5Р-2 з Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп в
ССРІ-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБ в аналізі іп міго в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 НМ або менше, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБЬ в 90 95 людській сироватці з величиною ІСхо 30 нМ або менше, де антитіло є фрагментом антитіла, вибраним із групи, що складається з Ем, Раб, ЕРар, Р(ар)» і Е(аб)», де антитіло є одноланцюжковою молекулою, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс2, де зазначене антитіло являє собою молекулу ІдсС1, де зазначене антитіло являє собою молекулу
І3054, де молекула Ідсб4 містить мутацію 5228Р. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, не зачіпаючи класичний шлях комплементу).
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло вводять у кількості, ефективній для поліпшення щонайменше одного або декількох клінічних параметрів, пов'язаних з анив, таких як збільшення кількості тромбоцитів, зниження І ОН, збільшення гаптоглобіну, збільшення гемоглобіну й/(або зменшення креатиніну.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАЗ5Р-2-інгібуючого антитіла суб'єкту, що страждає від резистентного до плазмотерапії ани5, через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, протягом щонайменше від одного дня до тижня або двох тижнів), і потім введення МА5Р-2-інгібуючого антитіла суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, у стадії тривалого лікування, протягом щонайменше двох тижнів або більше). У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий періоди часу проводять без застосування плазмотерапії. У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий періоди часу проводять із застосуванням плазмотерапії.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАЗ5Р-2-інгібуючого антитіла суб'єкту, що страждає від резистентного до плазмотерапії анНиз5, або внутрішньовенно, внутрішньом'язово, або переважно підшкірно. Лікування може бути тривалим і застосовуватися від одного разу на день до одного разу на місяць, але переважно один раз кожні два тижні.
МА5БР-2-інгібуюче антитіло можна вводити окремо або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
В одному варіанті здійснення, спосіб включає лікування суб'єкта, що страждає від резистентного до плазмотерапії анО5, яке включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить (1) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що містить послідовність амінокислот з 31-35 послідовності з«ЕО ІЮ МО:67; і і) важкий ланцюг СОК-Н2, що містить послідовність амінокислот з 50-65 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-
НЗ, що містить послідовність амінокислот з 95-102 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67, і Ю) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легсий ланцюг СОМ-Ї1, що містить послідовність амінокислот з 24-34 послідовності 5ЕО ІЮО МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-12, що містить послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-Ї З, що містить послідовність амінокислот з 89-97 послідовності ФЕО ІЮ МО:70, або (Ії) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 956, щонайменше з 92 95, щонайменше з 93 9565, щонайменше з 94 9565, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 96, щонайменше з 97 96, щонайменше з 98 95, щонайменше з 9995 тотожністю з 5ЕО ІЮ МО:67) і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 9095 тотожністю (наприклад, щонайменше з 9195, щонайменше з 92 95, щонайменше з 9395, щонайменше з 9495, щонайменше з 9595, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з «ЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІО МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЗЕО ІОЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає 60 МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5БР-2, розпізнаваного контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну області легкого ланцюга, позначувану як ЗЕО ІЮ МО:70.
ПРИКЛАД 45
У цьому прикладі описуються додаткові результати проведеного клінічного випробування у фазі 2 з метою оцінки безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального інгібуючого антитіла проти МА5БР-2 у дорослих пацієнтів із тромботичними мікроангіопатіями (ТМА), що описані у прикладі 44.
Рівень вивченості проблеми
Як описано в прикладі 44, тромботичні мікроангіопатії (ТМА) являють собою сімейство рідких, виснажливих і небезпечних для життя порушень, що характеризуються утворенням надмірної кількості тромбів (згустків) - агрегатів тромбоцитів - у капілярному кровообігу органів тіла, звичайно в нирках і головному мозку. Як описано у винаході, ТМА на фоні трансплантації (ТА-ТМА) являє собою дуже небезпечний синдром, який може виникати у пацієнтів із трансплантацією, такою як трансплантація гематопоетичних стовбурових клітин (НЗСТ).
У цьому прикладі описується початкові результати клінічного випробування фази 2 для оцінки безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального МАБР-2- інгібуючого антитіла у пацієнта, що страждає від ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин.
Методи
Як описано в прикладі 44, дослідження ТМА у фазі 2 складається зі стадії трирівневого дозування, за якою іде стадія фіксованого дозування МА5Р-2-інгібуючого антитіла ОМ5646. Як додатково описано в прикладі 44, стійкі і надійні позитивні результати були одержані у випадку пацієнтів з 8НИО5 і одного пацієнта з ТТР. Так само, як і у випадку групи з низькою дозою,
ОМ5646 добре переносилося всіма пацієнтами в групах з середньою і високою дозами протягом усього періоду лікування. Були завершені доклінічні дослідження токсичності, і вони не виявили ніяких проблем, пов'язаних з безпекою застосування цього антитіла, що дозволяло проводити тривале дозування при клінічних випробуваннях.
Як описано в прикладі 44, були одержані дані клінічного дослідження фази 2 ОМ5646 у випадку ТМА для пацієнтів з анО5 і ТТР. Було закінчене дозування одного додаткового пацієнта із ТМА, пов'язаною із трансплантацією стовбурових клітин, у групі 3 високою дозою, використовуючи методи, описані в прикладі 44. Цей пацієнт мав в анамнезі лімфому, у зв'язку з якою він піддавався трансплантації гематопоетичних стовбурових клітин. Перебіг його захворювання після трансплантації ускладнювався рядом загрозливих для життя порушень, у тому числі і ТМА, що вимагає інфузії тромбоцитів. Незважаючи на інфузію, у нього зберігалася
ТМА, пов'язана із трансплантацією стовбурових клітин, і він брав участь у дослідженні у фазі 2 антитіла ОМ5646.
Результати
Після дозування протягом чотирьох тижнів (група з високою дозою), як описано в прикладі 44, пацієнт із ТМА, пов'язаною з трансплантацією стовбурових клітин, характеризувався: чотириразовим збільшенням кількості тромбоцитів, у результаті чого кількість тромбоцитів перевищила 100000; рівень гаптоглобіну збільшився більше ніж у два рази і досяг норми; рівень лактатдегідрогенази в плазмі, показник ушкодження в кровоносних судинах, зменшився на 35 95, але усе ще був вище норми; виявлялася присутність одиничних шистоцитів.
Протягом усього часу дозування ОМ5646 і після завершення лікування ОМ5646 пацієнт не вимагав ні застосування інфузії тромбоцитів, ні застосування плазмаферезу.
Таким чином, дані, одержані у фазі 2 цього клінічного дослідження (як описано в прикладі 44 і в цьому прикладі), демонструють ефективність впливу ОМ5646 на пацієнтів з первинним анив, на пацієнтів з анив5, резистентних до плазмотерапії, на пацієнтів з ТТР і на пацієнта з
ТМА, пов'язаною з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин.
Відповідно до вищевикладеного, в одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб лікування людини, що страждає від ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАЗР-2- інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МА5БР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, яка резистентна до лікування шляхом інфузії тромбоцитів іабо плазмаферезу. В одному варіанті здійснення, спосіб включає ідентифікацію людини, що бо страждає від ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, яка резистентна до лікування шляхом інфузії тромбоцитів і/або плазмаферезу, до стадії введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МАБР-2-інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу.
Відповідно до будь-якого з розкритих у винаході варіантів здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше із наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МАБР-2 з Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп в
ССРІ-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБ в аналізі іп міго в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 НМ або менше, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБЬ в 90 95 людській сироватці при величині ЇСво 30 нМ або менше, де антитіло є фрагментом антитіла, вибраним із групи, що складається з Ем, Раб, ЕРар, Р(ар)» і Е(аб)», де антитіло є одноланцюжковою молекулою, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс2, де зазначене антитіло являє собою молекулу ІдДС1, де зазначене антитіло являє собою молекулу
І354, де молекула Ід024 містить мутацію 5228Р. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5БР-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, залишаючи незачепленим класичний шлях комплементу).
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло вводять у кількості, ефективній для поліпшення щонайменше одного або декількох клінічних параметрів, що належать до ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, таких як збільшення кількості тромбоцитів (наприклад, щонайменше у два рази, щонайменше у три рази, щонайменше у чотири рази, у порівнянні із числом тромбоцитів до лікування), збільшення гаптоглобіну і/або зниження лактатдегідрогенази.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАЗ5Р-2-інгібуючого антитіла суб'єкту, що страждає від ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, щонайменше протягом від одного дня до тижня або двох тижнів) з наступним введенням МА5Р- 2-інгібуючого антитіла суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, протягом тривалого часу, щонайменше протягом двох тижнів або більше). У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий період часу проводять без застосування плазмотерапії. У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий період часу проводять при
Зо застосуванні плазмотерапії.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАЗ5Р-2-інгібуючого антитіла суб'єкту, що страждає від ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, або внутрішньовенно, внутрішньом'язово, або переважно підшкірно. Лікування може бути тривалим і проводитися від одного разу на день до одного разу на місяць, але переважно один раз кожні два тижні. МАЗР-2-інгібуюче антитіло можна вводити окремо або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
В одному варіанті здійснення, спосіб включає лікування суб'єкта, що страждає від ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАБР-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що включає (І) (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: ї) важкий ланцюг СОК-НІ, що містить послідовність амінокислот з 31-35 послідовності
ЗБО ІО МО:67; і її) важкий ланцюг СОК-Н2г, що містить послідовність амінокислот з 50-65 послідовності зЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-НЗ, що містить послідовність амінокислот з 95-102 послідовності 5ЕО ІЮО МО:67, і В) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легкий ланцюг СОК-Ї1, що містить послідовність амінокислот з 24-34 послідовності 5Е0 ІЮ
МО:70; і її) легкий ланцюг СОК-1 2, що містить послідовність амінокислот з 50-56 послідовності
ЗБО ІО МО:70; і ії) легсий ланцюг СОК-ЇЗ, що містить послідовність амінокислот з 89-97 послідовності «ЕС ІЮ МО:70, або (ІІ) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 906 тотожністю з 5ЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 9ро, щонайменше з 9295, щонайменше з 9395, щонайменше з 9495, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю з 5ЕО ІЮ МО:67) і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю (наприклад, щонайменше з 91 956, щонайменше з 92 95, щонайменше з 93 9565, щонайменше з 94 9565, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 96, щонайменше з 97 96, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ЗЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає в себе амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить 60 амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЗЕО ІОЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5БР-2, розпізнаваного контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як послідовність «ЕС
ІО МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, позначувану як послідовність 5ЕО ІЮ МО:70.
ПРИКЛАД 46
У цьому прикладі описуються додаткові результати, одержані в проведеному клінічному дослідженні фази 2 для оцінки безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального МАЗБР-2-інгібуючого антитіла у дорослих пацієнтів із тромботичними мікроангіопатіями (ТМА), що описані у прикладах 44 і 45.
Рівень вивченості проблеми
Як описано у прикладі 45, ТМА (ТА-ТМА), пов'язана з трансплантацією, є дуже небезпечним синдром, який може виникати у пацієнтів, що перенесли трансплантацію, таких як реципієнти трансплантата гематопоетичних стовбурових клітин (НЗСТ). ТМА, пов'язані з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НБСТ-ТМА), являють собою небезпечне для життя ускладнення, викликане ушкодженням ендотелію. Найбільш часто уражуваним органом є нирки, хоча НЗСТ-ТМА може являти собою і системне захворювання, при якому також уражуються легеня, кишечник, серце і мозок. Виникнення навіть легкої ТМА пов'язане із тривалою нирковою недостатністю. Розвиток посталогенної НеСтТ-пов'язаної ТМА відрізняється по частоті виникнення, залежно від різних діагностичних критеріїв і схем запобігання відторгненню трансплантата в організмі-хазяїна, при цьому інгібітори кальциневрину найбільш часто викликають виникнення НеСтТ-пов'язаної ТМА (Но М.Т. еї аї., Віої. Віооа Маггом Тгаперіапі, 11(8):571-5, 2005). Модифікація режиму дозування імуносупресивного інгібітору кальциневрину може приводити до поліпшення ТМА у деяких пацієнтів протягом декількох тижнів після відміни або припинення введення інгібітору кальциневрину.
ТМА є потенційно небезпечним для життя ускладненням при Н5СТ, і на даний час тактика лікування основана, значною мірою, на зменшенні впливу провокуючих факторів, включаючи виключення застосування імунодепресантів (наприклад, інгібіторів кальциневрину) і лікування поточних інфекцій, а також на підтримуючих терапіях, таких як гемодіаліз. Незважаючи на те,
Зо що багато пацієнтів НОСТ-ТМА добре реагують на зниження або переривання приймання імунодепресантів, проте існує підгрупа пацієнтів, у яких спостерігається стійка НЗСТ-ТМА, незважаючи на консервативні способи лікування (тобто ТМА не реагує на зменшення дози імунодепресантів або на переривання їх приймання). Пацієнти, які не реагують на ці консервативні методи лікування, мають поганий прогноз. Заміщення плазми було неефективним, і ніякої іншої терапії схвалено не було.
У прикладі 45 описані початкові позитивні результати клінічного випробування фази 2 для оцінки безпеки і клінічної ефективності повністю людського моноклонального МАБР-2- інгібуючого антитіла (0М5646) у пацієнта, що страждає від постійної ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НЗСТ-ТМА). У цьому прикладі описується додаткові результати поточного клінічного випробування фази 2 для оцінки безпеки і клінічної ефективності ОМ5646 у трьох додаткових суб'єктів, що страждають постійною НОСТ-
ТМА, резистентною до консервативних способів лікування.
Методи
Як описано в прикладі 44, дослідження ТМА у фазі 2 складається зі стадії трирівневого дозування, за якою іде введення фіксованої дози МАБ5БР-2-інгібуючого антитіла ОМ5646.
ОМ5646 добре переносився всіма пацієнтами в групах з низькою, середньою і високою дозами протягом усього періоду лікування. Були завершені доклінічні дослідження токсичності, і вони не виявили ніяких проблем, пов'язаних з безпекою застосування цього антитіла, що дозволяло проводити тривале дозування при клінічних випробуваннях.
У дослідженні ТМА у фазі 2 брали участь суб'єкти, що страждають постійною ТМА, пов'язаною з НЗСТ, резистентною до консервативних способів лікування, яку визначали для цілей даного дослідження як таку, що характеризується всіма наведеними нижче показниками щонайменше через два тижні після відміни або припинення приймання імуносупресивного засобу (наприклад, інгібітору кальциневрину) або щонайменше через 30 днів після трансплантації: - тромбоцитопенія (кількість тромбоцитів «150000/мкл), і - докази мікроангіопатичної гемолітичної анемії (наявність шистоцитів, лактатдегідрогеназа (ОН) у сироватці »верхньої межі норми (ШІ-М) або гаптоглобін «нижньої межі норми (ГІ-М)).
Дозволена супутня терапія для НЗСТ-пов'язаної ТМА 60 " Застосування плазмотерапії під час лікування за допомогою ОМ5646 дозволяли, якщо дослідник вважав, що воно показане з медичної точки зору. Пацієнтам, до яких застосовували плазмотерапію, могли вводити додаткові половинні дози ОМ5646. " Дослідникам було рекомендовано, щоб гемодіаліз проводився згідно зі стандартом лікування. " Екулізумаб не вводили під час дослідження.
У це дослідження ТМА включені суб'єкти, що страждають постійною НОСТ-ТМА, яка резистентна до стандартних способів лікування (тобто постійна ТМА щонайменше через два тижні після відміни або переривання лікування інгібітором кальциневрину).
Як описано в прикладі 45, було завершене дозування пацієнта, що страждає постійною
НЗСТ-ТМА (пацієнт Ме 1), у групі з високою дозою (4 мг/кг ОМ5646, що вводиться внутрішньовенно один раз на тиждень протягом чотирьох тижнів) з використанням методів, описаних у прикладі 44.
Було завершене дозування додаткових 4 пацієнтів, що страждають постійною НЬСТ-ТМА, як описано нижче.
Пацієнту Мо 1 (описаному в прикладі 44) вводили ОМ5646 протягом чотирьох тижнів (4 мг/кг внутрішньовенно один раз на тиждень).
Пацієнтам Ме 2 ії Мо З вводили ОМ5646 протягом восьми тижнів (4 мг/кг внутрішньовенно один раз на тиждень).
Пацієнтам Ме 4 і Мо 5 вводили ОМ5646 (4 мг/кг внутрішньовенно один раз на тиждень) протягом двох і трьох тижнів, відповідно. Пацієнти Мо 4 і Мо 5, виведені з дослідження після двох і трьох тижнів, відповідно, не відреагували на лікування і їх стан погіршився. Слід зазначити, що у одного із цих пацієнтів був виявлений підвищений креатинін під час початку дослідження.
Результати
У цьому дослідженні брали участь п'ять пацієнтів з постійною НЗСТ-ТМА. Усі пацієнти були дорослими людьми, і їм проводили трансплантацію гематопоетичних стовбурових клітин (НЗСТ) у зв'язку з наявністю у них гематологічних злоякісних пухлин. На фігурах 58, 59 і 60 наведені зміни відносно базової лінії змінних для ТМА після лікування МА5Р-2-інгібуючим антитілом ОМ5646. На цих фігурах наведені дані по всіх п'яти пацієнтах, у випадку двох з яких дослідження було припинене через 2-3 тижні, після чого у одного пацієнта відбувся рецидив, а іншому надавали паліативну допомогу. Як відзначено на фігурах 58, 59 і 60, останнє введення антитіла могло бути проведене на 7 тижні.
На фігурі 58 графічно представлена середня зміна кількості тромбоцитів від вихідного рівня протягом часу (тижня) у суб'єктів, що страждають від персистуючої тромботичної мікроангіопатії, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НЕСТ-ТМА), після введення МА5Р-2-інгібуючого антитіла (0ОМ5646).
На фігурі 59 графічно представлена середня зміна ІОН від вихідного рівня протягом часу (тижня) у суб'єктів, що страждають персистуючою (НЗСТ-ТМА), після введення МАБР-2- інгібуючого антитіла (0М5646).
На фігурі 60 графічно представлена середня зміна гаптоглобіну від вихідного рівня протягом часу (тижня) у суб'єктів, що страждають персистуючою (НЗСТ-ТМА), після введення МАЗР-2- інгібуючого антитіла (0М5646).
Як показано на фігурах 59 і 60, під час лікування спостерігалося статистично значиме поліпшення показників ОН і гаптоглобіну. Як показано на фігурі 58, показник кількості тромбоцитів поліпшувався, але не був статистично значимий через невелику кількість пацієнтів.
Із трьох пацієнтів, для яких лікування було закінчене, у одного пацієнта не покращився показник креатиніну, але він одержував супутні нефротоксичні терапевтичні засоби. Показник креатиніну поліпшувався або залишався нормальним у двох інших пацієнтів. При тривалому наступному спостереженні, у одного пацієнта трансплантація виявилося невдалою, і він очікував другої трансплантації. Стани інші двох пацієнтів залишалися стабільними.
Незважаючи на ймовірність накладення однієї на одну дій лікарських препаратів, пов'язаних із пригніченням кісткового мозку і нефротоксичністю у двох суб'єктів, спостерігалися позитивні ефекти лікування за допомогою ОМ5646 у трьох суб'єктів, що страждають від персистуючої
НЗ5СТ-ТМА (один з яких описаний в прикладі 45), які додатково описані нижче. Примітно, що перші позитивні результати лікування у кожного із трьох пацієнтів спостерігалися після приблизно трьох тижнів лікування за допомогою ОМ5646.
Пацієнт Мо 1 (лікування протягом 4 тижнів, як описано в прикладі 45). Підводячи коротко підсумки, кількість тромбоцитів збільшилася в чотири рази, у результаті чого кількість тромбоцитів перевищила 100000/мкл, рівень гаптоглобіну збільшився більше ніж у два рази і був нормальним, рівень лактатдегідрогенази в плазмі знизився на 35 95, але усе ще був вище 60 норми, і виявлявся тільки один шистоцит.
Пацієнт Мо 2 (лікування протягом 8 тижнів). Лікування не впливало на кількість тромбоцитів, хоча пацієнт також страждав від пригнічення кісткового мозку на фоні одночасного лікування за допомогою валганцикловіру і пізніше у нього відбулося відторгнення трансплантата, рівень лактатдегідрогенази в плазмі знизився з 712 Од/л до 256 ОД/л, рівень гаптоглобіну збільшився від невизначуваних рівнів до 250 мг/дл.
Пацієнт Мо З (лікування протягом 8 тижнів). Кількість тромбоцитів збільшилася з 13500/мкл до 133000/мкл; рівень лактатдегідрогенази в плазмі знизився з 537 до 225 Од/л, рівень гаптоглобіну збільшився від невизначуваних рівнів до 181 мг/дл.
Короткий виклад результатів
У випадку трьох пацієнтів, що страждають персистуючою НЗСТ-пов'язаною ТМА, для яких було завершене дозування ОМ5646, дані демонструють сильний і стійкий ефект. Під час лікування спостерігалися статистично значимі поліпшення показника ОН і гаптоглобіну.
Поліпшувався показник кількості тромбоцитів, але він не був статистично значимим при цьому невеликому числі пацієнтів. Із трьох пацієнтів, які завершили лікування, у одного пацієнта не було поліпшення показника креатиніну, але він одержував паралельно нефротоксичні засоби.
Показник креатиніну поліпшувався або залишався в нормі у двох інших пацієнтів.
Висновки
Антитіло ОМ5646 поліпшувало показники маркерів ТМА у пацієнтів, що страждають персистуючою НЗСТ-ТМА, які не реагували на консервативні способи лікування. Пацієнти з
НЗСТ-ТМА, яких піддавали лікуванню за допомогою ОМ5646, є одними із найбільш складних для лікування пацієнтів, і при цьому антитілло ОМ5646 продемонструвало позитивні терапевтичні ефекти відносно пацієнтів з високим ризиком персистуючої НЗСТ-ТМА, незважаючи на консервативні способи лікування.
Відповідно до вищевикладеного, в одному варіанті здійснення, винахід пропонує спосіб лікування людини, що страждає від ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, який включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МАБР-2- інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МА5БР-2-залежної активації комплементу. В одному варіанті здійснення, суб'єкт страждає від персистуючої ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, яка стійка до консервативних способів лікування. В одному варіанті здійснення, спосіб додатково включає ідентифікацію людини, що страждає персистуючою ТМА, пов'язаною з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, яка стійка до консервативних способів лікування, до стадії введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла, ефективну для інгібування МА5Р-2-залежної активації комплементу.
Відповідно до будь-якого з розкритих у винаході варіантів здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло проявляє щонайменше одну або більше з наступних характеристик: зазначене антитіло зв'язує людську МАБР-2 з Ко 10 нМ або менше, зазначене антитіло зв'язує епітоп в
ССРІ-домені МА5Р-2, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБ в аналізі іп міго в 1 95 людській сироватці при величині ІСзо 10 НМ або менше, зазначене антитіло інгібує осадження СЗБЬ в 90 95 людській сироватці при величині ЇСво 30 нМ або менше, де антитіло є фрагментом антитіла, вибраним із групи, що складається з Ем, Раб, ЕРар, Р(ар)» і Е(аб)», де антитіло є одноланцюжковою молекулою, де зазначене антитіло являє собою молекулу Ідс2, де зазначене антитіло являє собою молекулу ІдсС1, де зазначене антитіло являє собою молекулу
І354, де молекула Ід024 містить мутацію 5228Р. В одному варіанті здійснення, антитіло зв'язується з МА5Р-2 і селективно інгібує лектиновий шлях і практично не інгібує класичний шлях (тобто інгібує лектиновий шлях, залишаючи незачепленим класичний шлях комплементу).
В одному варіанті здійснення, МА5Р-2-інгібуюче антитіло вводять у кількості, ефективній для поліпшення щонайменше одного або декількох клінічних параметрів, що стосуються ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, таких як збільшення кількості тромбоцитів (наприклад, щонайменше у два рази, щонайменше у три рази, щонайменше у чотири рази більше, ніж кількість тромбоцитів до лікування), збільшення гаптоглобіну й/або зниження лактатдегідрогенази.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАЗ5Р-2-інгібуючого антитіла суб'єкту, що страждає від ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, через катетер (наприклад, внутрішньовенно) протягом першого періоду часу (наприклад, щонайменше протягом від одного дня до тижня або двох тижнів, або трьох тижнів, або чотирьох тижнів, або більше), з наступним введенням МАЗР-2-інгібуючого антитіла суб'єкту підшкірно протягом другого періоду часу (наприклад, протягом тривалого часу, щонайменше протягом двох тижнів або більше). У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий період 60 часу проводять без застосування плазмотерапії. У деяких варіантах здійснення, введення в перший і/або другий період часу проводять із застосуванням плазмотерапії.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення МАЗ5Р-2-інгібуючого антитіла суб'єкту, що страждає від ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, або внутрішньовенно, внутрішньом'язово, або підшкірно. Лікування може бути тривалим і застосовуватися від одного разу на день до одного разу на місяць, але переважно щонайменше один раз кожні два тижні, або щонайменше раз на тиждень, наприклад два рази на тиждень або три рази на тиждень. МАБР-2-інгібуюче антитіло можна вводити окремо або в комбінації з інгібітором С5, таким як екулізумаб.
В одному варіанті здійснення, спосіб включає лікування суб'єкта, що страждає від персистуючої ТМА, пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, що включає введення суб'єкту композиції, яка містить кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає СОМК-НІ, СОВ-Н?2 і СОВ-НЗ амінокислотної послідовності, позначуваної як послідовність ЗЕО ІЮ МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає СОВБ-І1, СОВ- 2 ї СОК-ЇЗ амінокислотної послідовності, позначуваної як послідовність ЗЕ ІЮ МО:70. У деяких варіантах здійснення, композиція включає МАЗР-2-інгібуюче антитіло, що містить (а) варіабельну область важкого ланцюга, що включає: їі) важкий ланцюг СОМК-НІ, що містить послідовність амінокислот з 31-35 послідовності з«ЕО ІЮ МО:67; і і) важкий ланцюг СОК-Н2, що містить послідовність амінокислот з 50-65 послідовності 5ЕО ІЮ МО:67; і ії) важкий ланцюг СОК-
НЗ, що містить послідовність амінокислот з 95-107 послідовності ЗЕО ІЮ МО:67, і Ю) варіабельну область легкого ланцюга, що включає: ї) легсий ланцюг СОМ-Ї1, що містить послідовність амінокислот з 24-34 послідовності 5ЕО ІЮО МО:70; і її) легкий ланцюг СОК-12, що містить послідовність амінокислот з 50-56 послідовності «ЕО ІЮ МО:70; і ії) легкий ланцюг СОК-Ї З, що містить послідовність амінокислот з 89-97 послідовності ФЕО ІЮ МО:70, або (Ії) його варіант, що включає варіабельну область важкого ланцюга щонайменше з 90 95 тотожністю з БЕО ІЮ МО:67 (наприклад, щонайменше з 91 956, щонайменше з 92 95, щонайменше з 93 9565, щонайменше з 94 9565, щонайменше з 95 95, щонайменше з 96 96, щонайменше з 97 96, щонайменше з 98 95, щонайменше з 10095 тотожністю з ЗЕО ІЮ МО:67) і варіабельну область легкого ланцюга щонайменше з 9095 тотожністю (наприклад, щонайменше з 9195, щонайменше з 92 95, щонайменше з 9395, щонайменше з 9495, щонайменше з 9595, щонайменше з 96 95, щонайменше з 97 95, щонайменше з 98 95, щонайменше з 99 95 тотожністю) з ФЗЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МА5Р-2-інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО ІО МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЗЕО ІОЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту композиції, яка включає
МА5Р-2-інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно розпізнає щонайменше частину епітопа на людській МА5Р-2, що розпізнається контрольним антитілом
ОМ5646, що включає варіабельну область важкого ланцюга, позначувану як послідовність БХЕО
ІО МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, позначувану як послідовність 5ЕО ІЮ МО:70.
У деяких варіантах здійснення, спосіб включає введення суб'єкту, що страждає від ТМА, пов'язаної з НОСТ, або має ризик розвитку ТМА, пов'язаної з НОСТ, включаючи суб'єкта, що страждає від персистуючої ТМА, пов'язаної із трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин, яка резистентна до консервативних способів лікування, композиції, яка включає МАР -2- інгібуюче антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що включає варіабельну область важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність ЗЕО
ІОЮО МО:67, і варіабельну область легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність, позначувану як послідовність зЕО ІЮ МО:70, у дозі від 1 до 10 мг/кг (тобто 1,2, 3,4,5,6,7,8,9 або 10 мг/кг) щонайменше один раз на тиждень (наприклад, щонайменше два рази на тиждень або щонайменше три рази на тиждень) протягом щонайменше З тижнів або протягом щонайменше 4 тижнів, або протягом щонайменше 5 тижнів, або протягом щонайменше 6 тижнів, або протягом щонайменше 7 тижнів, або протягом щонайменше 8 тижнів.
Незважаючи на те, що у винаході були описані і проілюстровані варіанти здійснення, що не є обмеженнями, проте, очевидно, що у винахід можуть бути внесені різні зміни без відхилення від суті і обсягу винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Омерос Корпорейшн
Юніверсіті оф Лестер
Демопулос, Грегорі А.
Дадлер, томас
Швебле, Ханс-Вільхельм «1205 СПОСОБИ ЛІКУВАННЯ СТАНІВ, ПОВ'ЯЗАНИХ 3 МА5Р-2-ЗАЛЕЖНОЮ АКТИВАЦІЄЮ
КОМПЛЕМЕНТУ
«1305 МР.1.0248. РСТ «1405 62/406,726 «1415 2016-10-11 «1405 62/252,814 «1415 2015-11-09 «1605 71 «1705 РакепсІп мег5іоп 3.5 «2105 1 «2115» 725 «212» ДНК «2135 Людина «220» «221» с0р5 «222» (27)..0584) «4005 1 ддссаддсса дстддасддд сасасс атд адд стд стд асс о стс стад 99с с 53 меє Агд Гей Геи Ттиг Гей гГеи су гей 1 5 ст тує ддас хсуд дед дссоасс о сесс їїтд ддс ссуд аад дод сс даа сс 101
Ге Суз сіу 5ег маЇ Аїа тНг Рго Ге сЇу Рго Гу5 Тер Рго сіи РгО 10 15 20 25 да сс ода сдс студ дса сс о ссс о ддс тес сса ддд дад тає дсс аа 149 ма! Рпе сЇу Агуд Ге Аїа б5ег Рго сіу Ре Рго сЇУу сЇи Туг Аїа А5Пп 30 35 40 дас сад дад сдд сдс тду асс стд аст дса ссс о ссс 99с тас сас стад 197
А5зр сіп ої Аг Аг тер тс ге Тс Аїа Рго Рго оЇу Туг Ага Гей 45 50 55 сус сс тас тс асс сас с дас студ дад сс сс сас сс тас дад 245 Агд Гей Ттуг Ре Тийг Ні РПе А5зр Гей сіи Гей б5ег Ні Гей сСу5 си 60 65 70 тас дас тс дес аад студ адс суд ддд дсс аад дід студ дсс аса ста 293 туг Азр Ре ма! Гу5 Ге 5ег 5ег с1Їу АїЇа Гуз маїЇ Гей Аїа тНг Ге 75 80 85 тас 999 сад дад адс аса дас асд дад с9ддуд дсс сс 99с аад дас ас 341 суз сіу сіп сій 5ег Тийг А5зр Тс ої Аго Аа Рго сіу Гуз Азр ТЕГ 90 95 100 105 (516) ес отас суд студ ддс сс адс студ дас ас оасс тс сдс сс дас тас 389
Ре туг б5ег Гей сЇу б5ег 5ег їей Ар ІЇІе Тиг Ре Агу 5ег Азр Туг 110 115 120 65 сс аас дад аад ссуд їїс асд ддд сс дад дсс тс тає дса дсс дад 437 5зег А5Зп сі губ Рго Ре Тйг сіу Ре сій АЇїа Ре тТтуг АїЇа АїЇа сій 125 130 135 дас ас дас дад сдс сад дід дсс ссдуд дда дад дсд ссс асс тдс дас 485
А5р ІІе А5р сіи Суз сіп ма! АЇїа Рго сІу сій АЇїа Рго Тйг Су дор 140 145 150 сас сас тдс сас аас сас студ дадас дд с тас тдс тсс тдс сдс дса 533
Ні Ні сСу5 Ні А5п Ні Гей соЇу сіу Рйе туг Су5з 5ег сСуз Агд Аїа 155 160 165 дос тас дес студ сас са аас аад сдс асс тдс са дад сад адс стс 581 соІЇу туг Ма! Гей Ні5 Агд А5п Гуз Аг Тиг сСуз б5ег си сіп 5ег Геи 170 175 180 185 тад сстсссстду адстссддсес хдсссадсад дісадаадсс ададссадсс 634 тастддсестс адстссдддає сдддстдада тддстдсдсс ссаастссса тесасссасс 694 асддасссаа стаасааасст ддссссассс с 725 «2105» 2 «2115 185 «2125 РЕТ «2135 Людина «4005» 2 мес Агд Гей їеи тТийг Гей Ге сіу Ге Ге Суз сіу 5ег ма! АТа тЕг 1 5 10 15
Рго Геи сіу Рго Гуз Тгр Рго сій Рго ма! Ре с1у Агу Ге Аїа 5ег 20 25 30
Рго сіу Рпе Рго су сім Туг АїЇа Азп А5р сіп сім Агуд Ага Тер тег 35 40 45
Гей Тийг Аїа Рго Рго сіу Туг Агд Гей Агд Ге Туг Ре тТНг Ні РПе 50 55 60
АЗр Гей сі Гей 5ег Ні5 Ге Суз сіи ТтТуг Азр Ріе маїЇ Гуз Геци 5ег 65 70 75 80 5ег с1у АЇїа Гуз ма! Гей Аїа тТийг Гей Су5 сіу сіп сі 5ег Тиг др 85 90 95
Тк ої Аг Аїа Рго сІу Гуз Азр ТИг Ре туг 5ег Ге сіу 5ег 5ег 100 105 110
Гей А5р ІІе ТИйг РПе Агд 5ег Ар Туг 5ег А5п сі Гуз Рго Ре ТЕг 115 120 125 с1у Ре си АЇа Рпе Туг Аїа Аїа сіи А5р ІЇе д5р сіи сСу5 сп ма! 130 135 140
Аїа Рго сіу сій АЇїа Рго Тйг Суб Азр НІі5 Ні Су5 Ні А5п Ні Гей 145 150 155 160 сІ1у сіу Рпе Туг Суз 5ег сСуз Агуд Аїа сІу туг ма! гГеи Ні5 Ага А5П 165 170 175
Гуз Агд Тиг Суз 5ег сім сіп 5ег Геи 180 185 «210» З «2115 170 «2125 РЕТ «2135 Людина «А005» З
Тс Рго Геи сіу Рго Гуз Тгр Рго сій Рго ма! Ріє СсІ1У Аг9у Гей Аїа 1 5 10 15 5зег Рго с1у Ре Рго сіу сіи туг АЇа А5п А5р сп си Агд Ага тер 20 25 30
Тк Ге Ттийг АТа Рго Рго сІу Туг Агуд Гей Агд Ге Туг Ре Тиг НІі5 бо 35 40 45
Рпе А5зр Гей сіи Гей б5ег Ні5 Гей Суз сіи Ттуг Азр Ріе маї Гуз гей 50 55 60 5ег б5ег сІіу АїЇа Гуз ма! Ге Аїа тийг о Геци Су5 сіу сіп сіи 5ег тег 65 70 75 80 65 Ар Тг сій Агуд Аїа Рго сіу Гуз Азр Тийг РВйе Туг б5ег Геу су 5ег 85 90 95 зег Гей АЗр ІЇІе Тйг РПе Агуд 5ег А5р Туг бег А5Зп си Гуз Рго РПе 100 105 110
Тиг с1у Ре си Аїа Ре Туг АЇа АїЇа сіи А5р 'ІЇе д5р сіи су сп 70 115 120 125 ма! Аїа Рго сіу сі Аїа Рго Тиг Суб А5Зр Ні Ні Суб Ні Азп Ні 130 135 140
Ге сіу сіу Рпе туг Суз 5ег Суз5з Агуд АЇїа сіу туг ма! Ге Ні5 Ага 145 150 155 160 А5зп Гуз Агуд Тиг сСуз б5ег си сп 5ег їгеи 165 170 «210» 4 «2115 2460 «212» ДНК «2135 Людина «220» «221» с0р5 «222» (22)..(2082) «400» 4 ддссадстда асдддсасас с аскд адд студ стд асс о стс ста ддс ст стд 51 мес Агд Гей гей Ттиг Гей Гей су Гей Гей 1 5 10 жде 99с са 979 дсс асс ссс та 99с ссд аад тдд сст даа сс 979 99 суз сіу 5ег маЇ АТа Ттйг Рго Гей сіу Рго Гуз Тер Рго сЇи Рго мУа 15 20 25 тес ддд сус студ дса сс о ссс дудс тт сса ддд дад тає дсс аат дас 147
Ре сіу Агд Гей АТа б5ег Рго сіу Ре Рго сіу сім Ттуг АїТа А5п дор сад дад сдуд садс хдуд асс студ астї дса ссс ссс ддс хтас сдс о стд сдс 195 сп сій Агд Агу тер тис ге Тис Аїа Рго Рго сіу туг Аг Геи Ага 30 45 50 55 сс тас тс о асс сас тс дас стд дад сс сс сас сс тдс дад тас 243
Гей Туг Ре Тийг Ні5 Ре Азр Гей сі Гей 5ег Ні5 Ге Су5з сіи туг 60 65 70 35 дас тс діс аад студ адс суд ддд дсс аад дкд студ дсс асд стд тдс 291
Азр Ре ма!Ї Гу5 Ге 5ег 5ег су АїЇа Гуз МаЇ Гей Аїа тйг Гей суз 75 80 85 90 40 ддудд сад дад адс аса дас асд дад судд дсс ссІ ддс аад дас аст тс 339 соЇу сіп сій бек Тийг А5р тс сій Аг АТа Рго сіу Гуз Азр ТНг РВе 95 100 105 ас сад стад 99с сс адс студ дас ас асс тс сдс тсс дас тас тсс 387 Туг бег Ге сіу 5ег 5ег Гей Азр І1е ТИйг РМПе Аг 5ег Азр Туг 5ег 110 115 120 аас дад аад ссд с асд ддд сс дад дсс тс тат дса дсс дад дас 435
Азп сЇи Гуз Рго Ре Тиг сіу Ре сій Аїа Ре Ттуг Аїа АїЇа сіи др 125 130 135 ас дас дад тдс сад дід дсс ссуд дда дад дсд ссс асс тдс дас сас 483 ч11е Азр сій сСу5 сіп маїЇ Аїа Рго сіу сіи Аїа Рго Тиг сСу5 А5р Ні 140 145 150 сас тдс сас аас сас сід 99с 99 Ес тас тдс сс тдс сдс дса 99с 531
Ні Суз Ні АЗзп Ні Гей сіу соЇу Рйе Туг Су5з 5ег суз Агд АїЇа су 155 160 165 170 60 ас дес студ сас сді аас аад сдс асс тдс са дсс студ тдс хсс дадс 579 тукг ма! Геи Ні Агуд Ап Гуз Аг Тиг о Суз 5ег АЇїа Гей сСу5 5ег су 175 180 185 сад діс тс асс сад адд їсСї ддд дад сс адс адс ссІ даа тас сса 627 65 сіп Ма! Рпе тйг сіп Ага б5ег сіу сої Ге 5ег 5ег Рго сіи туг РгОо 190 195 200 сдд ссдуд тає ссс оааа сіс тсс ад хтдс аст тас адс ас адс ста дад 675
Ага Рго туг Рго Гуз Гей бег 5ег Суз ТиИг туг 5ег Іе 5ег Гей си 70 205 210 215 дад 939 т--ес ад дес ак ста дас т 929 Чад сс с дає 929 чад 723 сі сі1у Ре 5ег ма! ІЇе гей Азр Ре МаЇ сі б5ег Ре Азр маїЇ си 220 225 230 аса сас ссІ даа асс студ хдЕ ссс тас дас її сс аад ас саа аса 771
ТВгонНіб Рго сій Тйгогеи сСуз Рго Туг Азр Ре Геи Гуз ІЇе сіп Ттиг 235 240 245 250 дас ада даа даа сах ддс сса жїсС тд дод аад аса тд ссс сас ада 819
А5р Агуд сої оЇи Ні сіу Рго Ре Суз сіу Гу5 тТНг Ге Рго Ні Агд 255 260 265 ас даа аса ааа адс аас аса 9т9 асс ас асс тт діс аса дає даа 867
ІІе соїи тТийгогуз бек АЗп Ттиг Ма! Тк о ІЇе тийг Рпе ма! тег Ар си 270 275 280
Іса дда дас сас аса ддс ходу аад ас сас хас асдуд адс аса дса сад 915 5ег су А5зр Ні Ттйг сіу тер губ ІчІЇе нНі5 Туг тТиг 5ег тиг Аїа сіп 285 290 295 сст тус сст тат ссуд атуд дсуд сса сст аат ддс сас де са сст дід 963
Рго Суз Рго Туг Рго Мет АЇа Рго Рго Азп сіу Ні5 ма! 5ег Рго УМаї 300 305 310 саа дсс ааа тас асс студ ааа дас адс тс тсс ас т тдс дад ас 1011 сіп Аїа Гуз туг ІчІІе Гей Гуз Азр 5ег Ре 5ег ІЇе Ре Су5 сіи тНг 315 320 325 330
Зо ддс тає дад сс студ саа ддс сас тд ссс студ ааа сс 5 аст дса 1059 сіу туг сої Ге Гей сіп сіу Ні5 Ге Рго Ге Гуз 5ег Рпе Ттиг Аїа 335 340 345 дес сус сад ааа дає дда ст дуд дас сдуд сса ад ссс дсд тдс адс 1107
Ма! сСу5з сіп Гуз А5зр сіу бег Тер Ар АгО Рго Меї Рго АЇа су 5ег 350 355 360 ак а дас тд 99с сс сс дає дає ста ссс адс 99 сда 929 чад 1155
ІІе ма! Азр сСу5 сІіу Рго Рго А5р Ар Гей Рго 5ег сІу Аг9д маї си 365 370 375 ас ас аса ддї сс дда дід асс асс тас ааа дст дсд асо сад тас 1203 туг Ше тик сЇу Рго сіу МаЇ тйг тиг туг Гуз АїЇа ма те сп туг 380 385 390 адс сус даа дад асс тс тас аса ад ааа ду аат дає ддсє ааа тах 1251 5зег сСуз сіи сі Тс Ре туго тиг Мет Гуз МмаЇ А5зп Ар сіу Гуз туг 395 400 405 410 929 тає дад дсе дає да ес ду асд адс сс ааа да даа ааа са 1299 маЇ! сСуз сі Аїа Азр сІу Ре Ттгр тийг 5ег 5ег їу5 сЇу сіи Гуз 5ег 415 420 425 сс сса ас тд дад сс дс сус дда ста са дсс сдс аса аса дода 1347
Гей Рго Ма! Суз сої Рго Ма! Су5 сЇу Ге 5ег АЇа Агуд тиг тНг сіу 430 435 440 999 сс аса стаст дда ддд саа аад дса ааа сс дає дає єс сст тдд 1395
ОоЇУ Агд ІЇе Туг оЇу сіу сіп їу5 АТа Гуз Рго сіу Азр РіПе Рго Тгр (510) 445 450 455 саа діс стд аха їїа 9 да асс аса дса дса 99с дса сет та тає 1443 сіп ма! Гей ІчІЇе Гей сіу сЇу тийг тйг Аїа Аїа сіу АїЇа гей їгеи туг 460 465 470 65 дас аас да діс ста аса дст дст саст дсс дес таї дад саа ааа сах 1491
Азр Азп тер МмаїЇ Ге ТНг Аїа Аїа Ні5 Аїа ма! туг сЇи сіп Гуз Ні 475 480 485 490 70 дає дса сс дсс студ дас ас сда ад ддс асс стд ааа ада ста са 1539
А5р АїЇа 5ег АТа Ге Ар ІЇе Агуд Мет сіу тйг Гей Гуз Агд Геи 5ег 495 500 505 сст сат тат аса саа дсс худу ст даа дст дек сс аса сас даа дос 1587
Рго Ні Туг Тк сп Аїа тер 5екг си АТа ма! Рпе ІЇеє ні5 си сіІу 510 515 520 тат аст сат дає дсе 99с 2 дас аас дас ата дса стд аск ааа її9 1635 туг Те нів Азр Аїа сіу Ре Азр А5Зп А5р че АїЇа гей ІЇе Гуз Гей 525 530 535 аас аас ааа ді дса асс аа адс аас ас асуд сст ас тує стд сса 1683
Азп АЗп Гуз Ма! ма! ІЇе А5п 5ег Ап ІІе Тийг Рго ІЇе сСуз Геци Рго 540 545 550 ада ааа даа дсї даа сс 5 ад адд аса дає дас ас дда аст дса 1731
Агд Гуз сої АТа сіи бек Рпе Мет Аг Тийг Ар Азр ІЇе сіу тйг Аїа 555 560 565 570 тс да тад да їса асс саа адд 93 теЕ сет дст ада аахс ста ата 1779 5зег сіЇу тгр оЇу Геи Тиск сіп Аг сіу Ре Гей Аїа Ага А5зп Геи Мей 575 580 585 тає дес дас ата ссуд ас дес дас сас саа ааа тус аст дст дса тає 1827 Туг ма! Азр ІІе Рго ІїЇе ма! Азр ніх сіп Гуз Суз Тиг Аїа АїЇа туг 590 595 600 даа аад сса ссс о таст сса адд дда ад дса ас дсї аас ад сет тд 1875 сі Гуз Рго Рго Туг Рго Агд сіу 5ег Ма! Ттйг Аїа Азп Мет Геи су 0) 605 610 615 дсе 99с їха даа аде 939 99 аад дас адс тдс ада 93 дас адс да 1923
Аїа сіу гей соЇи 5ег сіу сіу Гуз Азр 5ег сСу5 Агу оЇу Азр 5ег су 620 625 630
З5 да дса ста дід сс ста дає адс даа аса дад адада кдд -525 дод дода 1971 су Аїа Гей ма!Ї Ре Геи Азр б5ег си тТиг сім Агд тгр Ре маї сіу 635 640 645 650 дда аса да сс ду дає сс оатд аас тд 999 даа дса ддс сад тах 2019 сіу ч1Іе ма! 5ег тер сіу 5ег Мет А5Зп Су5 сіу сЇи АЇа сіу сіп туг 655 660 665 да дес тас аса ааа дес ас аас тат асо ссс тддуд асс дад аас ата 2067 сІіу ма! туг тиг Гуз ма! ІТе д5п Туг ІЇе Рго Тер ІїІе си А5зп Пе 670 675 680 аск ад дає 5 таа сттдсдєдес хдсадссаад даєсстесає єесадааах 2122
ІІе 5ег Азр РІе 685 дсстдсдаад ассттддсад сдасдсддсс сдадаадсає ссассаєтас тотодасата 2182 дсадесдсд стссасссаа ааааасадас хтссаддєдад дстдстдіса кеестссаст 2242 тассадссса ассссадсст тасссаттда сссаадддда састааассас дададсдаса 2302 десаєстссд сссасссаді дсаасдесас тдстсааасс асаєсетссаєс ассттааааа 2362 бо дссадестст ессастастуд дстдєсддса есстдсааа стдсстодєсс атадсесттта 2422 теЕсетстаааст тадастесттаєі дааааааааа аааааааа 2460 «2105. 5 «2115» 686 65 «2125 РЕТ «2135 Людина «А005 5 70 мес Ага Гей їеи Тийг о Геи Геи сіу Гей Ге Суз сіу б5ег ма! АТа тНг
1 5 10 15
Рго Геи сіу Рго Гуз Тгр Рго сій Рго ма! Ре с1у Агу Ге Аїа 5ег 20 25 30
Рго сіу Рпе Рго су сім Ттуг АїЇа Ап А5р сіп сім Агуд Агуд Тер тег 35 40 45
Гей Тийг Аїа Рго Рго сіу Туг Агд Гей Агд Ге Туг Ре тТНг Ні РПе 50 55 60
АЗр Гей сіи Гей 5ег Ні5 Ге Суз сі Туг Азр Ре маїЇ Гуз Геци 5ег 65 70 75 80 5ег сіу АТа Гуз ма! Гей Аїа тийг Ге Су5з сіу сіЇп сЇи 5ег ТИг А5р 85 90 95
Тк ої Аг Аїа Рго сІ1у Гуз Азр Тис Ре Туг 5ег Геи сіу 5ег 5ег 100 105 110
Гей А5р ІІе ТИйг РПе Агд 5ег Ар Туг 5ег А5п сі Гуз Рго Ре ТЕг 115 120 125 с1у Ре сій Аїа РіПе Туг АЇїЇа АїЇа сіи Азр ІІе Азр сіи сСу5 сіп маї 130 135 140
Аїа Рго сіу сій АЇїа Рго Тйг Суб Азр НІі5 Ні Су5 Ні А5п Ні Гей 145 150 155 160 сІіу с1у РПе туг Су5 5ег сСу5 Агуд АЇїа сіу Туг ма!ї Геи Ні Аг А5бп 165 170 175
Гуз Агд Тпг о Суз 5ег АЇїа Ге Суз 5ег соЇ1у сіп ма! Ре тНг сп Ага 180 185 190 5зег сіу сі Гей б5ег бек Рго сіи туг Рго Агд Рго Туг Рго Гуз Гей 195 200 205 5зег бег Суз ТИг о Туг б5ег ІчІЇе 5ег Гей сі сій сіу Ре 5ег маїЇ ІЇе 210 215 220
Гей А5р Ре ма! сіи б5ег Ре Азр ма! сіи тиг Ні Рго сіи тег гей 225 230 235 240 сСуб5 Рго Туг А5р Рпе Гей Гу5 ІІе сіп Ттйг А5р Аг сіми сіи ніх с1у 245 250 255
Рго Ре Суб5 сіу Гуз ТИг Геи Рго Ні Агуд ІІе сіи Тйг Гу5 5ег дзп 260 265 270
ТВг Ома! тк о їТе тис РПе маї тйг А5Зр сіи 5ег с1у А5Зр Ні тиг сі1у 275 280 285
Тер Гуз ІчІЇе Ні Туг Тигоб5ег Тйг АЇїа сіп Рго Суз Рго Туг Рго Меє 290 295 300
Аїа Рго Рго Азп сіу Ні5 ма! 5ег Рго ма! сіп АЇа Гуз Ттуг Іе гГеи 305 310 315 320
Гуз А5Зр бег Рпе 5ег ІЇІе Ре Су5 сіи тийг сІу туг сЇи Ге Геи сіп 325 330 335 с1у Ні Гей Рго Гей Гуз 5ег Ре Тйг Аїа ма! Суб сіп Гуз А5р су 340 345 350 зег Тер АЗр Аг Рго Мет Рго АЇїа Су5 5ег ІЇІе ма! Азр Суз су Рго 355 360 365
Рго А5р А5р Гей Рго 5ег сіу Агд ма! сЇи туг ІЇе тк сТу Рго СсІУу 370 375 380 ма! тик о тийг отуг Гуз АТа ма! ІІе сіп туг 5ег Су5 сі сіи Тйг РНе 385 390 395 400
Туг тйг мет Гуз маї Азп Азр сіу Гуз Туг Ма! суз сім Аїа Аз5р Ос1У 405 410 415
Рпе Тер тТиг 5ег б5ег губ сІу сі Гуз бек їеи Рго ма! Су5 сіи РгОо 420 425 430 ма! Суз о1у Ге 5ег АїЇа Агуд тТийг тйг сіу сіу Агу Іе туг сТ1у с1у 435 440 445 сіп Гуз АЇїа Гуз Рго сіу А5р Ре Рго Тгр сіп ма!Ї їГеи Пе ге с1Уу 450 455 460 сіу тйг тНг Аїа АТа сіу АЇїа гей їеи Туг А5р А5Зп Тгр ма! гГеи тНг 465 470 475 480 60 Аїа Аїа Ні5 Аїа ма! туг сім сіп Гу5 Ні5 А5р АЇа 5ег Аїа Геи др 485 490 495
ІІе Агд Мет сіу Тийг Ге Гуз Агд Гей бег Рго Ні Туг Тиг сіп Аїа 500 505 510
Тер 5ег сій АТа ма! Ре ІЇе Ні5 сіи сіу туг Ттийг НІі5 Аз5р АїЇа сі1у 65 515 520 525
Ре А5Зр А5Зп А5р ІЇе АЇа гей ІЇе Гуз Гей А5Зп А5Зп Гуз ма! ма! Пе 530 535 540
АЗп о бег Ап ІЇе Тйг Рго ІЇе суз Геи Рго Агу Гуз см АїЇа сіи 5ег 545 550 555 560 70 Ре Мет Агдуд Тийг Ар Ар ІЇе сіу тийг АТа б5ег сіу тгр су Ге тег
565 570 575 сіп Аг сіу Ре Гей АЇа Агуд АЗп Ге Мет Туг ма! Азр ІЇе Рго Іе 580 585 590 ма! Азр Ні сіп Гуз Су5 ТИг АЇа АЇїа туг сій Гу5 Рго Рго Туг Рго 595 600 605
Агуд сіу 5ег ма! тТйг Аїа Ап Мет гГеи сСу5 АЇа су Ге сіи 5ег су 610 615 620 о1у Гуз Ар бег Су5з Агуд сіу Азр 5ег су сІ1у АїЇа гей ма! РНе гГеи 625 630 635 640
А5зр б5ег сіи Тиг сій Агуд Тер Рбе ма! сіу с1у ІІе ма! 5ег тгр Ос1Уу 645 650 655 5ег Мет А5п Су5 сіу сій Аїа сіу сіп туг сіу ма! тукг тиг Гуз ма! 660 665 670 ч11е А5зп Туг ІІе Рго Тгр ІЇе сі А5п ІЇе ІІе 5ег А5Зр РНе 675 680 685 «2105» 6 «2115 671 «2125 РЕТ «2135 Людина «400» 6
ТАК о РгГоО Ге сІіу Рго Гуз Тгр Рго сій Рго Ма! Ре СсІУ Агд Гей Аїа 1 5 10 15 5зег Рго с1у Ре Рго сіу сіи туг АЇа А5п А5р сп си Агд Ага тер 20 25 30
Тк Ге тТийг АТа Рго Рго сІЇу Туг Агуд Гей Агд Ге Туг Ре Тиг Ні
Рпе А5зр Гей сіи Гей бек Ні5 Гей Суз сі Ттуг Азр Ріе маї Гуз Гей
Ко) 50 55 60 5ег б5ег сІіу АїЇа Гуз ма! Ге Аїа тийг о Геци Су5 сІу сіп сі 5ег тНг 65 70 75 80
Азр Тс сої Агуд Аїа Рго сіу Гуз А5зр Тйг Ре туг 5ег Геи су 5ег 85 90 95 35 зег Гей АЗр ІЇїе Тйг РПе Агуд 5ег А5р Туг 5ег Ап сЇи Гуз Рго РПе 100 105 110
Тиг с1у Ре си Аїа Ре Туг АЇа АїЇа сіи А5р 'ІЇе д5р сіи су сп 115 120 125 ма! Аїа Рго сіу сі Аїа Рго Тиг о Су5 А5р Ні Ні5 Су5 НІ5 Ап НІ15 40 130 135 140
Ге сіу сіу Рпе туг Суз 5ег Су5з Агуд АЇїа сіу туг ма! Ге Ні5 Ага 145 150 155 160
Азп о Гуз Агуд ТйгоСуз б5ег АЇа Ге Суз 5ег сіу сіп ма! Ре тйг сп 165 170 175 45 Агд бег с1у сіи Ге бег бег Рго сіи Туг Рго Агд Рго Туг Рго Гуз 180 185 190
Ге 5ег б5ег Суз ТИг о туг б5ег ІЇе 5ег гей сій сіи сіу Рпе 5ег маї 195 200 205 ч1І1е Гей Ар Ре маїЇ сіи 5ег Ре А5зр ма! сіи тийг нНі5 Рго си Тиг 210 215 220
Ге Суз Рго Туг Азр Ре Геи Гуз ІЇе сп тТНг дор Агу си си нів 225 230 235 240
О1У Рго Рпе Суб5 сЇу Гуз ТИйг о їГеи Рго НІі5 Агуд ІЇе сіи тНг Гуз 5ег 245 250 255 А5зп ТйгомМма! тТийг оче тТийг Ре ма! тиг А5р сіи 5ег сІу Азр Ні ТЕГ 260 265 270 сіу Тер Гуз ІчІІе Ні5 Туг Тигоб5ег Тйг Аїа сіп Рго Суз Рго Туг РгГО 275 280 285 мес АЇа Рго Рго АЗзп сіу Ні5 Ма!Ї 5ег Рго ма! сіп АЇа Гуз туг Пе бо 290 295 00
Гей Гуз Азр 5ег Ре 5ег ІІе Ре Суз сіи Ттйг сІу Ттуг сЇи Геи Гей 305 310 315 320 сіп сіу Ні5 Ге Рго Ге Гуз 5ег Ре ТиПг АЇїа ма!ї Суз сп Гуз дзр 325 330 335 65 с1іу 5ег Тер А5р Агуд Рго Мет Рго АЇїа Су 5ег ІЇІе ма! Азр Суз су 340 345 350
Рго Рго А5р Ар Гей Рго 5ег сіу Агд ма! сіи туг ІЇе тийг су Рго 355 360 365 сіу ма! тийг о тйг туго Гуз АТа маїЇ ч1іе сіп туг 5ег Су5з сЇи сім тНг 70 370 375 380
Ре Ттуг тТиг Мет Гуз маїЇ Азп Азр сіу Гуз Ттуг ма! Су5з си АїЇа д5р 385 390 395 400 с1Уу Ре Тер тТиг о б5ег б5ег уз сіу сіи Гуз 5ег Гей Рго ма! Суз си 405 410 415
Рго ма! Су5 сіу Ге 5ег АЇїа Агуд тТийг тиг су сіу Агуд ІТе туг с1у 420 425 430 сіу сіп Гуз АЇїа Гуз Рго сСІу Азр Ре Рго Тгр сп маїЇ Гей Іе Гей 435 440 445 сіу сіу тиг тйг АТа Аїа СсІУу АЇа ге Гей Ттуг А5Зр А5Зп Тгр маї Геи 450 455 460
ТИг АТа Аїа нНі5 АЇїа ма! туг сіи сіп Гуз НІі5 Азр АЇа 5ег Аїа Ге 465 470 475 480
Азр ч11е Агд Мет сіу Тйг їеи Гуз Агд Гей бег Рго Ні5 Туг ТИг сп 485 490 495 Аїа тгр 5ег сім Аїа ма! Рпе ІЇе Ні сіи сІ1у туг тТйг Ні А5р АїЇа 500 505 510 с1У Ре А5Зр А5п А5Зр ІЇе АЇїа гей ІЇе Гу5 Ге А5Зп А5Зп Гуз маї ма! 515 520 525 че А5зп б5ег дп ІчІЇе Тиг Рго ІЇе Ссу5 Гей Рго Аг Гуз сЇи Аїа си 530 535 540 5зег Рпе Мет Агуд Тйг А5р Ар ІЇе сіу тТйг Аїа 5ег сТу Тер ст1У гей 545 550 555 560
Тк оп Аг с1у Ре Ге АЇїа Агуд Азп Гей Мет Туг ма! Азр ІЇе Рго 565 570 575
ІІе ма! А5р ніх сіп Гуз Суз Тиг Аїа АїЇа туг сім Гуз Рго Рго Туг 580 585 590
Рго Агуд сіу бек ма! Ттйг Аа Азп Меї гГеу сСу5 АЇа сіу Ге си 5ег 595 600 605 сІ1у сІіу Гуз А5зр б5ег Суз Агуд сіу Азр 5ег сіу сіу АїЇа Ге ма! РПе 610 615 620
Гей А5р б5ег сіи Тийг осі Агуд Тер Ре ма! сіу сіу ІЇе ма! 5ег Тер 625 630 635 640 с1іу 5ег Мет А5Зп Су5 сіу сій АїЇа сіу сіп туг сІіу ма! Ттуг тег Гуз 645 650 655 ма! ІЇе д5п тТуг ІЇе Рго Тгр ІЇїе сій А5п ІЇе ІЇе 5ег Азр РПе 660 665 670 «2105 7 «2115 4900 «212» ДНК «2135 Людина «4005 7 сстассстдс стдсстддаа стстдадсад дстддадіса тддадссдає ссссадаатс 60 ссададссад ддаддстдда ддсаддддса ддеісастдда сааасадаєс аааддсдада 120 ссадсдсадада астдсадасс аддссаддсс адстддасдд дсасассатд аддасаддаєда 180 дсдссасадс стссстдсад дахтдсддаді дддадсасад дсстдддссе сассдссссе 240 дссстдссса хтаддстдстд ассстсстддуд дсстЕстоасд хтдадстсдуєд дссасссссе 300 таддсссдаа діддсстдаа сстдтасссд ддсдсестддс ассссссддс еЕЕссадада 360 адксасдссаа сєдассаддад сддсдстдда ссстдастдс ассссссддс хтассдсстдс 420 дсстстастс сасссастсс дасстддадс єстсссасст стдсдадсас дастссдєса 480 аддсдссдіс адасдддадда дстддда стсаддаєсд дадддісссс ааддадсадс 540 (516) садддєєсад ддасасстду дадсаддддс саддсесддс саддадддад ассаддсста 600 даєстЕкдсст састссстуд єдасасстда ссссасадсе дадсссдддд дссааддсдс 660 65 тддссасдсї дідсдддсад дададсасад асасддадсд ддсссстддс ааддасастт 720 тстастсдст дддсессадс стддасаєюта ссттссдстс сдастастсс аасдадаадс 780 садсссасдда деЕссдаддсес Естатсдсад ссдадддасєда дссаададдд дЕсстдсаас 840 70 асстсадестї дсоадсадстядд стасдддаадЕ аасестдсст таддссаддс адссстдсся 900 тсадееєтссс сассеттссс адддсадддд ададдссест ддсстдасає сатссасаає 960 дсааадасса ааасадссдї дассессаєі сасахтдддсе дадедссаас сстдадссад 1020 ддасєсідада асадсаєсдс стсаадсдас дсадддасстд дссддасдсд дсадсссасд 1080 сстдсаассс садсастссуд ддаддссдад дскддсесда саасссдадда дссаддаде 1140 7 сааддссадс садддсааса сддідааастї стасстссас таааастаса аааастсадст 1200 ддасасадсЯд дсдсдсассії ддаассссад стастаддда ддассдаддса ддадаастсдс 1260 тсдаасстдс даддасддадда стдсадсдаа сададаєсдс ассастасас хссасстааа 1320 сдасадаста дастссудїсї саааааасаа аааасааааа ссасдсаддд ссдадддссс 1380 ассстасаадс хдасааадсуд ддссстдсса дсдддадсдс тдсаддаєтає ссдаєсесса 1440 "7 дассссадсс сстдсадада ссаастдсді дасстстддс аадсддсєса астстстстдс 1500 тсстІтадаад стдстдсаад ддасесадсдс хдсадссссд ссссстаддає єсдастсдаст 1560 сссстсатта дстддуєдас стсддссудда састдаааст сссастдуаєс саасададдє 1620 дасдеєсдса хсттестссс адсдстдстуд ддадсесдса дсдассстад дсстдасаада 1680 тдаєссддсесс ддсассадсс ссдсассста дасаддасстї аддсстсстс хдаддессас 1740 щ тстдаддуса тддасстсст дддаддадсс саддстддаєт сссдсестстт тссстсстда 1800 сддсстдсстІ ддссстдсст стсссссада састдасдад тдссаддаєдуд ссссдддада 1860 ддсдсссасс тдсдассасс астдссасаа ссасстдддс даєеестаст дстсстдссад 1920 сдсаддстас деісстдсасс дсаасаадсуд сасстдсіса ддаєдададад дстдсстдадаа 1980 ссссаасдса ссстстсстуд ддасасссддуд дастсстсад ддссаєстдсе дсестдссса 2040 7 ддадсдсддаа ддасстдддас стддасасту дасдсееста ддссстдстд сстссадстс 2100 сссттстсад ссстдсттсс сстстсадса дссаддссса ссадсдссас сстдссстад 2160 састдадасі аассстааса стсссастусд тасстддеєс сасстудддсес стдддаассс 2220 сісастдсадс сасдддадад ссдддаддсаєс тассстсдєс ссесддасту даєссстає 2280 ссстдсаста ддадасддас садсдсестуд ддасдедддс адссссассс тахдасоаста 2340 " ассстдстсс сссдастсдуд сееЕстсстст сддудеЕсесе ссттдсстст стдасстстс 2400 тІссададса дадссестад ссесссстдуд адстссддсе дсссадсадд ссадаадсса 2460 дадссаддсс дстддсстса дстіссддуає дадсєдадає дстдкдсссс аастсссатт 2520 сасссассаї ддасссаата асааасстдд ссссасссса сстдстдссду сатаєстста 2580 ддаасддаадд дісдддаддс ддакєддддсдс дсеЕсстстст дсстассстс стсасадсст 2640 о саєсдаасссс аддаєстдсду дадсстсстс сасддддсса сасддаусстс ддсстсассс 2700 сстдиесда адасдддаддса стдаддссду ададдддасаа ддсстсдстс дадсссададтє 2760 65 ссссададдс хдадсссада дсаасссесда ассассссса тссаддаєст ддасстоддада 2820 адсстдассс асададдада сассстдудда дасаєсссаєс даддддсаасє стддуссссс 2880 70 дсаааєссад ддаєдаєссс састдсссса хтаддсасадс сасдсддаад ааддсаддса 2940 асдесдддасє хсстсастсс стададдсест сасаастсаа асдсссссса стдсадстад 3000 ддасаддадсд дсддсасддд асддддасєса адсстссстс дааддасада дсссадссса 3060 асассссдсс ссадастддсадс адсаєсасдї дЕсссадсда ддааддадад сассадастс 3120 адссаєдаєс астуєсдсст сдаастссса адаасадссс садддсаадд дссаааасад 3180 дддаааддад дсдаєсдадад ассстсстсс садаєсдєссс сссаддаасс аддаддастада 3240 7 стадесссдд стддаєссду дсаддадасс саєсдаєдаає ааасссддда ассастдддаа 3300 тадстдсаад ддаасссадд ддадстссда адддассст адастсдада адатастсс 3360 сЕСстттЕссс дааттсссад ддасссадда дадстдессст єстссстст сстотєс 3420 сатссасссс сдссссссдс сстддсадад стддсддаас ссадстдстся адсссстасс 3480 стддадесдс дастстдуде саддасасса ссасдстссс таддадсоєд адсдадддесс 3540 "7 тасдсдстсс ахсссдадсд стдсстдс садстааадс стсааадсаа дадааасссс 3600 сЕстстаадс ддсссстсад ссассддуаєд дассдссдуд єеестддуаєва ддасстсадда 3660 дстддссасс хдсадддссс адсссаассс адддаєдсад ахкдісссадс сасаєссста 3720 тсссадеесс стдстсссса аддсаєтссас сстдстаєсд дсасдаддас сдасададад 3780 сасдссаадсі састсссстуд сссттссстсС стіссадссс татдссссду ссадаєстс 3840 щ асссададдсї стддддадсї садсадсссї даатасссас ддссдстаєсс сааастстсс 3900 адссдсастсї асадсаєссад сстдуддаддад дадесєсадсуд ссасестддда стесдсоддад 3960 тсстІссдастд тддадасаса ссстдааасс статакссст асдасттест саадаєстад 4020 стЕсстдддсес сстсаєсттуд ксссадаєсс тссссстсса дсссадстдс ассссстаст 4080 тсстдсадса тддсссссас сасдтсссд хсассстсдд хдассссасс хстісадата 4140 7 сеЕстасддад діесааддстд дддасессдад стасаадсуєд ддаддсадад хтаддоададдаад 4200 сассссаасс састддсстду деЕстддсстса стддстдЕсс стдааатдсс даддадасда 4260 деісастсссс хссдсессадд ссадасссад дсадстдсес сссадсееес асдадсесст 4320 тістсадаєс сааасадаса дадаадааса хтддсссаєссс хтдасдадаада саттдсссса 4380 саддаєсдаа асааааадса асасддєдас сассасстсс дссасадастд аассаддада 4440 " ссасасаддс хддаадаєсс астасасдад сасадсдадс аадсдддсес адасссттадад 4500 тадаадсдса дадстдсстс стстддаді дсааддадсї дсададсдса ддастстс 4560 ддасаддасі аддаадддас ассаддеєса дсдурєдстда ддаєстдаддс адсадсеся 4620 ааддддаадс асссдідссс хсстсадсад сасссадсає сттсассаст саєссттсаа 4680 ссасссаєсс асссаєссаст сассттсттас ссасссассс тетдссастс ассстсстди 4740 о ссстсассст хссаассаєі сассаассас ссасссатсс ассстттдсс асасаассатє 4800 ссасссаєсс сстасстас ссассстаєс сакссассст сстассадса ксстестасс 4860 65 асссассстї суєссддуса кссассаєса кссатссатс 4900 «210» 8 «2115 136 «2125 РЕТ «2135 Людина 70
«А00» 8 мес Агд Гей їеи тийг Гей Ге сіу Гей Ге Суз сіу 5ег ма! АТа тНг 1 5 10 15
Рго Геи сіу Рго Гуз Тгр Рго сій Рго ма! Ре с1у Агу Ге Аїа 5ег 20 25 30
Рго сіу Рпе Рго су сім Туг АЇа А5п А5р сп сім Агуд Агуд Тер тег 35 40 45
Гей Тийг Аїа Рго Рго сіу Туг Агд Гей Агд Ге Туг Ре тТНг Ні РПе 50 55 60
АЗр Гей сіи Гей 5ег Ні5 Ге Суз сіи Ттуг А5зр Ре маїЇ Гуз Геи 5ег 65 70 75 80 5ег с1у АЇїа Гуз ма! Гей Аїа тТийг Гей Су5 сіу сіп сі 5ег Тиг др 85 90 95
Тс си Ага Аїа Рго сіу губ А5р ТИг Ре Туг 5ег Геи сІу 5ег 5ег 100 105 110
Гей А5р ІІе ТИйг РПе Агд 5ег Ар Туг 5ег А5п сі Гуз Рго Ре ТЕг 115 120 125 с1у Ре сій Аїа Рібе туг АїЇа Аїа 130 135 «210» 9 «2115 181 «2125 РЕТ «2135 Людина «А00» 9 мес Агд Гей їеи тТийг Гей Ге сіу Ге Ге Суз сіу 5ег ма! АТа тЕг 1 5 10 15
Рго Геи сіу Рго Гуз Тер Рго сій Рго ма! Ре СТУ Аг Гей Аїа 5ег 20 25 30
Рго сіу Рпе Рго су сім Туг АїЇа Ап А5р сіп сім Агуд Ага Тер тег
Гей Тийг Аїа Рго Рго сІіу Ттуг Агд Гей Агд Ге Туг Ре ТНг Ні РПе 35 50 55 60
АЗр Гей сіи Гей 5ег Ні5 Ге Суз сіи ТтТуг Азр Ріе маїЇ Гуз Геци 5ег 65 70 75 80 5ег с1у АЇїа Гуз ма! Гей Аїа Ттиг Ге Су5 сіу сіп сі 5ег Тиг др 85 90 95 40 Тс сої Ага АЇїа Рго сіу губ А5р Тис РПе туг 5ег Геи сіу 5ег 5ег 100 105 110
Гей А5р ІІе ТИйг РПе Агд 5ег Ар Туг 5ег А5п сі Гуз Рго Ре ТЕг 115 120 125 с1у Ре сій АїЇа Ріпе Туг Аїа АїЇа сіи Азр ІЇе А5р сіи Су сіп маї 45 130 135 140
Аїа Рго сіу сій АЇїа Рго Тйг Суб Азр НІі5 Ні Су5 Ні А5п Ні Гей 145 150 155 160 сІ1у сіу Рпе Туг Суз 5ег сСуз Агуд Аїа сІЇу туг ма! гГеи Ні5 Ага А5П 165 170 175
Гуз Агд Тиг сСуз 5ег 180 «2105» 10 «2115 293 «2125 РЕТ «2135 Людина «400» 10 мес Агд Гей їеи тийг Гей Ге сіу Ге Ге Суз сіу б5ег ма! АТа тЕг во 1 5 10 15
Рго Геи сіу Рго Гуз Тгр Рго сій Рго ма! Ре СТУ Аг Гей Аїа 5ег 20 25 30
Рго сіу Рпе Рго су сім Туг АїЇа Азп А5р сіп сім Агуд Ага Тер тег 35 40 45 65 Гей Тийг Аїа Рго Рго сіу ТтТуг Агд Гей Агд Ге Туг Ре Тиг Ні РПе 50 55 60
АЗр Гей сіи Гей 5ег Ні5 Ге Суз сіи ТтТуг Азр Ріе маїЇ Гуз Геци 5ег 65 70 75 80 5ег с1у АЇїа Гуз ма! Гей Аїа тТийг Ге Су5 сіу сіп сій 5ег Тиг др 70 85 90 95
Тк ої Аг Аїа Рго сІу Гуз Азр ТИг Ре туг 5ег Ге сіу 5ег 5ег 100 105 110
Гей А5р ІЇе ТИйг РПе Агуд 5ег Ар Туг 5ег А5п сі Гуз Рго Ре ТЕг 115 120 125 о1у Рпе си АТа Ре Туг АїЇа АТа сіи А5р ІЇе А5р си Суз сіп ма! 130 135 140
АЇїа Рго сіу сій АЇїа Рго Тйг Суб Азр НІі5 Ні Су5 Ні А5п Ні Гей 145 150 155 160 сІ1у сіу Рпе Туг Суз 5ег сСуз Агуд Аїа сІЇу туг ма! гГеи Ні5 Ага А5П 165 170 175
Гуз Агд Тпг о Суз 5ег АЇїа Ге Суз 5ег соЇ1у сіп ма! Ре тиг сп Ага 180 185 190 5зег сіу сії Ге б5ег бек Рго сіи Туг Рго Агуд Рго Туг Рго Гуз Гей 195 200 205 5зег бег Суз Тиг Туг б5ег ІЇе 5ег Ге сіи сій с1у Ре 5ег ма! Пе 210 215 220
Гей А5р Ре ма! сіи бек Ре Азр ма! сіи тйг нНі5 Рго си тег ге 225 230 235 240 суз Рго Туг Азр Ре Геи Гуз ІЇе сп тТНг дор Агд сій си ні с1у 245 250 255
Рго Ре Суз сіу Гуз ТИйг оГеи Рго Ні5 Агуд ІІе сіи Тйг Гуз 5ег дзп 260 265 270
ТВг Ома! тк о їІТе тис РПе маї тйг А5Зр сіи 5ег с1у А5зр Ні тиг сі1у 275 280 285 Тегр Гуз Ше ніх туг 290 «2105 11 «2115 41 «2125 РЕТ
Зо «2135 Людина «4005 11 сім А5р т1Іе А5Зр сій Суб5 сіп маї Аїа Рго сІу сій АЇа Рго Тйг су 1 5 10 15
Азр Ні Ні Су5з Ні АЗп Ні Ге сіу сіу Ре туг Суз 5ег сСуз Агд 20 25 30
АТїа сіу туг маї гГеи Ні Аг А5п Гуз 35 40 «2105» 12 «2115 242 «2125 РЕТ «2135 Людина «4005 12 чІІе туг сіу сІу сіп Гуз АЇа Гуз Рго сіу А5зр Ре Рго Тгр сп маї 1 5 10 15
Гей че Гей сіу сіу тйг ТтНг Аїа АїЇа сіу АЇа гей їеи туг д5р доп 20 25 30
Тер ма! гей тНг Аїа АЇа Ні5 АЇа ма! туг сім сіп Гуз Ні5 А5р АЇа 35 40 45 5зег АЇїа Гей А5зр ІІе Агуд Мет сЇу Тйг Геи їу5 Агу Ге б5ег Рго Ні 50 55 60 Туг Тйг сп АЇїа Тер 5ег сій Аїа ма! Рпе ІЇе ніх сіи сіу туг тНг 65 70 75 80
Ні Ар АЇа сіУу Ре А5р А5п А5Зр ІЇе АЇа гей ІЇе Гу5 Ге Ап А5ПпП 85 90 95
Гуз ма! ма! ІЇе А5зп 5ег д5п ІЇе Тиг Рго ІЇе сСу5 Геи Рго Ага Гуз бо 100 105 110 сій Аїа сій бек РіПе Мет Адгд Тийг А5Зр А5Зр ІЇе сіу тийг Аїа 5ег су 115 120 125
Тер оТу Геи Ттйг сіп Агуд с1у РВе гей АЇа Агд АбЗп Гей Меє Туг ма! 130 135 140 65 Ар ІІе Рго ІЇе ма! А5р ніх сіп Гуз Су5 Тийг АїЇа АїЇа туг си Гуз 145 150 155 160
Рго Рго Туг Рго Агуд сіу 5ег ма! тТиг АїТа д5п мет гей сСуз Аїа с1у 165 170 175
Гей сім бек сіу сІ1у Гуз А5р 5ег Су5з Агуд сіу Азр 5ег су с1у Аїа 70 180 185 190
Геи ма! Рпе Гей Азр 5ег сіи Тк си Агод Тер Ре ма! су с1у Пе 195 200 205 ма! бек Тгр сіу 5ег Мет А5Зп Су5 сіу сій АїЇа сіу сіп туг су ма! 210 215 220 Туг Тк Гуз ма! ІЇе А5п Туг Іїе Рго Тер ІЇе сЇи А5Зп ІЇе ІЇе 5ег 225 230 235 240
Азр РПе «2105» 13 «2115 16 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 13 о1Уу Гуз Ар бег Су5 Агуд сіу Азр АЇа соЇу сСІу АЇа гей ма! РНе гГеи го 1 5 10 15 «2105» 14 «2115 15 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність 25 «220» «223» Синтетична «400» 14
Зо
Тис о РгГоО Ге сІіу Рго Гуз Тгр Рго сій Рго Ма! Ре СУ Аг гГеи 1 5 10 15 «2105» 15 «2115 43 35 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична 40 «4005» 15
Тк АТа Рго Рго сіу туг Агд Ге Агуд Гей Ттуг Ре ТИйг Ні Ре д5р 1 5 10 15 45 ем сі Гей бек Ні Ге Суз сіи туг Азр Ре ма! Гу5 Ге 5ег 5ег
СсСІ1У АЇа Гуз ма!Ї Гей Аїа тиг Гей Су сІ1у сіп «2105» 16 «2115 8 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 16
Тис Ре Агд 5ег Ар туг 5ег дзп во 1 5 «2105 17 «2115 25 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Синтетична «4005 17 70
Ре Ттуг б5ег їеи с1у 5ег 5ег їеи АЗр ІЇІе Тйг РПе Агу 5ег А5р туг 1 5 10 15 зег Азп сіи Гуз Рго Ре Тйг сіу Ре 20 25 «210» 18 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 18 че А5р сіи сСуз сіп ма! АїТа Рго с1у 1 5 «210» 19 «2115 25 «2125 РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 19
АТїа Азп Мет Гей Су5з АЇа сіу Гей сіи б5ег сіу сіу Гуз А5р 5ег суз 1 5 10 15
Агд сіу Азр 5ег сІу су Аїа Ггеи маї
Ко) 20 25 «2105» 20 «2115 960 «212» ДНК «2135 Людина «220» «221» с05 «222» (5135..(0797) «4005» 20 аксаастдад ассаассттс сстдадеьссс сеісасассаа ддсдаддасс ад сс 56 мет 5ег 1 студ 2 сса са стс сст стс сеї сс сту аде ахад 929 аса дсд с 104
Гей Ре Рго бег Геи Рго Ге їеи Ге Ге 5ег мет маїЇ АТа Аїа 5ег 5 10 15 тас са даа аст дід асс тд дад даї дсс саа аад асс тдс сст дса 152 туг 5ег сі тТийгомМмаї тйг сСу5 сім Азр АЇїа сіп Гуз Тиг о сСу5 Рго АїЇа 20 25 30 да ас дсс тс адс ст сса ддс ас аас ддс с сса ддс ааа дах 200 ма! ч1ІІе Аїа Суб 5ег 5ег Рго с)Їу ІЇе А5п сіу Ре Рго сіу Гуз А5р 35 40 45 50 999 сає дає 99с асс аад д9а даа аад 999 даа сса 99с саа 999 сс 248 оЇУ Агд Азр сіу тиг Гуз сІу си Гуз оЇу сЇми Рго сЇу сЇп оїУу Гей 55 60 65 60 ада ддс їта сад ддс ссс сстІ дда аад сту ддд сс сса дда аах сса 296
Агд сіу Гей сп сіу Рго Рго сЇу Гуз Ге с1у Рго Рго сіу А5п РГО 70 75 80 9дад сс тс дод са сса дда сса аад ддс саа ааа дда дас сст дода 344 65 с1у Рго 5ег сіу 5ег Рго сіу Рго Гуз сЇУу сіп Гуз сіу Азр Рго сіу 85 90 95 ааа ад ссада дах 99 дає адс адс студ дсї дсс їса даа ада ааа дсу 392
Гуз 5ег Рго Ар су Азр 5ег 5ег Гец АїЇа АЇїа 5ег сЇи Агд Гуз АїЇа 70 100 105 110 стд саа аса даа астуд дса сх асс ааа аад тдуд сс асс кс тст стад 440
Гей сіп Тк сіи Мет АТа Аг ІЇе Гуз Гуз Тер Ге Тиг РМНе 5ег Геи 115 120 125 130 дудс ааа саа де дду аас аад сс тс студ асс аат дує даа ата ахад 488 сІЇу Гуз сіп ма! сЇу Азп Гуз Ре Ре Гей ТНг Азп сіу сіи І1Іе Меє 135 140 145 асс її даа ааа дод аад дсс тд сус діс аад с сад дсс тс дід 536
Тис Ре сіи Гуз маЇ Гуз АЇїа Ге Суз ма! Гуз Ре сіп АїЇа 5ег маї 150 155 160 дсс асс ссс адд аат дст дса дад аас д9а дсс акт сад аас стс ас 584 Аїа Тс Рго Агд Азп Аїа АїЇа сій Ап сіу Аїа ІїЇе сіп Азп Гей Іе 165 170 175 аад дад даа дсс с студ ддс ас аст дає дад аад аса даа ддд сад 632
Гу5 сім СІ Аїа Ре Гей сіу ІЇе тйг Азр сіи Гу5 Ттйг си сіу сп 180 185 190 т-иЕК дтд дає студ аса дда аат ада студ асс тас аса аас тдд аас дад 680
Рпе маЇ Ар Гей тТийг сіу А5п Агуд Ге ТийготТуг ТВг о АбЗп тер Ап си 195 200 205 210 9 даа ссс аас аат дсі 93 ст дає даа дає тд дкса та ста ста 728 су сЇи РгО А5п о А5Зп АЇа сЇу б5ег А5зр сіи Азр Су маїЇ гей їеи гей 215 220 225 ааа аас ддс сад кдд аас дас дес ссс о тдс сс асс сс сат стд дсс 776
Гуз А5п о сЇу сіп Тер Азп Азр о Маї Рго Су5 5ег Тиг 5ег НІі5 Ге АїЇа 230 235 240 дсс хуЄ дад тс сс асс тда адддесасає сасссаддсес стссетасс 827
Ма! су5 оЇи Ріе Рго ІїЇе 245 т2Ее2растдса асссасаддс ссасадтатд стсдаааада саааєсстатає саасттсстс 887 акатссадста тд Есст гдсдддсаає састааааає дассастаас адсассааса 947 аадсаастаає адтс 960 «210» 21 «2115 248 «2125 РЕТ «2135 Людина «400» 21
Мет б5ег Геи Ре Рго 5ег Геи Рго Гей їеи Гей Гей б5ег мес ма! Аїа 1 5 10 15
АТїа бек Ттуг 5ег сіи Тийгома! тиг сСу5 си А5р АЇа сіп Гуз Тис сСуз 20 25 30
Рго АЇїа ма! ІЇїе Аїа Суб 5ег 5ег Рго сіу ч1Ї1е Азп сіу Ре Рго сС1У 35 40 45
Гуз Азр с1у Агд Азр су тйг о їтуз су оси Гуз с1у си Рго с1у сіп 50 55 60 о1Уу Ге Агд сіу Гей сіп сіу Рго Рго сЇу Гуз Гей с1іу Рго Рго су 65 70 75 80 60 Абп о РгГо сіу Рго б5ег сіу 5ег Рго су Рго Гуз сіу сіп Гуз оТу дор 85 90 95
Рго сіу Гуз бег Рго А5р сіу А5зр 5ег 5ег Геи АЇа АЇа 5ег си Ага 100 105 110
Гуз Аїа Гей сіп тийг сіи мес АїЇа Агу ІЇе Гуз Гуз Тгр Ге ТНг РПе 65 115 120 125 5ег Гей сіу Гуз сіп ма! сіу Ап Гуз Ре Ре Гей Тиг А5п СсІ1Уу Си 130 135 140
ІІе Мес Тийг РМПе сіи Гуз маЇ Гуз Аїа Ге Суз ма! Гуз Ре сп АїЇа 145 150 155 160 70 Зег ма! Аїа Тс Рго Агу Ап Аїа АїЇа сіи Азп СсІу Аїа ІЇе сіп дп
165 170 175
Гей чІЇе Гуз сіи сій Аїа Ре Гей СсСІіу ІЇе Тйг А5Зр 'сіи Гуз ТЕГ си 180 185 190 с1у сіп Рпе маї А5р Геи Тйг сіу А5зп Аг Ге Тиг отукг Тис А5Зп тер 195 200 205
А5зп сій сіу сЇи Рго АЗп АбЗп АЇа сіу б5ег Ар сій Азр Суз Ммаї Геи 210 215 220
Гей Ге Гуз АЗзп сіу сіп Тер АЗп А5ромаї Рго Су5 5ег ТИг 5ег Ні 225 230 235 240
Гей Аїа ма! Су5 сЇи Ре Рго ІїЇе 245 «2105» 22 «2115 6 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» ДОДАТКОВІ ОЗНАКИ «222» («1)..д.2013 «223» Де Х в положенні 1 представляє гідроксипролін «220» «221» ДОДАТКОВІ ОЗНАКИ «222» (4)..:(4) «223» Де Х в положенні 4 представляє гідрофобний залишок «4005» 22
Зо
Хаа сіу Гуз Хаа сіу Рго 1 5 «2105» 23 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» ДОДАТКОВІ ОЗНАКИ «222» («1)..д.2013 «223» Де Х представляє гідроксипролін «4005» 23
Хаа с1у гуз Гей сі1у 1 5 «2105» 24 «2115 16 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» ДОДАТКОВІ ОЗНАКИ «222» (93..(15) «223» Де Х в положеннях 9 1 15 представляє гідроксипролін (516) «4005» 24 о1Уу Ге Агд сіу Гей сіп сіу Рго Хаа сЇу Гуз Гей сіу Рго Хаа Сс1у 1 5 10 15 65 «2105» (25 «2115 27 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Синтетична «221» ДОДАТКОВІ ОЗНАКИ «222» (3)..(27) «223» Де Х в положеннях 3, 6, 15, 21, 24, 27 представляє гідроксипролін «4005» 25 с1у Рго Хаа с1у Рго Хаа сІу Геи Агуд сіу Гей сіп сіу Рго Хаа Сс1У 1 5 10 15
Гуз Ге сІ1у Рго Хаа сіу Рго Хаа сіу Рго Хаа 20 25 «210» 26 «2115 53 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» додаткові ознаки «222» (26)..(26) «223» Хаа може являти собою будь-яку природну амінокислоту «220» «221» додаткові ознаки «222» (32)..(32) «223» Хаа може являти собою будь-яку природну амінокислоту
Зо «220» «221» додаткові ознаки «222» (35)..(35) «223» Хаа може являти собою будь-яку природну амінокислоту «220» «221» додаткові ознаки «222» (41)..(41) «223» Хаа може являти собою будь-яку природну амінокислоту «220» «221» додаткові ознаки «222» (503..(50) «223» Хаа може являти собою будь-яку природну амінокислоту «400» 26 о1у Гуз Ар сіу Агуд А5р сіу Тег Гуз су сіи Гуз с1іу си Рго су 1 5 10 15 сп с1у Гей Агуд с1у Ге сіп сіу Рго Хаа сІЇу Гуз їеи сіу Рго Хаа 20 25 30 с1у А5зп Хаа сіу Рго 5ег СсІу 5ег Хаа сіу Рго Гу5 СсСІу сіп Гуз СсС1У 35 40 45
Азр Хаа сІіу Гуз 5ег 50 «2105 27 «2115 33 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Синтетична «220» «221» ДОДАТКОВІ ОЗНАКИ «222» (3)..(33) 65 «223» Де Х в положеннях 3, б, 12, 18, 21, 30, 33 представляє гідроксипролін «4005 27 70 с1у Аїа Хаа сіу 5ег Хаа су сіи Гуз су АїТа Хаа сіу Рго сп сІу
1 5 10 15
Рго Хаа сСІу Рго Хаа сіу Гу5 Мет сіу Рго Гуз СІу сіи Хаа сІу дор 20 25 30
Ххаа «2105» 28 «2115 45 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «220» «221» ДОДАТКОВІ ОЗНАКИ «222» (3)..(45) «223» Де Х в положеннях 3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 представляє гідроксипролін «400» 28 сіу Суз Хаа сІіу Гец Хаа СІ1у АїЇа Хаа сіу А5р Гуз СсСІу си АїЇа сі1у 1 5 10 15
Тк Ап су Гуз Агуд о1у сої Агуд сіу Рго Хаа сіу Рго Хаа су Гуз 20 25 30 Аїа с1у Рго Хаа сіу Рго Азп сіу АЇа Хаа сіу сЇи Хаа 35 40 45 «2105» 29 «2115 24 «2125 РЕТ «2135» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 29
Гей сіп Агд Аїа Гей сіи ІчІЇе Гей Рго Азп Агуд ма! Тийг ІТе Гуз АїЇа 1 5 10 15
АЗп Агу Рго Ре Геи ма! Ре Пе 20 «2105» 30 «2115 559 «212» ДНК «2135 Людина «4005 30 асдаддстдс хдассстсст дадссеєстуд хдсддсссдод хтддссасссс сттддассса 60 аадсддсста аасстдтдаєє сдддсдсестд дсаєсссссд дсеесссадда ддадсаєсдсс 120 аасдассада адсддсдстд дассстдасі дсассссссд дстассдссе дсдсстстас 180 тЕсасссаст ссдасстудда дсестсссас сІстдсдаді асдастссді саадстдадс 240 хсддададдсса аддсдстддс сасдстдтдс дадсаддада дсасадасас ддадсдддсс 300 сстддсаада асасттеста стсдстдддс хссадсстдд асаєтасстя ссдстссдас 360 тастссаасуд адаадссдї сасддадеес даддсестст асдсадссда ддасаєтдас 420 (516) дадсдссада хєддассссдоад ададдсдсесс асстдсдасс ассастдсса саассасста 480 дасадЕеест астдсесстд ссдсдсаддс хтасдісстдс ассдстаасаа дсдсасстдс 540 65 тсадссстді астссдасс 559 «210» 31 «2115 34 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Синтетична «400» 31 саддсасасс ахдаддстдс дассстсся ддаас 34 «2105» 32 «2115 33 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 32 дасаєтасся хссдстссда стссаасдад авад 33 «2105» 33 «2115 33 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 33 адсадссстд аасасссасуд дссдтаєссс ааа 33 «2105» 34 «2115 26 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетична «4005» 34 сддадаєссає даддстдстдуд ассстс 26 «2105» 35 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 35 ддаасссста ддстдсата 19 «2105» 36 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 36 ддаасссста садддсаст 19 «2105» 37 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність (516) «220» «223» Синтетична «4005 37 65 ддаасссста дсадсддатє 19 «2105» 38 «2115 25 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Синтетична «4005» 38 тасддссадсе асадасаста ст 25 «2105» 39 «2115 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 39 ддаасссаст сдстастстс даа 23 «2105» 40 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 40 тссдадааста асдадта 17 «210» 41 «2115 29 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетична «400» 41 сассдааадс есдддасад аадстдеєс 29 «2105» 42 «2115 27 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 42 сдсддссдса астдстісада дедсада 27 «210» 43 «2115 28 «2125» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 43 сддасаадсес састддссса доддааата 28 «2105» 44 «2115 37 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність (516) «220» «223» Синтетична «4005» 44 65 аадаадстскд ссдссассає ддаєтддстд єдааасе 37 «2105» 45 «2115 31 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Синтетична «4005» 45 сддадаєсстс ааасттест дсссасстта 9 з1 «210» 46 «2115 36 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 46 аадааадстї дссдссасса хтасестсасе адсеси 36 «2105» 47 «2115 26 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 47 сдадассстє стссстстаа састст 26 «2105» 48 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетична «400» 48 си Рго Гуз 5ег Су5 Азр Гуз ТИг Ні 1 5 «2105» 49 «2115 4960 «212» ДНК «2135 Людина «4005» 49 ссддасдідд хадсасатдс стдстааєссс адстастсдд даддасєдада саддадааєт 60 дсеЕсдаассс сададдсада даєтдддд сесасасстд таассссадс асттдсадад 120 дседаддсад дедсаєсодсе єтддсеісадд адсссаадас садсстдддс аасасадада 180 дасссссаєс хїстасааааа асааааасаа ахсахтаааддда дасааааааа ааааааадас 240 аадасаєсдаа їссатдадда сададвсдсідд аададдаадс адсадсстса аадетстада 300 адстддаада асадаєсааас аддсдєдааа стаастдсстд дааадсааст сс 360 тест теЕсдадоаєдд адсстсастс тодссасссад дстддадсас адсдасасда 420 тІстсуддаєса стдсаасстс сдсстсссад дстсаадсаа ЕсСтсстдсс хсадсстссс 480 60 дадсадстдд даєссасааді дсдсастдсс асасстддає даєтеевавта єеЕеетсадсад 540 адаєсдддаєє єсассатає дассаддасвд дЕстсаааст сссаасстсд єдаєссассс 600 ассттудсесе сссааадсдс хтаддаєсаса ддсастаадсс ассдадссса дссаааадса 660 65 асттстаадс стдсааддада ассдадааєє ддедасасса ддЕсстстд асададе ета 720 адаааєсадс садсстдадд студдасасдд єдастсасас стдстааєссс адсасьтда 780 70 даддссаадд саддсддаєс асстдаддадс аддадеєсаа дассадсстд ассаасатдд 840 адааасссса хссстассаа ааасаааааа стадссаддї дсддсдакдс ссдсстдтаа 900 тсссадстас ттдддаддсе даддсдддад дчаєссдсеєда асасаддаад тададдстдс 960 й адсдадстає дассдсадса стдсастдаа дссдддасаа садаасаада сссааааааа 1020 адддададає даддддсада дссаддаєсє дессссаддс хдасєсдссасс таддессдас 1080 тсстддстсс сададсадсс хтассстдссІ дсстддааст стдадсаддс хтддадесата 1140 дадссдаєсс ссадааєссс ададссаддд аддастддаддд саддддасадд ссастддаса 1200 аасадаєсаа аддсдадасс адсдсадддс хдсадассад дссаддссад стддасдддс 1260 7 асассаєдад дсаддеддас дсссасадсс хссстдсада дсдсдадаєд ддадсасадад 1320 сстдддссст сассдсссст дссстдссса таддстдстуд ассстсстдду дсстстата 1380 тадсссддасд дссассссст тдддсссдаа дсддсстдаа сстадатасса дасдсстадас 1440 ассссссдас ти сссаддад адсасдссаа сдассаддад сддсдстдда ссстдастдс 1500 ассссссдас хтассдсстдс дсстстастс сасссастсс дасстдудадс кстсссасст 1560 7 стдсдадсас дастссдіса аддасдссдєс аддасддадад дастддадеє ссесаддуєс 1620 дддаддєссс сааддадсад ссадддесєса дддасасстд ддадсаддда ссаддсетада 1680
Зо ссаддаддда дасєссаддссї дддаєстсдсс тесастссст дсдасасстуд ассссасадс 1740 тдадсссддд ддссааддсд стддссасдс тдасдсдддса ддададсаса дасасддадс 1800 ддасссстдуд сааддасаст сстастсдс таддстссад сстдуддасаєсє ассттссдси 1860 з ссдастастс саасдадаад ссдіссасдуд дасссдаддсе сетестасдса дссдададта 1920 адссаададд ддЕсстдсаа сасстсадсс тдсдсадстуд дстдсдддад саастстуєс 1980 тсаддссадд садссстдсс тесадестсс ссасстттсс саддасадда дададдестс 2040 таддсстдаса стсастссасаа тдсааадасс аааасадсса тдасстссат тсасатаддас 2100 тдадсдссаа стістдадсса дддаєстдад дасадсаєсд сстсаадсда сдсадддаст 2160 з ддадссддасас адсадсстсас дсстдсаасс ссадсастес дддаддссда дастддстда 2220 тсасссдадда ссаддадесс ааддссадсс адддсаасас ддсдааастс татстссаст 2280 аааастасаа ааассадсстуд ддсдаєдасду кдсдсасстуд даассссадс тастадддад 2340 дстдаддсад дадааєсдсс сдаасстдсуд аддсддаддс стдсадсдаас ададаєтдса 2400 ссастасастї ссадсстддуд сдасададсї адастссдіс ссааааавгаса ааааасаааа 2460 й асдасдсадд ддссдадддас сссаєтстаса дссдасааад тддддсесстд ссадсаддад 2520 сдстдссадд ахсдессдаєс ссадаєссса діссстдсад адассаастуд тдасдасстст 2580 бо ддсаадсддс хсаастсстс тдстссттад даадстдстд саадддаеєса дсдстдсадс 2640 сссдссссст ддаєссдасс дастсссстс астадсстддда хдасстсддд ссддасаста 2700 ааастсссас тддЕссааса даддаєдаєсдє ссдсаєстє стсссадсдс тоастдддадс 2760 й тсідсадсдас сстаддсстд стааддсдаєї ддсссддсас садссссдса ссстадасад 2820 дасдаддсст ссістдаддає ссастстдад десасддаєс ссстдуддадда адсссаддсе 2880 70 ддассссдсес хсттЕссстсС стдасддсст дсстддсесст дсстстсссс садасаєтда 2940 сдадсдссад дседдссссду дададдсдсс сасстдсдас сассастдсс асаассасся 3000 ддасаддеес хтастдстсст дссдсдсадд стасдісстуд сассдсааса адсдсасста 3060 й стсадссстуд хдстссддсес аддаєстссас ссададдаєсі ддадддадссса дсадссстда 3120 аксасссасдуд ссдсрасссса аастстссад стдсастстас адсаєсадсс тодаддадда 3180 деЕссадсдєс ассстддасі ссдсддадес стссдасусд дадасасасс стдааассст 3240 дкдЕссстас дастесстса адаєссааас адасададаа даасасддсес саєсстасад 3300 даадасаєсуд ссссасадда ссдааасааа аадсаасасуд дседассаєса сстттудссас 3360 7 адасдааєса ддадассаса саддстддаа дасссастас асдадсасад сдсасасета 3420 сссттасссдуд асддсдссас стаастддсса садастесасст дсдсаадсса аатасатсст 3480 дааадасадс ссстссаєст кттдсдадас тддсстаєсдад сттстдсаад дссасттдсс 3540 сстдаааєсс тттастдсад студ ссадаа адасддаєсі сдддассддс саасдсссдс 3600 дсдсадсаєі десдасстуєд дссстсстда сдаєсстассс адсддссдад хтддадсасат 3660 7 сасаддессї ддадсдасса сстасааадс тдєдаєссад хтасадстуєд аададасстт 3720 стасасаатуд ааадсдаасд асддсаааса тасусудаєдад дседасддає сстддасдад 3780
Зо стіссааадда даааааєссас ксссадсстуд сдадсстуєс сдсддастає садсссдсас 3840 аасаддаддд сдсасасастуд дадддсаааа ддсаааасстї ддаєдастьсс стсддсаадсе 3900 сстдасаєтста ддчддаасса садсадсадд хтдсастесса стасдасаасс дддссстаас 3960 з адстдстсає дссуєстастуд адсаааааса сдасдсаєсс дссстддаса сссдаатдда 4020 сассстдааа адасстаєсас стсаєстастас асаадсстдуд сстдаадстуд ссестатаса 4080 тадаааддесає асссаєсдаєд стддсессда саасдасата дсастдаєста аассдаатаа 4140 сааадссдса ассаасадса асассасдсес тасстсуєстд ссаадаааад аадстдаатс 4200 стсстасдадд асадаєдаса ссддаастдс асстддаєдд ддаєсаассс ааадддаєстт 4260 з тсттдстада аасстаатує асдусдасає ассдаєстаєс дассаєсааа аатдтастдс 4320 тасасаєдаа аадссасссї ахсссаадддд аадсдсааст дстаасатас етатсастад 4380 стсадааадс дддддсаадд асадссдсад аддсдасадс ддаддддсас таддсасесст 4440 адасадсдаа асадададдає ддаессдсдоад аддаасадсуд ссстдддадєє ссасдааєттад 4500 тадддаадса ддассадсасд дадестасас аааадстаєє аастастаєсс сстддатсда 4560 й даасасааєсї адсдаєсьсс аасттдсуєд сєстдсадсса аддаєсстєс ассстсадаа 4620 асдсстдсда адасстсддс адсдасдсдд стсдадаадс астсаєссаєс астусддаса 4680 бо тадсадссує сдстссассс аааавгаасад астссаддаса адастдстдє сатесстсса 4740 сттдссадес саассссадс сттасссаєії дасссааддд дасасааасс асдададсда 4800 садссаєстс тдсссассса дсдсаасдєс астдстсааа сстасаєьсса стассттааа 4860 й аадссадест сте ссастас тддстудєсдуд саєсстестдса аастдсстоє ссасдстст 4920 тасессстааа сттдсстта ссдааааааа аааааааааа 4960 «2105» 50 70 «211» 2090
«212» ДНК «2135 Миша «220» «221» с0р5 «222» (33)..(2090) «4005. к.г50 ддасастддас хдсададста таддіддсаса сс атд адд ста стс ас ї-жс стад 53 мес Агд Ге їеи ІЇе РНе Ге 1 5 дає ста ста ду ад студ дсуд дсс оаса сет студ ддє са аад да сс 101 сЇУу Ге Гей Тер 5ег ге ма! Аїа тйг Гей їеи сіу 5ег Гуз Тер РгОо 10 15 20 даа сст ака їс ддуд сас стд дод сс сс ддс с сса дад аад тах 149 си Рго Ма! Рпе сЇУу Агд Геи Ма! 5ег Рго с1Їу Ре Рго сіи Гуз ТтТуг 25 30 35 дсЕ дас саст саа дає сда сс тдуд аса студ астї дса ссс сс 99с тас 197
АТа Ар Ні5 сІп А5р Агу бег тгр Ттйг ге Тийг АїТа Рго Рго сіІу туг 40 45 50 55 сус ста сдс о сес тас тс асс сас її дас студ даа сс ст тас сдс 245 Агд Гей Агд Геи Туг Ре Тийг Ні Ре А5р Гей сіи Геи бег Туг Ага 60 65 70 ас дад тає дас с дос аад студ адс са ддд асс аад дсд стд дес 293 сСуз сі туг А5зр Ре мМаЇ Гуз Ге 5ег 5ег сіу тТиг Гуз маїЇ ге Аїа
Ко) 75 80 85 аса стад тах 999 сад дад адї аса дас астї дад сад дса сс 99с аах 341
Тиг Ге су5 су сіп сі 5ег Тийг Азр тс си сіп Аа Рго су Ап 90 95 100 дас асс тс тас са студ ддє ссс адс ста аад дес асс тс сас тсс 389
Азр Тйг Ре Туг 5ег Ге сіу Рго 5ег Ге Гуз ма! Тис Ре Ні 5ег 105 110 115 дас хтас тсс ааї дад аад ссд сс аса ддуд с дад дсс тс тат дса 437
Азр туг 5ег Ап сі Гуз Рго Ре Тийг сіу Ре сій Аїа Ре туг АїЇа 120 125 130 135 дса дад дає от дає даа сдс ада 929 ст стад д99а дас са дес сс 485 Аїа сій Азр МаЇ Азр сіи сСу5 Агуд Ма! бек ге сіу А5зр 5ег маї Рго 140 145 150 ас дас сат тат судс сас аас тас студ ддс ддс хас тат тдс тсс тас 533 сСуз Азр Ні Туг Су5 Ні АЗзп Туг Ге сіЇу сіу туг туг сСу5 5ег су 155 160 165 ада дсуд ддс тас ат сіс сас сад аас аад сас асд тдс са дсс ст 581
Аг Аїа сіу туг ІЇе Гей Ні сіп д5п Гуз Ні тТиг сСуз 5ег Аїа Геи 170 175 180 тає са 99с сад от - аса да ада сс 999 тає стс ад адс сс 629 суз 5ег сіу сіп Ма! Ре тйг сіу Агд б5ег сіу туг їеи 5ег 5ег Рго 185 190 195 60 дад тас ссуд сад сса ас ссс о аад стс сс адс тдс асс жтас адс ас 677 сі туго Рго сіп Рго Туг Рго Гу5 Ге б5ег 5ег Су5 ТиИг Ттуг 5ег Пе 200 205 210 215 сдс ста дад дас ддс сс ад; дес оасс студ дас тс дсд дад сс тт 725 65 Агуд Ге сій Азр сЇу Рбе 5ег ма! ІЇїе Гей Азр Рпе мМмаЇ соЇи 5ег РПе 220 225 230 чає 979 дад асд сас ссІ даа дсс сад тдс ссс тат дас сс сіс аад 773
Азр мМаЇ сіи тис Ні Рго сі Аїа сіп Суб Рго Туг Азр 5ег Геий уз 70 235 240 245 аск саа аса дас аад 999 даа сас 99с сса ее т 939 аад асд ста 821 ч11е сіп тийг Азр Гуз сіу сій Ні сЇу Рго Ре Суз сЇу Гу5 Тиг Ге 250 255 260 сс ссс адд ас даа асї дас адс сас аад дкд асс ас асс тт дес 869
Рго Рго Агд ІЇе сЇи Тйг о А5р бек Ні Гуз Ма! Тийг ІЇе тиг РНе Аїа 265 270 275 аст дас дад суд 9ддд аас сас аса ддс хдуд аад ахта сас хтас аса адс 917
Тис Азр сій 5ег су А5Зп Ні Тс о сіу тер губ ІчІЇе Ні5 Туг тТиг 5ег 280 285 290 295 аса дса сдд ссс ждс сс дає сса асуд дсдуд сса сс аа 99с адс ат 965
Тс Аїа Ага Рго Суб5 Рго Азр Рго ТПг АЇїа Рго Рго А5п с1Їу 5ег Іїе 300 305 310 са сс дід саа дсс асд тат діс студ аад дас ада сс ст дес -5-с 1013 5зег Рго Ма! сіп Аїа тйг тує Маї Ге Гуз Ар Аг Ре 5ег Ма! РНе 315 320 325 тас аад аса ддс сс дад сеї студ саа дає ст дос ссс студ ааа са 1061 суз Гуз ТИг сіу Ре сій Гей ей сіп сіу 5ег ма! Рго Гей Гуз 5ег 330 335 340 тес оаст дст дсс ху сад ааа дах да ст т9ду дас сдуд ссдуд ахд сса 1109
Ре тийг Аїа ма! су сіп Гуз Азр соЇу б5ег Тер Ар Аг Рго Мет Рго 345 350 355
Зо дад сдс адс акт ас дає сус ддс сст ссс дає дас ста ссс аат ддс 1157 сіи Суз 5ег ч1І1е ІІе Азр Су5 сЇу Рго Рго А5р Азр Ге Рго А5Пп су 360 365 370 375 саст дод дас тат асс аса ддс сс саа дсуд аст асс тас ааа дст дід 1205
Ні ма! Азр туг ІЇїе тТийкг сіу Рго сіп Ма! тТйг тиг туг Гуз Аїа маї 380 385 390 ас сад тас адс тд даа дад аст сс тас аса ад адс адс аа ас 1253
ІІе сіп туг б5ег Су5з сіи сі Тс о РБе Туг тиг оМет 5ег 5ег зп су 395 400 405 ааа стат дка скдс дад дсї дає дда сс ду асуд адс сс ааа дда даа 1301
Гуз туг маїЇ сСуз сій Аїа Азр сіу Ре тгр тиг 5ег 5ег Гуз су си 410 415 420 аааістс ссс сс дек тає дад сст а тд дду сто сс оаса сас аст 1349
Гуз Ге Рго Рго Ма! Суз сій Рго Ма! Су5 сЇу Гей 5ег Тис Ні тНг 425 430 435 ата да да сдс ахта ат да 999 сад сст дса аад сс 99- дас -тщ- 1397 чІ1е соЇу су Агд ІІе ма! осЇу сіу сіп Рго Аїа Гуз Рго сіу Азр РПе 440 445 450 455 сс дод саа діс суд суд студ дує саа аст аса дса дса дса ддс дса 1445
Рго Тер сіп ма! гей гей Ге сіу сіп тйг тйг Аїа Аїа АїТа су Аїа 460 465 470 ст аса сат дас аас тдуд діс ста аса дсс дст сат дсї да тає дад 1493
Гей ІІе Ні5 А5р А5Зп тер ма! Гей тйг Аїа АЇїа ні5 АЇа ма! туг си (510) 475 480 485 ааа ада аскд дса дсуд сс о жсс студ аас ас сда атд 99 асс стс ааа 1541
Гуз Агд мех Аїа Аїа 5ег 5ег ей А5зп ІЇІе Агд мет сіу ІЇе Геи Гуз 490 495 500 65 адд сс тса сст саст тас аст саа дсс ду ссс дад даа ас 5 ата 1589
Ага Гей 5ег Рго Ні Туг Тк сп Аїа Тер Рго соЇи сої І1е Рпе Іїе 505 510 515 70 саїс даа ддс тас аст сас дд дссї дос єс дас аас дає аса дса її9 1637
НІі5 сій сіу туг Ттйг ні сіу Аїа сіу РіПе А5р А5п А5р ІЇе АїЇа Ге 520 525 530 535 ас ааа сс аад аас ааа дсс аса асс аас дда адс асс ад сст а 1685 че Гуз Ге Гуз АЗп Гуз Ма! Тйг ІЇе АЗп сіу 5ег ІЇе Ме Рго Ма! 540 545 550 тадс ста ссуд сда ааа даа дст дса сс тїта атуд ада аса дас її ас 1733 суз Ге Рго Агд Гуз сім Аїа АїЇа 5ег Ге Мет Агд Тийг Азр Ре ТЕг 555 560 565 дда аст ака дсс ддс кдд дод ста асс сад аад ддад ст ст дст ада 1781 сЇу тиг маїЇ Аїа сЇу тер сіу геи тк сп Гуз сІ1Уу гей гей Аїа Ага 570 575 580 аас ста ака її дід дас аста сса ас дссї дас сас саа ааа ду асс 1829
АЗзп Гей Мет Ріпе ма! Азр ІЇе Рго ІЇе АТа Азр Ніх сіп Гуз сСу5 Тег 585 590 595 асс 929 тає даа аад сс тах сса да да ада дса адс дсе аас атд 1877 тик о мМмаїЇ туг сіи Гуз Ге Ттуг Рго сіу Ма! Агд Ма! 5ег АїЇа Азп Мет 600 605 610 615 сс тус ас ддс ста дад астї дує ддс аад дас адс хдс ада ддс дас 1925
Геи суз АїЇа сіу Гей сіи Тйг сіу соЇу Гуз А5зр б5ег сСу5 Ага су А5р 620 625 630 ад: дда дда дса ста дод с ста дає аас дад аса сад сда тдд с. 1973 5зег сіу соЇу АТа Геи ма! РПпе гей А5р доп си Ттиг сп Агд Тер Ре
Ко) 635 640 645 от да да ака дек сс да 93 сс ас аатє тах 999 дса дса 99 2021 ма! сіу сіу чІІе ма! 5ег тер сЇу 5ег те Азп сут сЇУу АїЇа АїЇа сіу 650 655 660 сад тат дда дес тас аса ааа дос ас аас тат ас ссс дод аах дад 2069 сіп тус сЇу ма! Ттуг тик Гуз МмаїЇ ч11е Азп Ттуг Іе Рго Тер Аб5п сій 665 670 675 аас аса ахта адс аат іс таа 2090
А5зп І1е ІТе 5ег А5зп РІе 680 685 «210» 51 «2115 685 «2125 РЕТ «2135 Мигіпе «400» 51 мес Агуд Геи Геи І1е Рпе Геи сіу Гей їеи Тгр 5ег Геи ма! АїЇа тпг 1 5 10 15
Гей Геи сіу бек Гуз Тер Рго сій Рго Ма! Ре сіу Агуд Ге ма! 5ег 20 25 30
Рго сіу Рпе Рго сЇи Гуз Ттуг АЇа Ар Ні5 сп А5р Агу б5ег Тер тег 35 40 45
Гей Тийг Аїа Рго Рго сіу ТтТуг Агд Гей Агд Ге Туг Ре тТНг Ні РПе 50 55 60
А5Зр Гей соЇи Ге б5ег о Туг Агуд Суз сЇи Туг Азр Ре маї Гуз Геи 5ег 65 70 75 80 60 5зег сіу тиг Гуз ма! Гей Аїа тиг Ге Су5з сіу сіЇп сЇи 5ег ТИг А5р 85 90 95
Тиг си сіп АТа Рго сіу Ап А5р Тс РБе Туг 5ег Геци сі1у Рго 5ег 100 105 110
Гей Гуз ма! Тиг о РМПе Ні 5ег Ар Туг 5ег А5Зп сіи Гуз Рго Ре ТЕГ 65 115 120 125
О1Уу Ре сій Аїа Ре туг АЇа АїЇа сіи Азр ма! А5р сіи сСуз Ага маї 130 135 140 5зег Гей сіу Азр 5ег ма! Рго Су5з Азр Ні5 Туг Су5 Ні А5зп Туг Ге 145 150 155 160 70 с1іу с1у туг туг сСу5 5ег сСу5 Агуд Аїа су Ттуг ІЇе Гей НІі5 сп д5п
165 170 175
Гуз Ні Тис Суз 5ег АЇїа Ге Суз 5ег сЇу сіп ма! Ре тиг СТУ Ага 180 185 190 5зег сіу туг Гей 5ег 5ег Рго сі Туг Рго сіп Рго Туг Рго Гуз Ге 195 200 205 5зег бег Суз Тиг Туг б5ег ІЇе Агд Гей сій Азр с1у Ре 5ег ма! Пе 210 215 220
Гей А5р Ре ма! сіи бек Ре Азр ма! сіи тйг нНі5 Рго Си АїЇа сп 225 230 235 240 сСу5 Рго Туг А5р 5ег ей Гуз ІІе сіп Тис А5р Гуз су сіи ніх с1у 245 250 255
Рго Ре Су5 сіу Гуз ТИйг о Геи Рго Рго Аг ІІе сіи Тйг А5Зр 5ег Ні 260 265 270
Гуз ма! Ттийг ІТе Ттийг Ре АТа тийг А5Зр сіи 5ег с1у А5Зп Ні ТВг с1Уу 275 280 285
Тер Гуз ІІе Ні Тукг Ттийг 5ег Тйг АЇїа Агу Рго Су5 Рго Азр Рго ТЕГ 290 295 00
АЇа Рго Рго Азп сіу 5ег ІІе 5ег Рго ма! сіп АЇїа тийг туг маї Ге 305 310 315 320
Гуз АЗр Агу Рпе б5ег ма! Ре Суз Гуз Тиг су Рпе си Геи Геи сіп 325 330 335 сіу 5ег ма! Рго Гей Гуз 5ег Ре Тйг Аїа ма! Суб сіп Гуз А5р су 340 345 350 зег Тер АЗр Аг Рго Мет Рго сіи Суз 5ег ІЇе ІІе А5р Суз су РгОо 355 360 365
Рго А5р АЗр о Геи Рго Ап сіу Ні ма! Азр туг те тйг су Рго сп 370 375 380 ма! тик о тийг отуг Гуз АТа ма! ІІе сіп туг 5ег Су5 сі сіи Тйг РНе 385 390 395 400
Туг тийг Мет 5ег бек Азп сіу Гуз Туг ма! Су5 сім Аїа Азр с1іу Ре 405 410 415
Тер тиг о5ег о б5ег губ сіу сій Гуз Гей Рго Рго Ма! Су5 сіЇи Рго Ммаї 420 425 430 суз сІ1у Гей бек Ттиг ніх тйг ІЇе су о1у Агуд ІїЇе ма! су су сіп 435 440 445
Рго АЇа Гуз Рго сіу Азр Ріе Рго Тгр сіп ма! Гей їГеи Гей су сп 450 455 460
ТАиг Тег АїТа АТа Аїа сСіу Аїа ге ІЇе Ні д5р Ап Тгр маїЇ Гей тиг 465 470 475 480
Аїа АЇїа Ні5 АЇа ма! туг сЇи Гуз Агдуд Мет АїТа Аїа 5ег 5ег їеийи двп 485 490 495
ІІе Агуд Меє сіу ІЇе Ге Гуз Агд Гей бег Рго Ні Туг Тиг сіп Аїа 500 505 510
Тер Рго сім сій ІчІЇе Рбе ІЇе Ні5 сіи сіу туг тийг Ні5 су АїТа сі1у 515 520 525
Ре А5Зр А5Зп А5р ІЇе АїЇа гей ІЇеєе Гуз Гей Гуз АЗзп Гуз ма! тйг Пе 530 535 540
АЗзп сіу 5ег ІЇІе Мет Рго ма! сут Геи Рго Аг Гуз см АїЇа Аїа 5ег 545 550 555 560
Геи Мет Агуд Тс о АЗр Ре тТийг сіу тийг ма! АїТа сіу тгр су Геи тЕг 565 570 575 сп Гуз сіу Гей Гей Аїа Агд АЗп Ге Мет Ре ма! Азр ІЇе Рго ІЇе 580 585 590
АТа Азр Ні сіп Гуз Су5 ТВг о тиг омаї туг сій Гуз Гей Туг Рго сІу 595 600 605 ума! Агд ма! 5ег АЇа Азп Мет гГеи сСу5 АЇа сіу гей сЇи тйг сТу сі1у 610 615 620
Гуз А5р б5ег Суз Агуд сіу А5зр б5ег сІЇу о1у АЇїа ге ма! РНе Геи дор 625 630 635 640 60 Абзп сій Тс о сіп Агуд Тер РБе ма! сіу сІ1у ІЇїе ма! бек тгр су 5ег 645 650 655 ч11е А5зп Су5 СІ1у АїЇа АЇїа сіу сіп туг сіу ма! туг тиг Гуз маї Пе 660 665 670
Азп Туг ч1Їе Рго Тер А5п сі АЗп ІЇе ІІе 5ег А5Зп Ре 65 675 680 685 «2105 ч52 «2115 670 «2125 РЕТ «2135 Миша 70
«4005 52
Тк Гей Геи сіу бек Гуз Тгр Рго сій Рго Ма! Ріе СТУ АгОд гГеи ма! 1 5 10 15 бег Рго с1у Ре Рго сіи Гуз туг АЇа А5р Ні сп А5р Агд 5ег тТгр 20 25 30
Тк Ге тТийг АТа Рго Рго сІЇу Туг Агуд Гей Агуд Ге Туг Ре Тиг Ні 35 40 45
Ре А5р Гей сіи Гей б5ег о Туг Агдуд Суз соЇи Туг Азр Рпе маї Гуз Геи 50 55 60 5ег б5ег сіу Тийг Гуз ма! Ге Аїа тийг о Геи Су5з сС1у сіп сіи 5ег тНг 65 70 75 80
Азр Тйг сій сіп АЇа Рго сіу А5п Ар Тг Ре Туг 5ег їеи сі1у Рго 85 90 95 зег Гей Гуз ма! Тийг РПе Ні 5ег д5р Туг 5ег А5зп сЇи Гуз Рго РПе 100 105 110
Тк о1у Ре сім Аїа Ре туг АЇа Аїа сіи Азр ма! А5р сіи сСуз Ага 115 120 125 ма! бек ге сіу А5р б5ег ма! Рго Суз А5р Ні Туг Су5 НІ5 Азп ТУуг 130 135 140
Ге сіу сіу Туг туг Суз 5ег Су5 Агу АЇа сіу туг ІЇе Геи НІі5 сІп 145 150 155 160
АзпогГу5 Ні Тйг оСуз 5ег АЇа Гей Суз 5ег сіу сіп маї Ре тик сІу 165 170 175 Агд бег сіу туг Ге бег б5ег Рго сіи Туг Рго сіп Рго Туг Рго Гуз 180 185 190
Гей 5ег бек Суз Тиг Туг 5ег ІчІЇе Агуд Ге сім Азр сіу Ріе 5ег маї 195 200 205 че Гей Ар Ре маїЇ сіи бек Ре А5зр ма! сіи тйг нНі5 Рго Си АїЇа 210 215 220 сіп Суз Рго Туг А5р 5ег ей їу5 ІІе сіп ТтНг Аз5р Гуз СсЇу си НІ15 225 230 235 240
О1У Рго Рпе Суб5 сІу Гуз ТИйг о їеи Рго РГгГО Агу ІЇе сіи тТНг А5р 5ег 245 250 255
Ні Гуз ма! тийг о ІЇе тйг РПе АТа тйг дор сіи 5ег су А5зп Ні тег 260 265 270 с1у Тер Гуз ІІе Ні Туг ТИйг бек Тиг АТа Агд Рго Суб Рго А5р РгОо 275 280 285
ТВг АТа РгОо Рго Ап сіу 5ег ІЇе 5ег Рго ма! сіп Аїа тиг туг маї 290 295 00
Гей Гуз А5р Агуд Ре 5ег ма! Рпе Суз Гуз Тиг сіу Рпе си Гени гГеи 305 310 315 320 сіп сіу б5ег ма! Рго Гей Гуз 5ег Ре ТиПг АЇа ма!ї Суз сп Гуз дзр 325 330 335 сІіу бег Тер А5р Агуд Рго Мет Рго сіи Суб5 5ег ІЇІе ІІе Азр Суз О1У 340 345 350
Рго Рго А5Зр А5р Геи Рго А5Зп сіу Ні маї Азр Туг ІчІЇе Ттиг сІу РгОо 355 360 365 сіп ма! тег отвг туго Гуз АТа маїЇ ч1іе сіп туг 5ег Су5з сЇи сім тНг 370 375 380
Ре Туг Тиг Мет 5ег б5ег А5Зп сіу Гуз Туг ма! Су5 сім Аїа дор с1Уу 385 390 395 400
Рпе Тер тТиг 5ег о б5ег губ сІу сі Гуз Гей Рго Рго ма! Су5 сіи РгОо 405 410 415
Ма! Суз с1у Ге 5ег Тиг Ні Тиг ІЇе сіу с1у Агу ІІе ма! сіу с1у 420 425 430 сп Рго АЇа Гуз Рго сіу А5р Ре Рго Тгр сіп маїЇ ге гей їГеи с1У 435 440 445 сіп тс тг Аїа АТа Аїа СІуУ АїЇа ге ІЇе Ні А5р А5п Тгр маї Гей бо 450 455 460
Тк АТа Аа ніх АЇїа ма! туг сіи їу5 Агуд Мет АЇа АЇа 5ег 5ег Геи 465 470 475 480
А5п ІІе Агд Мет сіу ІЇе гей Гуз Агд Гей бег Рго Ні5 Туг ТИг сп 485 490 495 65 АїЇа тер Рго сіи сій ІІе Рпе ІЇе Ні5 сіи сіу Туг Тк Ні5 О1Уу АїЇа 500 505 510 с1У Ре А5Зр А5п А5Зр ІЇе АЇїа гей ІЇе Гуз Ге Гу5 А5зп Гуз ма! тНг 515 520 525
ІІе А5п сіу 5ег ІЇе Меї Рго ма! сСуз5 Геи Рго Аг Гуз сЇи АїЇа Аїа 70 530 535 540 зег Гей Мет Агуд Тийг Ар Ре тТийг сіу тйг ма! АТа су Тер стТУ гей 545 550 555 560
Тег оп Гуз с1у гей Гей АТа Агд АЗп Гей Мет Ре ма! Азр ІЇе Рго 565 570 575
ІІе АТа д5р ніх сіп Гуз Суз Тийг тс ма! туг сім Гуз Гей Ттуг РгО 580 585 590 сІ1у ма! Агд ма! 5ег АЇа А5п Мет гГеи сСу5з АЇа сіу геи сЇи тНг су 595 600 605 о1Уу Гуз Ар бег Су5з Агуд сіу Азр 5ег су сСІ1у АЇа гей ма! РНе гГеи 610 615 620
А5Зр А5п сої Тг осіп Агуд Тер Ре ма! сіу сіу Іе ма! 5ег Тер с1у 625 630 635 640 5ег ІЇе А5п Су5 СсІіу АїЇа Аїа сіу сіп туг сіу ма! тукг тиг Гуз ма! 645 650 655
ІІе А5зп Туг ІЇе Рго Тер А5зп сім Ап ІчІЇе ІЇе 5ег дА5зп РПе 660 665 670 «2105 53 «2115 2091 «212» ДНК «2135» кає «220» «221» с0р5 «222» (1035..(2067) «4005 53 таддсасаса ад адд ста студ ас дес стад 99 ста сет ходу ад ста 979 51 меє Агд Гей їеи ІЇе Ма! ге сіу гей Геи тер 5ег Геци ма 1 5 10 дсс аса ст сто ддс сс о аад дод сс дад сс да ї-с 9д9дд сдс ста 99
Аїа Ттийг Гей ге сіу бек уз Тгр Рго сіи Рго Ма! Ріе сІУ Ага гей 15 20 25 30 да сс студ дес тс сса дад аад тат ддс аас саї сад дає сда сс 147 МаїЇ бег Ге Аїа Рпе Рго сій Гуз Туг сіу Азп Ні сіп Азр Аг 5ег 35 40 45 тдд асд студ аст дса ссс о сст ддс тс сас студ сдс сс тас тс асс 195
Тер тигогеи тиг Аїа Рго РгГО Фу Ре Агд Ге Агд Гей тТуг Ре ТтЕг 50 55 60 сас с аас студ даа сс ст тас сдс тдс дад тає дас 5 діс аад 243
Ні Рпе Ап Гей сіи Гей бек туг Агд Суз сій туг Азр Ре маї Гуз 65 70 75 ту асс їса ддд асс аад дтд ста дсс асд ста тд 9д9д сад дад адс 291
Ге Тйг о б5ег сіу тиг Гуз маїЇ гей Аїа тийг Ге сСу5 сіу сіп сіи 5ег 80 85 90 аса дат аст дад сду дса сс ддс ааст дас асс тс тас са стад дос 339
Тк Азр тс см Агу Аїа Рго Фу Азп А5р ТИг Ре Туг 5ег гей Фу 95 100 105 110 ссс адс ста аад діс асс тс сас сс дас тас тсс ааї дад аад сса 387
Рго 5ег Гей Гуз Ма! тТиг Ре Ні бек Азр Туг 5ег Азп си Гуз Рго 115 120 125 ос оаса дда с дад дсс тс тат дса дсд дад дат дод дає даа тас 435
Рпе тйг сЇу Ре сій Аїа Ре туг АЇа Аїа сіи Азр ма!Ї Азр сіи су бо 130 135 140 ада аса сс стд да дас тса дес сстІ худ дас сат тає сдс сас аас 483
Ага Тис об5ег ге сіу Азр бег Ма! Рго Суз Ар Ні5 Туг сСу5 Ні А5ПпП 145 150 155 65 ас студ ддс ддс хас тас тдс сс тдс сда дсд ддс тас ас стд сас 531 туг Ге сіу сіу туг туг Суз 5ег сСу5 Агуд Ма! сіу туг ІЇе Гей нНі5 160 165 170 70 сад аас аад саст асс тдс хса дсс ст тус са ддс сад дкд ї-5с ас 579 сіп А5п Гуз Ні ТигоСу5 5ег АЇа ге Су5з 5ег с1у сіп ма! Ре тНг 175 180 185 190 даа адд ст дадс ве сс аде адс сст дад тас сса сад сса тас ссс 627 со1|у Агд б5ег сЇУу Ре Гей бек 5ег Рго сіи Туг Рго сіп Рго Туг РГгО 195 200 205 ааа стс тсс адс тдс дсс тас аас ас сдс стд дад даа 99с т-ЕущеОКе адес 675
Гуз Ге б5ег бек сСсуз Аіїа Туг Азп ІЇІе Агд Ге сіи сіи соЇу Ріе 5ег 210 215 220 асс асс ста дас тс дід дад сс т дає дід дад ад сас сс даа 723
ІІе ТтНПг огГей АЗзр Ре ма! сіи 5ег Ре Азр ма! сіи мес Ні Рго сЇи 225 230 235 дсс сад тадс ссс ожтас дас сс сс аад ас саа аса дас аад адд даа 771
АТїа сіп су5 Рго Туг Азр б5ег їеи їу5 ІЇе сіп тНг Азр Гуз Ага си 240 245 250 хас 99с сса ЕЕ ту 999 аад асд студ ссс ссс адд ас даа аст дас 819
Тукг су Рго Ре Су5 оЇУу Гуз ТИйг Ге Рго Рго Ага ІЇе сім Тиг А5р 255 260 265 270 адс аас аад дід асс ас асс тїї асс асс дас дад са ддд аас сас 867 зег А5п Гуз Ма! Тийг о ІЇе Тис РНе тйг о тйг Азр ої 5ег сІ1Уу А5зп Ні 275 280 285 аса ддс тду аад аса сас тас аса адс аса дса сад ссс тдс ссе дає 915
Тис о сіу тер Гуз ІЇе Ні туг Тйг о5ег Тиг Аа сіп Рго Суб Рго Азр
Ко) 290 295 300 сса асд дсд сса ссе аас 99 сас а са сс 979 саа дсс асд тах 963
Рго Тйг АїТа Рго Рго Ап сЇу Ні Ііе 5ег Рго мМаЇ сіп Аїа тЕйг туг 305 310 315 дсс ста ааад дас адс сс ст дсс тс тдс аад аст ддс с дад ст 1011
Уа! Гей Гуз Азр 5ег Ріпе 5ег Ма! Ре сСу5з Гуз ТИг сЇу Ре си Гей 320 325 330 стд саа дді ст дос ссс студ аад са тс ас дсх дсс тує сад ааа 1059
Гей сіп сіу 5ег ма! Рго Гей губ 5ег РПпе Тйг АїТа ма! сут сіп Гуз 335 340 345 350 чає да ст 99 дас сдуд ссуд аста сса дад хтдс адс акт акт дас тах 1107 А5зр сЇу б5ег Тер А5р Агуд РгоО ІЇе Рго сіи Суз 5ег ІІе ІІе Азр су» 355 360 365 дудс сст ссс дає дас ста ссс о аат ддс сас дід дас тає асс аса ддс 1155
СУ Рго Рго А5зр Азр Гей Рго Ап сіу Ні ма!Ї Азр туг Пе тЕиг су 370 375 380 сс даа дкд асс асс тас ааа дст дод асо сад стас адс тус даа дад 1203
Рго сім ма! тТйг тиг о туг Гуз АЇїа ма! ч1їе сіп туг 5ег сСу5 сім сЇий 385 390 395 ас с тас аса атд адс адс аа 93 ааа ха 99 тає дад дсе дах 1251
Тс Ре туг тТиг Мет 5ег о 5ег А5п сЇу Гуз Туг Ма!Ї сСу5з сім Аїа дор 400 405 410 бо дда сс да асуд адс сс ааа дда даа ааа сс о стс ссд де тдс аад 1299 сІУ Ре тер тиг о б5ег б5ег губ сЇу сіи Гуз 5ег Гей Рго Ма! сСуз Гуз 415 420 425 430 сс ас тус дда студ сс оаса сас аст са дда ддс сх аста аск дда 1347 65 Рго Ма! Суз сіу Ге 5ег Тиг ні тиг 5ег сіу сіу Агд те Пе сіу 435 440 445 да сад сс дса аад сс 93 дас т сс ду саа діс тд ста стад 1395 су сіп Рго АЇа Гу5 Рго сІу Азр Ре Рго Тер сіп ма! Гей їеи гей 70 450 455 460
9 даа ас аса дса дса 93 ас ст ака сат дас дас тдд дес ста 1443 су сім тйг тйг АТа Аїа су Аїа ге ІЇе Ні Азр Азр тгр маї Гей 465 470 475 аса дса аст сас дсї дса тає ддд ааа аса дад дсд акд сс о тсс стад 1491
Тиг АТа Аїа ні5 Аїа ма! туг сіу Гуз тйг сій Аїа Мет 5ег 5ег гей 480 485 490 дас асс сдс ауд ддс асс сс ааа адд сс тсс стс ас тас аст саа 1539
А5зр чІІе Агуд Меї сіу ІЇе гей Гуз Агд Гей б5ег Гей ІЇе Туг Ттиг сп 495 500 505 510 дсс дод сса дад дсї дес 2 ас сат даа 99 тас аст сас да сх 1587 Аїа тгр Рго сі Аїа ма! Рпе ІЇе Ні5 сіи соЇу туг тйг ніх сіу Аїа 515 520 525 ддє с дас ааст дає ата дса студ ас ааа сс аад аас ааа дес аса 1635
СУ Ре Азр А5п Ар ІЇе Аїа гей ІЇе Гу5 Гей губ А5Зп Гуз ма! тис 530 535 540 асс аас ада аас ас ауд ссд ас тус ста сса ада ааа даа дст дса 1683 ч11е А5Зп Аг АбЗп о ІчІ1е Меї Рго ІЇе Ссу5 Гей Рго Аг Гуз сЇи АїЇа Аїа 545 550 555 сс о їта ауд ааа аса дас тс де да ас 929 ас 99 тад 999 ї-а 1731 5зег Гей мет Гуз ТИг Азр Ре ма! сіу тиг маїЇ Аїа сіу тер су Ге 560 565 570
Зо асс сад аад ддд сс ст дст ада аас ста ад її дід дас ата сса 1779
Тк сп Гуз с1Їу Ре Ге Аїа Агуд Азп Гей Мет Ре ма! Азр ІЇе Рго 575 580 585 590 ак де дас сас саа ааа тд дст ас дсуд тає аса аад сад ссс тас 1827
ІІе ма! А5р ніх сіп Гуз сСсуз Аіїа Тк Аїа туг тйг Гуз сіп Рго туг 595 600 605 сса да дса ааа от ас Яд аас ад стс тає дст 99 ста дас сдс 1875
Рго сіу Аїа Гуз Ма! тТийг Ма! Азп Меї гГеу су5 АЇа сіу Ге Азр Ага 610 615 620 дує дудс аад дас адс тдс ада ддсє дас адс дда ддд дса ста дет с 1923 соЇу сіу Гуз Ар 5ег сСуз Агуд сіу Азр 5ег сіу сіу Аїа Ге Ма!ї РПе 625 630 635 ста дас ааїт даа аса сад ада хдд 5 дід дда дда аса дес сс ад 1971
Гей А5р А5п сій Тгосіп Аг Тер Ре ма! сіу сіу ІЇе Ма! 5ег Тер 640 645 650 93 ст асс аас тає 999 999 са даа сад тах 999 дес хас асд ааа 2019 сІу 5ег ІІе А5п Су5 сіу сЇу 5екг сій сіп туг сіу ма! Ттуг тЕиг Гуз 655 660 665 670 дкс асд аас тат ас ссс тудуд ас дад аас аса ата аасє аас тс таа 2067
Ма! Ттйг Ап тТуг ч11е Рго Тер Іїе сій Ап ІЇе ІЇе А5п д5п РПе 675 680 685 тЕсдсааааа аааааагаааа аааа 2091 «2105» 54 60 «2115» 685 «2125 РЕТ «2135» кає «400» 54 65 мес Агд Гей Гей Іїе ма! Ге сіу гей Ге Тгр 5ег їеи ма! АТа тЕг 1 5 10 15
Гей Геи сіу бек Гуз Тер Рго сій Рго Ма! Ре сіу Агуд Ге ма! 5ег 20 25 30 70 Гей Аїа Рпе Рго сіЇи Гуз Туг сіу А5зп Ні5 сіп д5р Агу 5его Тер тег
35 40 45
Гей Тийг Аїа Рго Рго сіу Ре Агуд Гей Агд Геи Туг Ре тТНг Ні РПе 50 55 60
АЗзп о їеи сої Гей б5ег о Туг Агдуд Суз сім Туг Азр Ре маї Гуз Геи тпг 65 70 75 80 5ег сіу тйг Гуз ма! Гей Аїа тиг Гей Су5 сіу сіп сі 5ег Тиг др 85 90 95
Тк ої Агуд Аїа Рго с1у А5п Ад5р Тс Ре туг 5ег Ге сіу Рго 5ег 100 105 110
Гей Гуз ма! Тис Ре Ні 5ег А5р Туг 5ег А5п сіи Гуз Рго Ре ТЕг 115 120 125
О1Уу Ре сій Аїа Ре туг АЇа АїЇа сі Азр ма! Азр сіи сСуз Ага тиг 130 135 140 5зег Гей сіу Азр 5ег ма! Рго Су5з Азр Ні5 Туг Су5 Ні А5зп Туг Ге 145 150 155 160 сІ1у сіу Ттуг Тукг Суз 5ег Суз Агуд ма! оЇу туг ІЇе Гей НІі5 сп д5п 165 170 175
Гуз Ні Тис Суз 5ег АЇїа Ге Суз 5ег сЇ1у сіп ма! Ре тиг СТУ Ага 180 185 190 5зег сіу Ре Геи 5ег бег Рго сЇи Туг Рго сіп Рго Туг Рго Гуз Гей 195 200 205 5зег б5ег Суз АЇїа тТуг Азп ІЇе Агд Ге сіи сій с1у Ре 5ег ІЇе тпг 210 215 220
Гей А5р Ре ма! сіи 5ег Ре Азр ма! сіи мет ні5 Рго Си АїЇа сп 225 230 235 240 суз Рго Туг Азр 5ег Гей Гуз ІЇе сп тТНг А5р Гуз Агу сЇи Ттуг с1у 245 250 255
Рго Ре Суз сіу Гуз ТИйг о Геи Рго Рго Аг ІІе сіи Тйг А5р 5ег дп 260 265 270
Гуз ма! Тк ІТе тийг Ре тйг тис А5Зр си 5ег сіу Азп Ні Тг сТу 275 280 285
Тер Гуз ІчІЇе Ні Туг Тйг обегкг Тйг АТа сіп Рго Суз Рго Азр Рго ТИг 290 295 300
Аїа Рго Рго Азп сіу Ні5 ІІе 5ег Рго ма! сіп АЇїа тийг туг маї Ге 305 310 315 320
Гуз АЗр б5ег Ріпе 5ег ма! Ре Суб Гуз Тпг сІіу Ре сіи Гей Геи сп 325 330 335 сіу 5ег ма! Рго Гей Гуз 5ег Ре Тийг Аїа ма! Суб сіп Гуз А5р су 340 345 350 5зег Тер А5р Агу Рго ІЇе Рго сіи Су5з 5ег ІЇе ІІе А5р Суз су Рго 355 360 365
Рго Ар АЗр о Геи Рго Азп сіу Ні ма! Азр туг те тйг су Рго си 370 375 380 ма! тик о тийг туго Гуз АТа ма! ІІе сіп туг б5екг Су5 сі сіи Тийг РНе 385 390 395 400 туг Тег Мет б5ег о б5ег А5п сіу Гуз Туг ма! Су5 сім АТа Азр с1у Ре 405 410 415
Тер тиг о5ег о б5ег губ сіу сій Гуз 5ег Ге Рго Ма! Су Гуз Рго Ммаї 420 425 430 сСуз со1у Ге 5ег Тиск Ні тТиг 5ег сіу сіу Агу ІІе ІЇе с1у с1у сп 435 440 445
Рго АЇа Гуз Рго сіу Азр Ріе Рго Тгр сіп ма! Гей їГеи Гей сІу си 450 455 460
ТВиг Тег АїТа АТа сіу АЇа гей ІЇе НІі5 А5р д5р Тгр ма! Гей тиг Аїа 465 470 475 480
АТїа Ніб5 АЇїа маїЇ Ттуг сІу Гуз Тиг сі АТа Меї 5ег 5ег їеи А5р ІїЇє 485 490 495
Агд меє с1у ІЇе Ге їу5 Агуд Ге 5ег ем ІЇе туг тНг сіп Аїа тгр 500 505 510 60 Рго сім Аїа ма! Ре ІЇе ніх сіи сІу туг тТйг ніх сіу АТа с1у РПе 515 520 525
АЗр А5п А5р ІЇе АЇа гей ІЇе Гуз Гей губ Азп Гуз Ма! Тиг ІЇе деп 530 535 540
Аг А5п ІЇе Меї Рго ІЇе сСу5 Геи Рго Аг Гуз сЇи Аїа АїЇа 5ег геи 65 (545 550 555 560
Ммеє Гуз ТиПг Ар Ре маї сІу тиг ма! Аїа сіу Тер сІу Гей тЕг сп 565 570 575
Гуз сі1у Рпе Гей АТа Агуд АЗзп Гей Мет Ре ма! Азр ІЇе Рго Пе маї 580 585 590 70 Ар Ні5 сіп Гуз Су5з Аїа Тийг Аїа туг тиг о Гуз сіп Рго Туг Рго с1у
595 600 605
АТа уз ма! тиг ма! Азп Мет гГецу сСсу5 АїЇа сіу Гей А5Зр Агд су сі1у 610 615 620
Гуз А5р б5ег Суз Агуд сіу А5зр б5ег сІЇу о1у АЇїа ге ма! РНе Геи дор 625 630 635 640
АЗзп сій Тпг сій Аг Тер Ре ма! сіу сіу ІІе ма! 5ег Тгр сІу 5ег 645 650 655
ІчІІ1е А5зп Суб сІіу сіу 5ег сі сіп туг сіу ма! туг Ттиг Гуз ма! тег 660 665 670
А5зп Туг ІЇе Рго Тер ІЇе си А5п ІЇе ІЇе А5п А5п РПе 675 680 685 «2105 1055 «2115 670 «2125 РЕТ «2135» Щур «4005 155
Тк Гей Геи сіу бек Гуз Тгр Рго сіи Рго ма! Ре СТУ Ага гГеи ма! го 1 5 10 15 5зег Гей Аїа Ре Рго сіи Гуз Туг сІ1у А5зп Ні сп А5р Агд 5ег тТгр
Тк Ге Ттийг АТа Рго Рго сІ1у Ре Агд Гей Агуд Ге Туг Ре Тиг НІі5 25 Ре А5п Гей сіи Гей б5ег о Туг Агдуд Суз соЇи Туг Азр Рпе маї Гуз Геи 60
Тиг об5ег сіу тиг огуз ма! гей АЇїа тик Ге Су5 сіу сіп сіи 5ег тиг 65 70 75 80
Азр Тс сої Агуд АЇїа Рго сіу А5п др Тс Ре туг 5ег Геи сІу РгОо
Ко) 85 90 95 5зег Гей Гуз Ма! Тиг РМПе Ні 5ег А5р Туг 5ег А5Зп сіЇи Гуз Рго РЕНе 100 105 110
Тк о1у Ре сім Аїа Ре туг АЇїа Аїа сіи Азр ма! А5р сіи сСуз Ага 115 120 125 35 Тис обег ге сіу А5р б5ег ма! Рго Суз Ар Ні Туг Суз Ні А5зп Ттуг 130 135 140
Ге сіу сіу Туг туг Суз 5ег Суз Агуд ма! сіу туг ІЇе Геу НІі5 сІп 145 150 155 160
АзпогГуб5 Ні ТИг о Суз 5ег АЇа Ге Суз 5ег сіу сіп маї Ре тНг сІу 40 165 170 175
Аг бек с1у Ре Геи бек бег Рго сіи Туг Рго сіп Рго Туг Рго Гуз 180 185 190
Гей 5ег б5ег Суз Аїа туг А5Зп ІЇе Агд Ге сіи сім сіу Ре 5ег Пе 195 200 205 45 Тс Гей А5р Ре маї сіи б5ег Рпе А5зр ма! сіи Мес ніх Рго сіи Аїа 210 215 220 сп Суз Рго Туг А5р 5ег їГеи їу5 ІЇе сп Ттйг А5р Гуз Ага си туг 225 230 235 240
О1У Рго Рпе Суб5 сІу Гуз ТИйг о їеи Рго РГгГО Агу ІЇе сіи тТНг А5р 5ег 50 245 250 255
Азп Гуз ма! Тк о ІЇе Тиг о РНе тТиг тс А5Зр сій 5ег су А5Зп Ні тег 260 265 270 сіу Тер Гуз ІчІІе Ні5 Туг Тигоб5егкг Тйг Аїа сіп Рго Суз Рго А5р РгГО 275 280 285 55 Тс Аїа Рго Рго А5п с1у Ні ІЇе 5ег Рго ма! сіп АЇїа тйг туг ма! 290 295 00
Гей Гуз АЗр 5ег Ре 5ег ма! Ре Суз Гуз ТИг с1у Ріє Си Геи гГеи 305 310 315 320 сіп сіу б5ег ма! Рго Гей Гуз 5ег Ре Тийг АЇа ма!ї Су сп Гуз дзр бо 325 330 335 с1у б5ег Тер А5р Агу Рго ІЇе Рго сіи Су5з 5ег ІЇе ІЇе А5р Суз су 340 345 350
Рго Рго А5р А5р Геи Рго А5Зп сіу Ні маї Азр Туг ІчІІе Ттиг сІу РгОо 355 360 365 65 сій ма! тс оте тує Гуз АЇїа ма! І1ІІе сіп туг 5ег Су5 оЇи си тег 370 375 380
Ре Туг Тиг Мет 5ег б5ег А5Зп сіу Гуз Туг ма! Су5 сім Аїа дор с1Уу 385 390 395 400
Рпе Тер тТиг 5ег б5ег губ сІу сі Гуз бек Ге Рго ма! Су Гуз РгО 70 405 410 415 ма! Суз с1у Ге 5ег Тк Ні тиг 5ег су с1у Агу Іе те сТу с1у 420 425 430 сп Рго АЇа Гуз Рго сіу А5р Ре Рго Тгр сіп маїЇ ге гей їГеи с1У 435 440 445 си Тис тпг АТа Аїа сіу АїЇа ге ІЇе Ні А5р А5р Тгр ма! Геи тпг 450 455 460
Аїа Аїа Ні АЇїЇа ма! туг сіу Гуз Тйг сій АїЇа Меї 5ег 5ег Геи дор 465 470 475 480
ІІе Агуд мех су ІЇе Гей Гуз Агд Гей бек Ге ІІе Туг тис сіп Аїа 485 490 495
Тер Рго сій АТа ма! Ре ІЇе Ні5 сіи сіу туг тийг Ні5 с1у АїТа сі1у 500 505 510
Ре А5Зр А5Зп А5р ІЇе АїЇа гей ІЇеєе Гуз Гей Гуз АЗзп Гуз ма! тйг Пе 515 520 525 А5пП Агуд АЗп о ІЇе Мет Рго ІЇе сут Геи Рго Агд Гуз сім Аїа Аїа 5ег 530 535 540
Геи мет Гуз ТИг АЗр Ре ма! сіу тйг ма!їЇ Аїа СсІу Тер с1у гГеи тНг 545 550 555 560 сіп Гуз сіу Ре Гей АЇа Агуд АЗп Ге Меїс Ре ма! Азр ІЇе Рго ІЇе 565 570 575 ма! Азр Ні сіп Гуз сСу5 АЇїа Тиг АЇїа туг тик Гуз сіп Рго Туг Рго 580 585 590 о1Уу Аїа уз ма! тиг ма! А5п мет геи сСуз АїЇа сіу гей А5р Ага су 595 600 605 с1у Гу5 А5р 5ег Су5 Агуд с1у А5р 5ег сіу с1у Аїа Ге ма! РНе Геи 610 615 620
А5Зр А5п си Тг осіп Агуд Тер Ре ма! сіу сіу Іе ма! 5ег Тер с1у 625 630 635 640 5ег ІІе А5п Су5 сіу сіу 5ег сій сіп туг сіу ма! тукг тиг Гуз ма! 645 650 655
ТВг о АЗзп Ттуг те Рго Тегр ІЇе сі А5п ІЇе ІЇе А5п А5Зп РПе 660 665 670 «2105» 56 «2115 28 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Людина «4005 156 асдаддстдс хдассстсст дддсстс 28 «2105 57 «2115 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Людина «4005 57 дедсссстсс тодсдесасст ста 23 «2105» 58 «2115 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Людина (516) «4005 58 сададдсдас дсаддадддд сас 23 «2105 59 «2115 27 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Людина 70
«А00» 59 тсаааассас таасттасудєє сесдатс 27 «2105» 60 «2115 22 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Миша «400» 60 асдаддстас хсассттсст да 22 «2105» 61 «2115 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Миша «400» 61 стосададдс дасодсадада 999 23 «2105» 62 «2115 23 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Миша
Зо «4005» 62 ссссссстдс дссасстстду сад 23 «2105» 63 «2115 29 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Миша «400» 63 тстадаааєсста сттассаєсуає єстсаатсс 29 «2105» 64 «2115 29 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Щур «400» 64 даддедасдс аддаддддса єтадеде 29 «2105» 65 «2115 37 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Щур (516) «400» 65 стадааасас хаатдсссст сстдсдесас стстдса 37 «210» 66 «2115 354 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична 70
«4005 66 саддісасстї хєдааддадсс хтадЕсстасу стддідааас ссасададас сстсасдста 60 асстдсассаЯ Естстдддаєс стсастсадс аддддсаааа тдддасасдад стддасссдяе 120 садсссссад ддааддсссї ддадсддсес дсасасаєтє єссссдадсда сдааааатсс 180 тасаддасає сдстдаадад саддстсасс асстссаадд асасстіссаа ааассадатд 240 дЕссттасаа сдассаасаєт ддассстдсд дасасадсса сдсаєстастд сдсасддата 300 сдасдєддад даассдаста стддддсесад ддаассстдд ссастасстс стса 354 «2105» 67 «2115 118 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 67 сіп ма! тийгогГеи Гуз сі б5ег сіу Рго маЇ Ге ма!Ї Гуз Рго Тйг Си 1 5 10 15
Тис Гей тТигоСеи Тк о Суз ТигоМма! бек сіу Ріпе 5ег Геи 5ег Агд с1у 20 25 30
Гуз мет сіу ма! 5ег Тегр ІЇе Агу сп Рго Рго су Гуз АїТа Геи си
Тер Гей Аїа Ні ІЇе РіПе 5ег 5ег Ар сіи Гуз 5ег Туг Агуд Тиг 5ег
Ко) 50 55 60
Гей Гуз б5ег Агуд Гей Тйг о ІЇе бек Гуз Азр ТИг 5ег Гуз А5Зп сп маї 65 70 75 80 ма! Ге тийг оМес Тийг о АЗп Мет А5р о Рго ма! Азр Тийг Аїа тйг туго туг 85 90 95 35 сСу5 АЇа Ага ІЇе Агуд Агуд сЇу с1іу ІЇе А5р Ттуг Тгр сІу сіп су тНг 100 105 110
Ге ма! Тиг ма! 5ег 5ег 115 «210» 68 40 «2115» 121 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» 45 «223» Синтетична «4005 68 сіп ма! сіп ге сіп сіп б5ег сіу Рго сіу Ге ма!Ї Гуз Рго 5ег сп 1 5 10 15
ТИг Ге бек ге Тиг о Суз АїЇа ч1іе б5ег сіу А5р 5ег ма! 5ег б5ег тиг 20 25 30 5ег АїЇа Аїа Тер А5п Тгр ІЇе Агуд сіп 5ег Рго 5ег Аг су Геми си 35 40 45
Тер геи с1у Ага Тийг туго туг Агд бег о їуз Тгр Туг А5Зп А5р Туг АїЇа 50 55 60
Уа! бек ма! Гуз 5ег Агуд ІІе Тийг ІЇе А5п РгОо А5р тТНг 5ег Гуз А5бп 65 70 75 80 сіп Ре б5ег їеи сіп Гей АЗп б5ег ма! Тийг Рго сіи А5зр ТНг Аа маї бо 85 90 95 тукг туг суз АТа Агуд А5р Рго Ре сіу ма! Рго Ре А5р ІЇе тгр Ос1У 100 105 110 сіп сіу Ттийг Мет ма! тис ма! 5ег 5ег 115 120 65 «210» 69 «2115 318 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Синтетична «221» додаткові ознаки «222» (2463)..(246) «223» п являє собою а, с, 9 або ї «4005 69 садссадстдс єдастсадсс сссстсастд хссдідсссс саддасадас адссадсатс 60 асстдсестд дададаааєї дддддастааа тасдсесасі дасаєсадса даадссаддс 120 садссссста хдссддесає дсассаадає ааасадсддс сстсадддає ссстдадсда 180 тЕсСтЕСстддсе ссаастстдд даасасадсс астстдасса хсадсдддас ссаддстатд 240 даєсдапдстад астаєсстастуд ссаддсдсдд дасадсадса стдсдастаєс сддсададда 300 ассаадстда ссдесста 318 «2105 70 «2115» 106 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 70 сіп Рго ма! Ге Тийг о сіп Рго РгОо 5ег Ге 5ег ма! 5ег Рго су сп з30 1 5 10 15
ТВг АТа 5екг ІІе тийг Суз 5ег сіу сій Гуз Ге сіу А5Зр Гуз Ттуг АїЇа 20 25 30 туг Тер туг сіп сіп Гуз Рго сіу сіп 5ег Рго Ма! Гей ма! мес туг 35 сіп А5р Гуз сп Агуд Рго б5ег сіу ІЇе Рго сі Аг Ре б5ег су 5ег 60
Азп б5ег сіу Азп Тйг Аїа тТйг гей Тс ІІе 5ег сіу тийг сіп Аїа мет 65 70 75 80
Азр сі Аїа Азр Туг Туг Суз сіп Аїа Тер Азр 5ег 5ег ТтЕиг Аїа ма! 40 85 90 95
Рпе сіу сІу сіу Тиг Гуз Ге тиг маї гГеи 100 105 «2105 71 «2115 120 45 «2125 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Синтетична 50 «4005 71 5ег Туг сім Ге І1Іе сій Рго Рго 5ег ма! 5ег ма! АїЇа Рго сІ1у сіп 1 5 10 15 55 Тс Аїа тийг о ІІе тик су5 АїТа с1у А5р Ап ем су Гуз Гуз Агд ма! 20 25 30
Ні Тер туг оп сіп Агуд Рго с1у сіп АЇїа Рго Ма! Ге ма! ІІе туг 35 40 45
А5Зр Ар б5ег Ар Аг Рго бег с1у ІЇе Рго А5р Агу Ре 5ег АїЇа 5ег бо 50 55 60
АЗп о бег с1у Азп Тйг Аїа Тийг ге Ттйг ІЇе тиг Агу оТу сім Аїа сі1у 65 70 75 80
Азр сі Аїа Азр Туг Туг Суз сіп маї Тер Азр ч1Їе АЇїа тйг А5р Ні 85 90 95 65 ма! ма! Рпе сіу сіу с1у тТиг Гу5 Геци тиг ма! гГеми Аїа АТа Аїа сІу 100 105 110 5ег сій сіп Гуз Ге Те 5ег си 115 120 2

Claims (11)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб лікування людини, що страждає від персистуючої тромботичної мікроангіопатії (ТМА), пов'язаної з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НЬЕСТ-ТМА), який включає введення суб'єкту композиції, яка містить МА5Р-2-інгібуюче моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, позначувану як послідовність 5ЕО ІЮ МО:67, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, позначувану як послідовність 5ЕО ІЮ МО:70, в дозі щонайменше 4 мг/кг при щонайменше щотижневому введенні протягом періоду щонайменше три тижні, де у зазначеного суб'єкта присутня ТМА, яка персистує, незважаючи на зменшення або скасування введення імуносупресивного засобу, або де у зазначеного суб'єкта присутня ТМА, яка персистує щонайменше 30 днів після трансплантації, при цьому введення поліпшує щонайменше один або більше з наступних клінічних параметрів, що характеризують персистуючу ТМА, пов'язану з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин: (ї) збільшення кількості тромбоцитів (наприклад, щонайменше у два рази, щонайменше у три рази, щонайменше у чотири рази у порівнянні з кількістю тромбоцитів до лікування); (ії) збільшення гаптоглобіну; (ії) зниження лактатдегідрогенази (І ОН) і/або (ім) зниження креатиніну.
2. Спосіб за п. 1, де антитіло або його фрагмент вибирають з групи, яка складається з рекомбінантного антитіла, антитіла, що має знижену ефекторну функцію, химерного антитіла, гуманізованого антитіла і людського антитіла.
З. Спосіб за п. 1, де МА5Р-2-інгібуюче антитіло практично не інгібує класичний шлях.
4. Спосіб за п. 1, де МА5Р-2-інгібуюче антитіло інгібує відкладення СЗО в 90 95 сироватці людини з величиною ІСхо 30 НМ або менше.
5. Спосіб за п. 1, де МАБ5Р-2-інгібуюче антитіло вводять суб'єкту системно.
б. Спосіб за п. 1, який додатково включає ідентифікацію людини, що має персистуючу тромботичну мікроангіопатію (ТМА), пов'язану з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин (НЕСТ-ТМА), до стадії введення суб'єкту композиції, яка включає кількість МАЗР-2- інгібуючого антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, ефективну для інгібування Зо МА5Р-2-залежної активації комплементу.
7. Спосіб за п. 1, де суб'єкта піддавали раніше або піддають на даний момент лікуванню гуманізованим антитілом проти С5 або його антигензв'язувальним фрагментом.
8. Спосіб за п. 1, де кількість тромбоцитів збільшується щонайменше у два рази порівняно з кількістю тромбоцитів до лікування.
9. Спосіб за п. 1, де у суб'єкта є ТМА, яка персистує щонайменше протягом двох тижнів після зменшення або скасування введення імуносупресивного засобу.
10. Спосіб за п. 1, де у суб'єкта є ТМА, яка персистує щонайменше протягом 30 днів після трансплантації.
11. Спосіб за п. 1, де імуносупресивний засіб являє собою інгібітор кальциневрину. ча сЕСЕ-подібний шт вжи я Н М й окланов Кота і й ще Еш ше ШИ же ве я ше о шо на а ши М, У вен ше ни а нн и в НН іч кам і Серин-протеаза се ПН хе ЕЕ
ЯК Же ів аа о се НКР а и В ВОМУ ПІПИМ ОПП ТН я ОК КОВО Ж ОДА Я І МЕНІ ще МИ ин Кия ДОННА о М НК КВ и Я КОН ор вих пе ЕЕ й ве ПОДОЕ ОКО о Ко о ОХ ДК РОДОМ С ОО з Е ї Ї ї їх ен фея СОВ демен ЕСЕ Си о І век. п ин домеам серин«протваи зу кВх зичу же ка ? Е домен 0 домен домени
ФЕК. жд І Не БОМ, ока м а о о муж ек нем ОН СК МЖК ВАШ МК аа ОБО СМ ВИМ ни ЗНО У ХК КІ р в в ХК і МЕМ а т СуВ домен ЕСЕ домен г. яв ПЕВ ЕД ЗДУ т т т тт ВК НЕК М МБ дет по ЕК у во сечею ОКЕК К тщду. МБЯЖ ООЗК Б Же ух і Я як с кож ХЕ ру о НЕМУТАНТ МУ ТА Н 52 КИ палю я й КУ Ж хАЖВІ кн Кк з МІД кА Ух ТУ ! де В сх не їй шаж о вно ВЕ с и С ИЙ ї ' зе шк В Е і і Н ї НЕ: ок Враз Е нн ен нн нн мн нн мом мн нн нн нн З : з ще я а і : ее ке у як ЖК ги Ман АанНМмАИ сь хв може хро її сх ТК ТЕН ТИКМІДИНЕНАЗИ ях ще ще Ко нних х КОНЕТРУЮДЯ ВКО- МЕС ТЕН ВЕЗИСТЕВ МЕ кею Веб ше у Женв ще вику та ВОНО» ракет ек ко слух : І С С і і бом тили вес т В ГУ НАУ М а и СИ о ОН НН У шк ект НОСТІ ДО НЕМЦИНУ совки кАрКщо МО КАСЕТАФО оселетитктночкойх ВВНОГМАЖРЕ КО і МАРКСЕ НЕГАТИВ- но ЖИ і и ЛЯ ВНЕАРУММУК Н ЕК КІ А М еВ МЕ пути канзжіВ МИ ІННИ ЕАК УМ : зе ІМ и МУКАХ МНН ке вена : НОГО ВІДБОРУ ен ПОЗИТИВНОМУ ше ї сонне ду Хоче ух : й ВІДБОРУ ще ше : й й Кв щ СД Б о шк Я вушної веж веб й с НШ : Я НКН МОМ МЯКІ МЖК спеку ї ХВ : її и в дп плУпьтати сам. у КК цу РЕЗУЛЬТАТИ САУЗЕРН. кеди Й МНОгБЕЕХОВМ: і і Хражі ТАКЕ КОЯ прута па . «ІТТ юн ше та її М я М й НО КЗ ОК в Ваш Во щ НАЦ : кпОоНІВ Я, тя ЗОМ КАСЕТИ Я ЗОВНІ НА : єююрююююютюююеттююняю 00 ААУ Н ке ЗК НЕМУТАНТННИ ТЛ Же Н ; ї ПАК ти т вет тт ТТ ТТ ТТ ВТ ТАТУ КТ КАТЕТ тт тететтитьт. : ну и. Зх с. ; Же ЗУБ МИНЩЕНЬ дв Н М ДНТНКИ ВЕСТИ, пн кю юю ВОМ, М Хай З ЕН, Дежій?
: . и х я ЩО неї че Я у ку дк ян ся ПЕРЕДБАЧУВАНОЇ ПОДІЇ рон в нн Удод АНА АН АН А ТТ КАРІ А НОТ ТТ ТОНКОГО ТЕТ осо ото Ап т ТТ КАН КАРТА КААКАКАК но
БІК. З і і і і і і Н які Що она ДН що ї Е покра ї ше ; х о я ІЗ - Ж Е х Ж : х Я ; !
Ж . х х і вик це . ОХ м Я Ку ї ІЗ о ЩЕ: Ес У і Н жи Її р вк. п В ПО Я шк м Н х х : жов : : | Ох жона І х рекет он тонну нео ! х в а Н х ТУ Е що х "ше : х х Н Н ; . Б Б щі ге, нан о Кн І: че їх і ем й Ж, : ді жу в я Е нн нн Зм ав нн зав с с вини Н Н : Н Н Н Н Н ко Й З. Мнннннннннннтннннннкненкннтеенн нотні НН нт пп й з я п ; Ки КУ дя 4 Кк З Юа розведень сироватки
ЖІ. ЕД нн 1 і ї і ї поле ї т же Ши и Е ї ж - Я КІ х х ї ж те : Н ж х Н ; ; з і х х фотках хчнк, Е - : х х | щої ї - 8 ! зх. й речня УЖ оки і Е і Е Е сей В Н З | й х ан ї г х рми уч ЕУ -ж ї у к Еу Б ак З х . Мох : ї х і са і У я і ї У З 1 Е х : з х С і 7 :
і о. есе ї Що Беха, . ож ддв пд Що і КІ ї пня ПАНА йо. п потенжАж кож жджкх. ни а В С ПОВИ «м не Н В Н В ; і ЯТІ М оннннунуннннннонончлекюц опо дкдольтеопоннднлиовогонкнкнолно понос склер роса зок налн нку стану кнпункньн кн днчньнутня й Її г 3 Я ї 5 х Х Ху пихи 5 т кт 0 позвБодень сироватки ее. В тре не | І Зимозан ше | ! шк в, В До рент її С Манан їх и о - В щ п а здо ик МЕ Е ! ше Ш шк к Ж щу ові | МО щ щ Б ШИ дон : п щі п В вх т ПОД . СИ Кк ШЕ ПЕК : де Б щ пе ОО 4 ЩЕ ПВ : ТО г Ав и ШЕ ПИ й і 5 -е і па : ди сени: МИНЕ ВИНИ ВОК Я : Ко й ТТ МО зу. Мм2 у.
жкк. 8с і р ВУХ а и шо в ще конфі» ДЕВІЗ 4 з я гор І ро й іх. й - п - Я ї ск Й дет вх й . І Бі і їв ІРекомбінантний білок) мкг/мл
ВЖЖ. в
Її | інв вк вн в ка ва пок вйй за й і І тку, і би че нн АЙ. контроль га нин и п ВД ! - ! ж. х пек ДТ Сто виснажений : ст ту х вх че ж, . с в по З нн -ке хе ЩО) (То виснажений: й жи : вх х х ї Раш м нн а а а о М г і У х ї як ОХ Е Кн зу ! функ ук унМ, шк С ї Й їх уж. ПИТ, й ї й й що ро: З де М Х СК мух: м счй Н п 5 : й Гн МУ Я Ка Вк Ж Хей З Ку ж о розведень плазми
ФІК. яко й Рава Інпбування ке ій ря Ди ши шее утворення СА» ях : я -- су кор се й ханвеотази Ві Я Бе В чо З т Ве хо с : х Ед ля сгУ В У КІ СБ ОМ и шк їх Повне інпбування у х ТК ях я і Зо
ВО. я, маше : по Ка " я ДК чують у у а УЖ им ту ух НАУ тут учи а МА Х щі КОВІ нм
ФІГ. А аз Зв'язування Бабе ЯТІ з кнативною» МАБР-Я ва Я с і | и нон Ва р Н ен ях їй ння що ке Ї дЕ ак Н У у ДЕ В -е 7 і ЗЕ У ве-е ШИ Я Я Еш кож а в 5 в а 8 шо з я ов шо х гав РН НУ
ЖІ. 85 інгібування розщеплення Ся за допомогою ; т во ке в, РЕ НЯ : о вих. 5 о»
ДО . Юа ОА ВМ Щодо я ОВ й. Со іс в я Е: Е Ши ЛК сер КЯ «ОД жерти ДЕ ут Катрі ил ул дня мли уу у умлалюух ще щі ї хх КВОТ (НМ жІх. «о повацме вимі, ; Ру і о Вяібування позщеплення СЯ за допомагою Я БЖ шк еАБЯ І і ЯМ Бапе і ше - 4 ї шо Е Га е: МОЄ 1 : |: -е В Ще не І : Н ї ї ї що : їощоооужех М ЩО щує їі нах Око ше -000К Тані роко КО БАКІ ї Усик У її КЕ ї ї її : її Н Е сенс х І її: їх 1 ї їх Н : її : ї х-О- : і! НУ її і ОРЕ їі : її : х шо аж МЕ ШЕ ЕЕ ОЗ і Он: т ща ї і її ТІ і ї 3 І ї Ії ЕН ї дк ї НЕ ШЕ НЕ ШЕ ЕН - ам г У ИН ЕІ ОТ. ОБО Ех с УАМ ЗЯ Н ї НЕ Н ї її ї : ті 1 ї век. Н БОБ ШЕУ ШИ НИ ЕН ЕН їх Н НУ 3 Н : хі ї : т М : Я ЕН: КОВОЇ ОБО: зе Б: От кат ЕЕ ЗНМ ПИ НЕ ПИ ЗЕ НН КЕ МУ ї ЕЕ Є УНН ЕНН ЗЕ НЕ ІЕЕ НИХ НЕ ШЕ ї І 11 її ие хі Кок: 11 її ї кі ї 1: К ІЗ ті ті КО: її Ще ІЗ кі ЕМ Є ИН НЕ ЗЕ я ЗИ МИ Я зок НН КН Я МИ і ї т її ї ТЕ т Ж В: зх У сеча, Ку ї Не В Р Ії хі КЕ її 1 її її ї З ех ПИШЕ и З З и ПИ ЕН ХЕ З ЕН ри ще ун ря Мер ринв ту. ен нин нини нини нин ни нн: 3 я ж око ж м хв їв 5 дв що В Ка печчя дагя Евбов проти МАР;
Фхг. а сне Бека сов ССР СЕР Серин-протевза УНН і А Е і в в в-- МАЕ - ВА ї 1 : ІЗ Н вк жк ЗБІЗА п В ПК ї 1 : ї І 1 кахаАК пана аа аа ї Н : КІ 2 В. люки У КІ Кн ка МНН | Е й СО. В нн пн а па ни : Ї : х за. У ї а. трі и І се нин | в- СИВІЕСЕ-подібний Хатки анядактятальтьтитуя посланий їх г. у сек ! - ме СОВИ ЗВ
ЕК. МІ
7 ї х: і ВИК отут я Зв'язування АБО АБ ЯЯ0 19 з поппептидами їй пани 502 ЩУрЯчЧОЇ МАБІ ї мк ми нс он п ль Пи інн кв ї і Н А о дент ре о ши я Я : Менш джу Н шо а ши а дини : ве ов пункт : Я їх нен оо сеснаннй і що дикої М нн дн нн нянь нн Кк кснкккккинкк іа Б о оон сн Н : рій нн рн ВІ МАЯА Н ще їй Бе - пееттрро шк ї ї Ж вк п я ї : г У Я ей шк Н : : Н и он Ї х ще док ї ще па | оо сн рочки НЕО ММАБЛА їз па я кни В і : г Н Оле нн ! Н ї ян Е - - поем ї ва ди Ю нер КК уВЬИ : Мох 1 ще ї Н і | ! Й і г кегитів : Ще рони БОКІВ і Я нн й р Кен -х ав вени наван ов У тот отототтсттстевВ, У ІЗ їх : : : й ве нн нн зон нн мн нн тА АКАКАААААХАХААА АНТ нят, і в М в З М З зо БІВ що щ АВМ СЯ й РАІ Н
ФК. ЗУ ех знов он нн нні нон ! ї ї : ! ї Н 5 ян НН нн чо ї : Н Н : ї с 5 г зе знав ни нн Коса нн вовк нео ооо ден з о ї ї : і Е: | : ше в Я А пед ї Е З Кз Н Я ! і 1 ї Е : й ік Е і 5 Я І: ! і і ке Ку ЕОЗ знання НИМ зни нн фонннекнчннннчнння вені ї Н (у ї 1 ї ї У ї Муожка їх ії їх І ї ї ї ї ї й і Е : : і Н і Е : У Н Н ; Н і і Ї ! і СЕУ здаля ; ; і і ; ння -- м. Ку 5. ел о он не о о ой ой в ооо оо р зна зон кіля ще» же МОЖ З Н й у й З її й ї З і то і і Н ! і : Ї ! і ОО ї Н З З Н : Н ! Н Ух хи м 5. Н ї ц Я : Н Н ї «5 задо зр фенннннніннннжннно рек нан нанннпнаннннаннннннн ення сект ренні Н Н З 1 ! : Ж р | | і і і . «Ф Е Н ; З ! Н Н : Н Ся ї ! : ! ї і Е ! ; є - ї 3 Н й Ке 3 ІЗ о ері фею жжннй Ден тую ук кум мук кн зонжюю юю Я Денненееннннкнтюнютко Гн. Го й І Н І З ї т ІЗ Н ї ї Н Н : ї ї Н В : ї Н Е 3 ї ї Н Н ї ї Н Н З і ї І : ї х Н ї 3 і ї ї Н ї ї і ; Н і Її і : : ї Н ї : Н ї Н Н ї ПЕД фе укутю юну» нин в п ПК В КВ МАРСА (мя МАЯ я З М «В году за тодини 48 годин
ІК. ЗУ
Манн а КК т т і Н Н ї ї і: : ї : че Н І ї ї І І 1 ; ї Н ГЩУ ко нн нн т НН Ж їх Н с в Н ї і ца ож і он нен : дет, У х ї бак Ж Н ї Н зе і ї Н що - : 3 - ДІД яфоооююююкмновй ен З І; З - ОК ї Н Н ї а Н Ї Н Н Е Н ие Н і Н 8 І х ї й ї ї ї о. ї ск Я З ЗА Ці Я З Ї екон нні чн нн т НН КК КН НН М ДК днк схемі рес Ї ен З Я ее Я Е Н ї м ща Н Е Н ! п сі ї ї Н Я 5 Н ї Н Н ж ЕЕ як Е їх ї Н ЩЕ - Е ЕТ дж ЕК: СОКУ КУА ге КА А Док кюнк юки Е -Е з ї : й, -ож х І ї р Н ї : З Н ї : і я Н : Н і ї к х : Н ; і З ще і ї : ї це і і і і - Я Н ї ії гу : 3 ї ЗДУ доки юсунмх Міджжеюєювюютю м вою тори дреметіюютюєюютюююююю вин Козак ; З Ї ї І ї ї І ї Н ї і Її Н : ї Н ї Н ї ї І ї У ся х ї ї х х І ї ї х Її 3 ї ї ж Її З їх ї х ї З х 3 ї ! ї Н Ж З ї 2 ох Е х І ї Др; пику ку УК КУ У УК УК У КАХ КАВА КАК АТАКА АКА ТАТА КАТА Зх у кА АКА КАНА МАУ ААУ АК чи в/в МмаАяР-а х й «5 з КЗ вен нн нм нн мно ВЗ і: і: і: : ї ! І 3 ХО яке жи Же н юн ю теки кА ЖАЖН ЮК ж КК жи КН КАЖЖЖ тя жи жк нік жжжикя охжкжжжжкн о що ЩВея сесютнх сонкжккнюн хджкжяння чу как КАХ ЖеКАААЛАМАА жання х сккжкжкння, є М і ще Е і ї : -- ї ен ам 3 ї І 1 - Е і : є сехкк Е ї Я ДАЯХ 7 Я й |: ї а сх Н Н Н с і Н Ж- Н і ї У Ж ! і : «ши У Н Н ЖК соч т. ві - є Ву пвннчнннннннннннно нан нн нн нн нн а Кеше | ї : ї о і ї : Н оеЯ і Н І: «й Е Н ї І с : М : ї У Н ї : ї Н Н ї з 1 с 4. і : Е 3 МЕ ДЕ я суккюююююкнкккнй іонна нан ее і і : : Же Н : І ЩІ : Е : І з : : з Ящи : і ї СУ 4 і ! / «5 З Ак нику Думу Ану НУ УТ У У У У КУ КУ У У М М уки Ка 7 З ї о Н І : ї їй Я НІ ж Н : Е 3 : х к М ї х я ї ї х 1 І ї х У ї і Е: хе ЧИ 5 ї ее КІ лдкотючьн ее в п о в оз ї І М ї ї 1 уми жи жі ї ; і 1 Е; Н І ї ц І 1 1 х : х : НІ ї ї ї - А і 1 Н Фр ебннююєюєкте тк стю ніяк кєтю тк кн дяки я я як учи як кА пут п я ту ну и т із вадяр-я І. х ЖЕ ; Х
- ЗВО преп тесеткетннсіуосесооссросксотероккстотоетоітстн і іноссот се інеті есте яння и ї : : не і жллкникєюиннтннифнжекєюююнтюкюткя, і ї ї сх. КК ннжкнккккнннткюєккюккккюкн евнинавивновтни сек жк важка ВАК КААААКЯ х -х во КОЯ МЕМ | і ше й : й Н 5 КЕ їх зом е нина -- жк хх юююююнн ї зкекккккаккюююююювкживжи скжжжку ї х Ї і Н 3 с шк пренюнменн фотессоюткі діт ннккнпенюю стен лінія туя 2 ЖЖ я нин фев ічедтчччте нічне ченнннскннкни рення З СКУ пннннняяяяячяютююьяя вн а сечу яю тю яти роз тт жд З З ї Н КЕН пи знана а пк кокони Енненаннн І ї і ї ; п ; : і мага ячтіча я Ма ВК 4 В : і
«х. ! : -«ж-необроблена сх ; Кк НА НИ є ! Я «чкивам антагоніст МА Я ї х А се хе «и - й х СУК оброблена кас й ї ку ох й --Е : т 1 Б 5 Її б М хі Б ; ся ми і с т і Я г -к і Й о п й Мане днини ЦУ Кеш и а сан нн ЗИ З а мо шою я з ю Часіхв)
Фіт. 358 щ. ОК ТЕ т дО Н : Є ред : я ж с 4 і 5 ОО я е : З ! се» ВАДУ Ех 5 БЮ ян. ш н ря щ МОЗ А ОЇ Е я ! : рез Е і пи пос ВИ зни ж же З її її З ще що в Час іїха)
Фк. Зх
(в що 3 сте ВМ Х ВЕ ЗОМ АТЯ що нон й Кеся Ж ї ся ШЕ в) хх «КУ Ко ; | ен заннй ще : я -й | пом Но че йо и ОД на Б день пісня трансплантації жЕк. З ЕВЕК Ї ще ти шу : ща 5 Е « хо Її ще -- 0 МАДРОАЄ ж Я і земне МАРІЯ» п Що Ук р ща ї як що | . Я ї зво - 5 4 м а а а я зв Кен и НКУ 10» це І п нн ня Іо З й і ЕЗ і Іа за Днів пісня СЯ
Ід. їв вт -к ве нн В ке : Її і Пи я : З нт п и ши с нн З МАО МАРІО. види хай ле» о о ЩЕ ї х МОХ Ж з - раза аа ана анна аа на а о нн шо нини з пе ве | і ШЕ ща ї : в Торамуеіекиннненкюнккксахннсний МОКІЯ «ЖЕ ї п нан п ка а і Кі є. Я 5 й Днів після інфікування теж Мамутантні яе- МАБРАЯХ» фищЕ зе С виші Мчві
ФІ. ха що я рей ї Ж ве Є вх аа ще тої 5 о Шо: жо о щи ОА я сш я Ох я с ШЕ ШИШе ШИ Я В є ро КОЖ ОВ і б і : ЩЕ Б Я зби її Ї і: ооо сема п ще росою 2100 ЗИМОВЕ 0 БОНТЮЛЬНОГО бай ОБ Труди ис ВирИ вла проти : ТЯ МАВ БОКУ кн ні вне на ни нн мірний нн ня за нні на нні пан зн нн конк «М Ж 2 а ВО я НюЮ З За 350 ЗАЙ Час -піспя тідшкиного дозування Година) ФЕК: хі щрож є В В т -Е і : Б Я Кей ОН ШЕ й кі 3 і Канни нах У Ж а ж б зх за 35 3 Ох Час після внутовоньовенного дозування (днів
ХК. Ех ще ве ЗЖКе рн и по а Е М ' Н Н Н Е т Й ї ї Ка М : рнлалнно нянні Ж и ЕЕ ШУ і УНН су Е Н ! ПИ щ : Н Е ЕК ре : : Н і ОО ЕЕ ХИККЕ ; і ОО НИ: Е АВ хо Н ; і ООН ї Н ОО Як і ! ПЕС - ке І і КЕ с АХКАА ї і о ду І ; ЕК Е Н Н КК звана З Н ! КМ и ту Я : : ! Пе я їх МИМ : З ОН СО ето В Н ї ї Ду ПЕТ : х ї ТЖУ КИ ШИ Я ! ї і ен з ї ча Н Н Коен ща І ОУН Коси : І 1 КИ КО І ї ї ЕЕ УК ом у і Н Н ори Кт ин нн нн А КИ. із: М: З уче ев Кк що вОтипне Ол ан І мен КОНЮ льне аНІВТНО
Яхж. 55 З род ня Я ми ї . ї ! Доза ОВ КУС ПОД мки 3 " І і : Я ох мання нини мн вними нн Ще окр; юхкафйоюх МА р й і Кі -Е І бл. ся ж су я х - ДО рентні планка АЖААККК ЖЖ кю ЖЖ АЖЖЖААААЖАКН «Е КУТ нс з ні 3 : Н ; ж з СеВі В Рі що ! рен Мемутантний тип С57В о Ж ! Я і о Он Ї в пн нон, я | і Тк Н ; І Же | у ж Орфея чинни но о вико 5 їі 5 ! у Кк хі І ; І ся 1 ІЗ х х х Н К х Е нн нн и нн и ння В КЕ я КЗ БВ 5 БО т 5 Я й кгням Час годині
ЗІР. 2аА
КУС менінгокока, визначені у різні моменти часу в крові немутантних мишей МАБР-Є» мишей піспя інфікування за допомогою як 06 КУЄ менінтокока ЛОЮ мкл ! ази я ; де ї я 3 ин чна Тато і Кк ще типу Ї і ху. ях і сні: МАБР-2Ї. им : в Шен Як МИ Кк Н ще їй кон Бо м с і ж х Й. п т : рей 7 І: У ! 3 ся х, ІЗ в » фен м тк 4 - (й Н у. З 1 Н ще ; ке Ех -Щ. - х Н Н 3 і дж пхажлих й : ва х х ож ул Й н і Ї о с І но жд ча а 5 м їв за за Зк є Зк ве о руч т Час один)
Фтг. 24Б 155 руту поповнено і для у Р Згуй ї ; Доза зх В КУС ЛОЮ мкл ЕЕ чин дниннлнлнлллшєшжшшєнинннннни тп ща Се 24-22 вт бе Н 3 де 430 рент У А у кухню мттнукнен і І НУ Кок М ММ Н ой нн в НН - : Її й о ВУЖ Н НЕ: оя-яее Мемутантного типу СЗИВІВ а та 2 ЗВ ча 5 ща в я Час (годині
ФІ. ЗА
КУЄ менінгокока, визначені у різні моменти часу в крові немутантних СУ О мишей після інфікування за допомогою ах 199 КУЄ мецнінокока ГО вки 3 р КК КК о тт ПУЕ тет нн з. - я-ке- 0 немутантного типу з я ов | | дек ї- Ї | я я ч ве пана чин і з і» оо ооо пфекчлкаккч кання а з за Зк за за Часігодин)
ФІГ. Вч КУЄ менінгокока, визначені у різні моменти часу в крові МА5Р-З накаутних мишей піспя інфікування ха допомогою Зх 10 КУС манінгокока / 100 мМки : З ни 34 Й | вен ВАД Я Я ; У і І од І ; дрон - "не фено Дососюсюєсоо ффоосюємнкюсоой фун нлинннаанянрннннннананянндн нн рилнкннн лання й з а ж В зо 12 Часігодині
ЕК. 85
1 я Класичний ря 2783 шлях й щу Же / п ш їй во оо Й ай Ш- й кВ НЕ НН З т Е зн її З Концентрація сироватки 15оі : Альтернативний ще 24 шляхи ж | ; їх ї5 щі їх ує сен З у ї ВО п й | і : вх шк лин і, МН ї 1 Концентрація сироватки
ФІГ. ха
ААВОГ ІМЕ
КО. ! КК ЕЙ жоая т ЩЕ ШЕ пн і нн; ОО кщтА п нан. -е ши М Са як. 37 пен Ж с-я-- о намутантного типу чо - с» Ве Ж Я Я щи З я ШИ и ШИ ох - с жи ше: ШЕ Є Ав сні» НеМУТаНТНОГО ТИПУ сення ОА ДЕФІЧИТНА суден СИ дефівитна с манані і Мива х Ф Ї Ку Х ше : Ж, Ж о ОЙ ще . Шк І з Боня м; ї Концентрація плазми Сх ФІЕЖ. ХВ. дення МЕМУугаНТНОВО ТНПУ залюкнкфсфкксккє МДУ ку» зе БеДЕФЩИТНА ЗБя ож Мища в ї- Сх т З : вл чЕ Же і: З Ж ше Ж шен ї; 2. ок й ска ав м Як їх. Ї з Я Б сб дну де онн що я ї рок бери КУ тр кивок пл і з о ІЗ ї АВ НМ
ФІЖ. ХВ пня НЕМУТаМНТКОМО ТИНУ нсеярно» Са дефіцитна соня» ІЙ дефіцитна Семанані) Пюдина ; Я о гВ. У5 й г г що ї а Я со с в Ме се СУК х 2 ВоБ. я ше ро) ЕД сни Коен они їх ї т я й Яя в я і м и "я в ї Концентрація плазми С)
ФЕР. ЖВЄ ее Немутентного типу шхкеяуєтяня З ДОфФИТНа Ки Пеодина ж В Ж т А киш х Е І чех ках 7 й і; « - 5 -. т- че | х ее чу о Щк г винні: шкі жит і ик: ВИ ЕД і 1 НЕ. АВМ зжЕ. ЩО ноя їжі Ж - КЕ Лектиновий флях С Обл, її В ав що Кизонаний шлях що, за: ЗЕ ВШ З БЕ ех Тезе ; нини ШЕ ше В аа ще. ки ш щі й ш ш З ми Й як НИ ШК ба Е ше ше ше ен и Я: с й я ж Ж ке (: 5 ше ще ше ше Й хх КУ ЕЗ На З Ж зх. ЗА 4 дк со немУТанти ти й Її яке хе й; сжкжуфклнннях. ЗК ТЯ ТНЕО ТКУ ХЕ А дні о Ж й зй ди кий селен КІ Й Око во Її Я ни ся І; ї шив х І В аву й сл зеенйюняке ВЕ хі я ож Ку рн й й у св снеднн сееефдннсе 0 ВАВ «фе в ща ща ва меоіхв
Іг. яв Активація С3 за допомогою тромбінових субстратів
7. : В - у х ше бе ШЕ ше ше ни І - Ж» Е. 2 о щ ах. Кз» Ех КК» я -- що 5 (Я ШЕУ ; ща енон пнн пнн ннн оннн ща о: ОО я . ЕК ОН А В щи ню с ОК си и ШО М ж ВД МО ОО В о М НН : Х ши НН . З о ї родукт путолітичного . с ох, розщеплення, ЛО КДа вла С КОТУ УНН, Ов о В в, в В ООН КЕ УК НН НН НН НН НЯ . ОК и НК че с Є "о х Сх ПОНКМХ ЗХ ТшК ПП снах ОК Ки С по З Продукт вутолітичного с . що розщеплення, 45 Да у нен КОХАВ ВО еВ ВАВ ВВ ВІКО Еш ши и НЕ М НИ
ІК. За
ОО ВЕМутантнога те ОКО МУР гу» Ї вісник ту ; І Ше ея І Відкладення СЗ на манані сх ; ЕІ
5.5 плн - дит Й Ех У. : ї си юр спечччечеттччдин на се ва дог ор І ї й Шен і і Ех пн зн змі нин нн ех. І Ж с ї щ щі а ше : о й й пимннн син: НИ нн й ж я нини х шо зни ння: Ух Е шк і с І ї й й |! «туї Хе а Е СКЗ Кк во ЧИ се Е КЖЯКо ик ж и о кН В п шк со й ре і ді ца с Я дк уко Н З Я я леж соку я о Кн В У ТК дннлнчний Кок МИ о 30 З як во 0 5 86 о її Ху Час (хв!
Фїг. З
Крива виживаності для опромінення 7.0 Грей ДЕНО Я оон худ посух кю ту : Со що Хор З пнокінннти нн СО м в пре кан Ж Мих хх хюкоктю ян ххх кю жк чн Ії Ов Ії і В 7 | Ж дежавю вежу кжжж ж ж ук крики ккж : щ Змінна Ше ! Б ен Контроль ПАБ в Кене Доза до опіхнвінання пдшаМ ВоО0вурДе повна де нен ОСИ АВАНИ «икооНо післячиАиВ о я Не в - ож День після опромінення
ХК. еВ. Крива виживаності для опромінення 5.50 Грай Ге щи ие де хлдждюнх сення ях хддАжед. дж
Ж. ЩО Хжхуюювдкюююю є юку хчюююєююкик ї Ко ше пн м поп опи 500імінна ш ВО яв Контроль але ої ж Ес Доза до опромінення пащі ї оре До післячиАВМ ; ї а Я доня я ПіриввАнНи ше щем озна іні пов ііі Здінй іні нік інв з інінніннін і сін я х 3 т шк ХЕ що День пісня зпромічення
ЕЕ. ЗЕ Виживання після інфікування менмінгококом серологічної групи А ХО481 Ве зв: нн осн інн нів нананнвнни коні ВЕУ КУ ле ши вето "МАВ Ж 3 щ і що й я | Вежі тою мин нят як он ня ВИДІННЯ фнемутантного типу! м 5 ве : 7 щі ща Я ще В КУ рез КІзї яв ща ку Мас (годині «ре:
ЖЕК. ЗУ
- ке мдара я зейне вав М (номутантного типу) КЕ нн ЗБ З те щ | | ! ді ся ї ; ; во м 4 З Х па які З 3 ве ся | тео ій ЕІ пе ренні нткнннк нки рун фена й У а в яв ща та Час після інфікування (година)
ук. 35 - й в Я ш шрРш хе й ї ЖИ Шк ШЕ ЕЕ НЕ й З ге | ші шшІ ШЕ ше сни ши ш ши: -е Ши щк ші ши шщЕ ши щі шщ ся и КЕ фе: ЩЕ 5 їх З ВЕ : З В З і 3 | а ЕЕ Е рик инші шиші ши ши ще їй «Ко в. СНИ ши шин х ин сей У с: З ше й ї . КЕ в 5 Час після інфікування (година) МАР ШО мав"
ФІ. З ж Ух ге. ! Бк ще ї я Ж аю Ех се є і і «й рі : Я ще зни роя. ка Ух ї ж: ж В ї не Як що 07 З ЩЕ З що я . З щі ш З жк ШЕ: з що : ШЕ ШЕ: м її ! ї З ШЕ с шк іже 0 ії - Ф Пооребе В х І б вав я о : і і З Ва ЕЕ оон НО кіна ях: Ко нн В НН зн и КК ВК ж УК О з 5 1 за Час після Інфікування (година) Е зва мав ща а
ЖЕК. ЗЕ Інпбуюче Ав проти Й кофе х а зоб жених ї Аг ч МАР Контрольне ізотипне АБ Ба про пев і ижжнн А лк кквочкчк ду ж дж кафе А НК АНК КК Ж МОЖ диню Й ! ва Е са : : я до ; оче шо БО Я Ї їх Я с ка і сх де ЩЕ лен С ї ЕЕ се ненні он фуннннннанн фун ув норнтнннннні й в во за яв 5 т Час після інфікування (година)
ФК. 37 ще Ше и с виник «ве А (МАО ЖАВ проти МАЗР-Я) ! : Зк жи х ще . й с х є - БО «а В МАО КІЗОТИПНОе КОНТрольне Ав) ши ше и й «а МВ. людська сироватка) Сваокя ї- су че Е (Термоїнактивована МН) ж в Й ЕЕ нин а и і нин нн НН : Мас інкубації хв) ФЕК: В КУЯУ ч ска "Я сироватку кОСОННВЄЯАЯ жо. ВІМАШа І ЩЕ НН ї ІЗ м ї саше: КЗ - ясний ЖЖ м т ан І ї ХМ М В ее 7 ї ко ж Сея Е . й: -й ет й Ше Ше ек че Свв оф Я | Яр ще Ше жа | с, Ман ї окоту Я а Ек ЗМ З С ВИЙ ВИМ С В ЗЕ ЕК Час іхвипини)
ХК. я
Гемоліз покритих маненом мившачих вритроцитв ри вилив сироватки людини а ; є з нн Е | и и дк У о і : щи як Гук я ВЕ жав ак 7, з В їх : с Я ха Ка ту ї о ще: Ой -- я жі Ж ж п шо и З в ІСироватка!
ЕК. 45 Гемоліз еритроцитів немутантних мищей при впливі сироватки людини МБ дебсбепі- /МВІ. дефіцитна зав ЩЕ й що «а: МА. дефіцитна ЕЕ і в г чо Щі Я Е з й Ж «ее МО ї я Ж ш а КЗ Ж Ж ще, й Кі Кі 00 Ди їз ї кН «й Ге КГ. й з дв й Кк й сккнксксо пе он ші 3 Бе іСироватка) бе ФХКЕ.
Гемоліз еритроцитів ССЮМОВУ. мишей лви вилив Сироватки людини г з дк й и Я В риестурня мм рек ї ДУ : Е | і і «зам вна о | а 4 / «ах МБ. ДеЦцИТНа - ї з пе У СІК м ж же ї Сай 3 Х З М - Я рей НЯ кі Пк зе Я дення дооте ! . х за ІСнвроватка
ФЕЖ. Я Групи, піддані опрожіненню 2 рей, виживаність Ко Ек воксве ть сх Зник вно нн на сіння няння ххх учккук ух уки ит ут еут ттАА ТТ тКААн ЩЕ | х з фея пеня пня ОН : ї і 5 Я ІЗ х роб х х х ї у нн й вк З що а З вен ж КУ п нини кон в а Я х фон ннцж ху хна акннантятя нетто рндфафнфнфонфефаіннь їх нн ни а хт1іРБ ЗАЗ ЗІХВІВОКВИВИТНІКВИХВНІНЕКИВІЮ вена» чоках
ІК. 4
Час до виникнення мікросудинної окпюзії після інекції МР (модель Шварумана) з як В ох ще а : сей | ! знйвон НЕМУТаНТНОГО ТИПУ й в 23 . х ее МАН» КО В ОХ МОНА ЕН ях КК ХЯ щі гі з 48 що Мас іїхві зі. 44 Виживання при ЗТХЯ.РБ індукованому НИЗ а Є нн нн панни - ЗУ р нн Винннинннннннннн нн З ї З
І. СЕ пен нн нн нн - роеефезіНвобробпена контрольна трупа У зв оброблена за допомогою антитіла проти МАБР-? група ТК КУ я і. Ом В зо жо зо що Бе Час (година)
ІК. 45
ПАБНВ Інобує тромбсутворення в вкспериментальни модельна мишах тромібютичної мікроанлопатії, індукованої за допомогою ЕТО -декстран й 100 «ак КОНТрОПЬ е в-е «вн плаАВНе Ж во ! І БЕ вв | щ зе С У З ве - : К і Б ; Е: КО Ку З ; . ї
ЕВ. мине» нні нн ; і 20 40 що Чає їхві
ФК. 46 Обробка за допомогою Те не . в ГА ва ! не сь сх ще че Ку Ку ко фік. 47
UAA201806416A 2015-11-09 2016-11-09 Спосіб лікування стану, пов'язаного з masp-2-залежною активацією комплементу UA124094C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562252814P 2015-11-09 2015-11-09
US201662406726P 2016-10-11 2016-10-11
PCT/US2016/061113 WO2017083371A1 (en) 2015-11-09 2016-11-09 Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124094C2 true UA124094C2 (uk) 2021-07-21

Family

ID=58691444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201806416A UA124094C2 (uk) 2015-11-09 2016-11-09 Спосіб лікування стану, пов'язаного з masp-2-залежною активацією комплементу

Country Status (20)

Country Link
US (2) US20170137537A1 (uk)
EP (1) EP3373963A4 (uk)
JP (2) JP6814802B2 (uk)
KR (2) KR102432062B1 (uk)
CN (2) CN108472347B (uk)
AU (2) AU2016354117B2 (uk)
BR (1) BR112018009311A8 (uk)
CA (1) CA3004753C (uk)
CL (1) CL2018001258A1 (uk)
EA (1) EA201891132A1 (uk)
GE (2) GEP20247583B (uk)
IL (2) IL295200A (uk)
MD (1) MD4685C1 (uk)
MX (2) MX2018005165A (uk)
MY (1) MY197758A (uk)
NZ (1) NZ742987A (uk)
PH (1) PH12018501009A1 (uk)
SG (2) SG10202011469UA (uk)
UA (1) UA124094C2 (uk)
WO (1) WO2017083371A1 (uk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3287142B1 (en) 2011-04-08 2021-08-04 University Of Leicester Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation
EP3057993B1 (en) 2013-10-17 2020-08-12 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation
CA3029600A1 (en) * 2016-07-06 2018-01-11 Microoptx Inc. Glaucoma treatment devices and methods
JOP20170170B1 (ar) 2016-08-31 2022-09-15 Omeros Corp صيغ لجسم مضاد تثبيطية لـ masp-2 بتركيز عالي ولزوجة منخفضة وأطقم، وطرق
TWI818919B (zh) * 2017-08-15 2023-10-21 美商歐米諾斯公司 用於治療和／ 或預防與造血幹細胞移植有關的移植物抗宿主病和／ 或瀰漫性肺泡出血和／ 或靜脈閉塞性病的方法
CN111278863A (zh) * 2017-08-25 2020-06-12 奥默罗斯公司 高浓缩低粘度masp-2抑制性抗体制剂、试剂盒和治疗患有非典型溶血综合征的受试者的方法
BR112020025841A2 (pt) * 2018-06-22 2021-03-23 Omeros Corporation método para prevenir, reduzir e/ou tratar uma doença, distúrbio ou condição associada à ativação induzida por fibrina do sistema complemento e à ativação associada dos sistemas de coagulação e/ou contato
WO2021113682A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Omeros Corporation Masp-2 inhibitors and methods of use
CA3159167A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Neil S. Cutshall Masp-2 inhibitors and methods of use
JP2023504541A (ja) 2019-12-04 2023-02-03 オメロス コーポレーション Ｍａｓｐ－２阻害剤および使用方法
CN115052604A (zh) 2019-12-04 2022-09-13 奥默罗斯公司 Masp-2抑制剂和使用方法
WO2023108028A2 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Omeros Corporation Therapeutic antibodies that bind to the serine protease domain of masp-2 and uses thereof
WO2024118840A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Omeros Corporation Fused pyrimidines as masp-2 inhibitors

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4394370A (en) 1981-09-21 1983-07-19 Jefferies Steven R Bone graft material for osseous defects and method of making same
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4526909A (en) 1984-01-09 1985-07-02 Regents Of The University Of California Polymethylmethacrylate delivery system for bone morphogenetic protein
US4563489A (en) 1984-02-10 1986-01-07 University Of California Biodegradable organic polymer delivery system for bone morphogenetic protein
JPH0662679B2 (ja) 1985-06-21 1994-08-17 新田ゼラチン株式会社 組織親和性コラ−ゲンとその製法
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
AU632993B2 (en) 1987-12-15 1993-01-21 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8822492D0 (en) 1988-09-24 1988-10-26 Considine J Apparatus for removing tumours from hollow organs of body
US5211657A (en) 1988-11-07 1993-05-18 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Laminin a chain deduced amino acid sequence, expression vectors and active synthetic peptides
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
DE69030172T2 (de) 1990-01-26 1997-06-19 Immunomedics Inc Impfstoffe gegen Krebs und Infektionskrankheiten
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
US5789573A (en) 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5856121A (en) 1994-02-24 1999-01-05 Case Western Reserve University Growth arrest homebox gene
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
JPH10510540A (ja) 1994-12-12 1998-10-13 オメロス メディカル システムズ，インコーポレーテッド 灌注用溶液並びに疼痛、炎症及びけいれんの抑制法
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
CA2689694A1 (en) 1999-07-21 2001-02-01 Omeros Corporation Solutions and methods for inhibition of pain, inflammation and cartilage degradation
WO2001012212A1 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Inhibitors of the lectin complement pathway (lcp) and their use
US6649592B1 (en) 2000-01-14 2003-11-18 Science & Technology Corporation @ Unm Peptide inhibitors of LFA-1/ICAM-1 interaction
SG98393A1 (en) 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
CN1697647A (zh) 2002-02-01 2005-11-16 奥默罗斯公司 用于抑制疼痛,炎症和软骨退化的溶液及方法
US7297348B2 (en) 2002-07-19 2007-11-20 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefore, and hydrogels and biomaterials made there from
US20130266559A1 (en) 2004-06-10 2013-10-10 University Of Leicester Methods for Treating Conditions Associated with MASP-2 Dependent Complement Activation
US7919094B2 (en) 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
EP3287142B1 (en) * 2011-04-08 2021-08-04 University Of Leicester Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation
US20150166676A1 (en) * 2011-04-08 2015-06-18 Omeros Corporation Methods for Treating Conditions Associated with MASP-2 Dependent Complement Activation
CA3131223C (en) 2011-05-04 2024-01-30 Omeros Corporation Compositions for inhibiting masp-2 dependent complement activation
ES2864857T3 (es) * 2012-06-18 2021-10-14 Omeros Corp Composiciones y métodos para la inhibición de MASP-1 y/o MASP-2 y/o MASP-3 para el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos
WO2014066744A2 (en) 2012-10-25 2014-05-01 True North Therapeutics, Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
CA2921856A1 (en) * 2013-09-16 2015-03-19 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods for treatment of hsct-associated thrombotic microangiopathy
EP3057993B1 (en) * 2013-10-17 2020-08-12 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation
KR102011118B1 (ko) * 2018-04-13 2019-08-14 김정범 개선된 스냅 단추

Also Published As

Publication number Publication date
IL259225A (en) 2018-07-31
SG10202011469UA (en) 2020-12-30
NZ742987A (en) 2019-12-20
BR112018009311A2 (pt) 2018-11-06
BR112018009311A8 (pt) 2019-02-26
MD4685C1 (ro) 2020-12-31
MD20180042A2 (ro) 2018-09-30
EP3373963A4 (en) 2019-07-10
EP3373963A1 (en) 2018-09-19
AU2020201500A1 (en) 2020-03-19
CN108472347A (zh) 2018-08-31
CL2018001258A1 (es) 2018-10-12
IL295200A (en) 2022-10-01
US20210047433A1 (en) 2021-02-18
MX2023001193A (es) 2023-08-11
KR102277166B1 (ko) 2021-07-15
MY197758A (en) 2023-07-13
US11981749B2 (en) 2024-05-14
JP6814802B2 (ja) 2021-01-20
SG11201803834UA (en) 2018-06-28
KR20210090283A (ko) 2021-07-19
CN108472347B (zh) 2023-09-05
CN117398458A (zh) 2024-01-16
CA3004753A1 (en) 2017-05-18
KR102432062B1 (ko) 2022-08-12
KR20180074789A (ko) 2018-07-03
MX2018005165A (es) 2020-11-11
EA201891132A1 (ru) 2018-10-31
CA3004753C (en) 2023-02-28
AU2016354117B2 (en) 2019-11-28
PH12018501009A1 (en) 2019-01-28
IL259225B (en) 2022-09-01
US20170137537A1 (en) 2017-05-18
WO2017083371A1 (en) 2017-05-18
JP2018533592A (ja) 2018-11-15
GEP20237574B (en) 2023-12-25
JP2021063093A (ja) 2021-04-22
AU2016354117A1 (en) 2018-05-10
MD4685B1 (ro) 2020-03-31
GEP20247583B (en) 2024-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124094C2 (uk) Спосіб лікування стану, пов'язаного з masp-2-залежною активацією комплементу
JP6893539B2 (ja) Ｍａｓｐ−２依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法
US20220002439A1 (en) Methods for Treating Conditions Associated with MASP-2 Dependent Complement Activation
TWI818919B (zh) 用於治療和／ 或預防與造血幹細胞移植有關的移植物抗宿主病和／ 或瀰漫性肺泡出血和／ 或靜脈閉塞性病的方法
JP2020037568A (ja) Ｍａｓｐ−２依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法
AU2018200437B2 (en) Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
AU2017276333B2 (en) Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
EA042534B1 (ru) Способы лечения состояний, связанных с masp-2 зависимой активацией комплемента