DE69030172T2

DE69030172T2 - Impfstoffe gegen Krebs und Infektionskrankheiten

Info

Publication number: DE69030172T2
Application number: DE69030172T
Authority: DE
Inventors: David M Goldenberg; Hans J Hansen
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1990-12-28
Publication date: 1997-06-19
Anticipated expiration: 2010-12-29
Also published as: ATE149841T1; WO1991011465A1; IE910265A1; JP2919071B2; US6440416B1; IL96893A0; JPH10510509A; EP0438803A3; SG46445A1; US20020192227A1; CA2033640A1; EP0438803B1; ZA91559B; EP0438803A2; DE69030172D1; AU7158191A; IL96893A; AU641470B2; CA2033640C

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stimulation einer Immunantwort gegen maligne Zellen, pathogene Mikroorganismen, Parasiten oder Viren bei einem Patienten unter Verwendung eines "Pseudoantigen"- Anti-Idiotyp-Antikörpers von Primaten, der als eine immunogene Imitation eines Antigens wirkt, das von einer malignen Zelle, einem pathogenen Mikroorganismus, einem Parasiten oder Virus erzeugt wird oder mit diesem assoziiert ist. Eine Vakzine unter Verwendung eines derartigen Anti-Idiotyp- Antikörpers wird in dem vorgenannten Verfahren verwendet.
Eines der Hauptforschungsziele bei der Therapie von Krebs, mikrobiellen oder parasitären Infektionen ist es, das Immunsystem des Patienten anzuregen, aktiv auf die Vermehrung des Tumors oder des infektiösen Agens zu antworten. Bestimmte Pathologien, insbesondere Krebs und Virusinfektionen, scheinen gegen das Immunsystem resistent zu sein, weil sie Charakteristika aufweisen, die zu einer Toleranz durch den Wirt führen oder die die Fähigkeit des Immunsystems des Wirts, diese zu bekämpfen, ausschalten.
EP-A-141 783 (The Wistar Institute) betrifft eine Zusammensetzung zum Induzieren einer Immunantwort gegen einen Tumor oder einen Virus, die Anti-Idiotyp-Antikörper umfaßt, die ein Epitop erkennen, das das Paratop eines Anti-Tumor- oder Anti-Virus-Antikörpers ist. Der verwendete Anti- Idiotyp-Antikörper kann in bezug auf den Wirt homolog oder heterolog sein. Während ein menschlicher Antikörper bevorzugt ist, wenn das zu behandelnde Subjekt ein Mensch ist, können auch heterologe Antikörper verwendet werden (z.B. Maus, Ratte, Ziege, Kaninchen, etc.). Antikörper mit Pavian- Herkunft werden jedoch in diesem Dokument nicht erwähnt.
EP-A-325 847 (IDEC, INC.) beschreibt ein Verfahren zur Selektion von Anti-Idiotyp-Antikörpern und deren Verwendung in der Diagnostik, dem Monitoring und der Behandlung von Krankheiten, z.B. Krebs, infektiösen Krankheiten oder Autoimmunkrankheiten, Allergie oder Transplantationsabstoßungsreaktionen.
Austin et al., Immunology, 67:525-530, 1989, berichten über einen menschlichen monoklonalen Anti-Idiotyp-Antikörper, der mit der Bindungsstelle des monoklonalen Maus-Antitumor-Antikörpers 791T/36 reagiert und als solcher vermutlich ein Kandidat für eine anti-idiotypische Immunisierung von Krebspatienten ist.
Bosslet et al., Behring Inst. Mitt., 82:193-196, 1988, betrifft menschliche monoklonale Anti-Idiotyp-Antikörper als eine Epitop-Vakzine gegen Pankreaskarzinom.
Die Verabreichung von Anti-Idiotyp-Antikörpern stellt einen der am vielversprechendsten Ansätze dar, um die Selbst-Toleranz gegen Tumor- Antigene zu durchbrechen. Anti-Idiotyp-Antikörper (Ab2 genannt) sind Antikörper, die gegen die variable Region (Antigen-Bindungsstelle) eines anderen Antikörpers (Ab1), den Idiotyp, gerichtet sind, und einige dieser Ab2s (genannt Ab2β) können die dreidimensionale Struktur des Antigens imitieren, das durch den Ab1 erkannt wird. Die Immunisierung mit Ab2β- Antikörpern wiederum kann Ab3-Antikörper mit Spezifitäten induzieren, die denen der ursprünglichen Ab1-Antikörper ähneln (derartige Ab3-Antikörper werden Ab1' genannt).
In einer Vielzahl von experimentellen Systemen sind Ab2βs in der Lage gewesen, spezifische Immunantworten anstelle des ursprünglichen Antigens zu induzieren. Siehe z.B., Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2864-2867, 1984; Kennedy et al., Science (Wash., DC), 223:930-931, 1984; McNamara et al., Science (Wash., DC), 226:1325-1326, 1984; Grzych et al., Nature (Lond.), 316:74-76, 1985; Raychaudhuri et al., J. Immunol., 139:271-278, 1987; Durin et al., Immunology, 60:181-186, 1987; Bhattacharya-Chatterjee et al., J. Immunol., 139:1354-1360, 1987; Viale et al., J. Immunol., 139:4250-4255, 1987; Smorodinsky et al., Eur. J. Immunol., 18:1713-1718; Kresina et al., J. Clin. Invest., 83:912-920, 1989; und Powell et al., J. Immunol., 142:1318-1324, 1989.
Es sind verschiedene Ansätze unter Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Ab2-Antikörpern für die Therapie beim Menschen vorgeschlagen worden, aber alle verwenden Immunglobuline von fremden Spezies, z.B. von der Maus oder Ziege, als Immunogene. Siehe, z.B. Herlyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8055-8059, 1987; und Ferrone et al., 7th International Congress of Immunology (Abstract 117-9), Berlin, 1989.
Die Verabreichung derartiger Ab2-Moleküle induziert wahrscheinlich eine starke Immunantwort gegen die konstanten Regionen des Ab2-Moleküls, die keinen therapeutischen Wert besitzen würde. Darüber hinaus kann eine wiederholte Immunisierung mit fremden Proteinen schädliche Wirkungen verursachen. Alternativ dazu wird die Verabreichung von Ab2β-Molekülen, deren konstante Regionen mit denen von menschlichen Immunglobulinen identisch oder sehr ähnlich sind, eine Immunantwort induzieren, die auf die idiotypischen Determinanten beschränkt ist. So können Antikörper, die von Tieren wie Affen, die phylogenetisch nah mit dem Menschen verwandt sind, eine solche Alternative darstellen. Tatsächlich sind Pavian-Antikörper, die an Krebspatienten verabreicht wurden, weniger immunogen als Immunglobuline von anderen Tieren.
Bei einer Vielzahl von experimentellen Systemen ist gezeigt worden, daß Anti-Idiotyp-Antikörper das durch den Ab1 erkannte Antigen funktionell imitieren und eine spezifische Immunantwort anstelle dieses ursprünglichen Antigens hervorrufen. Siehe, z.B. Bona et al., Ann. Immunol. (Paris), 136C:299-312, 1985. Weiterhin haben in zwei derartigen Systemen, in denen die ursprünglichen Antigene das Reovirus Typ 3 Hämagglutinin und das Zufalls-Polymer GAT (Glutaminsäure, Alanin und Tyrosin) waren, Sequenzanalysen Homologien zwischen diesen Antigenen und den komplementären bestimmenden Regionen der Ab2-Moleküle gezeigt. Siehe Bruck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6578-6582, 1986; Ollier et al., EMBO, J., 4:3681-3688, 1985.
Eine Immunisierung mit Ab2-Antikörpern, die mikrobielle Agenzien imitieren, schützt gegen Herausforderungen mit dem pathogenen Agens in Tiermodellen und Ab2β-Antikörper würden daher wertvolle Ersatz-Antigene darstellen, wenn das ursprüngliche Antigen (mikrobiell oder parasitär) nicht für eine Impfung verfügbar ist. Die Verabreichung eines funktionalen Abbildungs-Antigens, das auf einem fremden Immunglobulinmolekul vorhanden ist, induziert eine Immunantwort gegen ein toleriertes Antigen in Mäusen. Im allgemeinen rufen Tumor-Antigene keine spontane Immunantwort durch den Wirt hervor. In einer Vielzahl von Tiermodellen ist gezeigt worden, daß eine Immunisierung mit Ab2 das anschließende Wachstum eines Tumors verhindert. Siehe, z.B., Raychaudhuri et al., supra; Dunn et al., supra; Powell et al., supra. Beim Menschen haben klinische Versuche gezeigt, daß eine Verabreichung eines Maus-Ab2 an Krebspatienten eine Bindung von Ab3-Antikörpern an Tumoren induzieren kann. Es ist erforderlich, daß die induzierten Antikörper therapeutisch wirksam sind. Eine vorteilhafte Wirkung von Antikörpern, die durch Maus-Ab2 induziert wurden, ist aber bisher noch nicht gezeigt worden. Siehe Herlyn et al., supra; Ferrone et al., supra.
So besteht weiterhin ein Bedarf an Lösungen für die oben genannten Probleme.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine Vakzine bereitzustellen, die die Erzeugung von Antikörpern gegen normalerweise tolerierte Tumor- und virale Antigene bei menschlichen Krebspatienten und Patienten, die üblicherweise hartnäckige virale Infektionen haben, stimulieren werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vakzine gegen pathogene Mikroorganismen und Parasiten bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Behandlung von Krebs und Infektionen durch pathogene Mikroorganismen oder Parasiten bereitzustellen, die ein Nicht-Tumor- und nicht-infektiöses Agens verwendet, um eine Immunantwort hervorzurufen, die spezifisch für Tumor- Antigene oder Antigene von infektiösen Agenzien ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Immunität gegen die Entwicklung von Tumoren und gegen die erfolgreiche Invasion von pathogenen Mikroorganismen und Parasiten bei gesunden Menschen und Tieren zu induzieren.
Andere Aufgaben der Erfindung werden für den Fachmann bei einem sorgfältigen Studium der folgenden Diskussion und den veranschaulichenden Beispielen ersichtlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorgenannten Aufgaben werden erzielt, indem eine Anti-Tumoroder Anti-Pathogen-Vakzine bereitgestellt wird, die eine immunogene Menge eines Pavian-Anti-Idiotyp-Antikörpers oder -Antikörperfragments und ein physiologisch verträgliches Vakzine-Vehikel umfaßt, wie es in den Ansprüchen definiert ist. Weiterhin wird die Verwendung einer immunogenen Menge eines Pavian-Anti-Idiotyp-Antikörpers oder -Antikörperfragments in Kombination mit einem physiologisch verträglichen Vakzine-Vehikel zur Herstellung einer Anti-Tumor- oder Anti-Pathogen-Vakzine bereitgestellt, wie es in den Ansprüchen definiert ist.

Ausführliche Diskussion

Anti-Idiotyp-Antikörper, die Antigene von einem Tumor oder einem infektiösen Agens imitieren, sind ein sicherer und wirksamer Bestandteil von Vakzinen, die eine Immunantwort gegen Krebs, pathogene Mikroorganismen, Parasiten und Viren induzieren können, entweder als eine Therapie für Patienten, die an Malignitäten oder Infektionen leiden oder als eine präventive Maßnahme, die Entwicklung von Krebs zu unterdrücken oder einen eindringenden Mikroorganismus, Parasiten oder Virus abzuwehren.
Mit dem Begriff "Mikrobe" wird hierin ein Virus, Bakterium, eine Rickettsie, Mycoplasma, eine Protozoe, Pilze und derartige Mikroorganismen bezeichnet, der Begriff "Parasit" bezeichnet infektiöse, im allgemeinen mikroskopische oder sehr kleine multizelluläre Invertebraten, oder deren Eier oder juvenile Formen, die empfänglich sind für eine Antikörper-induzierte Clearance oder einen lytischen oder phagozytischen Abbau, z.B. Malariapara siten, Spirochäten und dergleichen, während die Begriffe "infektiöses Agens" oder "Pathogen" sowohl Mikroben als auch Parasiten bezeichnen.
Der hierin verwendete Begriff "Antikörper" wird dahingehend verstanden werden, daß er ganze Antikörper, Antikörperfragmente und Subfragmente umfaßt und somit äquivalent zu dem Begriff "Antikörper/Fragment" ist, der deshalb in dieser Diskussion austauschbar verwendet wird, sofern dies nicht anderweitig festgestellt wird. Antikörper können gesamte Immunglobuline (IgG) jeder beliebigen Klasse, z.B. IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, chimäre Antikörper oder Hybrid-Antikörper mit dualen oder multiplen Antigen- oder Epitop-Spezifitäten oder Fragmente, z.B. F(ab')&sub2;, Fab', Fab und dergleichen, einschließlich Hybridfragmenten, sein und schliessen zusätzlich beliebige Immunglobuline und jedes beliebige natürliche, synthetische oder gentechnisch erzeugte Protein ein, das wie ein Antikörper wirkt durch Bindung an ein spezifisches Antigen, um einen Komplex zu bilden oder durch Stimulation der Erzeugung eines Anti-Idiotyp- oder Anti-Anti-Idiotyp-Antikörpers. Es sind rekombinante Moleküle bekannt, die die leichten und schweren Ketten eines Antikörpers beinhalten, z.B. gemäß dem Verfahren nach Boss et al., US-Patent 4,816,397. Analoge Verfahren zur Herstellung von rekombinanten oder synthetischen Bindungs-Molekülen mit den Charakteristiken von Antikörpern sind in die Erfindung mit eingeschlossen.
Mit dem Begriff "auf funktionelle Weise imitieren", wie er auf einen Anti-Idiotyp-Antikörper oder ein Antikörperfragment mit Bezug auf ein Antigen oder eines seiner spezifischen Epitope angewendet wird, wird die Eigenschaft des Induzierens einer Erzeugung eines menschlichen Antikörpers angedeutet, der spezifisch an das Antigen/Epitop bindet und auf kompetitive Weise die Bindung an das Antigen/Epitop des Idiotyp-Antikörpers oder Antikörperfragments inhibiert, der/das verwendet wird, um den Anti-Idiotyp zu erzeugen.
Die Idiotyp-Antikörper oder Antikörperfragmente (Ab1), die verwendet werden, um ein Anti-Idiotyp-Antiserum (Ab2) hervorzurufen, können polyklonal oder monoklonal sein, wobei letztere bevorzugt sind, Gesamtimmunglobu- lin oder Fragmente, oder sie können komplexere genetische Konstrukte sein, die durch synthetische und/oder rekombinante Techniken hergestellt wurden. Die wichtige Eigenschaft, die sie erfordern, ist eine Antigen-bindende Region, die verwendet werden kann, um die Erzeugung von Anti-Idiotypen zu stimulieren, wobei mindestens ein Teil auffunktionelle Weise das ursprüngliche Antigen imitiert.
Idiotyp-Antikörper gegen Tumor-Antigene und gegen Pathogene sind bekannt. Es sind z.B. Antikörper und Antikörperfragmente, die auf spezifische Weise an Marker binden, die durch Tumoren oder infektiöse Läsionen, einschließlich viraler, bakterieller, fungaler und parasitärer Infektionen, erzeugt wurden oder mit diesen verbunden sind, und Antigene und Produkte, die mit derartigen Mikroorganismen verbunden sind, offenbart worden, inter alia in Hansen et al., US-Patent 3,927,193 und Goldenberg, US-Patente 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,818,709 und 4,624,846. Insbesondere sind Antikörper gegen ein Antigen, wie ein oncofötales Antigen, erzeugt durch oder assoziiert mit einem malignen, soliden Tumor oder hämatopoetischen Neoplasma, wie einem Gastromtestinal- , Lungen-, Brust-, Prostata-, Ovarial-, Hoden-, Hirn- oder Lymph-Tumor, einem Sarkom oder einem Melanom, auf vorteilhafte Weise verwendet worden.
Eine große Vielzahl von monoklonalen Antikörpern gegen Agenzien von infektiösen Krankheiten sind entwickelt worden und wurden in einem Übersichtsartikel von Polin, in Eur. J. Clin. Microbiol., 3(5):387-398, 1984, zusammengefaßt, was ihre leichte Erhältlichkeit zeigt. Diese schließen monoklonale Antikörper (MAbs) gegen Pathogene und deren Antigene wie die folgenden mit ein:

Anti-bakterielle MAbs

Streptococcus agalactiae
Legionella pneumophilia
Streptococcus pyogenes
Escherichia coli
Neisseria gonorrhosae
Neisseria meningitidis
Pneumococcus
Hämophilus influenzae B
Treponema pallidum
Lyme disease-Spirochäten
Pseudomonas aeruginosa
Mycobacterium leprae
Brucella abortus
Mycobacterium tuberculosis
Tetanustoxin

Anti-virale MAbs

Rabies-Virus
Influenza-Virus
Cytomegalievirus
Herpes simplex I und II
Humaner Serum-parvo-artiger Virus
Respiratorischer Synzytial-Virus (respiratory syncytial virus)
Varicella-Zoster-Virus
Hepatitis B Virus
Masern-Virus
Adenovirus
Humane T-Zell-Leukämie-Viren
Epstein-Barr-Virus
Maus-Leukämie-Virus*
Mumps-Virus
Vesikulärer Stomatitis-Virus
Sindbis-Virus
Lymphozytischer Choriomeningitis-Virus
Warzen-Virus
Blue tongue-Virus
Sendai-Virus
Katzen-Leukämie-Virus*
Reo-Virus
Polio-Virus
Affen-Virus 40* (Simian virus 40)
Maus-Brusttumor-Virus*
Dengue-Virus
Rubella-Virus
* Tiervirus

Anti-Protozoen MAbs

Plasmodium falciparum
Plasmodium vivax
Toxoplasma gondii
Tyrpanosoma rangeli
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma rhodesiensei
Trypanosoma brucei
Schistosoma mansoni
Schistosoma japanicum
Babesia bovis
Eimeria tenella
Onchocerca volvulus
Leishmania tropica
Trichinella spiralis
Theileria parva
Taenia hydatigena
Taenia ovis
Taenia saginata
Echinococcus granulosus
Mesocestoides corti

Anti-Mycoplasma MAbs

Mycoplasma arthritidis
M. hyorhinis
M. orale
M. arginini
Acholeplasma laidlawii
M. salivarium
M. pneumoniae
Zusätzliche Beispiele von MAbs, die gegen infektiöse Mikroorganismen erzeugt wurden, die in der Literatur beschrieben worden sind, werden nachfolgend erwähnt.
MAbs gegen das gp120-Glykoprotein-Antigen des humanen Immundefizienz-Virus 1 (HIV-1) sind bekannt und bestimmte derartiger Antikörper können eine immunprotektive Rolle beim Menschen besitzen. Siehe, z.B., Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8055-8058, 1990. Dies zeigt, daß die richtige Auswahl eines Epitops zwischen einem therapeutischen und einem nichttherapeutischem Ziel unterscheiden kann, und dadurch die Auswahl eines Anti-Idiotyps erlaubt, der eine therapeutische Antikörperantwort in dem Patienten hervorruft.
MAbs gegen Malariaparasiten können gegen das Sporozoiten-, Merozoiten-, Schizonten- und Gametozyten-Stadium gerichtet sein. Es sind monoklonale Antikörper gegen Sporozoiten (Circumsporozoiten-Antigen) gebildet worden, und es ist gezeigt worden, daß sie Sporozoiten in vitro und in Nagetieren neutralisieren (N. Yoshida et al., Science 207:71-73, 1980).
Mehrere Gruppen haben MAbs gegen T. gondii entwickelt, den Protozoen-Parasiten, der an der Toxoplasmose beteiligt ist (Kasper et al., J. Immunol. 129:1694-1699, 1982; Id., 130:2407-2412, 1983).
Es sind MAbs gegen Schistosomular-Oberfiächen-Antigene entwickelt worden und es ist festgestellt worden, daß diese gegen Schistosomulae in vivo oder in vitro wirken (Simpson et al., Parasitology, 83:163-177, 1981; Smith et al., Parasitology, 84:83-91, 1982; Gryzch et al., J. Immunol., 129:2739-2743, 1982; Zodda et al., J. Immunol., 129:2326-2328, 1982; Dissous et al., J. Immunol., 129:2232-2234, 1982).
Trypanosoma cruzi ist das verursachende Agens der Chagas-Krankheit und wird durch blutsaugende Reduviid-Insekten übertragen. Ein MAb ist erzeugt worden, der spezifisch die Differenzierung einer Form des Parasiten in eine andere (Epimastigoten-zu-Trypomastigoten-Stadium) in vitro inhibiert, und der mit einem Zelloberflächen-Glycoprotein reagiert; jedoch tritt dieses Antigen nicht bei den Säugetier-(Blutstrom-)-Formen des Parasiten auf (Sher et al., Nature, 300:639-640, 1982).
Es sind geeignete MAbs gegen die meisten der Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Protozoen, Parasiten) entwickelt worden, die verantwort lich sind für die Mehrzahl der Infektionen beim Menschen, und viele sind zuvor für diagnostische Zwecke in vitro verwendet worden. Diese Antikörper und neuere MAbs, die durch konventionelle Verfahren erzeugt werden können, sind zur Erzeugung von Anti-Idiotyp-Antikörpern zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Bei den monoklonalen Antikörpern handelt es sich normalerweise um Antiserum-Präparationen von einer Vielzahl von üblicherweise verwendeten Tieren, wie Ziegen, Primaten, Eseln, Schweinen, Kaninchen, Pferden, Hühnern, Meerschweinchen, Ratten oder Mäusen, und sogar menschliche Antiseren nach geeigneter Auswahl und Reinigung. Die tierischen Antiseren werden durch Inokkulieren der Tiere gemäß einem konventionellen Protokoll mit einer immunogenen Form des Pathogens erzeugt, wie Gesamttumorzellen oder rohe oder gereinigte, lebende, attenuierte oder getötete Mikroben oder Parasiten, Ausbluten der Tiere und Gewinnen des Serums oder einer Immunglobulin enthaltenden Serumfraktion. Kleinere antigenische Strukturen, wie eine mehr oder weniger gereinigte Tumor-Antigen-Präparation, isolierte Tumor-Antigene und/oder deren Oligopeptid-Fragmente, oder virale Hüllproteine und/oder deren Fragmente (wie das HIV-1 gp-120-Peptid), mikrobielle Zellmembran- oder Zellwand-Bestandteile, Parasiten-Oberflächen-Antigene, Teile davon, oder Fragmente, die aus dem Abbau des Pathogens resultieren, können ebenfalls verwendet werden, um die Idiotyp-Antikörper-Erzeugung zu stimulieren.
Das Antiserum wird vorzugsweise durch übliche Verfahren affinitätsgereinigt, wie durch Binden von Antigen an chromatographisches Säulenmaterial, wie Sephadex, Fließen des Antiserums durch die Säule, wobei auf diese Weise die spezifischen Antikörper zurückgehalten werden und die anderen Immunglobuline und Kontaminanten abgetrennt werden und dann Rückgewinnen der gereinigten Antikörper durch Elution mit einem chaotropen Agens, wahlweise gefolgt durch weitere Reinigung, wie durch Passage durch eine Säule mit gebundenen Blutgruppen-Antigenen oder anderen nichtpathogenen Spezies. Dieses Verfahren kann bevorzugt sein, wenn die gewünschten Antikörper aus dem Serum von Patienten isoliert werden, die einen Antikörper-Titer gegen das fragliche Pathogen entwickelt haben.
Monoklonale Antikörper von Hybridomen (Mensch, Affe, Ratte, Maus oder dergleichen) sind ebenfalls zur Verwendung bei der Herstellung von Anti-Idiotypen geeignet und besitzen den Vorteil einer hohen Spezifität Sie können leicht hergestellt werden durch was nun üblicherweise als übliche Verfahren betrachtet wird zur Immunisierung von Säugetieren mit einem immunogenen Antigen-Präparat, Fusion der Immunlymph- oder der Milzzellen mit einer immortalisierten Myelom-Zellinie, und Isolierung der spezifischen Hybridom-Klone. Die monoklonalen Antikörper, die von Hybridomen stammen, stammen typischerweise von der Maus oder Ratte und sind typischerweise IgGs oder IgMs, obwohl es nicht beabsichtigt ist, die geeigneten Antikörper zur Verwendung bei der Herstellung von Anti-Idiotypen gemäß der Erfindung hinsichtlich Spezies oder Ig-Klasse zu beschränken. Unüblichere Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind nicht ausgeschlossen, wie Interspezies-Fusionen und gentechnische Manipulationen der hypervariablen Regionen, da es in erster Linie die Antigen-Spezifität der Antikörper ist, die ihre Nützlichkeit in der vorliegenden Erfindung beein trächtigt. Menschliche Lymphozyten können mit einer menschlichen Myelom-Zellinie fusioniert werden, um Antikörper mit bestimmten Spezifitäten zu erzeugen, vorzugsweise für Epitope, die nicht durch zirkulierende Antikörper gegen die bedeutenden antigenischen Stellen auf dem Pathogen maskiert sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stellt man sich auch die Verwendung von Antigen-spezifischen Fragmenten als Idiotypen und/oder Anti- Idiotypen vor. Antikörperfragmente können durch Pepsin- oder Papain- Verdau von Gesamtimmunglobulinen durch übliche Verfahren hergestellt werden. Es ist bekannt, daß Antikörperfragmente durch enzymatische Spaltung von Antikörpern mit Pepsin erzeugt werden können, um ein 5S- Fragment bereitzustellen, das als F(ab')&sub2; bezeichnet wird. Dieses Fragment kann weiter gespalten werden unter Verwendung eines Thiol-reduzierenden Agens und wahlweise einer Blockierungsgruppe/Schutzgruppe für die Sulffiydryl-Gruppen, die aus der Spaltung von Disulfid-Brücken resultieren, um monovalente 3,5S-Fab'-Fragmente zu erzeugen. Alternativ dazu erzeugt eine enzymatische Spaltung unter Verwendung von Papain zwei monovalente Fab- Fragmente und ein Fc-Fragment auf direkte Weise. Diese Verfahren sind beschrieben, inter alia, durch Goldenberg, in den US-Patenten Nr.4,036,945 und 4,331,647 und den darin enthaltenden Referenzen, und in Nisonoff et al, Arch. Biochem. Biophys., 89, 230 (1960); Porter, Biochem. J., 73, 119 (1959); und Edelman et al. in "Methods in Immunology and Immunochemistry", Bd. 1, 422 (Acad. Press, 1967), und sind im Stand der Technik üblich.
Andere Verfahren zur Spaltung von Antikörpern, wie die Trennung von schweren Ketten, um monovalente leichte-schwere Ketten-Fragmente zu bilden, weitere Spaltung von Fragmenten oder andere enzymatische, chemische oder gentechnische Verfahren können ebenfalls verwendet werden, solange wie die Fragmente ihre Spezifität für das Pathogen oder Antigen gegen das ihre Ausgangs-/Stamm-Antikörper (parent antibodies) erzeugt wurden, behalten.
Es ist nicht ausreichend, bloß Antikörper gegen das Antigen eines Tumors oder infektiösen Agens unter Verwendung eines Anti-Idiotyp-Antikörpers hervorzurufen. Eine therapeutische Antwort ist erforderlich, damit die Behandlung erfolgreich sein kann, d.h., die Antikörper müssen zu einer Regression der Malignität oder zur Unterdrückung, Attenuierung oder zum Abbau des infektiösen Agens führen. Eine sorgfältige Auswahl des Antigens des Tumors oder infektiösen Agens und dessen Epitops, das den Anti-Idiotyp auf funktionelle Weise imitiert, kann die Wirksamkeit der therapeutischen Antwort verstärken, da nicht alle Antigene eines Tumors oder infektiösen Agens auf gleiche Weise wirksame Ziele für eine therapeutische Antikörperantwort sind. Idiotyp-Antikörper für eine spätere Anti-Idiotyp-Erzeugung werden vorzugsweise ausgewählt, die an Epitope binden, die so spezifisch wie möglich für den Tumor oder das Pathogen sind und nicht kreuzreaktiv mit normalen menschlichen Geweben sind. Dies wird sicherstellen, daß die schließlich erhaltenen Antikörper, die in Antwort auf eine Herausforderung mit einem Anti-Idiotyp erzeugt wurden, das als eine funktionelle Imitation des Epitops wirkt, in erster Linie auf maligne Zellen oder infektiöse Agenzien wirken, anstatt auf gesunde Gewebe. Ein anderer Grund ein Epitop auszuwählen, das so spezifisch wie möglich für einen Tumor bzw. ein Pathogen ist, ist, daß eine Immunisierung gegen eine Determinante, die auf normalen Zellen gefunden wird, eine potentiell schädliche Autoimmunantwort auslösen könnte.
Der Idiotyp-Antikörper/-Fragment wird verwendet, um Anti-Idiotypen durch ähnliche herkömmliche Verfahren wie solche zu erzeugen, die verwendet werden, um die Idiotypen selbst zu erzeugen. Ein Antigen-spezifischer Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper oder Antikörperfragment, wird in ein Säugetier injiziert, vorteilhafterweise in Kombination mit einem Adjuvans. Die Immunisierungen werden normalerweise periodisch wiederholt und das Tier wird mehrere Wochen nach der Injektion ausgeblutet, um ein Antiserum zu erzeugen. Das Antiserum wird vorzugsweise ein oder mehrere Male an eine Affinitätssäule mit gebundenem normalen Immunglobulin des gleichen Isotyps wie des Idiotyps, der für die Immunisierung verwendet wurde, adsorbiert. Dadurch werden die Anti-Konstante Region-Bestandteile des Antiserums entfernt. Es kann eine weitere Adsorption an eine Säule von gebundenem Idiotyp bewirkt werden, gefolgt durch eine chaotropische Elution des Anti-Idiotyps. Die Bestätigung der Spezifität des Anti-Idiotyp-Antiserums wird durch Nachweis seiner Fähigkeit gezeigt, mit dem Antigen selbst fiir den Idiotyp-Antikörper zu konkurrieren, z.B. in einem ELISA-Assay.
Es müssen verschiedene Parameter berücksichtigt werden, wenn Ab2 als therapeutische Agenzien verwendet werden. Zum Beispiel kann ein monoklonaler oder polyklonaler Ab2 verabreicht werden, um eine protektive Immunität zu induzieren. Monoklonale Ab2-Antikörper besitzen offensichtlich praktische Vorteile, wie ihr potentiell unbegrenztes Angebot und die Praktikabilität ihrer Reinigung. Jedoch stellen Ab2βs, die auf funktionelle Weise ein Antigen eines Tumors oder Pathogens imitieren, nur einen kleinen Teil der gesamten Ab2-Population dar.
Außerdem haben einige, aber nicht alle, Ab2's (sogar wenn sie Ab1'- Antikörper induzieren können) schützende Wirkungen gegen das Wachstum eines Tumors oder Pathogens und deshalb besitzt nur ein Bruchteil aller monoklonalen Ab2s einen potentiellen therapeutischen Wert. Zum Beispiel verhinderte in einem Tiermodell nur einer von zwei monoklonalen Ab2s, die auf funktionelle Weise ein Antigen eines Maus-Tumors imitierten, L1210/GZL, das Tumorwachstum, obwohl beide die Ab1-Bindung des ursprünglichen Antigens induzieren konnten. Andererseits sind die schützenden Moleküle ein Teil der polyklonalen Ab2-Population, und die Verwendung eines polyklonalen Ab2 kann manchmal vorzuziehen sein. Durch Umgehen der Aufgabe, die das Screening von zahlreichen monoklonalen Ab2-Antikörpem beinhaltet, sind polyklonale Ab2 besonders geeignet, wenn die Wirksamkeit einer auf Idiotypen basierenden Therapie beurteilt wird. Der Anti-Idiotyp-Antikörper kann ein Gesamtantikörper, ein Antikörperfragment oder Subfragment sein. Das Anti-Idiotyp-Antiserum kann auf enzymatische Weise verdaut werden zur Bildung von Fragmenten, wie F(ab')&sub2; oder Fab, unter Verwendung üblicher Techniken, wie vorstehend im Zusammenhang mit den Idiotypen angemerkt wurde. Die Fragmente werden vorteilhafterweise anstelle von Gesamtimmunglobulin benutzt wegen des höheren Anteils des Moleküls, der durch die hypervariable Region dargestellt wird. Die konstanten Domänen stellen zwei Drittel des IgG- Moleküls dar und deshalb sind die meisten der antigenischen Determinanten auf einem Immunglobulinmolekül nicht Idiotyp-verwandt. Die Verabreichung des Fab- oder der F(ab')&sub2;-Fragmente des Ab2-Moleküls würde die Größenordnung der Antwort auf die konstanten Regionen verringern. Nichtsdestotrotz entwickeln Patienten, die F(ab')&sub2;-Fragmente von Maus-IgG-Antikörpern erhielten, Antikörper gegen die konstanten Regionen des Maus-Immunglobulins. Zurückliegende Fehlschläge mit Maus-Anti-Idiotypen, die eine Antikörperantwort induzieren konnten, von denen aber nicht gezeigt werden konnte, daß sie zu einem therapeutischen Nutzen für den Patienten führten, könnten an einer zu großen Immunogenität der konstanten Region gelitten haben, infolge einer hohen Interspeziesvarianz, die zu einer starken humanen Anti- Maus-Antikörper-(HAMA)-Antwort und nur einer schwachen Ab1'-Antwort führten.
Ein anderer wichtiger Parameter ist die tierische Herkunft des Ab2- Antikörpers. Die fremde Natur des Ab2-Moleküls trägt zu deren Immunogenität bei. Die Erzeugung von Antikörpern gegen die konstanten Regionen des Ab2-Moleküls ist aber kontraproduktiv.
Das Säugetier, das zur Erzeugung des Anti-Idiotyps ausgewählt wird, wird üblicherweise ein Primat sein. Es wird bevorzugt sein, ein nicht- humanes Primaten-Immunglobulin zu verwenden, um die Möglichkeit einer Autoimmunantwort zu verringern. Ein attraktiver Ansatz ist, Moleküle zu verwenden, die menschlichen Immunglobulinen phylogenetisch nahestehen.
Insbesondere werden Pavian-Ab2'-Antikörper oder Antikörperfragmente besonders bevorzugt sein. Pavian-Antikörper werden normalerweise gut von Menschen toleriert und werden viele gemeinsame antigenische Determinanten teilen, die Regionen hoher Homologie mit menschlichem Immunglobulin entsprechen. Dies wird durch die Tatsache gezeigt, daß kommerziell erhältliche Anti-Mensch-Antiseren auch Pavian-Antikörper binden. Deshalb werden die hypervariablen Regionen von Pavian-Antikörpern oder Antikörperfragmenten üblicherweise den Hauptteil der Immunantwort hervorrufen, was zu der besten Ausbeute von Antikörpern, die an das gewünschte Antigen binden, führt.
Wegen der hohen Homologie mit menschlichem Immunglobulin sind Pavian-Antikörper normalerweise bei Menschen sehr schwach immunogen. In einer Studie mit Patienten, die mit Anti-Tumor-Antikörpern von verschiedenen Tierspezies behandelt wurden, waren Pavian-Immunglobuline die am wenigsten immunogenen. Nur einer von 66 Patienten, die Pavian-Antikörper erhielten, entwickelte Anti-Pavian-Antikörper, während, z.B., 36% der Patienten, die mit Cynomolgus-Affen-Immunglobulinen behandelt worden waren, Anti-Antikörper bildeten. Siehe, Klein et al., supra. In einer anderen Studie entwickelten 9 von 14 Patienten, die eine Infusion mit Pavian-Anti-CEA-Antikörpern erhalten hatten, Anti-Pavian-Antikörper, aber die meisten der Antikörper-Titer waren geringfügig über der Sensitivitätsgrenze des verwendeten Assays. Siehe, Huberman et al., Cancer Immunol. Immunother., 23:137-142, 1986. Keiner der vier Patienten, die mit Pavian- Anti-Gross Cystic Disease Fluid Protein-15-Antikörper behandelt worden waren, bildeten menschliche Anti-Pavian-Antikörper, obwohl sogar einer dieser Patienten vier Antikörper-Infusionen erhielt. Siehe, Estabrook et al., Cancer Immunol. Immunother., 23:143-147, 1986.
Um die schwache Immunogenität von Primaten-Anti-Idiotyp-Antikörpern oder -Fragmenten, insbesondere Pavian-Ab2β, bei menschlichen Empfängern zu überwinden, werden die Immunglobuline vorzugsweise durch Verabrei chung in einem Impfvehikel stärker immunogen gemacht. Typischerweise werden sie in Kombination mit einem Adjuvans wie dem kompletten oder inkompletten Freundschen Adjuvans, Alaun, oder dergleichen injiziert. Weiterhin kann ihre Immunogenität erhöht werden durch Kopplung an einen immunogenen Träger, der beim Menschen bekanntermaßen sicher ist, wie einem attenuierten mikrobiellen Agens wie Tetanustoxoid, Bacillus Calmette- Guerin (BCG) oder dergleichen.
Das Antigen, das den Anti-Idiotyp imitiert, kann in einem Impfprotokoll in Verbindung mit dem Antikörper verwendet werden. Das Antigen kann mit dem Anti-Idiotyp oder getrennt, entweder gleichzeitig oder nacheinander, verabreicht werden. Oft wird das Anti-Idiotyp-Immunogen eine Immunantwort stimulieren, und den Patienten gegen das Antigen selbst sensibilisieren, wonach das Antigen für eine weitere Antikörperinduktion verwendet werden kann.
Es sind in erster Linie die nichthomologen Regionen des Anti-Idiotyps, insbesondere die hypervariable Region, die eine komplementäre Antikörper- Erzeugung induzieren. Die Verabreichung eines bevorzugten Pavian-Ab2- Antiserums resultiert in einer geringeren Erzeugung der Anti-Konstante Region-Antikörper als die Immunisierung mit Ab2 von üblicheren Quellen wie Ziege oder Maus.
Die Nützlichkeit eines Pavian-Antiserums zur Bildung von Antigenspezifischen Antikörpern kann in einem Maus-Modellsystem gezeigt werden. Mäuse, die mit Pavian-Ab2-Antikörpern gegen einen monoklonalen Maus- Antikörper immunisiert wurden, der spezifisch an den kolorektalen Krebsmarker karzinoembryonales Antigen (CEA) binden, entwickeln Ab3-Antiseren, die mindestens einige Antikörper des Ab1'-Typs enthalten und deshalb das CEA-Epitop binden, das durch NP-4 erkannt wird. NP-4 wurde ausgewählt, da es spezifisch für CEA mit hohem Molekulargewicht ist, und nicht mit normalem kreuzreaktivem Antigen reagiert, das auf Granulozyten vorkommt, oder mit CEA-Varianten mit niedrigem Molekulargewicht, wie dem Mekonium-Antigen. Die Bildung von Ab1' als ein Teil der Ab3-Antiseren kann gezeigt werden, indem nachgewiesen wird, daß die Ab3-Seren die nachfolgende Erkennung von CEA durch biotinyliertes NP-4 in einem kompetitiven ELISA inhibieren. Kontrollseren von Mäusen, die mit normalen Pavian Immunglobulinen immunisiert wurden, inhibieren diese Bindung nicht. Die Inhibierung ist selektiv, da keines der Seren von jeder der Gruppen die Bindung zwischen NP-3 und CEA inhibieren kann. Dies deutet darauf hin, daß Ab2-induzierte Maus-Anti-CEA-Antikörper für das Epitop, das durch NP-4 erkannt wird, spezifisch sind.
Diese Ergebnisse betreffen nicht eine möglicherweise schwache Immunogenität der normalen Pavian-Immunglobuline, da Seren von beiden Gruppen sehr hohe Titer an Maus-Anti-Pavian-Antikörpern enthalten. Außerdem teilen Ab3-Antikörper Idiotypen mit Ab1-(NP-4)-Antikörpern, da Seren von Mäusen, die mit Pavian-Ab2 immunisiert wurden, die Bindung zwischen NP 4 und Pavian-Ab2-Antikörpern inhibieren. Experimente wie diese liefern den weiteren Beweis dafür, daß Pavian-Anti-NP-4-Ab2-Antikörper auffunktionelle Weise ein CEA-Epitop imitieren, und daß sie Ab1'-Antikörper für dieses bestimmte CEA-Epitop induzieren können. Es werden nur Anti-CEA- Antikörper für das NP-4-Epitop und nicht für das nichtkreuzreagierende NP- 3-Epitop induziert. Darüber hinaus werden durch die Injektion von normalen Pavian-Immunglobulinen keine Anti-CEA-Antikörper induziert.
Anti-Idiotyp-Ab2'-Antikörper können als Ersatz-Antigene dienen und besitzen die weiteren Vorteile der Einfachheit der Herstellung und der oft größeren Sicherheit. Ein wichtiger weiterer Vorteil von kritisch ausgewählten Ab2β-Antikörpern in einer geeigneten Vakzineformulierung ist, daß sie verwendet werden können, um die Toleranz gegen Selbst-Antigene zu durchbrechen. Somit können sogar solche Antigene von einem Tumor oder einem infektiösen Agens, die normalerweise nicht immunogen sind ("tolerierte" Antigene) imitiert werden, und Antikörper, die spezifisch an derartige Antigene binden, können induziert werden.
Zusammenfassend ist festzuhalten, daß Primaten - vorzugsweise subhumane Primaten - und insbesondere Pavian-Anti-Idiotyp-Antikörper, auf funktionelle Weise ein Antigen-Epitop eines Tumors oder Pathogens, das durch einen spezifischen Idiotyp-Antikörper erkannt wird, imitieren können. Ihre Verwendung als eine Vakzine/ein Immunogen induziert die Erzeugung von Anti-Anti-Idiotyp-Antikörpern, wobei mindestens ein Anteil davon eine protektive/therapeutische Wirkung besitzen wird, wenn das Antigen-Epitop gut ausgewählt wird.
Um die Erfindung zu veranschaulichen, wird eine Beschreibung für die Erzeugung und Reinigung von Pavian-Ab2-Antikörpern bereitgestellt, die ein Epitop auf dem karzinoembryonalen Antigen (CEA) imitieren, einem Marker, der durch bestimmte Typen von kolorektalen Tumoren und von anderen Krebsarten sekretiert wird, und für deren Fähigkeit, die Erzeugung von therapeutischen Anti-CEA-Antikörpern zu induzieren, die eine Regression von CEA-produzierenden Krebsen verursachen. Es wird ebenfalls eine Beschreibung für die Erzeugung von Anti-Idiotyp-Antikörpem bereitgestellt, die den gp-120 virales Hüllglycoprotein-Bestandteil des menschlichen Immundefizienzvirus HIV-1 imitieren, der in die Krankheit AIDS verwickelt ist, und dessen Verwendung, um eine Immunität gegen eine Infektion durch das AIDS-Virus zu verleihen.

Beispiel 1

Herstellung eines Pavian-Anti-Tumor-Ab2-Antikörpers

Ein adulter weiblicher Pavian wird wiederholt mit 1 mg NP-4, emulgiert in inkomplettem Freundschem Adjuvans (Gesamtvolumen 1 ml/Injektion), immunisiert. NP-4 ist ein monoklonaler BALB/c-Maus-IgG&sub1;k-Antikörper, der ein Epitop auf dem CEA-Molekül erkennt, das weder mit dem unspezifisch kreuzreagierenden Antigen noch mit dem Meconium-Antigen geteilt wird. Die Injektionen wurden s.c. an vier verschiedenen Stellen in den Achselbereichen durchgeführt und zwei Wochen nach jeder Immunisierung wird eine Blutprobe von dem Tier genommen. Anti-NP-4-Antikörper werden durch Affinitätschromatographie gereinigt: die Seren werden an eine NP-4-Affi-Gel-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) adsorbiert und die spezifischen Antikörper werden durch 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,5, eluiert. Das resultierende Präparat enthält sowohl Anti-Idiotyp-Antikörper als auch Antikörper, die gegen die konstanten Regionen des NP-4-Moleküls gerichtet sind.
Das Präparat wird durch Adsorption der Anti-Konstante Region-Antikörper an die NP-3-Affi-Gel-Säule Idiotyp-spezifisch gemacht. NP-3 ist ein monoklonaler BALB/c-Maus-IgG&sub1;k-Antikörper, der nicht NP-4 kreuzblockiert und der ein Epitop auf dem CEA-Molekül erkennt, das nicht mit dem unspezifischen kreuzreagierenden Antigen geteilt wird, das aber auch auf dem Meconium-Antigen vorkommt. Der NP-3 wird als ein Adsorbens ausgewählt, da er den gleichen Isotyp (IgG&sub1;k) wie NP-4 besitzt und er ein Anti-CEA-Antikörper ist, der nicht mit NP-4 kreuzreagiert. Zwei Adsorptionsschritte über ein NP-3-Affi-Gel sind üblicherweise ausreichend, um alle nachweisbaren Anti-Konstante Region-Antikörper zu entfernen.

Beispiel 2

Spezifität von Pavian-Ab2-Antikörpern

Die Bindung von Pavian-Ab2-Antikörpern an monoklonale Maus-Antikörper wird in einem ELISA getestet. Kurz, es werden Polyvinyl-Mikrotiterplatten über Nacht mit einem von NP-4, NP-3 oder Mu-9 (10 µg/ml in Carbonat-Puffer, pH 8,6) beschichtet (50 µl/Vertiefung). Mu-9 ist ein monoklonaler IgG&sub1;k-Antikörper, der gegen das kolonspezifische Antigen-p gerichtet ist. Im Anschluß an eine Nachbeschichtung mit Rinderserumalbumin (BSA) (1 % in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) enthaltend 0,05% Tween-20) wird Pavian-Ab2, mit PBS-BSA-Tween auf verschiedene Konzentrationen verdünnt, für zwei Stunden bei Raumtemperatur zugesetzt (50 µl/Vertiefung). Nach einem Waschen wird Peroxidase-konjugierter Maus- Anti-Mensch-Immunglobulin IgG (Jackson-Immunoresearch, West Grove, PA, 1/10.000 in PBS-BSA-Tween) für zwei Stunden bei Raumtemperatur zugesetzt. In Pilotexperimenten ist bestimmt worden, das handelsüblich erhält liche Anti-Mensch-Immunglobulin-Reagenzien für den Nachweis von Pavian- Antikörpern geeignet sind. Nach ausgedehnten Waschschritten wird 100 µl Substrat (o-Phenylendiamin 0,4 mg/ml, H&sub2;O&sub2; 0,012% in Zitrat-Phosphat- Puffer, pH 5) zu jeder Vertiefung zugesetzt und die optische Dichte wird nach 20 Minuten bei 450 nm unter Verwendung eines kinetischen Mikrotiterplatten-Ablesegerätes (Molecular Devices, Pab Alto, CA) abgelesen.
Die Assays bestätigen, daß Pavian-Ab2 nur mit NP-4 und nicht mit den Kontroll-Antikörpem gleichen Isotyps, NP-3 oder Mu-9, reagiert. Auf ähnliche Weise zeigt Pavian-Ab2 praktisch keine Bindung, wenn er gegen andere irrelevante monoklonale Antikörper verschiedener Isotypen getestet wird. Somit sind die Ab2-Antikörper spezifisch für NP-4.

Beispiel 3

Inhibierung der Bindung von Pavian-Ab2-Antikörpern an CEA

Anti-Idiotyp-Antikörper sind gegen Determinanten in den variablen Regionen des Antikörper-Moleküls gerichtet, aber diese idiotypischen Determinanten können oder können auch nicht innerhalb der Antigen-Kombinierungsstelle des Antikörper-Moleküls lokalisiert sein sein. Definitionsgemäß muß ein Ab2-Molekül, das auf funktionelle Weise das ursprüngliche Antigen imitiert, eine Determinante innerhalb der Antigen-Kombinierungsstelle erkennen und sollte deshalb die Bindung zwischen Ab1 und dem ursprünglichen Antigen inhibieren.
Ein kompetitiver ELISA wird eingesetzt, um zu bestimmen, ob die Pavian-Ab2-Antikörper an eine Determinante, die sich innerhalb der Kombinierungsstelle des NP-4 befindet, bindet. Der kompetitive ELISA wird wie folgt durchgeführt: Pavian-Seren, 1/10 in PBS-BSA-Tween verdünnt, werden für 2 Stunden auf CEA-beschichtete Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatten gegeben (50 µl/Vertiefung). Nach einem Waschen wird biotynilierter NP-4 (0,025 µg/ml) für 30 Minuten auf die Platten gegeben, gefolgt von Streptavidin-peroxidase (0,05 µg/ml) für eine Stunde. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von Substrat, wie für Beispiel 2 beschrieben, sichtbar gemacht. Ein biotinylierter Anti-CEA-NP-3 wird als eine Kontrolle eingesetzt, während eine Vorinkubation mit normalen Pavian-Immunglobulinen als eine weitere Kontrolle verwendet wird.
Die Vorinkubation mit Pavian-Ab2 inhibierte praktisch völlig die Bindung von NP-4 an CEA. Pavian-Ab2 beeinträchtigte nicht die Bindung von NP-3 an CEA und normale Pavian-Immunglobuline inhibierten nicht die Bindung von NP-4 an CEA. Die Assays zeigen, daß diese Inhibition spezifisch ist.

Beispiel 4

Krebstherapie

Eine 40 Jahre alte Patientin mit einem rezidivierenden Tumor des Colonaszendens und Metastasen an mehreren Lappen der linken Lunge und mehreren Stellen in der Leber, hat einen erhöhten CEA-Titer. Sie wird in die linke Gesäßbacke mit einem Gemisch von 1 mg Pavian-Ab2-CEA-imitierendem Antikörper, der gemäß Beispiel 1 erzeugt wurde, in einem Adjuvanspräparat, das 0,1 ml BCG (Litton Bionetics) enthält, I.D. injiziert. Die Immunisierung wird für drei Wochen in wöchentlichen Intervallen wiederholt. Das BCG wird bei der dritten Injektion weggelassen. Eine 50 ml-fassende Probe von Gesamtblut wird vor dem Beginn der Behandlung, eine Woche nach jeder Injektion und monatlich danach, entnommen und die CEA-Titer werden bestimmt. Sechs Wochen später wird die Patientin auf ihre Reaktivität gegenüber sowohl CEA als auch Pavian-Ab2 hin getestet. Es wird ein signifikant höherer Reaktionsspiegel festgestellt.
Nach einem Induktionszeitraum von 6-20 Wochen im Anschluß an die Beendigung des Immunisierungsprotokolls ist der CEA-Titer der Patientin signifikant verringert und es wird eine partielle Regression der Tumoren beobachtet.
Einem anderen Patienten wird eine Pavian-Ab2-Antikörper-Vakzine in einem ähnlichen Immunisierungsprotokoll verabreicht, mit der Ausnahme, daß es sich bei der dritten Injektion um gereinigtes CEA anstelle von Ab2 handelt. Die Titer der Anti-CEA-Antikörper sind bei den beiden Patienten vergleichbar und es wird auch eine partielle Tumorregression bei dem zweiten Patienten beobachtet.

Beispiel 5

Herstellung eines Pavian-Anti-HIV-1-Ab2-Antikörpers

Pristan-stimulierte BALB/c-Mäuse wurden wiederholt mit dem Hüll- Glycoprotein gp120 des menschlichen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1), in komplettem Freundschem Adjuvans, immunisiert. Nach mehreren Wochen werden die Mäuse getötet, ihre Milz wird herausgeschnitten und die Milzzellen werden entfernt und gewaschen. Es wird die Fusion der Milzzellen mit Maus-Myelom-Zellen bewirkt und die resultierenden Hybridome werden selektiert und für die Erzeugung und Sekretion von monoklonalen Anti-HIV- 1-Antikörpern, die spezifisch an gp-120 binden, selektiert und kloniert.
Die monoklonalen Anti-HIV-1-Idiotyp-Antikörper werden verwendet, um Paviane zur Erzeugung von Ab2-Antikörpern zu immunisieren, in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Beispiel 1. Das Antiserum wird weiter durch Adsorption an eine Säule mit gebundenem Antikörper des gleichen Isotyps wie des Ab2, aber anderer Spezifität, weiter gereinigt. Die Immunspezifität des affinitätsgereinigten Ab2-Präparats wird durch Verfahren bestätigt, die zu denen von Beispielen 2 und 3 analog sind.

Beispiel 6

AIDS-Immunität

Eine Testgruppe von 20 intravenöse Drogen konsumierenden Männern, die einen negativen Test auf HIV-1-Antikörper besitzen, werden in zwei gepaarte Untergruppen aufgeteilt. Die Mitglieder der ersten Gruppe werden jeweils mit dem affinitätsgereinigten Ab2-Präparat gemäß Beispiel 5 unter Anwendung eines ähnlichen Immunisierungsprotokolls wie in Beispiel 4 immunisiert, mit der Ausnahme, daß Auffrischinjektionen von gp120 in Viermonatsintervallen während des Testzeitraums verabreicht werden. Die Mitglieder der zweiten Untergruppe erhalten keine Injektionen.
Die Mitglieder jeder Gruppe werden drei Jahre beobachtet und periodisch auf Anti-HIV-Serum-Antikörper und die Entwicklung von ARC- und AIDS-Symptomen hin untersucht. Nach drei Jahren sind sieben Mitglieder der zweiten Gruppe seropositiv und zwei entwickeln die frühen Symptome von AIDS. Ein Mitglied der ersten Gruppe wird innerhalb von zwei Wochen nach dem Ende des Immunisierungsprogramms seropositiv, was darauf hindeutet, daß er zu Beginn des Versuches auf nicht nachweisbare Weise infiziert ist.. Die übrigen Mitglieder der ersten Gruppe entwickeln innerhalb von 6-20 Wochen nach dem Ende des Immunisierungsprogramms Anti-HIV- Antikörper, entwickeln aber keine AIDS-Symptome während des dreijährigen Beobachtungszeitraums. Ihre Antikörpertiter bleiben während des Testzeitraums erhöht.

Beispiel 7

Antivirale Therapie

Es werden monoklonale Maus-Antikörper gegen das Cytomegalievirus- (CMV)-Hüllprotein erzeugt und verwendet, um einen Pavian zu immunisieren. Es wird ein Ab2-Antiserum entnommen, gereinigt und auf analoge Weise zu den Verfahren nach Beispielen 1-3 auf seine Spezifität hin überprüft. Einem drei Jahre alten männlichen Patienten mit einer Diagnose von krankhaften Cytomegalie-Einschlüssen in einem frühen Stadium werden unter Anwendung eines Protokolls, das dem von Beispiel 4 ähnlich ist, Injektionen des Pavian-Ab2-Antiserums verabreicht. Acht Wochen nach dem Ende des Immunisierungsprogramms hat der Patient einen hohen Titer von Anti-CMV- Antikörpern entwickelt und seine Symptome sind auf signifikante Weise weniger schlimm.

Beispiel 8

Antimalaria-Therapie

Monoklonale Maus-Antikörper gegen Merozoiten und Sporozoiten von Plasmodium falciparum werden gemäß dem Verfahren nach Beispiel 6 der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/399,566, die dem US-Patent 5,332,567 entspricht, hergestellt. Kurz gesagt, es werden Milzzellen von hyperimmunisierten Mäusen mit Myelom-Zellen fusioniert und Hybridome, die spezifische Antikörper sekretieren, werden selektiert und kloniert. Die Antikörper gehören zu der IgG&sub1;-Subklasse. Ein Gemisch von Anti-Merozoiten- und Anti-Sporozoiten-Antikörpern wird in einen Pavian injiziert und ein Ab2-Antiserum wird entnommen, gereinigt und auf seine Spezifität wie in den obigen Beispielen 1-3 durchgemustert.
Eine 37 Jahre alte Patientin, die an einem sehr frühen Stadium von P. falciparum-Malaria leidet und leichten Schüttelfrost und Fieber zeigt, erhält eine Injektion mit dem Pavian-Antiserum gemäß einem Immunisierungsprotokoll, das zu dem des obigen Beispiels 4 analog ist. Die Gegenwart von Merozoiten in dem Blut der Patientin ist zu Beginn der Behandlung nachweisbar. Innerhalb von zwei Wochen nach dem Ende des Immunisierungsprogramms ist der Anti-Merozoiten-Antikörper-Titer der Patientin hoch, und innerhalb einer weiteren Woche ist die Gegenwart von Merozoiten in ihrem Blut nicht länger nachweisbar. Die Krankheit schreitet nicht zum reifen erythrozytischen Stadium fort, das Fieber der Patientin sinkt und es treten keine weiteren Krankheitssymptome auf. Periodische Auffrischinjektionen mit Ab2-Antiserum in Dreimonatsintervallen über insgesamt ein Jahr halten den Anti-Merozoiten-Antikörper-Titer aufrecht und die Patientin ist für diese Zeit frei von Symptomen, ohne ein nachfolgendes Wiederauftreten, wenn die Auffrischinjektionen eingestellt werden.
Zum Beispiel können analoge Antiseren gegen Idiotypen, die spezifisch sind für therapeutisch sensitive Epitope auf anderen Tumor- oder Pathogen- Antigenen, erzeugt und verwendet werden, um eine vorbeugende Immunität oder eine therapeutische Immunantwort unter Anwendung von Verfahren bereitzustellen, die denen der vorhergehenden Beispiele analog sind. Es können ebenfalls Antikörperfragmente und/oder antikörperartige Konstrukte verwendet werden, um ein Antigen in einer Vakzine zu imitieren, um Antikörper für eine therapeutische oder vorbeugende Verwendung zu erzeugen.

Claims

1. Verwendung einer immuflogenen Menge eines Pavian-Anti-Idiotyp-Antikörpers oder -Antikörperfragments, das als eine immunogene funktionale Imitation eines Antigens wirkt, das von einer malignen Zelle oder einem infektiösem Agens erzeugt wird oder mit dieser/m assoziiert ist, in Kombination mit einem physiologisch verträglichem Vakzine-Vehikel, zur Herstellung einer Anti-Tumor- oder Anti-Pathogen-Vakzine zur Verwendung in einem Verfahren zur Stimulation einer Immunantwort gegen maligne Zellen oder ein infektiöses Agens bei einem Menschen, wobei die Vakzine an einen Menschen verabreicht wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Pavian-Anti-Idiotyp-Antikörper oder das -Antikörperfragment als eine immunogene funktionale Imitation eines Epitopes aut dem Anligen wirkt, das im wesentlichen spezifisch für die maligne Zelle oder das infektiöse Agens ist.

3. Anti-Tumor- oder Anti-Pathogen-Vakzine enthaltend eine immunogene Menge eines Pavian-Anti-Idiotyp-Antikörpers oder -Antikörperfragments, der/das als eine immunogene funktionale Imitation eines Antigens wirkt, das von einer malignen Zelle oder einem infektiösen Agens erzeugt wird oder mit dieser/m assoziiert ist, und ein physiologisch verträgliches Vakzine-Vehikel.

4. Vakzine nach Anspruch 3, wobei das Vakzine-Vehikel eine wirksame Menge eines Immunostimulans-Adjuvans enthält.

5. Vakzine nach Anspruch 4, wobei das Adjuvans mindestens ein Mitglied ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Freundschem Adjuvans, Alaun, Bacillus Calmette-Guerin und Tetanus-Toxoid besteht.

6. Vakzine nach einem der Anspruche 3-5, die weiterhin das Antigen enthält.

7. Vakzine nach einem der Anspruche 3-6, wobei das Antigen durch einen Virus, einen infektiösen Mikroorganismus ausgewählt aus Bakterien, Rickettsien, Mycoplasma, Protozoen und Pilzen, oder einen infektiösen Parasiten erzeugt wird oder mit diesem assoziiert ist.

8. Vakzine nach einem der Ansprüche 3-6, wobei das Antigen durch einen malignen festen Tumor oder ein hämatopoietisches Neoplasma erzeugt wird. der/das eine Gastromtestinal-, Lungen-, Brust-, Prostata-, Ovarial-, Testikular-, Hirn- oder eine Lymph-Läsion, eine Sarkom- oder eine Nielanom-Läsion ist.

9. Vakzine nach einem der Anspruche 3-6, wobei der Pavian-Anti-Idiotyp- Antikörper oder das -Antikörperfragment als eine immunogene Imitation eines Epitops auf dem karzinoembryonalen Antigen wirkt, das weder mit dem unspezifischen kreuzreagierenden Antigen oder dem Mekonium- Antigen geteilt wird.