DE3840968C2

DE3840968C2 -

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Publication number: DE3840968C2
Application number: DE19883840968
Authority: DE
Inventors: Volker Prof. Dr. 3000 Hannover De Moennig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-12-05
Filing date: 1988-12-05
Publication date: 1990-10-04
Also published as: DE3840968A1

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebenen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper, die ein Epitop eines Infektionserregers imitieren, das genetisch konserviert ist, nur bei Serotypen diese Infektionserregers vorkommt, dazu in der Lage ist, im natürlichen Wirt die Bildung von Antikörpern zu induzieren, und das Teil eines immundominanten Antigens ist. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen des Anspruchs 1.

Ferner betrifft die Erfindung nach den Ansprüchen 4 und 5 Verfahren zur Herstellung der genannten monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper und nach den Ansprüchen 6 bis 9 ihre Verwendung als diagnostisches Antigen, z. B. in einem diagnostischen Besteck (Kit) zum Nachweis von gegen einen Infektionserreger gerichteten Antikörper in einer Probe, beispielsweise in einer Serumprobe.

In der Human- und Tiermedizin spielt die serologische Diagnostik beim Nachweis von Erregern von Infektionskrankheiten eine wichtige Rolle. Allerdings sind die üblichen Verfahren mit dem Nachteil verbunden, daß man dabei bisher zum Nachweis von Antikörpern im Serum als Antigen den Erreger selbst oder nur in aufwendiger Weise aus ihm isolierbare Bestandteile verwenden mußte. Häufig ist sogar der Umgang mit den zum Nachweis benötigten Krankheitserregern aus seuchenhygienischen Gründen verboten, beispielsweise im Falle der afrikanischen Schweinepest, der Rinderpest oder der Maul- und Klauenseuche.

Somit liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, als Antigen beim Nachweis von Infektionserregern geeignete Stoffe bereitzustellen, die ohne Infektionsrisiko in wirtschaftlicher Weise verwendet werden können.

Dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper gelöst, die die bisher in der Diagnostik verwendeten üblichen Antigene ersetzen können.

Der Idiotyp eines Antikörpers ist definiert als eine antigene Determinante aus dem variablen Bereich des Immunglobulinmoleküls (Fab-Bereich). Innerhalb dieses Fab-Bereichs befindet sich der Teil des Antikörpers, der spezifisch an das Antigen bindet. Dieser Bereich des Moleküls stellt gewissermaßen einen Negativabdruck eines Teils des Antigens dar, d. h. des Epitops, und wird als Paratop bezeichnet. Bei der Verabreichung von heterologen Immunglobulinmolekülen an ein Tier wirkt das heterologe Immunglobulinmolekül als Antigen und induziert die Bildung von Antikörpern. Dabei werden auch gegen das Paratop gerichtete Antikörper gebildet, die man als anti-idiotypische Antikörper bezeichnet; vgl. Uyt de Haag et al., Immunol. Reviews 90 (1986), Herlyn et al., Science 232 (1986), S. 100-102. Einige der anti-idiotypischen Antikörper sind Abbilder des ursprünglichen Epitops, d. h. sie imitieren hinsichtlich ihrer Struktur das Antigen. Solche anti-idiotypischen Antikörper wurden bereits in verschiedenen Systemen zur Immunisierung gegen Infektionserreger oder gegen Tumorzellen verwendet. Der Vorteil dieser Art der aktiven Immunisierung besteht darin, daß risikolose Impfungen ohne Verwendung der eigentlichen Infektionserreger erfolgen können; vgl. Kennedy et al., Bio Technique 3 (1985), S. 404-408, Kennedy et al., Prog. med. Virol. 31 (1985), S. 168-182, und Reagan et al., J. Virol. 48 (1983), S. 660-666.

Jedoch wurde bisher nicht die erfolgreiche Verwendung von monoclonalen anti-idiotypischen Antikörpern zur zuverlässigen Diagnose verschiedener Serotypen eines Infektionserregers beschrieben. In Kaaden, Der praktische Tierarzt 9 (1987), S. 52-58 wurde zwar die grundsätzliche Eignung von anti-idiotypischen Antikörpern für diagnostische Zwecke angedeutet. Jedoch wurde nicht beschrieben, welche speziellen Merkmale anti-idiotypische Antikörper aufweisen müssen, um eine zuverlässige Diagnose verschiedener Serotypen eines Infektions erregers zu ermöglichen, ohne daß dabei Kreuzreaktionen mit anderen Infektionserregern auftreten und somit "falsch positive" Ergebnisse auftreten.

Die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper gestatten eine derartige zuverlässige Diagnose. Sie sind nämlich in der Lage, ein Epitop eines Erregers zu imitieren, das die folgenden Merkmale aufweist:

(a) es ist genetisch konserviert;
(b) es kommt nur bei Serotypen dieses Infektionserregers vor;
(c) es ist dazu in der Lage, im natürlichen Wirt die Bildung von Antikörpern zu induzieren; und
(d) es ist Teil eines immundominanten Antigens.

Die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper sind beispielsweise zur Diagnose folgender Infektionen geeignet:

Virusinfektionen:
Humanpathogene Lentiviren (HIV 1 und HIV 2),
Rubella,
Europäische Schweinepest (ESP),
Afrikanische Schweinepest,
Rinderpest,
Rinder-Herpesvirus 1 (IBR/IPV),
Schweine-Herpesvirus 1 (Aujeszkysche Krankheit),
Enzootische Rinderleukose ("Bovine Leukemia", BLV),
Katzenleukämie (Feline Leukemia, FeLV),
Katzen-Lentiviren (FIV/FTLV),
Infektiöse Katzenperitonitis (FIP),
Infektiöse Anämie der Einhufer (Equine infectious anemia, EIA),
Lentiviren der Schafe und Ziegen (Maedi/Visna, CAE),
Bluetonge,
Pferde-Herpesvirus, 1
Pferde Arthritis,
Parvovirusinfektionen von Haus- und Nutztieren,
Infektionen mit Pockenviren,
Respiratorische Syncytialviren von Mensch und Rind.

Bakterielle Infektionen:
Brucellosen des Menschen, der Rinder, Schafe und Schweine (Brucella abortus, -suis, -melitensis),
Mycobakterien des Geflügels, des Rindes und des Menschen,
Salmonellosen,
Pasteurellosen.

Parasitäre Erkrankungen:
Toxoplasmose,
Trichinose des Schweines,
Sarkosporidiose.

In einer bevorzugten Ausführungsform imitiert der erfindungsgemäße monoclonale anti-idiotypische Antikörper ein Epitop des Virus, das die Europäische Schweinepest (ESP) hervorruft.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der monoclonale anti-idiotypische Antikörper ein Maus-Antikörper.

Die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper lassen sich durch ein Verfahren herstellen, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:

(a) Immunisierung eines Versuchstieres mit dem Infektionserreger und Herstellung monoclonaler, gegen den Infektionserreger gerichteter Antikörper in an sich bekannter Weise;
(b) Absuchen der erhaltenen monoclonalen Antikörper mit einer repräsentativen Reihe unterschiedlicher Serotypen des Infektionserregers und Auswahl der mit allen Serotypen reagierenden monoclonalen Antikörper;
(c) Absuchen der in (b) erhaltenen monoclonalen Antikörper mit verwandten Infektionserregern und Auswahl der mono clonalen Antikörper, die keine Kreuzreaktion zeigen;
(d) Durchführung von Kompetitionstests mit den in (c) erhaltenen monoclonalen Antikörpern und gegen den Infektionserreger gerichteten polyclonalen Antikörper und Auswahl der mit den polyclonalen Antikörpern kompetierenden monoclonalen Antikörper;
(e) Herstellung der in (d) erhaltenen monoclonalen Antikörper in größeren Mengen in an sich bekannter Weise und affinitätschromatographische Reinigung;
(f) Vernetzung der monoclonalen Antikörper aus (d), vorzugsweise mit Glutaraldehyd;
(g) mehrfache Immunisierung eines Tieres mit den monoclonalen Antikörpern aus (f) und Herstellung von monoclonalen Antikörpern in an sich bekannter Weise; und
(h) Selektion monoclonaler anti-idiotypischer Antikörper.

Durch die Selektion in Stufe (b) des vorstehend genannten Verfahrens werden monoclonale Antikörper ausgewählt, die mit allen geprüften Varianten, Typen oder Subtypen, d. h. mit allen Serotypen, des Infektionserregers reagieren. Somit ist davon auszugehen, daß diese monoclonalen Antikörper gegen konservierte Epitope des Infektionserregers gerichtet sind. Durch die Selektion in Stufe (c) des Verfahrens werden monoclonale Antikörper ausgesondert, die eine Kreuzreaktion mit verwandten Infektionserregern aufweisen und somit nicht zur Herstellung erfindungsgemäßer monoclonaler anti-idiotypischer Antikörper geeignet sind, bei deren Verwendung in der Diagnose keine "falsch positiven" Ergebnisse auftreten sol len.

Durch die Selektion in Stufe (d) sollen monoclonale Antikörper ausgewählt werden, die gegen ein Epitop gerichtet sind, das im natürlichen Wirt des Infektionserregers die Bildung von Antikörpern induziert, also immunogen ist. Die Immunoge nität des Epitops ist dadurch erkennbar, daß es nicht nur mit den monoclonalen, sondern auch mit den polyclonalen Antikörpern reagiert. Wenn bei der wiederholten Herstellung von monoclonalen Antikörpern monoclonale Antikörper gefunden werden, die gegen die vorstehend beschriebenen Epitope gerichtet sind, ist davon auszugehen, daß es sich bei den immunogenen Epitopen um immundominante Epitope handelt.

Die affinitätschromatographische Reinigung der monoclonalen Antikörper in Stufe (e) kann beispielsweise mit Sepharose G erfolgen.

Das vorstehend in allgemeiner Form beschriebene Verfahren wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die monoclonalen Antikörper bei der Vernetzung in Stufe (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens an ein Makromolekül, vorzugsweise an KLH (Keyhole limpet hemocyanin) gebunden. Neben KLH kommen als Makromoleküle auch Rinderserumalbumin, Ovalbumin oder hoch molekulare Kohlenhydrate in Frage.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper als diagnostisches Antigen.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper zur Verbesserung der Diagnoseergebnisse nach der Bindung an ein Makromolekül und/oder an ein Trägermaterial mit einem Serum, vorzugsweise mit Pferde- oder Mausserum vorinkubiert. Dadurch werden beispielsweise unspezifische Bindungsstellen am Trägermaterial, z. B. an Mikrotiterplatten abgesättigt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper zur Verbesserung der Diagnoseergebnisse etwa 1 : 2000 mit einer geeigneten Pufferlösung, wie PBS verdünnt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper zur leichteren Handhabung bei der Diagnose an ein festes Trägermaterial gebunden, beispielsweise an Kunststoff, Nitrocellulose oder an Dextrankugeln.

Die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper können z. B. in diagnostischen Bestecken (Kits) zum Nachweis von gegen einen Infektionserreger gerichteten Antikörpern in einer Probe verwendet werden. Diese diagnostischen Bestecke enthalten

(a) mindestens einen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der (die) an ein Trägermaterial, vorzugsweise an Kunststoff, Nitrocellulose oder an Dextrankugeln gebunden ist (sind);
(b) markierte mono- oder polyclonale Antikörper, die gegen Immunoglobuline der Tierart gerichtet sind, aus der die zu untersuchende Serumprobe stammt;
(c) ein fluorogenes oder chromogenes Substrat;
(c) eine Stoplösung.

Die Antikörper können mit einem Enzym markiert sein, vorzugsweise mit einer Peroxidase, einer Phosphatase oder einer Galaktosidase oder mit Biotin, wobei zusätzlich Streptavidin enthalten ist.

Die Antikörper können auch radioaktiv markiert sein.

Als Stoplösung in den diagnostischen Bestecken läßt sich beispielsweise bei Enzym-Substratreaktionen mit Peroxidase, 4 bis 5 M Schwefelsäure oder eine 1-5%ige Natriumazid-Lösung verwenden.

Zur Gattung Pestivirus der Familie der Togaviren gehören die Viren der Europäischen Schweinepest (ESP), der Rinder-Virusdiarrhoe (BVD) und der "Border Disease" (BD) der Schafe; vgl. Horzinek "Non-arthropod-borne togaviruses", 1981, Academic Press. Alle drei Viren beeinträchtigen weltweit die Viehzucht. Sie ähneln sich morphologisch und zeichnen sich durch ausgedehnte serologische Kreuzreaktionen untereinander aus; vgl. Darbyshire, Vet. Rec. 72 (1960), S. 331. Dadurch, daß sich die Viren nicht nur in ihren natürlichen Wirten, sondern auch in heterologen Wirten vermehren können, führt die serologische Kreuzreaktion zu erheblichen Schwierigkeiten bei der serologischen Diagnose. So müssen z. B. positive Reaktionen gegen das Virus der ESP in Schweineseren erst mit BVD-Virus überprüft werden, um in den bisher bekannten Tests zu einer sicheren diagnostischen Aussage zu gelangen. Darüber hinaus ist die bisher erforderliche Präparation von Pestivirus-Antigenen schwierig und kosten intensiv.

Vor kurzem wurde beschrieben, daß die nicht-strukturellen Proteine von Pestiviren strukturell hoch konserviert und wahrscheinlich hauptverantwortlich für die serologischen Kreuzreaktionen innerhalb der Gattung Pestivirus sind; vgl. Moennig et al., Deutsche tierärztliche Wochenschrift 94 (1987), S. 572-576 und Moennig et al., "Monoclonal antibodies against bovine viral diarrhea virus: Production and characterization" Vth Annual Meeting of the American Society for Virology, 1986, University of California, Santa Barbara. In weiteren Versuchen wurde festgestellt, daß es auch Epitope in einem viralen Hüllglykoprotein dieser Viren gibt, die spezifisch für das ESP-Virus sind und nicht mit anderen Pestiviren kreuzreagieren; vgl. Moennig et al. 1987, a. a. O., Hess et al., Vet. Microbiol., 16 (1988), S. 315- 321.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Nachweis von ESP-Virus-spezifischen Antikörpern in Schweineseren.

Nr. 0431:
positives Hyperimmunserum,
Nr. 188/83:	positives Referenzserum,
Nr. 1/101:	negatives Serum,
Nr. 81:	negatives Serum.

Fig. 2: Nachweis von ESP-Virus-spezifischen Antikörpern in Schweineseren.
Gezeigt werden die Ergebnisse eines ELISA, bei dem die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper mit Pferde- bzw. Mausserum vorinkubiert wurden. Getestet wurden die Seren 0431 (positives Hyperimmunserum) und 81 (negatives Serum). Ein Vergleich mit den in Fig. 1 dargestellten Ergebnissen zeigt, daß durch die Vorinkubation unspezifische Hintergrundreaktionen stark reduziert werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung und Charakterisierung monoclonaler Antikörper gegen ESP-Virus-spezifische Epitope 1. Herstellung monoclonaler Antikörper gegen das ESP-Virus

Zur Produktion monoclonaler Antikörper werden Balb/c-Mäuse mit vorgereinigtem und konzentriertem ESP-Virus (Stamm Alfort/187) sechsmal in wöchentlichen Abständen durch intraperitoneale Injektion immunisiert. Drei Tage nach der letzten Immunisierung werden die Milzzellen der Tiere nach der von Köhler et al., Europ. J. Immunol. 6 (1976), S. 292-295, beschriebenen Methode mit NS-1 Myelomzellen fusioniert; vgl. Peters et al., Vet. Microbiol. 12 (1986), S. 195-200.

2. Identifizierung ESP-Virus-spezifischer monoclonaler Antikörper

Monoclonale Antikörper in den Überständen von Hybridzellkolonien werden in einem modifizierten Neutralisationstest auf PK-15-Zellen in Mikrotiterplatten nachgewiesen; vgl. Holm Jensen, Acta Vet. Scand. 22 (1981), S. 85 bis 98. Die Neu tralisationsreaktionen werden mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenztechnik und mit einem indirekten Enzymimmuntest auf virusinfizierten PK-15-Zellen bestätigt. Nicht infizierte PK-15-Zellen dienen als Kontrolle. Sodann werden drei Hybridzellen durch wiederholtes Reclonieren stabilisiert und die von ihnen sezernierten monoclonalen Antikörper HC/C34, HC/C36 und HC/C37 werden näher charakterisiert.

3. Charakterisierung ESP-Virus-spezifischer monoclonaler Antikörper

Die drei vorstehend genannten monoclonalen Antikörper neutralisieren zahlreiche Serotypen des ESP-Virus. Tabelle I zeigt das Neutralisationsspektrum der monoclonalen Antikörper mit 14 verschiedenen ESP-Virusstämmen. Die monoclonalen Antikörper HC/C34 und HC/C37 neutralisieren jeden Virusstamm. Bezüglich der Titerhöhen gibt es keine größeren Schwankungen. In einer ergänzenden Untersuchung läßt sich zeigen, daß die beiden Antikörper HC/C34 und HC/C37 mit etwa 100 weiteren ESP-Virusstämmen bzw. ESP-Virusisolaten reagieren; vgl. Hess et al., Vet. Microbiol. 16 (1988), S. 315-321. Der monoclonale Antikörper HC/C36 zeigt ein etwas eingeschränkteres Reaktionsspektrum. Kreuzreaktionen mit anderen Pestiviren (BVD- bzw. BD-Virus) werden nicht festgestellt. Aus diesen Befunden ergibt sich, daß die monoclonalen Antikörper Epitope erkennen, die nicht auf anderen Pestiviren vorkommen und die innerhalb der ESP-Viren hoch konserviert sind. Die Ergebnisse sind nachstehend in den Tabellen I und II zusammengefaßt.

Tabelle I

Ergebnisse des Neutralisationstests

Tabelle II

Ergebnisse des enzymimmunologischen Bindungstests

Beim Bindungstest werden zunächst suszeptible Zellen in Mikrotiterplatten gezüchtet. Sodann erfolgt die Infektion der Zellen mit ESP-Virus. 48 Stunden nach der Infektion werden die Zellen mit PBS gewaschen und 1 Stunde bei 80°C fixiert. Sodann erfolgt eine 1stündige Inkubation der Zellen mit den monoclonalen Antikörpern bei Raumtemperatur. Danach werden die monoclonalen Antikörper abgewaschen und die Zellen mit anti-Maus-IgG (Biotin-markiert) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und das Biotin-Konjugat wird abgewaschen. Die Zellen werden mit Biotin-Streptavidin-Peroxidase- Komplexen 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und die Komplexe werden abgewaschen. Anschließend wird das Substrat AEC (3-Amino-9-äthyl carbazol) zugegeben.

Außerdem werden mit den gereinigten monoclonalen Antikörpern Kompetitionstests durchgeführt. Dabei werden suszeptible Zellen in Mikrotiterplatten angezüchtet und mit dem homologen ESP-Virus (Alfort) infiziert. 48 Stunden nach der Infektion werden die Zellen mit PBS gewaschen und 1 Stunde bei 80°C fixiert. Danach erfolgt eine 1stündige Inkubation der Zellen mit den monoclonalen Antikörpern bei Raumtemperatur. Es wird eine Verdünnungsreihe der nicht markierten monoclonalen Antikörper zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die monoclonalen Antikörper werden abgewaschen und ein homologer bzw. heterologer, gereinigter und mit Peroxidase markierter monoclonaler Antikörper wird zugegeben. Es wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird der monoclonale Antikörper abgewaschen und das Substrat AEC zugegeben. Wenn eine Farbreaktion erfolgt, interferieren die Antikörper bei ihrer Bindung nicht und erkennen somit unterschiedliche Epitope. Eine weitere Beschreibung des Kompetitionstests findet sich in Moennig et al., (1986), a. a. O. Die Ergebnisse der Kompetitionstests sind nachfolgend in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Ergebnisse der Kompetitionstests zwischen Peroxidase-markierten (. . -PO) und unmarkierten Antikörpern

Die in Tabelle III zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß die drei monoclonalen Antikörper verschiedene Epitope des ESP-Virus erkennen.

Western Blot-Analysen (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 4350-4354) zeigen, daß die Antikörper mit einem viralen Hüllglykoprotein reagieren. Bei diesen Versuchen läßt sich feststellen, daß eine positive Reaktion nur zu erreichen ist, wenn das ESP-Virus unter nicht reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt wird. Eine Reduktion der Virus-Präparation zerstört offenbar die an den Immunreaktionen beteiligten Epitope. Daher wird vermutet, daß die in Frage kommenden Epitope nicht linear, sondern eher konformationsspezifisch sind.

Beispiel 2 Herstellung und Charakterisierung von monoclonalen anti- idiotypischen Antikörpern gegen ESP-Virus-spezifische mono klonale Antikörper 1. Reinigung des Antigens

Zur Immunisierung von Mäusen wird der monoclonale Antikörper HC/C37 in Serum-freiem Medium hergestellt und durch eine Af finitätschromatographie an Sepharose G gereinigt. Die Antikörperpräparationen sind elektrophoretisch rein, haben einen Proteingehalt von 1,2 mg/ml und einen Titer von 1 : 256 000 im Bindungstest auf ESP-Virus-infizierten PK-15-Zellen. Ein Teil der Präparation wird mit KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) gekoppelt und zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Die Kopplung der Antikörper erfolgt dabei mit Glutaraldehyd. Zu diesem Zweck werden die gereinigten Antikörper gegen Phosphatpuffer, pH 8,7, dialysiert und mit 5 mg KLH pro 1 mg Antikörper versetzt. Ferner werden gleiche Teile 0,05 M Glutaraldehyd zugegeben. Sodann wird 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und gegen PBS dialysiert. Der Rest der Präparation wird mit Peroxydase konjugiert und zum Nachweis der monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper verwendet. Die Konjugation mit Peroxidase erfolgt im wesentlichen wie von Boorsma et al., in J. Immunol. Meth. 30 (1979), S. 245 beschrieben. Dabei werden 4 mg Peroxidase in 1 ml H₂O bidest gelöst und zur Aktivierung 0,2 ml frisch angesetzte 0,1 M Natriumperjodatlösung zugegeben. Es wird 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sich die Lösung grünlich braun verfärbt. Sodann wird über Nacht gegen 0,001 M Acetatpuffer, pH 4,4, dialysiert. Der pH-Wert der aktivierten Peroxidase wird mit 1 M Carbonatpuffer auf 9,5 eingestellt. Danach wird eine Suspension der Antikörper, enthaltend 4-10 mg Protein in 1-5 ml Puffer, pH 8-8,5, zugegeben und nach erneuter Kontrolle des pH-Wertes wird 2 Stunden unter langsamem Rühren bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach der auf diese Weise durchgeführten Kopplung wird das Reaktionsgemisch mit 50 µl frisch angesetzter Natriumborhydrid- Lösung (4 mg/ml) versetzt. Das freie Enzym wird 2 Stunden bei +4°C reduziert. Nach der Dialyse gegen 1/10 PBS werden zur Konservierung 10 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,001% Thimerosal zugegeben. Das Konjugat wird portioniert und bei -20°C aufbewahrt.

2. Immunisierung von Mäusen

Zur Herstellung monoklonaler Antikörper werden Mäuse mit dem gereinigten und an KLH gekoppelten Antikörper HC/C37 sechsmal in wöchentlichen Abständen durch intraperitoneale Injektion immunisiert. Dabei werden Mäuse mit der Robertson′schen Chromosomen-Translokation 8.12 verwendet. 3 Tage nach der letzten Immunisierung werden die Milzzellen der Tiere mit FOX-NY-Myelomzellen (Taggart and Samloff, Science 219 (1983), S. 1228-1230) nach der von Köhler et al., a. a. O., beschriebenen Methode fusioniert; vgl. auch Peters et al., a. a. O. Bei der Immunisierung können auch andere Mäuse und Myelomzellen verwendet werden.

3. Identifizierung der monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper

Die Identifizierung der monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper in den Überständen von Hybridomzellkulturen erfolgt mit Hilfe eines ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Zu diesem Zweck werden anti-Maus-IgG-Antikörper an die Mikrotiterplatten gekoppelt. Im vorliegenden Fall handelt es sich dabei um Ziegenantikörper, die durch eine Affinitäts chromatographie an Maus-IgG-Sepharose gereinigt wurden. Die Überstände der Hybridkolonien werden in die Mikrotiterplatten pipettiert und 1 Stunde lang inkubiert. Nach dem Waschen der Platten werden die Reaktionsvertiefungen mit dem PO-markierten monoclonalen Antikörper HC/C37 inkubiert. Der Nachweis der Antigen-Antikörper-Bindung erfolgt mit dem Substrat ABTS (2,2′-Azino-bis(3-äthylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure). Die mit dem Test identifizierten monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper-bildenden Hybridomzellen werden durch Reclonierung stabilisiert und Aliquots davon werden bei -80°C in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

4. Reinigung der monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper

Die monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper, z. B. der Unterklasse IgG-I, werden in Serum-freiem Medium hergestellt und durch Affinitätschromatographie an Sepharose G gereinigt. Die so erhaltenen Antikörper-Präparationen sind elektrophoretisch rein.

5. Serologischer Nachweis mit Hilfe der monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper

Wie vorstehend erhaltene gereinigte anti-idiotypische Antikörper werden an die Oberfläche von Mikrotiterplatten in einer Konzentration von 8 µg/ml bei pH 7,2 und 4°C über Nacht gekoppelt. Danach werden die Platten mit 1% Pferdeserum in sterilem PBS (Phosphate buffered solution; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 23,7 NaH₂PO₄×12 H₂O, 2 g KH₂PO₄ in 1 Liter H₂O bidest) abgesättigt. Schweineseren werden auf den Testplatten, beginnend bei einer Verdünnung von 1 : 2, in Zweierverdünnungen titriert. Der Nachweis der Antigen-Anti körperkomplexe erfolgt mit einem PO-markierten Antiserum gegen Schweine-IgG (Konjugat) und ABTS als Substrat. Dabei werden zunächst 4 Seren überprüft:

Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 1 dargestellt. Die ESP-positiven Seren zeigen deutlich höhere Signale als die negativen Seren. Daraus ergibt sich, daß monoclonale anti-idiotypischen Antikörper, die ESP-Virus-spezifische Epitope mit bestimmten Merkmalen imitieren, in der Lage sind, ESP- spezifische Antikörper in Schweineseren zu erkennen.

5.1 Variation der Konzentration des Konjugates

Zur weiteren Verbesserung der Testergebnisse werden die Kon zentrationen des Konjugates zwischen 1 : 200 und 1 : 4000 variiert. Dabei erfolgt die Verdünnung des Konjugates in PBS. Mit einer Verdünnung von 1 : 2000 werden die besten Ergebnisse erzielt.

5.2 Vorinkubation des Konjugates

Zur weiteren Optimierung des Testsystems wird das Konjugat vor dem Gebrauch unverdünnt mit Pferde- bzw. Mausserum vorinkubiert. Dazu werden 100 µl Konjugat mit jeweils 1 ml Pferde- oder Mausserum gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Auf diese Weise lassen sich Testergebnisse mit sehr niedrigem unspezifischem Hintergrund erhalten, ohne daß dabei das Signal der positiven Seren vermindert wird. Dabei führt die Vorinkubation des Konjugates mit Pferde- oder Mausserum zur gleichen Reduktion des Hintergrundes. In Fig. 2 sind die Ergebnisse des optimierten Testsystems mit den Seren 0431 (positiv) und 81 (negativ) dargestellt. Dabei be trägt die Ausgangskonzentration des Serums 1 : 20. Die restliche Hintergrundreaktion läßt sich durch Zugabe geringer Mengen Mausserum zu den Testseren vor dem Test eliminieren.

Claims

1. Monoclonale anti-idiotypische Antikörper, die ein Epitop eines Infektionserregers imitieren, das die folgenden Merkmale aufweist:

2. Monoclonaler anti-idiotypischer Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Maus-Antikörper ist.

3. Monoclonaler anti-idiotypischer Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop des die europäische Schweinepest hervorrufenden Virus imi tiert.

4. Verfahren zur Herstellung von monoclonalen anti-idiotypischen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:

(a) Immunisierung eines Versuchstieres mit dem Infektionserreger und Herstellung monoclonaler, gegen den Infektionserreger gerichteter Antikörper in an sich bekannter Weise;
(b) Absuchen der erhaltenen monoclonalen Antikörper mit einer repräsentativen Reihe unterschiedlicher Serotypen des Infektionserregers und Auswahl der mit allen Serotypen reagierenden monoclonalen Antikörper;
(c) Absuchen der in (b) erhaltenen monoclonalen Antikörper mit verwandten Infektionserregern und Auswahl der monoclonalen Antikörper, die keine Kreuzreaktion zeigen;
(d) Durchführung von Kompetitionstests mit den in (c) erhaltenen monoclonalen Antikörpern und gegen den Infektionserreger gerichteten polyclonalen Antikörpern und Auswahl der mit den polyclonalen Antikörpern kompetierenden monoclonalen Antikörper;
(e) Herstellung der in (d) erhaltenen monoclonalen Antikörper in größeren Mengen in an sich bekannter Weise und affinitätschromatographische Reinigung;
(f) Vernetzung der monoclonalen Antikörper aus (d), vorzugsweise mit Glutaraldehyd;
(g) mehrfache Immunisierung eines Tieres mit den monoclonalen Antikörpern aus (f) und Herstellung von monoclonalen Antikörpern in an sich bekannter Weise; und
(h) Selektion monoclonaler anti-idiotypischer Antikörper.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die monoclonalen Antikörper bei der Vernetzung in Schritt (f) an ein Makromolekül, vorzugsweise an KLH (Keyhole limpet hemocyanin) gebunden werden.

6. Verwendung von monoclonalen anti-idiotypischen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als diagnostisches Antigen.

7. Verwendung nach Anspruch 6, bei der die monoclonalen Antikörper mit einem Serum, vorzugsweise mit Pferde- oder Mausserum, vorinkubiert werden.

8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, bei der die monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper 1 : 2000 mit einer geeigneten Pufferlösung verdünnt werden.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei der die monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper an ein festes Trägermaterial gebunden sind.