DE3586772T2

DE3586772T2 - Verfahren zur bestimmung von mimotopen.

Info

Publication number: DE3586772T2
Application number: DE8585903646T
Authority: DE
Inventors: Mario Geysen
Original assignee: Coselco Mimotopes Pty Ltd
Current assignee: Coselco Mimotopes Pty Ltd
Priority date: 1984-07-24
Filing date: 1985-07-23
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2005-07-24
Also published as: JPH07119760B2; US5194392A; EP0190205A1; JPH09183796A; DE3586772D1; JPS61502839A; DK136086D0; NO166465C; DK136086A; DK164942B; US5998577A; CA1255586A; NO166465B; JP2640438B2; ATE81722T1; EP0190205A4; MY102885A; EP0190205B1; JP2796962B2; WO1986000991A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis oder Bestimmung einer Sequenz von Monomer-Molekülen, die zu einem Epitop auf einem Antigen korrespondieren, oder die eine äquivalente molekulare Topologie zu dem Epitop besitzen.
Wie im Folgenden durch diese Beschreibung verwendet, haben die unten aufgeführten Ausdrücke die folgende Bedeutung:
Epitop:
die spezifische Oberfläche eines Antigen-Moleküls, die durch den Interaktionsbereich mit einem Antikörpermolekül abgegrenzt ist.
Katamer:
ein Polymer-Molekül, das eine genau definierte Sequenz besitzt und das durch Kondensation einer bestimmten Anzahl kleiner Moleküle gebildet wird. Zu beachten hierbei ist, daß dieser Ausdruck Moleküle mit einschließt, die durch unterschiedliche Arten von Kondensationsreaktionen aus den kleinen Molekülen hergestellt werden können. Eine Nummer vor dem Wort "Katamer" bedeutet, daß das Katamer durch Kondensation aus der angegebenen Anzahl von kleinen Molekülen gebildet wurde, z. B. 8-Katamer bedeutet, daß das Katamer aus 8 kleinen Molekülen gebildet wurde. Beispiele von Katameren schließen irgendwelche gegebenen Peptide, und irgendwelche gegebenen Oligosaccharide mit ein.
Monomer:
ein Teil des Satzes von kleinen Molekülen, die zusammengefügt werden können um ein Katamer auszubilden. Der Satz von Monomeren schließt z. B. den Satz von gewöhnlichen S-Aminosäuren, den Satz von D-Aminosäuren, den Satz von synthetischen Aminosäuren, den Satz von Nukleotiden, und den Satz von Pentosen und Hexosen mit ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Peptide:
ein Katamer, in dem die kleinen Moleküle α-Aminosäuren, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, sind. Im Zusammenhang mit dieser Beschreibung soll bemerkt werden, daß die Aminosäuren die L- oder D- optischen Isomeren darstellen können.
Mimotope:
Katamer, das in wenigstens einer seiner Konformationen einen Oberflächenbereich mit einer äquivalenten molekularen Topologie zu dem Epitop, das es nachahmen soll besitzt.
komplementär:
bezieht sich auf das Zusammenpassen der reagierenden Oberflächen eines Antikörper-Paratops und seines bestimmten Epitops. Diese Oberflächen müssen während des Bindens eines Antikörper- Paratops mit seinem Epitop zusammenpassen. Demzufolge können das Paratop und sein Epitop als komplementär beschrieben werden, und weiterhin sind die Kontakt-Oberflächen-Charakteristika komplementär zueinander.
Paratop:
die bindende Stelle eines Antikörpers, die zu einem bestimmten Epitop komplementär ist.
Es ist bereits gut bekannt, daß:
1. ein Antigen ein Makromolekül, wie z. B. ein Protein oder ein Polysaccharid darstellt, das gewöhnlich, aber nicht notwendigerweise fremd zu einem Menschen oder Tier ist, und sobald in den menschlichen- oder Tierkörper eingebracht entweder eine humorale oder zelluläre Immunantwort, oder beides stimuliert;
2. die spezifische Region des Antigens, an das Antikörper binden als Epitop bekannt ist;
3. es auf einem Antigen-Molekül mehr als ein Epitop geben kann;
4. die allgemeine humorale Antwort des Körpers auf ein Antigen in der Produktion von Antikörpern gegen verschiedene Epitope des Antigens besteht; jeder der individuellen Antikörper stellt einen monoklonalen Antikörper dar und wird per definitionem aus einer Gruppe von Zellen, die durch Vervielfachung und Differenzierung aus einer einzigen Vorläufer B-Zelle hervorgehen, gebildet;
5. das Paratop eines Antikörper-Moleküls als die molekulare Oberfläche der Antikörper-Bindungsstelle, die den Kontaktbereich zwischen dem Epitop und dem Antikörper darstellt, definiert ist;
6. gegen ein gegebenes Epitop des Antigens mehr als ein Antikörper produziert werden kann, die sich in ihren Paratopen unterscheiden; jedes Paratop kann durch seine Spezifität für das komplementäre Epitop charakterisiert werden; und
7. Antikörper, die als Antwort auf eine Stimulierung durch ein Antigen produziert wurden, weiter dahingehend charakterisiert werden können, daß einige direkt durch Binden mit dem Antigen neutralisieren können; andere können Aggregate ausbilden, die mit dem Makrophagen- System interagieren; und noch andere zeigen überhaupt keinen meßbaren biologischen Effekt.
Es ist ein vordringliches Ziel der vorliegenden Erfindung, die eine oder mehrere der kurzen Sequenzen von Monomeren nachzuweisen oder zu bestimmen, die einem Epitop eines Antigens gleichen, dergestalt, daß diese Sequenzen mit demselben Antikörper, wie das Epitop, binden können. Diese Katamere würden die Mimitope des Epitops sein. Diese Information ist zur Herstellung von syntetischen Katamer-Vakzinen gegen Krankheiten und zur Herstellung von äußerst spezifischen diagnostischen oder therapeutischen Mitteln unschätzbar.
Die gebräuchlichste Gruppe kleiner Moleküle, die zur Ausbildung eines Katamers zusammengefügt werden kann ist die Gruppe der α-Aminosäuren. Andere Moleküle, die mit der gewählten Chemie übereinstimmen können verwendet werden. Z.B. können β-Aminosäuren zum Anfügen eines zusätzlichen C-Bindungs-Spacer an genau kontrollierten Positionen vorzugsweise verwendet werden.
PNAS, 81 (1984), S. 3998-4002 offenbart ein Verfahren zur schnellen Synthese von Hunderten von kurzen Peptiden, die von der bekannten Sequenz eines FMDV-Typus O&sub1; abstammen. Diese Peptide können sodann auf ihre Immunogenität hin untersucht werden.
EMBO-Journal, Vol. 3, Nr. 6 (1984) S. 1295-1300 offenbart die Charakterisierung des Epitops des monoklonalen Antikörpers YL 1/2 der Ratte. Diese Charakterisierung wird unter Verwendung von synthetischen Peptiden, die den Carboxy-Terminus von tyrosiniertem α-Tubulin überspannen, ausgeführt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Monomeren, aus einem definierten Satz von Monomeren, die ein konformationsmäßiges Äquivalent eines Epitops, das zu einem bestimmten Paratop eines Antikörpers von Interesse komplementär ist, ausgewählt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(i) eine Vielzahl von Katamer-Präparationen herzustellen; wobei jede der Katamer-Präparationen aus einer Vielzahl von Katameren besteht, die aus einem definierten Satz von Monomeren hergestellt wurden und worin (i) die Zusammensetzung an zwei oder mehr bezeichneten Positionen in jedem Katamer bekannt und für jedes Katamer in der Katamer-Präparation konstant ist, und (ii) die Zusammensetzung an jeder der verbleibenden Positionen durch die Teile des definierten Satzes der Monomere zufällig gebildet wird; und die Vielzahl der Katamer-Präparationen Präparationen umfassen, in denen das/die Monomer(e) bei den bezeichneten Positionen systematisch variiert werden damit Teile des definierten Satzes von Monomeren enthalten sind;
(ii) Zusammenbringen jeder der Vielzahl von Katamer-Präparationen mit dem Antikörper von Interesse; und
(iii) Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von Bindung zwischen jeder der Vielzahl von Katamer-Präparationen und dem gegebenen Antikörper; und
(iv) Bestimmung einer Teil-Sequenz von Monomeren aus der bekannten Zusammensetzung der zwei oder mehr bezeichneten Positionen in jeder der Vielzahl der an den Antikörper bindenden Katamer-Präparationen, für das Konformations-Äquivalent eines Epitops, das zu dem einzelnen Paratop des Antikörpers komplementär ist.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren ebenso weiterhin die Schritte:
(v) eine weitere Vielzahl von Katamer-Präparationen, wie in Anspruch 1 definiert, und welche die Zusammensetzung der Teilsequenz wie in Schritt (iv) als anfänglich bezeichnete Positionen bestimmt, einschließen, herzustellen, wobei jede weitere Vielzahl von Katamer- Präparationen wenigstens eine oder mehrere zusätzliche Positionen in jedem Katamer als eine bezeichnete Position, an der das Monomer bekannt ist, enthält; und
(vi) (ii), (iii), und (iv) wie in Anspruch 1 beschrieben zu wiederholen, im Hinblick auf die weitere Vielzahl von Katamer- Präparationen.
Die Verfahrenschritte (v) und (vi) können wiederholt werden, bis alle Positionen in jeder Katamer-Präparation bezeichnet wurden; und alle abgeleiteten Mimotope können dann hergestellt werden, um aus ihrer relativen Reaktionsfähigkeit mit dem Antikörper von Interesse festzustellen, welche die besseren Mimotope für das für den gegebenen Antikörper korrespondierende Epitop darstellen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf der Tatsache, daß ein gegebener Antikörper mit einem Katamer, das das Mimotop des Epitops, gegen das der Antikörper gerichtet ist, darstellt, reagiert. Es gründet weiterhin auf dem Wissen, daß moderne Techniken der Immunologie den Nachweis von Reaktionen zwischen einem Antikörper und seinem Epitop auch bei kleinen Mengen erlauben. Bindung wurde bei Konzentrationen des Antikörpers und seines Epitops in Mengen von etwa 1 pMol nachgewiesen. Demzufolge wird eine Reaktion, wenn ein Antikörper mit einer Mischung von Katameren, unter denen sich ein Mimotop zu seinem Epitop befindet, nachzuweisen sein, wobei spezifische Bindung an das Mimotop beobachtet wird. Die Identität des Mimotops wird aus der bekannten Monomer-Zusammensetzung bei den bezeichneten Positionen von reagierenden Katamer-Präparationen abgeleitet. Ein vollständiges Mimotop würde als irgendeine Kombination der auf diese Weise abgeleiteten reagierenden Komponenten erwartet werden.
Es ist offensichtlich, daß das Verfahren der Erfindung keine Vorab- Informationen über die Natur des Antigens benötigt, und vor allen Dingen keine vorherige Kenntnis der Sequenz von Monomeren, die das Antigen ausbilden. Es ist tatsächlich zur Anwendung dieser Erfindung nicht nötig, die Herkunft oder die Identität des Antigens gegen das der Antikörper gerichtet ist zu kennen. Weiterhin macht die Erfindung keine Annahmen über das Epitop, das die Produktion von bestimmten Antikörpern stimulierte. Dieses Verfahren identifiziert Mimotope mit diskontinuierlichen als auch kontinuierlichen Epitopen. Aufgrund der Natur des Verfahrens der Erfindung, ist zu bemerken, daß sie auf jedes Antigen, das teilweise oder in seiner Gesamtheit kein Protein darstellt, und dessen Epitope durch ein geeignetes Katamer nachgeahmt werden können, anwendbar ist. Mimotope können aus Teilen des Gleichen oder anderen Sätzen von Monomeren, die das Antigen ausbilden, hergestellt werden.
Vorzugsweise wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung mittels Durchmustern einer Vielzahl von synthetisierten Katamer-Präparationen gegen einen Antikörper von Interesse durchgeführt. Idealerweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der nach einer der üblichen Methoden hergestellt werden kann. Polyklonale Antisera von Menschen und Tieren können verwendet werden, wenn monoklonale Antikörper nicht verfügbar sind, die Analyse der erhältlichen Ergebnisse kann jedoch schwieriger werden, da die beobachteten Reaktionen von mehr als einem monoklonalen Antikörper herrühren können. Wenn polyklonale Antisera verwendet werden, kann es notwendig sein, die Antikörper-Vielfalt durch dem Fachmann bekannte Techniken zu vermindern, z. B. durch Isoelektrische Fokussierung, HPLC- oder Affinitäts Chromatographie.
Gegenwärtige Hinweise suggerieren, daß ein Epitop durch ein Katamer, das etwa 8 Monomere lang ist nachgeahmt werden kann, wenn die Monomere aus dem Satz der α-Aminosäuren ausgewählt werden. Die Fähigkeit der 8-Katamere das Mimotop des Epitops darzustellen ist nicht im kritischen Sinne abhängig von jeder Position mit einem bestimmten Monomer. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf Sequenzen, die aus 8-Monomeren gebildet wurden beschränkt ist. Die Vielzahl von Katamer- Präparationen, die zur Anwendung der Erfindung hergestellt werden muß, kann nach irgendeinem bekannten Verfahren zur Katamerherstellung synthetisiert werden. Das bei Verwendung von Aminosäuren als Katamere bevorzugte Verfahren ist die Festphasen-Technik, wie in der australischen Patentschrift Nr. 25429/84 beschrieben, wobei jede Mischung von Katameren an einem Polyethylen-Träger hergestellt wird.
Das folgende ist eine detaillierte Beschreibung einer Verkörperung der vorliegenden Erfindung:

A. Synthese einer Vielzahl von Katamer-Präparationen

Wie oben erwähnt, besteht das bevorzugte Verfahren diese Erfindung anzuwenden in der Synthese der Katamere an einem festen Träger. In dieser Verkörperung besitzt die Vielzahl der Katamere die allgemeine Formel
Y-X-X-D&sub2;-D&sub1;-X-X-X-X-[fester Träger],
wobei 'X' einen Bestandteil eines Satzes von Monomeren repräsentiert. Idealerweise sollte jede Katamer-Präparation Katamere mit einschließen, in denen jede der 'X'-Positionen in der Katamer-Formel einen Teil eines Satzes von Monomeren darstellt, dergestalt, daß jedes Teil des Satzes in der Katamer-Präparation in etwa äquimolaren Mengen vorhanden ist. Zu bemerken ist, daß dergleiche Satz von Monomeren nicht an jeder 'X'-Position verwendet werden braucht. 'Y' in der allgemeinen Formel stellt eine Endgruppe des Katamers dar, und kann, ohne darauf beschränkt zu sein, z. B. ein Wasserstoff-Atom, oder eine Acetylgruppe sein. D&sub1; und D&sub2; stellen bestimmte Positionen dar, die mit bekannten, und in jeder hergestellten Katamer-Präparation gleichbleibenden Monomeren besetzt sind; diese können jedoch systematisch in den Katamer-Präparationen verändert werden. Zu bemerken ist, daß der gleiche Satz von Monomeren nicht bei jeder bezeichneten Position verwendet werden braucht. Es sollte ebenfalls bemerkt werden, daß wenn die Katamere aus Aminosäuren hergestellt werden, die Katamere an den festen Träger über ihre COOH-Enden, oder über ihre Amino-Enden gekuppelt werden können.
Wenn i die Anzahl der Teile in dem Satz von Monomeren, die in der Position D&sub1; gekuppelt werden sollen, ist, und j die Anzahl der Teile in dem Satz von Monomeren, die in der Position D&sub2; gekuppelt werden sollen ist, werden insgesamt i*j verschiedene Katamer-Präparationen hergestellt.
In der vorliegenden Verkörperung, werden die Träger-Stäbchen so hergestellt, daß die Monomere an diese gekuppelt werden können. Die Stäbchen werden dann der Reaktionsmischung, die je einen Teil des Satzes der entsprechenden Monomere enthält, ausgesetzt. Dadurch werden Monomere an der erste 'X'-Position gekuppelt. Dieses Verfahren wird 3 mal wiederholt, um das Katamer Z-X-X-X-X-[fester-Träger] zu erhalten, wobei 'Z' die für den betrachteten Satz von Monomeren geeignete Schutzgruppe darstellt; Beispiele von 'Z', wobei die Monomere Aminosäuren sind, schließen die BOC und Fmoc-Gruppen mit ein. Bis zu dieser Stufe wurden alle Stäbchen in der Durchführung des Verfahrens in gleicher Weise behandelt.
Zur Kupplung an die D&sub1; Position wird jedes Stäbchen mit einer Reaktionsmischung, die nur ein einziges Monomer, wie z. B. eine geschützte Aminosäure oder Ähnliches enthält, behandelt. In der D&sub1; Position wird jedes der i Monomere an die j-Stäbchen gekuppelt. Zur Kupplung an die D&sub2; Position wird jedes Stäbchen erneut mit einer Reaktionsmischung aus nur einem einzigen Monomer, wie z. B. einer geschützten Aminosäure oder Ähnlichem behandelt. Jedes der j Stäbchen, das ein bestimmtes Monomer an der D&sub1; Position besitzt, wird ein unterschiedliches Monomer an die D&sub2; Position gekuppelt, besitzen. Auf diese Weise wird jede Kombination der Teile des Satzes von Monomeren in den i*j Stäbchen gefunden werden. Kuppeln von Monomeren in den verbleibenden 'X'-Positionen ist identisch mit dem Kuppeln in den 'X'-Positionen, die näher am festen Träger liegen.
Nach Synthese einer Vielzahl von Katamer-Präparationen werden die Seitenketten-Schutzgruppen von den Katamer-Präparationen entfernt, wobei die üblichen Techniken angewandt werden, und die Stäbchen gekuppelten Katamere werden gewaschen.
Es wurde gefunden, daß eine bevorzugte Verkörperung der Erfindung die Herstellung von mehr als einem Satz einer Vielzahl von Katamer- Präparationen ist, um in der Analyse von Daten hilfreich zu sein. Demzufolge werden Katamere mit der allgemeinen Formel, wie oben beschrieben,
Y-X-X-D&sub2;-D&sub1;-X-X-X-X-[fester Träger]
hergestellt; ebenso können auch zusätzliche Sätze von Katameren mit der allgemeinen Formel
Y-X-X-D&sub2;-X-D&sub1;-X-X-X-[fester Träger]
und
Y-X-D&sub2;-X-X-D&sub1;-X-X-X-[fester Träger]
hergestellt werden.
Zu beachten ist, daß andere allgemeine Formeln zur Synthese aus anderen Sätzen von KatamerPräparationen ausgewählt werden können.

B. Testen der Katamer Präparationen

Die Vielzahl von Katamer-Präparationen, wie in A (oben) hergestellt werden sodann mit dem bestimmten Antikörper von Interesse zusammengebracht. Die Reaktion zwischen Antikörper und Komponenten der Katamer Präparationen können dann durch irgendeine der üblichen Verfahren, z. B. Radioimmunassay (RIA) nachgewiesen werden. Die bevorzugte Methode des Nachweises der Anwesenheit von Antikörper- Mimotop Bindung ist die Verwendung des gut bekannten Enzym-linked- Immunosorbent-Assay (ELISA).
Am Ende eines jeden Versuchs können Antikörper von den Katamer Präparationen entfernt werden durch, z. B. waschen mit einer Lösung aus 8M Harnstoff, 0,1% 2-Merkaptoethanol und 0,1% Natrium-Dodecylsulfat, gefolgt von mehreren Waschschritten in phosphat-gepufferten Salzlösungen. Auf diese Weise können die Vielzahl von Katamer Präparationen zum Test mit vielen anderen Antikörpern verwendet werden.

C. Analyse der Daten

In dem Test der Katamer Präparationen mit Antikörper wird gefunden, daß bestimmte Stäbchen nachweisbares Binden mit dem Antikörper aufweisen. Die Katamer Präparation, die an solche reagierende Stäbchen gekuppelt sind enthält eine definierte Kombination von den Teilen des Satzes/der Sätze von Monomeren in den Positionen D&sub1; und D&sub2;. Diese Kombination von Monomeren bildet wahrscheinlich einen Teil des Katamers aus, das ein Mimotop für ein Epitop, das komplementär zum Antikörper ist, ausbildet. Weitere Analyse der Daten können in einer Vielzahl von Wegen ausgeführt werden. Diese schließen mit ein:
1. kombinieren und verändern dieser reagierenden Monomere, um eine Liste von Katameren, die ein oder mehrere Mimotope für das Epitop mit einschließen können herzustellen; jedes Katamer in dieser Liste könnte als mögliches Mimotop angesehen werden;
2. die am besten geeigneten Kandidaten von der Liste der reagierenden Kombinationen von Monomeren zu nehmen (aber nicht notwendigerweise die, die die höchste Antikörper-Bindungs-Aktivität aufweisen) und weiteres Synthetisieren von Sätzen von Katamer Präparationen, in denen die bekannte reagierende Kombination von Monomeren konstant gehalten wird und die Monomere in anderen Positionen des Katamers systematisch variiert werden; damit würde in obigem Beispiel ein geeigneter Satz solcher Katamer Präparationen Katamere mit der Formel
Y-X-D&sub3;-D&sub2;-D&sub1;-X-X-X-X-[fester Träger]
und
Y-X-X-D&sub2;-D&sub1;-D&sub4;-X-X-X-[fester Träger]
enthalten, wobei D&sub1; und D&sub2; die reagierenden Kombinationen von Monomeren darstellen und D&sub3; und D&sub4; andere bezeichneten Positionen sind, worin jedes der Mitglieder des Satzes von Monomeren systematisch variiert wird; und
3. Kombinieren der Ergebnisse von mehr als einem der Sätze der Vielzahl von Katamer Präparationen und Entschlüsseln um eine einzelne Sequenz von Monomeren herzustellen, oder möglicherweise eine sehr kleine Anzahl solcher Sequenzen, die das Epitop von Interesse nachahmen können; dies, da bei Verwendung der oben angegebenen Verkörperung die reagierende Kombinationen von Monomeren, sobald sie nebeneinander vorliegen, die reagierenden Kombinationen von Monomeren, wenn sie durch eine Position voneinander getrennt sind, und schließlich die reagierenden Kombinationen von Monomeren, die durch 2 Positionen getrennt sind, alle bekannt sind; diese Daten können einfach entschlüsselt werden um so die Sequenz des Mimotops zu ergeben; diese Versuchsanordnung wird von größtem Nutzen sein, wenn der Antikörper, der zum Testen der Vielzahl von Katamer Präparationen verwendet wird, ein monoklonaler Antikörper ist.

D. Synthese ausgewählter Mimotope

Die ausgewählten Mimotope können dann unter Verwendung eines Verfahrens, ähnlich dem in der australischen Patentschrift Nr. 25429/84 beschriebenen synthetisiert werden. Nachdem die gewählten Katamere synthetisiert wurden, werden sie mit den interessierenden Antikörpern zur Reaktion gebracht. Es ist dann einfach die Katameren, die die Antikörper am stärksten binden auszuwählen. Als endgültige Überprüfung, daß dieses Katamer das beste Mimotop des Epitops ist, kann die Sequenz des Katamers die parentale Sequenz eines Ersatz Netzes verwendet werden, wie es in der australischen Patentschrift Nr. 25428/84 beschrieben ist.
In den unten gezeigten Beispielen 1, 2 und 3, ist der definierte Satz von Monomeren der Satz der üblichen L-alpha Aminosäuren. Dieser Satz von Monomeren wird wird für die beiden gekennzeichneten und die zufälligen Positionen verwendet (Positionen 'D&sub1;', 'D&sub2;' und 'X', wie in der allgemeinen Formel oben verwendet). Außerdem war in diesen Beispielen die Endgruppe der Katamere (die 'Y' gruppe) der Acetyl Teil.

Beispiel 1

Eine Vielzahl von 8-Katamer Präparationen wurde entsprechend der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-X-X-D&sub2;-D&sub1;-X-X-X-X-[fester Träger],
wobei 'X' ein Mitglied des Satzs von 20 üblichen L-alpha Aminosäuren ist, so synthetisiert, daß jedes Mitglied des Satzs in der 'X' Position in den Katamer Präparationen in etwa äquimolaren Mengen vertreten ist; beide bezeichneten Positionen D&sub1; und D&sub2; sind Teile desselben Satzs von Monomeren; und '-NH-' stellt die endständige Aminogruppe des Katamers dar. Die 8-Katamer Präparationen wurden an einer festen polymer Nadel oder einem Stäbchen, wie in der australischen Patent-Schrift Nr. 25429/84 allgemein beschrieben, synthetisiert, wobei die BOC Gruppe als Schutzgruppe für die L-α- Aminosäuren während der Synthese verwendet wurde.
Teile des Satzs üblicher L-Aminosäuren wurden in den 'X' Positionen folgendermaßen gekuppelt:
1. Eine Mischung von Aminosäuren wurde in 102 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst. Die Mischung bestand aus:
BOC-L-Alanin 32 mg
BOC- Methoxybenzyl-L-Cystein 100 mg
BOC-Benzyl-L-Asparaginsäure 90 mg
BOC-Benzyl-L-Glutaminsäure 96 mg
BOC-L-Phenylalanin 61 mg
BOC-L-Glycin 27 mg
BOC-Tosyl-L-Histidin 142 mg
BOC-L-Isoleucin.1/2 H&sub2;O 51 mg
BOC-Carbobenzoxy-L-Lysin 124 mg
BOC-L-Leucin.H&sub2;O 55 mg
BOC-L-Methionin 54 mg
BOC-L-Asparagin 47 mg
BOC-L-Prolin 42 mg
BOC-L-Glutamin 53 mg
BOC-Tosyl-L-Arginin.H&sub2;O 167 mg
BOC-Benzyl-L-Serin 76 mg
BOC-Benzyl-L-Threonin 83 mg
BOC-L-Valin 42 mg
BOC-L-Tryptophan 78 mg
BOC-Benzyl-L-Tyrosin 116 mg
2. Eine Lösung von 1310 mg 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) in 34 ml DMF wurde hergestellt.
3. Eine Lösung von 1150 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 34 ml DMF wurde hergestellt.
4. Vor Gebrauch wurde die Lösung von HOBT zu der Aminosäure-Lösung gegeben und gemischt. Dann wurde die DCC-Lösung zugegeben und gemischt. Das Katamer oder das bereits an den festen Träger gebundene Linker-Molekül, wurde dann mit der so hergestellten Mischung zur Reaktion gebracht.
Einzelne L-Aminosäuren wurden entsprechend der in der australischen Patent-Schrift Nr. 25429/84 beschrieben Methode in die Positionen D&sub1; und D&sub2; gekuppelt. Daraus ergab die Synthese von 400 Katamer Präparationen, die alle möglichen Paarungen der 20 Aminosäuren in den Positionen D&sub1; und D&sub2; umfaßten.
Die Vielzahl von 8-Katamer Präparationen wurden mittels ELISA gegen einen monoklonalen Antikörper getestet. Dieser monoklonale Antikörper wurde gegen Maul und Klauen Seuche Virus (FMDV) Subtyp A&sub1;&sub0;, unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Techniken hergestellt. Zur Durchführung des ELISA Assays wurden Träger gekuppelte Peptide in einer Vorbeschichtungs-Lösung aus 1% Ovalbumin/1% Rinder-Serum- Albumin/0.1% Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 1 Stunde bei 25ºC inkubiert, um unspezifische Absorption von Antikörpern zu blockieren. Nach Übernacht Inkubation bei 4ºC in einer geeigneten Verdünnung von monoklonalem Antikörper Vorbeschichtungs- Lösung folgten drei Waschschritte in 0.05% Tween 20/PBS. Nach einstündiger Reaktion bei 25ºC mit Ziegen Anti-Maus IGg, das mit Meerettich-Peroxidase konjugiert, in der Vorbeschichtungs-Lösung verdünnt war, folgte erneut intensives Waschen mit PBS/Tween, zum Entfernen von überschüssigem Konjugat. Die Anwesenheit von Antikörper wurde nachgewiesen durch eine 45 minütige Reaktion mit einer frisch hergestellten Enzym Substrat Lösung (40 mg o-Phenylendiamine und 18 ul "120 vol." Wasserstoffperoxid in 100 ml Phosphat/Zitratpuffer, pH 5.0), und die entstehende Farbe bei 450 nm bestimmt.
Fig. 1 zeigt das Resultat des Tests der 8-Katamer Präparationen mit diesem Antikörper. In Fig. 1, stellt jede Gruppe von zwanzig Linien die Reaktion in einem ELISA in Absorptionseinheiten, bei 450 nm gemessen, der entwickelten Farbe dar. Jedes Mitglied der Gruppe von zwanzig Linien hat eine gebräuchliche Aminosäure in Position 'D&sub1;', die, im Einbuchstaben Code, unmittelbar unter jeder Gruppe angegeben ist. Jedes Mitglied einer Gruppe von zwanzig Linien repräsentiert eine andere Aminosäure in Position 'D&sub2;'. Diese sind in alphabetischer Reihenfolge im Einbuchstaben Code angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. (In Tabelle 1 und in den restlichen Beispielen wird der Einbuchstaben Code für Aminosäuren benützt).

Tabelle 1. Antikörper Bindungs Aktivität der 8-Katamer Präparationsmischungen Ac-X-X-D&sub2;-D&sub1;-X-X-X-X-Ss.

Peptid Mischung Extinktion E&sub4;&sub1;&sub5;
Ac-X-X-M-H-X-X-X-X-Ss 0.624
Ac-X-X-M-K-X-X-X-X-Ss 0.582
Ac-X-X-K-K-X-X-X-X-Ss 0.537
Ac-X-X-K-H-X-X-X-X-Ss 0.510
Ac-X-X-Q-H-X-X-X-X-Ss 0.488
Ac-X-X-H-H-X-X-X-X-Ss 0.486
Ac-X-X-Q-N-X-X-X-X-Ss 0.460
Ac-X-X-W-M-X-X-X-X-Ss 0.448
Ac-X-X-K-N-X-X-X-X-Ss 0.431
Ac-X-X-H-K-X-X-X-X-Ss 0.417
Durchschnittliche Extinktion der niedrigeren 200 Werte war 0.202 (Standardabweichung 0.021).
Ac bedeutet Acetyl Teil.
Ss bedeutet [fester Träger].
Es ist ersichtlich, daß der Antikörper stark mit einer Anzahl von 8- Katamer Präparationen reagiert. In der Reihenfolge der Stärke der Reaktion, umfassen diese 8-Katamer Präparationen in denen die bezeichneten Positionen (-D&sub2;-D&sub1;-) darstellen: -M-H-, -M-K-, -K-K-, -K-H-, -Q-H- und -H-H-.
Zwei weitere Vielzahlen von 8-Katamer Präparationen wurden synthetisiert. Diese hatten die Formel
Acetyl-NH-X-D&sub3;-M-K-X-X-X-X-[fester Träger]
und
Acetyl-NH-X-X-M-K-D&sub4;-X-X-X-[fester Träger]
wobei 'M' für einen Methionin- und 'K' für einen Lysinrest stehen und 'D&sub3;' und 'D&sub4;' die neu bezeichneten Positionen für diese Serie von Synthesen sind; andere Begriffe in den Formeln wurden wie vorhergehend verwendet.
Diese 8-Katamer Präparationen wurden gegen monoklonale Antikörper gegen FMDV A&sub1;&sub0; getestet. Fig. 2A und 2B zeigen die Ergebnisse des ELISA Tests mit dem monoklonalen Antikörper, der für die in Fig. 1 gezeigten Ergebnisse verwendet wurde. Fig. 2A repräsentiert 8- Katamer Präparationen mit der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-X-D&sub3;-M-K-X-X-X-X-[fester Träger].
Fig. 2B repräsentiert 8-Katamer Präparationen mit der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-X-X-M-K-D-X-X-X- (fester Träger).
In beiden Figuren ist die Aminosäure in der Position '-D&sub3;-' oder '-D&sub4;-' unter jeder Linie angegeben, die die Absorption der entwickelten Farbe bei Messung bei 450 nm angibt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Antikörper-Bindungs-Aktivitäten relativ zu den 8- Katamer Präparationen, die das bezeichnete Aminosäuren-Paar M-K enthalten sind gezeigt, wobei alle 8-Katamer Präparationen einen Wert von mehr als 1.1 ergeben. Ebenfalls gezeigt ist der Wert, der für das umgekehrte Paar, K-M, gefunden wird. Tabelle 2 Relative Antikörper Bindungs Aktivitäten von 8-Katamer Präparationen die drei definierte Aminosäuren enthalten. Aminoterminale Erweiterung Carboxyterminale Erweiterung Sequenz Aktivität Kontroll Sequenzen M-K Test Hintergrund
Es ist ersichtlich, daß die 8-Katamer Präparationen die am stärksten mit dem monoklonalen Antikörper reagierten, die folgenden Sequenzen in den bezeichneten Positionen hatten: -H-M-K-, -W-M-K, und -Q-M-K in Fig. 2A; und -M-K-H-, -M-K-Q und -M-K-W- in Fig. 2B.
Einbau von Histidin an irgendeiner Seite des definierten M-K Paars ergab die größte Antikörper-Bindungs-Aktivität. Histidin auf der aminoterminalen Seite war jedoch nicht deutlich besser als Tryptophan, und die definierte Sequenz W-M-K-H wurde für weitere Bestimmungen gewählt.
Die Gültigkeit des Verfahrens mit der definierten Sequenz W-M-K-H, von der man durch Kombination der einzelnen bevorzugten Erweiterungen des Paars M-K, vorhersagte, daß sie optimal sei, wurde getestet. Katamer Präparationen basierend auf der parentalen Sequenz Acetyl-NH- X-W-M-K-H-X-X-X-Ss[fester Träger] wurden synthetisiert, in denen in jeder der vier definierten Positionen alle 19 alternativen Aminosäuren ausgetauscht wurden, jeweils nur eine. Der Test dieses Satzes von Katamer Präparationen auf Bindungsaktivität mit dem Test monoklonalen Antikörper (MAb) zeigte, daß Q-M-R-H die bevorzugte Sequenz für die Erweiterung ist. (die erhaltenen E&sub4;&sub5;&sub0; Werte waren; Ac-X-W-M-K- H-X-X-X-Ss= 0.69, Ac-X-Q-M-K-H-X-X-X-Ss= 1.47, und Ac-X-W-R-H-X-X-X- Ss = 1.11, Test-Hintergrund war 0.2). Die Bevorzugung von Glutamin auf der aminoterminalen Seite der definierten Sequenz M-K-H gegenüber Tryptophan wie bereits für das Paar M-K bestimmt, zeigt die Abhängigkeit von einzeln bestimmten Optima untereinander.
8-Katamer Präparationen mit der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-D&sub5;-Q-M-R-H-X-X-X-[fester Träger] und
Acetyl-NH-X-Q-M-R-H-D&sub6;-X-X-[fester Träger]
wurden synthetisiert. Die Präparationen mit der höchsten Antikörper Bindungsaktivität waren jene mit D&sub5;=Tryptophan und D&sub6;=Serin, woraus sich W-Q-M-R-H-S als optimale Sequenz ergeben würde. Keine deutliche Verbesserung der Antikörper Bindungs Aktivität wurde durch Bezeichnung weiterer Aminosäuren an irgendeinem Ende dieser Sequenz erreicht. Festlegung des Satzes von Peptiden, umfassend alle einzelnen Aminosäure Substitutionen dieser als Hexapeptid synthetisierten Sequenz, bestätigte, daß W-Q-M-R-H-S dem optimalen Hexapeptid nahe war. Leichte Erhöhung der Antikörper Bindungs Aktivität zeigte sich, wenn Glycin in dem Peptid durch Arginin ersetzt wurde, woraus sich die Sequenz W-Q-M-G-H-S ergab.
Um die Spezifität der Antikörper Bindungs Reaktion der bestimmten Gruppe verwandter Peptide für den Test MAb zu bestätigen, wurde der Titer des Test MAb für eine Anzahl von Peptiden mit denen von MAb gegen Pottwal-Myoglobin oder Hepatitis A (Tabelle 3) verglichen. Die Spezifität der Antikörper Bindungsreaktion ist eindeutig für den Test MAb, den Antikörper der zur Bestimmung der Sequenz dieser Peptide benützt wurde. Tabelle 3 Spezifität des Test MAb für W-Q-M-G-H-S verwandte Peptide Titer Peptid Test MAb anti-Hepatitis A anti-myoglobin
Antikörper Titer für jeden MAb wurden durch ELISA bestimmt und entsprechen den reziproken Verdünnungen der Ascites-Flüssigkeit wobei eine Extinktion von dreifachem Hintergrund erhalten wird. Die Werte wurden für unspezifische Absorption, die durch die Reaktion jeder Verdünnung der Ascites Flüssigkeit mit unabhängigen Kontroll-Peptiden bestimmt wurden, korrigiert. (Ac-G-D-L-G-S-I-Ss und Ac-G-D-L-Q-V-L- Ss). Getestete monoklonale Antikörper waren: Test MAb, anti-FMDV, Typ A&sub1;&sub0; wie im Text beschrieben (Titer gegen den ganzen Virus 1.3·10&sup6;); anti-Hepatitis A, Reaktionsstelle unbekannt (Titer gegen Hepatits A virus 10&sup6;); und Anti-Myoglobin (Pottwal), Reaktionsstelle ebenfalls unbekannt (Titer gegen Pottwal Myoglobin 10&sup6;),

Beispiel 2

Beispiel 2 veranschaulicht die Anwendung der Erfindung auf einen polyklonalen Antikörper.
Eine weitere Vielzahl von 8-Katameren wurde synthetisiert mit der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-X-X-D&sub2;-D&sub1;-X-X-X-X-[fester Träger]
wie in Beispiel 1 beschrieben. Dies wurde gegen einen Antikörper der gegen das synthetische Peptid C-G-D-L-G-S-I-A-K produziert wurde getestet. Dieses Peptid wurde unter Verwendung der üblichen Techniken der Merrifield Festphasen Peptid Synthese hergestellt. Das Peptid wurde über die Sulhydryl Gruppe des Cysteinrestess an "Keyhole Limpet Hämocyanin" gekuppelt. Das gekuppelte Peptid wurde mit Freund's incomplete adjuvant formuliert und über den intramuskulären Weg in ein Kaninchen injiziert. Antiserum wurde erhalten indem 40 Tage nach der Injektion Blut abgenommen wurde.
Die Ergebnisse des ELISA Tests der Vielzahl von 8-Katamer Präparationen mit dem Antikörper sind in Fig. 3 in derselben Weise wie in Fig. 1 dargestellt. Man sieht, daß alle 8-Katamer Präparationen mit E (Glutaminsäure) in Position D&sub1; deutlich mit dem Antikörper reagierten. Andere Kombinationen die deutlich mit dem Antikörper reagierten umfassen in sinkender Reihenfolge:
-D-I-, -G-D-, -I-G-, und -D-V-.
Wie im Beispiel 1 oben beschrieben, wurden weitere Vielzahlen von 8- Katamer Präparationen synthetisiert mit der Formel:
Acetyl-NH-X-D&sub3;-D-I-X-X-X-X-[fester Träger]
und
Acetyl-NH-X-X-D-I-D&sub4;-X-X-X-[fester Träger]
Wobei D Asparaginsäure und I Isoleucin ist. Ergebnisse des Tests mit dem Antikörper sind in Fig. 4 in derselben Weise wie in Fig. 2 gezeigt. Fig. 4A repräsentiert 8-Katamer Präparationen mit der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-X-D&sub3;-D-I-X-X-X-X-[fester Träger].
Fig. 4B repräsentiert Präparationen mit der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-X-X-D-I-D&sub4;-X-X-X-[fester Träger].
Fig. 4 zeigt, daß 8-Katamer Präparationen die mit dem Antikörper reagieren folgende Sequenzen in den bezeichneten Positionen einschließen: -G-D-I-, -A-D-I-, -P-D-I-, -D-I-D-, -D-I-M- und -D-I-T.
Bei Vergleich von Fig. 4A mit Fig. 4B ist deutlich ersichtlich, daß die Position unmittelbar vor dem -D-I- Paar eine bei weitem geringere Breite an erlaubten Aminosäuren zuläßt als die Position unmittelbar nach dem -D-I- Paar.
8-Katamer Präparationen basierend auf der parentalen Sequenz
Acetyl-NH-X-X-G-D-I-D-X-X-[fester Träger]
wurden synthetisiert, in denen in jeder der vier bezeichneten Positionen in der Katamer Präparation alle 19 verschiedenen Aminosäuren, jeweils eine, ersetzt wurden. Test dieses Satzs von Präparationen auf Bindungs Aktivität mit dem Test Antikörper zeigte, daß der Glycin Rest nur durch ein Alanin ersetzt werden konnte, wenn die Fähigkeit, mit diesem Antikörper zu reagieren, erhalten bleiben sollte. Die Amino-endständige Asparaginsäure konnte durch keine andere Aminosäure ersetzt werden. Das Isoleucin konnte durch Valin, Leucin oder Threonin oder durch etwa zehn andere Aminosäuren mit einer Senkung der Bindungs Aktivität ersetzt werden; und die Carboxyendständige Asparaginsäure konnte durch im wesentlichen jede Aminosäure ersetzt werden, wobei Serin in dieser Position die stärkste Bindung ergibt. Der Test ergab, daß die definierte Sequenz G-D-I-S für eine Erweiterung die Bevorzugte war.
Erweiterung der oben bezeichneten Sequenz verdeutlichte die Bevorzugung für den Einbau von Tryptophan am Amino-endständigen und Histidin am Carboxy-endständigen Ende. Keine der Erweiterungen ergab jedoch einen sehr deutlichen Anstieg der Antikörper Bindungs Aktivität.
Zusätzliche Erweiterung der bevorzugten, bezeichneten Sequenz W-G-D- I-S-H zeigte, daß eine weitere Sequenzerweiterung nur geringen Vorteil ergab.
Zu bemerken ist, daß das für diesen speziellen Antikörper bestimmte Mimotop, nämlich, W-G-D-I-S-H nur entfernte Ähnlichkeit mit dem Peptid, das für die Induktion des Antikörpers verwendet wurde, nämlich, C-G-D-L-G-S-I-A-K besitzt. Der Test des Antikörpers in einem Ersatz Netzwerk, basierend auf der immunogenen Sequenz G-D-L-G-S-I zeigte jedoch eine deutliche Bevorzugung für die Sequenz G-D-L-G-D-I gegenüber der induzierenden Sequenz G-D-L-G-S-I (E&sub4;&sub5;&sub0; Werte 0.45 beziehungsweise 0.16). Es gibt eine Ähnlichkeit zwischen dem bestimmten Mimotop und einem bevorzugt bindenden Peptid für den Antikörper. Dies ist ein starker Beweis für die breite Anwendbarkeit der Methode.

Beispiel 3

Beispiel 3 verdeutlicht, daß die Länge der Vielzahl von Katamer Päparationen kürzer als 8-Katamere sein kann.
Eine Vielzahl von 4-Katamer Präparationen wurde synthetisiert mit der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-X-D&sub2;-D&sub1;-X-[fester Träger]
wobei die Abkürzungen wie in Beispiel 1 verwendet wurden. Die Methode der Synthese war identisch mit der in Beispiel 1 verwendeten. Dies wurde gegen einen monoklonalen Antikörper getestet, der mittels dem Fachmann wohlbekannten Techniken gegen Pottwal Myoglobin hergestellt worden war.
Die Ergebnisse der ELISA Tests der Vielzahl von 4-Katamer Präparationen mit dem Antikörper sind in Fig. 5 in derselben Weise wie in Fig. 1 gezeigt. Man sieht, daß nur die Katamer Präparationen mit der Formel
Acetyl-NH-X-L-A-X-[fester Träger]
in der Lage waren mit dem monoklonalen Antikörper zu reagieren.
Wie oben in Beispiel 1 beschrieben, wurden weitere 4-Katamer Präparationen synthetisiert mit der Formel:
Acetyl-NH-D&sub3;-L-A-X-[fester Träger]
und
Acetyl-NH-X-L-A-D&sub4;-[fester Träger].
Tabelle 4 faßt die reaktivsten Katamer Präparationen getestet in einem ELISA System mit dem monokolnalen Antikörper, zusammen. Tabelle 4 - Relative Antikörper Bindungs Aktivitäten von 4-Katamer Präparationen die drei definierte Aminosäuren enthalten. Amino-terminale Erweiterung Carboxy-terminale Erweiterung Sequenz Aktivität Kontroll Sequenzen
Auf der parentalen Sequenz basierende Katamer Präparationen
Acetyl-NH-P-L-A-Q-[fester Träger]
wurden synthetisiert um, wie in Beispiel 2 beschrieben ein Ersatz Netz auszubilden. Fig. 6 zeigt die Ergebnisse der Tests dieser Peptide mit dem monoklonalen Antikörper in einem ELISA. Jede Gruppe von zwanzig Linien in Fig. 6 repräsentiert die Reaktion in Prozent verglichen mit dem Durchschnitt der parentalen Reaktion (E&sub4;&sub5;&sub0; = 2.62 vor einem Hintergrund von 0.25). Bei jedem Mitglied einer Gruppe von zwanzig Linien war die unten angegebene Aminosäure durch eine andere ersetzt worden. Die Linien sind in alphabetischer Reihenfolge gemäß dem Einbuchstaben Codes der Aminosäuren angeordnet. Die verdickte Linie in jeder Gruppe von zwanzig bezeichnet die parentale Sequenz P-L-A-Q. Man sieht deutlich, daß, damit die Katamer Präparationen wenigstens mit der Hälfte der Aktivität der parentalen Sequenz and den Antikörper binden, das Prolin durch Valin, Isoleucin, Leucin, Alanin oder Serin ersetzt werden kann; das Leucin kann nur durch Phenylalanin ersetzt werden; das Alanin kann im westenlichen durch jede andere Aminosäure ersetzt werden; und der Glutamin Rest kann nur durch Asparagin ersetzt werden.
Ein Satz aller überlappender 4-Katamer Präparationen der Pottwal-Myoglobin Sequenz wurde entsprechend der für die bezeichneten Positionen in Beispiel 1 beschriebenen Methoden synthetisiert. Diese Katamere wurden in einem ELISA mit dem monoklonalen Antikörper zu Reaktion gebracht. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt. Jede Linie repräsentiert die in einem ELISA entwickelte, bei 450 nm analysierten Farbe. Jede Linie ist so nummeriert, daß der Rest am aminoterminalen Ende des jeweiligen Katamers dieselbe Nummer hat wie in der Pottwal- Myoglobin Sequenz.
Man sieht deutlich, daß das einzige 4-Katamer, das mit dem monoklonalen Antikörper reagiert dasjenige ist, das aus den Resten 88 bis 91 der Pottwalsequenz besteht. Diese Sequenz ist P-L-A-Q. Offenbar erkennt der monoklonale Antikörper diese spezielle Determinante auf dem Pottwal-Myoglobin.
Ein Satz von 5-Katameren mit der allgemeinen Formel
Acetyl-NH-D&sub5;-P-L-A-Q-[fester Träger]
und
Acetyl-NH-P-L-A-Q-D&sub6;-[fester Träger]
wurden synthetisiert um die besten Erweiterungen der definierten Sequenz zu bestimmen. Die am besten bindenden Präparationen waren
Acetyl-NH-K-P-L-A-Q-[fester Träger]
und Acetyl-NH-P-L-A-Q-Y-[fester Träger].
Es sollte festgehalten werden, daß die Sequenz K-P-L-A-Q zur Sequenz des Pottwal Myoglobins in den Resten 87 bis 91 homolog ist. Dieses Beispiel verdeutlicht erneut die Anwendbarkeit dieser Technik.

Claims

1. Verfahren zur Sequenzbestimmung von Monomeren, ausgewählt aus einem definierten Satz von Monomeren, welcher ein Konformations-Äquivalent eines Epitops ist, das komplementär zu einem bestimmten Paratop eines Antikörpers von Interesse ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(i) eine Vielzahl von Catamer-Präparationen herzustellen; wobei jede der Catamer-Präparationen aus einer Vielzahl von Catameren besteht, die aus einem definierten Satz von Monomeren hergestellt wurden und worin (i) die Zusammensetzung an zwei oder mehr bezeichneten Positionen in jedem Catamer bekannt und für jedes Catamer in der Catamer-Präparation konstant ist, und (ii) die Zusammensetzung der verbleibenden Positionen durch die Teile des definierten Satzes der Monomere zufällig gebildet werden; und die Vielzahl der Catamer-Präparationen Präparationen umfassen, in denen das/die Monomer(e) bei den bezeichneten Positionen systematisch variiert werden, damit Teile des definierten Satzes von Monomeren enthalten sind;

(ii) Zusammenbringen jeder der Vielzahl von Catamer-Präparationen mit einem Antikörper von Interesse; und

(iii) Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von Bindung zwischen jeder der Vielzahl von Catamer-Präparationen und dem gegebenen Antikörper; und

(iv) Bestimmung einer Teil-Sequenz von Monomeren aus der bekannten Zusammensetzung der zwei oder mehr bezeichneten Positionen in jeder der Vielzahl der an den Antikörper bindenden Catamer-Präparationen, für das Konformations-Äquivalent eines Epitops, das zu dem einzelnen Paratop des Antikörpers komplementär ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend die zusätzlichen Schritte:

(v) eine weitere Vielzahl von Catameren wie in Anspruch 1 definiert, und welche die Zusammensetzung der Teilsequenz wie in Schritt (iv) als anfänglich bezeichnete Positionen bestimmt, einschließen, herzustellen, wobei jede weitere Vielzahl von Catamer-Präparationen wenigstens eine oder mehrere zusätzliche Positionen in jedem Catamer als eine bezeichnete Position, an der das Monomer bekannt ist, enthält; und

(vi) (ii), (iii), und (iv) wie in Anspruch 1 beschrieben zu wiederholen, im Hinblick auf die weitere Vielzahl von Catamer-Präparationen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei jede der Vielzahl der Catamer-Präparationen aus dem Satz der alpha-Aminosäuren gebildet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei jede der Vielzahl der Catamer-Präparationen aus einer Vielzahl von 4-Catameren bis 8-Catameren besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei jede Vielzahl von Catameren an einem festen Träger hergestellt wird, und die allgemeine Formel besitzt:

Y-X-X-D&sub2;-D&sub1;-X-X-X-X-(fester Träger) Y-X-X-D&sub2;-X-D&sub1;-X-X-X-(fester Träger) Y-X-D&sub2;-X-X-D&sub1;-X-X-X-(fester Träger) wobei y eine endständige Gruppe des Catamers ist, X (welches gleich oder unterschiedlich sein kann) ein Teil des Satzes von Momomeren ist, dergestalt, daß jeder Teil in der Catamer-Präparation vorhanden ist, und D&sub1; und D&sub2; bekannte Monomere sind, die in jeder Catamer-Präparation konstant sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei jede Vielzahl von Catameren die allgemeine Formel besitzt:

Acetyl-NH-X-X-D&sub2;-D&sub1;-X-X-X-X-(fester Träger) wobei X ein Teil des Satzes von L-alpha-Aminosäuren ist, und diese Vielzahl der Catamere dergestalt ist, daß jeder Teil des Satzes an der X-Position in etwa äquimolaren Mengen vorhanden ist, D&sub1; und D&sub2; bekannte Monomere ausgewählt aus dem Satz von L-alpha-Aminosäuren, sind.