DE3586679T2 - Immunoassays fuer denaturierte proteinanalyte, insbesondere hbalc und monoklonale antikoerper dafuer. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bindung eines Proteins mit einem Antikörperreagens, die es bei der Durchführung eines Immuntests geschieht. Insbesondere betrifft die Erfindung die Bindung von Antikörpern, Fragmenten davon und ähnlichem an spezifische Kohlenhydrat-modifizierte lineare Peptidepitope in Glycoproteinen und Polypeptiden. Die Erfindung ist geeignet bei der Bestimmung von Glycoproteinen von analytischer Bedeutung, z.B bei der als Hb Alc bekannte glukosilierte Form von Hämoglobin. Die Bestimmung des Ausmasses der Glukosilierung von Hämoglobin im Blut eines Individuums stellt einen nützlichen Index zur Kontrolle des Glukosespiegels bei Diabetikern zur Verfügung.
• Es besteht ein andauerndes Bedürfnis, die Spezifität von Anitkörperbindung an Proteine, insbesondere Proteine von analytischer Bedeutung, zu verbessern. Der spezifische Nachweis von bestimmten Proteinen in biologischen Proben wie Blut ist auf die Möglichkeit, Antireagenzien, die auf bestimmte Bindungsstellen oder Epitope auf dem frei zugänglichen Teil des Proteins gerichtet sind, beschränkt. Es gibt Situationen, wo das am meisten erwünschte Epitop zum spezifischen Nachweis eines bestimmten Proteins unzugänglich ist oder nur eine beschränkte Zugänglichkeit zur Bindung an ein Antikörperreagens aufweist.
• Ein Beispiel ist die Bestimmung der als Hb Alc bekannten glukosilierten Form von Hämoglobin in Blutproben von Diabetikern. Hämoglobin ist ein Proteintetramer bestehend aus vier Ketten (Untereinheiten) von Aminosäuren mit jeweils ca. 143 Einheiten und mit einem Gesamtmolekulargewicht von ca. 64.000. An einem Ende des Moleküls (der NH&sub2;-Terminus der beta-Untereinheit) kommt eine Valineinheit vor, die mit Glukose reagieren kann. Die Glukosilierung von Hämoglobin erfolgt durch nichtenzymatische Peaktion mit Glukose und der alpha-Aminogruppe des Valins. Nach Bildung einer Schiff'schen Base zwischen den Reaktanten kommt es zu einer Amadori-Umlagerung der Glukose unter Bildung von 1-Deoxyfructo-valin. Diese Komplexbildung ist kovalent und im wesentlichen irreversibel. Die Glukosilierungsreaktion wird durch die Konzentration der Reaktanten, z.B. Hämoglobin und Glukose, gesteuert. Bei einem normalen Individuum (Nichtdiabetiker) ist ca. 3 % des gesamten Hämoglobins glukosiliert. Hämoglobintetramere mit einem 1-Deoxyfructo-valin am N-Terminus einer beta-Kette werden als glukosiIiert oder Alc Hämoglobin identifiziert.
• Der Glukosespiegel bei Diabetikern hoch genug, um die Glukosilierungsrate in direkter Abhängigkeit vom Glukosespiegel im Blut zu steigern, was die Schwere der Diabeteserkrankung wiederspiegelt. Der Alc Spiegel mit Hämoglobin ist auf ca. 5 bis 12 % erhöht. Da die Halbwertzeit von Hämoglobin im Blutkreislauf ca. 120 Tage beträgt, liefert die Messung von glukosiliertem Hämoglobin einen Wert, der den mittleren Glukosespiegel für diesen Zeitraum wiedergibt. Bemerkenswerterweise schlägt sich eine hoch glukosehaltige Mahlzeit nicht in einem hochglukosiliertem Hämoglobin- oder Serumalbuminspiegel nieder. Daher liefert die Messung des glukosilierten Hämoglobingehalts ein genaueres Bild des mittleren Glukosespiegels im Blutkreislauf und bietet daher ein genaueres Bild über den Langzeitzustand des Patienten.
• Das US-Patent Nr 4,247,533 offenbart ein analytisches Verfahren, worin Antikörper gegen Hb Alc angeblich in einem bestimmten Schaf durch Injektion von Hb Alc erzeugt wurden und an nichtglukosiliertem Hämoglobin absorbiert wurden, um polyklonale Antikörper zu liefern, die zwischen Hb Alc und nichtglukosiliertem Hb unterschieden. Solche Antikörper bilden anschließend die Grundlage für einen Test zur Bestimmung des Anteils an glukosiliertem Hämoglobin in einer Probe. Der Test erfordert jedoch ein geeignet immunisiertes Schaf und Antikörperabsorptionen, um die geeignete Spezifität zu erhalten. Es ist daher kostenaufwendig und schwierig, spezifische polyklonale Antikörper zu produzieren. Die durch dieses Absorptionsverfahren hergestellten Antikörperpräparationen sollen einen niedrigen Titer und Affinität aufweisen. Die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens ist ebenfalls fragwürdig, da keine neueren Berichte vorliegen, die seine Verwendung in der Analyse von klinischen proben menschlichen Hämoglobins beschreiben.
• Ein weiterer Versuch, für Hb Alc spezifische Antikörper zu gewinnen, findet sich im US-Patent Nr. 4,478,744. Hier wurde ein synthetisches Peptidimmunogen für das normale Hämoglobinmolekül als immunisierendes Agens ausgetauscht. Das Material wurde in ein Tier injiziert, z.B. einem Schaf, bei dem normalerweise kein Hb Alc im Blutstrom vorliegt. Das synthetische Peptidimmunogen enthielt einen glukosilierten Peptidrest mit einer Aminosäuresequenz, die der N-terminalen Hämoglobinsequenz zwischen den ersten 4 und 10 Aminosäuren entsprach. Anschließende Untersuchungen, wie im folgenden berichtet, kamen zu dem Ergebnis, daß das polyklonale Schaf-Antiserum gegen das synthetische Peptidimmunogen keine nachweisbare Spezifität für die glukosilierte Form Hb Alc aufweist.
• Im US-Patent 4,478,744 wurde keine Denaturierung der Probe während des Testverfahrens durchgeführt.
• Es besteht daher weiterhin ein Bedürfnis, ein Verfahren zur Entwicklung von Antikörperreagenzien und Bindungsbedingungen zu entwickeln, die die spezifische Bindung eines Antikörperreagens an bestimmte Glycoproteine erlauben. Dies wird insbesondere aus der Unfähigkeit von Wissenschaftlern offenbar, bislang einen Immuntest zur Bestimmung von glukosilierten Proteinen, z.B. Hb Alc, zu entwickeln. Definitionen Aminosäure Abkürzung Arginin Asparginsäure Glutaminsäure Lysin Serin Asparagin Glutamin Glycin Prolin Threonin Alanin Histidin Cystein Methionin Valin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan
• Es wurde gefunden, daß eine hochspezifische Immunbindung an ein bestimmtes Glycoprotein erreicht werden kann, indem ein für die Bindung eines Kohlenhydrat-modifizierten linearen Peptidepitops in einem solchen Protein spezifisches Antikörperreagens gebildet wird und dieses mit dem Protein in Kontakt gebracht wird, nachdem das Protein zur Freilegung oder Erhöhung der Freilegung des darin enthaltenen linearen Peptidepitops ausreichend denaturiert wurde. Das lineare Zielpeptidepitop wird im Prinzip mindestens 2 und im allgemeinen weniger als 15 Aminosäureinheiten umfassen. Das Epitop kann am N- oder C-Terminus einer Peptidkette auftreten oder entlang der Peptidkette im Protein erscheinen, wobei es mit Kohlenhydraten, einschließlich Mono-, Oligo- und Polysaccharidgruppen und auch einschließlich anderer chemischer Gruppen, die kovalent an das Proteingerüst gebunden sein können, modifiziert ist. Solche Gruppen umfassen durch post-translationale Modifikationen zugefügte Gruppen, die enzymvermittelt oder das Ergebnis einer nichtenzymatischen chemischen Reaktion sein können, und umfassen daher Modifikationen, die natürlich im Glycoprotein auftreten oder durch Umwelteinfluß verursacht sind. Das Antikörperreagens wird normalerweise gegen ein synthetisches Peptid, welches das lineare Kohlenhydrat-Peptidepitop gebunden an ein immunogenes Trägermaterial enthält, das im allgemeinen verschieden vom bestimmten Protein ist, erzeugt. Es ist besonders bevorzugt, somatische Zellhybridisierungstechniken einzusetzen, um Antikörper zu erhalten, die monoklonal sind und nach hoher Spezifität gegen das lineare Peptidepitop selektiert sind.
• Die Denaturierung des Glycoproteins kann im wesentlichen nach üblichen Verfahren erfolgen, um so das ausgewählte Peptidepitop freizulegen oder die Freilegung davon für eine Antikörperbindung zu steigern, wobei eine wesentliche Menge des Proteins in Lösung verbleibt. Physikalische oder chemische Behandlung, letztere einschließlich Proteinverdauung, stehen zur Selektion von optimalen Denaturierungsbedingungen zur Verfügung. Der Umfang oder das Ausmaß der Denaturierung wird notwendigerweise im wesentlichen empirisch für jedes protein und für jede beabsichtigte Anwendung der erhaltenen Immunbindung, z.B. Bedingungen für einen erwünschten Immuntest, ermittelt. Der Effekt der Denaturierung dient im wesentlichen dazu, wenigstens die Region des protein zu linearisieren, in der das selektierte Peptidepitop auftritt, und es für das umgebende wäßrige Medium ausreichend zur Bindung an das Antikörperreagens freizulegen.
• Die vorliegende Erfindung erlaubt die Durchführung eines Immuntests und die Herstellung eines Reagenssystems zur Bestimmung von Glycoproteinen, die an das Antikörperreagens gegen Kohlenhydrat-modifizierte lineare Peptidepitope binden, die beim Protein im nativen Zustand im wesentlichen unzugänglich sind oder eine beschränkte Zugänglichkeit für die Immunbindung aufweisen. Es werden insbesondere Mittel zur hochspezifischen Bestimmung von glukosiliertem Hämoglobin und Albumin und insbesondere Hb Alc in biologischen Flüssigkeiten wie Blut zur Verfügung gestellt. Es wurde gefunden, daß monoklonale Antikörper, die gegen synthetische glukosilierte N-terminale Peptidreste, wie sie in Hb Alc auftreten, erzeugt wurden, spezifisch an solche Reste in der glukosilierten beta-Untereinheit des Hämoglobins binden. Die Antikörper können nach einer Vielzahl von Verfahren entsprechend üblichen monoklonalen Techniken hergestellt werden. Prinzipiell werden die Antikörper gegen ein synthetisch abgeleitetes Immunogen erzeugt, das den bestimmten glukosilierten N-terminalen Peptidrest chemisch an einen Immunträger gebunden enthält, wobei das glukosilierte Peptid mindestens 2 und vorzugsweise von ca. 5 bis 15 Aminosäureeinheiten entsprechend Hb Alc umfaßt. Die erhaltenen Antikörper sind spezifisch gegen das glukosilierte synthetische Peptid und das entsprechende freigelegte Epitop auf dem Hämoglobin Alc Molekül.
• Die Zeichnungen sind grafische Darstellungen, welche die experimentellen Daten aus den unten folgenden Beispielen betreffend den Immunnachweis von Hb Alc wiedergeben.
• Fig. 1 ist eine Auftragung zur Darstellung der Inhibierung der Ab-3 Bindung an Alc durch Glycopeptid 1 (PEPTID 1). Der Antikörper wurde mit dem Glycopeptid vor Transfer auf eine Alc beschichtete Mikrotiterplatte vorinkubiert. Der monoklonale Antikörper, der an Alc bindet, wurde unter Verwendung eines sekundären Antikörperenzyms nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 als Prozent-Inhibierung dargestellt, wobei 0 % Inhibierung der ohne Kompetitor erhaltene Wert ist. Die 0 - 0 Linie stammt von einem identischen Peptid, dem das Kohlenhydrat fehlt, was darauf hinweist, daß das Kohlenhydrat für die Antikörperbindung wesentlich ist. Alle Punkte geben das Mittel von Dreifach-Messungen wieder.
• Fig. 2 ist eine grafische Darstellung der Inhibierung der Ab-3 Bindung an Alc durch Glycopeptid 3 (PEPTID 3). Das Verdrängungsexperiment wurde wie in Fig. 1 beschrieben durchgeführt
• Fig. 3 ist eine grafische Darstellung der Inhibierung von Ab-3 und Ab-4 durch Glycopeptid 4 (PEPTID 4) für die Alc Bindung. Das Verdrängungsexperiment wurde wie in Fig. 1 beschrieben durchgeführt.
• Fig. 4 ist eine typische Standardkurve unter Verwendung optimaler Testbedingungen. Der Vollblutstandard wurde hergestellt unter Verwendung verschiedener Verhältnisse von denaturiertem Vollblut eines Diabetikers mit 12,66 % Alc, gemessen durch HPLC Ionenaustausch mit dem Vollblut eines Normalspenders (3,83 % Alc) Alle Punkte sind als Dreifachbestimmungen ermittelt.
• Fig. 5 ist eine Standardkurve unter Verwendung eines synthetischen Peptidstandards. Der Test wurde wie in Fig. 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Vollblut verschiedene Mengen eines synthetisierten Glycopeptids als Kompetitor verwendet wurden. Alle Werte wurden als Dreifachbestimmungen wiedergegeben.
• Fig. 6 ist eine grafische Darstellung des Vergleichs des Immuntestverfahrens mit einem Boronat-Affinitätsverfahren für Spender. Die Mittel von Dreifachbestimmungen sind für die Immuntest-Koordinate wiedergegeben.
• Fig. 7 ist eine grafische Darstellung zur Demonstration der Freilegung des Hb Alc Epitops unter verschiedenen Denaturierungsbedingungen.
• Fig. 8 ist eine grafische Darstellung des Ergebnisses der Immunisierung eines Schafes mit dem synthetischen Glycopeptid aus Beispiel 1(b).
• Fig. 9 ist eine grafische Darstellung zur Demonstration, daß monoklonale Maus-Antikörper spezifisch für Alc Hämoglobin sind.
• Ein Polypeptid oder Protein existiert als eine lineare Sequenz von Aminosäuren, die in Lösung eine dreidimensionale Struktur ausbilden. Die Faktoren, die die spontane Anordnung dieser dreidimensionalen Struktur eines Proteins kontrollieren, sind wie folgt:
• 1. Die planare Struktur einer Peptidbindung mit einer beschränkten Rotation um das Calpha und C' Kohlenstoffatom (Psi Bindungsrotation) und um die N-Calpha Stickstoff-Kohlenstoffbindung (Phi Bindungsrotation). Diese beschränkte Rotation schränkt die Bewegung um die Peptidbindung ein und vermindert die Gesamtanzahl möglicher Konformationen.
• 2. Die Aminosäure-Seitenketten (R-Gruppen) weisen eine Trans-Orientierung auf, da ein all-cis-Polypeptid eine deutliche Einschränkung des verfügbaren Konformationsraums für die Seitenkettenatome aufweist.
• 3. Wechselwirkungen zwischen verschiedenen funktionellen Gruppen des Peptidgerüsts und Seitenketten sind für die dreidimensionale Faltung eines Polypeptids verantwortlich, und die Summe dieser Wechselwirkungen liefert die Energie, aufgrund welcher das Protein seine Konformation beibehält.
• Diese Wechselwirkungen umfassen:
• (a) Dispersionskräfte - wobei oszillierende Dipole zwischen nebeneinander liegenden Atomen koppeln und dadurch eine Anziehungskraft zwischen den beiden Atomen hervorrufen. Diese Kräfte werden im Gleichgewicht gehalten durch die Abstossung der Elektronenschalen (z.B. können zwei Atome nicht den gleichen Platz einnehmen).
• (b) Wasserstoffbindung - wobei die gesamte Elektronenschale eines Wasserstoffatoms sich auf das Atom bewegt, an welches der Wasserstoff gebunden ist (Wasserstoffakzeptor).
• (c) elektrostatische Kräfte - wobei verschiedene Typen von Atomen eine asymmetrische Elektronenverteilung haben und dadurch eine Teilladung tragen, die mit Atomen, welche die entgegengesetzte Ladung tragen, in Wechselwirkung treten kann. Diese Wechselwirkung kann eine einfache Dipolwechselwirkung sein oder als Salzbrücke existieren.
• (d) Disulfidbindungen - zwischen SH-Gruppen von Cysteinaminosäuren stabilisieren die Proteinkonformation. Die Bildung einer Disulfidbindung ist sekundär zu der durch Dispersionskräfte, Wasserstoffbindung und elektrostatische Kräfte wie oben beschrieben bewirkten dreidimensionalen Faltung des Proteins.
• 4. Wechselwirkung des Proteins mit der wäßrigen Umgebung hat einen einflußreichen Effekt bei der Organisation der Selbstanordnung von wasserlöslichen Proteinen. Die polaren Wassermoleküle solvatisieren hydrophobe Gruppen auf der Oberfläche des Proteins und bevorzugen thermodynamisch die Einkapselung von hydrophoben Aminosäure-Seitenketten in das Innere des Moleküls (so daß sie in einer ähnlichen hydrophoben Umgebung vorliegen). Bei einer jüngsten Untersuchung von bekannten Proteinen ergab sich, daß ein größerer Teil der Oberfläche der hydrophoben Aminosäuren Phe, Leu, Ile, Val, Trp und Tyr im Inneren des Proteins eingeschlossen vorliegt als neutrale oder polare Aminosäuren (Science 229: 834-838, 1985). Es soll ebenfalls darauf hingewiesen werden, daß viele Reste auf der Proteinoberfläche hydrophob sind und daß eingeschlossene Reste polar oder sogar geladen sein können. Die eingeschlossenen polaren Gruppen erfüllen im allgemeinen die Anforderungen für eine Wasserstoffbindung im Inneren des Proteins, und 90 % der gesamten internen polaren Gruppen sind an Wasserstoffbindungen beteiligt. In gleicher Weise sind geladene Aminosäuren im Proteininneren höchstwahrscheinlich bei Salzbrücken beteiligt.
• Die Konformation eines Proteins kann in eine Strukturhierarchie wie folgt aufgeteilt werden.
• 1. Die Primärstruktur ist die lineare Aminosäuresequenz des Polypeptids.
• 2. Die Sekundärstruktur betrifft die Weise, in welcher die Polypeptidkette durch Wasserstoffbindung stabilisiert ist.
• 3. Die Tertiärstruktur ist die strukturelle Faltung der Polypeptidkette. Diese Struktur wird durch Wasserstoffbindungen, elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und durch Disulfidbindungen stabilisiert.
• 4. Die Quartärstruktur betrifft die Struktur, die gebildet wird, wenn zwei Polypeptidketten miteinander in Wechselwirkung treten. Die Arten der Wechselwirkungen sind dieselben wie für die Tertiärstuktur.
• Die beschriebenen Wechselwirkungen des Polypeptids mit dem Polypeptid und mit der wäßrigen Umgebung sind für die komplexe Faltung und für die dadurch resultierende dreidimensionale Struktur von nativen Proteinmolekülen verantwortlich. Die Information für diese Faltung ist in der Aminosäuresequenz des Polypeptids (Primärstruktur) kodiert. In vielen Fällen können native Proteine durch Behandlung mit physikalischen oder chemischen Denaturierungsmitteln total denaturiert werden (was durch ein Fehlen einer Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur deutlich wird) und können nach Entfernung des Denaturierungsmittels sich in ein Molekül zurückfalten, das in Struktur und Funktion vom nativen Protein ununterscheidbar ist (Adv. Prot. Chem. 29: 205-299, 1975; Journal of Biol. Chem. 251: 3154-3157, 1976).
• Der Faltungsprozeß ist energetisch bevorzugt und die resultierende native dreidimensionale Konformation liegt im Stadium minimaler freier Energie vor (oder ist mindestens nahe daran). Als Folge der Faltung des Polypeptids in eine dreidimensionale Konformation sind einige Aminosäuren auf der Oberfläche des Moleküls dem umgebenden Lösungsmittel frei zugänglich, wogegen andere Aminosäuren eingeschlossen sind und für das Lösungsmittel unzugänglich sind. Dieses Konzept wird durch eine große Anzahl von biophysikalischen Daten und auch durch die Unterschiede in den chemischen Reaktivitäten von Aminosäuren auf der Proteinoberfläche im Gegensatz zu solchen im Proteininneren unterstützt.
• Die dreidimensionale Konformation ist keinesfalls eine feste Struktur. Die meisten der zuvor beschriebenen Wechselwirkungen sind relativ schwach und brechen ständig auf und bilden sich erneut (zu einem Zeitpunkt wird jedoch nur ein kleiner Prozentsatz der Gesamtbindungen gebrochen). Man könnte erwarten, daß die Peptidsegmente mit den geringsten Wechselwirkungen eine größere Mobilität als Peptidsegmente mit einer größeren Anzahl von Wechselwirkungen zeigen. Die Segmente mit der größeren Mobilität könnten eine größere Anzahl von Konformationen einnehmen, von denen eine zur Wechselwirkung mit einem Antikörper in der Lage sein kann. Es wurde vorgeschlagen, daß diese mobilen Anteile von nativen Proteinen diejenigen sind, die die höchste Antigenität aufweisen (Nature 312: 127-132, 1984).
• Die Wechselwirkungen zwischen einem Antigen und einem Antikörper sind dieselben wie jene, die die Proteinstruktur stabilisieren (z.B. Wasserstoff, elektrostatische, hydrophobe Bindungen). Damit die Wechselwirkung spezifisch ist und ausreichende Affinität zeigt, ist es notwendig, die Komplementarität der zwei wechselwirkenden Oberflächen und eine ausreichende Annäherung von gegensätzlich geladenen Gruppen, die Salzbrücken bilden, Wasserstoffbindungsdonatoren und -akzeptoren und hydrophobe Taschen aufrechtzuerhalten (Ann. Rev. Immunol. 1: 87-117, 1983). Falls sich die Komplementärität verändert (z.B. durch Aminosäure-Substitution), kann die Affinität des Antikörpers für das Antigen drastisch verändert sein.
• Die Kontaktstellen auf dem Antigen können in zwei Gruppen eingeteilt werden (1) die linearen oder sequentiellen und (2) die konformellen (Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984).
• Lineare oder sequentielle Determinanten sind solche, bei denen die gesamte antigenische Determinante auf einem einzelnen linearen Segment einer Proteinsequenz gefunden wird, die einen Bereich von ca. 2 bis 15 Aminosäuren aufweist und im allgemeinen weniger als 10 Aminosauren hat.
• Konformelle Determinanten sind solche, bei denen Anteile von Peptiden, die in der Sequenz entfernt liegen, in engen Kontakt miteinander durch dreidimensionale Faltung des Proteinantigens kommen. Daher wird die antigene Determinante oder das Epitop aus mehr als einem Teil des Proteinantigens gebildet. Zum Beispiel haben Röntgen-Diffraktionsuntersuchungen mit Lysozym und einem monoklonalen Antikörper gegen Lysozym gezeigt, daß der Antikörper mit dem Lysozym an den Positionen 29-37 und 116-129 in Kontakt steht. Obwohl diese Aminosäuren in der Sequenz auseinanderliegen, bilden sie eine zusammenhängende Fläche von ca. 20x25Å auf der Oberfläche des Lysozymmoleküls und können mit einer Vielzahl von Atomen der Antikörper-Bindungsstelle in Wechselwirkung treten (Nature 313: 156-158, 1985). Es folgt auch daraus, daß Antikörper, die konformelle Determinanten erkennen, nicht die denaturierte Form des Proteins erkennen.
• Beim konventionellen Immunisierungsverfahren zur Erzeugung von Antiprotein-Antikörper wird ein natives oder halbnatives Protein in das Tier injiziert, welches nach einer Zeit Immunoglobuline gegen das Immunogen produziert. Ein polyklonales Antiserum enthält sehr wahrscheinlich Antikörper, welche sowohl sequentielle und konformelle antigenische Determinanten erkennen. Diese Determinanten sind höchstwahrscheinlich auf der Oberfläche des nativen Proteins angeordnet. Zum Beispiel hat das Hämaglutinmembran Glycoprotein des Grippevirus vier hauptantigenische Determinanten, von denen drei auf der Oberfläche des Glycoproteins lokalisiert sind (Nature 289: 366-373 und 373-378, 1981).
• Falls ein synthetisches Peptid oder kleines Peptid aus einem nativen Molekül als Immunogen verwendet wird, kann die erhaltene Antwort nur gegen sequentielle Determinanten erfolgen (und eine begrenzte Anzahl von Konformationen, die das Peptid einnehmen kann). Bei Versuchen zur Verwendung synthetischer Peptide als Immunogene zur Auslösung einer Antikörperantwort, welche gegen das native Protein binden (mit derselben Sequenz als das synthetische Peptid), haben Forscher zunachst Immunogene entwickelt, indem sie die Sequenz des nativen Proteins auf Regionen mit mehreren polaren Aminosauren durchsuchten (Rev-Science 229: 932-940, 1985). Diese Sequenzen sollten statistisch eine größere Wahrscheinlichkeit haben, auf der Oberfläche des nativen Proteins zu liegen, und könnten frei zur Reaktion mit dem Antikörpermolekül sein. Daher dachte man auch, daß hydrophile Reste weniger immunogen seien als hydrophobe Peptide, und so synthetisierten andere Forscher Immunogene basierend auf der Hydrophobizität, in der Hoffnung, daß diese hydrophoben Sequenzen auf den Oberflächen-Antigenen angeordnet sein sollten. In beiden Fällen reagiert ein hoher Anteil der durch diese Strategien erzeugten Antikörpers mit dem scheinbar nativen Antigen, was nahelegt, daß, solange das synthetische Peptid einer Sequenz entspricht, die auf der Oberfläche eines nativen Proteins gefunden werden kann, ein Antikörper, der gegen das synthetische Peptid gewonnen wurde, auch mit dem nativen Antigen reagieren würde (Nature 299: 592-596, 1982). Es gibt eine Reihe von Berichten, daß gegen gewisse synthetische Peptide erzeugte Antikörper, wobei die Peptide solchen entsprechen, die als eingeschlossen innerhalb des Proteins angesehen werden, mit dem scheinbaren nativen Protein reagieren (PNAS 80: 4949-4953, 1983). Es ist unklar, welcher Mechanismus für diese Beobachtung verantwortlich sein könnte.
• Für die vorliegende Erfindung wird ein natives Glycoprotein zweckmäßigerweise denaturiert, um die sequentiellen oder linearen antigenischen Determinanten in optimaler Weise freizulegen, so daß sie mit Antikörpern, die gegen diese Determinanten hergestellt wurden, in Wechselwirkung treten Insbesondere in einem Test, der eine frische, echt natives Antigen enthaltende Probe erfordert, ist die Denaturierung des Antigens eine absolute Voraussetzung. Falls das Epitop des nativen Proteins an oder nahe auf der Oberfläche ist und daher teilweise für die Antikörper-Wechselwirkung freiliegt, kann die Denaturierung seine Mobilität erhöhen und zu einem Anstieg der Anzahl möglicher Konformationen, die es einnehmen kann, führen und dadurch die Antikörper-Antigen Wechselwirkung beschleunigen.
• Viele vorhandene Immuntestformate umfassen die Verwendung niedriger Konzentrationen von Detergenzien, z.B. Triton und Twenn-20 , um nichtspezifische Adsorption der Reaktanten in der klassischen Antikörper-Antigen Reaktion zu verhindern, um proteine von biologischen Membranen zu dissoziieren oder Lipide von Lipoproteinen unter Bereitstellung einer homogenen Probe des entlipidisierten Proteins abzutrennen (Biochem. Biophys Acta 620: 447-453, 1980; Clin. Chem. 28: 199-204, 1981) . Es ist das erklärte Ziel der vorliegenden Erfindung, die Glycoprotein-Determinante eines Proteinantigens durch Denaturierung der sekundären, tertiären und quartären Struktur des nativen Proteins unter Verwendung von physikalsichen und/oder chemischen Denaturierungsmitteln freizulegen. Das freigelegte Peptidepitop liegt anschließend ungebunden vor und kann die Konformationen des synthetischen Peptids einnehmen, gegen welches die Antikörper erzeugt wurden.
• Der sterische Zugang des Antikörperreagens zum Epitop kann in jeder wirksamen Weise erfolgen. Freilegung des Epitops in einem intakten Glycoprotein wird normalerweise als physikalische oder chemische Denaturierung oder Verdauung von mindestens der Epitopregion verstanden. Solche Denaturierung oder Verdauung kann auf die Region des Epitops lokalisiert sein, oder kann eine allgemeine oder im wesentlichen die gesamte Denaturierung der tertiären und zusätzlich der sekundären Struktur des Proteins, oder eine teilweise oder vollständige Verdauung des Proteins umfassen.
• Die Denaturierung kann auf eine Vielzahl von Arten erfolgen, einschließlich üblicher Behandlung des Proteins durch physikalische Mittel, wie z.B. Hitze, Ultraschall, hoher oder niedriger pH, und bevorzugt chemische Denaturierung durch Verdauung oder Wechselwirkung mit einem chaotropen Agens oder einem Chaotrop in Lösung. Geeignete chaotrope Mittel umfassen, ohne Beschränkung, Guanidin, Harnstoff und eine Reihe von Detergenzien wie Natrium-dodecylsulfat (SDS) und andere, ohne Einschränkung, einschließlich Deoxycholat und bestimmte Gallensalze, 3-(3-Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio- 1-propansulfonat, organische Lösungsmittel wie Methanol, Propanol, Acetonitril und bestimmte Salze wie Kaliumthiocyanat, nichtionische Detergenzien wie Triton X , Tween , Nonidet NP-40 und Octyl-glycoside können ebenfalls als Denaturierungsmittel für Protein dienen. Zusatz von Reagenzien (z.B. Mercaptoethanol oder Dithiothreitol), die die Sulfidbindungen verringern, können wirksam den Denaturierungsprozeß beschleunigen Die Proteindenaturierung kann besonders effektiv erreicht werden, wenn Kombinationen von chemischen und/oder chemischen und physikalischen Mitteln eingesetzt werden (z.B. Guanidin und Hitze, Guanidin und SDS oder Guanidin und Dithiothreitol). Insbesondere starke Chaotrope wie Guanidin sind besonders bevorzugt. Natürlich müssen denaturierende Bedingungen, die zu einer wesentlichen Aggregation, Unlöslichkeit und Präzipitation des Proteins führen, so daß nur eine unwesentliche Menge des freigelegten Epitops in der Lösung für die Antikörper zugänglich ist, vermieden werden. Eine wirksame Menge des denaturierten Proteins muß in Lösung oder Suspension verbleiben, um zur Immunbindung geeignet zu sein. Das Ausmaß der notwendigen Solubilisierung wird von Umständen der beabsichtigten oder erwünschten Bindung abhängen.
• Eine wesentliche Menge des erwünschten Proteins in einer bestimmten Probe kann denaturiert werden, um das Peptidepitop zur Antikörperbindung freizulegen, durch Zusammengeben der Probe mit einer wäßrigen Lösung des Chaotrops, welches in einer ausreichenden Konzentration zur Denaturierung einer wesentlichen Menge des Proteins in der erhaltenen wäßrigen Mischung vorliegt. Bei Vollblut als Probe zur Bestimmung von Hb Alc dient das Chaotrop auch zur Lyse der roten Blutzellen, zur Freisetzung von Hb und zur Inaktivierung von Proteasen. Im Fall von Guanidin ist die Konzentration in der Mischung vorzugsweise größer als ca. 1 Molar, wobei eine Konzentration von ca. 3 Molar besonders geeignet ist. Der Denaturierungsprozeß wird wirksam beschleunigt durch Erhitzen der Mischung für einen kurzen Zeitraum. Es wurde gefunden, daß bei einer Temperatur unter 37ºC die Denaturierung durch das Chaotrop eine bis mehrere Stunden dauern kann, wogegen Temperaturen über 50ºC eine ausreichende Denaturierung in einer Minute oder weniger erlauben. Um eine deutliche Denaturierung des Antikörpers und anderer proteinöser Reagenzien, die anschließend der Mischung zugesetzt werden, zu verhindern, wird die Proben-Chaotropmischung normalerweise in einem Einzelschritt oder durch Zusatz einer Reagenslösung auf ein Maß verdünnt, daß das Chaotrop praktisch unwirksam ist, solche Reagenzien zu denaturieren, jedoch ausreicht, die Freilegung des Epitops durch Verhinderung einer wesentlichen Denaturierung des speziellen Proteins sicherzustellen. Für Guanidin erfordert die bevorzugte Verdünnung eine Konzentration von weniger als ca. 1,0 Molar, wobei 0,3 Molar besonders bevorzugt ist.
• Nicht limitierende Beispiele von proteolytischen Enzymen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zur Verdauung umfassen Trypsin, Chymotrypsin, prolinspezifische Endoprotease, Pepsin und Papain. Bei der Durchführung eines Immuntests werden bekannte Inhibitoren für proteolytische Enzyme zur Testmischung zugesetzt, die ausreichend ist, die Verdauung von proteinartigen Testagenzien zu verhindern
• Die Erfindung kann im wesentlichen auf jedes gewünschte Glycoprotein angewendet werden, einschließlich solcher mit einem niedrigeren Molekulargewicht, z.B. 5.000 Dalton oder weniger (der hier verwendete Begriff Protein soll solche Verbindungen umfassen, die als Polypeptide aufgrund ihres Molekulargewichts bezeichnet werden), wie auch solche mit einem Molekulargewicht von mehreren Hundertausend oder mehr. Ein besonders vorteilhaftes Merkmal der Erfindung ist, daß sie einen allgemeinen Weg zur Verbesserung der Spezifität der Bindung und Nachweis von Proteinen von analytischem Interesse zur Verfügung stellt, wie z.B. im Bereich von Medizin- und Veterinärdiagnostika. Die Erfindung ermöglicht sonst unzugängliche oder verborgene lineare Peptidfragmente oder Regionen in einem Protein auf Epitope zu durchmustern, die ein hohes Ausmaß an Immunogenität wie auch Spezifität und Bereitschaft zur Antikörperbindung aufweisen. Anwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen daher jede Situation, bei der es erwünscht ist, ein bestimmtes Glycoprotein an ein Antikörperreagens zu binden, und welches selbst denaturierende Bedingungen für das Protein bereitstellt.
• Die vorliegende Erfindung ist besonders geeignet für Immuntests und Reagenssysteme zur spezifischen Bestimmung eines bestimmten Proteinanalyten. Die vorliegende Erfindung ermöglicht das Auffinden neuer und nützlicher Kohlenhydrat-modifizierter linearer Peptidepitope und die Steigerung der Zugänglichkeit solcher Epitope in bestimmten Proteinen. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung zur Entwicklung eines Antikörperreagens und zur Festlegung der Bindungsbedingungen, was einen erfolgreichen oder verbesserten spezifischen Nachweis des Glycoproteins auch in Fällen erlaubt, worin das charakterisierende Epitop unzugänglich oder nur beschränkt für die Antikörperbindung im nativen protein zugänglich ist. Beispiele solcher Glycoproteine, insbesondere im medizinischen und diagnostischen Feld, umfassen naheliegenderweise glukosiliertes Hämoglobin (z.B. Hb Alc) und glukosiliertes Albumin. Eine andere Anwendung der Erfindung liegt darin, Epitope in Proteinen zu finden, die eine spezifischere und/oder eine höhere Bindungsaffinität haben als solche, die zur Antikörperbildung und -bindung auf den normalerweise freigelegten Teilen zur Verfügung stehen. Durch Immunisierung eines bestimmten Wirtstieres mit einer geeignet denaturierten Form eines Proteins oder eines Fragments davon kann man die erhaltene Immunantwort auf Antikörper untersuchen, die die erwunschte gesteigerte Spezifität und/oder Avidität zeigen Eine Ausdehnung dieser Anwendung liegt im spezifischen Nachweis von zellulären Analyten wie Blutzellen, Mikroorganismen einschließlich Bakterien und Viren, und ähnlichen. Wo es wünschenswert ist, die Spezifität des Nachweises über diejenige, welche durch Antikörperbindung auf Oberflächen-Proteinantigene geliefert wird, zu verbessern, kann man die internen Epitope durch Denaturierung der Oberflächenproteine und/oder Proteine innerhalb der Zelle zur Suche nach einer verbesserten Antikörperantwort überprüfen.
• Die Immuntestbestimmung eines Glycoprotein-Analyten unter Verwendung des vorliegenden Antikörperreagenzes, welches spezifisch für ein lineares Peptidepitop ist, mit der Denaturierung des Proteinanalyten in der Probe oder Testmediums kann nach im wesentlichen üblichen Methoden erfolgen. Solche umfassen die klassischeren Techniken wie Immundiffusion, Immunelektrophorese, Agglutinationtechniken und Komplementfixierung, wie auch neuere Techniken, die die Verwendung von spezifisch nachweisbaren Markierungen umfassen, wie z.B. Radioimmuntest und nichtradioisotropische Verfahren. Die Durchführung eines Immuntests für einen Proteinanalyten unter Einsatz der vorliegenden Erfindung beinhaltet die wesentlichen Schritte: Behandlung der wäßrigen Testprobe zur effektiven Denaturierung einer wesentlichen Menge eines solchen Proteins zur Freilegung des erwünschten linearen Peptidepitops, Inkontaktbringen der denaturierten Probe mit dem Antikörperreagens und Bestimmung der Bindung des Antikörperreagenzes an das Protein. Der Denaturierungsschritt wird natürlich in Abhängigkeit von der eingesetzten Grund-Immuntesttechnik variieren. Eine übliche Technik zur Durchführung dieser Bestimmung umfaßt die Verwendung eines markierten Reagenzes, welches entweder mit dem Analyten oder Antikörperreagens in Wechselwirkung tritt, und wird in einer solchen Weise eingesetzt, um die Bildung des Immunkomplexes zwischen dem Analyten und dem Antikörperreagens anzuzeigen oder mit einer solchen Bildung zu konkurrieren.
• Die letztere Technik kann in einer Vielzahl von Formaten eingesetzt werden, wie dem Verdrängungs-Bindungsformat, bei dem man ein markiertes Reagens mit einem Proteinanalyten zur Bindung an ein Antikörperreagens konkurrieren läßt. Die Menge des markierten Reagens, welches an das Antikörperreagens gebunden ist, oder die freie Spezies, bestehend aus dem markierten Reagens, welches nicht in dieser Weise gebunden ist, wird in geeigneter Weise gemessen und kann mit der Menge des Proteinanalyten in der Probe in Beziehung gesetzt werden. Da das erfindungsgemäße Antikörperreagens gegen ein lineares Epitop auf dem Proteinanalyten gerichtet ist, kann das markierte Reagens als markierte Form des denaturierten Proteins oder eines denaturierten Fragments davon vorliegen oder, wie es bevorzugt ist, als markierte Form eines Peptidrests, welcher die lineare Epitopsequenz der Aminosäuren enthält. Das letztere bevorzugte Reagens kann durch übliche synthetische Peptidverfahren und Geräte hergestellt werden, und erfordert keine Isolierung, Reinigung und Denaturierung des Proteinmoleküls selbst.
• Ein weiteres geeignetes Immuntestverfahren zum Nachweis von Proteinanalyten ist das als Sandwichtechnik bekannte Verfahren. Bei diesem Verfahren werden zwei Sets von Antikörperreagenzien eingesetzt, von denen eines markiert ist und das andere so ausgebildet ist, um eine Trennung des zuletzt markierten ersten Antikörperreagenzes, welches an den Proteinanalyten gebunden ist, von dem, welches ungebunden ist, durchzuführen. Das unmarkierte zweite Antikörperreagens ist typischerweise immobilisiert oder liegt, wie im Stand der Technik bekannt, in immobilisierter Form vor.
• Bei Radioimmuntests muß die freie Spezies und die gebundene Spezies physikalisch unterscheidbar sein oder getrennt werden, um die Messung der Markierung zu erlauben, da das durch die Markierung erzeugte Signal qualitativ dasselbe in beiden Spezien ist. Ein solches Verfahren ist im Stand der Technik als heterogen bekannt, da es eine Phasentrennung erfordert. Andere heterogene Immuntesttechniken sind bekannt, einschließlich enzymmarkierten Immuntests, manchmal als ELISA-Technik bezeichnet (siehe US Patent Nr. 3,654,090), und Fluoreszenzimmuntests (siehe US Patente Nr. 4,201,763, 4,133,639 und 3,992,631).
• Erst kürzlich sind eine Anzahl von Immuntestverfahren entwickelt worden, welche den Trennungsschritt durch Verwendung einer Markierung umgehen, deren nachweisbares Signal durch Bindung des markierten Reagens an einen Bindungspartner, z.B. an einen Antikörper, moduliert wird. Solche Techniken sind als homogen bekannt und sind, falls einsetzbar, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, da keine Abtrennung erforderlich ist und keine Radioisotope beteiligt sind. Solche Techniken sind die Fluoreszenzlöschung und -verstärkung (siehe US Patent Nr. 4,160,016), Energietransfer-Immuntest (siehe US Patent Nr. 3,996,345) und Doppelantikörper-Sterischer-Hinderungsimmuntest (siehe US Patente Nr. 3,935,074 und 3,998,943). Besonders bevorzugte homogene Immuntestverfahren sind solche, bei denen eine Markierung verwendet wird, die in einer enzymkatalysierten Reaktion teilnimmt. Beispiele sind der substratmarkierte Immuntest (siehe US Patent Nr. 4,279,992 und Britische Patentanmeldung 1,552,607), ein Immuntest, bei dem die prosthetische Gruppe (FAD)-markiert ist (siehe US Patent Nr 4,238,565), der Enzymmodulator markierte Immuntest, z.B. bei Verwendung von Inhibitormarkierungen (siehe US Patente Nr. 4,134,92 und 4,273,866) und der enzymmarkierte Immuntest (siehe US Patent Nr. 3,817,837).
• Das erfindungsgemäße Antikörperreagens ist durch seine spezifische Bindungsaffinität zu einem Kohlenhydrat-modifizierten linearen Peptidepitop im bestimmten Protein charakterisiert. Daher bezieht sich der hier verwendete Begriff "Antikörperreagens" auf jedes Material, welches eine Antikörper-Bindungsstelle, die für ein solches Peptidepitop spezifisch ist, enthält. Der Ausdruck umfaßt daher den gesamten Antikörper wie auch geeignete Fragmente oder polyfunktionalisierte Formen davon. Wenn er als Gesamtantikörper vorliegt, kann er zu jeder Klasse und Unterklasse bekannter Immunglobuline gehören, z.B. IgG, IgM usw.. Jedes Fragment eines solchen Immunglobulins, welches die spezifische Bindungsaffinität für das Peptidepitop beibehält, kann ebenfalls eingesetzt werden, z.B. die Fragmente von IgG, in üblicher Weise bekannt als Fab, Fab' und F(ab')&sub2;. Zusätzlich können, wo es geeignet ist, Aggregate, Polymere, Derivate, Konjugate und Hybride von Immunglobulinen oder ihre Fragmente eingesetzt werden.
• Die Immunglobulinquelle für das Antikörperreagens kann nach jeder verfügbaren Methode erhalten werden, z.B. nach üblichen Antiserum- und monoklonalen Verfahren. Antiserum kann nach üblichen Verfahren nach Immunisierung eines Tieres, wie z.B. einer Maus, Kaninchen, Meerschweinchen und ähnlichen, mit einem geeigneten Immunogen erhalten werden. Die Immunglobuline können auch durch somatische Zellhybridisierung erhalten werden, was zu den im allgemeinen als monoklonal bezeichneten Antikörpern führt.
• Monoklonale Antikörperreagenzien sind besonders bevorzugt. Hybridomzellinien werden erzeugt, um Antikörper nur gegen den linearen Peptidepitopteil des Proteinmoleküls anstelle des gesamten Proteins zu produzieren. Solche Zellinien und ihre Antikörper werden durchmustert, um die monoklonalen Antikörper zu identifizieren und isolieren, welche selektiv mit dem erwünschten Epitop reagieren.
• Bei einem Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper wird ein Fragment der Proteinkette, welches der natürlich vorkommenden linearen Peptidepitopsequenz entspricht und diese enthält, an einen Proteinträger gekoppelt und in das Labortier zur Auslösung einer Immunantwort injiziert. Wahlweise kann das Immunogen eine linearisierte oder denaturierte Form des Proteins oder eines Fragments davon enthalten. Lymphozyten, wie z.B. Milzzellen aus dem immunisierten Tier, werden mit Myelomzellen zur Herstellung von Hybridomas fusioniert, die kultiviert und auf Produktion von monoklonalen Antikörpern durchmustert werden. Die monoklonalen Antikörper werden auf solche, die selektiv für das Peptidepitop sind, durchmustert, und die bestimmte Zellinie wird zur Verwendung bei der Produktion zusätzlicher Mengen von monoklonalen Antikörpern kloniert.
• Zur Produktion von Antikörpern gegen ein synthetisches Peptidimmunogen mit einem Labortier, z.B. BALB/c Mäusen, Ratten oder ähnlichen, wird ein Peptid, das das erwünschte Epitop enthält, aus dem natürlich vorkommenden Protein hergestellt und isoliert oder wird chemisch synthetisiert und gereinigt. Ein solches Proteinfragment umfaßt die gesamten kritischen Aminosäureeinheiten des erwünschten Epitops und kann zusätzlich Aminosäureeinheiten umfassen, einige oder alle davon können wahlweise der Sequenz der Aminosäure des bestimmten Proteins entsprechen.
• Zur Sicherstellung der optimalen Antigenität des das Epitop enthaltenden Peptidfragments wird es vorteilhaft mehrfach an ein immunogenes Trägermaterial gekoppelt. Das immunogene Trägermaterial kann ausgewählt sein aus üblicherweise Bekannten mit funktionellen Gruppen, die zur Kopplung des Peptidrests zur Verfügung stehen. In den meisten Fällen wird der Träger ein Protein oder Polypeptid sein, obwohl andere Materialien wie Kohlenhydrate, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nukleinsäuren und ähnliche von geeigneter Größe und Immunogenität in gleicher Weise eingesetzt werden können. Meistens weisen die immunogenen Proteine und Polypeptide ein Molekulargewicht zwischen 4.000 und 10.000.000, vorzugsweise größer als 15.000 im allgemeinen größer als 50.000 auf. Im allgemeinen sind Proteine aus einer Tierspezies immunogen, wenn sie in den Blutstrom einer anderen Spezies eingeführt werden. Insbesonders geeignet sind Proteine wie Albumine Globuline, Hämocyanine Gluteline und ähnliche. Ferner finden sich Hinweise im Stand der Technik betreffend übliche immunogene Trägermaterialien und Verfahren zur Kopplung von Haptenen daran bei Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey USA, 1976); Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24 (1974); Weinryb und Shroff, Drug Netab. Rev. 10: 271-283 (1974); Broughton und Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976) und Playfair et al, Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974).
• Die Zahl der an ein gegebenes immunogenes Trägermaterial dekoppelten Epitope ist nur durch die Zahl der zur Verfügung stehenden Kopplungsstellen auf dem Träger begrenzt und kann mehrere Tausend im Falle von bestimmten synthetischen Polypeptiden mit hohem Molekulargewicht, wie Polylysin, umfassen. Die Epitopdichte auf dem bestimmten Träger hängt vom Molekulargewicht des Trägers ab und der Dichte der zur Verfügung stehenden Kopplungsstellen.
• Optimale Epitopdichten liegen im Hinblick auf die Einfachheit und Reproduzierbarkeit der Immunogensynthese und der Antikörperantwort zwischen ca. 10 % und ca. 50 % der zur Verfügung stehenden Kopplungsgruppen auf dem beteiligten Träger.
• Die Peptidfragmente werden an das Trägermaterial nach üblichen Kopplungsverfahren gekoppelt. Funktionelle Gruppen auf den nativen Aminosäuren im Fragment oder funktionelle Gruppen, die durch chemische Modifikation des Fragments eingeführt wurden, werden normalerweise zur Direktkopplung oder zur Kopplung durch bifunktionelle Kopplungsreagenzien an die funktionellen Gruppen des Trägers verwendet. Es ist bevorzugt, das Peptidfragment mit einer einzigen, einheitlich reaktiven funktionellen Gruppe auszubilden, um eine unzweifelhafte Kopplung an den Träger zu erhalten.
• Insbesondere stellt die Erfindung Mittel für einen hochspezifischen Immuntest zur Bestimmung von glukosiliertem Hämoglobin in biologischen Flüssigkeiten wie Vollblut zur Verfügung. Es wurde gefunden, daß monoklonale Antikörper gegen die synthetischen glukosilierten N-terminalen Peptidreste in Hb Alc spezifisch an solche Reste in der glukosilierten beta-Untereinheit des Hämoglobins binden. Die Antikörper können nach einer Reihe üblicher monoklonaler Techniken hergestellt werden. Prinzipiell werden die Antikörper gegen ein synthetisch gewonnenes Immunogen hergestellt, das den erwünschten glukosilierten N-terminalen Peptidrest chemisch an einen immunooenen Träger gebunden enthält, wobei das glukosilierte Peptid mindestens 2 und vorzugsweise von ca. 5 bis 15 Aminosaureeinheiten entsprechend Hb Alc hat. Die erhaltenen monoklonalen Antikörper sind spezifisch gegen das glukosilierte synthetische Peptid und gegen das entsprechende freigelegte Epitop für das Hämoglobin Alc Molekül.
• Weitere Einzelheiten über die Herstellung und Verwendung von Hb Alc spezifischen monoklonalen Antikörpern sind der Ausscheidungsanmeldung mit der Nummer EP-A-316 306 zu entnehmen.
• Die Erfindung wird nun durch die folgenden spezifischen Beispiele erläutert.
Beispiel 1 Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen das Glycopeptidepitop in Hb Alc
• a) Ein 11 Aminosäurepeptid, enthaltend die 8 N-terminalen Einheiten des beta-Hämoglobins plus 2 Einheiten Tyrosin plus 1 Einheit Cystein wurde nach Gutte, B. und R.B. Merrifield; J. Am. Chem Soc , 91: 2501 (1969) synthetisiert unter Erhalt des folgenden Peptids:
• NH&sub2;-Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin- Glutaminsäure-Glutaminsäure-Lysin-Tyrosin- Tyrosin-Cystein-COOH.
• Um das Peptid zu glukosilieren, wurden 200 mg des gereinigten Peptids mit 0,25 M Glucose in 20 ml wasserfreiem Pyridin 48 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln umgesetzt. Die Mischung wurde im Vakuum getrocknet. Der erhaltene Sirup wurde in 20 mM Kaliumphosphat, pH 2,95, resuspendiert und über HPLC gereinigt.
• Die Glucopeptid enthaltenden Fraktionen wurden in 0,1 M Triethylammoniumacetat pH 8,5 gelöst und über Affigel-601 Boronat-Affinitätsharz (Biorad) chromatografiert, wobei das Glucopeptid selektiv adsorbiert wird. Das Harz wird mit 0,1 M Triethylammoniumacetat pH 8,5 gewaschen und das Glucopeptid mit 0,1 M Triethylammoniumacetat pH 5,0 eluiert. Das Eluat wird lyophilisiert.
• Das Produkt wird in 1 ml Wasser resuspendiert, mit einem 500fachen molaren Überschuß Dithiothreitol (zur Wiederherstellung der SH-Gruppe des Cysteins) umgesetzt und das reduzierte Peptid über HPLC gereinigt und lyophilisiert. Das Glucopeptid wird bei -20ºC unter N&sub2; bis zur weiteren Verwendung gelagert.
• b) Ein KLH-MBC Konjugat, wie zuvor bei Lerner, R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3403 (1981) beschrieben, wird mit dem Produkt aus (a) in einem 2fachen molaren Verhältnis des Glycopeptids zu Maleinimid auf dem Träger in 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,2, 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt.
• c) Die Lösung aus (b) wird mit einem gleichen Volumen an Freund'schen kompletten Adjuvans unter Bildung einer Wasser-in-Öl Emulsion vermischt, und 200 ug des Konjugats werden in BAlb/cBy Mause injiziert Die Mäuse werden nach 30 und 60 Tagen geboostet, getötet und ihre Milz zur Fusion nach Kohler und Milstein, Nature 256:
• 495 (1975) unter Bildung zahlreicher Hybridomas verwendet. Die Hybridomas werden durchmustert auf solche, die monoklonale Antikörper spezifisch gegen das glukosilierte Peptidepitop produzieren.
• Das Durchmustern nach Alc spezifischen monoklonalen Antikörpern wird unter Verwendung eines ELISA Formats durchgeführt, worin das Antigen auf Polystyrol-Mikrotiterplatten (Linbro) absorbiert ist. Die Antigene sind gereinigtes humanes Alc und nichtglukosiliertes Ao Hämoglobin. Das Alc wird aus einem roten Blutzellenhämolysat unter Verwendung von zwei verschiedenen chromatografischen Verfahren gereinigt. Die erste Reinigung besteht aus der Bindung von glukosiliertem Hämoglobin an ein Boronat-Affinitätsharz, wie beschrieben bei Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA, Produkt Nr. 42.000. Typischerweise werden 1 bis 5 Gramm Hämoglobin auf 100 ml Boronatharz aufgegeben und die gebundene (Glycohämoglobin) Fraktion eluiert, wie beschrieben bei Pierce Chemical Co., GlycoTest Bulletin, Produkt Nr. 42.000. Die eluierte Glycohämoglobin-Fraktion wird in einen Puffer mit niedriger Ionenstärke equilibriert und auf einem Ionenaustauschharz, wie beschrieben bei McDonald, M. et al, J. Biol. Chem., 253: 2327-2332 (1978), chromatografiert. Der Alc "Peak" wird durch isoelektrische Fokussierung und Kohlenhydratanalyse unter Verwendung des Thiobarbituratsäure-Tests analysiert und die Ergebnisse bestätigen, daß diese Reinigung ultrareines Alc Hämoglobin lieferte, wobei das gereinigte Material in beiden Fällen Kohlenhydrat aufweist und von normalem Ao Hämoglobin im isoelektrischen Punkt abweicht. In ähnlicher Weise wurde Ao Hämoglobin durch seine Eigenschaft, nicht an das Boronat-Affinitätsharz zu binden und durch Ionenaustauschchromatografie als Ao "Peak" bei der Ionenaustauschchromatografie-Reinigung gereinigt. Die reinen Alc und Ao Hämoglobine werden auf getrennten Mikrotiterplatten (2 ug pro 100 Mikroliter PBS pro Vertiefung) über Nacht bei 4ºC adsorbiert. Die Platten werden in 1 % Rinderserumalbumin in PBS 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und anschließend 4 mal mit PBS gewaschen. Der Überstand aus jeder Hybridomazellinie wurde zur den Alc und Ao Platten gegeben und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubiert. Die Platten werden 4 mal in PBS gewaschen und ein zweiter Antikörper (Kaninchen-anti-Maus-IgG-peroxidase, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA mit einer 1:5000 Verdünnung in 1 %igem Rinderserumalbumin in PBS) wird zugegeben und einer 60minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unterworfen. Die Platte wird 4 mal in PBS gewaschen, und es werden 200 Mikroliter einer Substratlösung zugegeben (24,3 mM Zitronensäure, 51,4 M Natriumphosphat, pH 5,3, enthaltend 2,2 mM o-Phenylendiamin und 5,2 mM Wasserstoffperoxid). Die Reaktion wird nach 20 Minuten durch Zugabe von 50 Mikroliter 8 M H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und das Produkt der Peroxidasereaktion bei 492 nm abgelesen.
• Aus 200 Ausgangshybridomas, die Antikörper gegen Hämoglobin produzierten, wurden 9 als spezifisch gegen das Alc Epitop identifiziert, wogegen 191 sowohl mit Alc und dem nichtglukosilierten Hämoglobin reagierten Da vorimmunisiertes Mausserum keine nachweisbare Antikörperantwort gegen Ao oder Alc humanes Hämoglobin im ELISA Verfahren aufweist, ist die Hauptimmunantwort gegen die Peptidsequenz mit 8 Aminosäureeinheiten gerichtet, die sowohl Alc und Ao gemeinsam haben. Da das synthetische Peptidimmunogen aus 8 Aminosäureresten besteht, richtet sich die Hauptimmunantwort bei der Maus gegen das Peptid der Hämoglobinsequenz und nicht gegen das Kohlenhydrat (191 der 200 Hybridomas reagieren sowohl mit Ao und Alc). Wie erwartet, weist das immunisierte Mausserum auch Antikörper mit breiter Kreuzreaktion auf, die sowohl mit Ao und Alc reagieren, was nahelegt, daß keine Spezifität für Alc erhalten wird, wenn die Hybridomas nicht auf Reaktivität gegen Alc sondern gegen Ao Hämoglobin durchmustert werden. Die bevorzugten Hybridomas, welche Antikörper gegen Alc Hämoglobin und nicht gegen Ao Hämoglobin lieferten, wurden beim ATCC als ATCC HB 8639 und ATCC HB 8869 am 11. Oktober 1984 und 10. Juli 1985 hinterlegt.
• d) Identifizierung der Peptide, die mit Alc um die Bindung an den Antikörper konkurrieren:
• Die folgenden Peptide werden durch Enzymverdauung des glukosilierten 11 Aminosäure-Stammpeptids erzeugt Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (GLYCOPEPTID 1):
• Alle Peptidfragmente werden über HPLC gereinigt und durch Aminosäuresequenzierung quantitativ bestimmt. Die tryptische Verdauung des Stammpeptids lieferte Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys (GLYCOPEPTID 2). Eine prolinspezifische Endoprotese liefert Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro (GLYCOPEPTID 3). Das Peptid Glyco-Val-His FAD (GLYCOPEPTID 4), worin das Dipeptid an ein N&sup6;-Aminohexyl FAD gekoppelt und anschließend glukosiliert ist, wird nach dem Verfahen von Carrico und Johnson hergestellt, US Patent Nr. 4,255,566, und wurde von Dr. Kin Yip und Dr. R. Buckler, Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA zur Verfügung gestellt.
• In einem typischen Verdrängungstest wurden 8 nMol bis 8 pMol eines jedes Peptids in 100 ul PBS-7,2 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 2,8 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 127 mM NaCl, pH 7,4 mit 100 ul monoklonalem Zellkulturüberstand 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde in eine mit 1 ug Alc Hämoglobin/Vertiefung beschichteten Polystyrol-Mikrotiterplatte gegeben. Wenn das Peptid den Antikörper verdrängt ist der Antikörper nicht zur Bindung von immubilisiertem Alc frei. Die Platte wird 4 mal mit PBS gewaschen. Ein zweiter Antikörper (Kaninchen-anti-Maus-IgG, gekoppelt an Meerrettichperoxidase) wird 30 Minuten zugegeben und die Platte mit PBS gewaschen. Das Substrat (o-Phenylendiamin 2,2 mM) und Wasserstoffperoxid (0,012 %) wurden zugegeben und die gebildete Farbe bei 492 nm gemessen. Die quantitative Bestimmung des Produkts gibt das Ausmaß der Verdrängung wieder, d.h. kein Produkt läßt darauf schließen, daß das konkurrierende Peptid total den Antikörper von der Bindung an immobilisiertes Alc blockiert. Die Ergebnisse legen nahe, daß alle vier der zuvor beschriebenen Glycopeptide einschließlich Glyco-Val-His-FAD wirksame Kompetitoren sind. Einer der Antikörper, Ab-4, wird total von der Bindung an Alc durch GLYCOPEPTIDE 1 bis 4 abgeblockt (siehe Fig. 1-3). Ein weiterer Antikörper, Ab-3, wird durch die GLYCOPEPTIDE 1 bis 3, nicht aber durch GLYCOPEPTID 4 blockiert (siehe Fig. 1-3).
• Peptide, denen das Kohlenhydrat fehlt, zeigen keine verdrängende Inhibierung, was nahelegt, daß das Kohlenhydrat wesentlicher Bestandteil des Epitops ist und die Spezifität für die Antikörper-Erkennung von Alc Hämoglobin (siehe Fig. 1) liefert.
Beispiel 2 Verdrängungsimmuntest für Hb Alc
• Dieser Verdrängungsimmuntest beruht auf der Verwendung einer definierten Menge einer Haptenmarkierung (wie beschrieben in Beispiel 5), die mit dem Alc im lysierten Vollblut um die Bindung des immobilisierten Antikörpers konkurriert. Da der Antikörper sowohl Alc und das Hapten erkennt, bestimmt die Menge an Alc in der Probe die Menge der Haptenmarkierung, die an den Antikörper bindet. Da der Antikörper immobilisiert ist, können alle nichtgebundenen Reaktionsteilnehmer durch einen einfachen Waschschritt entfernt werden. Die gebundene Markierung kann anschließend gemessen und mit einem Standard zur quantitativen Bestimmung von Alc in den ursprünglichen Blutproben gemessen werden.
• Der Test wurde unter Verwendung von Vollblut als Probe entwickelt und kann in die im folgenden aufgeführten Schritte aufgeteilt werden:
(1) Zellyse-Hämoglobin-Denaturierung:
• Da der endgültige Test weniger als 0,3 Mikroliter Vollblut erfordert, wird ein genau pipettierbares Volumen an Blut (5-50 ul aus einem Fingerstich oder einem Vollblut) in einer denaturierenden Lösung verdünnt (3 M Guanidin HCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5) und bei 56ºC 2 bis 15 Minuten erhitzt. Niedrigere Temperaturen funktionieren ebenfalls, jedoch ist zusätzliche Zeit zur vollständigen Denaturierung der Probe erforderlich. Die Denaturierung (a) inaktiviert die Gerinnungsmechanismen, falls die Probe nicht mit Antikoagulanzien hergestellt ist; (b) lysiert die roten Blutzellen; (c) denaturiert Proteasen, Enzyme usw. und legt das Alc Epitop auf dem Hämoglobin in optimaler Weise frei; (d) scheint entweder die Probe zu sterilisieren oder das Wachstum von Mikroorganismen in der denaturierten Blutprobe zu inhibieren, auch wenn die Probe unter nichtaseptischen Bedingungen hergestellt und gehandhabt wird (z.B. Blut aus einem Fingerstich) und (e) liefert eine stabile klinische Probe, die für Tage bei Raumtemperatur ohne Einfluß auf den endgültigen Test gelagert werden kann.
(2) Verdünnung und Verdrängung:
• Ein Aliquot des denaturierten Vollbluts wird in ein 10faches Volumen an Puffer, welches die Haptenmarkierung enthält, pipettiert. Dies verdünnt wirksam das Hömoglobin auf eine geeignete Konzentration für den Test und verdünnt das Denaturierungsmittel zu einer niedrigen Konzentration, so daß es den Antikörper oder die Enzymaktivität nicht stört. Die Antikörper beschichteten Perlen werden anschließend für einen bestimmten Zeitraum zugegeben, während der Antikörper entweder an das Alc Hämoglobin oder das Hapten-HRP bindet.
(3) Waschen und Ablesen:
• Anschließend an die Verdrängungsinkubation werden die Perlen gewaschen und die Markierung nach Zugabe von geeignetem Substrat abgelesen. Das Signal wird anschließend mit einem Standard verglichen und die Menge an Alc in der ursprünglichen Vollblutprobe bestimmt.
• Die Einzelheiten des verwendeten Tests sind im folgenden zusammengefaßt:
Perlen-Beschichtungsverfahren:
• Polystyrolperlen (Durchmesser 1/4 Inch mit einer spiegelnden Oberfläche) sind von Precision Ball Company, Chicago, Illinois, USA erhältlich. Großpackungen wurden auf Perlen untersucht, die die niedrigste Variabilität in mehrfachen Immuntestbestimmungen der Probe lieferten. Vor der Beschichtung werden die Perlen mit absolutem Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen. Die Methanolwaschung schien die Korrelation der Abweichung bei Mehrfachbestimmungen derselben Probe signifikant zu verringern. Anschließend wird eine Antikörperlösung (5 ug Antikörper/100 ul in 0,2 M Natriumborat, pH 8,5, 0,02 % Natriumazid) zu den feuchten Perlen zugegeben und die Perlen über Nacht bei 4ºC geschüttelt. Anschließend werden die Perlen gewaschen, mit 1 %igem Rinderserumalbumin in 0,02 % Natriumazid haltigem PBS blockiert. Typischerweise werden 500 bis 1000 Perlen gleichzeitig beschichtet und für Wochen ohne sichtbaren Verlust an Antikörperreaktivität verwendet. Beschichtungsexperimente mit radioaktivem Antikörper weisen darauf hin, daß 0,5 ug Antikörper pro Perle bindet.
• Die Perlen werden in diesem Immuntest nur aufgrund ihrer Eigenschaft der Bindung von relativ großen Proteinmengen verwendet. Die hydrophobe Absorption von Protein auf Polystyrol ist bequem, kann aber jederzeit durch mehrere andere Verfahren ersetzt werden, wo Proteine kovalent an Polystyrol, funktionalisierte Harze oder Kieselgel gebunden sind. Polystyrol kann auch in Form einer Röhre oder Kuvette vorliegen.
• Das Arbeitsprotokoll läßt sich wie folgt zusammenfassen:
• (a) Verdünne 50 Mikroliter Vollblut in 1,0 ml denaturierender Lösung (3 M Guanidin-HCl, 10 mM Tris pH 7,5), erhitze auf 56ºC, 15 Minuten, verdünne noch einmal 100 ul auf 1,0 ml Denaturierungsmittel.
• (b) Gebe 50 Mikroliter der obigen Lösung zu 0,5 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,5, die Hapten-HRP enthält. Die Inkubationen, Waschvorgänge und enzymatische Reaktionen werden zweckmäßigerweise in Polystyrol-Gewebekulturplatten mit 48 Vertiefungen durchgeführt.
• (c) Gebe Antikörper beschichtete Perlen hinzu und inkubiere 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln.
• (d) Wasche die Perlen mit Puffer (PBS) (im allgemeinen mit je 3-1 ml)
• (e) Gebe o-Phenylendiaminsubstrat und Wasserstoffperoxid hinzu.
• (f) Breche die Reaktion ab und lese das Produkt nach 20 Minuten ab. Der obige Test wird zur Bestimmung der klinischen Daten wie unten beschrieben verwendet. Die Standardkurve ist in Fig. 4 gezeigt. Verdrängung unter Verwendung von GLYCOPEPTID 1 ist in Fig. 5 gezeigt. Die Bestimmung von normalen und diabetischen Spendern ist in Fig. 6 gezeigt. Die Boronat-Affinitätsbestimmung kann genau wie von Pierce Chemical Co. (GlycoTest, Produkt Nr. 42,000) beschrieben durchgeführt werden.
Beispiel 3 Optimale Freilegung des Alc Epitops
• Optimale Reaktivität des humanen Alc Epitops kann nach folgender Behandlung des nativen Hämoglobins (in einem Vollblut oder Hämolysat) mit Verfahren oder Mitteln, welche das Epitop für die Antikörper-Bindungsstelle freilegen, beobachtet werden. Die optimale Freilegung des Epitops kann durch eine physikalische Denaturierung (Hitze, Ultraschall usw.), durch ein chemisches Verfahren einschließlich klassischer Denaturierungsmittel (Harnstoff, Guanidin, SDS, Protease) oder durch eine Kombination von physikalischen und chemischen Verfahren erreicht werden. Besonders wirksam ist ein Verfahren, bei dem Vollblut (50 Mikroliter) zu 1 ml Lösung von 3 M Guanidinhydrochlorid, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, zugegeben wird und auf 56ºC für mehr als 1 Minute erhitzt wird. Die erhaltene Probe ist optimal für den anschließenden Immuntest auf das Alc Epitop geeignet. Die Lösung kann 10fach in Puffer verdünnt werden, was effektiv das Guanidin auf 0,3 M verdünnt, eine Konzentration, die wenig Einfluß, wenn überhaupt, auf die normale Antikörper-Antigen Wechselwirkungen und Enzymaktivitäten ausübt, und ein geeignetes Medium zum anschließenden Immuntest zur Verfügung stellt.
• Es wird der Verdrängungsimmuntest aus Beispiel 2 verwendet. Der Kompetitor ist das Alc, welches im Vollblut eines Diabetikers vorliegt. Die Vollblutprobe wird in 3,0 M Guanidin bei 20ºC, 37ºC oder 56ºC für einen Zeitraum von 0-320 Minuten gegeben. Die Ergebnisse (Fig. 7) zeigen, daß mit der Zeit bei 20ºC oder 37ºC das Epitop freigelegt wird und so wirksam mit dem Hapten-HRP Konjugat konkurriert. Bei 56ºC ist das Epitop nach 5 Minuten maximal freigelegt, der früheste Zeitpunkt, der in diesem Test bestimmt wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß im nativen Hämoglobin Alc Tetramer das Epitop im Inneren des Proteins eingeschlossen und unzugänglich ist und nicht mit dem linearen synthetischen Glycopeptid-HRP Konjugat konkurriert. Falls jedoch Hämoglobin Alc denaturiert ist, reagiert das neu freigelegte Epitop als ein wirksamer Kompetitor für das lineare Glycopeptidenzym-Konjugat. Beispiel 4 Vergleich der Antikörperspezifität - polyklonale Immunantwort beim Schaf gegenüber monoklonaler Immunantwort bei der Maus
• Ein Schaf wird an 5 Stellen intramuskulär mit Freund'schem kompletten Adjuvans mit dem Glycopeptid-KLH Konjugat (4 mg) aus Beispiel 1(b) immunisiert. Boostinjektionen werden in gleicher Weise nach 30 und 60 Tagen durchgeführt. Der Boost nach 60 Tagen erfolgt mit Freund'schen inkompletten Adjuvans. Der Titer des Vorimmunserums und des Immunserums auf Alc und Ao Spezifität werden in einem ELISA Test, wie in Beispiel 1(c) beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse (siehe Fig. 7) zeigen, daß das synthetische Glycopeptid eine Immunantwort gegen humanes Hämoglobin stimuliert, aber daß die Immunglobuline nicht spezifisch für Alc Hämoglobin sind. Im Gegensatz hierzu sind monoklonale Antikörper aus der Maus gegen Alc ziemlich spezifisch für Alc, wenn sie im selben Test gemessen werden (siehe Fig. 8 für den ELISA Test aus Beispiel 1c). Immunaffinitätsversuche zur Reinigung des Antikörpers spezifisch auf Alc aus dem Schaf-Antiserum waren nicht erfolgreich.
Beispiel 5 Herstellung von Hapten-Markierungskonjugaten
• Es wurde ein Konjugat aus dem GLYCOPEPTID 1 (HRP) hergestellt. Das Hapten-HRP Konjugat wurde hergestellt durch Umsatz von 15 mg Meerettichperoxidase (HRP) mit einem 10 molaren Überschuß von MBS (siehe Beispiel 1b) in 50 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH 7,0. Das MBS-HRP Konjugat wurde durch Gelfiltration gereinigt (unter Verwendung des obigen Puffers) und 0,34 mg des Glycopeptidhaptens (PEPTID 1) wurden zugegeben. Das fertige Hapten-HRP Konjugat wurde durch Gelfiltration über HPLC gereinigt und wurde in einer Verdünnung von 1:1000 - 1:100.000 in einem Verdrängungsimmuntest aus Beispiel 3 eingesetzt.
Beispiel 6 Streifen-Immuntest auf Hb Alc
• a) 1 mg des monoklonalen Antikörpers aus Beispiel 1(c) in 0,1 molarem Natriumboratpuffer, pH 8,5, kann mit einem 200fachen molaren Überschuß von Fluorescin-isothiocyanat (FITC) vermischt werden und 30 Minuten bei Raumtemperaturen umgesetzt werden. Der Fluorescin markierte monoklonale Antikörper kann durch Gelfiltration gereinigt werden.
• b) Ein Streifen (Polystyrol, Zellulose usw.) mit COOH-Gruppen wird in 0,5 ml eines zu untersuchenden denaturierten Hämolysats, pH 7,5, eingetaucht. Der Streifen wird mit Puffer bei pH 7,5 abgespült und in einen fluoreszierenden monoklonalen Antikörper aus in einer gepufferten Lösung 5 Minuten bei Raumtemperatur eingetaucht. Der Streifen wird wiederum abgespült und das Ausmaß der Fluoreszenz des Streifens zeigt die Menge von Alc Hb in der unbekannten Probe an.
Beispiel 7 Kopplung von monoklonalem Antikörper an einem Reagensstreifen und seine Verwendung in einem Immuntest
• Whatman #1 Filterpapier (7 cm) wird in 20 ml eiskaltes d-H&sub2;O getaucht und der pH der Lösung auf zwischen 10,5 - 11,5 mit 5 M NaOH eingestellt. Die Lösung wird ständig während der Aktivierung überprüft und der pH zwischen 10,5 - 11,5 durch tropfenweise Zugabe von 5 M NaOH gehalten. Ein kleiner Rührstab befindet sich am Boden des das Filterpapier enthaltenden Kolbens. Der Kolben wird anschließend in eine eisgefüllte Petrischale auf einem Magnetrührer gestellt. 1 Gramm festes BrCN wird in den Kolben gegeben und unter Rühren 20 Minuten (auf Eis) inkubiert. Das Filterpapier wird aus der Lösung entfernt und in 100 ml eiskaltem destillierten Wasser (d-H&sub2;O) gewaschen. Es wird anschließend in eiskaltem 0,2 M Na&sub2;H PO&sub4;-Zitronensäurepuffer, pH 6,8, gewaschen. Es wird Antikörper (1 mg/ml in 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;-Zitronensäure, pH 6,8) zugegeben und man läßt die Kopplung des Antikörpers 1 Stunde fortschreiten. Zur Blockierung der nichtumgesetzten Stellen wird Ethanolamin (10 ml einer 1 mM Lösung) zugegeben (15 Minuten) und das Papier mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 140 mM NaCl, pH 7,5) zur Entfernung von nichtumgesetzten Bestandteilen gewaschen.
• Der Reagensstreifen wird in eine standardisierte Menge eines unbekannten denaturierten Hämolysats, welches einen markiertem Kompetitor der Antikörperbindung für das Alc Hämoglobin enthält, eingetaucht. Ein zweckmäßiger Kompetitor ist das Glycopeptid (GLYCOPEPTID 1), das kovalent an Meerettichperoxidase (HAPTEN-HRP) gebunden ist. Der Streifen wird entfernt und mit PBS abgespült. Die Menge des an dem Streifen gebundenen Hämoglobins wird gemessen (die Menge ist umgekehrt proportional zum Alc in der Probe und das Alc Hämoglobin kann durch Vergleich mit Standardproben quantitativ bestimmt werden).
Beispiel 8 Enzymmarkierter Immunosorbenttest für Alc
• Ein bestimmtes Volumen eines denaturierten Bluthämolysats (100 ul) wurde in Polystyrol-Mikrotiterplatten gegeben und man ließ bei Raumptemperatur 60 Minuten binden. Die Platte wird 4 mal in 0,05 % Tween-20 (PBST) haltigen PBS gewaschen. Der monoklonale Antikörper (gekoppelt an Meerrettichperoxidase) wird zugegeben (100 ul, 1 ug/ml) in PBST und 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Antikörperüberschuß wird durch 4 Waschvorgange mit PBST entfernt. Das Substrat (o-Phenylendiamin, 2,2 mM) und H&sub2;O&sub2; (0,012 %) in PBS werden zugegeben und das Reaktionsprodukt bei 492 nm gemessen. Die Farbintensität gibt die quantitative Menge von Alc im Hämolysat durch Vergleich mit Standardwerten wieder.
Beispiel 9 Radioimmuntest für Alc
• 100 Mikroliter eines denaturierten Bluthämolysats (220 nM Hämoglobin) wird mit 7 nM jodiertem Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (500.000 cpm/7 nM) vermischt. Monoklonaler Antikörper wird in einer Menge zugegeben, die ausreicht, 50 % des glukosiliertem Peptids zu binden, falls das Bluthämolysat normales Alc Hämoglobin (ca. 3 %) enthält. Höhere Hämoglobin Alc Werte konkurrieren um das Peptid, wodurch die durch den Antikörper gebundene Radioaktivität verringert wird. Der Antikörper kann durch Immunpräzipitation mit einern zweiten Antikörper wiedergewonnen werden (Kaninchen-anti-Maus-IgG) oder durch Adsorption am Protein A beschichteten Partikeln. Das jodierte, an den Antikörper gebundene Peptid kann quantitativ in einem Gamma-Isotopenzähler bestimmt werden und gibt die Menge von Alc im Vollbluthämolysat im Vergleich zum Standard wieder.

Claims (17)

1. Immuntestverfahren zur Bestimmung eines bestimmten Glycoproteinanalyten in einer wäßrigen Probe, worin die Probe mit einem Antikörperreagens in Kontakt gebracht wird, das spezifisch für die Bindung eines Kohlenhydrat-modifizierten linearen Peptidepitops in einem solchen bestimmten Protein ist, und worin die Bindung des Antikörperreagenzes an ein solches Protein bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe zuerst behandelt wird, um eine wesentliche Menge des Proteins darin zu denaturieren, um das lineare Peptidepitop zur Bindung durch das Antikörperreagens freizulegen oder dessen Freilegung zu steigern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Glycoproteinanalyt Hämoglobin Alc oder glukosiliertes Albumin ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, worin die Probe unter denaturierenden Bedingungen behandelt wird, die nicht zu einer wesentlichen Aggregation oder Präzipitation des Proteinanalyten führen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Probe mit einem chaotropen Reagens behandelt wird, um das Epitop freizulegen oder dessen Freilegung zu steigern.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Probe mit einem proteolytischen Enzym behandelt wird, um das Epitop freizulegen oder dessen Freilegung zu steigern.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Probe mit Kaliumthiocyanat behandelt wird, um das Epitop freizulegen oder dessen Freilegung zu steigern.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Proteinanalyt auf eine Mikrotiterplatte adsorbiert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Antikörperreagens monoklonal ist und durch Immunisierung eines Tieres mit (a) einem synthetischen Peptidimmunogen, das den Rest mit dem Kohlenhydrat-modifizierten linearen Peptidepitop, gebunden an ein immunogenes Trägermaterial, enthält, oder (b) einer denaturierten oder verdauten Form des Glycoproteins gewonnen wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der zu bestimmende Glycoproteinanalyt HbAlc ist, die Probe Blut ist und das Antikörperreagens ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist, das die Antikörper-Bindungsstelle enthält, die spezifisch an die glukosilierte N-terminale Peptidsequenz in der beta-Untereinheit des menschlichen Hämoglobins bindet.

10. Reagenzsystem zur Immuntestbestimmung eines bestimmten Glycoproteinanalyten in einer wäßrigen Probe, wobei das System einen für die Bindung eines Kohlenhydrat-modifizierten linearen Peptidepitops in einem solchen bestimmten Protein spezifisches Antikörperreagens enthält, dadurch gekennzeichnet daß es zusätzlich ein chemisches Mittel enthält, das unter Kontakt mit der Probe zur Denaturierung einer wesentlichen Menge des Proteins darin in der Lage ist, um das lineare Peptidepitop zur Bindung durch das Antikörperreagens freizulegen oder dessen Freilegung zu steigern.

11. Reagenzsystem nach Anspruch 10, worin der Glycoproteinanalyt Hämoglobin Alc oder glukosiliertes Albumin ist.

12. Reagenzsystem nach einem der Ansprüche 10 und 11, worin das chemische Denaturierungsmittel nicht zu einer wesentlichen Aggregation oder Präzipitation des Proteinanalyten führt.

13. Reagenzsystem nach einem der Ansprüche 10 und 11, worin das chemische Denaturierungsmittel ein chaotropes Agens ist.

14. Reagenzsystem nach einem der Ansprüche 10 und 11, worin das chemische Denaturierungsmittel Kaliumthiocyanat ist.

15. Reagenzsystem nach einem der Ansprüche 10 bis 14, worin das Antikörperreagens durch Immunisierung eines Tieres mit (a) einem synthetischen Peptidimmunogen erhalten wird, das den Rest mit dem Kohlenhydrat-modifizierten linearen Peptidepitop, gebunden an ein immunogenes Trägermaterial, enthält, oder (b) einer denaturierten oder verdauten Form des Glycoproteins gewonnen wird.

16. Reagenzsystem nach einem der Ansprüche 10 bis 15, das zusätzlich eine markierte Form des Kohlenhydrat-modifizierten linearen Peptidepitops enthält.

17. Reagenzsystem nach einem der Ansprüche 10 bis 16, worin der zu bestimmende Proteinanalyt HbAlc ist, die Probe Blut ist, und das Antikörperreagens ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist, das eine Antikörper-Bindungsstelle enthält, die spezifisch an die glukosilierte N-terminale Peptidsequenz in der beta-Untereinheit des menschlichen Hämoglobins bindet.