JPH11258238A - 免疫学的凝集測定用試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗原に対する特異性や結合力が安定している
モノクローナル抗体を用いて、直接的に再現性良く且つ
高感度に被検体液中の抗原を測定することができる免疫
学的測定方法を提供する。 【解決手段】 カルボキシメチル化ヘモグロビン等の抗
原を含有する被検体液に、該抗原のモノクローナル抗体
が認識する部位とは異なる部位で該抗原を認識するポリ
クローナル抗体が不溶性担体に担持されてなる試薬
（Ｂ）を接触させて免疫学的予備凝集反応を行い、次い
で該抗原のモノクローナル抗体が不溶性担体に担持され
てなる試薬（Ａ）を加えて免疫学的凝集反応を進行せし
めて、得られた凝集体の凝集状態を目視又は光学的に検
知する等して検体液中の該抗原の存在又は存在量を測定
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的凝集反応
を利用した測定用試薬及び測定方法に関する。更に詳し
くは、モノクローナル抗体を利用した免疫学的測定用試
薬を用い、カルボキシメチル化ヘモグロビン等の抗原を
簡便に高感度でしかも再現性良く測定することが出来る
抗原の免疫学的測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、医療分野においては、病気の診断
や病気の重篤度の評価或いは治療経過の観察のために、
血液や尿などの体液成分を迅速且つ簡便に、しかも再現
性良く測定することが重要な課題となっている。このよ
うな測定には、抗原抗体反応によって起こる凝集を利用
する方法が広く用いられている。

【０００３】例えば、抗体を担持した不溶性担体と該抗
体に対する抗原(検査対象物質)を含む血液とを接触させ
て起こる凝集を光学的に、または目視で確認して、血液
中における抗原の存在又は存在量が測定されている。と
ころで、該測定においては、不溶性単体に担持される抗
体としては一般にポリクローナル抗体が使用されてい
る。その理由は、多数の抗原決定基を認識するポリクロ
ーナル抗体が担持された不溶性担体は抗原と接触した場
合に該抗原を介して架橋して凝集するからである。

【０００４】これに対し、モノクローナル抗体に対する
抗原の抗原決定基は、通常、抗原１分子当たり１つしか
存在しないことが多く、モノクローナル抗体が担持され
た不溶性担体を用いて抗原と接触させても抗原による架
橋が起こらず凝集反応が起こらない。

【０００５】しかしながら、ポリクローナル抗体は、そ
の特異性や結合力において安定的に作製できず、測定用
試薬の作製や測定方法の構築はポリクローナル抗体のロ
ットに左右されるという問題があった。これに対し、モ
ノクローナル抗体は特異性や結合力を安定的に作製でき
ることから、最近では、上記問題点を解決する試みもい
くつかなされている。

【０００６】例えば、特開平６−２５８３２５号公報に
示されるように、異なる２種類又は３種類のモノクロー
ナル抗体を使用して凝集反応を起こさせる方法、或いは
モノクローナル抗体に対する抗原を人工的に複数架橋さ
せた化合物と不溶性担体に担持された該モノクローナル
抗体の反応に、抗原を含む血液等の検査対象物を共存さ
せて凝集反応を競合阻害的に減少させる方法等が試みら
れている。

【０００７】しかしながら、異なる２種類又は３種類の
モノクローナル抗体を使用しても、抗原抗体反応によっ
て得られる凝集体は小さいため、検出感度が低いという
問題点があった。また、凝集反応を競合阻害的に減少さ
せる方法においては、間接的に抗原又は抗体を検知して
いるため、再現性が悪いという問題点があった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、抗原に対す
る特異性や結合力が安定的しているモノクローナル抗体
を用いて、直接的に再現性良く且つ高感度に被検体液中
の抗原を検知することができる免疫学的凝集測定用試薬
キット及び該試薬キットを用いた免疫学的測定方法を提
供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意検討した結果、測定対象となる抗
原に対するモノクローナル抗体を使用した場合でも、先
ず測定対象となる抗原を該モノクローナル抗体が認識す
る部位とは異なる部位で認識するポリクローナル抗体を
用いた試薬と被検体液とを接触させて、抗原抗体反応に
より該試薬を予備的に凝集させ、次いでこの予備的な凝
集体を上記特定のモノクローナル抗体を用いた試薬を接
触させれば凝集反応を起こすことを見出し、本発明を完
成するに至った。

【００１０】即ち、第一の本発明は、モノクローナル抗
体が不溶性担体に担持されてなる試薬（Ａ）、及び該モ
ノクローナル抗体に対する抗原を該モノクローナル抗体
が認識する部位とは異なる部位で認識するポリクローナ
ル抗体が不溶性担体に担持されてなる試薬（Ｂ）の組み
合わせからなることを特徴とする該モノクローナル抗体
に対する抗原の免疫学的凝集測定用試薬キットである。

【００１１】更に、第二の本発明は、被検体液に、下記
試薬（Ａ）で使用するモノクローナル抗体に対する抗原
を該モノクローナル抗体が認識する部位とは異なる部位
で認識するポリクローナル抗体が不溶性担体に担持され
てなる試薬（Ｂ）を接触させて免疫学的予備凝集反応を
行い、次いでモノクローナル抗体が不溶性担体に担持さ
れてなる試薬（Ａ）を加えて免疫学的凝集反応を進行せ
しめて、得られた凝集体の凝集状態を検知して該モノク
ローナル抗体に対する抗原の存在又は存在量を測定する
ことを特徴とする、該モノクローナル抗体に対する抗原
の免疫学的測定方法である。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の免疫学的凝集測定試薬キ
ットは、モノクローナル抗体が不溶性担体に担持されて
なる試薬（Ａ）、及び該モノクローナル抗体に対する抗
原を該モノクローナル抗体が認識する部位とは異なる部
位で認識するポリクローナル抗体が不溶性担体に担持さ
れてなる試薬（Ｂ）の組み合わせからなる。

【００１３】本発明で試薬（Ａ）に使用するモノクロー
ナル抗体は、測定対象となる抗原を認識するモノクロー
ナル抗体であれば特に限定されない。このようなモノク
ローナル抗体は、測定対象となる抗原をマウス、ラット
等の哺乳動物に免疫し、１〜２週間の間隔で追加免疫し
て得たリンパ球や脾細胞等の抗体産生細胞と骨髄腫細胞
とを融合させて得た単一クローンの抗体産生細胞によっ
て産生することができる。通常、モノクローナル抗体に
対する抗原の抗原決定基は抗原１分子当たり１箇所しか
存在しない。

【００１４】ここで、上記の測定対象となる抗原は、特
に限定されないが、臨床検査の見地から病態の有無や重
篤度、進行度等と何らかの関連がある抗原であるのが好
ましい。この様な抗原としては、カルボキシメチル化ヘ
モグロビン（以下、「ＣＭ化Ｈｂ」と略すこともあ
る）、ペントシジン化アルブミン、ヘモグロビンＡ１ｃ
（以下、「ＨｂＡ１ｃ」と略すこともある）、ＦＤＰ−
Ｄダイマー（フィブリン分解産物）等が挙げられる。こ
れら抗原の中でも、カルボキシメチル化ヘモグロビンは
糖尿病或いは糖尿病合併症用マーカーとして近年注目さ
れいる抗原であるが、従来の免疫学的凝集試薬を用いて
該抗原を再現性良く測定するのは非常に困難であり、該
抗原の測定に本発明の免疫学的測定方法を適用する意義
は大きい。

【００１５】試薬（Ａ）において、前記モノクローナル
抗体を担持させる不溶性担体は、前記モノクローナル抗
体を物理吸着又は化学吸着等により担持できるもので、
検体溶液に不溶性であるものであれば特に限定されず、
一般的な免疫学的凝集試薬で使用されている公知の不溶
性担体が使用できる。この様な不溶性担体を例示すれ
ば、ポリスチレン、スチレン・ブタジエン共重合体、ス
チレン・メタクリル酸共重合体、スチレン・グリシジル
メタクリレート共重合体の様な乳化重合により得られる
有機高分子ラテックス等の有機高分子物質の微粒子、或
いはシリカ、シリカ・アルミナ、アルミナの様な無機酸
化物又は該無機酸化物等にシランカップリング処理等を
施し官能基を導入した無機粒子、更にはヒトＯ型赤血
球、ヒツジ赤血球等の生物由来の粒子等が挙げられる。

【００１６】上記不溶性担体の粒径は特に制限されるも
のではないが、抗原抗体反応後の凝集の起こり安さや凝
集の検知のしやすさの観点から、平均粒径が０．０５〜
１０μｍの不溶性担体を使用することが好ましい。自動
分析装置での分析に適し、且つ粒子が自然沈降しにくい
という点で０．０５〜０．４μｍの担体を使用するのが
特に好適である。

【００１７】上記不溶性担体へのモノクローナル抗体の
担持方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合
法、架橋法等の公知の方法が何ら制限無く使用できる。
例えば、ＣＭ化Ｈｂ測定用の試薬（Ａ）は、抗ＣＭ化Ｈ
ｂモノクローナル抗体とラテックス粒子を混合し、１時
間程度放置することにより簡単に調製することが出来
る。

【００１８】本発明で試薬（Ｂ）に使用されるポリクロ
ーナル抗体は、測定対象となる抗原を試薬（Ａ）に用い
たモノクローナル抗体が認識する部位とは異なる部位で
認識するポリクローナル抗体であれば特に限定されな
い。ここで、ポリクローナル抗体とは、種々の異なった
クローンの抗体産生細胞が産生する抗体分子の集団を指
しており、通常、ポリクローナル抗体と反応する抗原に
は多数の抗原決定基が存在する。本発明では、上記ポリ
クローナル抗体としては、上記モノクローナル抗体に対
する抗原と反応するものを用いるが、該モノクローナル
抗体と抗原の反応が阻害されないよう、該モノクローナ
ル抗体が認識する抗原決定基以外の部位を認識する抗体
を用いる。

【００１９】例えば、抗原がＣＭ化Ｈｂであるときはヘ
モグロビンに対するポリクローナル抗体は抗ＣＭ化Ｈｂ
モノクローナル抗体が認識する抗原決定基であるカルボ
キシメチル基以外の部位を認識すると考えられるので、
試薬（Ｂ）用のポリクローナル抗体として好適に使用で
きる。

【００２０】このようなポリクローナル抗体は、モノク
ローナル抗体が認識する部位を含まない抗原を免疫する
ことにより得ることができる。あるいは、ポリクローナ
ル抗体からアフィニティ精製等によりモノクローナル抗
体と同じ認識部位を持つ抗体を除去しても得ることが出
来る。

【００２１】試薬（Ｂ）において、上記ポリクローナル
抗体を担持させる不溶性担体としては、試薬（Ａ）にお
いて使用できる不溶性担体として説明したのと同じも
の、すなわち、同じ種類、大きさのものが使用できる。
また、不溶性担体へのポリクローナル抗体の担持方法
は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法
等の公知の方法が何ら制限無く使用できる。例えば、Ｃ
Ｍ化Ｈｂ測定用の試薬（Ｂ）は、抗ヘモグロビンポリク
ローナル抗体とラテックス粒子を混合し、１時間程度放
置することにより簡単に調製することが出来る。

【００２２】本発明の免疫学的測定方法では、前記試薬
（Ａ）及び試薬（Ｂ）を組み合わせてキットとして用
い、次のようにしてモノクローナル抗体に対する抗原を
測定することができる。すなわち、先ず被検体液に前記
試薬（Ｂ）を接触させて免疫学的予備凝集反応を行い、
次いで前記試薬（Ａ）を加えて免疫学的凝集反応を進行
せしめて、得られた凝集体の凝集状態を検知することに
より該モノクローナル抗体に対する抗原の存在又は存在
量を測定することができる。

【００２３】本発明の免疫学的測定方法で使用する被検
体液は、測定対象となる抗原として前記したような抗原
を含む液体、或いは該抗原を含む可能性のある液体であ
れば特に限定されず、例えば生体由来の体液、特に血
液、血漿、血清、尿等の体液、及びこれら体液に精製、
濃縮又は希釈等の処理を施した液体が使用できる。

【００２４】本発明の免疫学的測定方法では、測定対象
となる抗原の種類に応じて試薬（Ａ）で使用されるモノ
クローナル抗体、及び試薬（Ｂ）で使用されるポリクロ
ーナル抗体の種類が決定される。

【００２５】本発明の免疫学的測定方法では、先ず被検
体液に前記試薬（Ｂ）を接触させて免疫学的予備凝集反
応を行う。試薬（Ｂ）においては、測定対象となる抗
原、すなわち試薬（Ａ）で使用されているモノクローナ
ル抗体に対する抗原を該モノクローナル抗体が認識する
部位とは異なる部位で認識するポリクローナル抗体が不
溶性担体に担持されているので、該試薬（Ｂ）を被検体
液に接触させると、試薬（Ａ）に使用しているモノクロ
ーナル抗体の認識部位を潰すことなく被検体液に含まれ
る抗原と上記ポリクローナル抗体との間に抗原抗体反応
が起こり、試薬（Ｂ）が架橋されて凝集する免疫学的予
備凝集反応が起こる。ここで、上記免疫学的予備凝集反
応とは、光学的に或いは目視で検知可能な凝集塊を形成
させない予備的な凝集反応のことを意味する。

【００２６】試薬（Ｂ）を被検体液に接触させたときに
起こる免疫学的凝集反応を、光学的に或いは目視で検知
できる凝集塊が生成しないように行う方法は特に限定さ
れないが、例えば、試薬（Ｂ）におけるポリクローナル
抗体の担持量、不溶性担体の種類及び大きさ、並びに被
検体溶液単位量当たりに使用する試薬（Ｂ）の量等を制
御することにより行うことができる。このときの各条件
は、測定対象となる抗原の種類、被検体液の種類等によ
り異なるため一概に決定することはできない。

【００２７】このため、測定系毎に予備的な実験を行
い、被検体液と接触させたときに光学的に或いは目視で
検知可能な凝集塊を形成させない条件を予め決定してお
くのが好適である。この様な条件の決定は、例えば、被
検体溶液に任意の量の試薬（Ｂ）を接触させ、光学的に
検知可能な濁度が得られる直前の試薬（Ｂ）の量を採用
することにより行うことができる。ポリクローナル抗体
は、同一の抗原を免疫しても免疫する個体が異なれば親
和力や特異性が異なるため、試薬（Ｂ）の使用量は、抗
体のロットごとに予備的な実験を行い、決定することが
好ましい。このように予備的凝集反応の至適条件は、試
薬（Ｂ）で使用するポリクローナル抗体のロットの違い
により異なるが、各ロットのポリクローナル抗体ごとに
至適条件を決定しておけば、どの様なロットのポリクロ
ーナル抗体を使用した試薬（Ｂ）を用いても、その後試
薬（Ａ）を加えて得られる最終的な測定結果は再現性の
良いものとなる。

【００２８】一例として、被検体液中のＣＭ化Ｈｂを測
定する場合についての好適な条件について説明すると、
例えば後述する実施例１で使用した抗ヘモグロビンポリ
クローナル抗体を用いる場合には、被検体液と接触させ
るときの試薬（Ｂ）の使用量｛予備凝集時の試薬（Ｂ）
量｝は反応液中の濃度で約０．０００１重量％であり、
該被検体液は、水或いは界面活性剤を含む溶液で溶血さ
せた血液を５０〜１０００倍に希釈して用いることが好
ましい。

【００２９】本発明の免疫学的測定方法では、上記免疫
学的予備凝集反応終了後、反応溶液に前記試薬（Ａ）を
加えて、免疫学的凝集反応（以下、成長反応ともい
う。）をさらに進行せしめる。モノクローナル抗体が担
持された試薬（Ａ）と被検体液を単に接触させた場合に
は架橋反応が起こらず凝集反応は進行しないと考えられ
るが、上記免疫学的予備凝集反応で形成された予備凝集
体中には複数の抗原が結合しているため、該予備凝集体
に試薬（Ａ）を作用させた場合には該予備凝集体に試薬
（Ａ）が結合することによって予備凝集体が成長し、光
学的に或いは目視で検知可能な凝集体を形成するに至
る。この様にして形成された凝集体の凝集状態（凝集の
程度）は、被検体液中に含まれる測定対象である抗原の
量に依存するので、該凝集状態を光学的に或いは目視で
検知することによって被検体液中の抗原の存在又は存在
量を知ることができる。このとき、光学的に或いは目視
で検知可能な凝集体の形成は、常に同じ性質を示すモノ
クローナル抗体との抗原抗体反応によって起こるため、
再現性の高い測定結果が得られる。

【００３０】なお、上記成長反応の進行は、前記予備重
合体中に含まれる抗原の数、その存在状態（主に立体的
状態）等に影響を受ける他、使用する試薬（Ａ）におけ
るモノクローナル抗体の種類及び担持量、不溶性担体の
種類及び大きさ、並びに使用する試薬（Ａ）の量等の影
響を受ける。このため、光学的に或いは目視で検知可能
な凝集体を形成させるような上記成長反応の条件は、測
定系毎に予備的な実験を行い、好適な条件を予め決定し
ておくのが好ましい。この様な条件の決定は、例えば予
備凝集反応を行った試料に試薬（Ａ）を接触させ、濁度
を表す吸光度が０．１以上となる試薬（Ａ）の量を採用
することにより行うことができる。試薬（Ａ）の使用量
は、該モノクローナル抗体が認識する抗原の種類によっ
て異なる。

【００３１】一例として、被検体液中のＣＭ化Ｈｂを測
定する場合についての好適な条件について説明すると、
例えば後述する実施例１で使用したモノクローナル抗体
を用いた場合には、被検体と接触させるときの試薬
（Ａ）の使用量｛予備凝集させた試料の凝集を進行させ
るときの試薬（Ａ）量｝は、反応液中の濃度で約０．０
６重量％である。

【００３２】凝集状態の検知は、目視の他、反応溶液の
濁度を透過光或いは散乱光を用いて検知する等の、従来
公知の光学的手法で行うことができる。目視で測定する
ことによって測定対象となる抗原の存在又はその存在量
を定性的に確認することが出来る。また、上記のような
光学的な検知の場合には、測定対象となる抗原の存在量
を定量的に測定することができる。

【００３３】

【実施例】以下、本発明をより具体的に説明するために
実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって限定
されるものではない。

【００３４】実施例１ （１）〔抗カルボキシメチル化ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体（抗ＣＭ化Ｈｂモノクローナル抗体）担持ラテ
ックス懸濁液（甲剤）の調製〕 平均粒径０．１２μｍ、ラテックス濃度１％となるよう
に、ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液にポリスチ
レン粒子を懸濁した。この粒子懸濁液１ｍｌとｐＨ８．
０の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で０．１ｍｇ／ｍｌとな
るように希釈した抗ＣＭ−Ｈｂモノクローナル抗体溶液
１ｍｌとを混合し、４℃で１時間静置した。その後、
０．３％の牛血清アルブミン（シグマ：ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ Ｖ）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液２ｍｌを添加
し、更に４℃で２時間静置した。次いで、遠心分離によ
り得られた沈さ（抗ＣＭ−Ｈｂモノクローナル抗体担持
ラテックス）に、１００ｍＭ塩化ナトリウムと０．１％
アジ化ナトリウムを含むｐＨ８．０の１００ｍＭトリス
緩衝液（以下、この混合溶液をＴＢＳと略す）２ｍｌを
加えて懸濁した後、遠心分離により沈さを回収し、次い
でＴＢＳ４ｍｌを加えて懸濁し、甲剤１を調製した。

【００３５】なお、抗ＣＭ化Ｈｂモノクローナル抗体と
しては、ハイブリドーマ２Ｂ３（寄託番号：生命研菌寄
第１６６３２号）をマウスの腹水に免疫して得られたも
のを陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製したもの
を用いた。

【００３６】また、上記ハイブリドーマを異なるマウス
の腹水に免疫して上記と同様に調製した抗ＣＭ化Ｈｂモ
ノクローナル抗体を用いて、上記と同様の方法にて甲剤
２を調製した。

【００３７】（２）〔抗ヘモグロビンポリクローナル抗
体（抗Ｈｂポリクローナル抗体）担持ラテックス懸濁液
（乙剤）の調製〕 平均粒径０．１２μｍ、ラテックス濃度１％となるよう
に、ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液にポリスチ
レン粒子を懸濁した。この粒子懸濁液１ｍｌとｐＨ８．
０の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で３．０ｍｇ／ｍｌとな
るように希釈した抗Ｈｂポリクローナル抗体溶液１ｍｌ
とを混合し、４℃で１時間静置した。その後、０．５％
の牛血清アルブミン（シグマ：ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）
を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液２ｍｌを添加し、更に
２５℃で２時間静置した。次いで、遠心分離により得ら
れた沈さ（抗Ｈｂポリクローナル抗体担持ラテックス）
に、１００ｍＭ塩化ナトリウムと０．１％アジ化ナトリ
ウムを含むｐＨ８．０の１００ｍＭトリス緩衝液（以
下、この混合溶液をＴＢＳと略す）２ｍｌを加えて懸濁
した後、遠心分離にて沈さを回収し、次いでＴＢＳ４ｍ
ｌを加えて懸濁した。この抗Ｈｂポリクローナル抗体担
持ラテックス懸濁液を１％のポリエチレングリコール
（平均分子量２００００：和光純薬工業）を含むＴＢＳ
で更に２０００倍に希釈して、乙剤１を調製した。

【００３８】なお、抗Ｈｂポリクローナル抗体は市販の
もの（日本バイオテスト研究所社製：ＨＢＧ００４）を
使用した。

【００３９】（３）〔被検体液の調製〕 健常者または糖尿病患者由来の血液を０．６％のオクチ
ルグルコシドを含む蒸留水（以下、溶血液と略す）で４
００倍に希釈し、被検体液とした。

【００４０】（４）〔被検体液中のカルボキシメチル化
ヘモグロビン（ＣＭ化Ｈｂ）量の測定〕 乙剤１（又は乙剤２）２４０μｌに被検体液１５μｌを
ガラスセル中で添加攪拌した後、３７℃で４．５分間静
置した。次いで、甲剤１（又は甲剤２）を８０μｌ添加
攪拌し、８０秒後（３６ポイント）から２６０秒（５２
ポイント）までの波長５７２ｎｍにおける光学密度変化
量を測定した。以上の操作には、自動分析装置ＴＢＡ−
３０Ｒ（東芝メディカル）を用いた。甲剤１を用いた測
定結果を１回目の測定結果とし、甲剤２を用いた測定結
果を２回目の測定結果として結果を表１に示した。

【００４１】

【表１】

【００４２】比較例１ 実施例１の乙剤の代わりに、乙剤に抗Ｈｂポリクローナ
ル抗体担持ラテックス懸濁液を加えない１％のポリエチ
レングリコール（和光純薬工業）を含むＴＢＳを用いた
こと以外は、実施例１と同様の方法にて、実施例１で用
いた被検体と同じ被検体液中のＣＭ−Ｈｂ量の測定を試
みた。結果を表１に示した。

【００４３】比較例２ ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で２．０ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに希釈した抗ＣＭ−Ｈｂポリクローナル抗体を用いた
こと以外は実施例１の甲剤と同様の調製方法で、抗ＣＭ
化Ｈｂポリクローナル抗体が担持されたラテックス粒子
を作製した。該ラテックス粒子懸濁液に１％となるよう
にポリエチレングリコール（平均分子量２００００）を
添加し、丙剤１とした。

【００４４】なお、抗ＣＭ化Ｈｂポリクローナル抗体
は、以下のようにして調製したものを用いた。即ち、水
素化シアノホウ素ナトリウム存在下でヘモグロビン（ヒ
ト由来：シグマ社製）とグリオキシル酸（和光純薬工業
社製）を４℃で一晩反応させて作製したＣＭ化Ｈｂを免
疫原とし、ウサギに免疫して得た抗血清をＣＭ化されて
いないヘモグロビンが固定されたカラムを用いてアフィ
ニティ精製したもの（非吸着画分）を用いた。

【００４５】また、別ロットの抗ＣＭ化Ｈｂポリクロー
ナル抗体を用いて上記と同様の方法で丙剤２を調製し
た。被検体は実施例１で用いたものと同じものを用い
た。被検体中のＣＭ化Ｈｂ量の測定は、１％ポリエチレ
ングリコール（平均分子量２００００）を含むＴＢＳ２
４０μｌに被検体液１５μｌをガラスセル中で添加攪拌
した後、丙剤１（又は丙剤２）を８０μｌ添加攪拌し、
８０秒後（３６ポイント）から２６０秒（５２ポイン
ト）までの波長５７２ｎｍにおける光学密度変化量を測
定した。以上の操作には、自動分析装置ＴＢＡ−３０Ｒ
（東芝メディカル）を用いた。

【００４６】丙剤１を用いた測定結果を１回目の測定結
果とし、丙剤２を用いた測定結果を２回目の測定結果と
して結果を表１に示した。

【００４７】表１の結果から、抗Ｈｂポリクローナル抗
体担持ラテックス懸濁液を加えた乙剤を用いた場合（実
施例１）、光学密度変化量が０．１０２〜０．１８７の
範囲で得られているのに対して、抗Ｈｂポリクローナル
抗体担持ラテックス懸濁液を加えない乙剤（比較例１）
を用いた場合、光学密度変化量が殆ど得られなかった。
この光学密度変化量の大小は凝集性の高低を意味してい
ることから、比較例１では抗原抗体反応によるラテック
スの凝集が殆ど起こっていないことが判る。また、実施
例１では、異なるロットのモノクローナル抗体を用いて
もＣＭ化Ｈｂ量の実測値は殆ど変わらないのに対して、
ポリクローナル抗体のみを用いた比較例２では、ＣＭ化
Ｈｂ量の実測値が抗体のロットによって大きく変わるこ
とが判る。

【００４８】実施例２ 実施例１で抗ＣＭ−Ｈｂモノクローナル抗体の代わり
に、抗ヘモグロビンＡ１ｃモノクローナル抗体を用いた
こと以外は、実施例１と同様の方法にて、実施例１で用
いた被検体と同じ被検体液中のＨｂＡ１ｃ量を測定し
た。

【００４９】なお、抗ヘモグロビンＡ１ｃモノクローナ
ル抗体は、市販のもの（コスモバイオ社製）を用いた。

【００５０】結果を表２に示した。

【００５１】

【表２】

【００５２】比較例３ 実施例２の乙剤の代わりに、乙剤に抗Ｈｂポリクローナ
ル抗体担持ラテックス懸濁液を加えない１％のポリエチ
レングリコール（和光純薬工業）を含むＴＢＳを用いた
こと以外は、実施例２と同様の方法にて、実施例２で用
いた被検体と同じ被検体液中のＨｂＡ１ｃ量の測定を試
みた。結果を表２に示した。

【００５３】表２に示されるように、この光学密度変化
量の大小は凝集性の高低を意味しており、実施例２では
抗原抗体反応によるラテックスの凝集が見られたのに対
し、比較例３では抗原抗体反応によるラテックスの凝集
が殆ど起こらないことが判る。

【００５４】

【発明の効果】本発明の免疫学的凝集測定用試薬キット
用いた本発明の免疫学的測定方法により、再現性良く、
しかも簡便且つ高感度で被検体液中の抗原を測定できる
ようになった。即ち、本発明は、現在臨床検査の項目と
なっている各種抗原、或いは将来検査項目となり得るカ
ルボキシメチル化ヘモグロビン等の抗原について、簡便
且つ再現性良く、しかも高感度で測定する方法を提供す
るものであり、その意義は大きい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 平田 広一郎 山口県徳山市御影町１番１号 株式会社ト クヤマ内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 モノクローナル抗体が不溶性担体に担持
   されてなる試薬（Ａ）、及び該モノクローナル抗体に対
   する抗原を該モノクローナル抗体が認識する部位とは異
   なる部位で認識するポリクローナル抗体が不溶性担体に
   担持されてなる試薬（Ｂ）の組み合わせからなることを
   特徴とする該モノクローナル抗体に対する抗原の免疫学
   的凝集測定用試薬キット。
2. 【請求項２】 抗カルボキシメチル化ヘモグロビンモノ
   クローナル抗体が不溶性担体に担持されてなる試薬
   （Ａ）、及び抗ヘモグロビンポリクローナル抗体が不溶
   性担体に担持されてなる試薬（Ｂ）の組み合わせからな
   ることを特徴とするカルボキシメチル化ヘモグロビンの
   免疫学的凝集測定用試薬キット。
3. 【請求項３】 被検体液に、下記試薬（Ａ）で使用する
   モノクローナル抗体に対する抗原を該モノクローナル抗
   体が認識する部位とは異なる部位で認識するポリクロー
   ナル抗体が不溶性担体に担持されてなる試薬（Ｂ）を接
   触させて免疫学的予備凝集反応を行い、次いでモノクロ
   ーナル抗体が不溶性担体に担持されてなる試薬（Ａ）を
   加えて免疫学的凝集反応を進行せしめて、得られた凝集
   体の凝集状態を検知して該モノクローナル抗体に対する
   抗原の存在又は存在量を測定することを特徴とする、該
   モノクローナル抗体に対する抗原の免疫学的測定方法。
4. 【請求項４】 被検体液に、抗ヘモグロビンポリクロー
   ナル抗体が不溶性担体に担持されてなる試薬（Ｂ）を接
   触させて免疫学的予備凝集反応を行い、次いで抗カルボ
   キシメチル化ヘモグロビンモノクローナル抗体が不溶性
   担体に担持されてなる試薬（Ａ）を加えて免疫学的凝集
   反応を進行せしめて、得られた凝集体の凝集状態を検知
   してカルボキシメチル化ヘモグロビンの存在又は存在量
   を測定することを特徴とする、カルボキシメチル化ヘモ
   グロビンの免疫学的測定方法。