JPH09274038A - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
糖化ヘモグロビンの測定方法Info
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- JPH09274038A JPH09274038A JP10619896A JP10619896A JPH09274038A JP H09274038 A JPH09274038 A JP H09274038A JP 10619896 A JP10619896 A JP 10619896A JP 10619896 A JP10619896 A JP 10619896A JP H09274038 A JPH09274038 A JP H09274038A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検体中のヘモグロビンの妨害を受けずに、簡
便、迅速、かつ正確に、糖化ヘモグロビンを特異的に測
定する方法を提供する。 【解決手段】 抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合
粒子と、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒
子の混合粒子と、糖化ヘモグロビンを含む検体とを接触
させ、得られる凝集反応によって糖化ヘモグロビンを測
定する。
便、迅速、かつ正確に、糖化ヘモグロビンを特異的に測
定する方法を提供する。 【解決手段】 抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合
粒子と、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒
子の混合粒子と、糖化ヘモグロビンを含む検体とを接触
させ、得られる凝集反応によって糖化ヘモグロビンを測
定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖化ヘモグロビン
の測定方法に関する。
の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１Ｃ）は、糖
尿病患者において、疾病の進行度に応じ血中濃度が増加
することが知られており、糖化ヘモグロビンの測定は血
糖値の測定と併用して糖尿病の診断及び治療に広く利用
されている。従来、糖化ヘモグロビンの測定は、検体中
の糖化ヘモグロビンを直接固相に結合させ、酵素標識抗
糖化ヘモグロビン抗体を反応させるエンザイムイムノア
ッセイ（ＥＩＡ）により行われていた〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９９，９５（１９８７）〕。し
かしながら、この方法では、それぞれの検体中の糖化ヘ
モグロビンを固相に直接結合させるという前処理が必要
であり、大量の検体を迅速かつ正確に測定するには不適
当な方法であった。
尿病患者において、疾病の進行度に応じ血中濃度が増加
することが知られており、糖化ヘモグロビンの測定は血
糖値の測定と併用して糖尿病の診断及び治療に広く利用
されている。従来、糖化ヘモグロビンの測定は、検体中
の糖化ヘモグロビンを直接固相に結合させ、酵素標識抗
糖化ヘモグロビン抗体を反応させるエンザイムイムノア
ッセイ（ＥＩＡ）により行われていた〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９９，９５（１９８７）〕。し
かしながら、この方法では、それぞれの検体中の糖化ヘ
モグロビンを固相に直接結合させるという前処理が必要
であり、大量の検体を迅速かつ正確に測定するには不適
当な方法であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、簡便、迅
速、かつ正確にヒト糖化ヘモグロビンの測定を行うこと
ができる方法を開発するべく鋭意研究した結果、２種の
特定のモノクローナル抗体と不溶性担体粒子との結合体
の組み合わせを用いると、検体中のヘモグロビンの妨害
を受けずに、糖化ヘモグロビンの特異的な測定を行うこ
とができることを見出した。本発明はこうした知見に基
づくものである。
速、かつ正確にヒト糖化ヘモグロビンの測定を行うこと
ができる方法を開発するべく鋭意研究した結果、２種の
特定のモノクローナル抗体と不溶性担体粒子との結合体
の組み合わせを用いると、検体中のヘモグロビンの妨害
を受けずに、糖化ヘモグロビンの特異的な測定を行うこ
とができることを見出した。本発明はこうした知見に基
づくものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、抗ヘモグロビ
ンモノクローナル抗体結合粒子と、抗糖化ヘモグロビン
モノクローナル抗体結合粒子の混合粒子と、糖化ヘモグ
ロビンを含む検体とを接触させ、得られる凝集反応によ
って糖化ヘモグロビンを測定する方法に関する。
ンモノクローナル抗体結合粒子と、抗糖化ヘモグロビン
モノクローナル抗体結合粒子の混合粒子と、糖化ヘモグ
ロビンを含む検体とを接触させ、得られる凝集反応によ
って糖化ヘモグロビンを測定する方法に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明方法において使用する抗ヘ
モグロビンモノクローナル抗体結合粒子は、それ単独
で、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含有する検体
と接触させても、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの
いずれに対しても凝集反応を示さない抗体結合粒子であ
る。また、本発明方法で使用する抗糖化ヘモグロビンモ
ノクローナル抗体結合粒子も、それ単独で、ヘモグロビ
ン及び糖化ヘモグロビンを含有する検体と接触させて
も、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンのいずれに対し
ても、同様に凝集反応を示さない抗体結合粒子である。
しかしながら、前記の抗ヘモグロビンモノクローナル抗
体結合粒子と、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
結合粒子との組合せを、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロ
ビンを含有する検体と接触させると、ヘモグロビンに対
しては凝集反応を示さないが、糖化モグロビンに対して
は特異的に凝集反応を示す。
モグロビンモノクローナル抗体結合粒子は、それ単独
で、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含有する検体
と接触させても、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの
いずれに対しても凝集反応を示さない抗体結合粒子であ
る。また、本発明方法で使用する抗糖化ヘモグロビンモ
ノクローナル抗体結合粒子も、それ単独で、ヘモグロビ
ン及び糖化ヘモグロビンを含有する検体と接触させて
も、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンのいずれに対し
ても、同様に凝集反応を示さない抗体結合粒子である。
しかしながら、前記の抗ヘモグロビンモノクローナル抗
体結合粒子と、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
結合粒子との組合せを、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロ
ビンを含有する検体と接触させると、ヘモグロビンに対
しては凝集反応を示さないが、糖化モグロビンに対して
は特異的に凝集反応を示す。
【０００６】すなわち、本発明方法において使用する前
記の組合せ、すなわち、前記の抗ヘモグロビンモノクロ
ーナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノクローナ
ル抗体結合粒子との組合せは、糖化ヘモグロビン１分子
に対して２個のエピトープをもつので凝集するのに対
し、ヘモグロビン１分子に対して１個のエピトープしか
もたないので凝集しない。従って、本発明による前記の
組合せを用いると、凝集反応により、検体中の糖化ヘモ
グロビンを特異的に非常に迅速に測定することができ
る。本発明において、検体とは、糖化ヘモグロビンを含
有するおそれのある生物学的試料であれば特に限定され
ないが、特には、血液、血清、血漿又は尿である。な
お、本明細書において、生物学的試料は特にヒトの試料
であり、従って、ヘモグロビンは、特にヒトヘモグロビ
ンであり、糖化ヘモグロビンは、特にヒト糖化ヘモグロ
ビンである。また、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体
は、特に抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体であ
り、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体は、特に抗
ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体である。
記の組合せ、すなわち、前記の抗ヘモグロビンモノクロ
ーナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノクローナ
ル抗体結合粒子との組合せは、糖化ヘモグロビン１分子
に対して２個のエピトープをもつので凝集するのに対
し、ヘモグロビン１分子に対して１個のエピトープしか
もたないので凝集しない。従って、本発明による前記の
組合せを用いると、凝集反応により、検体中の糖化ヘモ
グロビンを特異的に非常に迅速に測定することができ
る。本発明において、検体とは、糖化ヘモグロビンを含
有するおそれのある生物学的試料であれば特に限定され
ないが、特には、血液、血清、血漿又は尿である。な
お、本明細書において、生物学的試料は特にヒトの試料
であり、従って、ヘモグロビンは、特にヒトヘモグロビ
ンであり、糖化ヘモグロビンは、特にヒト糖化ヘモグロ
ビンである。また、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体
は、特に抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体であ
り、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体は、特に抗
ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体である。
【０００７】本発明方法で用いることのできる粒子は、
凝集反応のモノクローナル抗体用担体として、通常使用
されている水不溶性担体粒子であれば特に限定はされな
いが、ポリスチレン粒子が最も好ましい。ポリスチレン
粒子の平均粒径（直径）も特に限定されないが、好まし
くは０．１〜１μｍである。ポリスチレン粒子の平均粒
径が０．１μｍ未満になると、遠心分離が困難であり、
１μｍを越えると均一に分散させにくい。
凝集反応のモノクローナル抗体用担体として、通常使用
されている水不溶性担体粒子であれば特に限定はされな
いが、ポリスチレン粒子が最も好ましい。ポリスチレン
粒子の平均粒径（直径）も特に限定されないが、好まし
くは０．１〜１μｍである。ポリスチレン粒子の平均粒
径が０．１μｍ未満になると、遠心分離が困難であり、
１μｍを越えると均一に分散させにくい。
【０００８】抗ヘモグロビンモノクローナル抗体それ自
体、及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体それ自
体は、従来より周知であり、それぞれ周知の方法で調製
することができる。しかし、本発明方法で使用すること
のできる抗ヘモグロビンモノクローナル抗体は、それを
粒子と結合させ、その結合粒子を単独でヘモグロビン及
び糖化ヘモグロビンと反応させた場合に、いずれとも凝
集反応をしないという性質をもつことが必要である。更
に、この抗体のエピトープが本発明方法で使用するもう
一方の抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体のエピト
ープと相互に立体障害を起こさない位置にあることが必
要である。
体、及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体それ自
体は、従来より周知であり、それぞれ周知の方法で調製
することができる。しかし、本発明方法で使用すること
のできる抗ヘモグロビンモノクローナル抗体は、それを
粒子と結合させ、その結合粒子を単独でヘモグロビン及
び糖化ヘモグロビンと反応させた場合に、いずれとも凝
集反応をしないという性質をもつことが必要である。更
に、この抗体のエピトープが本発明方法で使用するもう
一方の抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体のエピト
ープと相互に立体障害を起こさない位置にあることが必
要である。
【０００９】従って、本発明方法で使用することのでき
るモノクローナル抗体は、前記の抗ヘモグロビンモノク
ローナル抗体及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗
体の中から、目的に沿って選択する。すなわち、各抗体
を粒子と結合させ、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体
結合粒子及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結
合粒子を調製し、それぞれ単独でヘモグロビン及び糖化
ヘモグロビンと反応させ、いずれとも凝集反応をしない
モノクローナル抗体を選択する。次に、選ばれたモノク
ローナル抗体結合粒子の中から、ヘモグロビンを含む検
体と接触させても凝集しないが、糖化ヘモグロビンを含
む検体と接触させると凝集を起こす、抗ヘモグロビンモ
ノクローナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノク
ローナル抗体結合粒子との組合せを選択する。こうして
本発明方法で用いる結合粒子の組み合わせを得ることが
できる。
るモノクローナル抗体は、前記の抗ヘモグロビンモノク
ローナル抗体及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗
体の中から、目的に沿って選択する。すなわち、各抗体
を粒子と結合させ、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体
結合粒子及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結
合粒子を調製し、それぞれ単独でヘモグロビン及び糖化
ヘモグロビンと反応させ、いずれとも凝集反応をしない
モノクローナル抗体を選択する。次に、選ばれたモノク
ローナル抗体結合粒子の中から、ヘモグロビンを含む検
体と接触させても凝集しないが、糖化ヘモグロビンを含
む検体と接触させると凝集を起こす、抗ヘモグロビンモ
ノクローナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノク
ローナル抗体結合粒子との組合せを選択する。こうして
本発明方法で用いる結合粒子の組み合わせを得ることが
できる。
【００１０】本発明で用いるモノクローナル抗体と不溶
性担体との結合は、周知の方法で実施することができ
る。例えば、ラテックスと抗体含有緩衝液とを、撹拌下
に混合し、遠心分離して得られる沈渣を適当な緩衝液に
懸濁する。得られた感作ラテックスはこの懸濁液で保存
することができる。
性担体との結合は、周知の方法で実施することができ
る。例えば、ラテックスと抗体含有緩衝液とを、撹拌下
に混合し、遠心分離して得られる沈渣を適当な緩衝液に
懸濁する。得られた感作ラテックスはこの懸濁液で保存
することができる。
【００１１】本発明方法で用いる抗ヘモグロビンモノク
ローナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体結合粒子との組合せにおいて、両者の使用比率
は、特に限定はされないが、抗ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体結合粒子：抗糖化ヘモグロビンモノクローナル
抗体結合粒子の比が、好ましくは１：１である。また、
検体に対して使用する抗ヘモグロビンモノクローナル抗
体結合粒子及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
結合粒子の添加量は、特に限定されないが、好ましくは
１：１（ｖ：ｖ）である。
ローナル抗体結合粒子と抗糖化ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体結合粒子との組合せにおいて、両者の使用比率
は、特に限定はされないが、抗ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体結合粒子：抗糖化ヘモグロビンモノクローナル
抗体結合粒子の比が、好ましくは１：１である。また、
検体に対して使用する抗ヘモグロビンモノクローナル抗
体結合粒子及び抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
結合粒子の添加量は、特に限定されないが、好ましくは
１：１（ｖ：ｖ）である。
【００１２】本発明方法は、スライドグラス上での肉眼
による凝集検査だけでなく、自動分析機による分光学的
自動分析にも適用することができる。
による凝集検査だけでなく、自動分析機による分光学的
自動分析にも適用することができる。
【００１３】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ヒトヘモグロビンに対するモノクローナル抗
体の作製 ヒトヘモグロビン（２ｍｇ／ｍｌ）をフロイント完全ア
ジュバンド（体積比１：１）に充分に分散させた。この
分散液１００μｌをＢａｌｂ／ｃマウスに一回免疫し、
４週間後から２週間毎に、生理食塩水で１ｍｇ／ｍｌの
濃度にしたヒトヘモグロビン液１００μｌにより４回免
疫した。この免疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、
この脾臓より脾細胞をマウス一匹あたり０．５×１０8
個得た。この脾細胞１．５×１０8 個とマウスミエロー
マ細胞（ＳＰ ２／ｏ）３．０×１０7 個とを、ＰＥＧ
４０００（４５％）存在下で、融合させ培養した。増殖
した細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗ヒトヘ
モグロビン抗体の有無を調べた。該抗体が陽性の細胞を
限界希釈法によりクローニングし、抗ヒトヘモグロビン
抗体を産生している細胞８種を確立した。これにより得
られた細胞８種を抗ヒトヘモグロビンマウスモノクロー
ナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）として、それぞれ
大量に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後に腹
水を採取し、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体８
種（Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−
６、Ｈ−７、Ｈ−８）を得た。得られたモノクローナル
抗体の免疫グロブリンサブクラスは、以下の表１に示す
とおりであった。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ヒトヘモグロビンに対するモノクローナル抗
体の作製 ヒトヘモグロビン（２ｍｇ／ｍｌ）をフロイント完全ア
ジュバンド（体積比１：１）に充分に分散させた。この
分散液１００μｌをＢａｌｂ／ｃマウスに一回免疫し、
４週間後から２週間毎に、生理食塩水で１ｍｇ／ｍｌの
濃度にしたヒトヘモグロビン液１００μｌにより４回免
疫した。この免疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、
この脾臓より脾細胞をマウス一匹あたり０．５×１０8
個得た。この脾細胞１．５×１０8 個とマウスミエロー
マ細胞（ＳＰ ２／ｏ）３．０×１０7 個とを、ＰＥＧ
４０００（４５％）存在下で、融合させ培養した。増殖
した細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗ヒトヘ
モグロビン抗体の有無を調べた。該抗体が陽性の細胞を
限界希釈法によりクローニングし、抗ヒトヘモグロビン
抗体を産生している細胞８種を確立した。これにより得
られた細胞８種を抗ヒトヘモグロビンマウスモノクロー
ナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）として、それぞれ
大量に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後に腹
水を採取し、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体８
種（Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−
６、Ｈ−７、Ｈ−８）を得た。得られたモノクローナル
抗体の免疫グロブリンサブクラスは、以下の表１に示す
とおりであった。
【００１４】
【表１】
【００１５】実施例２：抗ヒトヘモグロビンモノクロー
ナル抗体結合ラテックスの調製とそのラテックス反応性 ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製（米国）；１
０％，直径０．４８９μｍ〕０．２ｍｌを、実施例１で
作製した抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体それぞ
れを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．
８ｍｌ（それぞれの抗体濃度０．９ｍｇ／ｍｌ）に混合
し、マグネチックスターラーで攪拌した。混合液を遠心
分離（２０，０００ｇ×１０分間）し、０．０５％Ｎａ
Ｎ3 を含む蒸留水で４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ
（ウシ血清アルブミン）を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に懸濁させ（１ｗ／ｖ％）、保存し
た。各感作ラテックスと種々の濃度のヒトヘモグロビン
を混合し、凝集の有無を確認した。結果を表２に示す。
以下の各表において「Ｌ−」は、モノクローナル抗体Ｈ
−１〜Ｈ−８とラテックスとの結合体であることを意味
し、「＋」は凝集有り、「−」は凝集無しを示す。
ナル抗体結合ラテックスの調製とそのラテックス反応性 ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製（米国）；１
０％，直径０．４８９μｍ〕０．２ｍｌを、実施例１で
作製した抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体それぞ
れを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．
８ｍｌ（それぞれの抗体濃度０．９ｍｇ／ｍｌ）に混合
し、マグネチックスターラーで攪拌した。混合液を遠心
分離（２０，０００ｇ×１０分間）し、０．０５％Ｎａ
Ｎ3 を含む蒸留水で４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ
（ウシ血清アルブミン）を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に懸濁させ（１ｗ／ｖ％）、保存し
た。各感作ラテックスと種々の濃度のヒトヘモグロビン
を混合し、凝集の有無を確認した。結果を表２に示す。
以下の各表において「Ｌ−」は、モノクローナル抗体Ｈ
−１〜Ｈ−８とラテックスとの結合体であることを意味
し、「＋」は凝集有り、「−」は凝集無しを示す。
【００１６】
【表２】 ヒトヘモグロビン濃度（μｇ／ｍｌ） 800 400 200 100 50 20 10 ４ ２ １ Ｌ−Ｈ−１ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − − − Ｌ−Ｈ−２ − − − − − − − − − − Ｌ−Ｈ−３ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ Ｌ−Ｈ−４ − − − − − − − − − − Ｌ−Ｈ−５ − − − − − − − − − − Ｌ−Ｈ−６ − − − − − − − − − − Ｌ−Ｈ−７ − − − − − − − − − −Ｌ−Ｈ−８ − − − − − − − − − − 抗体ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体Ｈ−２、Ｈ−
４、Ｈ−５、Ｈ−６、Ｈ−７、又はＨ−８を感作したラ
テックス試薬であるＬ−Ｈ−２、Ｌ−Ｈ−４、Ｌ−Ｈ−
５、Ｌ−Ｈ−６、Ｌ−Ｈ−７、又はＬ−Ｈ−８、単独で
はヒトヘモグロビンと凝集しなかった。
４、Ｈ−５、Ｈ−６、Ｈ−７、又はＨ−８を感作したラ
テックス試薬であるＬ−Ｈ−２、Ｌ−Ｈ−４、Ｌ−Ｈ−
５、Ｌ−Ｈ−６、Ｌ−Ｈ−７、又はＬ−Ｈ−８、単独で
はヒトヘモグロビンと凝集しなかった。
【００１７】実施例３：糖化ヘモグロビンに対するモノ
クローナル抗体の作製 糖化ヘモグロビンをフロイント完全アジュバンドに充分
に分散させ、この分散液１００μｌ（糖化ヘモグロビン
濃度１ｍｇ／ｍｌ）でマウスに３週間毎に３回免疫し
た。この免疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、この
脾臓から一匹あたり１．５×１０8 個の脾細胞を得た。
この脾細胞１．５×１０8 個とマウスミエローマ細胞
（ＳＰ ２／ｏ）３．０×１０7 個とを、ＰＥＧ４００
０（４５％）存在下で、融合させ培養した。増殖した細
胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗ヒト糖化ヘモ
グロビン抗体の有無を調べた。該抗体が陽性の細胞を限
界希釈法によりクローニングし、抗ヒト糖化ヘモグロビ
ン抗体を産生している細胞１種を確立した。これにより
得られた細胞１種を抗ヒト糖化ヘモグロビンマウスモノ
クローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）として大量
に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後に腹水を
採取し、抗糖化ヒトヘモグロビン抗体１種（ｇＨ−１）
を得た。得られたモノクローナル抗体ｇＨ−１の免疫グ
ロブリンサブクラスは、ＩｇＧ1 κであった。
クローナル抗体の作製 糖化ヘモグロビンをフロイント完全アジュバンドに充分
に分散させ、この分散液１００μｌ（糖化ヘモグロビン
濃度１ｍｇ／ｍｌ）でマウスに３週間毎に３回免疫し
た。この免疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、この
脾臓から一匹あたり１．５×１０8 個の脾細胞を得た。
この脾細胞１．５×１０8 個とマウスミエローマ細胞
（ＳＰ ２／ｏ）３．０×１０7 個とを、ＰＥＧ４００
０（４５％）存在下で、融合させ培養した。増殖した細
胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により抗ヒト糖化ヘモ
グロビン抗体の有無を調べた。該抗体が陽性の細胞を限
界希釈法によりクローニングし、抗ヒト糖化ヘモグロビ
ン抗体を産生している細胞１種を確立した。これにより
得られた細胞１種を抗ヒト糖化ヘモグロビンマウスモノ
クローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）として大量
に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後に腹水を
採取し、抗糖化ヒトヘモグロビン抗体１種（ｇＨ−１）
を得た。得られたモノクローナル抗体ｇＨ−１の免疫グ
ロブリンサブクラスは、ＩｇＧ1 κであった。
【００１８】実施例４：抗ヒト糖化ヘモグロビンモノク
ローナル抗体結合ラテックスの調製とそのラテックスの
反応性 ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製（米国）；１
０％，直径０．４８９μｍ〕０．２ｍｌと、実施例３で
作製した抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
（ｇＨ−１）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）１．８ｍｌ（抗体濃度０．９ｍｇ／ｍｌ）とを
混合し、マグネチックスターラーで撹拌した。混合液を
遠心分離（２０，０００ｇ×１０分間）し、０．０５％
ＮａＮ3 を含む蒸留水で４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＢ
ＳＡを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に
懸濁させ（１ｗ／ｖ％）、保存した。この感作ラテック
スと種々の濃度のヒト糖化ヘモグロビン、又はヒトヘモ
グロビンとを混合し、凝集の有無を確認した。結果を表
３及び表４に示す。
ローナル抗体結合ラテックスの調製とそのラテックスの
反応性 ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製（米国）；１
０％，直径０．４８９μｍ〕０．２ｍｌと、実施例３で
作製した抗ヒト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
（ｇＨ−１）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）１．８ｍｌ（抗体濃度０．９ｍｇ／ｍｌ）とを
混合し、マグネチックスターラーで撹拌した。混合液を
遠心分離（２０，０００ｇ×１０分間）し、０．０５％
ＮａＮ3 を含む蒸留水で４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのＢ
ＳＡを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に
懸濁させ（１ｗ／ｖ％）、保存した。この感作ラテック
スと種々の濃度のヒト糖化ヘモグロビン、又はヒトヘモ
グロビンとを混合し、凝集の有無を確認した。結果を表
３及び表４に示す。
【００１９】
【表３】 ヒト糖化ヘモグロビン濃度（μｇ／ｍｌ） 800 400 200 100 50 20 10 ４ ２ １ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −
【００２０】
【表４】 ヒトヘモグロビン濃度（μｇ／ｍｌ） 800 400 200 100 50 20 10 ４ ２ １ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − − 抗ヒト糖化ヘモグロビン抗体ｇＨ−１を感作したラテッ
クス試薬Ｌ−ｇＨ−１単独では、ヒト糖化ヘモグロビン
及びヒトヘモグロビンの両方とも凝集しなかった。
クス試薬Ｌ−ｇＨ−１単独では、ヒト糖化ヘモグロビン
及びヒトヘモグロビンの両方とも凝集しなかった。
【００２１】実施例５：抗ヒトヘモグロビンモノクロー
ナル抗体結合ラテックスと抗ヒト糖化ヘモグロビンモノ
クローナル抗体結合ラテックスの混合ラテックスの反応
性 単独ではヒトヘモグロビンと凝集しない抗ヒトヘモグロ
ビンモノクローナル抗体ラテックスと、単独ではヒト糖
化ヘモグロビン及びヒトヘモグロビンと凝集しない抗ヒ
ト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックス
を混合して、前記の抗原との反応性を調べた。結果を表
５及び表６に示す。
ナル抗体結合ラテックスと抗ヒト糖化ヘモグロビンモノ
クローナル抗体結合ラテックスの混合ラテックスの反応
性 単独ではヒトヘモグロビンと凝集しない抗ヒトヘモグロ
ビンモノクローナル抗体ラテックスと、単独ではヒト糖
化ヘモグロビン及びヒトヘモグロビンと凝集しない抗ヒ
ト糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテックス
を混合して、前記の抗原との反応性を調べた。結果を表
５及び表６に示す。
【００２２】
【表５】 ヒト糖化ヘモグロビン濃度（μｇ／ｍｌ） 800 400 200 100 50 20 10 ４ ２ １ Ｌ−ｇＨ−１ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋Ｌ−Ｈ−２ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−４ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−５ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−６ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−７ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−８
【００２３】
【表６】 ヒトヘモグロビン濃度（μｇ／ｍｌ） 800 400 200 100 50 20 10 ４ ２ １ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−２ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−４ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−５ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−６ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−７ Ｌ−ｇＨ−１ − − − − − − − − − −＋Ｌ−Ｈ−８
【００２４】表５及び表６に示すとおり、抗ヒト糖化ヘ
モグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスＬ−ｇＨ
−１と抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテ
ックスＬ−Ｈ−２との混合ラテックスだけがヒト糖化ヘ
モグロビンと凝集反応を示した。この混合ラテックスを
用いて、光学的測定機器ＬＰＩＡ−２００〔登録商標；
三菱化学（株）〕により、検体中の糖化ヘモグロビンを
分光学的反応速度法で測定した結果を図１に示す。な
お、図１のＶ値とは、凝集反応速度である。図１から明
らかなとおり、本発明方法によれば、自動分析装置を利
用する定量も可能である。
モグロビンモノクローナル抗体結合ラテックスＬ−ｇＨ
−１と抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体結合ラテ
ックスＬ−Ｈ−２との混合ラテックスだけがヒト糖化ヘ
モグロビンと凝集反応を示した。この混合ラテックスを
用いて、光学的測定機器ＬＰＩＡ−２００〔登録商標；
三菱化学（株）〕により、検体中の糖化ヘモグロビンを
分光学的反応速度法で測定した結果を図１に示す。な
お、図１のＶ値とは、凝集反応速度である。図１から明
らかなとおり、本発明方法によれば、自動分析装置を利
用する定量も可能である。
【００２５】
【発明の効果】本発明方法によれば、従来法に比べて遥
かに短時間（１０分以内）で、検体中のヘモグロビンの
妨害を受けずに、糖化ヘモグロビンの特異的な測定を行
うことができる。
かに短時間（１０分以内）で、検体中のヘモグロビンの
妨害を受けずに、糖化ヘモグロビンの特異的な測定を行
うことができる。
【図１】本発明による混合ラテックスを用いて、光学的
測定機器により糖化ヘモグロビン濃度を測定した結果を
示すグラフである。
測定機器により糖化ヘモグロビン濃度を測定した結果を
示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/72 Ｇ０１Ｎ 33/72 Ｚ
Claims (5)
- 【請求項１】 抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合
粒子と、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒
子の混合粒子と、糖化ヘモグロビンを含む検体とを接触
させ、得られる凝集反応によって糖化ヘモグロビンを測
定する方法。 - 【請求項２】 単独では、検体中の糖化ヘモグロビン及
びヘモグロビンと凝集しない特性をもつ抗ヘモグロビン
モノクローナル抗体結合粒子を使用する請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 単独では、検体中の糖化ヘモグロビン及
びヘモグロビンと凝集しない特性をもつ抗糖化ヘモグロ
ビンモノクローナル抗体結合粒子を使用する請求項１に
記載の方法。 - 【請求項４】 ヘモグロビンを含む検体と接触させても
凝集しない、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒
子と抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体結合粒子と
の混合粒子を使用する請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 粒子の直径が０．０２〜４μｍのラテッ
クスを用いる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10619896A JP3550614B2 (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10619896A JP3550614B2 (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09274038A true JPH09274038A (ja) | 1997-10-21 |
| JP3550614B2 JP3550614B2 (ja) | 2004-08-04 |
Family
ID=14427483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10619896A Expired - Fee Related JP3550614B2 (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3550614B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11258238A (ja) * | 1998-03-10 | 1999-09-24 | Tokuyama Corp | 免疫学的凝集測定用試薬キット |
| JPH11304781A (ja) * | 1998-04-20 | 1999-11-05 | Hitachi Ltd | 液体クロマトグラフ |
| JP2007315776A (ja) * | 2006-05-23 | 2007-12-06 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃ測定用測定キット |
| CN110702894A (zh) * | 2019-10-10 | 2020-01-17 | 南京欧凯生物科技有限公司 | 一种直接测定糖化血红蛋白含量的检测方法 |
| CN111157747A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-15 | 上海高踪医疗器械科技有限公司 | 一种糖化血红蛋白检测试剂盒及其生产工艺 |
-
1996
- 1996-04-03 JP JP10619896A patent/JP3550614B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11258238A (ja) * | 1998-03-10 | 1999-09-24 | Tokuyama Corp | 免疫学的凝集測定用試薬キット |
| JPH11304781A (ja) * | 1998-04-20 | 1999-11-05 | Hitachi Ltd | 液体クロマトグラフ |
| JP2007315776A (ja) * | 2006-05-23 | 2007-12-06 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃ測定用測定キット |
| CN110702894A (zh) * | 2019-10-10 | 2020-01-17 | 南京欧凯生物科技有限公司 | 一种直接测定糖化血红蛋白含量的检测方法 |
| CN111157747A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-15 | 上海高踪医疗器械科技有限公司 | 一种糖化血红蛋白检测试剂盒及其生产工艺 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3550614B2 (ja) | 2004-08-04 |
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