CN111323601A - 用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,所述化学发光试剂盒采用双单抗夹心法检测尿液中的微量触珠蛋白,所述化学发光试剂盒包括化学发光板、酶标单抗溶液、标准品溶液和发光底物,所述化学发光板采用稀释后的单克隆抗体5C4包被,并采用封闭液封闭,所述酶标单抗溶液包括由HRP标记的单克隆抗体HRP‑1A2和抗体稀释液,所述单克隆抗体5C4和单克隆抗体1A2为可识别人类天然Hp分子结构表位的单克隆抗体。本发明化学发光试剂采用双单抗夹心法检测尿液中Hp含量,利用单克隆抗体5C4和1A2作为双单抗体,此对单克隆抗体可特异性识别人类Hp分子结构表位,结构表位抗体可特异性的检测非变性的Hp分子,检测准确度高,偏倚值为‑6.78%~10.12%。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒及方法,属于生物医药诊断技术领域。
背景技术
触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)又称结合珠蛋白,广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及其他体液中。在CAM电泳及琼脂糖凝胶电泳中,触珠蛋白位于α2区带,分子中有两对肽链(α链与β链)共同形成α2β2的四聚体。Hp的分子结构受遗传控制,人类存在两种不同的等位基因Hp1和Hp2。因此,形成了三种Hp基因型:Hp1-1,Hp2-1和Hp2-2。
触珠蛋白的主要功能是与游离血红蛋白结合成复合物并通过与CD163分子结合提呈给单核-巨噬细胞系统处理,从而可以去除血液循环中的游离血红蛋白,避免其对肾脏的损害。研究显示不同基因型的Hp结合血红蛋白的能力不同,其中以Hp1-1最强,Hp2-2最弱。Hp在临床上常用于诊断血管内溶血性疾病,如阵发性睡眠性血红蛋白尿症和蚕豆病,以及先天性无结合珠蛋白血症等。同时,Hp还是一种急性时相蛋白,当机体处在应激状态时,血液中的结合珠蛋白明显增多,如心肌梗塞、肿瘤、炎症、创伤、感染等病理状态时,以及应用某些激素,如皮质激素和雄性激素后,其血清含量常有显著升高,并与严重程度和预后有关。
近年来,随着蛋白组学技术的广泛应用,Hp更多的新功能被人们认识和发现。尤其是在糖尿病领域,研究发现Hp是糖尿病患者血管并发症易感的决定因素之一,弥补了传统预测因素无法早期预测远期预后的不足。其中美国学者、新加坡学者和中国学者(北京同仁医院杨金奎教授)三个独立的研究团队先后实验证实尿液Hp浓度是2型糖尿病肾病敏感的早期标志物,其中杨金奎团队率先证明了尿Hp与糖尿病视网膜微血管病变的关系,其研究内容为《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》所采纳。因此尿Hp的检测对糖尿病并发症(视网膜病变和肾病)早期诊断和预防具有非常重要的意义。
目前,用于检测血液Hp含量的测定试剂盒的检测原理基于散射比浊法:血清中包含的Hp蛋白与试剂中的特异性抗体结合形成免疫复合物,这些免疫复合物会使穿过标本的光束发生散射,散射光的强度与血清中Hp浓度成正比,通过与已知的标准Hp浓度对比可计算出血清中Hp的含量。但是,由于受到散射比浊方法学的限制,虽利于自动化,但检测灵敏度较差,只能检测μg/mL级浓度水平的Hp,对于浓度低至ng/mL的尿液Hp无法完成精确分析。另一种可用于Hp含量分析的试剂为触珠蛋白ELISA检测试剂盒。该试剂盒采用单克隆抗体包被空白酶联板,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆抗体为检测抗体,通过两步法的方式检测体液中的Hp浓度。此检测法的操作简便,无需复杂仪器,可稳定检测浓度低至0.2ng/mL的Hp蛋白。但是,此检测试剂也存在明显的不足:⑴检测效率低下,需要较长的检测时间;⑵检测抗体为多克隆抗体,稳定性差,导致不同批次的试剂检测一致性较差;⑶与小鼠Hp有0.855%的非特异性交叉反应;⑷无法实现自动化检测。尿液Hp浓度分析对糖尿病肾损伤早期诊断具有重要的意义,目前还不存在适合于临床实验室使用的用于检测尿液低浓度Hp的自动化方法。
发明内容
本发明为克服现有技术弊端,提供一种用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒及方法,本发明化学发光试剂采用双单抗夹心法检测尿液中Hp含量,利用单克隆抗体5C4和1A2作为双单抗体,此对单克隆抗体可特异性识别人类Hp分子结构表位,结构表位抗体可特异性的检测非变性的Hp分子,检测准确度高,偏倚值为-6.78%~10.12%。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,所述化学发光试剂盒采用双单抗夹心法检测尿液中的微量触珠蛋白,所述化学发光试剂盒包括化学发光板、酶标单抗溶液、标准品溶液和发光底物,所述化学发光板采用稀释后的单克隆抗体5C4包被,并采用封闭液封闭,所述酶标单抗溶液包括由HRP标记的单克隆抗体HRP-1A2和抗体稀释液,所述单克隆抗体5C4和单克隆抗体1A2为可识别人类天然Hp分子结构表位的单克隆抗体。
上述用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,所述单克隆抗体5C4为IgG2aλ型抗体;所述单克隆抗体1A2为IgG1κ型抗体。
上述用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,所述化学发光板的制备过程包括包被、封闭和干燥密封,具体步骤为:采用50mM、pH=9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液,将单克隆抗体5C4稀释至3μg/mL,化学发光板的每个微孔中加入100μL稀释后的单克隆抗体5C4,37℃静置4h;封闭液为20mM pH=7.4的PBS缓冲液,包括1.2%BSA、0.1%酪蛋白及0.1%Proclin300,包被后的化学发光板经洗涤后,每孔加入封闭液120μL,37℃静置2h;封闭后的发光板加干燥剂密封处理,即得到包被的化学发光板。所述封闭液中百分数含量指100mL封闭液中含有1.2gBSA、0.1g酪蛋白及0.1g Proclin300。
上述用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,所述酶标单抗溶液中单克隆抗体HRP-1A2和抗体稀释液的稀释比例为1:3000,所述抗体稀释液为20mM、pH=7.4的PBS缓冲液,包括3%的BSA、0.8%氯化钠、0.01%氯化钾及0.1%Proclin300。所述百分数含量指100mL抗体稀释液中含有3gBSA、0.8g氯化钠、0.01g氯化钾及0.1g Proclin300。
上述用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,所述标准品溶液由已知浓度可溯源的Hp蛋白经过标准品稀释液稀释而成,所述标准品稀释液为20mM、pH=7.4的PBS缓冲液,包括1%BSA、0.8%氯化钠、2%新生牛血清和0.1%Proclin300。所述百分数指100mL抗体稀释液中含有1gBSA、0.8g氯化钠、2g新生牛血清及0.1g Proclin300。
上述用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,所述发光底物由A液和B液按体积比1:1混合制成,所述A液制备过程为:称取BSA6mg和甘氨酸14mg,溶解于200mL,pH=8.5,0.1M Tris-HCl溶液中,加入0.02M的鲁米诺溶液10mL,0.1M过碘酚1mL;溶解后混匀4℃避光保存;
所述B液制备过程为:称取过氧化脲48mg,溶解于200mL,pH=8.5,0.1M Tris-HCl溶液中,加入Triton X-100 0.5mL;溶解后混匀,4℃避光保存。
一种尿液中微量触珠蛋白的检测方法,利用上述化学发光试剂盒检测尿液中微量触珠蛋白,所述检测方法为双单抗夹心法,包括如下步骤:在稀释后的单克隆抗体5C4包被后的化学发光板每孔加入待测样本或者标准品溶液25μL,再向微孔中加入100μL的制备好的酶标单抗溶液,混匀,37℃温育60min,用PBST洗板五次,按体积比为1:1分别加入的发光底物A液和B液,避光反应3分钟后上机测定发光值,根据给出的发光值强度与Hp含量关系的标准曲线,得到触珠蛋白的含量。
本发明的有益效果是:
本发明通过人类天然Hp蛋白免疫小鼠获得了一对可特异性识别人类Hp分子结构表位的单克隆抗体5C4和1A2,与线性表位抗体相比,结构表位抗体可特异性的检测非变性的Hp分子,即具有生物活性的Hp分子;本发明建立的可检测Hp含量的化学发光法为双单抗夹心检测法,可特异、灵敏的检测各种体液中的Hp含量,检测下限低至3.256ng/mL,本发明化学发光试剂盒可以与已有化学发光检测平台相匹配,从而实现自动化检测;与现有的HpELISA检测试剂盒相比较,本发明使用的一对单克隆抗体检测Hp的准确度更好,偏倚值为-6.78%-10.12%,明显优于现有检测试剂盒的3.39%-84.36%。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为Hp2-1表型人触珠蛋白SDS-PAGE电泳图;
图2为抗人触珠蛋白单抗WB分析图(完整蛋白);
图3为抗人触珠蛋白单抗WB分析图(解离蛋白);
图4为不同的单克隆抗体配对检测不同浓度Hp的光密度曲线;
图5为Hp检测标准曲线(双对数直线拟合)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒采用双单抗夹心法检测尿液中的微量触珠蛋白,所述化学发光试剂盒包括化学发光板、酶标单抗溶液、标准品溶液和发光底物,所述化学发光板采用稀释后的单克隆抗体5C4包被,并采用封闭液封闭,所述酶标单抗溶液包括单克隆抗体1A2和抗体稀释液,所述单克隆抗体5C4为IgG2aλ型抗体;所述单克隆抗体1A2为IgG1κ型抗体,所述单克隆抗体5C4和单克隆抗体1A2为可识别人类天然Hp分子结构表位的单克隆抗体。
所述化学发光板的制备过程包括包被、封闭和干燥密封,具体步骤为:采用50mM、pH=9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液,将单克隆抗体5C4稀释至3μg/mL,化学发光板的每个微孔中加入100μL稀释后的单克隆抗体5C4,37℃静置4h;封闭液为包括1.2%BSA、0.1%酪蛋白及0.1%Proclin300的20mM pH=7.4的PBS缓冲液,包被后的化学发光板经洗涤后,每孔加入封闭液120μL,37℃静置2h;封闭后的发光板加干燥剂密封处理,即得到包被的化学发光板。
所述酶标单抗溶液中由HRP标记的单克隆抗体HRP-1A2和抗体稀释液的稀释比例为1:3000,所述抗体稀释液为包含3%的BSA、0.8%氯化钠、0.01%氯化钾及0.1%Proclin300的20mM、pH=7.4的PBS缓冲液。
所述标准品溶液由已知浓度可溯源的Hp蛋白经过标准品稀释液稀释而成,所述标准品稀释液为包含1%BSA、0.8%氯化钠、2%新生牛血清和0.1%Proclin300的20mM、pH=7.4的PBS缓冲液。
所述发光底物由A液和B液按体积比1:1混合制成,所述A液制备过程为:称取BSA6mg和甘氨酸14mg,溶解于200mL,pH=8.5,0.1M Tris-HCl溶液中,加入0.02M的鲁米诺溶液10mL,0.1M过碘酚1mL;溶解后混匀4℃避光保存;所述B液制备过程为:称取过氧化脲48mg,溶解于200mL,pH=8.5,0.1M Tris-HCl溶液中,加入Triton X-100 0.5mL;溶解后混匀,4℃避光保存。
尿液中微量触珠蛋白的检测方法为双单抗夹心法,包括如下步骤:向利用稀释后的单克隆抗体5C4包被后的化学发光板每孔中加入待测样本或者标准品溶液25μL,再向微孔中加入100μL的制备好的酶标单抗溶液,混匀,37℃温育60min,用PBST洗板五次,分别加入50μL的发光底物A液和B液,避光反应3分钟后上机测定发光值。利用酶催化化学底物发光,检测发光底物的强度,发光值强度与Hp含量成正比;利用标准曲线和测得的待测样品的发光值强度,计算得到触珠蛋白的含量。标准曲线斜率受多种因素影响,包括抗体性质、反应介质的调配,发光底物浓度和仪器的参数等。所以在实际的应用中,标准曲线为相对的标准,因实验场地和条件的变化而变化,每个实验室均会建立自己的标准曲线,严格的实验室每一次实验都会带标准品,制定每次实验的标准曲线。读取荧光的仪器为:厦门天中达TZD-CL-200S化学发光免疫分析仪。
本发明采用的单克隆抗体5C4和单克隆抗体1A2是通过人类天然Hp蛋白免疫小鼠而获得,可特异性的识别人Hp分子的结构表位,获得过程如下:
1、单克隆抗体的制备
1.1抗原
抗原为实验室亲和纯化人Hp2-1表型触珠蛋白5mL,浓度1.12mg/mL。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度及分子量,参看图1,可见抗原完整蛋白分子量大于100kD,呈现多条区带,对应Hp2-1表型相应的多聚体;解离的蛋白形成3条区带,对应Hp2-1表型特有的α1、α2和β链;以上分子特征均与已知文献报道一致。同时,电泳未见杂带,抗原纯度≥95%。
图1中泳道:1marker;2Hp2-1完整蛋白8μg;3Hp2-1完整蛋白4μg;4Hp2-1解离蛋白8μg;5Hp2-1解离蛋白4μg
1.2动物免疫
7周龄雌性Balb/c小鼠2只,体重25g左右。具体免疫方案为:初次基础免疫使用1mg/mL的Hp蛋白与等体积的福氏完全佐剂充分混匀,每只小鼠腹腔注射0.2mL。初次免疫后的第14天和28天进行两次加强免疫,使用免疫原为等体积充分混匀的Hp蛋白(1mg/mL)与福氏不完全佐剂,腹腔注射0.2mL。第42天直接脾脏注射1mg/mL Hp蛋白0.1mL。
初次免疫后第45天,摘除小鼠眼球取血并断颈处死,无菌条件下分离脾脏用于细胞融合。使用小鼠为2号小鼠,处死时血清抗体效价为1:256000。
1.3细胞融合
研磨小鼠脾脏收集脾细胞,GKN缓冲液洗涤后以10mL DMEM重悬细胞。脾细胞与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞按照1.6:1的比例混匀后离心,去除上清,轻扣离心管,使沉淀成糊状。加入37℃预温的50%PEG3500 1ml,逐滴加入,边加边摇,1分钟内加完后再摇1分钟。逐滴加入37℃预温的无血清DMEM 2ml,2分钟之内加完。继续加入无血清DMEM 7ml,2-3分钟之内加完,边加边摇。将细胞悬液离心弃上清,加入预温的含20%牛血清的HAT培养基,混匀细胞,后加入96孔培养板,置5%CO2,37℃细胞培养箱中培养。
1.4阳性克隆筛选及亚克隆
用碳酸盐缓冲液将Hp蛋白稀释至3μg/mL包被96孔酶标板,4℃冰箱过夜,经洗涤、封闭后,加入细胞培养上清孵育,以HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体进行检测。经4次检测,检测718孔,共计获得阳性克隆18株。以有限稀释法对18个阳性克隆进行亚克隆,经反复冻融,共获得稳定分泌抗体的阳性细胞株9株,编号如下:
1A2,1E8,3G4,4F9,5A9,5C4,6C11,9G2,10E11。
1.5单克隆抗体鉴定
1.5.1间接ELISA法检测抗体的反应性
如1.4所述用3μg/mL的Hp蛋白包被96孔酶标板,以HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体为检测抗体分析上述9个细胞株培养上清与Hp的反应性,结果如下表1所示:
表1阳性克隆细胞培养上清ELISA检测结果
由表1可知,9株阳性克隆与3种不同Hp表型均能反应,但反应强弱各有不同,没有针对特定表型的克隆株,这与Hp分子结构高度一致相关。
1.5.2 Western-blot分析单克隆抗体识别表位的特性
取3种不同表型的Hp蛋白SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜,经洗涤封闭后与不同的细胞克隆培养上清反应,以HRP标记的兔抗小鼠IgG为指示抗体,DAB显色液显色。结果如图2和图3所示,可见不同的单克隆抗体识别Hp分子的表位特征不同。一部分抗体可以同时与变性的和非变性的Hp分子反应,识别的是Hp分子的线性表位,这些抗体包括:1E8,3F6,5A9,6C11,9G2和10E11,其中5A9识别的是Hp分子的β链,其余5株识别Hp分子的α链。另一部分抗体可以与非变性Hp分子反应,不与变性Hp分子反应,识别的是Hp分子的结构表位,这些抗体包括:1A2,5C4和4F9。
注:图2中上样:M为Marker;1,4,7,10为Hp1-1血清;2,5,8,11为Hp2-1血清;3,6,9,12为Hp2-2血清(均为完整蛋白);抗人Hp单抗(一抗);1-3为1E8;4-6为5A9;7-9为1A2;10-12为5C4(均为细胞培养上清);HRP-羊抗小鼠IgG(二抗)1:1000稀释。
图3中M为Marker;1,4,7,10为Hp1-1血清;2,5,8,11为Hp2-1血清;3,6,9,12为Hp2-2血清(均为解链蛋白);抗人Hp单抗(一抗);1-3为1E8;4-6为5A9;7-9为1A2;10-12为5C4(均为细胞培养上清);HRP-羊抗小鼠IgG(二抗)1:1000稀释。
1.5.3小鼠腹水制备及抗体纯化
接种杂交瘤细胞前10天,小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。收集对数生长期的杂交瘤细胞,调节细胞浓度至1×106/mL,每只小鼠注射0.5mL。5~7天后,待小鼠腹部隆起,处死收集腹水,离心冻存。
抗体纯化使用蛋白G-琼脂糖凝胶预装柱进行亲和层析。预装柱用结合缓冲液平衡5~10个柱床体积,小鼠腹水离心后用结合缓冲液10倍稀释,0.45um滤膜过滤上样。用结合缓冲液平衡5~10个柱床体积后,用洗脱液洗脱,收集洗脱峰各管,收集管中预置中和缓冲液60~100μl,调节其PH至中性。用紫外可见分光光度计测定蛋白浓度,计算公式:蛋白(mg/ml)=OD280×1.45-OD260×0.74。
2、筛选用于检测Hp的单克隆抗体
2.1 HRP标记重组结构表位抗体
取5mg HRP溶解于0.5mL蒸馏水中,加入0.5mL新配的0.06mol/LNaIO4溶液,室温避光搅拌20min后置4℃半小时;加入0.16M乙二醇水溶液0.5mL,混匀后室温放置30分钟;加入1mL抗体溶液(2.5mg/mL),混匀后装入透析袋中,在0.05M,pH=9.6的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜;在透析过的溶液中加入0.2mL 5mg/mL的NaBH4溶液,4℃静置2小时;加入等体积饱和硫酸铵,4℃静置30分钟后10 000rpm离心10分钟,去除上清后用少许0.02M,pH=7.4的PBS缓冲液重新溶解沉淀并对之4℃透析过夜;离心去除不溶物所得即为HRP标记的抗体,加入0.02M,pH=7.4的PBS与适量中性甘油定容至5mL,小量分装备用。筛选过程中,标记了3个Hp分子结构表位抗体,分别为HRP-1A2,HRP-5C4和HRP-4F9。
2.2双抗体夹心ELISA筛选合适的抗体
将不同的单克隆抗体稀释到3μg/mL包被96孔酶标板,4℃冰箱过夜,经洗涤、封闭后,加入不同浓度的Hp溶液,分别用HRP-1A2,HRP-5C4和HRP-4F9作为配对的检测抗体进行检测。结果如图4所示,确定5C4和1A2为测定Hp含量的最优配对抗体。
2.3单克隆抗体5C4和1A2亚类的鉴定
使用小鼠IgG亚类鉴定试剂盒(Southern biotech)鉴定5C4和1A2的亚类,操作按照试剂盒说明书进行,结果如表2所示,经鉴定抗体1A2为IgG1κ型抗体,5C4为IgG2aλ型抗体。
表2阳性克隆1A2 5C4 IgG亚类鉴定结果
本发明化学发光试剂盒检测性能验证:
(一)化学发光试剂盒检测Hp的准确度
以国家食药监批准的多项蛋白定标品【国食药监(进)字2014第3402493】作为Hp检测标准品,SIEMENS公司生产;批号:083623;Hp含量:1.31ng/ml;效期至2019.12.15。可溯源到国际标准ERM@-470。
与已有试剂盒标准品比对:a)用校准品稀释液将美国R&D System公司人Hp检测ELISA试剂盒的标准品稀释为100ng/ml备用。b)以本发明试剂盒重复检测20次,依据标准曲线计算其Hp浓度。
表3 Hp检测标准曲线(采用双对数直线拟合法计算)
表4 R&D公司100ng/ml标准品重复测定20次检测结果(发光值)
表5 R&D公司100ng/ml标准品重复测定20次计算Hp浓度值(ng/ml)
结论:以SIEMENS公司生产的Hp校准品制作标准曲线,对R&D公司生产的100ng/ml的Hp标准品进行检测,经计算平均值M=101.45,标准偏差=1.45%。
(二)化学发光试剂盒检测Hp回收实验
分别准备两个不同浓度(如表7所示的高值和低值)的Hp含量样本,按照回收实验要求,将高值样本与低值样本按照1:9的比例制成混合样本,根据公式计算回收率。本实验的标准曲线制作与实施例1一致。
表6 Hp测定回收试验检测结果(发光值)
表7 Hp测定方法回收试验计算结果(ng/ml)
由表6和表7可知,本发明化学发光试剂检测Hp的回收率R=109.1%。
(三)化学发光试剂盒检测Hp的最低检出限
以样本稀释液为标本,应用本发明试剂盒连续监测20次,结果见表8和表9。本实验的标准曲线制作与(一)中一致。
表8以标本稀释液进行20次重复测定结果(发光值)
表9以标本稀释液进行20次重复测定计算结果(ng/ml)
计算上述结果平均值(M)和标准差(SD):M=2.84,SD=0.208。
最低检测限:根据标准曲线方程计算最低检测限
M+2SD=2.84+0.208×2=3.256ng/mL。
(四)重复性
用Hp浓度分别为40ng/ml和80ng/ml的样本各重复检测20次,以图5标准曲线计算其浓度值,结果分别见表9-表12。
表10 40±8ng/ml样本20次检测结果(发光值):
表11 40±8ng/ml样本20次检测计算结果(ng/ml):
表12 80±16ng/ml样本20次检测结果(发光值):
表13 80±16ng/ml样本20次检测计算结果(ng/ml):
分别计算上述结果的平均值(M)和标准差(SD),再根据公式CV=SD/M×100%计算各自变异系数(CV)。
由表10计算可知,40±8ng/ml样本20次检测M=41.32;SD=2.31;CV=5.6%。
由表12计算可知,80±16ng/ml样本20次检测M=81.08;SD=4.77;CV=5.9%。
(六)特异性
主要考量标本中白蛋白对检测稳定性的影响:将含Hp标本分成2份,分别制作成对照样本和干扰样本。干扰样本为Hp标本与高浓度人白蛋白标本(20μg/ml)按9:1比例混合而成;对照样本为Hp标本与生理盐水按9:1比例混合而成。每组标本反复测定3次,以图5标准曲线计算其浓度值,计算测量结果的平均值及偏差。
参看表14和表15,本实验可见使用本发明的化学发光试剂盒,白蛋白对于Hp测定无明显影响,测定平均偏差4.9%。
表14白蛋白干扰试验数据(发光值)
表15白蛋白干扰试验数据计算结果(ng/ml)
(七)偏倚度分析
取靶值为15ng/mL的三种型别的Hp蛋白,分别用本发明的方法和市场上现有的ELISA试剂(R&D公司)对其进行测定,结果如表16所示,本发明测定偏倚度为-6.78~10.12%,R&D公司ELISA试剂测定偏倚度为3.39~84.26%。可见,与现有的Hp ELISA检测试剂盒相比较,本发明使用的一对单克隆抗体检测Hp的准确度更好。
表16本发明检测方法与R&D公司ELISA试剂检测三种型别Hp偏倚度比较
Claims (7)
1.一种用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,其特征在于:所述化学发光试剂盒采用双单抗夹心法检测尿液中的微量触珠蛋白,所述化学发光试剂盒包括化学发光板、酶标单抗溶液、标准品溶液和发光底物,所述化学发光板采用稀释后的单克隆抗体5C4包被,并采用封闭液封闭,所述酶标单抗溶液包括单克隆抗体1A2和抗体稀释液,所述单克隆抗体5C4和单克隆抗体1A2为可识别人类天然Hp分子结构表位的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,其特征在于:所述单克隆抗体5C4为IgG2aλ型抗体;所述单克隆抗体1A2为IgG1κ型抗体。
3.根据权利要求2所述的用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,其特征在于:所述化学发光板的制备过程包括包被、封闭和干燥密封,具体步骤为:采用50mM、pH=9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液,将单克隆抗体5C4稀释至3μg/mL,化学发光板的每个微孔中加入100μL稀释后的单克隆抗体5C4,37℃静置4h;封闭液为包含1.2%BSA、0.1%酪蛋白及0.1%Proclin300的20mM pH=7.4的PBS缓冲液,包被后的化学发光板经洗涤后,每孔加入封闭液120μL,37℃静置2h;封闭后的发光板加干燥剂密封处理,即得到包被的化学发光板。
4.根据权利要求3所述的用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,其特征在于:所述酶标单抗溶液中单克隆抗体1A2和抗体稀释液的稀释比例为1:3000,所述抗体稀释液为20mM、pH=7.4的PBS缓冲液,其包括3%的BSA、0.8%氯化钠、0.01%氯化钾及0.1%Proclin300。
5.根据权利要求4所述的用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,其特征在于:所述标准品溶液由已知浓度可溯源的Hp蛋白经过标准品稀释液稀释而成,所述标准品稀释液为20mM、pH=7.4的PBS缓冲液,包括1%BSA、0.8%氯化钠、2%新生牛血清和0.1%Proclin300。
6.根据权利要求5所述的用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒,其特征在于:所述发光底物由A液和B液按体积比1:1混合制成,所述A液制备过程为:称取BSA 6mg和甘氨酸14mg,溶解于200mL,pH=8.5,0.1M Tris-HCl溶液中,加入0.02M的鲁米诺溶液10mL,0.1M过碘酚1mL;溶解后混匀4℃避光保存;
所述B液制备过程为:称取过氧化脲48mg,溶解于200mL,pH=8.5,0.1M Tris-HCl溶液中,加入Triton X-100 0.5mL;溶解后混匀,4℃避光保存。
7.一种尿液中微量触珠蛋白的检测方法,其特征在于:利用如权利要求1至6任一项所述的化学发光试剂盒检测尿液中微量触珠蛋白,所述检测方法为双单抗夹心法,包括如下步骤:向利用稀释后的单克隆抗体5C4包被后的化学发光板每孔加入待测样本或者标准品溶液25μL,再向微孔中加入100μL的制备好的酶标单抗溶液,混匀,37℃温育60min,用PBST洗板五次,按体积比为1:1分别加入的发光底物A液和B液,避光反应3分钟后上机测定发光值;根据测定的发光值与Hp含量标准曲线,计算得到Hp的含量。
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