JP3258407B2 - 乳ガン患者の血液試料中のｎｃａ−ｂｔの監視方法、試薬および試験キット - Google Patents
乳ガン患者の血液試料中のｎｃａ−ｂｔの監視方法、試薬および試験キットInfo
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、乳ガン患者における疾
患の進行または期を監視することに関する。より詳細に
は、本発明は、ガンマーカーの血液中レベルの測定に基
づくそのような監視方法に関する。
患の進行または期を監視することに関する。より詳細に
は、本発明は、ガンマーカーの血液中レベルの測定に基
づくそのような監視方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多数の物質が、種々のガン疾患の経過の
監視に用いるのに有用なマーカーであることがわかって
いる。同定されているいくつかの有用なマーカーは、ガ
ン胎児性抗原（ＣＥＡ）やα−フェトプロテインのよう
なオノフィタル（ｏｎｏｆｅｔａｌ）抗原、前立腺特異
性抗原（ＰＳＡ）のような組織特異性抗原、ならびにＣ
Ａ−１２５およびＣＡ−１９−９として従来知られてい
るもののようなムチン抗原である。
監視に用いるのに有用なマーカーであることがわかって
いる。同定されているいくつかの有用なマーカーは、ガ
ン胎児性抗原（ＣＥＡ）やα−フェトプロテインのよう
なオノフィタル（ｏｎｏｆｅｔａｌ）抗原、前立腺特異
性抗原（ＰＳＡ）のような組織特異性抗原、ならびにＣ
Ａ−１２５およびＣＡ−１９−９として従来知られてい
るもののようなムチン抗原である。
【０００３】このような抗原に関するイムノアッセイ
は、一般に診断時の確認試験として、および続いて患者
の状態の監視のために用いられる。時々、このような試
験は、腫瘍タイプの境界を越えて利用されるが（例え
ば、結腸ガン、乳ガンおよび肺ガンにおけるＣＥＡ試験
の利用、ならびに肝細胞および精巣のガンにおけるα−
フェトプロテイン）、しかし、各々の試験タイプの効用
は、単一の腫瘍タイプのためのものが主流である（例え
ば、前立腺ガンのためのＰＳＡ、および卵巣ガンのため
のＣＡ−１２５）。
は、一般に診断時の確認試験として、および続いて患者
の状態の監視のために用いられる。時々、このような試
験は、腫瘍タイプの境界を越えて利用されるが（例え
ば、結腸ガン、乳ガンおよび肺ガンにおけるＣＥＡ試験
の利用、ならびに肝細胞および精巣のガンにおけるα−
フェトプロテイン）、しかし、各々の試験タイプの効用
は、単一の腫瘍タイプのためのものが主流である（例え
ば、前立腺ガンのためのＰＳＡ、および卵巣ガンのため
のＣＡ−１２５）。
【０００４】遺伝学的および免疫学的にＣＥＡに関連す
る一群の抗原性タンパク質が同定されている［Thompso
n, J. and W. Zimmerman (1988) Tumor Biol. 9, 63-8
3;および Barnett, T. and W. Zimmerman (1990) Tumor
Biol. 11, 59-63］。これらの中には、非特異的交差反
応性抗原（ＮＣＡ）およびトランスメンブレン抗原（Ｔ
Ｍ−ＣＥＡ）が含まれる。
る一群の抗原性タンパク質が同定されている［Thompso
n, J. and W. Zimmerman (1988) Tumor Biol. 9, 63-8
3;および Barnett, T. and W. Zimmerman (1990) Tumor
Biol. 11, 59-63］。これらの中には、非特異的交差反
応性抗原（ＮＣＡ）およびトランスメンブレン抗原（Ｔ
Ｍ−ＣＥＡ）が含まれる。
【０００５】さらに、少なくとも２種のＮＣＡが存在す
ることが見いだされ［Tawargi, Y.,Oikawa, S., Matsuo
ka, Y., Kosaki, G. and H. Nakazato (1988) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 150, 89-96; および Neumaie
r, M., Zimmerman, W., Shively, L., Hinoda, Y., Rig
gs, A.D. and J.E. Shively (1988) J. Biol. Chem.26
3, 3202-3207］、ＮＣＡ−ＢＴおよびＮＣＡ−ＣＭＬと
名付けられた［ＮＣＡ−ＢＴに関しては、Barnett, T.,
Goebel, S.J., Nothdurft, M.A. and J.J.Elting (198
8) Genomics 3:59-66; Tawargi, Y., et al.前出; およ
びNeumaier, M., Zimmerman, W., Shively, L., Hinod
a, Y., Riggs, A. and J.E. Shively (1988) J. Biol.
Chem. 263:3202-3207を参照; ＮＣＡ−ＣＭＬに関して
は、Arakawa, F., Kuroki, M., Misumi, Y., Oikawa,
S., Nakazato, H. and Y. Matsuoka(1990) Biochem. Bi
ophys. Res. Commun. 166:1063-1071 を参照］。
ることが見いだされ［Tawargi, Y.,Oikawa, S., Matsuo
ka, Y., Kosaki, G. and H. Nakazato (1988) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 150, 89-96; および Neumaie
r, M., Zimmerman, W., Shively, L., Hinoda, Y., Rig
gs, A.D. and J.E. Shively (1988) J. Biol. Chem.26
3, 3202-3207］、ＮＣＡ−ＢＴおよびＮＣＡ−ＣＭＬと
名付けられた［ＮＣＡ−ＢＴに関しては、Barnett, T.,
Goebel, S.J., Nothdurft, M.A. and J.J.Elting (198
8) Genomics 3:59-66; Tawargi, Y., et al.前出; およ
びNeumaier, M., Zimmerman, W., Shively, L., Hinod
a, Y., Riggs, A. and J.E. Shively (1988) J. Biol.
Chem. 263:3202-3207を参照; ＮＣＡ−ＣＭＬに関して
は、Arakawa, F., Kuroki, M., Misumi, Y., Oikawa,
S., Nakazato, H. and Y. Matsuoka(1990) Biochem. Bi
ophys. Res. Commun. 166:1063-1071 を参照］。
【０００６】ガン胎児性抗原類（ファミリー）に属する
糖タンパク質の複雑な群のよりよい理解から、このファ
ミリーの種々のメンバーが種々の腫瘍タイプによって異
なって発現されるという観察がなされた。最もよく知ら
れた事実は、ＣＥＡが、全部でないにしてもほとんどの
結腸直腸ガン（カルシノーマ）によって発現される一
方、ごく少数の乳ガン（カルシノーマ）によって発現さ
れるということである。
糖タンパク質の複雑な群のよりよい理解から、このファ
ミリーの種々のメンバーが種々の腫瘍タイプによって異
なって発現されるという観察がなされた。最もよく知ら
れた事実は、ＣＥＡが、全部でないにしてもほとんどの
結腸直腸ガン（カルシノーマ）によって発現される一
方、ごく少数の乳ガン（カルシノーマ）によって発現さ
れるということである。
【０００７】この抗原ファミリーの種々のメンバーに特
異的なモノクローナル抗体の産生が成功しているため、
種々のガン集団からの血清をスクリーニングし、種々の
タイプのガンにおけるこのＣＥＡファミリーの個々のメ
ンバーの上昇の出現率を測定することが今では可能であ
る。このような特異的抗体の出現以前には、ガン血清中
のＮＣＡレベルを定量する試みは、用いられるイムノア
ッセイと交差反応する様々の量のＣＥＡファミリー中の
他のメンバーの存在によって混乱させられていた。
異的なモノクローナル抗体の産生が成功しているため、
種々のガン集団からの血清をスクリーニングし、種々の
タイプのガンにおけるこのＣＥＡファミリーの個々のメ
ンバーの上昇の出現率を測定することが今では可能であ
る。このような特異的抗体の出現以前には、ガン血清中
のＮＣＡレベルを定量する試みは、用いられるイムノア
ッセイと交差反応する様々の量のＣＥＡファミリー中の
他のメンバーの存在によって混乱させられていた。
【０００８】ＮＣＡに特異的なモノクローナル抗体の生
成の成功の報告は存在していたが［Chavanel, G., Fren
oy, N., Escribano, M.J. and P. Burtin (1983) Oncod
ev.Biol. and Med. 4, 209-217 ］、血液中のＮＣＡレ
ベルと特定のガン患者の臨床的状態との間の相関につい
ての報告はなかった。実際、文献には、ＮＣＡはガンに
関して非常に貧弱なマーカーであるという具体的な記述
がある［Shively, J.E., Spayth, V., Chang, F.-F., M
etter, G.E., Klein, L., Presant, C.A. andC.W. Todd
(1982) Cancer Res. 42:2502-2513;および Burtin,
P., Chavanol, G., Hendrick, J.C. and N. Frenoy (19
86) J. Immunol. 137:839-845］。さらに、今ではＣＥ
Ａおよびその他の抗原に関して広く受け入れられている
ようなモノクローナル抗体に基づくイムノアッセイは、
開発することが非常に困難であろうと推測されていた
（Burtin, P. et al, 前出) 。
成の成功の報告は存在していたが［Chavanel, G., Fren
oy, N., Escribano, M.J. and P. Burtin (1983) Oncod
ev.Biol. and Med. 4, 209-217 ］、血液中のＮＣＡレ
ベルと特定のガン患者の臨床的状態との間の相関につい
ての報告はなかった。実際、文献には、ＮＣＡはガンに
関して非常に貧弱なマーカーであるという具体的な記述
がある［Shively, J.E., Spayth, V., Chang, F.-F., M
etter, G.E., Klein, L., Presant, C.A. andC.W. Todd
(1982) Cancer Res. 42:2502-2513;および Burtin,
P., Chavanol, G., Hendrick, J.C. and N. Frenoy (19
86) J. Immunol. 137:839-845］。さらに、今ではＣＥ
Ａおよびその他の抗原に関して広く受け入れられている
ようなモノクローナル抗体に基づくイムノアッセイは、
開発することが非常に困難であろうと推測されていた
（Burtin, P. et al, 前出) 。
【０００９】
【課題を解決するための手段】乳ガン患者における血液
中ＮＣＡ−ＢＴレベルの変化が、その疾患の進行を監視
する手段となることが見いだされた。ある期間にわたっ
て一連の特異的イムノアッセイを実施することによって
測定した血液中ＮＣＡ−ＢＴレベルの増加は、有意の数
の患者において悪化状態を示し、一方、血液中ＮＣＡ−
ＢＴレベルの減少は、このような患者において改善状態
を示す。
中ＮＣＡ−ＢＴレベルの変化が、その疾患の進行を監視
する手段となることが見いだされた。ある期間にわたっ
て一連の特異的イムノアッセイを実施することによって
測定した血液中ＮＣＡ−ＢＴレベルの増加は、有意の数
の患者において悪化状態を示し、一方、血液中ＮＣＡ−
ＢＴレベルの減少は、このような患者において改善状態
を示す。
【００１０】血液（例えば、血清または血漿）中ＮＣＡ
−ＢＴレベルの測定において、本質的にいかなる方法を
用いても良い。典型的には、このような測定は、２つの
抗体試薬、即ち、そのうち１つはＮＣＡ−ＢＴに特異的
であり（その他のＣＥＡファミリーのメンバー抗原、特
にＣＥＡ、ＮＣＡ−ＣＭＬおよびＴＭ−ＣＥＡに対する
実質的な反応性を示さない）、もう一方はＮＣＡ−ＢＴ
と特異的または非特異的に結合し得るような２つの抗体
試薬を用いるサンドイッチイムノアッセイによって実施
されるであろう。
−ＢＴレベルの測定において、本質的にいかなる方法を
用いても良い。典型的には、このような測定は、２つの
抗体試薬、即ち、そのうち１つはＮＣＡ−ＢＴに特異的
であり（その他のＣＥＡファミリーのメンバー抗原、特
にＣＥＡ、ＮＣＡ−ＣＭＬおよびＴＭ−ＣＥＡに対する
実質的な反応性を示さない）、もう一方はＮＣＡ−ＢＴ
と特異的または非特異的に結合し得るような２つの抗体
試薬を用いるサンドイッチイムノアッセイによって実施
されるであろう。
【００１１】アッセイ形式および必要な抗体試薬の調製
のための方法は、この分野の技術者（当業者）によって
選択され得る。好適な抗体試薬は、酵素標識のように標
識され、あるいは、例えば、マイクロタイタープレート
へのコーティングまたはプラスチックもしくは磁気性の
ビーズもしくは粒子への結合のように固定化されること
ができ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのような免疫グロブリン
全体、またはＦａｂ、Ｆａｂ′およびＦ（ａｂ′）2 フ
ラグメントのようなフラグメント、あるいはそれらの集
塊を含むことができる。
のための方法は、この分野の技術者（当業者）によって
選択され得る。好適な抗体試薬は、酵素標識のように標
識され、あるいは、例えば、マイクロタイタープレート
へのコーティングまたはプラスチックもしくは磁気性の
ビーズもしくは粒子への結合のように固定化されること
ができ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのような免疫グロブリン
全体、またはＦａｂ、Ｆａｂ′およびＦ（ａｂ′）2 フ
ラグメントのようなフラグメント、あるいはそれらの集
塊を含むことができる。
【００１２】好ましくは、ＮＣＡ−ＢＴ特異的抗体試薬
は、例えば、脾臓または腫瘍細胞の精製抽出物；ＮＣＡ
−ＢＴ発現トランスフェクタント細胞株（ヨーロッパ特
許公報第３４６，７０２号参照）；従来の免疫原担体分
子に結合した合成ペプチドであって、ＮＣＡ−ＢＴのエ
ピトープを包含するアミノ酸配列を有するペプチドを含
む免疫原複合体（コンジュゲート）；および当業界で理
解されるであろう通りの同様のものである、ＮＣＡ−Ｂ
Ｔ含有免疫原混合物のような好適な免疫原で宿主動物を
免疫することによって調製する。
は、例えば、脾臓または腫瘍細胞の精製抽出物；ＮＣＡ
−ＢＴ発現トランスフェクタント細胞株（ヨーロッパ特
許公報第３４６，７０２号参照）；従来の免疫原担体分
子に結合した合成ペプチドであって、ＮＣＡ−ＢＴのエ
ピトープを包含するアミノ酸配列を有するペプチドを含
む免疫原複合体（コンジュゲート）；および当業界で理
解されるであろう通りの同様のものである、ＮＣＡ−Ｂ
Ｔ含有免疫原混合物のような好適な免疫原で宿主動物を
免疫することによって調製する。
【００１３】モノクローナル抗体を含む抗体試薬は、一
般に好ましい。特に好ましいＮＣＡ−ＢＴ特異的モノク
ローナル抗体は、本発明者によってthe American Type
Cultutre Collection (ATCC), Rockville, Maryland, U
SAに識別番号２２８．２（受託番号：ＨＢ１１２０４）
として寄託されているハイブリドーマによって産生され
るものと同一のエピトープに結合するようなものであ
る。
般に好ましい。特に好ましいＮＣＡ−ＢＴ特異的モノク
ローナル抗体は、本発明者によってthe American Type
Cultutre Collection (ATCC), Rockville, Maryland, U
SAに識別番号２２８．２（受託番号：ＨＢ１１２０４）
として寄託されているハイブリドーマによって産生され
るものと同一のエピトープに結合するようなものであ
る。
【００１４】他のタイプの受け入れられている疾患監視
法と同様に、本発明は乳ガンと診断されたすべての患者
に有用であるとは言えないことは、理解されるであろ
う。むしろ、医師は、各々の個々の患者のための処置お
よび治療法の方針を建てるために、その他の診断値およ
び臨床観察と組み合わせて血液中ＮＣＡ−ＢＴ値を用い
るであろう。血液中ＮＣＡ−ＢＴの測定は、乳ガンの発
病を検出する手段を提供し、それにより選択した患者集
団をその疾患に関してスクリーニングするための方法を
提供するであろうということも、企図される。
法と同様に、本発明は乳ガンと診断されたすべての患者
に有用であるとは言えないことは、理解されるであろ
う。むしろ、医師は、各々の個々の患者のための処置お
よび治療法の方針を建てるために、その他の診断値およ
び臨床観察と組み合わせて血液中ＮＣＡ−ＢＴ値を用い
るであろう。血液中ＮＣＡ−ＢＴの測定は、乳ガンの発
病を検出する手段を提供し、それにより選択した患者集
団をその疾患に関してスクリーニングするための方法を
提供するであろうということも、企図される。
【００１５】本発明を以下の実施例により説明するが、
本発明はそれによって制限されるものではない。
本発明はそれによって制限されるものではない。
【００１６】
【実施例】Ｍａｂ２２８．２（モノクローナル抗体２２８．２） ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、５０μg のヒト脾臓から精製し
たＮＣＡ（von Kleist, S. and P. Burtin (1969) Canc
er Res. 29:1961-1964) およびフロイント完全アジュバ
ントの乳化液で免疫した。高度免疫動物の脾臓を、安楽
死させた動物から取り出し、脾臓細胞をＡＧ８マウスミ
エローマ細胞（ATCC CRL 1580)と融合した。
たＮＣＡ（von Kleist, S. and P. Burtin (1969) Canc
er Res. 29:1961-1964) およびフロイント完全アジュバ
ントの乳化液で免疫した。高度免疫動物の脾臓を、安楽
死させた動物から取り出し、脾臓細胞をＡＧ８マウスミ
エローマ細胞（ATCC CRL 1580)と融合した。
【００１７】生じたハイブリドーマを、サンドイッチＥ
ＬＩＳＡによって抗ＮＣＡ抗体産生に関してスクリーニ
ングした。続いて、陽性のクローンを、サンドイッチＥ
ＬＩＳＡアッセイによって抗ＣＥＡおよび抗ＴＭ−ＣＥ
Ａ（ＢＧＰ）活性に関してスクリーニングした（Barnet
t, T. and W. Zimmerman 前出; およびBarnett, T.R.,
Kretschmer, A., Austen, D.A., Goebel, S.J., Hart,
J.T., Elting, J.J.and M.E. Kamarck (1989) J. Cell
Biol. 108:267-276 参照）。
ＬＩＳＡによって抗ＮＣＡ抗体産生に関してスクリーニ
ングした。続いて、陽性のクローンを、サンドイッチＥ
ＬＩＳＡアッセイによって抗ＣＥＡおよび抗ＴＭ−ＣＥ
Ａ（ＢＧＰ）活性に関してスクリーニングした（Barnet
t, T. and W. Zimmerman 前出; およびBarnett, T.R.,
Kretschmer, A., Austen, D.A., Goebel, S.J., Hart,
J.T., Elting, J.J.and M.E. Kamarck (1989) J. Cell
Biol. 108:267-276 参照）。
【００１８】これらのＮＣＡ−ＢＴに特異的なクローン
を、再クローニングし、ＣＥＡおよびＴＭ−ＣＥＡ（Ｂ
ＧＰ）との交差反応性に関して、ＥＬＩＳＡによって、
そしてさらに原形質膜上にＣＥＡ、ＮＣＡ−ＢＴまたは
ＴＭ−ＣＥＡを発現している組換えマウス細胞株を用い
て、再度ＦＡＣＳ分析によって再チェックした（ヨーロ
ッパ特許公報第３４６，７０２号参照）。このスクリー
ニング法の結果、ＮＣＡ−ＢＴに特異的であり、ＣＥ
Ａ、ＮＣＡ−ＣＭＬまたはＴＭ−ＣＥＡとＥＬＩＳＡで
検出可能な反応性を持たないＭａｂ２２８．２を同定し
た。
を、再クローニングし、ＣＥＡおよびＴＭ−ＣＥＡ（Ｂ
ＧＰ）との交差反応性に関して、ＥＬＩＳＡによって、
そしてさらに原形質膜上にＣＥＡ、ＮＣＡ−ＢＴまたは
ＴＭ−ＣＥＡを発現している組換えマウス細胞株を用い
て、再度ＦＡＣＳ分析によって再チェックした（ヨーロ
ッパ特許公報第３４６，７０２号参照）。このスクリー
ニング法の結果、ＮＣＡ−ＢＴに特異的であり、ＣＥ
Ａ、ＮＣＡ−ＣＭＬまたはＴＭ−ＣＥＡとＥＬＩＳＡで
検出可能な反応性を持たないＭａｂ２２８．２を同定し
た。
【００１９】Ｍａｂ１７６．７．５（モノクローナル抗
体１７６．７．５） ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１９９０年２月１５日に出願さ
れた米国特許出願第４８０，４２８号に記載されている
ようにＴＭ−ＣＥＡで免疫した。選択された抗体を産生
するハイブリドーマを、the American Type Culture Co
llection, Rockville, Maryland, USAに寄託し、ＡＴＣ
Ｃ ＨＢ−１０４１１と名付けられた。この抗体は、Ｎ
ＣＡおよびＴＭ−ＣＥＡの両方と反応するが、ＣＥＡと
は反応しない。この抗体を、ヘテロ２官能性架橋剤であ
るスルホ−ＳＭＰＢ（Pierce Chem. Co., Rockford, I
L, USA)を用いた２−イミノチオラン(2-iminothiolane)
による抗体のチオール化後、仔ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼ(Biozyme Corp., San Diego, CA, USA) に架橋
した。この複合体を、本明細書中、以下、１７６．７．
５−Ａ．Ｐ．と名付ける。
体１７６．７．５） ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１９９０年２月１５日に出願さ
れた米国特許出願第４８０，４２８号に記載されている
ようにＴＭ−ＣＥＡで免疫した。選択された抗体を産生
するハイブリドーマを、the American Type Culture Co
llection, Rockville, Maryland, USAに寄託し、ＡＴＣ
Ｃ ＨＢ−１０４１１と名付けられた。この抗体は、Ｎ
ＣＡおよびＴＭ−ＣＥＡの両方と反応するが、ＣＥＡと
は反応しない。この抗体を、ヘテロ２官能性架橋剤であ
るスルホ−ＳＭＰＢ（Pierce Chem. Co., Rockford, I
L, USA)を用いた２−イミノチオラン(2-iminothiolane)
による抗体のチオール化後、仔ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼ(Biozyme Corp., San Diego, CA, USA) に架橋
した。この複合体を、本明細書中、以下、１７６．７．
５−Ａ．Ｐ．と名付ける。
【００２０】ＮＣＡ標準液 ヒト脾臓から精製したＮＣＡ（von Kleist, S. et al,
前出）を、ＮＣＡ−ＢＴアッセイのための標準物として
用いた。抗原の量を、精製ＮＣＡの加水分解試料のアミ
ノ酸分析によって測定した。アッセイ標準液は、精製Ｎ
ＣＡをＰＢＳＴ−ＢＳＡ（以下を参照）中に希釈するこ
とによって調製した。
前出）を、ＮＣＡ−ＢＴアッセイのための標準物として
用いた。抗原の量を、精製ＮＣＡの加水分解試料のアミ
ノ酸分析によって測定した。アッセイ標準液は、精製Ｎ
ＣＡをＰＢＳＴ−ＢＳＡ（以下を参照）中に希釈するこ
とによって調製した。
【００２１】ＮＣＡ特異的イムノアッセイ ＮＣＡ特異的Ｍａｂ２２８．２を固相捕獲抗体とし、Ｍ
ａｂ１７６．７．５−Ａ．Ｐ．をレポーター抗体として
用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡを企画した。マイクロ
タイターＥＬＩＳＡプレート（製品番号２５８０１、Co
rning Glass Works, Corning, NY, USA)のウェルを、１
００μl の０．１M Ｎａ2 ＣＯ3 ／ＮａＨＣＯ3 、 p
H ９．０中のＭａｂ２２８．２で、３７℃で１時間コー
ティングした。このウェルを、３００μl の０．０５M
Ｎａホスフェート緩衝液、 pH ７．２、０．１M ＮａＣ
ｌおよび０．０１％チメロサール（ＰＢＳＴ）中、０．
１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウリエート）で、３７℃で１時間ブロッキングし
た。
ａｂ１７６．７．５−Ａ．Ｐ．をレポーター抗体として
用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡを企画した。マイクロ
タイターＥＬＩＳＡプレート（製品番号２５８０１、Co
rning Glass Works, Corning, NY, USA)のウェルを、１
００μl の０．１M Ｎａ2 ＣＯ3 ／ＮａＨＣＯ3 、 p
H ９．０中のＭａｂ２２８．２で、３７℃で１時間コー
ティングした。このウェルを、３００μl の０．０５M
Ｎａホスフェート緩衝液、 pH ７．２、０．１M ＮａＣ
ｌおよび０．０１％チメロサール（ＰＢＳＴ）中、０．
１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウリエート）で、３７℃で１時間ブロッキングし
た。
【００２２】プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、５
０μl の抗原溶液［５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢ
ＳＴ（ＰＢＳＴ−ＢＳＡ）中の標準液または未知血清］
を加え、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ
で５回洗浄した後、１００μl の１７６．７．５−Ａ．
Ｐ．（ＰＢＳＴ中、１５μg /ml ）を各ウェルに加え、
３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、２００μ
l のｐ−ニトロフェニルホスフェート（１．０M ジエチ
ルアミン緩衝液、 pH ９．８中）を各ウェルに加え、室
温で３０分間インキュベートした。次いで、４０５nmで
の吸光度を測定し、試験血清試料中の抗原量を検量用標
準曲線から測定した。
０μl の抗原溶液［５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢ
ＳＴ（ＰＢＳＴ−ＢＳＡ）中の標準液または未知血清］
を加え、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ
で５回洗浄した後、１００μl の１７６．７．５−Ａ．
Ｐ．（ＰＢＳＴ中、１５μg /ml ）を各ウェルに加え、
３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、２００μ
l のｐ−ニトロフェニルホスフェート（１．０M ジエチ
ルアミン緩衝液、 pH ９．８中）を各ウェルに加え、室
温で３０分間インキュベートした。次いで、４０５nmで
の吸光度を測定し、試験血清試料中の抗原量を検量用標
準曲線から測定した。
【００２３】患者血清試料 臨床的に確認された乳ガン患者の血清試料は、the Univ
ersity of Texas M.D.Anderson Cancer Center, Housto
n, TX, USA から入手した。臨床的に正常な個人の試料
は、M.D. Anderson および団体内の志願者から入手し
た。
ersity of Texas M.D.Anderson Cancer Center, Housto
n, TX, USA から入手した。臨床的に正常な個人の試料
は、M.D. Anderson および団体内の志願者から入手し
た。
【００２４】結果 ＮＣＡ−ＢＴに関するイムノアッセイの抗原特異性は、
図１および２に示すデータから確立される。図１は、Ｃ
ＥＡとの、およびＴＭ−ＣＥＡ（ＢＧＰ）との交差反応
性の欠如を示す。クローン化された遺伝子配列を含む組
換え発現ベクターから精製したＮＣＡ−ＢＴおよびＮＣ
Ａ−ＣＭＬを用いた試験（図２）は、アッセイがＮＣＡ
−ＢＴに特異的であることを示す（ＮＣＡ−脾臓は、前
出のvonKleist, S. et al. に記載されているようにヒ
ト脾臓から精製したＮＣＡである）。
図１および２に示すデータから確立される。図１は、Ｃ
ＥＡとの、およびＴＭ−ＣＥＡ（ＢＧＰ）との交差反応
性の欠如を示す。クローン化された遺伝子配列を含む組
換え発現ベクターから精製したＮＣＡ−ＢＴおよびＮＣ
Ａ−ＣＭＬを用いた試験（図２）は、アッセイがＮＣＡ
−ＢＴに特異的であることを示す（ＮＣＡ−脾臓は、前
出のvonKleist, S. et al. に記載されているようにヒ
ト脾臓から精製したＮＣＡである）。
【００２５】臨床的に正常な女性の血清中のＮＣＡ−Ｂ
Ｔレベルを測定し、カットオフ（９５百分位数信頼性レ
ベル）が１４３ng/ml であることがわかった（表１）。
臨床的に診断された２０２人の乳ガン患者の平均血清中
濃度は、３５８ng/ml であった。
Ｔレベルを測定し、カットオフ（９５百分位数信頼性レ
ベル）が１４３ng/ml であることがわかった（表１）。
臨床的に診断された２０２人の乳ガン患者の平均血清中
濃度は、３５８ng/ml であった。
【００２６】 表１ 正常人 平均 ９５百分位数 女性非喫煙者 ６４．９ng/ml １３５ng/ml （ｎ＝５０） 女性喫煙者 ８２．３ng/ml １６１ng/ml （ｎ＝２５） 女性合計 ７０．１ng/ml １４３ng/ml （ｎ＝７５）ガン患者 上昇したＮＣＡ− ３５８．１ng/ml １７５６ng/ml ＢＴレベルを示し （ｐ＜０．０００１） ている患者の％ ＝６６％
【００２７】乳ガンと診断され、治療中の有意数の患者
において、血清中のＮＣＡ−ＢＴレベルの変化がこの疾
患の期と相関することが見いだされた。連続的な血清試
料を臨床的に確認された乳ガン患者から入手した。これ
らの連続試料は、２０９ng/ml の平均ＮＣＡ−ＢＴ値を
有した。図３〜８に、これらの患者の血清中ＣＥＡおよ
びＮＣＡ−ＢＴレベルと臨床的状態の相関の６例を示
す。各々のグラフには、 （ａ）上記のサンドイッチイムノアッセイ法によって測
定したＮＣＡ−ＢＴレベル （ｂ）臨床実験室で測定され、患者のチャートに示され
ていた血清中ＣＥＡレベル （ｃ）正常ＮＣＡ−ＢＴの９５百分位数のカットオフ値
（例えば１４３ng/ml ）、および （ｄ）グラフの頂上を横切って、疾患の進行の概要（略
号については符号の説明参照）が示されている。
において、血清中のＮＣＡ−ＢＴレベルの変化がこの疾
患の期と相関することが見いだされた。連続的な血清試
料を臨床的に確認された乳ガン患者から入手した。これ
らの連続試料は、２０９ng/ml の平均ＮＣＡ−ＢＴ値を
有した。図３〜８に、これらの患者の血清中ＣＥＡおよ
びＮＣＡ−ＢＴレベルと臨床的状態の相関の６例を示
す。各々のグラフには、 （ａ）上記のサンドイッチイムノアッセイ法によって測
定したＮＣＡ−ＢＴレベル （ｂ）臨床実験室で測定され、患者のチャートに示され
ていた血清中ＣＥＡレベル （ｃ）正常ＮＣＡ−ＢＴの９５百分位数のカットオフ値
（例えば１４３ng/ml ）、および （ｄ）グラフの頂上を横切って、疾患の進行の概要（略
号については符号の説明参照）が示されている。
【００２８】これらの例において、血清中ＮＣＡ−ＢＴ
がこの疾患の臨床的後退、安定性および進行との相関を
示すだけでなく、このような相関が血清中ＣＥＡレベル
（一般に用いられる乳ガン監視のための血清マーカー）
との相関よりも有意であることをも示す。
がこの疾患の臨床的後退、安定性および進行との相関を
示すだけでなく、このような相関が血清中ＣＥＡレベル
（一般に用いられる乳ガン監視のための血清マーカー）
との相関よりも有意であることをも示す。
【００２９】乳ガン血清における上昇したＮＣＡ−ＢＴ
レベルの高い出現率、およびＮＣＡ−ＢＴレベルの変化
と臨床的状態との有意の相関は、患者における乳ガンの
監視の手段として本方法が有用であることを示す。
レベルの高い出現率、およびＮＣＡ−ＢＴレベルの変化
と臨床的状態との有意の相関は、患者における乳ガンの
監視の手段として本方法が有用であることを示す。
【００３０】本発明を、上記に詳細に記載し、例示し
た。明らかに、本発明の精神および範囲を逸脱すること
なく、本発明の多くのその他の変形および修正が可能で
ある。
た。明らかに、本発明の精神および範囲を逸脱すること
なく、本発明の多くのその他の変形および修正が可能で
ある。
【図１】実施例に記載された特定のイムノアッセイの、
ＣＥＡおよびＴＭ−ＣＥＡと比較したＮＣＡ−ＢＴに対
する特異性を示すグラフである。
ＣＥＡおよびＴＭ−ＣＥＡと比較したＮＣＡ−ＢＴに対
する特異性を示すグラフである。
【図２】実施例に記載された特定のイムノアッセイの、
脾臓から得られたＮＣＡおよびＮＣＡ−ＣＭＬと比較し
たＮＣＡ−ＢＴに対する特異性を示すグラフである。
脾臓から得られたＮＣＡおよびＮＣＡ−ＣＭＬと比較し
たＮＣＡ−ＢＴに対する特異性を示すグラフである。
【図３】ＮＣＡ−ＢＴおよびＣＥＡの血液レベルと治療
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
【図４】ＮＣＡ−ＢＴおよびＣＥＡの血液レベルと治療
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
【図５】ＮＣＡ−ＢＴおよびＣＥＡの血液レベルと治療
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
【図６】ＮＣＡ−ＢＴおよびＣＥＡの血液レベルと治療
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
【図７】ＮＣＡ−ＢＴおよびＣＥＡの血液レベルと治療
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
【図８】ＮＣＡ−ＢＴおよびＣＥＡの血液レベルと治療
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
中の患者における乳ガンの段階との相関の比較を示すグ
ラフである。
Ｄｘ 臨床的診断 Ｓｕｒｇ ガンを除去する外科的手順 Ｃｈｅｍｏ 化学療法が施された期間 Ｓｔａｂｌｅ 担当医師による、患者の乳ガンが安定化
したという評価 Ｍｅｔ↑ 担当医師による、転移が起きていたかまたは
乳ガンがその他の方法で進行しているという評価 Ｐｒｏｇ 担当医師による、乳ガンが進行しているとい
う評価 ＋ 患者の死亡 Ｍｅｔ↓ 担当医師による、転移が停止していたという
評価 ＮＥＤ 担当医師による、もはや疾患の証拠がないとい
う評価
したという評価 Ｍｅｔ↑ 担当医師による、転移が起きていたかまたは
乳ガンがその他の方法で進行しているという評価 Ｐｒｏｇ 担当医師による、乳ガンが進行しているとい
う評価 ＋ 患者の死亡 Ｍｅｔ↓ 担当医師による、転移が停止していたという
評価 ＮＥＤ 担当医師による、もはや疾患の証拠がないとい
う評価
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (56)参考文献 特開 昭64−29400（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−120289（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/577 C12N 15/02 G01N 33/53 G01N 33/535 G01N 33/574 C12P 21/08 C12R 1:91
Claims (11)
- 【請求項１】 患者における乳ガンの進行の監視方法で
あって、ある期間にわたって一連の特異的イムノアッセ
イを実施して患者から得た血液試料のＮＣＡ−ＢＴレベ
ルの変化を測定し、それにより血液中ＮＣＡ−ＢＴレベ
ルの増加が悪化状態を示し、一方、血液中ＮＣＡ−ＢＴ
レベルの減少が改善状態を示すことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 実施されるイムノアッセイがサンドイッ
チイムノアッセイであって、その少なくともひとつの抗
体試薬がＮＣＡ−ＢＴに特異的であり、ＣＥＡ、ＮＣＡ
−ＣＭＬまたはＴＭ−ＣＥＡに対して実質的に反応性を
持たない、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該ＮＣＡ−ＢＴ特異的抗体試薬が、モノ
クローナル抗体である、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 該ＮＣＡ−ＢＴ特異的抗体試薬が、本発
明者らによってtheAmerican Type Culture Collection
(ATCC), Rockville, Maryland, USA に識別番号２２
８．２（受託番号：ＨＢ１１２０４）として寄託されて
いるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル
抗体と同一のエピトープに結合する、請求項２記載の方
法。 - 【請求項５】 該血液試料が血清試料である、請求項１
記載の方法。 - 【請求項６】 本発明者らによってthe American Type
Culture Collection(ATCC), Rockville, Maryland, USA
に識別番号２２８．２（受託番号：ＨＢ１１２０４）
として寄託されているハイブリドーマによって産生され
るモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合するこ
とを特徴とする、ＮＣＡ−ＢＴ特異的抗体試薬。 - 【請求項７】 モノクローナルである、請求項６記載の
抗体試薬。 - 【請求項８】 第一抗体試薬として請求項６記載の抗体
試薬、およびＮＣＡ−ＢＴに特異的または非特異的に結
合することができる第二の抗体試薬を含む、血液試料中
のＮＣＡ−ＢＴの測定用サンドイッチイムノアッセイ試
験キット。 - 【請求項９】 該第一抗体試薬がモノクローナルであ
る、請求項８記載の試験キット。 - 【請求項１０】 該第二抗体試薬もモノクローナルであ
る、請求項９記載の試験キット。 - 【請求項１１】 該抗体試薬のひとつが酵素で標識され
ている、請求項８記載の試験キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81593491A | 1991-12-30 | 1991-12-30 | |
| US815934 | 1991-12-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06102274A JPH06102274A (ja) | 1994-04-15 |
| JP3258407B2 true JP3258407B2 (ja) | 2002-02-18 |
Family
ID=25219225
Family Applications (1)
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