JP3291525B2 - ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定方法 - Google Patents
ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定方法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体（Plasmin−α２−Plasmin inhibitor Com
plex:以下PICの略称を用いることがある）に対して反応
性を有する各種のモノクローナル抗体群を用いたヒトプ
ラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の免疫
学的定量方法に関する。
ビター複合体（Plasmin−α２−Plasmin inhibitor Com
plex:以下PICの略称を用いることがある）に対して反応
性を有する各種のモノクローナル抗体群を用いたヒトプ
ラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の免疫
学的定量方法に関する。
背景技術 汎発性血管内凝固症候群（DIC:Disseminated intrava
scular coagulation）患者の血漿中や、ウロキナーゼ又
はティシュープラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−PA）
を用いた血栓溶解療法実施中の患者血漿中では、プラス
ミノーゲンが活性化されてプラスミンが生成される。生
成されたプラスミンは、流血中では瞬時にα２プラスミ
ンインヒビター（α2PI:青木ら、J.Biol.Chem.,251,595
6−5965,1976）と1:1の複合体、即ち前記のPICを形成す
る。従って、PICを測定することにより、プラスミンの
生成、即ち、線溶系活性化の事象を把握することができ
る。最近、血漿中のPICはDICの診断及び血栓溶解療法の
モニター等の分子マーカーとして重要視されている。そ
のため、血液あるいは血漿中のPICの量を正確かつ簡単
に測定する必要がある。
scular coagulation）患者の血漿中や、ウロキナーゼ又
はティシュープラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−PA）
を用いた血栓溶解療法実施中の患者血漿中では、プラス
ミノーゲンが活性化されてプラスミンが生成される。生
成されたプラスミンは、流血中では瞬時にα２プラスミ
ンインヒビター（α2PI:青木ら、J.Biol.Chem.,251,595
6−5965,1976）と1:1の複合体、即ち前記のPICを形成す
る。従って、PICを測定することにより、プラスミンの
生成、即ち、線溶系活性化の事象を把握することができ
る。最近、血漿中のPICはDICの診断及び血栓溶解療法の
モニター等の分子マーカーとして重要視されている。そ
のため、血液あるいは血漿中のPICの量を正確かつ簡単
に測定する必要がある。
従来から知られているPICの測定法としては、以下の
５つの方法を挙げることができる。第１の方法は、二次
元交叉免疫電気泳動法を用いる方法である。第２の方法
は、PICのネオアンチゲンを認識するポリクローナル抗
体を用いたラテックス凝集法である。第３の方法は、プ
ラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体とα２−プ
ラスミンインヒビターに対するポリクローナル抗体の両
者を用い、その一方を固定化抗体とし、他方を酵素標識
抗体とした。酵素免疫測定法である。第４の方法は、α
２−プラスミンインヒビターに存在するプラスミンの繊
維素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識するモノク
ローナル抗体とプラスミンポリクローナル抗体の両者を
用い、その一方を固定化抗体とし、他方を酵素標識抗体
とし、血漿検体を1200倍に希釈して測定して測定する酵
素免疫測定法である。第５の方法は、PICのネオアンチ
ゲンを認識するモノクローナル抗体２種又は３種を用い
るラテックス凝集法である。
５つの方法を挙げることができる。第１の方法は、二次
元交叉免疫電気泳動法を用いる方法である。第２の方法
は、PICのネオアンチゲンを認識するポリクローナル抗
体を用いたラテックス凝集法である。第３の方法は、プ
ラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体とα２−プ
ラスミンインヒビターに対するポリクローナル抗体の両
者を用い、その一方を固定化抗体とし、他方を酵素標識
抗体とした。酵素免疫測定法である。第４の方法は、α
２−プラスミンインヒビターに存在するプラスミンの繊
維素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識するモノク
ローナル抗体とプラスミンポリクローナル抗体の両者を
用い、その一方を固定化抗体とし、他方を酵素標識抗体
とし、血漿検体を1200倍に希釈して測定して測定する酵
素免疫測定法である。第５の方法は、PICのネオアンチ
ゲンを認識するモノクローナル抗体２種又は３種を用い
るラテックス凝集法である。
しかしながら、第１の方法には、感度が低く定量性に
欠けるという欠点があった。第２の方法には、PICを特
異的に測定できないという欠点があった。第３の方法
は、感度は良好であるが、抗血清の安定な確保が困難で
あり、免疫反応が２工程であるので操作が煩雑で、測定
に長時間を要するという欠点があった。第４の方法は、
α２−プラスミンインヒビターに対するモノクローナル
抗体を使用する点及び免疫反応を１工程で操作する点で
前記の第３の方法が改良されているが、酵素免疫反応が
有する欠点、即ち、操作が煩雑で測定に長時間を要する
という問題点を解消するものではなかった。更に、第４
の方法には、１工程の免疫反応を導入するために、検体
を1200倍に希釈する工程が必要になるという欠点もあっ
た。第５の方法は、ポリクローナル抗体を用いた第２の
方法と比較して、特異性や測定感度において差異はな
く、PICを特異的に測定できないという問題点を解決す
るものではなかった。
欠けるという欠点があった。第２の方法には、PICを特
異的に測定できないという欠点があった。第３の方法
は、感度は良好であるが、抗血清の安定な確保が困難で
あり、免疫反応が２工程であるので操作が煩雑で、測定
に長時間を要するという欠点があった。第４の方法は、
α２−プラスミンインヒビターに対するモノクローナル
抗体を使用する点及び免疫反応を１工程で操作する点で
前記の第３の方法が改良されているが、酵素免疫反応が
有する欠点、即ち、操作が煩雑で測定に長時間を要する
という問題点を解消するものではなかった。更に、第４
の方法には、１工程の免疫反応を導入するために、検体
を1200倍に希釈する工程が必要になるという欠点もあっ
た。第５の方法は、ポリクローナル抗体を用いた第２の
方法と比較して、特異性や測定感度において差異はな
く、PICを特異的に測定できないという問題点を解決す
るものではなかった。
本発明者は、PICを簡便に、正確にそして再現性よく
測定する方法を開発するべく鋭意研究をした結果、PIC
及びプラスミノーゲンの両者に反応性を示す第１のモノ
クローナル抗体（PIC−１）、PIC及びα２−プラスミン
インヒビターの両者に反応性を示す第２のモノクローナ
ル抗体（PIC−２）、そしてPICに特異的反応性を示す
が、PICの構成タンパク質であるプラスミノーゲン及び
α２−プラスミンインヒビターには反応性を示さない第
３のモノクローナル抗体（PIC−３）の、３種のモノク
ローナル抗体を見出し、これらのモノクローナル抗体の
２種以上の組み合わせを用いると、血漿中のPICを、血
漿検体の希釈工程を必要とせず、迅速かつ正確に、しか
も検体中に遊離の状態で存在するプラスミノーゲン及び
α２−プラスミンインヒビターの妨害を受けずに、特異
的に測定することができることを見出した。従って、本
発明の目的は、前記の各モノクローナル抗体を用いる新
規の免疫学的定量方法を提供することにある。
測定する方法を開発するべく鋭意研究をした結果、PIC
及びプラスミノーゲンの両者に反応性を示す第１のモノ
クローナル抗体（PIC−１）、PIC及びα２−プラスミン
インヒビターの両者に反応性を示す第２のモノクローナ
ル抗体（PIC−２）、そしてPICに特異的反応性を示す
が、PICの構成タンパク質であるプラスミノーゲン及び
α２−プラスミンインヒビターには反応性を示さない第
３のモノクローナル抗体（PIC−３）の、３種のモノク
ローナル抗体を見出し、これらのモノクローナル抗体の
２種以上の組み合わせを用いると、血漿中のPICを、血
漿検体の希釈工程を必要とせず、迅速かつ正確に、しか
も検体中に遊離の状態で存在するプラスミノーゲン及び
α２−プラスミンインヒビターの妨害を受けずに、特異
的に測定することができることを見出した。従って、本
発明の目的は、前記の各モノクローナル抗体を用いる新
規の免疫学的定量方法を提供することにある。
発明の開示 従って、本発明は、不溶性担体に固定化された、
（１）ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター
複合体及びヒトプラスミノーゲンと特異的に反応し、ヒ
トα２−プラスミンインヒビターとは反応しないモノク
ローナル抗体、（２）ヒトプラスミン−α２−プラスミ
ンインヒビター複合体及びヒトα２−プラスミンインヒ
ビターと特異的に反応するモノクローナル抗体、及び
（３）ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター
複合体と特異的に反応し、ヒトプラスミノーゲン及びヒ
トα２−プラスミンインヒビターとは反応しないモノク
ローナル抗体少なくとも２種と、被検試料とを接触さ
せ、被検試料における凝集反応を観察することを特徴と
する、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター
複合体の測定方法に関する。
（１）ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター
複合体及びヒトプラスミノーゲンと特異的に反応し、ヒ
トα２−プラスミンインヒビターとは反応しないモノク
ローナル抗体、（２）ヒトプラスミン−α２−プラスミ
ンインヒビター複合体及びヒトα２−プラスミンインヒ
ビターと特異的に反応するモノクローナル抗体、及び
（３）ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター
複合体と特異的に反応し、ヒトプラスミノーゲン及びヒ
トα２−プラスミンインヒビターとは反応しないモノク
ローナル抗体少なくとも２種と、被検試料とを接触さ
せ、被検試料における凝集反応を観察することを特徴と
する、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター
複合体の測定方法に関する。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明のモノクローナル抗体ラテックス複
合体を用いて、健常人血漿（12検体）及びDIC患者血漿
（15検体）中のPIC量を測定した結果を示す説明図であ
る。
合体を用いて、健常人血漿（12検体）及びDIC患者血漿
（15検体）中のPIC量を測定した結果を示す説明図であ
る。
発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を、モノクローナル抗体、ハイブリドー
マ及び免疫学的測定方法の順に説明する。
マ及び免疫学的測定方法の順に説明する。
免疫原として用いるヒトPICは、例えば、Plowらの方
法（J.Lab.Clin.Med.93,199−209,1979）に従って調製
することができる。即ち、ヒト（健常人）の血漿からプ
ラスミノーゲンを除去し、プラスミノーゲン不含のこの
血漿に、プラスミンを徐々に加えることによりPICを生
成させ、生成したPICを適当な親和性ゲルに吸着させ
る。この吸着PICを適当な緩衝液で溶出させ、更に、イ
オン交換クロマトグラフィーや分子ふるいクロマトグラ
フィー等による精製操作で処理し、純化ヒトPICを得
る。こうして得られたヒトPICは、SDS−PAGE（SDS−Pol
yacrylamidegel elctrophoresis）で単一のバンドを示
す。
法（J.Lab.Clin.Med.93,199−209,1979）に従って調製
することができる。即ち、ヒト（健常人）の血漿からプ
ラスミノーゲンを除去し、プラスミノーゲン不含のこの
血漿に、プラスミンを徐々に加えることによりPICを生
成させ、生成したPICを適当な親和性ゲルに吸着させ
る。この吸着PICを適当な緩衝液で溶出させ、更に、イ
オン交換クロマトグラフィーや分子ふるいクロマトグラ
フィー等による精製操作で処理し、純化ヒトPICを得
る。こうして得られたヒトPICは、SDS−PAGE（SDS−Pol
yacrylamidegel elctrophoresis）で単一のバンドを示
す。
次に、精製したPIC免疫原溶液を用いて哺乳動物（例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマ）をイン
・ビボ免疫法により免疫する。
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマ）をイン
・ビボ免疫法により免疫する。
具体的には、例えば、精製したヒトPIC免疫原溶液を
等量のフロインド氏完全アジュバント又は不完全アジュ
バントと乳化するまで混合する。この混合液を、例えば
マウスの皮下に投与する（第１回免疫）。以後、２〜４
週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免
疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ステンレスメ
ッシュなどで押しつぶして脾臓細胞を調製し、細胞融合
工程に用いる。
等量のフロインド氏完全アジュバント又は不完全アジュ
バントと乳化するまで混合する。この混合液を、例えば
マウスの皮下に投与する（第１回免疫）。以後、２〜４
週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免
疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ステンレスメ
ッシュなどで押しつぶして脾臓細胞を調製し、細胞融合
工程に用いる。
細胞融合に用いるもう一方の親細胞であるミエローマ
細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞株、例
えば、p3（p3/×63−Ag8）〔Nature,256,495−497（197
5）〕、p3−U1〔CurrentTopics in Microbiology and I
mmunology,81;1−７（1978）〕、NS−１〔Eur.J.Immuno
l.,6;511−519（1976）〕、MPC−11〔Cell,8;405−415
（1976）〕、SP2/0〔Nature,276;269−270（1978）〕、
FO〔J.Immunol.Meth.,35;1−21（1980）〕、×63.6.55.
3〔J.Immunol.,123;1548−1550（1979）〕、S194〔J.Ex
p.Med,148;313−323（1978）〕、又はラットにおけるR2
10〔Nature,277;131−133（1979）〕などを使用するこ
とができる。
細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞株、例
えば、p3（p3/×63−Ag8）〔Nature,256,495−497（197
5）〕、p3−U1〔CurrentTopics in Microbiology and I
mmunology,81;1−７（1978）〕、NS−１〔Eur.J.Immuno
l.,6;511−519（1976）〕、MPC−11〔Cell,8;405−415
（1976）〕、SP2/0〔Nature,276;269−270（1978）〕、
FO〔J.Immunol.Meth.,35;1−21（1980）〕、×63.6.55.
3〔J.Immunol.,123;1548−1550（1979）〕、S194〔J.Ex
p.Med,148;313−323（1978）〕、又はラットにおけるR2
10〔Nature,277;131−133（1979）〕などを使用するこ
とができる。
免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合は通常の
方法で行うことができ、例えば、公知の融合促進剤（ポ
リエチレングリコール又はセンダイウイルスなど）を用
い、場合により補助剤（ジメチルスルホキシドなど）を
用いることもできる。免疫脾臓細胞とミエローマ細胞と
の使用比率も常法と同様でよく、例えば、エミローマ細
胞に対して脾臓細胞を約１〜10倍程度の量で用いる。融
合用培地としては、例えば、40％（w/v）ポリエチレン
グリコールを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）
を用いることができる。融合は、前記の培地内で免疫脾
臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって
行う。続いて、選別用培地（例えば、HAT培地）を用い
てハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイブリドーマ
培養上清の抗体産生の有無を、例えばELISA法によって
測定し、目的とするハイブリドーマを分離する。
方法で行うことができ、例えば、公知の融合促進剤（ポ
リエチレングリコール又はセンダイウイルスなど）を用
い、場合により補助剤（ジメチルスルホキシドなど）を
用いることもできる。免疫脾臓細胞とミエローマ細胞と
の使用比率も常法と同様でよく、例えば、エミローマ細
胞に対して脾臓細胞を約１〜10倍程度の量で用いる。融
合用培地としては、例えば、40％（w/v）ポリエチレン
グリコールを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）
を用いることができる。融合は、前記の培地内で免疫脾
臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって
行う。続いて、選別用培地（例えば、HAT培地）を用い
てハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイブリドーマ
培養上清の抗体産生の有無を、例えばELISA法によって
測定し、目的とするハイブリドーマを分離する。
こうして得られた、モノクローナル抗体PIC−１、PIC
−２又はPIC−３を分泌するハイブリドーマPIC−１、PI
C−２又はPIC−３は、通常の培地で継代培養することが
でき、また液体窒素等の中で容易に長期間保存すること
ができる。
−２又はPIC−３を分泌するハイブリドーマPIC−１、PI
C−２又はPIC−３は、通常の培地で継代培養することが
でき、また液体窒素等の中で容易に長期間保存すること
ができる。
また、前記のハイブリドーマを培養する培地として
は、ハイブリドーマの培養に適した任意の培地を用いる
ことができ、好適にはDMEMにウシ胎児血清、Ｌ−グルタ
ミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとス
トレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
は、ハイブリドーマの培養に適した任意の培地を用いる
ことができ、好適にはDMEMにウシ胎児血清、Ｌ−グルタ
ミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとス
トレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
前記のハイブリドーマの培養は、イン・ビトロの場合
には例えば培地中で５％CO2濃度及び37℃で約３日間、
またイン・ビボ例えばマウスの腹腔中で培養する場合に
は約14日間実施するのが好ましい。
には例えば培地中で５％CO2濃度及び37℃で約３日間、
またイン・ビボ例えばマウスの腹腔中で培養する場合に
は約14日間実施するのが好ましい。
前記のハイブリドーマPIC−１、PIC−２又はPIC−３
を常法によって培養した培養液から、あるいは前記３種
のいずれかのハイブリドーマを投与した適当な哺乳動物
（例えばマウス又はラット）の腹水から、目的とするモ
ノクローナルを分離し、精製することが可能である。
を常法によって培養した培養液から、あるいは前記３種
のいずれかのハイブリドーマを投与した適当な哺乳動物
（例えばマウス又はラット）の腹水から、目的とするモ
ノクローナルを分離し、精製することが可能である。
このようにして製造された培養液又はマウスの腹水か
らモノクローナル抗体を分離、精製する場合にはタンパ
ク質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いるこ
とが可能である。そのような方法としては硫安塩析、イ
オン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子
篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類
を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結
乾燥の方法等がある。
らモノクローナル抗体を分離、精製する場合にはタンパ
ク質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いるこ
とが可能である。そのような方法としては硫安塩析、イ
オン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子
篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類
を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結
乾燥の方法等がある。
こうして得られた抗PICモノクローナル抗体は、その
反応性によって以下の３種に分類することができる。
反応性によって以下の３種に分類することができる。
（１）PIC及びプラスミノーゲンとは反応するが、α２
−プラスミンインヒビターとは反応しない第１のモノク
ローナル抗体（PIC−１）。
−プラスミンインヒビターとは反応しない第１のモノク
ローナル抗体（PIC−１）。
（２）PIC及びα２−プラスミンインヒビターとは反応
するが、プラスミノーゲンとは反応しない第２のモノク
ローナル抗体（PIC−２）。
するが、プラスミノーゲンとは反応しない第２のモノク
ローナル抗体（PIC−２）。
（３）PICとは反応するが、プラスミノーゲン及びα２
−プラスミンインヒビターとは反応しない第３のモノク
ローナル抗体（PIC−３）。
−プラスミンインヒビターとは反応しない第３のモノク
ローナル抗体（PIC−３）。
前記の第１のモノクローナル抗体（PIC−１）は、好
ましくはヒトプラスミノーゲンのクリングル２及びクリ
ングル３を含む領域を認識する。
ましくはヒトプラスミノーゲンのクリングル２及びクリ
ングル３を含む領域を認識する。
前記の第１〜第３の抗PICモノクローナル抗体を不溶
性担体に固定化させ、それらの少なくとも２種を被検試
料と接触させると、被検試料中の遊離のプラスミノーゲ
ン及びα２−プラスミンインヒビターとは凝集反応を起
こさず、PICとの間でのみ凝集反応を起こさせることが
できるので、PICの免疫学的定量方法に用いることがで
き、そして免疫学的定量用試薬としても有用である。
性担体に固定化させ、それらの少なくとも２種を被検試
料と接触させると、被検試料中の遊離のプラスミノーゲ
ン及びα２−プラスミンインヒビターとは凝集反応を起
こさず、PICとの間でのみ凝集反応を起こさせることが
できるので、PICの免疫学的定量方法に用いることがで
き、そして免疫学的定量用試薬としても有用である。
本発明の免疫学的定量方法に用いる被検試料は、PIC
を含有する可能性のある試料であれば特に制限されるも
のではないが、例えば、生体試料、特には血液、血清、
血漿又は尿、好ましくは血漿である。本発明の免疫学的
定量方法においては、被検試料を希釈せずに、そのまま
使用しても、被検試料中に遊離の状態で存在するプラス
ミノーゲン及びα２−プラスミンインヒビターの妨害を
避けることができる。即ち、本発明方法によれば、被検
試料中に存在するプラスミノーゲン及びα２−プラスミ
ンインヒビターの干渉を受けずに、ヒトプラスミン−α
２−プラスミンインヒビター複合体の測定を行うことが
できる。
を含有する可能性のある試料であれば特に制限されるも
のではないが、例えば、生体試料、特には血液、血清、
血漿又は尿、好ましくは血漿である。本発明の免疫学的
定量方法においては、被検試料を希釈せずに、そのまま
使用しても、被検試料中に遊離の状態で存在するプラス
ミノーゲン及びα２−プラスミンインヒビターの妨害を
避けることができる。即ち、本発明方法によれば、被検
試料中に存在するプラスミノーゲン及びα２−プラスミ
ンインヒビターの干渉を受けずに、ヒトプラスミン−α
２−プラスミンインヒビター複合体の測定を行うことが
できる。
不溶性担体としては、高原抗体の凝集反応を利用する
免疫学的測定方法において一般的に用いられる任意の不
溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子
（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げること
ができる。
免疫学的測定方法において一般的に用いられる任意の不
溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子
（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げること
ができる。
モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるに
は、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカ
ルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物
理吸着法を用いることができる。こうして、モノクロー
ナル抗体と不溶性担体との複合体を形成し、これを本発
明の免疫学的定量方法に用いることができる。
は、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカ
ルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物
理吸着法を用いることができる。こうして、モノクロー
ナル抗体と不溶性担体との複合体を形成し、これを本発
明の免疫学的定量方法に用いることができる。
本発明の免疫学的定量方法においては、前記の不溶性
担体に固定化した少なくとも２種のモノクローナル抗体
を使用するが、或る１種のモノクローナル抗体を不溶性
担体に固定化して調製した複合体を２種又は３種用いる
か、あるいは、２種又は３種のモノクローナル抗体を或
る１種の不溶性担体に固定化して調製した複合体を用い
ることができる。更に、或る１種のモノクローナル抗体
を不溶性担体に固定化して調製した複合体１種と、２種
のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性担体に固定化
して調製した複合体１種との組み合わせを用いることも
できる。
担体に固定化した少なくとも２種のモノクローナル抗体
を使用するが、或る１種のモノクローナル抗体を不溶性
担体に固定化して調製した複合体を２種又は３種用いる
か、あるいは、２種又は３種のモノクローナル抗体を或
る１種の不溶性担体に固定化して調製した複合体を用い
ることができる。更に、或る１種のモノクローナル抗体
を不溶性担体に固定化して調製した複合体１種と、２種
のモノクローナル抗体を或る１種の不溶性担体に固定化
して調製した複合体１種との組み合わせを用いることも
できる。
モノクローナル抗体２種の組み合わせは任意でよい
が、前記の第１のモノクローナル抗体（PIC−１）と第
２のモノクローナル抗体（PIC−２）との組み合わせを
用いるのが好ましい。
が、前記の第１のモノクローナル抗体（PIC−１）と第
２のモノクローナル抗体（PIC−２）との組み合わせを
用いるのが好ましい。
本発明の測定方法においては、前記のモノクローナル
抗体固定化不溶性担体複合体の既知一定量と未知量のPI
Cを含有する水性被検試料の一定量とを適当な反応容器
（例えば、スライド板上あるいは反応セル）中で接触さ
せる。例えば血漿試料の場合には、血漿試料（非希釈
液）１容量部に対して前記の複合体懸濁水（１％以上の
濃度）を１容量部又は１容量部以上加えて接触させる。
また、凝集像をより鮮明にするために、試料と複合体懸
濁水に更に緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）を加え
て接触させてもよい。こうして形成される凝集の程度か
らPIC濃度の定量を行うことができる。この凝集反応
は、血漿試料中に存在する遊離のプラスミノーゲン及び
α２−プラスミンインヒビターの妨害を受けない。例え
ば、スライド板の場合には目視的に、反応セルの場合は
特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、非検
試料中のPIC濃度を定量することができる。
抗体固定化不溶性担体複合体の既知一定量と未知量のPI
Cを含有する水性被検試料の一定量とを適当な反応容器
（例えば、スライド板上あるいは反応セル）中で接触さ
せる。例えば血漿試料の場合には、血漿試料（非希釈
液）１容量部に対して前記の複合体懸濁水（１％以上の
濃度）を１容量部又は１容量部以上加えて接触させる。
また、凝集像をより鮮明にするために、試料と複合体懸
濁水に更に緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）を加え
て接触させてもよい。こうして形成される凝集の程度か
らPIC濃度の定量を行うことができる。この凝集反応
は、血漿試料中に存在する遊離のプラスミノーゲン及び
α２−プラスミンインヒビターの妨害を受けない。例え
ば、スライド板の場合には目視的に、反応セルの場合は
特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、非検
試料中のPIC濃度を定量することができる。
実施例 次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、
本発明は以下の実施例によって限定されるものではな
い。
本発明は以下の実施例によって限定されるものではな
い。
実施例1:PICの精製 （ａ）ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター
複合体（PIC）の精製はPlowらの方法（J.Lab.Clin.Med.
93,199−209,1979）に従って行った。簡単に説明する
と、ヒト（健常人）血漿100mlをリジン−セファロース
カラム（ベッド容量、100ml）に通過させ、プラスミノ
ーゲンを除去た。プラスミノーゲン不含のこの血漿に、
プラスミン水溶液（60μg/ml）100mlを徐々に加えた
後、37℃で10分間保温した。反応後の水溶液をリジン−
セファロースカラム（ベッド容量、200ml）に通し、PIC
を吸着させた。PIC吸着カラムを0.1Mリン酸緩衝生理食
塩水（PBS）洗浄した後、50mMε−アミノカプロン酸を
含むPBSでPICを溶出させた。
複合体（PIC）の精製はPlowらの方法（J.Lab.Clin.Med.
93,199−209,1979）に従って行った。簡単に説明する
と、ヒト（健常人）血漿100mlをリジン−セファロース
カラム（ベッド容量、100ml）に通過させ、プラスミノ
ーゲンを除去た。プラスミノーゲン不含のこの血漿に、
プラスミン水溶液（60μg/ml）100mlを徐々に加えた
後、37℃で10分間保温した。反応後の水溶液をリジン−
セファロースカラム（ベッド容量、200ml）に通し、PIC
を吸着させた。PIC吸着カラムを0.1Mリン酸緩衝生理食
塩水（PBS）洗浄した後、50mMε−アミノカプロン酸を
含むPBSでPICを溶出させた。
更に、得られたPICをウルトロゲルACA44による分子篩
クロマトグラフィーによって精製した。この精製PICを
免疫原及び抗PICモノクローナル抗体のスクリーニング
に使用した。
クロマトグラフィーによって精製した。この精製PICを
免疫原及び抗PICモノクローナル抗体のスクリーニング
に使用した。
（ｂ）免疫化脾臓細胞の調製： PIC免疫原溶液（A280nm＝0.1）を等量のフロインド氏
完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液20
0μｌをBALB/c系マウスの腹腔内に投与することにより
免疫を行った（第１回免疫）。30日経過後、前記と同様
の混合液200μｌを前記マウスの腹腔内に投与した（第
２回免疫）。第２回免疫から21日経過後、PIC免疫原溶
液（A280nm＝0.1）を等量の生理食塩水で希釈して調製
したPIC希釈液200μｌを、前記マウスの静脈内に投与し
た（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓を無菌
的にマウスから取り出し、次の細胞融合工程に使用し
た。
完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液20
0μｌをBALB/c系マウスの腹腔内に投与することにより
免疫を行った（第１回免疫）。30日経過後、前記と同様
の混合液200μｌを前記マウスの腹腔内に投与した（第
２回免疫）。第２回免疫から21日経過後、PIC免疫原溶
液（A280nm＝0.1）を等量の生理食塩水で希釈して調製
したPIC希釈液200μｌを、前記マウスの静脈内に投与し
た（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓を無菌
的にマウスから取り出し、次の細胞融合工程に使用し
た。
（ｃ）細胞融合 15％ウシ胎児血清を含むDME培地5mlを入れたシャーレ
に、無菌的に抽出した前記の脾臓を入れた。次に、15％
ウシ胎児血清を含むDME培地約15mlで前記脾臓を還流し
て脾臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイ
ロンメッシュに通した。この脾臓細胞を50ml遠心チュー
ブに集め、500×ｇで10分間遠心した。こうして得たペ
レットにヘモライジング溶液（155mM−NH4Cl、10mM−KH
CO3、1mM−Na2EDTA:pH7.0）4mlを加え、懸濁させた。０
℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。15
％ウシ胎児血清10mlを含むDME培地を加えてから遠心分
離した。こうして得たペレットをDME培地で遠心法によ
り洗浄し、生きている脾臓細胞数を測定した。
に、無菌的に抽出した前記の脾臓を入れた。次に、15％
ウシ胎児血清を含むDME培地約15mlで前記脾臓を還流し
て脾臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイ
ロンメッシュに通した。この脾臓細胞を50ml遠心チュー
ブに集め、500×ｇで10分間遠心した。こうして得たペ
レットにヘモライジング溶液（155mM−NH4Cl、10mM−KH
CO3、1mM−Na2EDTA:pH7.0）4mlを加え、懸濁させた。０
℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。15
％ウシ胎児血清10mlを含むDME培地を加えてから遠心分
離した。こうして得たペレットをDME培地で遠心法によ
り洗浄し、生きている脾臓細胞数を測定した。
一方、予め培養しておいたマウスエミローマ細胞（骨
髄腫細胞）SP2/0−Ag14（理化学研究所ジーンバンク細
胞銀行）約２×107個に前記脾臓細胞１×108個を加え、
DME培地中でよく混合し、遠心分離を行った（500×ｇ、
10分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐ
し、40％ポリエチレングリコール4000溶液（38℃に保
温）0.5mlを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やか
に回転することによってポリエチレングリコール溶液と
細胞ペレットとを混合させた。次に、38℃に保温してお
いたDME培地を30秒毎に1mlずつ加えて、チューブを穏や
かに回転させた。この操作を10回繰り返した後、15％ウ
シ胎児血清20mlを含むDME培地を加えて、遠心分離（500
×ｇ、10分間）を行った。上清を除去した後、15％ウシ
胎児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノプテリン４×
10-7、チミジン1.6×10-5M,ヒポキサンチン１×10-4Mに
なるように添加したもの）で細胞ペレットを遠心法によ
って２回洗浄した後、前記HAT培地40mlに懸濁した。こ
の細胞懸濁液を96ウエル細胞培養プレートの各ウエルニ
200μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養
器で37℃にて培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で
各ウエルの培地を約100μｌ除き、新たに前記のHAT培地
100μｌを加えることによりHAT培地中で増殖するハイブ
リドーマを選択した。８日目から15％ウシ胎児血清を含
むHT培地（DME培地にチミジン1.6×10-5M、ヒポキサン
チン１×10-4Mになるように添加したもの）に交換し、
ハイブリドーマを観察するとともに、10日目に、後記の
ELISA法により、PIC抗体産生ハイブリドーマをスクリー
ニングした。
髄腫細胞）SP2/0−Ag14（理化学研究所ジーンバンク細
胞銀行）約２×107個に前記脾臓細胞１×108個を加え、
DME培地中でよく混合し、遠心分離を行った（500×ｇ、
10分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐ
し、40％ポリエチレングリコール4000溶液（38℃に保
温）0.5mlを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やか
に回転することによってポリエチレングリコール溶液と
細胞ペレットとを混合させた。次に、38℃に保温してお
いたDME培地を30秒毎に1mlずつ加えて、チューブを穏や
かに回転させた。この操作を10回繰り返した後、15％ウ
シ胎児血清20mlを含むDME培地を加えて、遠心分離（500
×ｇ、10分間）を行った。上清を除去した後、15％ウシ
胎児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノプテリン４×
10-7、チミジン1.6×10-5M,ヒポキサンチン１×10-4Mに
なるように添加したもの）で細胞ペレットを遠心法によ
って２回洗浄した後、前記HAT培地40mlに懸濁した。こ
の細胞懸濁液を96ウエル細胞培養プレートの各ウエルニ
200μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養
器で37℃にて培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で
各ウエルの培地を約100μｌ除き、新たに前記のHAT培地
100μｌを加えることによりHAT培地中で増殖するハイブ
リドーマを選択した。８日目から15％ウシ胎児血清を含
むHT培地（DME培地にチミジン1.6×10-5M、ヒポキサン
チン１×10-4Mになるように添加したもの）に交換し、
ハイブリドーマを観察するとともに、10日目に、後記の
ELISA法により、PIC抗体産生ハイブリドーマをスクリー
ニングした。
（ｄ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養液の上清における産生抗体の有無
はELISA法により測定した。96ウエルELISA用プレート
（Immulon II、日本ダイナテック株式会社）の各ウエル
に前記のPIC免疫原溶液（A280nm＝0.05、生理食塩水で
希釈した）50μｌずつを分注し、25℃で２時間放置し
た。次に、0.05％Tween20−生理食塩水で３回洗浄した
後、各ウエルに培養液上清50μｌを加え、25℃で１時間
反応させた。
はELISA法により測定した。96ウエルELISA用プレート
（Immulon II、日本ダイナテック株式会社）の各ウエル
に前記のPIC免疫原溶液（A280nm＝0.05、生理食塩水で
希釈した）50μｌずつを分注し、25℃で２時間放置し
た。次に、0.05％Tween20−生理食塩水で３回洗浄した
後、各ウエルに培養液上清50μｌを加え、25℃で１時間
反応させた。
次に、Tween20−生理食塩水で200倍に希釈したペルオ
キシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50
μｌを各ウエルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20
−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、0.5mMアミノア
ンチピリン、10mMフェノール及び0.005％過酸化水素水
を含む溶液250μｌを各ウエルに加え、25℃で30分間反
応させ、各ウエルの490nmにおける吸光度を測定した。
その結果、192ウエル中、３ウエルに抗体産生が認めら
れた。その３ウエル中のハイブリドーマを24ウエルプレ
ートに移し、15％ウシ胎児血清を含むHT培地で４〜５日
間培養した。その後、再度ELISA法によって抗PIC抗体の
産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニン
グした。限界希釈法は、HT培地でハイブリドーマが５個
/mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常BALB/
C系マウスの腹腔細胞がウエル当たり２×104個分注して
ある96ウエルプレートの各ウエルに100μｌずつ分注し
た。10日後、ELISA法によって抗PIC特異的抗体を産生す
るハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。
キシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50
μｌを各ウエルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20
−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、0.5mMアミノア
ンチピリン、10mMフェノール及び0.005％過酸化水素水
を含む溶液250μｌを各ウエルに加え、25℃で30分間反
応させ、各ウエルの490nmにおける吸光度を測定した。
その結果、192ウエル中、３ウエルに抗体産生が認めら
れた。その３ウエル中のハイブリドーマを24ウエルプレ
ートに移し、15％ウシ胎児血清を含むHT培地で４〜５日
間培養した。その後、再度ELISA法によって抗PIC抗体の
産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニン
グした。限界希釈法は、HT培地でハイブリドーマが５個
/mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常BALB/
C系マウスの腹腔細胞がウエル当たり２×104個分注して
ある96ウエルプレートの各ウエルに100μｌずつ分注し
た。10日後、ELISA法によって抗PIC特異的抗体を産生す
るハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。
その結果、各ハイブリドーマにつき、20〜40個の抗体
産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、
増殖力が強く、抗体分泌能が高く、しかも安定なクロー
ンを選び、前記と同様の方法で再クローン化を行い、３
種の抗PIC抗体産生ハイブリドーマPIC−１、PIC−２及
びPIC−３を樹立した。これら３種のハイブリドーマか
ら分泌される３種のモノクローナル抗体PIC−１、PIC−
２及びPIC−３とヒトプラスミノーゲン（アテンズ・リ
サーチ社、アメルカ）あるいはヒトα２−プラスミンイ
ンヒビター（アテンズ・リサーチ社、アメリカ）との反
応性を、96ウエルELISA用プレートにヒトプラスミノー
ゲンあるいはヒトα２−プラスミンインヒビターを被覆
し、前記のELISA法と同様の方法により調べた。モノク
ローナル抗体PIC−１はヒトプラスミノーゲンと反応し
たが、ヒトα２−プラスミンインヒビターとは反応しな
かった。モノクローナル抗体PIC−２はα２−プラスミ
ンインヒビターと反応したが、ヒトプラスミノーゲンと
は反応しなかった。一方、モノクローナル抗体PIC−３
はヒトプラスミノーゲンにも、ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターにも反応しなかった。
産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、
増殖力が強く、抗体分泌能が高く、しかも安定なクロー
ンを選び、前記と同様の方法で再クローン化を行い、３
種の抗PIC抗体産生ハイブリドーマPIC−１、PIC−２及
びPIC−３を樹立した。これら３種のハイブリドーマか
ら分泌される３種のモノクローナル抗体PIC−１、PIC−
２及びPIC−３とヒトプラスミノーゲン（アテンズ・リ
サーチ社、アメルカ）あるいはヒトα２−プラスミンイ
ンヒビター（アテンズ・リサーチ社、アメリカ）との反
応性を、96ウエルELISA用プレートにヒトプラスミノー
ゲンあるいはヒトα２−プラスミンインヒビターを被覆
し、前記のELISA法と同様の方法により調べた。モノク
ローナル抗体PIC−１はヒトプラスミノーゲンと反応し
たが、ヒトα２−プラスミンインヒビターとは反応しな
かった。モノクローナル抗体PIC−２はα２−プラスミ
ンインヒビターと反応したが、ヒトプラスミノーゲンと
は反応しなかった。一方、モノクローナル抗体PIC−３
はヒトプラスミノーゲンにも、ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターにも反応しなかった。
前記の各ハイブリドーマは通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所（あて名：〒305日本国茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に1990年12月４日から国内寄託さ
れ、1991年12月16日から国際寄託に移管されている。国
際寄託番号（国際寄託番号につづく［］内は国内寄託番
号）は、ハイブリドーマPIC−１が微工研条寄第3681号
（FERM BP−3681）［微工研菌寄第11888号（FERM Ｐ
−11888）］、ハイブリドーマPIC−２が微工研条寄第36
82号（FERM BP−3682）［微工研菌寄第11889号（FERM
Ｐ−211889）］そしてハイブリドーマPIC−３が微工
研条寄第3683号（FERM BP−3683）［備工研菌寄第1189
0号（FERM Ｐ−11890）］である。
物工業技術研究所（あて名：〒305日本国茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に1990年12月４日から国内寄託さ
れ、1991年12月16日から国際寄託に移管されている。国
際寄託番号（国際寄託番号につづく［］内は国内寄託番
号）は、ハイブリドーマPIC−１が微工研条寄第3681号
（FERM BP−3681）［微工研菌寄第11888号（FERM Ｐ
−11888）］、ハイブリドーマPIC−２が微工研条寄第36
82号（FERM BP−3682）［微工研菌寄第11889号（FERM
Ｐ−211889）］そしてハイブリドーマPIC−３が微工
研条寄第3683号（FERM BP−3683）［備工研菌寄第1189
0号（FERM Ｐ−11890）］である。
実施例2:モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマPIC−１、PIC−２及びPIC−３
を、それぞれ15％ウシ胎児血清を含むDME培地で、37℃
で５％二酸化炭素雰囲気中において72〜96時間培養し
た。培養物を遠心分離（10000×ｇ、10分間）後、上清
に固形の硫酸アンモニウムを50％最終濃度となるように
徐々に加えた。混合物を氷冷下で30分間攪拌した後、60
分間放置してから遠心分離（10000×ｇ、10分間）処理
し、得られた沈渣を少量の10mMリン酸緩衝液（pH8.0）
に溶解し、1000倍量の10mMリン酸緩衝液ですでに平衡化
したDEAE−セルロースのカラムに充填した。モノクロー
ナル抗体の溶出は10mMリン酸緩衝液（pH8.0）と0.2M−N
aClを含む10mMリン酸緩衝液（pH8.0）の間で濃度勾配法
により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外
過法で濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に対して透
析した。ウシ血清IgGを除くために、透析物をヨギ抗ウ
シ血清IgG−セファロース4Bカラムに通した。次に、通
過液を0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したプロテ
インＡ−セファロース4Bカラムに充填した。カラムをpH
3.5の緩衝液で溶出して、精製した抗PIC特異モノクロー
ナル抗体PIC−１、同様にモノクローナル抗体PIC−２、
及びモノクローナル抗体PIC−３の溶液を得た。
を、それぞれ15％ウシ胎児血清を含むDME培地で、37℃
で５％二酸化炭素雰囲気中において72〜96時間培養し
た。培養物を遠心分離（10000×ｇ、10分間）後、上清
に固形の硫酸アンモニウムを50％最終濃度となるように
徐々に加えた。混合物を氷冷下で30分間攪拌した後、60
分間放置してから遠心分離（10000×ｇ、10分間）処理
し、得られた沈渣を少量の10mMリン酸緩衝液（pH8.0）
に溶解し、1000倍量の10mMリン酸緩衝液ですでに平衡化
したDEAE−セルロースのカラムに充填した。モノクロー
ナル抗体の溶出は10mMリン酸緩衝液（pH8.0）と0.2M−N
aClを含む10mMリン酸緩衝液（pH8.0）の間で濃度勾配法
により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外
過法で濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に対して透
析した。ウシ血清IgGを除くために、透析物をヨギ抗ウ
シ血清IgG−セファロース4Bカラムに通した。次に、通
過液を0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したプロテ
インＡ−セファロース4Bカラムに充填した。カラムをpH
3.5の緩衝液で溶出して、精製した抗PIC特異モノクロー
ナル抗体PIC−１、同様にモノクローナル抗体PIC−２、
及びモノクローナル抗体PIC−３の溶液を得た。
（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカ
ン）0.5mlを10〜12週齢のBALB/c系マウスの腹腔内に投
与し、それから14〜20日目のマウスの腹腔内にインビト
ロで増殖されたハイブリドーマPIC−１、PIC−２、又は
PIC−３をマウス一匹あたり２×106個となるように接種
した。各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約10〜
15mlの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜10mg/ml
であった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記
のイン・ビトロ精製と同様の方法（但し、ヤギ抗ウシ血
清IgG−セファロース4Bのカラムを通す操作を除く）で
行なった。
ン）0.5mlを10〜12週齢のBALB/c系マウスの腹腔内に投
与し、それから14〜20日目のマウスの腹腔内にインビト
ロで増殖されたハイブリドーマPIC−１、PIC−２、又は
PIC−３をマウス一匹あたり２×106個となるように接種
した。各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約10〜
15mlの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜10mg/ml
であった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記
のイン・ビトロ精製と同様の方法（但し、ヤギ抗ウシ血
清IgG−セファロース4Bのカラムを通す操作を除く）で
行なった。
実施例3:モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及
び特異性の同定 抗PIC特異モノクローナル抗体PIC−１、PIC−２及びP
IC−３の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定はそれ
ぞれオクテロニー免疫拡散法、エンザイムイムノアッセ
イ法及びイムノブロット法により行った。結果は表１に
示す通りである。
び特異性の同定 抗PIC特異モノクローナル抗体PIC−１、PIC−２及びP
IC−３の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定はそれ
ぞれオクテロニー免疫拡散法、エンザイムイムノアッセ
イ法及びイムノブロット法により行った。結果は表１に
示す通りである。
表１において、「＋」はELISA法で反応を示すこと
を、そして「−」はELISA法で反応を示さないことを意
味する。更に、「有」はイムノブロット法で反応を示す
ことを、そして「無」はイムノブロット法で反応を示さ
ないことを意味する。
を、そして「−」はELISA法で反応を示さないことを意
味する。更に、「有」はイムノブロット法で反応を示す
ことを、そして「無」はイムノブロット法で反応を示さ
ないことを意味する。
実施例4:抗体と不溶性担体（ラテックス）との結合 モノクローナル抗体PIC−１（2.0mg/ml）を含有する
水溶液2mlと、ラテックス溶液（２％、Dow Chemical
社：粒径0.482μｍ）2mlとを混合し、約１時間攪拌し
た。遠心（20,000×ｇ、10分間）した後、沈澱を0.1％B
SA溶液に懸濁し、約１時間攪拌した。再び遠心（20,000
×ｇ、10分間）した後、沈澱を水に懸濁し、約２時間攪
拌した。こうして、モノクローナル抗体PIC−1/ラテッ
クス複合体含有液を得た。同様にしてモノクローナル抗
体PIC−２又はモノクローナル抗体PIC−３を用いて、単
独の各モノクローナル抗体とラテックスとの複合体の含
有液を調製した。
水溶液2mlと、ラテックス溶液（２％、Dow Chemical
社：粒径0.482μｍ）2mlとを混合し、約１時間攪拌し
た。遠心（20,000×ｇ、10分間）した後、沈澱を0.1％B
SA溶液に懸濁し、約１時間攪拌した。再び遠心（20,000
×ｇ、10分間）した後、沈澱を水に懸濁し、約２時間攪
拌した。こうして、モノクローナル抗体PIC−1/ラテッ
クス複合体含有液を得た。同様にしてモノクローナル抗
体PIC−２又はモノクローナル抗体PIC−３を用いて、単
独の各モノクローナル抗体とラテックスとの複合体の含
有液を調製した。
抗体混合物とラテックスとの複合体は以下のように調
製した。モノクローナル抗体PIC−１、モノクローナル
抗体PIC−２及びモノクローナル抗体PIC−３をそれぞれ
0.66mg/mlずつ含有する水溶液2mlと、ラテックス溶液
（２％、Dow Chemical社：粒径0.482μｍ）2mlとを混合
し、約１時間攪拌した。以下、前記と同様に処理して、
モノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル抗体PIC−2/
モノクローナル抗体PIC−3/ラテックス複合体を調製し
た。
製した。モノクローナル抗体PIC−１、モノクローナル
抗体PIC−２及びモノクローナル抗体PIC−３をそれぞれ
0.66mg/mlずつ含有する水溶液2mlと、ラテックス溶液
（２％、Dow Chemical社：粒径0.482μｍ）2mlとを混合
し、約１時間攪拌した。以下、前記と同様に処理して、
モノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル抗体PIC−2/
モノクローナル抗体PIC−3/ラテックス複合体を調製し
た。
モノクローナル抗体PIC−１及びモノクローナル抗体P
IC−２をそれぞれ1mg/mlずつ含有する水溶液とラテック
ス溶液とを等量混合すること以外は前記と同様にして、
モノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル抗体PIC−2/
ラテックス複合体を調製した。
IC−２をそれぞれ1mg/mlずつ含有する水溶液とラテック
ス溶液とを等量混合すること以外は前記と同様にして、
モノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル抗体PIC−2/
ラテックス複合体を調製した。
実施例５ スライド凝集反応による定量 実施例４で調製した抗体ラテックス複合体含有液40μ
ｌと種々な濃度のPICを含有する水溶液40mlとをスライ
ドガラス上で混合し、揺動して３分後に凝集像を目視的
に判定した。結果を以下の表２に示す。
ｌと種々な濃度のPICを含有する水溶液40mlとをスライ
ドガラス上で混合し、揺動して３分後に凝集像を目視的
に判定した。結果を以下の表２に示す。
表２において、「＋」は凝集ありを、そして「−」は
凝集なしを各々意味する。また、表２の抵抗／ラテック
ス複合体の欄において、複合体の種類をその複合体に結
合するモノクローナル抗体によって示す。従って、例え
ばPIC−１はモノクローナル抗体PIC−1/ラテックス複合
体を意味し、PIC−１＋PIC−２はモノクローナル抗体PI
C−1/ラテックス複合体とモノクローナル抗体PIC−2/ラ
テックス複合体との等量混合液を意味する。更に、PIC
−1/PIC−２はモノクローナル抗体PIC−1/モノクローナ
ル抗体PIC−2/ラテックス複合体を意味する。
凝集なしを各々意味する。また、表２の抵抗／ラテック
ス複合体の欄において、複合体の種類をその複合体に結
合するモノクローナル抗体によって示す。従って、例え
ばPIC−１はモノクローナル抗体PIC−1/ラテックス複合
体を意味し、PIC−１＋PIC−２はモノクローナル抗体PI
C−1/ラテックス複合体とモノクローナル抗体PIC−2/ラ
テックス複合体との等量混合液を意味する。更に、PIC
−1/PIC−２はモノクローナル抗体PIC−1/モノクローナ
ル抗体PIC−2/ラテックス複合体を意味する。
実施例6:精製PICの添加回収試験 ５種の検体（健常人Ａ、健常人Ｂ、DIC患者Ｃ、DIC患
者Ｄ及びDIC患者Ｅから採取した血漿）中のPIC濃度を、
実施例５のモノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル
抗体PIC−2/ラテックス複合体溶液を用いて測定した。
次いで、それぞれの検体に精製PIC2μg/ml、４μg/ml及
び８μg/mlを添加し、添加回収試験を行った。測定値は
検体を倍々希釈して凝集の消失する希釈倍数から半定量
的に測定した。結果は表３に示すように、良好な回収が
得られた。
者Ｄ及びDIC患者Ｅから採取した血漿）中のPIC濃度を、
実施例５のモノクローナル抗体PIC−1/モノクローナル
抗体PIC−2/ラテックス複合体溶液を用いて測定した。
次いで、それぞれの検体に精製PIC2μg/ml、４μg/ml及
び８μg/mlを添加し、添加回収試験を行った。測定値は
検体を倍々希釈して凝集の消失する希釈倍数から半定量
的に測定した。結果は表３に示すように、良好な回収が
得られた。
実施例7:健常人とDIC患者群のPIC値 実施例６で使用したモノクローナル抗体PIC−1/モノ
クローナル抗体PIC−2/ラテックス複合体溶液を用い
て、健常人血漿12検体、DIC患者血漿15検体のPIC量を測
定した。結果を図１に示す。健常人群のPIC量は全例１
μg/ml未満であった。それに対してDIC患者群は全例２
μg/ml以上であった。
クローナル抗体PIC−2/ラテックス複合体溶液を用い
て、健常人血漿12検体、DIC患者血漿15検体のPIC量を測
定した。結果を図１に示す。健常人群のPIC量は全例１
μg/ml未満であった。それに対してDIC患者群は全例２
μg/ml以上であった。
産業上の利用可能性 以上詳細に説明したとおり、本発明によれば、血漿試
料の希釈操作を行わなくても、血漿中の遊離プラスミノ
ーゲン及び遊離α２−プラスミンインヒビターの干渉を
受けることなく、患者血漿中のPIC量を特異的に、簡便
かつ迅速に、凝集法により測定することができる。これ
は、本発明によって初めて可能になったものである。従
って、本発明はDIC等の診断及び病理研究に有用な手段
を提供するものである。
料の希釈操作を行わなくても、血漿中の遊離プラスミノ
ーゲン及び遊離α２−プラスミンインヒビターの干渉を
受けることなく、患者血漿中のPIC量を特異的に、簡便
かつ迅速に、凝集法により測定することができる。これ
は、本発明によって初めて可能になったものである。従
って、本発明はDIC等の診断及び病理研究に有用な手段
を提供するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/577 C07K 16/36 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】不溶性担体に固定化された、（１）ヒトプ
ラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体及びヒ
トプラスミノーゲンと特異的に反応し、ヒトα２−プラ
スミンインヒビターとは反応しないモノクローナル抗
体、（２）ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビ
ター複合体及びヒトα２−プラスミンインヒビターと特
異的に反応するモノクローナル抗体、及び（３）ヒトプ
ラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体と特異
的に反応し、ヒトプラスミノーゲン及びヒトα２−プラ
スミンインヒビターとは反応しないモノクローナル抗体
少なくとも２種と、被検試料とを接触させ、被検試料に
おける凝集反応を観察することを特徴とする、ヒトプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の測定方
法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-411805 | 1990-12-20 | ||
| JP41180590 | 1990-12-20 | ||
| PCT/JP1991/001736 WO1992011384A1 (en) | 1990-12-20 | 1991-12-19 | ANTIBODY AGAINST HUMAN PLASMIN-α2-PLASMIN INHIBITOR COMPLEX, HYBRIDOMA AND IMMUNOASSAY |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3291525B2 true JP3291525B2 (ja) | 2002-06-10 |
Family
ID=18520741
Family Applications (1)
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| JP50147592A Expired - Lifetime JP3291525B2 (ja) | 1990-12-20 | 1991-12-19 | ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定方法 |
Country Status (9)
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|---|---|
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| JP (1) | JP3291525B2 (ja) |
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| AU (1) | AU657504B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69129582T2 (ja) |
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| WO2013026807A1 (de) * | 2011-08-19 | 2013-02-28 | Protagen Ag | Neues verfahren zur diagnostik von hochaffinen bindern und markersequenzen |
| WO2023213869A1 (en) * | 2022-05-04 | 2023-11-09 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Plasmin-binding vhhs |
| CN116284415B (zh) * | 2022-12-29 | 2023-11-14 | 山东大学 | 一种纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物单克隆抗体及其制备和应用 |
| CN117568445B (zh) * | 2024-01-18 | 2024-04-09 | 西南交通大学 | 一种tat、pic复合质控品的制备方法及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| NL7511055A (nl) * | 1975-09-19 | 1977-03-22 | Leuven Res & Dev Vzw | Trombosetest. |
| EP0044219A1 (en) * | 1980-07-16 | 1982-01-20 | Unilever Plc | Methods of immuno analysis using monoclonal antibodies |
| US4849353A (en) * | 1980-09-30 | 1989-07-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Immunocapture of enzyme inhibitor, enzyme complexes and uses thereof |
| US4629694A (en) * | 1983-07-12 | 1986-12-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detecting and distinguishing between plasminogen activators |
| GB8408193D0 (en) * | 1984-03-30 | 1984-05-10 | Cambridge Patent Dev | Antibodies |
| DK166627B1 (da) * | 1984-04-17 | 1993-06-21 | Teijin Ltd | Monoklont antistof, der er specifikt over for human-alfa-2-plasmininhibitor, fremgangsmaade til fremstilling af et hybridom, der producerer antistoffet, anvendelse af antistoffet til immunologisk analyse for human-alfa-2-plasmininhibitor og anvendelse af antistoffet til fraskillelse og udvinding af human-alfa-2-plasmininhibitor |
| JPS60222426A (ja) * | 1984-04-17 | 1985-11-07 | Teijin Ltd | モノクローナル抗体及びモノクローナル抗体の製造方法 |
| JPS61213671A (ja) * | 1985-03-20 | 1986-09-22 | Teijin Ltd | ヒトプラスミン−α↓２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定法 |
| DE3586577T2 (de) * | 1984-07-26 | 1993-03-25 | Teijin Ltd | Immunologische bestimmung von menschlichem plasmin/alpha-2-plasmin-hemmstoff. |
| US4820635A (en) * | 1985-08-27 | 1989-04-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Kit for assaying activation of terminal complement cascade |
| JPH074270B2 (ja) * | 1986-06-24 | 1995-01-25 | 帝人株式会社 | モノクローナル抗体 |
| AT398004B (de) * | 1992-04-14 | 1994-08-25 | Berbi Gmbh | Verfahren zur bestimmung von plasmin-alpha2- antiplasmin-komplexen unter verwendung eines komplexspezifischen monoklonalen antikörpers |
-
1991
- 1991-12-19 KR KR1019920701986A patent/KR100207351B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 CA CA002075937A patent/CA2075937C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 JP JP50147592A patent/JP3291525B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 WO PCT/JP1991/001736 patent/WO1992011384A1/ja active IP Right Grant
- 1991-12-19 AU AU91001/91A patent/AU657504B2/en not_active Expired
- 1991-12-19 ES ES92901440T patent/ES2118807T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 EP EP92901440A patent/EP0516863B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 DE DE69129582T patent/DE69129582T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 US US07/920,544 patent/US5888749A/en not_active Expired - Lifetime
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| US5888749A (en) | 1999-03-30 |
| DE69129582D1 (de) | 1998-07-16 |
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| CA2075937A1 (en) | 1992-06-21 |
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| KR927003838A (ko) | 1992-12-18 |
| KR100207351B1 (ko) | 1999-07-15 |
| EP0516863A4 (en) | 1993-06-09 |
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| EP0516863B1 (en) | 1998-06-10 |
| ES2118807T3 (es) | 1998-10-01 |
| DE69129582T2 (de) | 1999-02-18 |
| CA2075937C (en) | 2002-01-29 |
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