DK166627B1 - Monoklont antistof, der er specifikt over for human-alfa-2-plasmininhibitor, fremgangsmaade til fremstilling af et hybridom, der producerer antistoffet, anvendelse af antistoffet til immunologisk analyse for human-alfa-2-plasmininhibitor og anvendelse af antistoffet til fraskillelse og udvinding af human-alfa-2-plasmininhibitor - Google Patents

Description

i DK 166627 B1

Den foreliggende opfindelse angår et raonoklont antistof, der er specifikt over for en human-a2-plasinin-inhibtor eller et a2-antiplasmin, især et monoklont antistof, som specifikt blokerer det reaktive sted i en human-5 -a2-plasmininhibitor, dvs. det sted i a2-plasmininhibitor, der inhiberer plasmins fibrinolytiske aktivitet og følgelig undertrykker human-a2-plasmininhibitorens virkning til inhibering af plasmins fibrinolytiske aktivitet og fremmer fibrinolyse ved hjælp af plasmin; en fremgangsmåde til 10 fremstilling af et hybridom, der kan producere det monoklone antistof; det monoklone antistofs anvendelse til immunologisk analyse for human-a^-plasmininhibitor; et pharmaceutisk middel til behandling af thrombotiske sygdomme, og anvendelsen af det monoklone antistof til fraskillelse og udvin-15 ding af human-c^-plasmininhibitor.

Det er kendt, at human-a2-plasmininhibitoren (herefter forkortet til "human-a2-PI") er et enkeltkædet glycoprotein med et carbonhydratindhold på 11,7% og en molekylevægt på ca. 67.000, og som først blev isoleret 20 i ren form ud fra humanplasma af Aoki og Moroi og fungerer som en kraftig inhibitor, der øjeblikkelig kan inhi-bere esteraseaktiviteten hos plasmin, et fibrinolytisk enzym [jfr. Moroi og Aoki, The Journal of Biological Chemistry 251, 5956-5965 (1976)].

25 På den anden side har human-α2-PI tre funktio ner. For det første har den et sted til inhibering af plamins fibrinolytiske aktivitet (i den foreliggende beskrivelse omtales dette sted som det "reaktive sted") [jfr. B. Wiman og D. Collen, The Journal of Biological 30 chemistry 254, 9291-9297 (1979)]. For det andet har det et sted, der kombinerer med plasmin ved carboxyl-gruppeendestillingen [B. Wiman og D. Collen, European Jorunal of Biochemistry 84, 573-578 (1978)]. For det tredje har det et sted, der kombinerer med fibrin ved 35 aminogruppeendestillingen [Y. Sakata m.fl., Thrombosis Research 16, 279-282 (1979)].

Hvis det er muligt at tilvejebringe et mono- DK 166627 B1 2

O

klont antistof, der selektivt blokerer det reaktive sted i human-c^-PI blandt disse tre aktive steder, ville det inden for medicinen være yderst ønskeligt til behandling af throrribotiske lidelser og lignende, fordi 5 anvendelsen af et sådan monoklont antistof direkte .kan undertrykke virkningen af human-o^-PI til inhibering af plasmins fibrinolyse og til fremme af fibrinolyse ved hjælp af plasmin.

Det er kendt inden for klinisk medicin, at ni-10 veauet af human-o^-PI i blodet aftager ved lidelser i parenchymatøse leverceller, og der finder rapporter om, at human-α2-PI-niveauet i blod udviser en stærkt nedgang. ved dekompenseret levercirrhose og fulminant hepatitis [jfr. N. Aoki og T. Yamanaka, Clinica Chimica Ac-15 ta, 84, 99-105 (1978)].

For nylig er human-c^-PI1 s kemiske, fysiske og biologiske egenskaber blevet nøje belyst, og det har vist sig, at human-c^-PI specifikt styrer og regulerer plasmins fibrinolytiske mekanisme og har en vigtig ind-20 virkning på denne mekanisme [jfr. f.eks. N. Aoki og P.

C. Harpel, "Seminars in Thrombosis and Hemostasis" 10, 24-41 (1984)].

Følgelig ville tilvejebringelsen af et monoklont antistof, der kan blokere det reaktive sted i 25 human-a2“PI specifikt, muliggøre en akkurat og let måling af mængden af human-c^-PI i blodet og ville være meget nyttigt til forebyggelse og diagnosticering af forskellige sygdomme.

Den eneste litteraturhenvisning, som omtaler 30 et monoklont antistof mod human-c^-PI, er belgisk patentskrift nr. 896.543, som anfører, at 23 monoklone antistoffer mod c^-PI, som kan klassificeres i 11 antistofgrupper med forskellige epitope specificiteter, er blevet fremstillet, men i patentskriftet bestemmes 35 ikke, hvilke o^-PI-epitoper disse monoklone antistoffer specifikt genkender og kombineres med.

3 DK 166627 B1

Det er således opfindelsens· primære formål at tilvejebringe et stærkt specifikt monoklont antistof eller fragment heraf med den funktion, at det specifikt blokerer det reaktive sted i human-o^-Pl, som inhibe-5 rer plasmins fibrinolytiske aktivitet og derved undertrykker human-c^-PI's virkning, nemlig at inhibere plasmins fibrinolytiske aktivitet.

Det er endvidere opfindelsens formål at tilvejebringe et hybridom, som udskiller et sådant monoklont 10 antistof, og at angive en fremgangsmåde til fremstilling heraf.

Yderligere angår opfindelsen en fremgangsmåde til immunologisk at påvise c^-PI i en analyseprøve ved hjælp af det ovennævnte monoklone antistof samt et reals gens til brug ved denne fremgangsmåde.

Endelig angår opfindelsen tilvejebringelsen af et selektivt adsorbens for c^-PI ved hjælp af ovennævnte monoklone antistof samt en fremgangsmåde til fra-skillelse eller udvinding af c^-PI ved hjælp af adsor-20 benset.

Yderligere formål med og fordele ved opfindelsen vil fremgå af den følgende beskrivelse.

Opfindelsen angår et monoklont antistof, der er specifikt over for en human a2-PI, hvilket antistof er ejendomme-25 lig ved, at det specifikt blokerer det sted i human a2-PI, der inhiberer plasmins fibrinolytiske aktivitet, og at det undertrykker human a2-PI 's inhiberende virkning på den fibrinolytiske aktivitet, eller et fragment af det monoklone antistof med samme biologiske virkning.

30 Det monoklone antistof ifølge opfindelsen muliggør nøjagtig måling af a2-PI i sig selv (dvs. ikke i form af et kompleks) i blod, til forskel fra et a2”PI“Plasmin"komPleks·

Dette er meget væsentligt og nyttigt til nøjagtig bestemmelse af den rette dosis af et thrombus-opløsende middel ved be-35 handling af patienter med thrombotiske sygdomme.

Det er velkendt, at når den indgivne dosis af et 4 DK 166627 B1 thrombus-opløsende middel er for lille ved behandling af thrombotiske sygdomme, kan den tilsigtede effekt ikke opnås, medens der, når den indgivne dosis er for stor, optræder hæmoragi som uønsket bivirkning. Det er derfor væsentligt 5 at bestemme den mest korrekte dosis.

Stedet for forekomsten af og omfanget af en thrombus er forskellig fra patient til patient, og det er umuligt på forhånd at fastlægge en typisk dosis, som er generelt anvendelig. Den optimale dosis skal bestemmes for hver enkelt 10 patient og afhængigt af ændringer i patientens tilstand.

Det har som resultat af undersøgelser af forholdet mellem helbredelsesprocessen hos thrombotiske patienter, som har modtaget et thrombus-opløsende middel, og a2-PI-koncentrationen i patientens blod, ved anvendelse af det 15 monoklone antistof ifølge den foreliggende opfindelse, vist sig, at der findes en signifikant korrelation mellem disse, jf. artiklen: Nobuo Aoki, et al.: "Fundamental Study of a2PI (TD-80) and a2PI-Plasmin Complex (TD-80C) Measurement Kit Using EIA-Method; Rinsho Bvori (klinisk patologi) Vol.

20 35, No. 11 (Nov. 1987), publ. af Publishing Association of

Rinsho Byori.

Det fremgår af artiklen, at når en passende dosis af det thrombus-opløsende middel (urokinase) indgives, og throm-ben opløses, begynder mængden af a2-PI i sig selv i patien-25 tens blod at falde, fordi indgivelsen af urokinase bevirker plasmindannelse, og proportionalt dermed danner a2-PI i blodet a2-PI-plasminkompleks til nedsættelse af mængden af frit a2-PI.

På grund af dette fænomen kan det konstateres, om 30 den indgivne dosis af det thrombus-opløsende middel er passende, ved at overvåge koncentrationen af frit a2-PI i patientens blod.

Den totale mængde af a2-PI og a-Pl-plasminkompleks i blod er omtrent konstant efter indgivelse af urokinase.

35 5 DK 166627 B1

Derfor har anvendelsen af det monoklone antistof ifølge den foreliggende opfindelse, som muliggør måling af koncentrationen af fri a2-PI i blod til forskel fra a2-PI-plasminkom-pleks, gjort den ovennævnte behandlingsmetode (optimal do-5 sering af urokinase) mulig for første gang.

De monoklone antistoffer, som er beskrevet i belgisk patentskrift nr. 896 543, og som ikke udviser den specielle specificitet, som det monoklone antistof ifølge opfindelsen udviser, vil give et målesystem, som ikke er i stand til at 10 skelne mellem fri a2-PI og a2-PI-plasminkompleks, og kan derfor ikke anvendes til overvågning af behandlingen af thrombotisk sygdom under anvendelse af urokinase.

Ifølge opfindelsen kan det monoklone antistof fås ved at finde frem til en hybridomcellelinie, der 15 kan producere antistoffet, og dyrke hybridomet.

Hybridomet, der kan producere det monoklone antistof ifølge opfindelsen, kan fremstilles ved hjælp af en teknik, der er kendt som Kohier og Milstein's metode [Kohier og Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)].

20 Specifikt immuniseres et pattedyr såsom en mus med human (X2-PI, og antis tof producerende celler, f.eks. miltceller, fra dette dyr sammensmeltes med myelomceller. De sammensmeltede celler screenes ved kloning for sammensmeltede celler, der kan producere det monoklone antistof ifølge 25 opfindelsen. Således screenes de fremstillede sammensmeltede celler systematisk for et antistof, som reagerer med human c^-PI Mikseret på mikrotiterplader. På denne måde udvælges hybridomceller, som syntetiserer og udskiller et antistof mod c^-PI. De fremkomne hybridom-celler 30 dyrkes i et medium med eller uden serum. Antistoffer mod human ot2~PI, udskilt i væskeoverfasen fra dyrkningsvæsken, undersøges på fibrinplader for undertrykkende virkning på human a2“PI's fibrinolyse-inhiberende virkning. Som følge heraf kan der isoleres et hybridom, der kan produ-35 cere et monoklont antistof med den virkning, at det spe- 6 DK 166627 B1

O

cifikt undertrykker den fibrinolyseinhiberende aktivitet hos human a2-PI.

Det monoklone antistof ifølge opfindelsen kan fås ud fra det produkt, der ydes af dette hybridom. Det 5 herved fremkomne monoklone antistof virker monospecifikt på human c^-PI's reaktive sted.

Det monoklone antistof ifølge opfindelsen og fremgangsmåden til fremstilling heraf vil nu blive beskrevet detaljeret.

10 (A) Isolering og rensning af antigen.

Human a2-PI, der anvendes som et antigen, isoleres i ren form ud fra en human plasmaprøve ved hjælp af den 'ovennævnte Aoki og Moroi-metode.

(B) Immunisering af pattedyr med human a^-PI 15 Der findes ingen særlige begrænsninger med hen syn til de dyr, der bliver immuniseret, og der kan anvendes flere forskellige pattedyr, såsom mus, rotter, marsvin, kaniner, får, geder, hunde og katte. Af hensyn til nem håndtering anvendes i reglen Balb/c-hanmus. Der kan 20 også anvendes mus af andre stammer. Immuniseringen skal planlægges, og den koncentration af human a2~PI, der skal anvendes til immunisering, skal vælges således, at der kan dannes tilstrækkelige mængder af antigent stimulerede lymphocytter. Således immuniseres en mus intraperitone-25 alt flere gange med en lille smule human a2-PI med bestemte mellemrum, og der indgives yderligere antigen intravenøst flere gange for at forøge antistoftiteren. Flere dage efter den sidste immunisering, udtages antistof-producerende celler, f.eks. lymphocytter, fortrinsvis milt-30 celler, fra de immuniserede dyr. I det følgende gives en beskrivelse med hensyn til anvendelsen af miltceller som antistof-producerende celler, men det skal bemærkes, at der lige så vel kan anvendes andre antistof-producerende celler, der er isoleret fra immuniserede dyr, til 35 cellefusion.

7 DK 166627 B1

O

(C) Cellefusion

Milten udtages aseptisk fra det immuniserede dyr, og der fremstilles herudfra en miltcellesuspension. Miltcellerne sammensmeltes med myelomceller, der er ta-5 get fra en passende cellelinie, i et fusionsmedium i nærvær af en passende fusionspromotor. Myelomcellerne, der anvendes til fusion, kan fås fra et hvilket som helst pattedyr, men i reglen foretrækkes dem, der stammer fra samme dyreart som det immuniserede dyr. Det foretruk-10 ne blandingsforhold mellem miltceller og myelomceller ligger i reglen i intervallet fra ca. 20:1 til ca. 2:1, fortrinsvis 10:1 til 2:1. I reglen er anvendelsen af g 0,5-1,-5 ml fusionmedium passende pr. ca. 10 miltceller.

Egnede fusionsmedier er f.eks. fysiologisk saltvandsop-15 løsning, pufret saltvandsopløsning, et serum-frit medium, som hver indeholder en fusionpromotor i en koncentration på 30-70%.

Der kendes mange myelomceller, der er egnet til cellefusion. I de nedenfor anførte eksempler anvendes 20 P3-X63-Ag8-Ul-celler (forkortet til P3-U1) [jfr. D.E.

Yelton m.fl., Current Topics in Microbiology and Immunology 8o, 1 (1978)]. Der er en 8-azaguanin-resistent cellelinie. De mangler hypoxanthin-guanin-phosphoribo-syl-transferase og overlever derfor ikke i HAT-medium 25 (indeholdende hypoxanthin, aminopterin og thymidin).

Desuden er denne cellelinie, eftersom den er af en ikke-sekreterende type, der ikke selv udskiller et antistof, egnet til produktion af hybridomet ifølge den foreliggende opfindelse. Der kan også anvendes andre myelom-30 celler, f.eks. P3-NSl-l-Ag4-l, NSl-Ag4/l, P3-X63-Ag8, (MPCH-45, 6.TGI.7), SP2/0-Agl4, FO, X-63-Ag8.6.5.3 , 210.RCY3.Agl,2,3, S194/5XXO.BU.1, SKO-007 og GM15006TG--A12.

Polyethylenglyco1 med en gennemsnitlig mole-35 kylevægt på 1000-4000, f.eks., kan med fordel anvendes som fusionspromotor. Der kan også anvendes andre kend- 8 DK 166627 B1

O

te fusionspromotorer, såsom Sendai-virus. I de følgende eksempler anvendes polyethylenglycol med en gennemsnitsmolekylevægt på 1540.

(D) Påvisning af sammensmeltede celler 5 En blanding af sammensmeltede celler, ikke- -sammensmeltede miltceller og ikke sammensmeltede myelom-celler fortyndes i en separat beholder (såsom en mikro-titerplade) med et selektivt medium, hvori de ikke-sam-mensmeltede myelomceller ikke kan overleve, og dyrkes i 10 tilstrækkelig lang tid til, at de ikke-sammensmeltede celler dør (ca. 1 uge). Dyrkningsmediet kan være et, der er resistent over for et præparat, såsom 8razagua-nin, og hvori de ikke-sammensmeltede myelomceller ikke kan overleve, f.eks;: det ovennævnte HAT-medium. I det 15 selektive medium dør de ikke sammensmeltede myelomceller. Eftersom de ikke-sammensmeltede miltceller er ikke-tumorale, dør de efter et vist tidsrum (ca. 1 uge).

På den anden side kan sammensmeltede celler overleve i det selektive medium, fordi de både har de oprindelige 20 myelomcellers tumorbærende karakter og de oprindelige miltcellers natur.

(E) Bestemmelse af antistof mod human g^-PI i hver beholder

Efter at hybridomcellerne er påvist som anført 25 ovenfor, opsamles overfasen over dyrkningsvæsken og screenes for antistof mod human c^-PI ved hjælp af enzymbundet immunsorbentanalyse [jfr. f.eks. A.H.W.M.

Schuurs og B.K. van Weemen, Clin. Chim. Acta 81, 1-40 (1977)].

30 (F) Udvælgelse af et hybridom, der kan producere et antistof med aktivitet på human ou-PI Overfasen over dyrkningsvæsken, der fås ved dyrkning af hybridomet, der producerer antistof mod human a2~PI, koncentreres og inkuberes med human c^-PI i 35 et bestemt tidsrum. Der tilsættes plasmin til blandingen, og denne anbringes på en fibrinplade. Arealet af 9 DK 166627 B1

O

opløst fibrin måles. På denne måde udvælges et hybridom, der kan producere et antistof med aktivitet over for human a2~PI.

(G) Kloning af hybridomet, der kan producere det 5 ønskede antistof

Hybridomet, der kan producere det ønskede antistof, kan klones på en hvilken som helst passende måde, såsom en begrænset fortyndingsmetode på to forskellige måder. Ved den ene dyrkes hybridomet i et passen-10 de medium i et bestemt tidsrum, og det monoklone antistof, der produceres af hybridomet, kan fås fra dyrkningsvæskens overfase. Ved den anden kan hybridomet injiceres intraperitonealt i en syngenisk mus. Efter et bestemt tidsrum kan det monoklone antistof, der pro-15 duceres af hybridomet, fås fra værtsdyrets blod og a-scitesvæske..

Det herved fremkomne monoklone antistof er y-derst specifikt over for human a2-PI 0<Z vir^er således, at det specifikt blokerer det reaktive sted i human 20 cc2-PI, dvs. det sted i human o^-PI, som inhiberer plas-mins fibrinolytiske aktivitet, og undertrykker den iboende virkning i human c^-PI' ^er inhiberer plasmins fibrinolytiske aktivitet.

I den foreliggende beskrivelse med krav bety-25 der udtrykket "blokerer det reaktive sted" tilføjelsen eller kombinationen af det monoklone antistof på eller med det reaktive sted i human a2-PI på en sådan måde, at det monoklone antistof genkender selve det reaktive sted eller en hvilken som helst af human c^-PI's epito-30 per, så at det reaktive sted herved mister sin aktivitet.

Man mener, at det monoklone antistof ifølge opfindelsen, ligesom andre antistoffer, i sin variable region har et antigenbindende sted, der kan udføre den ovennævnte funktion.

35 Det fremkomne monoklone antistof spaltes ved hjælp af Porter's metode [jfr. R.R. Porter, Biochemical 10 DK 166627 B1

Journal 73, 119-126 (1959)] ved hjælp af papain, et pro-teolytisk enzym, og der isoleres en delstruktur omgivet af en stiplet linie i tegningens fig. 1 og mærket "Fab".

Det monoklone antistofs delstruktur Fab under-5 søges på en fibrinplade*, for hvorledes det fungerer med hensyn til at undertrykke human c^-PI's aktivitet til inhibering af plasmins fibrinolytiske aktivitet. Dette fører til den konstatering, at endog delstrukturen Fab alene i det monoklone antistof har den funktion, at 10 det specifikt undertrykker human c^-PI's inhiberende virkning på plasmins fibrinolytiske aktivitet.

Ifølge endnu et aspekt af opfindelsen angår denne derfor et monoklont antistoffragment ifølge opfindelsen, som er ejendommeligt ved, at det omfatter i det mindste 15 FAB-regionen af det monoklone antistof. Et sådant fragment omfatter f.eks. ikke blot et papainspaltet fragment, men også andre fragmenter, der indeholder Fab-regionen, og som fås efter spaltning med trypsin, plasmin, etc.

Trypsin- og plasmin-spaltningsstederne er vist med pi-20 le i tegningens fig. 1.

Det monoklone antistof ifølge opfindelsen eller det Fab-holdige fragment, fremstillet som ovenfor, kan anvendes til at bestemme a^-PI i en biologisk prøve såsom en human plasmaprøve, fordi det har den funktion, 25 at det specifikt blokerer det reaktive sted i human c^--PI. En tidligere kendt metode til prøvning af o^-PI er en immundiffusionsmetode, der indebærer anvendelse af et antisrum mod human c^-Pl [N. Aoki og I. Yamanaka,

Coinica Chimica Acta 84, 99-105 (1978)]. Ved en anden 30 metode tilsættes overskud af plasmin til analyseprøven, og man måler aktiviteten af det tiloversblevne plasmin, der ikke er bundet til c^-PI [A.C. Tiger-Nilsson m.fl.,

Scand. J. Clin. Lab. Invest. 37, 403-409 (1977)].

35 11 DK 166627 B1

Ved udførelse af den første metode er det y-derst vanskeligt at få et antisesum med en konstant aktivitet, fordi antiserummet er af animalsk oprindelse.

Man må derfor gøre sig den ulejlighed at korrigere an-5 tiserummets aktivitet ved hjælp af et standardstof.

Den har også den ulempe, at der kræves lang tid til immundiffusion. Ved den sidste metode måles mængden af human o^-Pl indirekte ved at måle mængden af tiloversblevet plasmin. Den er derfor underkastet virkningerne 10 af forskellige plasminaktivitetsinhiberende stoffer, der findes i analyseprøven, og man kan ikke undgå eventuelle fejl i den mængde human c^-plasmin, der måles indirekte.

Det må- endvidere også påses ved denne metode, at det anvendte plasmin er rent og stabilt.

15 I modsætning hertil har det ifølge den forelig gende opfindelse vist sig, at mængden af human c^-PI i opløsning kan bestemmes immunologisk direkte og nøjagtigt ved hjælp af den såkaldte "sandwich-metode” , ved hvilken der anvendes det monoklone antistof eller et 20 Fab-holdigt fragment heraf ifølge opfindelsen.

Ved endnu et aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes derfor en metode til immunologisk bestemmelse af en human c^-plasmininhibitor i en analyseprøve ved hjælp af et primært antistof fikseret på 25 en uopløselig fast bærer og et mærket sekundært antistof (den såkaldte "sandwich-metode"), hvor det primære og det sekundære antistof er anti-human-o^-plasmininhi-bitorantistoffer eller fragmenter deraf indeholdende Fab-regionen, hvor de to antistoffer specifikt genkender og 30 kombineres med forskellige epitoper i human a2“Plasiain;i-n“ hibitoren, og et af dem er det monoklone antistof eller et Fab-regionholdigt fragment der ifølge opfindelsen.

I reglen kaldes en metode til bestemmelse af forekomst eller fravær af et antigen eller måling af 35 mængden heraf ved hjælp af antistoffer, der kombinerer med to forskellige steder i antigenet, "sandwich-meto- DK 166627 B1 12

O

den" og findes beskrevet f.eks. i Wide's Radioimmunoassay Methods, 199-206 (1970).

Den immunologiske analysemetode ifølge opfindelsen er karakteriseret ved anvendelse af anti-human-5 -c^-Pl-antistoffer, som specifikt genkender og kombineres med human-o^-PI1 s forskellige epitoper, som de to antistoffer (primært og sekundært antistof) og ved somdet ene af disse antistoffer at anvende det monoklone antistof ifølge opfindelsen, som specifikt blokerer 10 det reaktive sted i human c^-PI· Ved fremgangsmåden i-følge opfindelsen kan der også anvendes et fragment af det monoklone antistof ifølge opfindelsen, der i det mindste indeholder en Fab-region med et antigenbindingssted (variabel region). Følgelig skal det bemærkes, at 15 medmindre andet er anført^ betegner udtrykket "antistof" anvendt i den foreliggende beskrivelse også dets fragment indeholdende i det mindste Fab-regionen.

Således kan man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen altid bestemme human c^-PI ^ °plØsn;i-n9/ f.eks. i 20 en plasmaprøve, meget nøjagtigt uden nogen forskel med hensyn til kvaliteten af det anvendte reagens. Eftersom mængden af human c^-PI måles direkte, påvirkes fremgangsmåden overhovedet ikke af fremmede materialer, og man kan bestemme human c^-PI nøjagtigt i løbet af kort tid.

25 Følgelig udgør den foreliggende opfindelsen en ny fremgangsmåde til nøjagtig og hurtig bestemmelse af human a2-PI.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fikseres det ene (primære) af to antistoffer på en uopløselig fast 30 bærer, og det andet (sekundære) antistof anvendes i mærket tilstand. Det monoklone antistof ifølge opfindelsen kan anvendes som primært antistof fikseret på den uopløselige faste bærer eller som det mærkede sekundære antistof. I begge tilfælde bliver resultaterne af bestemmel-35 sen af human c^-PI i det væsentlige ikke påvirket.

o DK 166627 Bl 13

Antx-human“a2~Pl-antistoffet, der skal anvendes kombineret med det monoklone antistof ifølge opfindelsn, kan være monoklont eller polyklont, hvis det kan genkende og kombineres med et sted i human der ikke er 5 det reaktive sted. I reglen er det bedst at anvende et monoklont antistof, som specifikt genkender og kombineres med et sted i human a2~PI, som ikke er det reaktive sted, og udskilles af et hybridom, der fås som biprodukt under fremstillingen af det monoklone antistof ifølge 10 opfindelsen.

Det primære antistof kan fikseres på den uopløselige faste bærer ved i og for sig kendte metoder. Således bringes en opløsning af det primære antistof og den uopløselige faste bærer i berøring med hinanden og hen-15 står, hvorved antistoffet adsorberes fysisk på bæreren.

Det er også muligt at kombinere de funktionelle grupper i antistoffet, såsom en carboxyl-, amino- eller hydroxyl-gruppe, kemisk med den opløselige faste bærer. Fortrinsvis er overfladen af bæreren, hvortil det primære anti-20 stof er fikseret, overtrukket med en passende substans, såsom okeseserumalbumin, for at undgå ikke-specifik kombination med det sekundære antistof i analyseprøven.

Eksempler på den opløselige faste bærer, der anvendes til fiksering af det primære antistof, omfatter 25 polymere materialer, såsom polystyren, polyethylen, polypropylen, polyestere, polyacrylonitril, fluor-holdige harpikser, nitrocellulose, tværbundet dekstran, polysac-charider og agarose, uorganiske materialer, såsom glas og metal og kombinationer af disse. Den faste bærer kan 30 have forskellige former, f.eks. udformet som en bakke, kugle, fiber, partikel, perle, plade, stang, beholder, celle og reagensglas. Særlige eksempler på uopløselige faste bærer er plastbeholdere, plastperler, glasperler og metalpartikler.

35 Det sekundære antistof mærkes med radioisotoper, enzymer eller luminiscerende stoffer. Eksempler på ra- DK 166627 B1 14

O

j. , 125T 131_ 14^ 3TT . e dioxsotoper er I, I, C og H. Eksempler pa enzymer er alkalisk phosphatase, peroxidase og β-D-galac-tosidase. Eksempler på luminiscerende stoffer er fluore-sceinisothiocyanat og tetramethyl-rhodamin-isothiocyanat.

5 Disse er kun nævnt belysende, og der kan også anvendes andre mærkestoffer til immunologisk analyse. Kombination af mærkestofferne med det sekundære antistof kan ske ved i og for sig kendte metoder, f.eks. som beskrevet af G.

S. David, Biochem. Biophys. Res. Commun. 48, 464-471 10 (1972), M. Imagawa m.fl., Anal. Lett. 16, 1509-1523 (1983) og M. Nishioka m.fl.. Cancer Res. 32, 162-166 (1972)].

Det fikserede primære antistof og det mærkede sekundære antistof bringes derpå i kontakt med en analyseprøve til bestemmelse af human a2-PI ved hjæ^P af en 15 to-trinsmetode, ved hvilken prøven først bringes i be røring med det fikserede primære antistof og derpå med det mærkede sekundære antistof, eller ved en et-trins-metode, ved hvilken prøven og det sekundære antistof samtidig bringes i berøring med det primære antistof.

20 Et-trinsmetoden er imidlertid mere fordelagtig end totrinsmetoden, fordi den tillader en enklere og hurtigere bestemmelse af human c^-PI.

Ved to-trinsmetoden bringes det fikserede primære antistof og prøven først i berøring og omsættes 25 ved en bestemt temperatur i et bestemt tidsrum. I løbet af dette tidsrum kombineres det fikserede primære antistof med human o^-PI'et i prøven. Efter vask med en passende vaskevæske bringes reaktionsproduktet i berøring med og omsættes med en opløsning (f.eks. en 30 vandig opløsning) af det mærkede sekundære antistof ved en bestemt temperatur i et bestemt tidsrum. Reaktionsproduktet vaskes med en passende vaskevæske, og mængden af mærkestof, der findes på den uopløselige faste bærer, måles. Mængden af human o^-PI i prøven 35 kan bestemmes ved at sammenligne mængden af mærkestoffet med en kalibreringskurve, der er tegnet ved hjælp DK 166627 Bl 15

O

af en analyseprøve, der indeholder human a2-PI 1 en kendt koncentration.

Ved et-trinsmetoden bringes det fikserede primære antistof i berøring og omsættes med analyseprøven 5 og samtidig med det mærkede sekundære antistof, fortrinsvis med en blanding af prøven og det mærkede sekundære antistof ved en bestemt temperatur i et bestemt tidsrum. Derpå vaskes produktet med en passende vaskevæske, og den mængde mærkestof, som findes på den uop-10 løselige faste bærer, måles som beskrevet ovenfor. På denne måde kan mængden af human c^-PI *· en Pr^ve bestemmes .

Ifølge de to ovenfor beskrevne fremgangsmåder kan mængden af human i analyseprøven let måles 15 med god reproducerbarhed og med stor nøjagtighed. Humanplasma, humanserum og en væskeoverfase fra en cellekultur er eksempler på en prøve, der kan analyseres ved hjælp af de ovennævnte metoder.

Ved udøvelsen af den ovennævnte metode giver 20 den foreliggende opfindelse et reagenssystem, der omfatter det primære antistof fikseret på den uopløselige faste bærer og det mærkede sekundære antistof. Der kan fremstilles et sæt ud fra dette reagenssystem og forskellige hjælpemidler, så at reagenssysternet kan anven-25 des let og effektivt. Eksempler på hjælpemidlerne omfatter opløsningsmidler til opløsning af det faste sekundære antistof, vaskemidler til vask af den uopløselige bærer, substrater til måling af enzymaktiviteten hos enzymer, der kan anvendes som mærkestoffer til det sekundære 30 antistof, og reaktionsafbrydere dertil, som normalt anvendes i reagenssæt til immunologisk analyse.

Anvendelsen af det monoklone antistof eller dets Fab-holdige fragment ifølge opfindelsen muliggør en nøjagtig og let bestemmelse af human (^-PI ^ analyseprøven 35 med god reproducerbarhed ved anvendelse af "latex-agglu-tineringsmetoden".

DK 166627 B1 16

O

"Latex-agglutineringernetoden" er en metode, ved hvilken et antistof bindes kemisk og fysisk til en immunologisk inaktiv syntetisk harpiks og den syntetiske harpiks agglutineres ved et opløseligt antigen.

5 Ved den foreliggende opfindelse udføres den ved at bringe et primært antistof og et sekundært antistof fikseret samtidig på fine partikler af samme uopløselige bærer eller separat på fine. partikler af forskellige uopløselige bærere i berøring med en analyseprø-10 ve i et flydende medium og påvise ændringer, der kan forekomme ved agglutinering af partiklerne.

Som primært og sekundært antistof, der skal fik-seres på de uopløselige fine bærerpartikler, anvendes anti-human ct2“PI-antistoffer, som specifikt genkender 15 og kombineres med forskellige human c^-PI-epitoper som ved "sandwich-metoden", der er beskrevet ovenfor, og et af disse antistoffer er det monoklone antistof ifølge opfindelsen, som specifikt blokerer det reaktive sted i human a2-PI.

20 Den uopløselige bærer, hvortil det primære og det sekundære antistof er fikseret, kan passende være et immunologisk inaktivt, uopløseligt stof, fortrinsvis polymere, siliciumoxid, aluminium oxid eller metaller.

Særlig egnede uopløselige bærere har tilnærmelsesvis 25 samme vægtfylde som det flydende medium, der anvendes ved fremgangsmåden. Passende fine partikler har en partikeldiameter på i reglen 0,05-10^umeter, fortrinsvis 0,2-2yUm, og partikeldiametrene er fortrinsvis så ensartede som muligt.

30 Fiksering af det primære og det sekundære an tistof på uopløselige bærerpartikler kan ske ved fysisk adsorption eller kemisk binding som ved den ovenfor beskrevne sandwich-metode. Det primære og det sekundære antistof kan fikseres samtidig på fine partikler af 35 samme bærer, så at de to antistoffer forekommer i den 17 DK 166627 B1 o samme bærer, eller de kan fikseres på fine partikler af forskellige bærere.

Ved bestemmelse af human «2“ΡΙ * en analyseprøve ved hjælp af fikseret primært og sekundært antistof, 5 bringes disse primære og sekundære antistoffer i berøring med prøven i et flydende medium ved en bestemt temperatur. Som følge heraf reagerer det primære og det sekundære antistof med ctj-PI# og bærerpartiklerne, hvortil disse antistoffer er fikseret, agglutinerer sammen 10 ved o^-PI's mellemkomst og vokser. Ved at påvise ændringer, der forekommer ved agglutinering af disse partikler, og sammenligne dem med en kalibreringskurve , der er fremstillet ved hjælp af en prøve med kendt koncentration, kan mængden af human o^-PI * PrØven bestem-15 mes.

Ændringer på grund af partiklernes agglutinering kan påvises som ændringer i lystransmissionen gennem væskemediet eller ændringer i selv-fluorescering, der dannes ved anvendelse af ultraviolet lys. Således 20 kan mængden af human c^-PI i analyseprøven bestemmes ved at måle væskemediets lystransmission efter forløbet af et bestemt tidsrum eller den tid, der går, indtil en forudbestemt transmission nås, og sammenligne den målte værdi med en kalibreringskurve (standardkurve) frem-25 stillet i forvejen.

En hvilken som helst væske, der er blandbar med analyseprøven, kan anvendes som væskemedium ved o-vennævnte fremgangsmåde. I reglen er fysiologisk saltvandsopløsning, phosphatpufret saltvandsopløsning, Tris-30 pufret saltvandsopløsning egnede som væskemedium. Ef ter behov kan der tilsættes glycin, albumin, natriuma-zid etc. til væskemediet. Koncentrationen af de fine bærerpartikler, hvorpå der er fikseret primært og sekundært antistof, i det flydende medium er i reglen 35 0,002 til 10, fortrinsvis 0,02-2%. Forholdet mellem fikseret primært antistof og fikseret sekundært antistof DK 166627 B1 18

O

ligger i reglen fra 0,01 til 100, fortrinsvis fra 0,1 til 10.

Opfindelsen angår også et reagenssystem til brug ved ovennævnte målemetode. Principielt omfatter 5 dette reagenssystem et primært og et.sekundært antistof fikseret samtidig på fine partikler af samme uopløselige bærer eller separat på fine partikler af forskellige uopløselige bærerej og efter behovet kan de kombineres med et vaskemiddel, en reaktionsafbryder, en fortyn-10 dingsvæske, en standardsubstans etc., så at de udgør et reagenssæt.

De uopløselige fine bærerpartikler, hvorpå det primære antistof og/eller det sekundære antistof er fikseret, kan lyophiliseres til et pulver, eller de 15 kan inkorporeres i form af en suspension i det ovennævnte flydende medium i reagenssystemet.

Det monoklone antistof eller et Fab-region-hol-digt fragment deraf ifølge opfindelsen kan også anvendes til fraskillelse eller udvinding af human o^-PI 20 fra en væske indeholdende human c^-PIf fordi det har den virkning, at det specifikt blokerer human o^-PI's reaktive sted.

Ved endnu et aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes et selektivt adsorbens til human 25 c^-PI, omfattende en uopløselig fast bærer og det monoklone antistof eller et Fab-region-holdigt fragment deraf ifølge opfindelsen fikseret derpå, og en fremgangsmåde til fraskillelse eller udvinding af human o^-Pl ^ra en væske indeholdende human c^-PI, ved hvilken væsken, 30 der indeholder human a2~PI, bringes i kontakt med det ovennævnte selektive adsorbens til adsorbering af human a2-PI på adsorbenset, og adsorbenset fraskilles fra væskelog efter behov desorberes human a0-PI'et fra adsorbenset og udvindes.

35 I reglen kaldes chromatografi baseret på ud nyttelsen af et adsorbens1 biologiske affinitet til 19 DK 166627 B1

O

fraskillelse og rensning af et biologisk stof affini-tetschromatografi [Ichiro Chihata, Testsuya Tosa og Yu-shi Matsuo, "Experimental and Applied Affinity Chromatography" (japansk-sproget publikation), Kodansha Co., 5 Ltd.].

Udtrykkene "affinitet", "ligand", "uopløselig fast bærer" og "adsorbens", som de anvendes her, har følgende betydninger:

Affinitet: specifik affinitet mellem to stoffer.

10 Ligand: Et stof med affinitet for et stof, der skal adsorberes eller renses.

Uopløselig fast bærer: En fast understøtning, der er uopløselig i vand (ekskl. ligand).

Adsorbens: Den uopløselige faste bærer, hvortil 15 liganden fikseres.

Herefter vil det selektive adsorbens for human o^-PI og en fremgangsmåde til fraskillelse eller udvinding af human ^-PI fra en væske, der indeholder human c^-PI, ifølge opfindelsen blive detaljeret beskrevet. .

20

Det monoklone antistof mod human c^-PI eHer et Fab-region-holdigt fragment heraf ifølge opfindelsen bindes kemisk som ligand til en passende uopløselig· bærer (f.eks. "Sepharose") ,' og bæreren pakkes derpå til en 25 kolonne. Kolonnen bringes derpå i ligevægt med en passende puffer (f.e-s. 50 mmolær Tris-puffer, pH 7,4, 0,15 molær NaCl). En væske indeholdende human o^-PI, der skal behandlesj (såsom en humanplasma- eller serumprøve) tilsættes til det fremkomne adsorbens for at ad-30 sorbere human c^-PI P® adsorbenset. Urenheder fjernes derpå fra adsorbenset med en passende vaskeopløsning (f.eks. 50 mmolær Tris-puffer, pH 7,4, 0,15 molær NaCl).

Derpå måles en mængde human c^-PI ·* en fraktion, som har passeret gennem kolonnen ("gennemløbsfraktion") og 35 en fraktion, som er blevet udvasket fra kolonnen ("vasket fraktion"). Ud fra de målte værdier kan graden 0 20 DK 166627 B1 af fraskillelse af human a2-PI ud fra prøvevæsken beregnes .

Der kan anvendes forskellige stoffer som uopløselig fast bærer, der anvendes i det selektive adsor-5 bens ifølge opfindelsen. Fortrinsvis består den f.eks. af agarose, polyacrylamid, cellulose, dekstran, malein-syrepolymer eller en blanding heraf. Den uopløselige faste bærer kan foreligge i forskellige former, f.eks. som et pulver, granulat, pellets, perler, film eller 10 fiber.

Fiksering af det monoklone antistof eller et fragment heraf på den uopløselige faste bærer sker i reglen ved kemisk at binde det til bæreren. Således kan dette foregå ved at aktivere "Sepharose" ved ind-15 virkning af CNBr og fiksere antistoffet derpå [R. Axén m.fl·., Nature 214, 1302-1304 (1967)].

Når adsorbenset, hvorpå der er adsorberet human a2-PI, ved kontakt med væsken, der indeholder human o^-PI, adskilles fra væsken, kan den human o^-PI, der 20 forekommer i væsken, fjernes. Hvis der som væske anvendes humanplasma eller -serum, kan der fås humanplasma eller -serum hovedsagelig uden human a2-PI. Sådant human c^-PI-frit humanplasma eller -serum kan med fordel anvendes til f.eks. plasma- eller serum-udskiftningsterapi.

25 Adsorbenset, hvorpå der er adsorberet human a2~ -PI, og som er fraskilt fra analysevæsken, kan underkastes desorptionsbehandling for at eluere human a2-PI fra adsorbenset og udvinde den. Den udvundne human a2~PI ^an f.eks. anvendes som supplement ved medfødt c^-PI-mangel-30 sygdom og leversygdomme eller som hæmostat. Desorptions-behandlingen kan udføres ved at behandle adsorbenset, hvorpå der er adsorberet human a2~PI, med et eluerings-middel. En vandig opløsning af ethylenglycol med pH 2,5-12,5, fortrinsvis 5,0-11,5, kan med fordel anvendes 35 som elueringsmiddel. Andre eksempler på elueringsmid-del, der kan anvendes ved opfindelsen, omfatter en van- DK 166627 B1 21

O

dig glycerolopløsning, en vandig glycinopløsning, en vandig propionsyreopløsning, en vandig thiocyanatsaltop-løsning og en vandig guanidinopløsning.

Ethylenglycolkoncentrationen i den vandig opløs-5 ning er bedst 20-80, fortrinsvis 40-60%. Til pH-juste-ring kan den vandige opløsning omfatte passende pH-justerende midler, f.eks. hydroxider, såsom natriumhydroxid eller kaliumhydroxid, salte, såsom Tris-salte, phosphat-salte eller "Veronal"-salt, syrer, såsom saltsyre, salpe-10 rersyre, eddikesyre, citronsyre og oxalsyre, aminer, såsom ethanolamin, ammoniak eller urinstof. Desorptions-behandlingen udføres ved en temperatur over frysepunktet, men -ikke over 37°C, fortrinsvis ved 2-10°C. Desorptions-behandlingen udføres ved en kolonnemetode, en portions-15 metode etc. Den tid, der er nødvendig til eluering, er helst kort, men den kan være op til ca. 2 dage.

Fra eluatet, der indeholder den eluerede human θ2”ΡΙ, kan human c^-PI fras^iHes °9 renses ved i og for sig kendte metoder, f.eks. ved dialyse, koncentrering 20 eller væskechromatografi.

Som anført ovenfor har det monoklone antistof eller et Fab-region-holdigt fragment heraf ifølge opfindelsen den funktion, at det specifikt blokerer det reaktive sted i human c^-PI, dvs. det sted i human o^-25 -PI, som inhiberer plasmins fibrinolytiske aktivitet, og at det undertrykker human c^-PI's inhiberende virkning på plasmins fibrinolytiske virkning. Hvis derfor det monoklone antistof eller dettes fragment indgives til en patient, hvor plasmins fibrinolytiske akti-30 vitet inhiberes ved indvirkning af human α2_ΡΙ, og der dannes thrombe i karret, blokeres human c^-PI's inhiberende virkning, og plasmin kan virke direkte på throm-ben og opløse den. Den virkning ved det monoklone antistof eller dettes fragment ifølge opfindelsen, at 35 det fremmer thrombefibrinolyse, kan f.eks. fastslås ved følgende to in vitro-prøver. Den første af disse DK 166627 B1 22

O

prøver en en lyseprøve i et renset system ved hjælp af en fibrinplade, og den anden er en lyseprøve på thrombe fremstillet ved hjælp af plasma eller blod. Ved den første prøve måles arealet af den fibrinplade, der er 5 opløst af plasmin i nærvær af human a2-EI og i nærvær af human c^-PI °9 ^et mon°klone antistof eller dettes fragment ifølge opfindelsen og sammenlignes med arealet af en fibrinplade, der kun er opløst ved tilstedeværelse af plasmin. Ved den anden prøve koaguleres hu-10 manplasma eller -blod med thrombin, og den koagulerede klump suspendes i humanplasma eller -blod, hvortil der er tilsat monoklont antistof eller dettes fragment ifølge opfindelsen. Den tid, der går, indtil den koagulerede klump opløses, sammenlignes med den tid, der går 15 ved anvendelse af normalt humanplasma eller -blod.

Det er blevet bekræftet, som det vil blive detaljeret beskrevet i eksemplerne, ved begge disse prøver, at fi-brinpladen eller den koagulerede klump let og hurtigt opløses i nærvær af det monoklone antistof eller dettes 20 fragment ifølge opfindelsen.

Det monoklone antistof eller et Fab-region-hol-r. digt fragment heraf ifølge opfindelsen kan derfor anvendes til behandling af human thrombosesygdomme, herunder myocardieinfarkt, cerebral infrakt, veneobstruktions-25 sygdomme og arterieobstruktionssygdomme.

Det monoklone antistof eller dettes fragment ifølge opfindelsen kan indgives parenteralt, fortrinsvis intravenøst. Dosis varierer afhængigt af patientens køn, alder, tilstand, legemsvægt etc. Generelt kan dosis lig-30 ge på ca. 0,01 til ca. 10 mg/kg legemsvægt pr. dag som en mængde, der er effektiv til at opløse thromber, en eller flere gange daglig. Alt efter lægens skøn kan der naturligvis indgives højere doser.

Det monoklone antistof eller dettes fragment 35 kan tilberedes i en form, der er egnet til indgift, f. eks. en injicerbar opløsning, som drop, en lyophilise- 23 DK 166627 B1

O

ret pulver, sammen med en pharmaceutisk acceptabel bærer eller fortyndingsmiddel. Eksempler på pharmaceutisk acceptable bærere eller fortyndingsmidler kan nævnes vand, puffere, blod-isotoneringsmidler, stabilisatorer (f.eks.

5 humanplasmaalbumin, mannitol) og human-antistoffer eller fragmenter heraf. En injicerbar opløsning eller et drop kan fremstilles ved at opløse det monoklone antistof eller dettes fragment ifølge opfindelsen i fysiologisk saltvandsopløsning i en koncentration på 0,001^ug/ml til 10 100 ng/ml og efter behov yderligere tilsætte 0,01 molær natriumphosphat som puffer og 1% mannitol og 0,1% human-serumalbumin som stabilisatorer. Koncentrationerne af de yderligere midler kan varieres. Efter behov kan der tilsættes et humanantistof eller fragment heraf. Den in-15 jicerbare opløsning eller droppet kan fremstilles i form af en opløsning eller en lyophiliseret form. Det lyophi-liserede produkt kan opløses i et medium som rent vand før brug. Den injicerbare opløsning, droppet, et lyophiliseret produkt deraf og en opløsning af dette bør 20 fremstilles og opbevares aseptisk.

Opfindelsen vil i det følgende bliver forklaret nærmere ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1

25 (1) Fremstilling af human ot^-PI

Ifølge Aoki og Moroi's metode ovenfor fås 7,7 mg human o^-PI ud fra 2.360 ml humanplasma.

(2) Immunisering af mus

Balb/c hanmus immuniseres intraperitonealt med 30 en emulsion af 100^,ug human c^-plasmininhibitor og komplet Freund's adjuvans to gange med 21 dages mellemrum.

7 Dage og 88 dage senere indgives yderligere 30^ug human a2~PI intravenøst. Fire dage efter den sidste immunisering isoleres miltceller til cellefusion.

35 DK 166627 B1 24

O

(3) Fremstilling af miltcellesuspension Miltcellerne udtages aseptisk og passeres gennem en rustfri stålsigte, så at der fås en suspension af miltcellerne. Cellerne overføres til RPMI-1640-me- 5 dium (et produkt fra Gibco) suppleret med 0,39 g/liter L-glutamin, 0,2 g/liter kanamycinsulfat og 2,0 g/liter NaHCO^. Cellerne, som formeres, vaskes tre gange med RPMI-1640 og suspenderes igen i RPMI-1640-medium.

(4) Fremstilling af myelomceller 10 Musemyelomceller, P3-U1, dyrkes i RPMI-1540-me- dium suppleret med 0,39 g/liter L-glutamin, 0,2 g/liter kanamycinsulfat, 2,0 g/liter NaHCO^ og 10% kalvefoster-serum (forkortes 10% FCS-RPMI-1640). På cellefusions-tidspunktet foreligger myelomcellerne i cellefissionens 15 logaritmiske fase.

(5) Cellefusion

Miltcellerne og myelomcellerne suspenderes i forholdet 10:1 i serum-fri RPMI-1640-medium og centrifugeres derpå ved ca. 200 G i 5 minutter. Væskeover-20 fasen fjernes, og sedimentet inkuberes sammen med 1 ml [50%:s opløsning af polyethylenglycol med en gennemsnitsmolekylevægt på 1540 (pH 8,2)] ved 37°C i 2 minutter.

Derpå tilsættes 9 ml serumfrit RPMI-1640 medium, og cellerne suspenderes igen omhyggeligt i 5 minutter. Sus-25 pensionen centrifugeres i 5 minutter ved ca. 200 G og suspenderes atter i 10% FCS-RPMI-1640-medium, så at der g fås en koncentration på 8 x 10 celler/ml. Suspensionen fordeles derpå på en 96-hullers mikroplade (ca. 100 ^uliter pr. hul). De sammensmeltede celler dyrkes ved 30 37°C ved hjælp af 5% C02.

(6) Udvælgelse og dyrkning af sammensmeltede celler, der kan producere antistof mod human a^-PI

En dag efter cellefusion tilsættes HAT-medium i en mængde på lOO^uliter pr. hul. Derefter udskiftes 35 halvdelen af dette medium med 2 dages mellemrum med en frisk tilførsel af HAT-medium, og dyrkningen fortsættes.

DK 166627 B1

O

25 8 dage senere screenes overfasen på hybridomceliernes dyrkningsvæske for antistoffer mod human c^-PI ved hlælp af enzymbundet immunsorbensanalyse (ELISA). Antigenet, der anvendes til screeningen, er human α2~ΡΙ, og det an-5 det antistof er alkaliphosphacase-konjugeret kanin-anti-muse-antistoffer.

I alt 349 huller viser sig at være positive ved ELISA og altså at producere antistoffer mod o^-PI.

Når man kan se, at formeringen af cellerne er 10 aktiv, tilsættes HT-medium. Mediet udskiftes med HT-me-dium fire gange med en dags mellemrum. Derefter foretages dyrkningen ved hjælp af almindeligt 10% FCS-RPMI--164O-medium.

15 Eksempel 2

Udvælgelse af sammensmeltede celler, der producerer antistoffer mod human g^-PI

De sammensmeltede celler, der producerer antistoffer mod human i^-Pl screenes ved hjælp af følgende 20 metode for celler, der har den virkning, at de undertrykker human c^-PI’s fibrinolyse-inhiberende virkning.

De sammensmeltede celler i hvert hul dyrkes i 10% FCS-RPMI-1640-medium, indtil antallet af celler har 7 nået ca. 2 x 10 . Cellerne centrifugeres derpå ved ca.

25 200 G i 5 minutter. Væskeoverfasen fjernes, og celler ne vaskes med 10 ml serumfrit RPMI-1640-medium og centrifugeres yderligere ved ca. 200 G i 5 minutter. Væskeoverfasen fjernes, og cellerne suspenderes i 10 ml blandet serumfrit medium (forkortet til "Mites-medium") 30 sammensat af RPMI-1640-medium suppleret med 5,0 ml/liter 2-mercaptoethanol, 7,5 ml/liter insulin, 5,0 ml/liter transferrin, 5,0 ml/liter ethanolamin, 5,0 ml/liter na-triumselenit, 0,39 g/liter L-glutamin, 0,2 g/liter kana-mycinsulfat og 2,38 g/liter "Hepes, Dulbecco’s MEM" og 35 "Ham's F-12" (2:1:1) og dyrkes i 3 dage.

DK 166627 B1 26

O

Overfasen på dyrkningsvæsken udvindes og koncentreres 25 gange. Til 25^,uliter koncentrat tilsættes 0,4^ug human , og blandingen inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Derpå tilsættes 0,025 enhed plas-5 minogen og 0,031 enhed urokinase, og hele opløsningens volumen justeres til 40yUliter. 10yUliter heraf anbringes på en fibrinplade, som henstår ved 37°C og en fugtighed på mere end 95% i 18 timer, og arealet af opløst fibrin måles.

10 Resultaterne viser, at den fibrinolyse-inhibe- rende aktivitet hos human o^-PI tilsat til de antistoffer, der er produceret af lDlO-sammensmeltede celler, er fuldstændig undertrykt.

15 Eksempel 3

Kloning af sammensmeltede celler De sammensmeltede celler (1D10), som findes positive ved prøven for aktivitet hos antistofferne mod human a2~PI, klones ved hjælp af følgende metode: 20 1D10-Cellerne fortyndes, så at hvert hul i en 96-hullers mikrotiterplade indeholder 0,9 celle. Der tilsættes thymusceller fra Balb/c-mus som fødeceller og disse fordeles på pladen og dyrkes i 10% FCS-EPMI--1640-medium. Mikroskopisk iagttagelse viser nøjag-25 tigt de enkelte cellerkolonier, der dannes. De sammensmeltede cellers dyrkningsvæskeoverfase screenes ved hjælp af ELISA-prøven for antistoffer mod human c^-PI.

Rensning af monoklone antistoffer

For at kunne producere store mængder monoklo- 7 30 ne antistoffer mod human aPI injiceres ca. 10 sammensmeltede celler intraperitonealt i Balb/c-mus, der i forvejen er behandlet med pristan. Ca. 1 uge senere isoleres antistofferne fra ascitesvæsken og renses ved hjælp af Ey m.fl.'s metode [P.L. Ey, S.J. Prowse og C.R. Jenkin, 35 Immunochemistry 15, 429-436 (1978)]. 20 mg monoklone an tistoffer mod human c^-PI u<^ ^ra 2/5 ml ascites væske.

DK 166627 B1 27

O

Karakterisering af de rensede monoklone antistoffer

De særlige klasser rensede monoklone antistoffer bestemmes ved hjælp af Ouchterlony-geldiffusionsprøven ved brug af klassespecifikke antimuse-imimmglobulin-5 antisera. Resultaterne findes i tabel I nedenfor og viser, at mange af antistofferne mod human c^-PI er af H-kæde-Y^-typen og L-kæde-kappa-typen.

Tabel I

10

Antistof I9Gi IgG2a IgM K

1B10C4 + + 1B10G11 + + lDibci + + 13 1D10F10 + + 1D10-1F5 + + 1D10B11 + + 1D10-2H8 + + 20

Eksempel 4

Undertrykkelse af aktiviteten hos human α^-PI med antistoffer mod human a^-PI

l^ug human c^-PI og 5^,ug af hver af de ovenfor 25 anførte monoklone antistoffer opløses i 50^uliter 0,05 molær phosphatpufret fysiologisk saltvandsopløsning (forkortet til PBS) og inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Derpå tilsættes 0,025 enhed plasminogen og 0,031 enhed urokinase, og opløsningens volumen justeres til 60^,uliter.

30 10 ,uliter heraf anbringes på en fibrinplade, som henstår ved 37 C og en fugtighed på mere end 95% i 18 timer, og arealet af opløst fibrin måles. Resultaterne ses i tabel II.

De værdier, der er anført i tabel II, er rela-35 tive værdier, der fås ved at sætte det areal, der er op- DK 166627 B1 28

O

løst med 0,025 enhed plasminogen og 0,031 enhed urokinase, til 100%-

Tabel II

5 Antistof Opløst areal (%) 1D10C1 100 1D10F10 97 1D10-1F5 109 1D10B11 85 10 1D10-2H8 100 1D10-1H2 70 15 Eksempel 5

Virkningen af det monoklone antistof mod human α^-ΡΙ ef- ter kombinering af human α„-ΡΙ med fibrin 125

0,01^umolær med I mærket human c^-PI 0f05 ^umolær monoklont antistof mod c^-PI i^uberes ved 37°C 20 i 30 minutter sammen med 2% okseserumalbumin-0,05 molær Trispuffer (pH 7,4)-0,15 molær NaCl og henstår derpå natten over ved 4°C. Til reaktionsblandingen af antigen/ antistof tilsættes 2,5 mmolær CaC^, 7^,umolær fibrinogen-fraktion og 2 enh,/ml thrombin, og hele blandingens vo-25 lumen justeres til lOO^uliter. Den inkuberes ved 37°C

i 30 minutter. Dannelse af et koaguleret materiale (fi-brinklump) iagttages. 30 minutter senere tilsættes 100 ^uliter 200 mmolær EDTA, og calciumionen fjernes. Derpå udtages det koagulerede materiale ved at vikle det 30 omkring en tynd pind lavet af bambus. Det koagulerede materiale vaskes 3 gange med en vaskevæske af 2% BSA, 0,05 molær Tris-puffer (pH 7,4), 0,10 molær NaCl, 2 mmolær EDTA. Endelig fjernes det koagulerede materiale fra bambuspinden og udvindes i et reagensglas. Det ko-35 agulerede materiales radioaktivitet (cpm) måles derpå.

Det koagulerede materiales radioaktivitet i forhold DK 166627 Bl 29

O

til den oprindelige reaktionsblandings radioaktivitet i hvert tilfælde er vist i tabel III.

I tabel III ses også det resultat, der fås ved anvendelse af almindeligt muse-IgG i handelen anvendt 5 som sammenlignende antistof.

Tabel III

Antistof_% kombination (¾) 1B10C4 14f3 10 1B10G11 16.2 1D10C1 17'4 1D10F10 17 j 8 1D10-1F5 17*1 1D10B11 17^6 15 1D10—2H8 18

Muse-IgG 14^0

Resultaterne viser, at de afprøvede monoklone 20 antistoffer mod human a2-PI er monoklone antistoffer, der ikke genkender human c^-PI’s fibrinbindingssted.

Eksempel 6

Udvælgelse af et monoklont antistof, som genkender human 25 cu-PI's reaktive sted I dette eksempel undersøges virkningen af et monoklont antistof mod human c^-PI efter inaktivering af plasmin med human c^-PI· 0,6^,ug o^-PI og 6,6^,ug monoklont antistof mod 30 o^-PI °plØses i 60yUliter 2% okseserumalbuminopløsning [0,05 molær Tris-puffer (pH 7,4), 0,15 molær NaCl] og inkuberes ved 37°C i 30 minutter efter henstand natten over ved 4°C.

Reaktionsblandingen blandes med 20^uliter plas-35 minopløsning (0,47yUmolær), og 0,05 molær Tris-puffer (pH 7,4) og 0,15‘imolær NaCl, og væskens samlede volumen

O

30 DK 166627 B1 justeres til SOO^uliter. For hvert monoklont antistof fremstilles to prøver af denne blanding, som inkuberes ved 37°C i hhv. 2 minutter og 20 minutter. Derpå tilsættes 200yUliter vandig opløsning af 3,5 mmolær syntetisk 5 substrat S-2251 (H-D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroani-lid-dihydrochlorid), og ved hjælp af et spektrofotometer (Beckman, "DU-8") måles ændringer i absorbens ved en bølgelænge på 405 nm pr. minut. Som kontrol undersøges på lignende måde ændringer i absorbens med hensyn til en 10 prøve, der kommer fra omsætning af plasmin alene og en prøve, der fås ved omsætning af human c^-PI med plasmin uden nærvær af monoklont antistof. Resultaterne ses i tabel- IV.

15

Tabel IV

Absorbensændrinqer (405 nm/min.) 20 -----

Reaktionstid Reaktionstid

Antistof 2 minutter 23 minutter 1B10C4 0,008 1B10G11 0,012 25 - 1D10C1 0;140 0,108 1D10F10 0,145 0,110 1D10-1F5 0,150 0,100 30 1D10B11 0,162 0,109 1D10-2H8 0,150 0,103

Plasmin alone 0,122 0,102

Human a^-PI 0,026 0,005.

+ plasmin 35 DK 166627 B1 31

O

De resultater, der fås i eksemplerne 5 og 6, viser, at de monoklone antistoffer ifølge opfindelsen specifikt genkender det reaktive sted i human o^-PI °9 ikke genkender human c^-PI's plasminbindingssted og fi-5 brinbindingssted.

Eksempel 7

Spaltning med papain af et monoklont antistof, som genkender det reaktive sted i human a.,-PI 10 1 mg af det monoklone antistof 1D10C1, der er beskrevet i det foregående eksempel, og som specifikt genkender det reaktive sted i human c^-PI, opløses i 300 ^,ulit.er opløsning [2 mmolær EDTA, 12,5 mmolær cystein, 50 mmolær Tris-puffer (pH 7,4), 0,15 molær NaCl],og 100 15 .uliter papainopløsning i en koncentration på 1 mg/ml

i O

tilsættes og reagerer ved 37 C i 18 timer.

Reaktionsblandingen væskechromatograferes, og antistoffets Fab-komponent skilles fra. Ved hjælp af SDS-polyacrylamid-gelelektorforese måles dets molekyle-20 vægt under reducerende og ikke-reducerende betingelser.

Det fastslås, at Fab-komponenten er sammensat af et fragment med en molekylevægt på ca. 23.000 fra amino-gruppeendestiliingen i antistoffets tunge kæde, og hele den lette kæde har en molekylevægt på ca. 23.000.

25

Eksempel 8

Undertrykkelse af aktiviteten hos human ou-PI med Fab--komponenten i antistoffet mod human 0U-PI

l^ug human a2-PI °9 3/u9 af hvert af de i ta-30 bel V anførte monoklone antistoffer opløses i 50^,uliter 0,05 molær PBS og inkuberes ved 37°c i 30 minutter. Derpå tilsættes 0,025 enhed plasminogen og 0,031 enhed urokinase, og hele opløsningens volumen justeres til 60yUli-ter. 10 ,uliter heraf anbringes på en fibrinplade, og 35 denne henstår ved 37 C og en fugtighed på over 95%.

Arealet af opløst fibrin måles. Resultaterne ses i ta- DK 166627 B1 32

O

bel V. Værdierne i den følgende tabel er relative værdier, der fås ved at sættes arealet af fibrin opløst med 0,025 erhed plasminogen og 0,031 enhed urokinase som 100%.

5 Tabel V

Antistof Opløst areal (%) 1D10C1 100 1D10C1 Fab 100 10 Endvidere undersøges ved samme metode som i ek sempel 6 undertrykkelsen af aktiviteten hos human o^-PI ved hjælp af Fab-komponenten i dette monoklone antistof.

0,6^,ug (9 picomol) o^-PI og 40 picomol mono-klont antistof mod human c^-PI opløses i 60^,uliter 2% 15 okseserumalbuminopløsning [0,05 molær Tris-puffer (pH 7,4), 0,15 molær NaCl], og dette inkuberes ved 37°C i 30 minutter efterfulgt af henstand natten over ved 4°C.

Reaktionsblandingen blandes med 20^,uliter plas-minopløsning (0,47^umolær), og hele opløsningens volumen 20 justeres til 500yUliter. Derpå tilsættes 200^,uliter vandig opløsning af 3,5 mmolær syntetisk substrat S-2251, og ændringer i absorbens ved en bølgelængde på 405 nm pr. tidsenhed måles med et spektrofotometer (Hitachi "100-50"). Som kontrol undersøges på lignende måde æn-25 dringer i absorbens med hensyn til en prøve, der fås ved at omsætte plasmin alene, og en prøve, der fås ved at omsætte både human c^-PI °9 plasmin. Resultaterne ses i tabel VI.

30 Tabel VI

Antistof Absorbensændringer (405nm/min) 1D10C1 24,8 x 10~5 1D10C1 Fab 26,0 x 10~3

Plasmin alene 24,0 x 10 35 Human a^-PI-plasmin 8,4 x 10 3 DK 166627 B1 33

O

De i eksempel 8 opnåede resultater viser, at det monoklone antistof med en Fab-region ifølge opfindelsen specifikt genkender det reaktive sted i human (*2--PI og undertrykker human c^-PI's fibrinolyse-inhiberen-5 de funktion.

Eksempel 9

Spaltning med pepsin af et monoklont antistof, som genkender det reaktive sted i human a^-PI 10 0,39 mg monoklont antistof 1D10C1, der er be skrevet i det foregående eksempel, og som specifikt genkender det reaktive sted i human c^-PI, opløses i 0,5 ml 0,1 molær natriumacetat (pH 4,6), og der tilsættes 1,0 ml pepsinopløsning (0,1 molær natriumacetat, pH 4,6) med 15 en koncentration på 0,33 mg/ml, og dette omsættes ved 37°C i 14 timer.

Reaktionsblandingen væskechromatograferes, og F(ab')2-komponenten fraskilles. Denne komponents molekylevægt måles ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese 20 under reducerende og ikke-reducerende betingelser. Det viser sig at være en F(ab1)2-komponent sammensat af et fragment med en molekylevægt på ca. 28.000 fra aminogrup-peendestiliingen i den tunge kæde, og hele den lette kæde har en molekylevægt på ca. 23.000.

25

Eksempel 10

Undertrykkelse af aktiviteten hos human a^-PI med F(ab')2--komponenten i et antistof mod human a^PI

l^ug human c^-PI og 2^,ug monoklont antistof op-30 løses i 50^.uliter 0,05 molær PBS og inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Derpå tilsættes 0,025 enhed plasminogen og 0,031 enhed urokinase, og hele opløsningens volumen justeres til 60^uliter. lO^uliter heraf anbringes på en fibrinplade, som henstår ved 37°C og en fugtighed på over 35 95% i 18 timer. Det opløste fibrinareal måles. Resul taterne ses i tabel VII. Værdierne i den følgende tabel DK 166627 Bl 34

O

er relative værdier, der fås ved at sætte det areal, der opløses af 0,025 enhed plasminogen og 0,031 enhed urokinase til 100%.

5 Tabel VII

Antistof Opløst areal (%) 1D10C1 100 1D10C1 F(ab')2 100 10 Ved hjælp af samme metode som i eksempel 6 un dersøges undertrykkelsen af aktiviteten hos human c^-PI ved hjælp af dette monoklone antistofs F(ab')2-komponent.

0,6^ug (9 picomol) c^-PI ^0 picomol monoklont antistof mod t^-PI °plØses i 60^,uliter 2% okseserumalbu-15 minopløsning [0,05 molær Tris-puffer (pH 7,4), 0,15 molær NaCl] og inkuberes ved 37°C i 30 minutter efter henstand natten over ved 4°C.

Reaktionsblandingen blandes med 20^uliter 0,47 yumolær plasminopløsning, og der tilsættes 0,05 molær 20 Tris-puffer (pH 7,4) og 0,15 molær NaCl, og opløsningens samlede volumen justeres til 500^uliter. Derpå tilsættes 200^uliter vandig opløsning af 3,5 mmolær syntetisk substrat S-2251. Ændringer i absorbens ved en bølgelængde på 405 nm pr. tidsenhed måles med et spektrofotometer 25 (Hitachi "100-50"). Som kontroller undersøges ligeledes ændringer i absorbens med hensyn til en prøve, der fås ved at omsættes plasmin alene og en prøve, der fås ved at omsættes human c^-PI plasmin uden tilsætning af det monoklone antistof. Resultaterne ses i tabel VIII.

30

Tabel VIII

Antistof Absorbensændringer (405 nm/min) 1D10C1 24,8 x 10-8 1D10C1 F(ab1) 2 24,4 x 10~3 35 Plasmin alene 24,0 x 10 3 _3 a2~PI og plasmin 8,4 x 10 DK 166627 B1 35

O

Ovenstående resultater viser, at det raonoklone antistof med F(ab')2 ifølge opfindelsen specifikt genkender det reaktive sted i human c^-PI og undertrykker human o^-Pl's fibrinolyse-inhiberende funktion.

5

Eksempel 11

Fremstilling af et immunologisk analysereagens indeholdende et monoklont antistof mod a^-PI

Første antistof. Antistoffet 1D10C1, der fås 10 i eksempel 3, anvendés, efter at det er fikseret på en uopløselig bærer (mikrotiterplade) som vist nedenfor.

Dette antistof kan specifikt genkende det reaktive sted i c^-PI, hvor denne inhibitor inhiberer plasmins fibri-nolytiske aktivitet.

15 Andet antistof. Antistoffet 1B1QG11, der fås i eksempel 3, anvendes. Dette antistof genkender specifikt andre steder i o^-PI end det reaktive sted. Det anvendes efter mærkning med alkaliphosphatase.

Det monoklone antistof 1D10C1 i en koncentra-20 tion på 20yug/ml henstår ved 4°C på en mikrotiterplade, så at det fikseres på pladen. Der tilsættes en puffer (15 mmolær ^200^» 35 mmolær NaHCO^, 2 mmolær NaN3), der indeholder 1% okseserum, og blandingen henstår i 4 timer.

Pladen vaskes derpå 5 gange med en vaskevæske (20 mmolær 25 phosphatpuffer, 0,135 molær NaCl, 2 mmolær NaN^, 0,05% , "Tween 20"), indeholdende 1% okseserumalbumin. Derefter fortyndes c^-PI til f°rs^eHiGe koncentrationer med en fortyndende 20 mmolær phosphatpuffer,(0,135 mmolær NaCl). Blandingen henstår ved stuetemperatur i 4 timer.

30 Pladen vaskes derpå 5 gange med den ovennævnte vaskevæske, og der tilsættes det med alkaliphosphatase mærkede monoklone antistof, 1B10G11, der genkender steder i c^-PI, i en koncentration på 329 ng/ml efterfulgt af henstand natten over ved 4°C. Pladen vaskes med den 35 ovennævnte vaskevæske, og derpå tilsættes en alkaliphos-phatasesubstratopløsning i en koncentration på 1 mg/ml.

O

36 DK 166627 B1

Absorbensændringer ved en bølgelængde på 405 nm pr. minut måles. Resultaterne er vist i fig. 2 på den ledsagende tegning. Det ses ud fra denne firug, at c^-Pl's koncentration og absorbensændringer udgør et lineært 5 forhold. Følgelig kan man let ved hjælp af et monoklont antistof, som specifikt genkender det reaktive sted i c^-PI, som det ene antistof i sandwich-metoden/ måle mængden af c^-PI.

10 Eksempel 12

Det monoklone antistof, 1D10C1, der specifikt kan genkende det reaktive sted i human c^-Pl, anvendes i en-koncentration på 20 ,ug/ml og henstår natten over ved 4 C på en mikrotiterplade for at fikseres herpå.

15 Der tilsættes en puffer (15 mraolær Na^O^, 35 mmolær NaHCOg, 3 mmolær NaN^) indeholdende 1% okseserumalbu-min, og blandingen henstår ved stuetemperatur i 4 timer. Derpå vaskes blandingen 5 gange med en vaskevæske (20 mmolær phospha tpuf fer, 0,135 molær NaCl, 2 mmo-20 lær NaN^, 0,05% "Tween 20"), indeholdende 1% okseserum-albumin. Derpå tilsættes en analyseprøve (humanplasma) fortyndet til forskellige koncentrationer med en fortyndingsopløsning (20 mmolær phosphatpuffer, 0,135 mmolær NaCl, og dette henstår ved stuetemperatur i 4 timer.

25 Derpå vaskes blandingen 5 gange med den oven nævnte vaskevæske, og der tilsættes det med alkaliphos-phatase mærkede monoklone antistof, 1B10G11, der genkeder andre sted i human c^-PI end det reaktive sted, i en koncentration på 329 ng/ml, og blandingen henstår 30 natten over ved 4°C. Blandingen vaskes med den ovennævnte vaskevæske, og der tilsættes en alkaliphospha-tasesubstratopløsning (1 mg/ml), og absorbensændringer ved en bølgelængde på 405 nm/minut undersøges.med den tidligere ELISA-analysator. Resultaterne er afsat i 35 tegniflgens- fig. 3. Det vil fremgå af fig. 3, at fortyndingsforholdet for analyseprøven (humanplasma) og ab- DK 166627 B1 37

O

sorbensændringerne udgør et lineært forhold. Eftersom absorbensændringsværdien for en standard analyseprøve -3 fortyndet 600 fold er 6,2 x 10 , er koncentrationen af human o^-PI i denne prøve 74,0yug/ml (l,l^umolær).

5

Eksempel 13

Immunologisk bestemmelse af g-PI i human plasma i et trin Første antistof. Antistoffet 1D10C1, der fås i eksempel 3, anvendes, efter at det er fikseret på en 10 uopløselig bærer (mikrotiterplade) på følgende måde.

Det er et monoklont antistof, der specifikt kan genkende det reaktive sted i human (^-PI.

Andet antistof. Antistoffet 1B10G11, der fås i eksempel 3, anvendes, efter at det er mærket med alka-15 liphosphatase. Dette er et monoklont antistof, der spe cifikt kan genkende andre steder i c^-PI en<^ ^et reakti” ve sted.

Det monoklone antistof, 1D10C1, der specifikt kan genkende det reaktive sted i human a2~PI, anvendes 20 i en koncentration på 20/ug/ml og henstår natten over ved 4 C på en mikrotiterplade, så at det fikseres på pladen. Der tilsættes en phosphat-pufret saltvandsopløsning indeholdende 0,5% okseserumalbumin (forkortet til 0,5% BSA-PBS). Blandingen henstår ved stuetemperatur 25 i 2 timer og vaskes tre gange med 0,5% BSA-PBS. En blanding sammensat af humanplasma fortyndet med PBS og det med alkaliphosphatase mærkede monoklone antistof, 1B10G11, i en koncentration på 329 ng/ml tilsættes, og det omsættes ved stuetemperatur i 2 timer. Reaktions-30 blandingen vaskes med 0,5% BSA-PBS, og der tilsættes en alkaliphosphatase-substratopløsning i en koncentration på 1,0 mg/ml. Blandingen omsættes ved stuetemperatur i 20 minutter. Derpå måles reaktionsopløsningens absor-bens ved en bølgelængde på 405 nm ved hjælp af et mikro-35 pladefotometer. Der fremstilles en kalibreringskurve ved hjælp af en standardprøve af renset c^-PI, og ud fra DK 166627 Bl 38

O

kalibreringskurven beregnes mængden (^ug/ml) a2-PI 1 en serumprøve fra hver patient. I tegningens fig. 4 ses kalibreringskurven, og mængderne af c^-PI i patienternes plasmaprøver er anført i tabel IX.

5 Koncentrationen af c^-PI og absorbensen udgør et lineært forhold, og ved hjælp af ovenstående analysemetode kan mængden af a2-PI i plasmaet bestemmes nøjagtigt.

10 15 20 25 30 35 39 DK 166627 B1

O

Tabel IX

Analysepr tave a2~PI <micrograms/ml)

B SUNDE PERSONER

5 SU 63^0 KO 57,8 SZ 66r2

PATIENTER

10 FU 32r1

Kl 17^9 AB 36 ^8 AB 36,8

Kl 25.9 15 MI °76 AB 21^9 AB 54;1 BI 58^9 TA 40?3 20 K0 58T3 YA 48^2 KA 98,4

Kl 118,8 SU 30,8 SU 24.8 25 * AK 66.4 ) _ TA 50.0 . ).

Kl .16,0 AK 58,4 01 86.4

30 J

SU 50,4 35

O

40 DK 166627 B1

Eksempel 14

Immunologisk bestemmelse af mængden af α^-PI i humanplas-ma ved hjælp af latexagglutinering

Monoklone antistoffer 1D10C1 og lBloGll mod 5 a2”PI °plØses hver for sig i opløsninger indeholdende 0,02 molær glycin og 0,03 molær NaCl (pH 9,0) i en koncentration på 50^ug/ml. En polystyrenlatex med en partikeldiameter på 0,60yUmeter suspenderes i hver af disse to antistofopløsninger (1,0 ml) til en koncentration 10 på 2%. Suspensionerne henstår natten over ved stuetemperatur for at latexerne kan absorbere antistofferne.

Latexerne vaskes hver to gange med en opløsning indeholdende 0,02 molær glycin og 0,03 molær NaCl (pH 9,0) og suspenderes derpå i 1,0 ml opløsning indeholdende 0,1 15 molær glycin, 0,15 molær NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN^ (pH 9,0) . Derpå blandes 50^,uliter af den latex, hvorpå det monoklone antistof 1D10C1 mod a^-PI er adsorberet, med 50^,uliter af den latex, hvorpå det monoklone antistof 1B10G11 er adsorberet, så at der fås en standard-20 latexprøve. lOO^uliter af standardlatexprøven og en standard c^-PI-prøve i forskellige tilstande eller 100 yUliter humanplasmaprøve fortyndet med en opløsning indeholdende 0,1 molær glycin, 0,15 molær NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN^ (pH 9,0) blandes og omsættes ved 37°C i 30 25 minutter. Reaktionsblandingen fortyndes 125 gange med en opløsning indeholdende 0,1 molær glycin, 0,15 molær NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN^ (pH 9,0), og den fortyndede opløsnings absorbens ved en bølgelængde på 600 nm måles.

Der fremstilles en kalibreringskurve ved hjælp af stan-30 dard-c^-PI-prøven i forskellige koncentrationer, og mængden af c^-PI humanpiasmaprøven beregnes. I teg ningens fig. 5 vises kalibreringskurven.

Eftersom absorbensen ved 600 nm for en plasma fra et sundt menneske fortyndet 620 gange er 1,068, er 35 den mængde a2~PI, der beregnes ved hjælp af kalibrerings-kurven , 60,8^ug/ml.

41 DK 166627 B1

O

Eksempel 15

Immunologisk bestemmelse af mængden af α^-PI i humanplasma ved hjælp af latexagglutinering

Monoklone antistoffer, 1D10C1 og 1B10G11, mod 5 a2*"PI bisses, så at forholdet mellem deres koncentrationer bliver 1:1. Blandingen opløses i en opløsning indeholdende 0,02 molær glycin og 0,03 molær NaCl (pH 9,0), så at der fremstilles en opløsning med en antistofkoncentration på 50^ug/ml. En polystyrenlatex med 10 en diameter på 0,60^um suspenderes i en koncentration på 2% i 1,0 ml af antistofopløsningen og henstår natten over ved stuetemperatur for at adsorbere de to monoklone antistoffer på latexen. Latexen vaskes to gange med 1,0 ml opløsning indeholdende 0,02 molær glycin 15 og 0,03 molær NaCl (pH 9,0) og suspenderes i 1,0 ml op løsning indeholdende.0,1 molær glycin, 0,15 molær NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN^ (pH 9,0). lOO^uliter af suspensionen og en standard c^-PI-prøve i forskellige koncentrationer eller lOO^uliter humanpiasmaprøve fortyndet med 20 en opløsning indeholdende 0,1 molær glycin, 0,15 molær NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN^ (pH 9,0) blandes og omsættes ved 37°C i 30 minutter. Reaktionsblandingen fortyndes 125 gange med en opløsning indeholdende 0,1 molær glycin, 0,15 molær NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN^ (pH 9,0), og op-25 løsningens absorbens ved en bølgelængde på 600 nm måles.

Der fremstilles en kalibreringskurve ved hjælp af standard c^-PI-prøver i forskellige koncentrationer, og mængden af i^-PI i humanpiasmaprøven beregnes. I tegningens fig. 6 vises kalibreringskurven.

30 Eftersom absorbensen for en plasmaprøve fra et sundt menneske fortyndet 620 gange er 1,002, er den mængde c^-PI/ der beregnes ved hjælp af kalibreringskurven , 60,l^ug.

35

O

42 DK 166627 B1

Eksempel 16

Fraskillelse af g^-PI fra humanplasma

Et adsorbens (0,5 ml) , hvortil der kemisk som ligand er bundet antistoffet 1D10C1, der fås i eksempel 5 3, pakkes i en kolonne. Kolonnen vaskes omhyggeligt med en vaskevæske (50 mmolær puffer, pH 7,4, 0,15 molær NaCl), og der ledes 1,0 ml humanplasmaprøve gennem kolonnen. Kolonnens indvendige væg vaskes med l,o ml af den ovennævnte vaskevæske. Den eluerede fraktion betegnes 10 som " gennemledningsfraktionen". Kolonnen vaskes derpå med 2,0 ml af samme vaskevæske for at eluere ikke-adsor-' beret stof, der udgør en "vasket fraktion". De foregå ende operationer udføres alle ved 4°C. Gennemlednings-fraktionen og den vaskede fraktion afsaltes og koncen-15 treres ved 4°c.

Fremstilling af en kalibreringskurve for human a^-PI

Mængden af a2~PI måles ved hjælp af den metode, der er beskrevet i eksempel 11. Der anvendes specifikt følgende første og andet antistof: 20- Første antistof. Antistoffet 1D10C1, der fås i eksempel 3, anvendes og fikseres på en uopløselig bærer (mikrotiterplade) på følgende måde. Dette antistof er et monoklont antistof, der specifikt kan genkende det reaktive sted i c^-PI.

25 Andet antistof. Antistoffet 1B10G11, der fås i eksempel 3, anvendes, efter at det er mærket med alka-liphosphatase. Dette antistof er et monoklont antistof, der specifikt kan genkende et sted, der ikke er det reaktive, i a2-PI.

30 Det monoklone antistof 1D10C1 henstår i en kon centration på 20yUg/ml natten over ved 4°C på en mikrotiterplade og fikseres derpå. Der tilsættes en puffer (15 mmolær Na2C03, 35 mmolær NaHCC>3, 3 mmolær NaN3) , der indeholder 1% okseserumalbumin, og blandingen henstår 35 ved stuetemperatur i 4 timer. Den vaskes derpå 5 gange med en væskevæske (20 mmolær phosphatpuffer, 0,135 molær DK 166627 B1 43

O

NaCl, 2 mmolær NaN^, 0,05% "Tween 20”) indeholdende 1% okseserumalbumin, og derpå tilsættes c^-PI for‘tyndet til forskellige koncentrationer med en fortyndingsopløsning (20 mmolær phosphatpuffer, pH 7,4, 0,136 mmolær 5 NaCl), og blandingen henstår ved stuetemperatur i 4 timer.

Blandingen vaskes yderligere 5 gange med samme vaskevæske som ovenfor, og der tilsættes det med alkali-phosphatase mærkede monoklone antistof 1B10G11, der kan genkende et sted, der ikke er det reaktive, i a^-PI, og 10 blandingen henstår natten over ved 4°C. Efter vask med samme vaskevæske, som anvendes ovenfor, tilsættes en al-kaliphosphatasesubstratopløsning i en koncentration på 1 mg/ml. 20 minutter senere måles opløsningens absor-bens ved en bølgelængde på 405 nm ved hjælp af et mikro-15 pladefotometer ("MTP-20" fremstillet af Corona Electri cal Co., Ltd.). Resultaterne er afsat i tegningens fig.

7. Det fremgår af fig. 7, at c^-PI's koncentration og absorbensen udgør et lineært forhold. Man kan derfor ved hjælp af et monoklont antistof, der specifikt kan 20 genkende det reaktive sted i α2~ΡΙ, som det ene antistof ved sandwich-metoden let måle mængden af a^-PI.

Ved hjælp af fig. 7 som kalibreringskurve måles mængder af c^-PI "^n~9enn emlednings fraktionen" og i "den vaskede fraktion" .

25 Måling af ^ en analysePrØve <

Det monoklone antistof 1D10C1, der specifikt kan genkende det reaktive sted i human c^-Pl, henstår natten over i en koncentration af 20 ,ug/ml på en mikro-titerplade ved 4 C natten over, så at det fikseres på 30 pladen. Der tilsættes en puffer (15 mmolær Νη200^, 35 mmolær NaHCO^, 3 mmolær NaN^) indeholdende 1% okseserumalbumin, og blandingen henstår ved stuetemperatur i 4 timer. Blandingen vaskes derpå 5 gange med en vaskevæske (20 mmolær phosphatpuffer, 0,135 mmolær NaCl, 2 35 mmolær NaN^, 0,05% "Tween 20") indeholdende 1% okseserumalbumin. Der tilsættes en prøve (gennemledningsfrak-

O

44 DK 166627 B1 tionen, vasket fraktion og humanplasma) fortyndet til forskellige koncentrationer med en fortyndingsopløsning (20 mmolær phosphatpuffer, 0,135 mmolær NaCl) / og blandingen henstår ved stuetemperatur i 4 timer.

5 Blandingen vaskes 5 gange med samme vaskevæske som ovenfor, og der tilsættes det med alkaliphosphatase mærkede monoklone antistof 1B10G11, der kan genkende et sted i human c^-PI, der ikke er det reaktive. Blandingen henstår natten over ved 4°C og vaskes med samme va-10 skevæske som anvendes ovenfor. Derefter tilsættes en alkaliphosphatasesubstratopløsning i en koncentration på 1 mg/ml, og 20 minutter senere måles opløsningens ab-sorbens ved en bølgelængde på 405 nm med et mikroplade-fotometer ("MTP-12" fremstillet af Corona Electrical Co., 15 Ltd.).

Resultaterne ses i tabel X. Der påvises intet. a2“PI i gennemledningsfraktionen og den vaskede fraktion.

Det kan derfor slås fast, at ved tilsætning af humanplasma til adsorbenset kan o^-Pl ^skilles fuldstændig fra 20 humanplasma.

Tabel X

Prøve_Mængde cu-PI ( ,ug) 20 mmolær phosphatpuffer 25 (pH 7,4) 0

Humanplasma (1,0 ml) 59,8

Gennemledningsfraktion 0 • Vasket fraktion 0 30 Eksempel 17

Fraskillelse og eluering af human a^-PI fra humanplasma ved hjælp af et selektivt adsorbens for human a^-PI

1,0 ml adsorbens, der kemisk er kombineret med det monoklone antistof 1D1DC1 mod human c^-PI, pakkes 35 i en kolonne. Kolonnen bringes i ligevægt med en passende puffer (0,01 molær natriumphsophatpuffer, 0,15 molær 45 DK 166627 B1

O

NaCl, pH 7,2). Derpå ledes 2,0 ml humanplasma gennem kolonnen pakket med adsorbenset. Fraktioner, der elue-res uden adsorption på adsorbenset, opsamles og anvendes som gennemledningsfraktion. Derpå ledes 10 ml af 5 samme puffer som ovenfor gennem kolonnen, og stofferne, der ikke-specifikt adsorberes på adsorbenset, elueres og opsamles (vasket fraktion).

Endelig elueres ved hjælp af passende eluerings-midler human a2-PI ^un<^et til adsorbenset, så at der 10 fås en elueret fraktion.

Der anvendes følgende tre elueringsmidler: (a) 50%, vo/vo, ethylenglycol, pH 11,5 (b) 50%, vo/vo, ethylenglycol-PBS, pH 7,4 (c) 50%, vo/vo, ethylenglycol-PBS, 0,05% "Tween 15 80", pH 7,4.

Efter hver eluering regenereres kolonnen (adsorbenset) og bringes i ligevægt, og der adsorberes human ct^-PI på adsorbenset og elueres med det næste elu-eringsmiddel. Mængden af det antigene ctg-PI i hver af 20 de eluerede fraktioner, der fås med de tre typer elue-ringsmiddel bestemmes ved hjælp af ELISA-analyse. α --PI's aktivitety bestemmes ved at måle den residuale plas-minaktivitet med et syntetisk substrat S-2251 (H-D-va-lyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroanilid-dihydrochlorid).

25 Mængden (^ug) af det antigene c^-PI i hver reaktion bestemmes ved hjælp af ovennævnte analysemetode og vises i tabel XI, og mængden (^ug) o^-PI aktivitet bestemt ved hjælp af det syntetiske substrat ses i tabel XII.

30 35

O

46 DK 166627 B1

Tabel XI

_Elueringsmiddel_

Fraktion_(aj_(b)_(c)

Gennemledningsfr. 000 5 Vasket fraktion 000

Elueret fraktion 37,2 19,0 37,4

Tabel XII

_Elueringsmiddel_ 10 Fraktion_(a)_(b)_(c)

Gennemledningsfr. 000

Vasket fraktion 000

Elueret fraktion 20,1 15,2 37,2 15 Resultaterne viser, at gennemledning af elue- ringsmidlerne (a)-(c) gennem adsorbenset kan føre til eluering og rensning af human a2-PI, og især når (c) anvendes som elueringsmiddel, elueres 37,4yUg, som svarer til 29,7% ot2~PI (126^,ug) i 2,0 ml humanplasma, og 20 mængden af a2-PI med aktivitet er 37,2^ug, hvilket viser, at det eluerede a2-PI har en aktivitet på ca.

100%.

Eksempel 18 25 Fremstilling af a^-PI i humanplasma 4,0 ml humanplasma fyldes på en kolonne pakket med 2,0 ml af det i eksempel 17 beskrevne adsorbens. Kolonnen vaskes på samme måde som i eksempel 17 og elueres med elueringsmiddel (c) (50%, vo/vo, ethylenglycol-PBS, 30 0,05% "Tween 80", pH 7,4), hvorved der fås. en a2-PI-frak- tion ud fra humanplasmaet. Denne fraktion koncentreres og renses yderligere med højtydende væskechromatografiap-parat ("HLC-803D", Toyo Soda Co., Ltd.). Der fraskilles og udvindes a2~PI med et opløsningsmiddel bestående af 35 0,1 molær trifluoreddikesyre og 50% acetonitril, og det te koncentreres. Opløsningsmidlet udskiftes med vand, DK 166627 B1 47

O

og produktet lyophiliseres, så at der fås 70,4^,ug renset standard o^-Pl-prøve. SDS-polyacrylamid-elektrofo-rese ved 10% gelkoncentration på denne standardprøve giver det resultat, at der isoleres renset CC2-PI med 5 en molekylevægt på 67.000.

Eksempel 19

Prøve for opløsning af thrombe ved hjælp af humanplasma 60^uliter thrombinopløsning (200 enh./ml) til-10 sættes til 150^,uliter plasmaprøve taget fra et normal sundt menneske. Blandingen opvarmes ved 37°C i 2 minutter for at koagulere plasmaet, så der fås en klump. Separat tilsættes 27^uliter opløsning af et monoklont antistof mod ct2“PI (1D10C1, 3,30 mg/ml) til 290^,uliter plas-15 maprøve taget fra et normal sundt menneske. Blandingen opvarmes ved 37°C i 30 minutter. Til opløsningen tilsættes lOO^uliter plasminopløsning (1000 enh./ml) og samtidig nedsænkes klumpen i den. Opløsningen opvarmes derpå ved 37°C. Til sammenligning gentages ovennævnte pro-20 cedure ved hjælp af phosphatpufret saltvandsopløsning i stedet for den monoklone antistofopløsning. De tidsrum, der medgår til opløsning af klumpen, sammenlignes. Anvendelsen af det monoklone antistof mod c^-PI fører til fuldstændig opløsning af klumpen på ca. 2 timer. Uden 25 det monoklone antistof kræves der et tidsrum på over 10 timer for at opløse den.

Eksempel 20

Prøve for opløsning af thrombe ved hjælp af humanblod 30 Til 150^,uliter blodprøve taget fra et normalt sundt menneske tilsættes 60 ,ug thrombinopløsning (200 enh./ml) . Blandingen opvarmes ved 37 C i 2 minutter for at koagulere blodet og få en klump. Separat tilsættes 27 .uliter monoklont antistofopløsning mod o^-PI U-Dl°cl' 35 3,39 mg/ml), og blandingen opvarmes ved 37 C i 30 mi nutter. Til opløsningen tilsættes lOO^uliter plasminop- 48 DK 166627 B1

O

løsning (1000 enh./ml), og samtidig nedsænkes klumpen deri. Opløsningen opvarmes derpå ved 37°C. Som sammenligning gentages ovennævnte procedure med phosphat-pufret saltvandsopløsning i stedet for opløsningen af 5 monoklont antistof. De tidsrum, der medgår for at opløse klumpen^ sammenlignes. Anvendelse af det monoklone antistof mod c^-PI fØrer til fuldstændig opløsning af klumpen på ca. 2 timer. Uden det monoklone antistof kræves der et tidsrum på mere end 10 timer for at oplø-10 se den.

15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Monoklont antistof specifikt for en human c^-plasmininhibitor, kendetegnet ved, at antistoffet har den virkning, at det specifikt blokerer 5 det sted i human-a2-plasmininhibitoren, der inhiberer plasinins fibrinolytiske aktivitet, og at det undertrykker a?-plasmininhibitorens inhiberende virkning på den fibrinolytiske aktivitet, eller et fragment af det monoklone antistof med samme biologiske virkning.

2. Monoklont antistoffragment ifølge krav 1, ken detegnet ved, at det omfatter mindst en Fab-region af det monoklone antistof.

3. Fremgangsmåde til immunologisk bestemmelse af en human a2-plasmininhibitor i en analyseprøve ved 15 hjælp af et primært antistof fikseret på en uopløselig fast bærer og et mærket sekundært antistof, kendetegnet ved, at det primære og det sekundære antistof er anti-human c^-plasmininhibitor-antistoffer eller fragmenter deraf, som specifikt genkender og kombineres 20 med forskellige epitoper af human a2-plasmininhibitoren, og at det ene af dem er det monoklone antistof ifølge krav 1 eller det monoklone antistoffragment ifølge krav 2.

4. Reagenssystem til immunologisk bestemmelse af en human a2~plasmininhibitor i en analyseprøve, hvil- 25 ket system omfatter et primært antistof fikseret på en uopløselig fast bærer og et mærket sekundært antistof, kendetegnet ved, at det primære og det sekundøre antistof er anti-human-a2-plasmininhibitor-anti-stoffer eller fragmenter heraf, som specifikt genkender 30 og kombineres med forskellige epitoper af human a2-plas-mininhibitoren, og at det ene af dem er det monoklone antistof ifølge krav 1 eller det monoklone antistoffragment ifølge krav 2.

5. Fremgangsmåde til immunologisk bestemmelse 35 af en human <x2-plasmininhibifcor i en analyseprøve, hvor et primært antistof og et sekundært antistof fikseret DK 166627 B1 samtidig på fine partikler af samme uopløselige bærer eller hver for sig på fine partikler af forskellige uopløselige bærer bringes i kontakt med analyseprøven i et flydende medium, og at en ændring, der kan forekomme 5 ved agglutinering, påvises, kendetegnet ved, at det primære og det sekundære antistof er anti-human-a2“plasmininhibitor-antistoffer eller fragmenter deraf, som specifikt genkender og kombineres med forskellige epitoper af human c^-plasmininhibitoren, og at det ene 10 af dem er det monoklone antistof ifølge krav 1 eller det monoklone antistoffragment ifølge krav 2.

'' 6. Reagenssystem til immunologisk bestemmelse af en human a2-plasmininhibitor i en analyseprøve omfattende et primært antistof og et sekundært antistof fik-15 seret samtidig på fine partikler af den samme uopløselige bærer eller hver for sig på fine partikler af forskellige uopløselige bærer, kendetegnet ved, at det primære og det sekundære antistof er anti-human-c^-plasmininhibitor-antistoffer eller fragmenter heraf, 20 som specifikt genkender og kombineres med forskellige epitoper af human c^-plasmininhibitoren, og at det ene af dem er det monoklone antistof ifølge krav 1 eller det monoklone antistoffragment ifølge krav 2.

7. Fremgangsmåde til fraskillelse eller udvin-25 ding af human a2-plasmininhibitor fra en væske indeholdende human a2_plasmininhibitoren, kendetegnet ved, at væsken bringes i kontakt med en uopløselig fast bærer, hvorpå det monoklone antistof ifølge krav 1 eller det monoklone antistoffragment ifølge krav 30 2 er fikseret, til adsorbering af human c^-plasmininhi- bitor på bæreren, og at bæreren fraskilles fra væsken og om ønsket human o^-plasmininhibitor desorberes fra bæreren og udvindes.

8. Selektiv adsorbens til en human a2-plasmininhibitor 35 til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den omfatter en uopløselig fast bærer og det DK 166627 B1 monoklone antistof ifølge krav 1 eller det monoklone antistoffragment ifølge krav 2 fikseret derpå.

9. Pharmaceutisk middel til behandling af throm-botiske sygdomme, kendetegnet ved, at det om-5 fatter det monoklone antistof ifølge krav 1 eller det monoklone antistoffragment ifølge krav 2.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af et hybridom, som kan frembringe det monoklone antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man sammensmelter 10 (fuserer) antistof-producerende celler taget fra et pattedyr, der er immuniseret med en human a2~plasmininhibi-tor, med myelomceller og kloner de sammensmeltede (fuse-rede) celler til dannelse af hybridomet. 15 20 25 30 35