ES2237272B1 - Reactivo de latex para la deteccion de anticuerpos frente a legionella pneumophila. - Google Patents
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Abstract
Reactivo de látex para la detección de anticuerpos frente a Legionella pneumophila. Se describe un procedimiento (test de inmunodiagnóstico) para detectar y cuantificar anticuerpos específicos de Legionella pneumophila en muestras serológicas, mediante aglutinación-sedimentación de partículas de látex sensibilizadas con un antígeno lipídico de Legionella pneumophila. Asimismo se describe el método de obtención de las partículas de látex sensibilizadas y el tampón de reacción donde se desarrolla la inmunorreacción. El desarrollo del inmunodiagnóstico tiene lugar en pocillos de una placa de microtitulación mezclando las partículas sensibilizadas con muestras de sueros humanos en un tampón de reacción específico. La presencia de anticuerpos se detecta mediante la aglutinación de las partículas de látex sensibilizadas y la ausencia se detecta mediante la sedimentación de éstas partículas. Este test es económico, técnicamente simple, tiene una elevada estabilidad temporal y unos niveles de sensibilidad y especificidad adecuados, de acuerdo con las técnicas serológicas de referencia.
Description
Reactivo de látex para la detección de
anticuerpos frente a Legionella pneumophila.
Obtención de un reactivo de
aglutinación-sedimentación de partículas de látex
para la detección y titulación de sueros que contienen anticuerpos
humanos frente a Legionella pneumophila. El reactivo
comprende partículas de poliestireno coloreadas y sensibilizadas
con antígeno de Legionella pneumophila, capaces de aglutinar
de forma específica en presencia de anticuerpos humanos frente a
Legionella pneumophila, y un medio de reacción que favorece
el proceso de aglutinación-sedimentación de las
partículas sensibilizadas. El reactivo permite indicar la
positividad o negatividad de un suero así como su titulación.
La invención consistente en un test de
aglutinación-sedimentación de partículas de látex
coloreadas es un método muy útil para detectar la presencia de
inmunoquímicos como los anticuerpos en una muestra biológica. Se
enmarca dentro del área de la biotecnología, y presenta aplicación
directa en el inmunodiagnóstico serológico.
La interacción
antígeno-anticuerpos es la base de todos los métodos
inmunológicos. Proteínas especiales llamadas anticuerpos son
producidas por los mamíferos como respuesta a la presencia de un
cuerpo extraño conocido como antígeno. Esta respuesta normal del
cuerpo ante un agente patógeno ha permitido el desarrollo de
numerosas técnicas que se usan para diagnosticar enfermedades. En
algunos de estos tests la presencia del antígeno sospechado se pone
de manifiesto añadiendo a la muestra biológica el anticuerpo
complementario. Si el antígeno está presente las reacciones
antígeno-anticuerpos que se producen originan un
precipitado que generalmente es muy difícil de detectar visualmente
debido a su pequeño tamaño. Por esta razón los antígenos o
anticuerpos se unen a partículas de látex de forma que los
precipitados o agregados formados por las reacciones
antígeno-anticuerpo entre distintas partículas de
látex sean grandes y se detecten visualmente con facilidad.
La aglutinación de partículas de látex
sensibilizadas constituye uno de los métodos de inmunodiagnóstico
más simples y rápidos. En un inmunoensayo de este tipo, las
partículas de látex en cuya superficie se ha adsorbido un
anticuerpo (o antígeno) se mezclan con la muestra a analizar y que
contiene el antígeno específico correspondiente (o anticuerpo). La
existencia de reacciones antígeno-anticuerpo
cruzadas entre partículas de látex conduce a la aglutinación del
coloide que se puede observar visualmente por el operador.
Los primeros inmunoensayos fueron realizados por
Singer y Plotz^{1} al detectar el factor reumatoide en el suero
humano mediante partículas poliméricas recubiertas de
inmuno-gammaglobulina G (IgG).
En la actualidad esta técnica es ampliamente
utilizada en química clínica habiéndose aplicado para la detección
de más de 80 enfermedades infeccionas, incluyendo el SIDA. De igual
forma, existen reactivos comerciales repartidos en disciplinas como
son alergias, test de embarazo, detección de cáncer, marcadores
tumorales o hepáticos, pruebas tiroideas, identificación y
cuantificación de numerosas sustancias como las hormonas,
etc.^{2}
Legionella pneumophila es una bacteria
gram-negativa que ha alcanzado el rango de
importante patógeno humano. Es responsable de un amplio espectro
clínico de enfermedades que abarca desde infecciones asintomáticas o
enfermedades respiratorias suaves, hasta neumonías fulminantes
(enfermedad del legionario)^{3-5}.
Según estudios del Grupo Europeo de Trabajo en
Infecciones por Legionella^{6} la fuente de infección
puede ser determinada en aproximadamente la mitad de los casos.
Alrededor de un tercio son adquiridas en comunidad, otra tercera
parte asociadas a viajes y el otro tercio de origen hospitalario.
La enfermedad tiende a afectar a personas de mediana y avanzada
edad y el riesgo se incrementa en pacientes con varios tipos de
inmunodepresión (cáncer, diabetes, enfermos renales, SIDA). La
mortalidad para pacientes sanos tratados es de alrededor del 5%,
pero puede ser mayor para pacientes no tratados. Este índice puede
subir hasta el 20% en pacientes inmunodeprimidos^{7}. Esta
bacteria reside en una gran variedad de medios acuáticos naturales,
lagos o balnearios; y artificiales, piscinas públicas o sistemas
acuosos de edificios como dispositivos de climatización y sus
correspondientes torres de refrigeración^{8}. Este microorganismo
es relativamente resistente a los efectos de la cloración y del
calentamiento. Según los datos de que se dispone, el medio más
común de transmisión es la inhalación directa de aerosoles
procedentes de aguas contaminadas y no se ha evidenciado contagio
directo por contacto entre personas^{4}. Las infecciones por
Legionella pueden ser esporádicas o epidémicas. Hay una gran
variabilidad geográfica en la frecuencia de infección. En todos los
casos es más común en los meses cálidos, quizás debido a las torres
de refrigeración que generan aerosoles.
La especie Legionella pneumophila es
responsable de entre el 80-95% de las infecciones
en humanos por Legionella. Ésta presenta 15 serogrupos
patógenos para el ser humano. El serogrupo 1 es el responsable de
entre el 50-75% de las infecciones causadas por
ésta especie^{6,9}. Este hecho es muy importante desde el punto
de vista de los procedimientos de diagnóstico.
El diagnóstico en el laboratorio de infecciones
por Legionella es considerado normalmente problemático. La
razón de esta consideración es que todos los métodos de detección
existentes tienen sus limitaciones y no se ha conseguido
desarrollar hasta el momento un método universal de diagnóstico para
Legionella^{10,11}. Por ello ninguno de los métodos cubre
todas las posibilidades. Este hecho conduce a sensibilidades en la
detección que están entre el 60-70% y que no supera
el 90% para ninguno de los test "clásicos". La disponibilidad
de un buen repertorio de técnicas de diagnóstico constituye la base
para tomar las medidas efectivas para conseguir la prevención y el
control mediante un rápido reconocimiento de futuras infecciones
por Legionella.
Según Pouffle y col.^{12} se puede confirmar un
caso de legionelosis con un diagnóstico clínico en combinación con:
1) un cultivo positivo, 2) detección mediante técnicas serológicas
de una elevación del titulo de anticuerpos específicos en cuatro
diluciones de muestras pareadas de suero, o 3) un resultado
positivo en un test de detección de antígeno en orina.
De acuerdo con el Centro de Control de
Enfermedades (CDC) de Estados Unidos, un diagnóstico positivo puede
tener confirmación en el laboratorio siguiendo alguno de los
siguientes criterios^{13}
- 1)
- Aislamiento de Legionella en secreciones respiratorias, muestras de tejido pulmonar o sangre.
- 2)
- Detección de una elevación del titulo de anticuerpos específicos de Legionella pneumophila (sg1) en cuatro diluciones de muestras pareadas de mediante IFA (Inmunofluorescencia indirecta)
- 3)
- Detectando Legionella pneumophila (sg1) en secreciones respiratorias, tejido pulmonar o fluido pleura mediante fluorescencia directa de anticuerpos.
- 4)
- Demostrando la presencia de antígenos de Legionella pneumophila (sg 1) en orina mediante radioinmunoensayo o ensayos inmunoenzimáticos (ELISA).
Según el Grupo Europeo de Trabajo para
Infecciones por Legionella, los casos pueden tener
confirmación microbiológica según alguno de estos
criterios^{14}:
- 1)
- Aislamiento de Legionella en secreciones respiratorias, muestras de tejido pulmonar o sangre.
- 2)
- Detección de una elevación del titulo de anticuerpos específicos de Legionella pneumophila (sg1) en cuatro diluciones de muestras pareadas mediante IFA o microaglutinación.
- 3)
- Detección de antígenos específicos de legionella en orina utilizando reactivos validados.
Una presunción microbiológica puede tenerse
según:
- 1)
- Detectando una elevación del titulo de anticuerpos específicos de Legionella pneumophila (sg1) en cuatro diluciones de muestras pareadas de otros serogrupos de Legionella pneumophila u otras especies de Legionella mediante IFA o microaglutinación.
- 2)
- Detectando un título simple elevado de anticuerpos específicos de Legionella pneumophila (sg 1) u otros serogrupos, u otras especies de Legionella.
- 3)
- Detectando antígenos específicos de Legionella en secreciones respiratorias, o permanencia del microorganismo mediante inmunofluorescencia directa de anticuerpos (DFA) utilizando reactivos monoclonales evaluados.
- 4)
- Detectando ADN de especies de Legionella mediante PCR.
Maiwald y col.^{10} proponen un esquema para el
diagnóstico en el laboratorio para casos en los que se sospeche una
infección por Legionella. Se recomienda obtener tres tipos
de muestras (tejido pulmonar o secreciones respiratorias, Orina y
suero) en paralelo para su evaluación. El diagnóstico en un solo
método puede conducir a resultados negativos que sean falsos. Si dos
o más métodos conducen a resultados negativos, entonces se podría
descartar la infección por Legionella.
Aunque el cultivo y aislamiento del
microorganismo es el indicador preferido para confirmar la
infección, su utilización presenta diversos inconvenientes. Entre
estos destacan el dificultoso crecimiento de esta bacteria en medios
artificiales y la disponibilidad de muestras adecuadas. Por ello, la
sensibilidad de esta técnica^{15} puede abarcar un amplio
intervalo que va desde el 10 al 80%.
Los antígenos específicos de Legionella
pneumophila se pueden detectar en muestras de orina mediante
radioinmunoensayos (RIA), ELISA o aglutinación de látex^{16}.
Estos métodos son simples, no invasivos, rápidos y con sensibilidad
y especificidad aceptables. Sin embargo también presentan algunos
inconvenientes como una posible persistencia en la excreción de
antígeno que no se corresponde con un infección desde un punto de
vista clínico o la o disminución de la sensibilidad para serogrupos
distintos del 1^{11}. Otra desventaja es la utilización de
radioquímicos en el caso de RIA, o la necesidad de disponer de
anticuerpos específicos para la fabricación de los reactivos de
látex lo que se refleja en el incremento del coste de los equipos.
Finalmente, el uso de equipos costosos y personal altamente
cualificado puede suponer otro aspecto negativo.
La Organización Mundial de la Salud en su
Registro epidemiológico semanal^{17} revela que de todos los
casos de Legionelosis diagnosticados en Europa en 1999, un 32% de
los casos fueron determinados mediante técnicas o serológicas
(seroconversión y detección de un título simple elevado), mientras
que en un 17% se realizo el aislamiento de la bacteria, en un 45%
se utilizó la detección de antígeno en orina y en el 6% restante
otras técnicas distintas. La tendencia en la última década es un
incremento importante en el uso como técnica de diagnóstico de la
detección de antígeno en orina^{18,19}. Sin embargo, también se ha
constatado una disminución importante de sensibilidad,
40-50%, en esta técnica en casos de neumonías poco
severas, por lo que parece recomendable su uso junto a otras
técnicas de diagnóstico^{20}.
La serología es otra de las técnicas
frecuentemente utilizadas en el diagnóstico de infecciones por
Legionella pneumophila. Dentro de este grupo se pueden
incluir Inmunofluorescencia indirecta (IFA), técnicas enzimáticas
(ELISA) y técnicas de microaglutinación^{15,21}. Estas técnicas
presenta una adecuada sensibilidad (85%) y especificidad (95%). Son
técnicas útiles desde un punto de vista epidemiológico. La facilidad
de obtención de muestras y la detección de infecciones poco severas
o asintomáticas son otras de sus ventajas. Sin embargo, presenta
diversos inconvenientes como la alta prevalencia de anticuerpos en
la población, y la seroconversión a las 4-8 semanas.
Además un 20% de los pacientes no muestra un nivel adecuado de
anticuerpos para s u correcta detección con procedimientos
serológicos.
La incorporación de la detección de IgM
conjuntamente con IgG mejora la sensibilidad y ayuda a detectar la
presencia de una infección por Legionella, facilitando un
diagnóstico más rápido^{10,22}.
De entre estos métodos serológicos, IFI y
técnicas enzimáticas (ELISA), son procedimientos que, con la
sensibilidad y especificidad adecuadas, requieren de personal
altamente especializado y equipos costosos. Otro método bastante más
barato, rutinario y que no necesita tecnología especializada,
consiste en un test de aglutinación de látex. Estas partículas son
recubiertas por un grupo proteico de la membrana externa de
Legionella pneumophila^{23-25}. Es un
procedimiento muy simple pero se ve reducida la sensibilidad y es
difícil realizar una cuantificación de anticuerpos o titulación del
suero. También se puede utilizar las técnicas de microaglutinación
de partículas^{26-29}. Estos procedimientos son
sencillos de realizar y proporcionan una sensibilidad y
especificidad adecuadas. El proceso de
aglutinación-sedimentación de partículas de látex
sensibilizadas con antígeno de Legionella pneumophila, se
puede incluir dentro de este tipo de técnicas, ya que combina el uso
de la aglutinación de partículas de látex, recubiertas por un
antígeno bacteriano de carácter lipolisacaridico, con la
sedimentación de éstas en pocillos de microplacas.
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La presente invención consiste en un
procedimiento (test de inmunodiagnóstico) para detectar y
cuantificar anticuerpos específicos de Legionella
pneumophila presentes en muestras serológicas, mediante la
aglutinación-sedimentación de partículas de látex
sensibilizadas con un antígeno lipopolisacarídico (LPS) de
Legionella pneumophila. El desarrollo del inmunodiagnóstico
tiene lugar en los pocillos de una placa de microtitulación
mezclando las partículas sensibilizadas con muestras de sueros
humanos en un tampón de reacción específico. La presencia en el
suero de anticuerpos frente Legionella pneumophila se
detecta mediante la aglutinación de las partículas de látex
sensibilizadas. La ausencia de anticuerpos específicos se detecta
mediante la sedimentación de éstas partículas.
El test presenta dos componentes:
A) Partículas de látex sensibilizadas con
antígeno de Legionella pneumophila y bloqueadas con albúmina
de suero bovino.
B) Una solución (un tampón) que constituye el
medio de la reacción inmunológica.
El procedimiento de obtención de las partículas
de látex sensibilizadas con antígeno de Legionella
pneumophila esencialmente comprende los siguientes pasos:
- -
- sensibilización de las partículas de látex mediante el recubrimiento de las mismas con un lipopolisacárido (LPS) de Legionella pneumophila, previamente obtenido de un extracto crudo de estos microorganismos. El recubrimiento de las partículas con este antígeno lipolisacarídico de Legionella pneumophila se consigue mediante un proceso de adsorción física.
- -
- bloqueo de las partículas de látex, ya sensibilizadas, con albúmina de suero bovina (BSA) por un proceso de adsorción física en la superficie polimérica de las partículas de látex.
El tampón de reacción es una solución de los
siguientes componentes: Glicina, NaCl u otra sal de cationes
monovalentes, ácido etilendiaminotetracético (EDTA), Albúmina de
suero bovino (BSA) y NaN_{3}. Este tampón sirve para favorecer la
interacción inmunológica y consecuentemente la aglutinación
específica de las partículas de látex sensibilizadas con LPS de
Legionella pneumophila en presencia de anticuerpos
específicos frente a Legionella pneumophila, y también para
minimizar la aparición de interacciones inespecíficas con lo que se
consigue una adecuada sedimentación de las partículas que no
aglutinan específicamente en ausencia de estos anticuerpos
específicos.
Este test de inmunodiagnóstico es económico,
técnicamente simple, tiene una elevada estabilidad temporal y
presenta unos niveles de sensibilidad y especificidad adecuados, de
acuerdo con IFA, que puede considerarse la técnica de referencia
desde un punto de vista serológico.
Fig. 1. Imagen de los pocillos de la placa de
microtitulación tras la inmunoreacción.
Resultado positivo: El suero contiene
anticuerpos específicos de Legionella pneumophila. Las
partículas de látex aglutinan y una fina capa de partículas recubre
la totalidad del fondo de los pocillos.
Resultado negativo: En el suero hay
ausencia de estos anticuerpos específicos. Las partículas
permanecen en suspensión y sedimentan de forma discreta apareciendo
un botón en el centro del fondo del pocillo.
Fig. 2. Imagen de la titulación de un suero en la
microplaca con pocillos.
El procedimiento (test de inmunodiagnóstico) para
detectar y cuantificar anticuerpos específicos de Legionella
pneumophila presentes en muestras serológicas, objeto de la
invención presenta dos componentes:
A) Partículas de látex sensibilizadas con
antígeno de Legionella pneumophila y bloqueadas con albúmina
de suero bovino.
B) Una solución (un tampón) que constituye el
medio de la reacción inmunológica.
El primer paso para producir el componente A
consiste en la obtención del antígeno de Legionella
pneumophila. Este antígeno es un lipopolisacarido (LPS)
presente en la pared celular de este tipo de bacterias. Para su
obtención se procede como se indica a continuación:
Un extracto crudo de Legionella
pneumophila envejecida se sonica en baño de hielo durante 10
minutos. Un volumen de este extracto se mezcla con un volumen de
una solución reactiva que contiene un 20% de glicerina, 10% de
mercaptoetanol, 2% de Dodecil sulfato de sodio (SDS) y una
concentración 0,624 M de TRIS-ácido, y que presenta un pH de 6,8.
Se eleva la temperatura a 100ºC durante 15 minutos. A continuación
se realiza una evaluación cuantitativa de la cantidad de proteína
total presente en la mezcla mediante cualquier procedimiento
adecuado. Posteriormente se añade una cantidad de proteinasa K que
sea diez veces menor en peso que la cantidad de proteína total
encontrada. La mezcla con proteinasa K se mantiene a 60ºC durante 1
hora. Transcurrido este tiempo se añaden dos volúmenes de una
solución de etanol al 95% que tiene una concentración 0,375 M de
cloruro de magnesio, manteniendo esta mezcla a -20ºC durante una
noche. Finalmente se realiza una centrifugación a 1000G de forma
que el precipitado, donde se encuentra el LPS se resuspende en
medio volumen de agua desionizada y se dializa frente a agua
desionizada durante 24 horas.
Las partículas comerciales de látex coloreadas
que se utilizan presentan un diámetro homogéneo alrededor de 800
nm, aunque pueden usarse sistemas con tamaño desde 0,7 \mum hasta
1,2 \mum. Estas partículas se recubren con LPS de Legionella
pneumophila mediante un proceso de adsorción física. Una vez
sensibilizadas con el antígeno, las partículas se someten a una
etapa de bloqueo con albúmina de suero bovino (BSA), proteína que
también resulta adsorbida en la superficie polimérica de las
partículas de látex. El procedimiento de obtención de las
partículas sensibilizadas, componente A, se desarrolla según las
siguientes etapas:
1) Un volumen determinado de suspensión comercial
de las partículas de látex se lava con 20 volúmenes de tampón
fosfato salino (PBS) y se resuspende en este tampón a un 5% de
contenido sólido.
2) La suspensión de látex se mezcla con la
suspensión de LPS bacteriano a razón de tres volúmenes de látex al
5% con 1 volumen de antígeno y todo ello con 20 volúmenes de PBS. El
proceso de adsorción transcurre con agitación por un periodo entre
6 y 12 horas a temperatura ambiente.
3) Finalizada la adsorción, las partículas de
látex sensibilizadas se lavan dos veces con 20 volúmenes de tampón
fosfato (PB).
4) Finalmente las partículas son redispersadas en
20 volúmenes de una solución 3 mM de ácido acético a pH 5 que
contiene un 0.05% de BSA. Esta etapa debe extenderse por un periodo
de tiempo que oscile entre 5 y 12 horas.
5) Finalmente las partículas sensibilizadas y
bloqueadas se lavan dos veces con 20 volúmenes de tampón glicina
(GB) a pH 8 y se resuspenden al 0.065% en GB, pH 8 y 0.2 mg/ml de
NaN_{3}.
El componente B es una solución 0.1 M de Glicina
a pH entre 8 y 8,5 que tenga una concentración de NaCl (u otra sal
de cationes monovalentes) entre 300 y 450 mM, entre 0,1 y 0,15% de
ácido etilendiaminotetracético (EDTA), entre 0,7 y 1% de BSA, y 0,2
mg/ml de NaN_{3}. Mediante el uso de este medio se favorece el
acercamiento entre partículas y la interacción inmunológica entre el
antígeno inmovilizado en la superficie de éstas y los
correspondientes anticuerpos específicos que pudieran estar
presentes en el suero humano que se estudia. Además, se minimiza a
aparición de interacciones inespecíficas y se consigue o una
adecuada sedimentación de aquellas partículas sensibilizadas que no
aglutinan debido a la ausencia de anticuerpos específicos en los
sueros testados.
Una vez disponibles los componentes A y B, el
procedimiento para la detección de anticuerpos específicos puede
ser el siguiente:
La inmunoreacción se desarrolla en una microplaca
con pocillos en U o V. 5 \mul de suero son diluidos en 195 \mul
del tampón que constituye el componente B. De esta solución se
realizan diluciones dobles en serie hasta alcanzar una determinada
titulación del suero, por ejemplo desde 1/80 hasta 1/10250. Se
introducen en los pocillos de la placa 30 \mul de cada una de
estas diluciones. Después de añadir 30 \mul de la solución de
partículas sensibilizadas, componente A, se mezcla mediante
agitación a 300 r.p.m. durante 2 minutos. La lectura del resultado
se puede realizar transcurridas 12 horas. Si el suero contenía
anticuerpos específicos de Legionella pneumophila, las
partículas de látex aglutinan y una fina capa de partículas recubre
la totalidad del fondo de los pocillos, véase la figura 1. Sin
embargo, si en el suero hay ausencia de estos anticuerpos
específicos, las partículas permanecen en suspensión y sedimentan
de forma discreta apareciendo un botón en el centro del fondo del
pocillo, véase figura 1. La titulación de un suero se puede observar
en la figura 2. Los sueros con títulos mayores o iguales a 1/80 son
considerados positivos.
Con el fin de demostrar la utilidad del reactivo
objeto de esta patente se presenta un estudio en el que un conjunto
de sueros, tanto positivos como negativos frente a anticuerpos de
Legionella pneumophila, han sido evaluados con el reactivo
de aglutinación-sedimentación de látex. Los
resultados obtenidos han sido comparados con los obtenidos mediante
la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFA) que puede
considerarse como referencia dentro de los test serológicos. De
esta forma se han podido calcular parámetros que caracterizan el
comportamiento inmunológico de este reactivo de látex, tales como
la sensibilidad, especificidad y eficiencia.
Con el fin de determinar la especificidad del
reactivo de aglutinación-sedimentación de látex se
utilizó un panel de 269 sueros procedentes de donantes de sangre.
Todos ellos fueron evaluados como negativos frente a anticuerpos de
Legionella pneumophila mediante dos técnicas serológicas:
Una de tipo inmunoenzimático (ELISA) y la otra IFI tanto para IgG
como IgM. Cuatro de estos sueros dieron un título de 1/80 mediante
aglutinación-sedimentación de látex mientras que el
resto dieron negativos. Así pues, si se consideran como resultados
de referencia serológicos los obtenidos mediante las técnicas
anteriores, la especificidad del reactivo de
aglutinación-sedimentación de látex para la
detección de anticuerpos frente a Mycoplasma pneumoniae es del
98,5%.
Para determinar la sensibilidad del reactivo de
aglutinación-sedimentación de látex se empleó una
colección de 39 sueros provenientes de enfermos hospitalizados en
diferentes centros y diagnosticados de neumonía por
Legionella. Los resultados obtenidos utilizando
aglutinación-sedimentación de látex e IFI (para IgG
e IgM) se muestran en la tabla 1. En las muestras positivas por
IFI-IgG pero negativas para IFI-IgM,
sólo una de ellas fue negativa por
aglutinación-sedimentación de látex, mientras que el
resto fueron positivas aunque con titulaciones bajas. Sin embargo,
las tres muestras positivas en IFI-IgM pero
negativas para IFI-IgG si fueron detectadas mediante
la aglutinación-sedimentación de látex. Asumiendo
como verdaderos los resultados de IFI, técnica que se considera de
referencia para los test serológicos, la sensibilidad o del
reactivo de aglutinación-sedimentación por látex es
del 98%.
La eficiencia es un valor combinado de
especificidad y sensibilidad que indica el porcentaje de pacientes
correctamente clasificados. Asumiendo como verdaderos los
resultados de IFI la eficiencia del reactivo de
aglutinación-sedimentación de látex es del 97%.
El estudio que se muestra en la tabla 1 confirma
que el reactivo de látex es capaz de detectar anticuerpos frente
Legionella pneumophila de tipo IgG e IgM, aunque la
sensibilidad del reactivo aumenta si se consideran los resultados
de IFI-IgM lo que implica una detección preferente
de IgM. La presencia en un suero de este tipo de anticuerpo es
indicativa de una infección reciente, por lo que su detección es
necesaria para asegurar el uso de una terapia antibiótica adecuada.
Además, el test de aglutinación-sedimentación de
látex presenta otra serie de ventajas frente a otros métodos
convencionales. Es un test muy simple desde un punto de vista
técnico que puede desarrollarse sin la necesidad de equipos de
laboratorio complejos. Tampoco es necesario realizar una
inactivación previa de los sueros. Por otro lado, el test de
aglutinación-sedimentación de látex ofrece reactivos
muy económicos y con una elevada estabilidad que les permite
mantener su inmunoreactividad después de 12 meses de almacenamiento
a 4ºC.
Claims (18)
1. Procedimiento de obtención de partículas de
látex sensibilizadas con un antígeno lipídico Legionella
pneumophila, caracterizado porque esencialmente comprende
la utilización de partículas de látex esféricas y monodispersas con
un diámetro entre 0,7 y 1,2 \mum, preferiblemente de 0,8 \mum,
y de un antígeno de Legionella pneumophila de naturaleza
lipopolisacarídica (LPS).
2. Procedimiento de obtención de partículas de
látex sensibilizadas con LPS de Legionella pneumophila según
reivindicación 1, caracterizado porque esencialmente
comprende los siguientes pasos:
- i)
- sensibilización de las partículas de látex con LPS de Legionella pneumophila, previamente obtenido de un extracto crudo de estos microorganismos, mediante el recubrimiento de las partículas con el antígeno LPS de Legionella pneumophila por un proceso de adsorción física,
- ii)
- bloqueo de las partículas de látex, ya sensibilizadas, con albúmina de suero bovina (BSA) por un proceso de adsorción física en la superficie polimérica de las partículas de látex.
3. Procedimiento de obtención de partículas de
látex sensibilizadas con un antígeno lipopolisacarídico de
Legionella pneumophila según reivindicación 2,
caracterizado porque la sensibilización de las partículas de
látex con el antígeno LPS de Legionella pneumophila consta
esencialmente de los siguientes pasos:
- a)
- un volumen determinado de suspensión comercial de las partículas de látex se lava con tampón fosfato salino (PBS) y se resuspende en el mismo,
- b)
- la suspensión de látex se mezcla con la suspensión de LPS y con tampón PBS, transcurriendo el proceso de adsorción con agitación a temperatura ambiente,
- c)
- finalizada la adsorción, las partículas de látex sensibilizadas se lavan con tampón fosfato (PB).
4. Procedimiento de obtención de partículas de
látex sensibilizadas con LPS de Legionella pneumophila según
reivindicación 3, caracterizado porque en el paso a) se
realiza un lavado de un volumen determinado de suspensión comercial
de las partículas de látex con 20 volúmenes de PBS y la
resuspensión en este tampón se hace a una concentración del 5% de
contenido sólido.
5. Procedimiento de obtención de partículas de
látex sensibilizadas con un antígeno LPS de Legionella
pneumophila según reivindicación 3, caracterizado porque
en el paso b) la suspensión de látex se mezcla con la suspensión de
antígeno LPS a razón de tres volúmenes de látex al 5% con 1 volumen
de antígeno y todo ello con 20 volúmenes de PBS, transcurriendo el
proceso de adsorción con agitación por un periodo entre 6 y 12 horas
a temperatura ambiente.
6. Procedimiento de obtención de partículas de
látex sensibilizadas con LPS de Legionella pneumophila según
reivindicación 3, caracterizado porque en el paso c) las
partículas de látex sensibilizadas se lavan dos veces con 20
volúmenes de PB.
7. Procedimiento de obtención de partículas de
látex sensibilizadas con LPS de Legionella pneumophila según
reivindicación 2, caracterizado porque el bloqueo de las
partículas de látex, ya sensibilizadas, con albúmina de suero
bovina (BSA) consta esencialmente de los siguientes pasos:
- a)
- las partículas son redispersadas en una solución de ácido acético que contiene BSA,
- b)
- las partículas sensibilizadas y bloqueadas se lavan con tampón glicina (GB) y se resuspenden en GB y NaN_{3}.
8. Procedimiento de obtención de partículas de
látex sensibilizadas con LPS de Legionella pneumophila según
reivindicación 7, caracterizado porque en el paso b) las
partículas sensibilizadas y bloqueadas se lavan dos veces con 20
volúmenes de GB a pH 8 y se resuspenden al 0.065% en GB, pH 8 y 0.2
mg/ml de NaN_{3}.
9. Uso de las partículas de látex sensibilizadas
con LPS de Legionella pneumophila mediante el procedimiento
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la puesta en
práctica de un procedimiento (test de inmunodiagnóstico) para la
detección y cuantificación de anticuerpos específicos frente a
Legionella pneumophila presentes en muestras
serológicas.
10. Tampón de reacción caracterizado
porque es una solución de los siguientes componentes: Glicina, NaCl
u otra sal de cationes monovalentes, ácido etilendiaminotetracético
(EDTA), Albúmina de suero bovino (BSA) y NaN_{3}.
11. Tampón de reacción según reivindicación 10,
caracterizado porque dicha solución contiene sus componentes
en las siguientes concentraciones: 0,1 M de Glicina, entre 300 y 450
mM (preferiblemente 350 mM) de NaCl, entre
\newpage
0,1 y 0,15% de ácido
etilendiaminotetracético (EDTA), entre 0,7 y 1% de BSA
(preferiblemente 1%), y 0,2 mg/ml de
NaN_{3}.
12. Tampón de reacción según reivindicaciones 10
ó 11, caracterizado porque tiene un pH de 8.
13. Uso del tampón de reacción según cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 12, para la puesta en práctica de un
procedimiento (test de inmunodiagnóstico) para detectar y
cuantificar anticuerpos específicos frente a Legionella
pneumophila presentes en muestras serológicas.
14. Procedimiento (test de inmunodiagnóstico)
para detectar y cuantificar anticuerpos específicos frente a
Legionella pneumophila presentes en muestras serológicas,
caracterizado porque esencialmente comprende el uso de las
partículas de látex sensibilizadas con LPS de Legionella
pneumophila mediante el procedimiento de reivindicaciones 1 a 8
y/o del tampón de reacción de cualquiera de las reivindicaciones 10
a 12.
15. Procedimiento (test de inmunodiagnóstico)
para detectar y cuantificar anticuerpos específicos frente a
Legionella pneumophila presentes en muestras serológicas
según reivindicación 14, caracterizado porque se desarrolla
mezclando la muestra de suero diluida en el tampón de reacción con
las partículas de látex sensibilizadas con LPS de Legionella
pneumophila.
16. Procedimiento (test de inmunodiagnóstico)
para detectar y cuantificar anticuerpos específicos frente a
Legionella pneumophila presentes en muestras serológicas
según reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque las
titulación del suero se realiza mezclando la muestra de suero
diluida en el tampón de reacción con las partículas de látex
sensibilizadas con LPS de Legionella pneumophila, en
pocillos de una placa de microtitulación.
17. Procedimiento (test de inmunodiagnóstico)
para detectar y cuantificar anticuerpos específicos frente a
Legionella pneumophila presentes en muestras serológicas
según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16,
caracterizado porque consiste en un proceso de
aglutinación-sedimentación de las partículas de
látex sensibilizadas con LPS de Legionella pneumophila, en
el que se produce la aglutinación específica de las partículas de
látex sensibilizadas en presencia de anticuerpos específicos frente
a Legionella pneumophila en el suero y la sedimentación de
estas partículas de látex sensibilizadas en ausencia de dichos
anticuerpos específicos en el suero.
18. Uso del procedimiento (test de
inmunodiagnóstico) para detectar y cuantificar anticuerpos
específicos frente a Legionella pneumophila presentes en
muestras serológicas de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17,
para la puesta en práctica de un método de diagnóstico de
enfermedades producidas por Legionella pneumophila.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200300670A ES2237272B1 (es) | 2003-03-21 | 2003-03-21 | Reactivo de latex para la deteccion de anticuerpos frente a legionella pneumophila. |
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| ES200300670A ES2237272B1 (es) | 2003-03-21 | 2003-03-21 | Reactivo de latex para la deteccion de anticuerpos frente a legionella pneumophila. |
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| ES2237272A1 ES2237272A1 (es) | 2005-07-16 |
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| ES200300670A Expired - Fee Related ES2237272B1 (es) | 2003-03-21 | 2003-03-21 | Reactivo de latex para la deteccion de anticuerpos frente a legionella pneumophila. |
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| RU2505819C1 (ru) * | 2012-12-07 | 2014-01-27 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЛИМЕРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Legionella pneumophila 1,3 И 6 СЕРОГРУПП (ВАРИАНТЫ) |
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| RU2505819C1 (ru) * | 2012-12-07 | 2014-01-27 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЛИМЕРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Legionella pneumophila 1,3 И 6 СЕРОГРУПП (ВАРИАНТЫ) |
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