JPS63500797A - 崩壊加速因子に対するモノクロ−ン抗体、その生成方法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 崩壊加速因子に対するモノクローン抗体、その生成方法および使用 技術分野 米国政府は、米国保険人類サービス省の許可番号ＮＩＨＡ１−１３２２４号およ びＰ３０ＣＡ−１６０８７号に基づき本発明の権利を有するものである。

背景技術 崩壊加速因子（ＤＡＦ）は、赤血球膜から単離され、特定された７　０，０００ Ｍｒの蛋白質である。従来、ＤＡＰは、補体カスケードの増幅酵素が赤血球表面 に集まるのを抑制し、赤血球細胞が自らの補体により損傷を受けるのを防止する 機能を有するのではないかと考えられてきた。すなわち、ＤＡＦがＣ３−コンバ ターゼ（Ｃ４ｂ２ａおよびＣ３ｂＢ　ｂ’）と０５−コンバターゼ（Ｃ４ｂ２　 ａ３　ｂおよびＣ３ｂＢｂ３ｂ）との集合を妨げるという具体的な証拠がある。

Ｍｅｄｏｆ、Ｍ、Ｅ、らのＪ　、ＥｘＰ、Ｍｅｄ、　１６０：１５５８　（１９ ８４年１１月）参照。

ＤＡＦの作用について明確な機構は知られていない。しかし、ＤＡＦがＣ４ｂま たはＣ３ｂに結合してＣ２およびファクタＢとの相互作用を拮抗的に防止すると いういくつかの証拠がある。

前掲Ｍｅｄｏｆらの報告参照。　゛ 赤血球のＤＡＦは、それが見い出される膜においてのみ機能する。すなわち、Ｄ ＡＦは、隣接細胞の０３−もしくはＣ５−コンバターゼまたは外部基質例えばバ クテリアもしくは免疫複合体には作用しない。ＤＡＦのこのような挙動により、 ＤＡＦは赤血球が自らの補体により損傷をうけるのを防止することが考えられる 。

この上うなりＡＦの機能についての仮説は、ｐ　ａｎｇｂｕｒｎらの発見〔米国 科学アカデミ−誌８０　：　５４３０　（１９８３））およびＮ　１ｃｈｏｌｓ ｏｎ　−Ｗｅｌｌｅｒらの発見〔米国科学アカデミ−誌８０：５０６６（１９８ ３））と符合する。すなわち、赤血細胞の補体活性に対する異常に高い感受性に よって特定される後天性の症候群である夜間発作性血色素尿性症（ＰＮＨ）患者 由来の赤血球はＤＡＦ欠乏性である。また、ＰＮＨにおいては、血小板および白 血球異常も見られる。しかし、これら血小板および白血球異常におけるＤＡＦの 役割は未だ判明するに到っていない。

したがって、ＤＡＦの性質および機能についてさらに研究する必要があることは 明らかである。このような研究は、ＤＡＦの機能について理解を深めるとともに 、ＰＮＨの治療または処置にも貢献し得るものである。

不幸にも、ＤＡＦは、天然には極めて微量しか生起しない。

純ＤＡＦ１ａ＋ｇを得るには、赤血球膜７．０００９を入念かつ一時間をかけて 処理する必要がある。ＤＡＦに対するモノクローン抗体（抗−ＤＡＦ）を利用す ると、ＤＡＦの精製（イムノアフィニティクロマトグラフィによる）が非常に簡 単化され、新たなりＡＦ源を見い出す助けともなり、組換技術によりＤＡＦの合 成も可能となり得るであろう。さらに、組換技術によるＤＡＦの合成が達成され れば、ＤＡＦの構造についての詳細な情報も得られるであろう。

しかしながら、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる試験のように、蛋白質を精製して等質性 にすることが困難であったために、本発明以前のモノクローン抗−ＤＡＦを生成 させる試みは成功しなかった。すなわち、細胞融合に先立って初期免疫化するた めには純ＤＡＦを必要とする。

発　明　の　開　示 したがって、本発明は、ＤＡＦに対するモノクローン抗体を提供することを目的 とする。

また第２に、本発明は、新たなりＡＦ源の発見、ＤＡＦの精製、ＤＡＦを生成す る組換型の微生物のスクリーニング、およびＤＡＦ研究における研究手段として 役立てるのに有用なりＡＦに対するモノクローン抗体を提供することを目的とす る。

さらに第３に本発明は、ＤＡＦに対するモノクローン抗体を生成させ、精製する ための手段および方法を提供することを目的とする。

さらにまた第４に、本発明は、ＤＡＦの精製、ＤＡＦを含有する新たな細胞の発 見およびＤＡＦを生成する組換型の生物のスクリーニングにモノクローン抗−Ｄ ＡＦを使用することを目的とする。

さらに第５に、本発明は、モノクローン抗−ＤＡＦを包含する手段および方法を 提供し、これらの手段および方法を使用してＤＡＦの構造および機能についてさ らに研究し、ＰＮＨを診断、治療、処置し、ＰＮＨの発病およびその他のＤＡＦ 生合成欠陥に由来する赤血球疾患について研究することを目的とする。

また第６に、本発明は、補体により細胞（腫瘍細胞も含めて）の抑止、特に生体 外における抑止を高める方法を提供することを目的とする。

また第７に、本発明は、分子を挿入して細胞膜内に到達させるための手段および 方法を提供することを目的とする。

そしてまた第８に、本発明は、ＤＡＰに対するモノクローン抗体を使用すること により、ＰＮＨを診断およびステージングする方法を提供することを目的とする 。

本発明の第１の特徴は、崩壊加速因子と免疫化学的に反応するモノクローン抗体 に係ることである。

本発明の第２の特徴は、崩壊加速因子と免疫化学的に反応するモノクローン抗体 を生成させるための方法であって、前記方法が、 ＤＡＦを含有する細胞からＤＡＦを硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミド ゲル電気泳動およびウェスターンブロッティングにより試験できる程度に等質に 精製し、前記ＤＡＦでマウスを免疫化し、 前記マウスの膵臓細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合させてハイブリット細胞を生 成させ、 前記精製ＤＡＦをスクリーニング剤として使用し、前記ハイブリット細胞をスク リーニングして前記モノクローン抗体を分泌するハイブリッド細胞を同定する、 ことからなる方法に係ることである。

本発明の第３の特徴は、モノクローン抗−ＤＡＦを分泌するハイブリット細胞に 係ることである。

本発明の第４の特徴は、免疫吸着剤としてモノクローン抗−ＤＡＦを使用し、不 純なりＡＦｇ製物をイムノアフィニティクロマトグラフィに付することによりＤ ＡＦを精製する方法に係ることである。

本発明の第５の特徴は、ＰＮＨを診断またはステージングするための方法であっ て、前記方法が、患者の赤血球に含まれるＤＡＦの量を測定し、前記ＤＡＦ量を 正常で健康なヒトの赤血球に含まれるＤＡ’Ｆ量と比較することからなる方法に 係ることである。

本発明の第６の特徴は、ＤＡＦと抗−ＤＡＦとの間で免疫化学反応を可能にする 条件下、細胞抽出物を抗−ＤＡＦの存在に付し、結合した抗−ＤＡＦとこのよう にしてＤＡＦが存在することとなった組織とを同定することによりＤＡＦ源を発 見するための方法に係ることである。またこれに関連して、本発明の第７の特徴 は、モノクローン抗ＤＡＦを使用し、ＤＡＦ存在組織からＤＡＦを抽出するため の方法に係ることである。

本発明の第ｉの特徴は、原ＤＡＦ分子に生起する連鎖からなるアミノ酸連鎖を有 する蛋白質を生成する組換型の微生物をスクリーニングするための方法であって 、前記方法が、ＤＡＦ−（抗−ＤＡＦ）免疫化学反応が生起する条件下前記微生 物の調製物をモノクローン抗−ＤＡＦの存在に晒し、前記反応が生ずるかどうか を測定する方法に係ることである。

以下、特に好ましい実施例について本発明をさらに説明する。

なお、以下の記載において、添付の図面を参照する。

図面の簡単な説明 第１図は赤血球当たりのＤＡＦ分子数を実施例５の方法に従い抽出に付される赤 血球数に対してプロットしたものである。

第１図は赤血球抽出の作業効率を測定したものである。

第２図はハイブリドーマ培養上澄液中の抗−ＤＡＦ検出に使用されたウェスター ンブロッティングの一連のラジオオートグラフである。

第３図は種々の細胞型におけるＤＡＦの存在を証拠づける一連のラジオオートグ ラフである。

第４図は正常なヒトおよびＰＮＨ患者の赤血球ＦＡＣＳ分析結果をプロットした ものである。

第５図は抗−ＤＡＦを使用し、正常なヒトおよびＰ　Ｎ　Ｈ患者の血小板ＦＡＣ Ｓ分析結果をプロットしたものである。

第６図は正常なヒトお上びＰＮＨ患者の白血球（単核細胞、多形核細胞およびリ ンパ球）Ｆ’ＡＣＳ分析結果をプロットしたものである。

第７図は酸性化した血清で崩壊したＰＮＨ患者の赤血球ＦＡＣ８分析結果をプロ ットしたものである。

発明を実施するための最良の形態 赤血球ＤＡＦをまずＮ　１ｃｈｏｌｓｏｎ　−Ｗｅｌｌｅｒらにより米国科学ア カデミ−誌８０　：　５０６６．１９８３　（参考文献として含まれる。）に記 載された如く分割法で精製し、続いて、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性 アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過′およびレクチンアフィニティクロマ トグラフィで順次精製した。このようにして精製した生成物をさらにＩ　ｉｄａ らによりＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５５　：］４２７，１９８２　（参考文献とし て含まれる。）に記載された方法に従い処理した。すなわち、ＣＲＩ（以下に記 載する如くして得られる。）に対するモノクローン抗体を免疫吸着剤として使用 し、イムノアフィニティクロマトグラフィセルロースカラムにより夾雑するＣＲ Ｉを除去した。流出物を再度陰イオンクロマトグラフィで精製し、続いて、サイ ジングカラム（ステ−ジング、ブロンマ所在のＬＫＢより入手されるＴＳＫＧ　 ３０００ＳＷ）工高性能液体クロマトグラフィにより精製して、残留夾雑物、特 にグリコフォリンを除去した。最終生成物は、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｆ　Ａ、　Ｇ　Ｅ およびウェスターンブロッティングにより等質であった。

この高純度精製ＤＡＦをモノクローン抗−ＤＡＦ生成のためのマウスの免疫化に おける抗原として使用した。本発明におけるような目的に対しては、ＤＡＦ調製 物の夾雑物に対する抗体が生起しないように高純度の抗原が望ましい。何故なら ば、これらの夾雑物のうちには、ＤＡＦそれ自身よりもはるかに抗原性の強いも のがあるからである。

しかしながら、本発明によりＤＡＦに対するモノクローン抗体が生成されたので 、ＤＡＦの精製方法は、好ましくは、免疫吸着剤としてモノクローン抗＝ＤＡＦ のカクテルを使用するイムノアフィニティクロマトグラフィによることとなろう 。したがって、高純度のＤＡＦが望ましい場合には、上記した陰イオンクロマト グラフィによる精製に先立って、ＤＡＦ調製物をイムノアフィニティクロマトグ ラフイに付すのが好ましい。

マウスの骨髄腫細胞と上記のようにして精製したＤＡＦで免疫化したマウスの婢 臓リンパ球とを融合させてハイブリドーマを形成した。モノクローン抗体生成に 使用した方法は一般によく知られている方法である。例えばＧ　ｏｄｉｎｇ、　 Ｆ　、　Ｗ　、著Ｍｏｎｏｃｌ。

ｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃ ｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　（Ｌｏｎｄｏｎ　１９８３　） 参照。この方法の貴重な変法は以下の実施例２および３に詳細に記載する。すな わち、ポジティブな（陽性）クローンの選択は、抗原として夾雑物を含むＤＡＦ ｎ製物を使用してウェスターンブロッティングによりなされた。このような陽性 クローンの選択により、７０，０００Ｍｒバンドと反応するモノクローンの正確 な同定が可能となった。

このようにして単離されたモノクローン抗−ＤＡＦは、特定され、ＤＡＦ特異的 であることが見出された。そして、これらの抗体のカクテルのみがＤＡＦ活性を 定量的（９８％）に中和した（実施例１０参照）。これら抗体の特異性は、ＤＡ Ｆ活性の抑制（実施例１０および第１表参照）とイムノブロッティングとにより 確認された。

その他の血液細胞およびリンパ細胞のＤＡＦ含有量は以下のようにして測定した 。末梢血細胞および扁桃細胞を、実施例４に記載した以外の血液およびリンパ分 割技術を使用することも可能であるが、好ましくは実施例４に記載したようにし て収集し、分離した。このようにして、赤血球、血小板、好中球、軟膜細胞、単 核細胞、Ｔ−リンパ球、さらには扁桃Ｔ−およびＢ−リンパ球調製物が得られた 。細胞抽出物は、実施例５に記載したように各調製物から形成された。

ＤＡＦは、予め調製した標識化されたモノクローン抗＝ＤＡＦを使用してこれら の細胞抽出物から免疫沈降された（実施例１）。この免疫沈降操作は実施例６に 詳細に記載する。細胞抽出物におけるＤＡＦの存在は、さらに、２一部位免疫放 射分析法により立証された（実施例１２）。これらの種々の細胞型によるＤＡＦ の表面発現は、蛍光活性化された細胞ソータ分析法［ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ 　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　５ｏｒｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ（以下ＦＡ Ｃ８分析法と略称する。）〕により測定した。測定方法力＜ＩＨＭＡである場合 には、ＤＡＦ分子は好中球に最も数多く見出され、次いで、単核細胞およびリン パ球に数多く見出された。ＦＡＣＳ分析法による場合には、単核細胞が最も数多 くの表面ＤＡＦを有していた。このことは、好中球中にＤＡＦが内部集積して存 在することを示すものである。

最も重要なことは、赤色細胞から精製されたＤＡＦが生体外でこれら赤色細胞の 膜内に自然に再挿入されることである。このことは、ＤＡＦまたはＤＡＦドメイ ン（あるいはこのようなドメインの後転写されたペプチド）がその他の分子を細 胞膜内に到達させるための輸送手段として使用できることを意味する。

このようにＤＡＦを輸送手段として使用するにはいくつかの方法があり、 （ａ）ＤＡＦドメイン、ペプチドまたは分子を膜内に輸送される分子に化学的に 共役させたり、 （ｂ）膜を捜しめるＤＡＰドメインを含有するハイブリッド分子を遺伝子工学的 に創出したり、 （ｃ）膜探査Ｄ　Ａ、　Ｆドメインを合成してそれを到達分子に結合させたり、 すればよい。

ＤＡＦの分子量は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されるように種々の細胞型の間 で変化する。

Ｉ　ＲＭＡおよびＦＡＣＳ分析法により正常なヒトの赤血球中に存在するＤＡＦ の量をＰＮＨ患者の赤血球中に存在するＤＡＦの量と比較した。Ｐ　Ｎ　Ｈ患者 の赤血球は全てＤＡＦ欠乏性でＰ　Ｎ　Ｈ患者由来の血小板および白血球は、赤 血球におけると同様にＤＡＦ欠乏性であることが見出された。

研究の結果、患者細胞のＤＡＦ欠乏量と疾患の重度との間に相関があることも示 唆される。したがって、ＤＡＦはＰＮＨの診断およびステージングのための標識 としても使用することができる。細胞膜たりのＤＡＦ’分子数は、本発明室中に 記載されたいずれの技術、例えば、免疫沈降法、Ｉ　ＲＭＡまたはＦＡＣ８分析 法によっても測定することができ、正常なヒトおよびＰＮＨ患者について確立さ れた標準と比較することができる。

−人のＰＮＨ患者ＳＢにおいては、赤色細胞、単核細胞、好中球および血小板に ついて、２つの母集団が末梢血中に見出された。このうち、１つの母集団は、表 面ＤＡＰが著しく欠乏していて、もう１つの母集団は正常を呈していた。この患 者由来のリンパ球は、正常な表面ＤＡＰ濃度を有していた。

その他の二人の患者ＧＣ，ＶＲにおいては、リンパ球表面のＤＡＦ発現も異常で あった。さらに重度の疾患を存する患者ＧＣにおいては、ＰＭＮ（多形核細胞） 、単核細胞ならびに大部分の赤色細胞およびリンパ球がＤＡＦ陰性であった。患 者ＶＲの血液要素には、少量のＤＡＦが検出され、この場合、ＤＡＦ欠乏は、非 機能性または抹消された遺伝子によるというよりもむしろ遺伝子の異常調節によ って惹起されたものであることを示唆する。

これらの観察結果は、ＰＮＨ細胞がモノクローン源であり、異常な骨髄原のクロ ーン拡大によって生ずるというこれまで存続している概念をさらに支持するもの である。患者ＳＢにおいては、赤血球系統、骨髄系統および巨核球系統も異常で あり、突然変異が共通の前駆体において生起していることを示している。この患 者ＳＢにおいては、前記三系統由来の正常な要素も異常な要素も循環系中に見出 され、これら要素の３／４がＤＡＦ欠乏性である。前記要素の比率は、１０週間 の間隔をおいて採取した血液試料においても変化することなく、異常および正常 骨髄前駆体増殖と、末端細胞の循環系からの回収との間に事実定常状態があるこ とを反映している。患者ＧＣおよびＶＲにおいては、リンパ球もＤＡＦ欠乏性で あるので、全ての血液要要素を生みだす更に元となる細胞が恐らく異常であった 。このような全てを司る細胞は単離されてもいず、また形態学的に同定もされて いないが、哺乳類の生後に生ずる骨髄中にそのような細胞が存在するという注目 せざるを得ない証拠がある。

ＰＮＨ細胞の膜内に見られる多重奇形を生む一連の事象が説明を要すべく残され ているけれども、本発明により可能となった発見はこの病気の病原論に関するも のである。ＤＡＦ欠乏はＰＮＨに特有な性質のいくつか、例えば、赤血球、Ｐ　 Ｍ　Ｎおよび血小板表面への０３フラグメントの大規模な集積ならびにこれら細 胞の補体による崩壊に対する異常感受性を説明することができる。事実、ＤＡＦ はＣ３−コンバターゼの集合を抑制し細胞表面へのＣ３ｂの沈着を防止する。第 ７図はＤＡＦ欠乏性細胞を酸性の新鮮血清に付したとき、ＤＡＦ欠乏性細胞が優 先的に崩壊される直接的な証拠を表わす。しかし、白血球および血小板へのＣ３ ｂの集積と観察される血小板減少症、白血球減少症、血栓症の増大傾向および感 染との間の関係は未だ不明である。血小板へのＣ３ｂ付着が血小板の凝集放出反 応および凝塊性の向上を生むこと、およびＰＮＨ好中球へのＣ３ｂの付着が走化 性の欠除を生ずることを提唱する人々もいた。

ＤＡＦの機能についての現在の知識を基にしては、ある特定のＰＮＨ患者の細胞 が単離されたＣ３ｂ−９作用複合体に対して高い感受性を示すことを説明するこ とは難しい。したがって、上記高感受性がＤＡＦ欠乏に対して副次的なものであ るかどうか、またはＤＡＦ欠乏とは無関係な細胞膜異常性を含むものであるかど うかを検証するためには更なる研究を必要とする。本発明により可能となった抗 −ＤＡＦの利用および大量のＤＡＦは、ＤＡＦの発生および機能についてさらに 研究するための有益な手段を提供することとなるであろう。

ＤＡＦに対する抗体のもう１つの重要な応用は、補体による細胞例えば腫瘍細胞 の抑止を高めることであろう。例えば、骨髄移植組織を有効に活用するための大 きな障害のひとつは、グラフト−ホスト反応を媒介することができる成熟したＴ リンパ球が骨髄に存在することである。これらのＴ細胞は、補体の存在において 、Ｔ細胞標識に対するモノクローン抗体により抑止することができる。宿主の骨 髄細胞を抗−ＤＡＦで処理するとＴ細胞の抑止を促進し、ヒト由来の補体、さら には自己由来の補体□さえも使用可能とすることが期待される。

このような骨髄移植には、現在、兎の補体が使用され、効果的である。その理由 は、恐らく、兎のＣ３ｂおよびＣ４ｂが宿主の骨髄細胞でヒトのＤＡＦにより抑 制されないからである。しかし、ヒトの補体を使用するのが好ましい。

また現在、抗体および補体を使用して骨髄から選択的に腫瘍細胞を除去すること 、特に自己移植のために使用される骨髄から選択的に腫瘍細胞を除去することに 非常な関心が集中している。抗−Ｄ　Ａ　Ｆ’抗体は、腫瘍および補体に対して 特異的な抗体とともに使用した場合、生体外でこれらの腫瘍細胞の抑止を促進す ることができる。抗−ＤＡＦは抗腫瘍特異性抗体と結合するのであろう。抗体共 役体は、これらの腫瘍細胞のＤＡ’Ｆに結合し、これらの腫瘍細胞を補体により 崩壊しやすくする。

以下、本発明を具体的な実施例に基づき、さらに詳細に説明する。しかし、これ らの実施例は、本発明を理解しやすくするためのものであって、何ら本発明を限 定するものでもない。

以下の略語は、それぞれ、以下の意味を有する。

ＡＺ＝ナトリウムアジド、ＣＲ１＝Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプタ、ＤＡＦ＝崩壊加速 因子、Ｅｈｕ−人の赤血球、ＥＡＣ１４１ｉｍ＝過剰量の０１と限定量のＣ４と を産む抗体感作性羊赤血球、ＥＡＣ１４１驚ｍ（ＤＡＦ）＝ＤＡＦで感作された ＥＡＣ１４１ｉｍ細胞、ＥＡＣ１４１驚ｍ（Ｂｕｆｆｅｒ）　＝基準としてバッ ファで処理されたＥＡＣ１４１ｉｍ細胞、ＦＡＣＳ＝蛍光活性化された細胞ソー タ、ＩＲＭＡ＝免疫放射分析法、ＮＰ４０＝ノニデットＰ−４０＝非イオン性洗 浄剤、ｌＡｌ０．ｌｌＨ６および■Ａ７＝３つの抗−ＤＡＦモノクローン抗体、 ＰＭＳＦ＝フェニルメチルスルホニルフルオライド、ＰＮＨ−夜間発作住血色素 尿症、５ＤＳ−硫酸ドデシルナトリウム、Ｚ＝細細胞りの溶血部位数。

１驚 ★ＰＢＳ　：ダルベコのリン酸塩緩衝生理食塩水：ニューヨーク州グランドアイ ランド所在のＧＩＢＣＯ社から入手される。

★ＤＧＶＢ”°：２．４７ｍＭのナトリウムベロナールバッファにュージャージ ー州フェアローン所在のフィッシャーサイエンティフィック社製）ｐＨ７，３， ７２，７ｍＭのＮ　ａＣＱ、２゜５％のデキストロース、０．１％のゼラチン、 ０．１５ｍＭのＣａＣｆ２−ｔおよび０．５ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１２ｔを含有する 等張性ベロナ−ルバッファ。

＊’Ｅ：）’７０−ン抗−ヒトＣＲＩ、５７Ｆ　参考文献とするＩ　ｉｄａ。

Ｋ、らのＪ、Ｅｘｄ、Ｍｅｄ、１５５：１４２７（１９８２）に記載されている ようにして調製した。要するに、抗体は、骨髄腫細胞とＣＲＩで免疫化されたマ ウスの胛蔵細胞との融合により調製されたハイブリドーマの培養により得られた 。ＣＲＩに対する抗体は、カルフォルニア州マウンテンビュー所在のベクトンー ディッキンソン社から市販されている。

大兎抗−グリコフォリンＡ　参考文献とするＭ　ｅｄｏｒ、Ｍ　、Ｅ　、らのＪ 、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６０：１５５８（１９８４）に記載されているようにして 調製した。要するに、兎は、純グリコフォリンＡで免疫化され、４週間後出面し た。

★モルモットＣＩ　参考文献とするＮ　ｅｌｓｏｎ、　Ｒ、Ａ　、らのＩ　ｍｍ ｕｎｏｃｈｅｍ、３：、１１１（１９６６）に記載されているようにして調製し た。これはまた、フロリダ州マイアミ所在のコルディスラボラトリーズインク社 から入手することもできる。

★ヒトＣ４およびＣ２参考文献とするＴａｃｋ、Ｂ、Ｆ、らのＭｅｔｈ、Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、８０：６４（１９８１）に記載されているようにして調製した。これ とは別に、これらは前掲のコルディス社からも入手することができる。

モルモットＣＩの溶血部位３００　（Ｚ：３００）とヒトＣ４の１〜２部位を有 する★抗体感作された羊昌血球（以後、ＥＡＣ１４１ｉｍと称する。） これは前掲Ｍｅｄｏｒにより記載されているようにして調製した。

抗体感作された羊赤血球はコルディス社から入手することができる。これらの細 胞は、適当量のＣＩと３０℃で１５分間インキュベートし、ＤＣＶＢ”で洗浄し 、次いで、適当量の０４と３０°Ｃで２０分間インキュベートして、それぞれＣ １３００Ｚと０４　１〜２Ｚとした。

ＥＡＣ１４１ｉｍ細胞は、Ｄ　Ｇ　Ｖ　Ｂ　”において５Ｘ１０”細胞／２ρの ＥＡＣ１４１ｉｍを３７℃で３０分間インキュベートすることによりＤＡＦで感 作された。これらの細胞は、以後ＥＡＣ１４１ｉｍ（ＤＡＦ）と称し、ＤＧＶＢ ″０で２度洗浄した。基準として、ＥＡＣ１４１ｉｍ細胞は、ＤＧＶＢ”バッフ ァのみで同様に処理され、ＥＡＣ１４１ｉｍ（Ｂｕｆｆｅｒ）と称することとす る。

実施例１　抗原（ＤＡＦ）の精製 集めたヒト赤血球（Ｅ　ｈｕ）支質からＤＡＦを精製した。Ｎ１ｃｈｏｌｓｏｎ 　−ＷｅｌｌｅｒらによりＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２９　：１８４　（１９８２ ）および米国科学アカデミ−誌８０：５０６６（１９８３）−いずれも本明細書 において参考文献とするーに記載されている一連の分割法をまず使用した。

血液４ユニツト（国際単位）からＥｈｕゴーストをブタノールで抽出し、得られ たブタノール飽和水層を、ＤＢＡＥ−セファセル、フェニル−セファロース（い ずれもニューシャーシー州ビスカタウエイ所在のファルマシア　ファインケミカ ルズ社製）、ヒドロキシアパタイトバイオゲルＨＴ（カリフォルニア州すッチモ ンド所在のバイオラッドラボラトリーズ社製）およびレンチルーレクヂンーセフ ァロース（ファルマシア社！！！ｌりを使用して前掲Ｎ　１ｃｈｏｌｓｏｎ−Ｗ 　ｅｌｌｅｒの方法に従って一連のクロマトグラフィに付した。

精製中、ＤＡＦは、Ｎ　１ｃｈｏｌｓｏｎ−Ｗ　ｅｌｌｅｒらによりＪ　、ｉ　 ｍｍｕｎｏｌ。

１２９　＋１８４　（１９８２）に記載されているように、そのＥＡＣ１４２の 崩壊を加速する能ツノにより分析した。ＥＡＣ１４２細胞（ＩＸＩＯ８細胞／辺 細胞７濁ρを１００μｇ）を被検試料または基準としてのＤＧＶＢ”１００μａ と各々混合して３０℃で５分間インキュベートした。次いで、各混合物に１．３ １ｅの０３−９を添加し、３７℃で６０分間インキュベートし、２゜５００　ｒ ｐｍで５分間遠心分離した。細胞の崩壊度は、上澄液に放出されたヘモグロビン の（ＯＤ　４１２）　４１２　ｎｍ波長における光学濃度で測定した。試料中に はＤＡＦの存在が検出され、このＤＡＦは、ＥＡＣＩ４．２細胞がＤ　Ｇ　Ｖ　 Ｂ　”ティンキュベートした基準に比べ試料中でどれだけ少なく崩壊したかによ り定量された。ＥＡＣＩ　４細胞は適当量の０２と３０℃で５分間インキュベー トすると基準試験管中に５０％崩壊した。

上記操作により得られたＤＡＰ調製物をセファロースビーズに結合したＣＲＩ　 （５７Ｆ）に対するモノクローン抗体で処理すると、夾雑するＣＲＩが除去され た。この調製物を公知のＬａｅｍｍｌｉ、Ｕ、　ＫのＮ　ａｔｕｒｅ　（ａンド ン）２２７　：　６８０　（１９７０）に記載された方法による硫酸ドデシルナ トリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドーゲルー電気泳動（ＰＡＧＥ）および シルバーステイニング（バイオランド社製）により分析するといくつかの夾雑物 が存在することが判明した。これら夾雑物のあるものは特異的兎抗体で顕現され るウェスターンブロッテングによりグリコフォリンであると同定された。

ウェスターンブロツテングは以下のようにして行った。

上述したように部分的に精製したＤＡＦを、非還元条件下、５ＤＳ−ＰＡＧＥに 付し、ニトロセルロース紙に点滴した。この紙を抗グリコフォリン抗血清とイン キュベートし、次いで、ベク）・ンーディッキンソン社製の放射性標識したアフ ィニティ精製山羊抗−兎１ｇとインキュベートした。この試片を乾燥しラジオオ ートグラフィに付した。

ＤＡＦは、更にＤＥＡＥセファセル（ファルマシア社製）クロマトグラフィとＴ ＳＫＧ　３０００　ＳＷゲル濾過マトリックス（スウェーデン国、ブロンマ所在 のＬＫＢ社製）を介する高性能液体クロマトグラフィとを使用して以下のように 精製された。先の粗精製工程による不純なりＡＦ溶液（プール）は、０．０５％ ノニデットＰ−４０（ＮＦ２０．ミズリー州セントルイス所在のシグマケミカル ズ社製の非イオン性洗浄剤）を含有するｐｔ−ｒｓ、ｏの０，０１Ｍリン酸ナト リウムバッファに対し一晩透析し、前記バッファと同じバッファで平衡にある２ ０１１（２のＤＥＡＥ−セファセル（バイオラッド社製）カラムに加えられた。

前記初期バッフｙ５０ｍ１２と、０．３ＭＬ：ｒ）ＮａＣＩ２および０゜０５％ のＮＦ４０を含有するｐＨ６，８の０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファ５０ｘ Ｃとで形成したＮ　ａＣＱ／　Ｉ）　Ｈ勾配を用いて前記カラムを溶離させた。

ＤＡＦバンドは、グリコフォリン主ピークの直前の８〜１０ｍ５に溶離した。Ｄ ＡＦと痕跡量のグリコフォリンとを含有する画分を集め、アミコンＰＭ３０超濾 過装置（マサチューセッツ州レキシントン所在のアミコンコーポレイション社製 ）で濃縮し、０．１％ＮＰ４０−ＰＢＳで。

平衡に保たれたＴＳＫＧ３０００ＳＷにかけた。４本の分離したピークが得られ たが、このうち最初のピーク（排除体積）のみがＤＡＦ活性を有し、このピーク は、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびシルバーステイニングにより評価されるようにＭｒ ７０，０００のバンドであった。この調製物においては、ウェスターンブロッテ ィングによりグリコフォリンは検出されず、抗原は、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウ ェスターンブロッティングにより等質であった。

実施例２　モノクローン抗−ＤＡＦの生成実施例１で得られた精製ＤＡＦ４μ９ を完全なフロイントのアジュバントに溶解させて筋肉内注射することによりＢ　 ａｌｂ／Ｃマウスを免疫化した。この注射をさらに３週間後繰返した。

その血清がウェスターンブロッティングにより１：２００以上の抗体力価を有す るマウスは静脈内で増強され、０．１％のＮＦ２０−ＰＢＳに純ＤＡＦ２０μ９ を産生ずる。３日後これらマウスの膵臓細胞を骨髄腫細胞（メリーランド州ロッ クビル所在のアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手されるＸ６３Ａ ９８．６５３）と融合させた。生じたハイブリドーマの培養上澄液について、後 の実施例３に記載したような抗−ＤＡＦ活性を試験した。このようにして３つの 陽性モノクローン抗体ｌＡｌ０（続いて、１９０２ａと特定された。）、ｌｌＨ ６および■Ａ７（続いてこれらはどれも１９Ｇ１と特定された。）が同定された 。

ＥｙらのＩ　ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５　：　４２９　（１９７８） に記載された方法に従い、モノクローン抗体を培養上澄液から蛋白質Ａ−セファ ロース（ファルマシア社製）で精製し、ヨードケン（イリノイ州ロックランド所 在のピアスケミカルカンパニー製）を用いてＩＩＪで標識した。要約すれば、Ｅ ｙの方法は、培養上澄液をｐＨｓ、６でセファロースビーズとインキュベートす ることにより抗体を蛋白質Ａ−セファロースにュージャージー州ビスカタウェイ 所在のファルマシア社製）に特異的に吸着させることを含む。さらに、このビー ズをｐＨ４，３の酢酸塩緩衝生理食塩水でインキュベートすると抗体を溶離する 。

精製抗体の大部分の量は、５０％飽和硫酸アンモニウムによる沈降、ＤＥＡＥ− セファセルクロマトグラフィおよびセファデックスＧ−２００ゲル濾過により、 ハイブリドーマを有するマウスの腹水から得られた。

実施例１で得られた精製ＤＡＦ（１μ９／酎）を７．５％ゲル上非還元条件下５ ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いでニトロセルロース上に点滴した。この紙を、０． ０２％ＡＺを含有する５％ＢＳＡのＰＢＳ　（５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−ＡＺ）を用 いて３７℃で１時間ブロックし、さらにカットして５　Ｘ　５０’ｍｍの試片と した。この試片と同じ寸法の濾紙片を各試片上に載置した。ハイブリドーマの培 養上澄液２００μｇをこの濾紙に塗布した。基準は、免疫性または正常なマウス 血清を包含するＨＡＴ媒体中でＤＡＦとは特に関係のないモノクローン由来の培 養上澄液を用いて処理した。湿潤室中室温で２時間インキュベートした後、濾紙 を取り除き、試片を５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−ＡＺ各５ｉＱでそれぞれ３回洗浄した 。１０個の洗浄した試片群を、１２５■で標識したアフィニティ精製山羊抗マウ スＩ９Ｇ、（ペンシルバニア州ウェストチェスター所在のカペルラボラトリーズ 社製）を含有する５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−ＡＺ　１０漏Ｑと室温で１時間インキュ ベートし、５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａ、Ｚ各１（１ｍＱで３回洗浄した。

乾燥した試片をコダックＸ−オーマットＸＡＲ−５フィルムにューヨーク州ロチ ェスター所在のイーストマンコダックカンパニー製）に晒してラジオオートグラ フィを行なった。

１敷１支　末梢血および扁桃細胞の調製クエン酸塩加した血液を４℃で１０分間 ５００　Ｘ９で遠心分離した。血漿および軟膜を除去した後、赤血球をＰＢＳで ３回洗浄した。３５人の正常なヒトの血液試料をニューヨーク市所在のニューヨ ーク血液センタから入手した。３人のヒト由来の赤色細胞を、Ｌｕｔｚ、Ｈ，Ｖ 、およびＦｅｈｒ、Ｊ、によりＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５４：１１１７７（ １９７９）に記載されているように、パーコール（遠心分離で濃度勾配を形成す るシリカ粒子のコロ赤色細胞１５ｊＩＱをパーコール溶液３５ＨＱと混合し、こ の混合物を２５．００Ｏｒｐｍで２３分間遠心分離した。生じた赤色細胞バンド を頂部から底部まで等体積の４画分に分割した。上部画分はど軽い赤色細胞を含 有する。

血小板を２５００ｘｙの遠心分離１０分間により血小板富裕の血漿から集め、１ ０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで３回洗浄した。夾雑する赤血球および白血 球は２００　Ｘ９の遠心分離１０分間により除去した。ＰＭＮおよび単核細胞は 、Ｂｏ）＋ｍ。

Ａ、により５ｃａｎｄ、Ｊ　、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、２１．５ ｕｐｐ１．９７　ニア７（１９６７）に記載されているように、フィコール−バ ク−（密度１　、０７７９／ｙｒ（ｌを有する合成高分子溶液；ファルマシア社 から入手可能）上遠心分離により、次いでデキストラン沈渣により、新鮮なりエ ン酸塩加血液から分離された。ヒト血液３０峠をフィコール−バク−２０ｍ＋２ 上に層状にし１５００　ｒｐｍ（４００Ｘ９）で４０分間遠心分離した。単核細 胞は頂部層から回収された。ＰＭＮおよび赤色細胞を含有する結晶小球は、１゜ ２％デキストランに懸濁し、この懸濁液は、細胞を沈渣させるために１時間放置 した。赤色細胞の沈渣が速く、ＰＭＮは懸濁液の上部半分から回収された。

夾雑する赤血球はハイボトニックショッ６りにより除去した。

単核細胞およびリンパ球は実施例４の最初の項目に詳細に記載したように、Ｗｒ ｉｇｈｔ、　Ｓ　、Ｄ　、およびＳ　１ｌｖｅｒｓｔａｉｎ、　Ｓ　、　Ｃ、に よりＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、ｌ　５６　：１１４９　（１９８２）に記載された方 法に従い、パーコール勾配から得られた。上部バンドの細胞の９５％以上が間接 的な免疫蛍光染色によりＯＫＭ５陽性（単核細胞）であった。リンパ球は下部バ ンドから得られ、夾雑する単核細胞の含有率は３％以下であった。

軟膜細胞はクエン酸塩加した血液から５００Ｘｙの遠心分離１０分間により得ら れ、ＰＢＳで２回洗浄した。夾雑する赤血球はハイポトニックショックにより除 去された。

Ｔ−リンパ球は、血液単核細胞をフィコエリスリン共役モノクローン抗ロイシン ｌ−陽性細胞（ルイジアナ州マウンティンビュー所在のべり）・ンーディキンソ ン社から入手可能）により染色し、ロイシンＩ−陽性細胞を蛍光活性化された細 胞ソータ（ＦＡＣＳ、サイトフルオログラフ５０−１−１．マサヂコーセッッ州 ウェストウッド所在のオルソ　インスツルメンツ社製）で選別することにより得 られた。

扁桃リンパ球はフィコール−バーク（ファルマシア社製）上゛　の遠心分離によ り扁桃腺から精製された。Ｔ−およびＢ−リンパ球は、Ｗｅｒｎｅｒ、Ｍ、Ｓ　 、らによりＢＩｏｏｄ４２：９３９　（１９７３）に記載されているようにして 単離された。

実施例上　細胞抽出物の調製 赤血球　５Ｘ１０８個のパックされ、洗浄された赤血球を、合成エラスターゼ抑 制剤、Ｓｕｃ（ＯＭｅ）　−Ａｌａ−Ａ、１ａ−Ｐｒ。

−Ｖａ、ｌ−ＭＣＡ（カルフォルニア州サンカルロス所在のベニンスララボラト リーズインク社製）５０μ９／峠とフェニルメヂルスルフォニルフルオライド（ ＰＭＳＦ、ミズリー州セン）・ルイス所在のシグマケミカルカンパニー製）１ｍ Ｍとを含有する１％ＮＦ４０　ＰＢＳ溶液１２０μＱで崩壊させた。室温でＬ時 間インキュベートした後、前記プロテアーゼ抑制剤を含有する１％ＢＳＡ、−Ｐ ＢＳ１ｘｆｆを添加し、混合物を１２，０００Ｘｙで１５分間遠心分離した。こ の」二澄液は直ちに使用するかあるいは一７０℃に凍結した。赤血球の濃度は溶 血試料の０Ｄ５４１を測定することにより決定した。以下の実験により測定され るように、この操作では抽出可能なりＡＦの８０％しか可溶化しないので、２部 位免疫放射分析法により得られるＤＡＦ含有量は１．２５倍した。

ハックしりＥｈｕ（７）増大１ｔ（１，５Ｘ１０ｓ〜２．４Ｘ１０９）は上記の ようにしてめられ、抽出物のＤＡＦ含有量は２部位免疫放射分析法により測定さ れた。Ｅｈｕ当たり抽出されたＤＡＦの量は、最初に１％ＮＦ４０で処理したＥ ｈｕの関数としてブロワ）・シた。抽出されたＤ　Ａ、　Ｆ量は、洗浄剤に可溶 化したＥｈｕ数の減少につれ、わずかだが漸次増大した。抽出可能なりＡＦ量の 最大量は、第１図に示したように使用したＥｈｕをゼロに補性することにより得 られた。

血小板　血小板懸濁液（ＰＢＳ中２　ｘ　１０８／ｘ□を、５０μ９／ｆｆ（２ のエラスターゼ抑制剤と１ｍＭのＰＭＳＦと５．ｌＦ／＋７２の大豆トリプシン 抑制剤（シグマ社製）と１００ユニツト／１１Ｑのトラシロールにューヨーク州 ニューヨーク所在のモベイケミカルコーポレーション社製）とを含有する等体積 の１％ＮＦ４０−ＰＢＳ液と混合した。この混合物を水冷下２０分間インキュベ ートし、１２，０００ｘｙで１５分間遠心分離して少量の残留不溶性物質を除去 した。

白血球　白血球懸濁液ＣＰＢＳ中ｌＸｌ０’／ｙ＋ρ）を、プロテアーゼ抑制剤 を含有する等体積の１％ＮＦ４０−ＰＢＳ液と混合した。この混合物を水冷下２ ０分間インキュベートし、１５００×９で１５分間遠心分離して損傷していない 核を除去し、さらに１２，０ＯＯｘｙで１５分間遠心分離して不溶物質を除去し た。

実施例６　細胞抽出物からのＤＡＦの免疫沈降蛋白質Ａ−セファロース（１００ μ１２）を、モノクローン抗体ｌＡｌ０を含有する培養上澄液５７！σと室温で １時間インキュベートした。ｌＡｌ０−蛋白質Ａ−セファロースをＰＢＳで２回 洗浄し、次いで、種々の細胞のＮＰ４０抽出物（抽出物１＋σ当りビーズ２０μ ρ）と４℃で１時間インキュベートした。結合されたＤＡＦ分子を、５％ＳＤＳ −１２５ｍＭ）リス塩酸塩。

ｐＨ６，８−１０％グリセロール−０，０１％ブロムフェノールブルーからなる 試料バッファ５０μρと８０℃で５分間インキュベートすることによりビーズか ら溶離させた。この溶離液を、７．５％ゲルを使用して５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し 、電気泳動的にニトロセルロース紙に移動させた。ＤＡＦは、＋２Ｊ識ｌＡｌ０ １ＩＩＨ６または■Ａ７により、次いでラジオオートグラフィにより前記ニトロ セルロース紙において検出された。

これとは別の操作においては、赤血球、単核細胞およびＰＭＮは、ヨードゲン（ イリノイ州ロックフォード所在のピアスケミカルカンパニーから入手される；　 ２　Ｘ　］　０ｅＥｈｕまたは１×１０７白血球当り１ｍＣ１Ｎａ”Ｊ）を使用 して目５Ｉで表面標識した。Ｎ　Ｐ　４０抽出物を調製し、ＤＡＦをｌＡｌ０ま たは標準としての特に関係のない抗体で免疫沈降させた。ＤＡＦバンドは、還元 条件下および非還元条件下の双方において５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、続い てラジオオートグラフィによりプラスチックプレート（９６個のＵ底つェル：カ ルフォルニア州オックスナード所在のベクトンーディッキンソン社製）のウェル は、０．０２％のナトリウウムアジド（ＡＺ）を含有し、ＰＢＳ内に２０μ９／ ｘｃのｌＡｌ０を含有する液５０μｉ２と室温で２時間インキュベートすること により抗−ＤＡＦモノクローンｌＡｌ０（捕捉抗体）で被覆した。このウェルに １％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０２％ＡＺを満たして４℃で一晩放置し、過剰の結合 部位を飽和させた。ウェルを１％ＢＳＡ−０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ’Ｓ −０，０２％Ａ　Ｚ　（Ｔｗｅｅｎ２０は、デラ　゛ウェア州つィルミントン所 在のＩＣＩアメリカズから入手した。

）で３回洗浄し、次いで、細胞抽出物２５μＱまたは純ＤＡＦの１％ＢＳＡ−０ ，０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ−０，０２％ＡＺの逓減希釈液を同時調製的に 添加した。室温で２時間インキュベートし前記バッファで３回洗浄した後、′２ ５Ｉ標識抗ＤＡＦモノクローンｌｌＨ６（発現抗体、４ｎ９，１．２Ｘ１０’ｃ ｐｍ）２５μＱを各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、ウ ェルを前記バッファで４回洗浄し、カットしてＤＡＦ量をカウントした。細胞抽 出物中のＤＡＦＭは精製ＤＡＦで得られた標準曲線から計算された。結合された 発現抗体のカウント数をＤＡＦ濃度の関数としてプロットした上記標準曲線は、 １１１１２当たり２５０　ｎ９のＤＡＦまで直線的であった。純ＤＡＦ溶液の蛋 白質濃度は、公知のＬ　ｏｗｒｙらによりＪ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

１９３：２６５（１９５１）に記載された方法により、基準蛋白質としてＢＳＡ を使用して測定された。

実施例８　蛍光活性化された細胞ソータ（ＦＡＣ９）による細胞表面のＤＡＦ分 析 正常なヒト及びＰＮＨ患者からの赤血球、血小板または軟膜細胞を抗−ＤＡＦモ ノクローン抗体とフルオロセイン共役山羊Ｆ　（ａｂ’　）　２抗−マウス１ｇ （Ｈ＋Ｌ）（カペルラボラトリーズ社製）で処理し、次いで、ＦＡＣ８により分 析した。赤血球（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．１％ＡＺ２５μρ中１０８細胞）を ＤＡＦに対する３つのモノクローン抗体（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．１％ＡＺを 含有する媒体の各抗体／ｉｔρ　５ｒｒ１ｇ）の混合物２５μｇまたは同じサブ クラスの特に関係のないモノクローン抗体の混合物で処理した。水冷下３０分間 インキュベートした後、赤色細胞を２回洗浄し、前記バッファ２５μＱに再懸濁 させ、二次抗体のｌ：５０希釈液２５ｘＱと水中で３０分間インキュベートし、 さらに前記バッファで再度洗浄した。軟膜細胞（前記バッファ２５μρ中１０８ 細胞）を５μ９／震ρのｌＡｌ０（または基準モノクローン抗体）２５μＱと水 中で３０分間インキュベートした。次いで、上述したように、洗浄し、二次抗体 とインキュベートした。バッファに１０ｍＭのＥＤＴＡを添加した以外は赤色細 胞と同様にして血小板を染色した。

ＰＮＨ患者からの洗浄赤血球を６０％酸性化したヒト血清（ＩＯ’Ｅｈｕ／πＱ ）と３７℃で３０分間インキュベートした。崩壊しなかった赤血球を結晶小球化 し、ＰＢＳで２回洗浄した。この操作によりＤＡＦ陰性細胞が選択的に崩壊した 。

Ｐ　Ｎ　Ｈ患者由来の赤血球（ＰＢＳ−０，０２％ＡＺ中１０’Ｅｈｕ／ｘｃ） を等体積の１０ｔｔ９／ｘＱのｌＡｌ０抗−ＤＡＦと混合した。水冷下６０分間 インキュベートした後、細胞をＰＢＳ−０，０２％ＡＺで１回洗浄し、１０　” Ｅ　ｈｕ／　ｘ（ｌに再懸濁させ、次いで、前記バッファで平衡させた蛋白質Ａ −セファロースＣＬ−４Ｂカラム（２Ｘ１０’Ｅｈｕ／肩Ｃをバックしたゲル） にかけた。カラムを密封し室温で１５分間放置した。然る後、このカラムを前記 のバッファ５力ラム体積量で洗浄し、ＤＡＦ陰性細胞（非結合細胞）を集めた。

ＦＡＣＳ分析法により評価したところ、この両分の９０％以上がＤＡＦ陰性であ った。

ついて検討した。患者ＧＣは、４６オのラテンアメリカ系の婦人であり、疾病期 間が１７年の重症患者であった。この婦人は、ノルアントラロン、プレドニゾン の投与を受け、冷凍解除された赤血球の輸血を受けていた。患者ＳＢは４７オの コーカサス人であり、疾病期間が４年で患者ＧＯよりは肩気が軽かった。

この婦人は、投薬は受けておらず、溶血症状の際はヘマトクリット値が２４体積 ％に減少したが、通常は、約３８体積％の安定したヘマトクリット値を維持して いた。患者ＶＲは、４６オの減少症（血小板２０．０００／ｍｎ＋３）と間欠性 貧血の症状があった。この婦人はノルアントラロンおよびプレドニゾンの投与を 受けていた。これらの患者は全て、酸血清（Ｈａｍ）試験およびシュクロース溶 血試験において陽性であった。

実施例１０　抗−ＤＡＦモノクローン抗体ｌＡｌ０１ＩＩＨ６および■Ａ７の特 定 抗−ＤＡＰモノクローン抗体の特異性は、抗原として精製ＤＡＦまたはＥｈｕ膜 の全抽出物を使用するウェスターンブロッティング実験により示された（第２図 ）。第２Ａ図を作成するために用いられた実験においては、抗−ＤＡＦハイブリ ドーマの培養上澄液は、前述した実施例３において記載したように、非還元条件 下で５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した精製ＤＡＦを予め点滴し〜たニトロセルロース試 片とインキュベートした。ＤＡＦ　１０　ｎ９を含有する各試片をハイブリドー マ培養上澄液２００μａと室温で２時間インキュベートした。洗浄後、この試片 を１″５Ｉ標識山羊抗−マウスＩ９Ｇとインキュベートし、洗浄してラジオオー トグラフィに晒した。全ての抗−ＤＡＦ抗体（ＩＡＩＯの場合レーンＬ　ｎＨ６ の場合レーン２および■Ａ７の場合レーン３において）がＤＡＦバンドを検出し た。ＨＡＴ媒体（レーン４）またはＣＲＩに対するモノクローン５７Ｆ抗体（レ ーン５）についてはＤＡＦバンドは検出されなかった。ニトロセルロース試片に Ｅｈｕの膜抽出物を点滴した場合にも、同様の結果が得られた（第２Ｂ図）。こ の実験においては、洗浄したＥｈｕ（５Ｘ１０”細胞）をｐＨ７，８のトリス− 塩酸塩１５１１Ｑで崩壊させた。前述したように、遠心分離により赤血球ゴース トを集め、煮沸することにより前記ゴーストを非還元性ＳＤＳ試料に可溶化し、 ７．５％ゲル中５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続いてウェスタユンブロツティングし た。

各ニトロセルロース試片（３Ｘ　１０　’Ｅｈ＋Ｊｖら得られた全膜蛋白質を含 有する）をハイブリドーマｌＡｌ０（レーン１）、ｎＨ６（レーン２）、■Ａ７ （レーン３）および５７Ｆ抗−Ｃ−シン４とインキュベートした。続いて、上記 の如く第２Ａ図に関して記載したように、２次標識抗体とインキュベートした。

然る後、この試片をラジオオートグラフィに晒した。抗−ＤＡＦ抗体は分子量７ ０，０００の１つのバンドを検出した。対照抗−ＣＲ１は２つの型のＣＲＩを検 出したが、ＤＡＦは検出されなかった。

実施例７で記載した固相の２部位Ｉ　ＲＭＡは、２種のモノクローン抗体のいか なる組合わせにおいても行うことができた。

しかし、捕捉剤および発現剤として単一の抗体を使用した場合、消極的な結果し か得られなかった。このことは、ｌＡｌ０１■Ｈ６および■Ａ７がＤＡＦ分子上 で異なるエピトープを認識したことを意味する。

モノクローン抗体のＤＡＦ活性に及ぼす効果は、ＤＡＦ処理したＥＡＣ１４１ｉ ｍ細胞を使用して試験した（第１表）。抗体ｌＡｌ０．Ｉ［Ｈ６または■Ａ７の みではＤＡＦ活性には全くあるいはごくわずかしか効果がなかった。しかしなが ら、これらの抗体を組合わせて使用した場合、ｌＡｌ０および■Ａ７の組み合わ せ以外は、より大きな効果が観察された。９μ９／Ｍ（ｌ濃度の３つのモノクロ ーン抗体混合物にあってはＤＡＦ活性の９８％が抑制された。これらの結果から 、これらの抗体の結合部位は、ＤＡＦ分子の活性部位とは一致せず、これらの抗 体がＤＡ　Ｆを中和しないことが示唆される。したがって、これらの抗体混合物 は、免疫親和性クロマトグラフィを使用してＤＡＦを精製するのに好適である。

実施例１１　免疫沈降による種々の細胞母集団におけるＤＡＦ然伍久悲Ｌ【 血小板、ＰＭＮ、血液単核細胞、扁桃単核細胞、扁桃Ｂ−およびＴ−リンパ球画 分のＮ　Ｐ　４．０抽出物ならびに純赤血球ＤＡＦの溶液（各ｊｉｆｆ）は、ｌ Ａｌ０産出蛋白質Ａ−セファロースピース（ビーズ２０μ（２）と４℃で１時間 インキュベートした。

実施例６に記載したように、ビーズを非還元ＳＤＳ試料バッファ中で煮沸して、 ビーズからＤＡＦを溶離させて５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続いて、ウエスターン ブロツディングした。第３図に示したように、全ての細胞種がＤＡＦを含有して いた。

ＤＡＦバンドは、ニトロセルロース紙をｌｔＪ標識ｌＡｌ０（ｌ　Ｏ’ｃｐｍ） と室温で１時間インキュベートし、続いて、洗浄し、ラジオオートグラフィによ り検出された。第３図に示したように、レーン１と８とは赤血球からの純ＤＡＦ を含有する。

レーン２〜７は種々の細胞抽出物を含有する。即ち、血液単核細胞（レーン２） 、扁桃単核細胞（レーン３）、扁桃Ｂ−リンパ球（レーン４）、扁桃Ｔ−リンパ 球（レーン５）、多形核白血球（レーン６）、および血小板（レーン７）。ＤＡ Ｆは、■ＡＩＯと同様にＩｆＪ標識ｌｌＨ６または〜’ＩＡ７（図示せず）によ り検出することができた。ＤＡＦバンドのＭｒは細胞型により種々異なった（第 ３図）。血小板およびＰＭＮからのＤＡＦは赤血球からのＤＡＦより大きく（約 ５０００ドルトン）、単核細胞からのＤＡＦはそれらの中間の大きさであるよう であった。寸法の違いは、表面標識した細胞からのＤＡＦの免疫沈降、続く還元 および非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥによっても示された（図示せず）。

実施例１２　正常な易−トルソ”ｙＯｐ□覧久（ｒ）ｍｍＭ（ｆ）　Ｄ　Ａ　Ｆ の定」ＤＡＦ含有量は、実施例７に記載したように、２部位免疫放射分析法を使 用し、細胞のＮＰ４０抽出物において測定された。

第■表に示したように、正常なヒトからの赤血球は、細胞当り平均で（３，３± ０．４）Ｘ１０３分子、即ち４．０および２．１×１０３間の範囲内であった。

血小板および多形核細胞は、各々、細胞当り（２，１±０．３）ＸＩＯ’および （８，５±１．５）Ｘ１０４分子を有していた。分離しなかった単核細胞および 精製した単核細胞は、各々細胞当り（３，６±０．４４）ＸＩＯ’および（６， ８±１．５０）ＸＩＯ’分子を有していた。末梢血からのリンパ球は、細胞当り （３，３±０゜９７）ｘｌＱ’分子を有していた。正常なヒト１人の末梢血から の精製したＴ−リンパ球は細胞当り９．０ＸＩＯ３分子を有していた。扁桃から の未分離単核細胞は細胞当り４．２Ｘ１０’分子を有していた。この扁桃からの 精製したＢ−およびＴ−リンパ球は、各々細胞当り５．４Ｘ１０’および！、７ Ｘ１０’分子を有していた。

末梢血からの種々の細胞型におけるＤＡＦの表面発現は、間接的な免疫蛍光染色 法１．続＜ＦＡＣ８分析法により検討した。

赤血球および血小板は、３つのモノクローン抗体とＦＩＴＣ−山羊Ｆ（ａｂ’） を抗−マウスＮｊＧとの混合物で染色したところ蛍光強度が増大した（第４図お よび第５図の実線）。これらの免疫グロブリンはペンシルバニア州コクランビル 所在のカベルラボラトリーズ社から入手することができる。多形核細胞、単核細 胞およびリンパ球はそれらの光散乱性に従って分離し、別々に分析した。

第４Ａ図は正常なヒトからの赤血球の分析結果を示す。第４Ｂ図は３人のＰＮＨ 患者からの結果を示す。正常な結果は、さらにその他の正常なヒトからの細胞を 使用する同様な試験において生ずる結果（図示せず）に等しい。

これとは対照的に、３人のＰ　Ｎ　Ｈ患者は２つの異なる赤血球母集団を有して いた。第４Ａ図および第４Ｂ図の双方における点線が対照の染色を表わす。

第５Ａ図は正常なヒトからの染色された血小板の分析結果を示し、第５Ｂ図はＰ ＮＨ患者の細胞についての結果を示す。この際もまた、ＰＮＨ患者は血小板の２ つの母集団を有していた。

点線は基準の染色を表わす。

第６Ａ図は正常なヒトからの染色された白血球の分析結果を示し、第６Ｂ図はＰ ＮＨ患者の細胞についての結果を示す。点線は対照の染色を表わす。

第４Ａ図、第５Ａ図および第６Ａ図に示したように、全ての細胞型が表面ＤＡＦ を発現した。蛍光強度は、赤色細胞以外は全ての細胞において正常に分布してい た。なお赤色細胞においては、ＤＡＦの分布は、調べたヒト全員において非常に ひずんでいた。例えば、第４Ａ図に示す試料の平均相対蛍光強度は１２０であっ たが、赤色細胞のかなり大きな部分は約３００の強度を示した。３人のヒトにお いて、パーコール勾配における遠心分離による４両分の密度を基にして赤色細胞 を分離した。ＤＡＦ発現は、赤色細胞の密度の増加につれ減少し、最も軽い細胞 では、最も重い細胞よりもＤＡＦの濃度が１９．４±０．２％も高いことが判明 した。しかしながら、ひずんだＤＡＦ分布はいずれの両分においてもなお観察さ れた（結果は図示せず）。

ＦＡＣ３分析により、単核細胞がＤＡＦ表面発現が最も高いことが判明した（平 均蛍光強度−７５６）。血液細胞のうちで、におけるＤＡＦの表面発現（平均蛍 光強度−２１２）は単核細胞におけるＤＡＦの表面発現よりもはるかに低かった 。リンパ球は２つの明確な母集団として現われた。大きな母集団は全リンパ球の 約６５％を含むが、そのＤＡＦ表面発現（平均蛍光強度−１０９）’は小さな母 集団（平均蛍光強度＝３４９）より小さがった（第６Ａ図）。軟膜細胞をフィコ エリスリン共役抗ロイシン１（パンＴ試薬）と抗−ＤＡＦとで同時に染色した場 合、ＤＡＦの発現の高いリンパ球の９０％以上がロイシンｌ−陰性であった（図 示せず）。このことは、本実施例において記載したＩ　ＲＭ　Ａ結果と一致し、 したがって、扁桃Ｂ細胞の抽出物はＴ細胞の抽出物よりも高いＤＡＦ濃度を有し 、細胞ソーティングにより精製されたＴリンパ球はＤＡＰ含有量が非常に低かっ た。

実施例１３　ＰＮＨ患者からの赤血球におけるＤＡＦの定量３人のＰＮＨ患者か らの赤血球抽出物におけるＤＡＦ濃度を実施例１２記載の２部位免疫放射分析法 で測定したところ正常よりもはるかに低いことが判明した（それぞれ、細胞当り １゜１００．１，０００．および９００分子）。この結果は第■表に示す。

ＤＡＦの表面発現パターンについて情報を得るべく、同一の患者からの赤血球を 実施例１２におけると同様にＦＡＣＳにより検討した。検討前６ケ月輸血を受け ていない患者ＳＢおよびＶＲにおいて、第４Ｂ図および第４Ｄ図に示すように、 赤色細いでは３０％であった。赤色細胞の第２の母集団は陽性であり、患者ＳＢ においては、ＤＡＦは正常濃度であるが、患者ＶＲにおいては、低濃度であった 。第３の患者はしばしば溶血性フライセスを起こし輸血を受けていたので、その 赤色細胞の分析が複雑であった。この場合も、ＦＡＣＳパターンは２つの細胞母 集団を呈し、一方はＤＡＦ陰性（４９％）であり、もう一方も正常なりＡＦｆｉ 度より低かった（第４Ｃ図）。少なくとも部分的に輸血に由来するＤＡＦ含有細 胞の存在を調べるべく、この２つの母集団を、実施例８に記載したように親和性 クロマトグラフィと酸血清崩壊とにより分離し、それらの網状赤血球含有量を測 定した。分割されなかった赤色細胞は１０％の網状赤血球を含有していたが、Ｄ ＡＦ陰性およびＤＡＦ陽性細胞は、各々１７％および２％の網状赤血球を含有し ていた。これとは対照的に、輸血を受けていない患者からの赤色細胞を同様な方 法で分割した場合には、未分離の細胞の網状赤血球含有量とＤＡＦ陽性細胞の網 状赤血球含有量とはあまり違わなかった（患者ＳＢにおいては２．１％対１．６ ％、患者ＶＲにおいては０．９％対０．６％）。したがって、患者ＧＣ固有の赤 色細胞の大部分または全てはＤＡＦ陰性であったようである。このことを確かめ るべく、患者ＧＣのＤＡＰ陰性およびＤＡＦ陽性母集団の双方について、血液型 分類を行なった。

ＤＡＦ陰性母集団には抗原Ｅ、Ｎ、ＫｅｌｌおよびＫｐａが欠けていたが、ＤＡ Ｆ陽性細胞の母集団においてはこれらの抗原が存在していた。

患者Ｓ　Ｂ、Ｇ　ＣおよびＶＲの赤血球をＨａｍ試験に付した場合、それぞれ、 ５４％、３９％および３０％が補体により崩壊した。

いずれの細胞母集団が補体感作性であるかを見出すべく、これら患者の赤血球を 酸性化した血清崩壊に付し、次いで、残留細胞についてＦＡＣＳによりＤＡＦ発 現試験を行なった。

患者ＳＢからの赤血球１０’細胞（第７図におけるＡ−Ｃ）とをバッファ１００ μＱ　（第７図におけるＡおよびＤ）、３０％酸性化した血清１００μＱ　（第 ７図におけるＢおよびＥ）または６０％酸性化した血清１ＯＯＪＬＱ　（第７図 におけるＣおよびＦ）と３７℃°で３０分間インキュベートした。崩壊しなかっ た細胞は、遠心分離により集め、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＦに対するモノクロ ーン抗体または対照抗体で実施例１２において記載したように染色し、その後、 ＦＡＣＳにより分析した。

第７図における実線は抗−ＤＡＦ染色化細胞を表わす。第７図において示したよ うに、酸性化した血清は、ＤＡＦ陰性細胞を優先的に崩壊させた。

すなわち、これら患者からの赤色細胞は非常に異なる量のＤＡＦを発現した。こ れら患者のうちの２人ＳＢおよびＶＲにおいては、一部の赤色細胞のみがＤＡＦ 陰性であったが、最も溶血の激しかった第３の患者においては、患者自身の細胞 のほとんどまたは全てがＤＡＦ陰性であった。これらいずれの患者においてもＤ ＡＦ陰性母集団のみがＨａｍ試験において補体により崩壊した。したがって、赤 色細胞を崩壊から守るというＤＡＦの役割が確認されたこととなる。さらに、患 者の赤色細胞のＤＡＦ含有量は病気の進行につれ減少する。それ故に、赤色細胞 のＤＡＦ含有量はＰＮＨの診断およびステージングに対する指標として使用する ことができる。

実施例１４　ＰＮＨ患者からの血小板および白血球におけるＤ同一の患者からの 血小板および白血球におけるＤＡＦの表面発現をＦＡＣＳ分析法により検討した （第５Ｂ図および第６Ｂ〜Ｄ図）。ＤＡＦ陰性およびＤＡＦ陽性赤色細胞が循環 していた患者ＳＢにおいては、好中球、単核細胞および血小板が２つの明確な母 集団を呈し、そのうち一方は、正常量のＤＡＦ　（各細胞型について、それぞれ 、２３％、２０％および２２％）を有し、もう一方はＤＡＦ陰性であった。リン パ球におけるＤＡＦ発現は正常のようであった（第５Ｂ図および第６Ｂ図）。患 者ＧＣおよびＶＲは患者ＳＢと２つの点で著しく異なっていた。

すなわち、末梢血において、ＤＡＦ欠乏性好中球および単核細胞は単一の母集団 として存在し、ＤＡＦ欠乏性のリンパ球が存在していた（第６Ｃ図および第６Ｄ 図）。患者ＶＲからの単核細胞と好中球とにおいて、また患者ＶＲおよびＧＣに 由来するリンパ球においては少量のＤＡＦが検出された。患者ＶＲのリンパ球お よび赤色細胞からのＤＡＦは、実施例６に記載したように免疫沈降され、実施例 １１に記載したようにウェスターンブロッティングにより調べた。ＤＡＦ領域は 、正常なヒトからのＤＡＦ領域と同じＭｒに検出された（図示せず）。

２人のＰＮＨ患者、ＳＢおよびＧＣからの血小板抽出物におけるＤＡＦ濃度は、 実施例１２に記載したのと同様にＩ　ＨＭＡで測定した（第■表）。ＦＡＣＳ分 析の結果と一致したことから、患者ＳＢからの血小板は約３０％のＤＡＦ正常濃 度を有していた。患者ＧＣの血小板には、ＤＡＦは検出されなかった。

バックした赤色細胞から０．１％ノニデートＰ４０（ＮＰ４０）のリン酸塩バッ ファ生理食塩水でＤＡＦを抽出する。この抽出物を１０，０００Ｘ５で遠心分離 し不溶物質を除去する。抽出物をモノクローン抗−ＤＡＦの混合物に結合したセ ファロースビーズと６０分間インキュベートする。このビーズを洗浄し、上澄液 の光学濃度を２８０ｎｍで０．０２０以下とする。０．１Ｍトリエチルアミンの ０．０１％ＮＰ４０溶液でＤＡＦを溶離し、ＰＢＳ−０，０１％Ｎ　Ｐ　４０で 平衡させたセファデックスＧ−２５を介して濾過する。溶離液を５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅとウエスターンブロリティックに付し、双方の試験により等質であることが判 明する。

考察実施例１６　ＤＡＦのクローンｆｉｔｓ実施例１５で得られた精製ＤＡＦを 参考文献として含むＨｅｎｒｉｃｋらによりＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６　 ：　７９９０　（１９８１）に記載された方法に従い、マイクロシーフェンシン グに付し、Ｎ−末端で２０〜３０のアミノ酸連鎖を得る。ＤＡＰはまたノアノー ゲンブロマイドまたはトリプシンによる環装に付す。高性能液体クロマトグラフ ィによりフラグメントが単離され、このフラグメントは上記のような連鎖である 。連鎖データは、参考文献として含むＤ　ｕｃｋｗｏｒｔｈ、　Ｍ　、　Ｌ　、 らによりＮ　ｕｃｌｅｉｃ　Ａ　ｃｉｄＲｅｓ、９：１９８１　（１９８１）に 記載されているように、混合デオキシヌクレオヂドブローブを合成するために使 用される。

このプローブはＢリンパ球および好中球からのヒトＤＮＡライブラリーをスクリ ーニングするために使用される。ポジティブなりローンは培養液中で増殖され、 プラスミドが精製する。上記フラグメントは、Ｓ　ａｎｇｅｒらにより米国科学 アカデミ−誌７４　：５１６３　（１９７７）に記載されたようにして切断され 、シーフェンシングされる。全ＤＡＦ蛋白質の連鎖はこのようにして明らかにさ れる。

モノクローン抗体の濃度　（Ｉｔ９／ｍＲ）　Ｄ　Ａ　Ｆ活性９　９　９　９８ ．０ ★　ＥＡＣＩ　４］ｉｍ（ＤＡＦ）０）Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ”／１ＮＤＧＶＢ”溶液 １００μｇをＤＡＦに対するモノクローン抗体の種々の組合わせまたは基準とし てのＤ　Ｇ　Ｖ　Ｂ　”各１００μｇと３０℃で１５分間インキュベートした。

ＥＡＣ１４１ｉｍ（Ｂｕｆｆｅｒ）細胞を同様の方法でＤＣＶＢ”と処理し、イ ンプットされたＣ４ｂ溶血部位を測定した。インキュベートした後、細胞をＤ　 Ｇ　Ｖ　Ｂ　”で１回洗浄し、ＤＣＶＢ”１００μＱに再懸濁した。次いで、Ｃ ４ｂ溶血部位を、Ｍｅｄｏｆ、Ｍ、Ｅ、らによりＪ　、Ｅ　ｘｐ、Ｍｅｄ、　１ ６０：ｌ５５８　（１９８４）に記載されているように、Ｃ２で発育させ、続い て０３〜９により発育させた。細胞をＣ２１５０μａと３０℃で５９ｊ間インキ ュベートし、次いで、Ｃ３−９１，３ｍＣを加えてこの混合物を再度３７℃で６ ０分間インキュベートし、然る後、２．５０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離した。崩 壊度は上澄液に放出したＯＤ４＋、により測定した。

＋　Ｄ　Ａ　Ｆ’活性の逆転パーセントは以下のようにして計算した。

ｒ　ｌ：ＥＡｃ１４１ｉｍ（ＤＡＦ）で処理した抗ＤＡＦの数Ｚ−ＥＡＣ１４１ ｉｍ（ＤＡＦ）の数Ｚ）　／　（ＥＡＣ１４１ｉｍ（Ｂｕｆｆｅｒ）の数Ｚ−Ｅ ＡＣ１４１ｉｍ（ＤＡＦ）の数Ｚ）ＩＸ１００式中、Ｚは細胞当りの溶血部位数 である。本実験におけるＥＡ　Ｃ１４１ｉｍ　（Ｂ　ｕｆｆｅｒ）およびＥＡＣ ｌ　４１ｉｍ（ＤＡＦ）は、それぞれ、２．４８０および０．７００であった。

第　■　表 細胞種類　ＤＡＦ分子数（ｘｌｏ−３）士標準偏差／細胞正常な人　赤血球　３ ．３±　０．４　（３５）★血小板　２．１±　０．３　（４）★ ＰＭＮ　８５．０土Ｉ５．０　（４）★単核、全量　３５．７±　４．４　（３ ）★単核細胞　６７．９±１５．０　（３）★リンパ球　３２．８±　９．７　 （３）★ＰＮＨ患者の赤血球（ＳＢ）　１．１ 血小板（ＳＢ）　０．６ （ＧＣ）　検出されず ★検査試料数 Ｐ　Ｎ　Ｉ−（患者におけるＤＡＦの発現細胞型　患者ＳＢ　患者ＧＣ患者ＶＲ 赤血球　６０％検出不能　４０％検出不能★　３０％検出不能４０％正常　６０ ％正常以下★　７０％低濃度血小板　７８％検出不能　検出不能　測定されない 単核細胞　８０％検出不能　検出不能　非常に低い２０偏正常 ＰＭＮ　７７％検出不能　検出不能　非常に低い２３！Ａ正常 リンパ球　正常　非常に低いか　非常に低い検出不能 ★この母集団の大部分または全ての細胞は輸血されている。

Ｆｌθ、ｌ 抽出されたＥｈ”−欧（Ｍ対Ｉ） Ｆ／θ２ Ｆ／θ、３ イヨ　対貧尤注戻 Ｆ／Ｇ、４ １　んｕ　２汐り　ユπ　倍　９θ 羊Ｕ　丈丁黴尤５会度 Ｆ／６．５ 孫　対　玄　九疎潰 Ｆ／Ｇ、６ 利　苅　式　九強良 国際調査報告 ”−””′Ａ””””””　ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１１７７ＡＴＴ八（ＪＭＦＮ Ｔ Ｘ、ＣＬＡＳＳＩＦＩＣＡＴ工ＯＮ　ＯＦ　ＳＯＢ、７ＥＣＴ　ＭＡＴＴＥＲ： 工ＰＣ’：　Ｃｌ２Ｐ　２１１００；　Ｃｌ２Ｎ　１５１００．１１１００．５ １００゜Ｃｌ２Ｒ１／９１ Ｕ、Ｓ＋＝　４３５７７．６８，１７２．２，１７４，２４０，８０３，９４８

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．崩壊加速因子と免疫化学的に反応するモノクローン抗体。
2. ２．前記因子がヒト崩壊加速因子である請求の範囲第１項記載の抗体。
3. ３．前記抗体がＩｇＧ２ａとＩｇＧ１とからなる群から選ばれた重複基準である 請求の範囲第２項記載の抗体。
4. ４．前記抗体が前記崩壊加速因子を中和することなく前記崩壊加速因子と結合す る能力を有する請求の範囲第２項記載の抗体。
5. ５．崩壊加速因子と免疫化学的に反応するモノクローン抗体を生成させるための 方法であって、前記方法が、崩壊加速因子を硫酸ドデシルナトリウムポリアクリ ルアミドゲル電気泳動およびウェスターンブロッティングにより試験できる程度 に等質に精製し、 前記ＤＡＦでマウスを免疫化し、 前記マウスの脾臓細胞をマウスの骨髄細胞と融合させてハイブリットを生成させ 、 前記ハイブリット細胞をスクリーニングして前記モノクローン抗体を分泌するハ イブリット細胞を同定する、ことからなる方法。
6. ６．部分的に精製された崩壊加速因子の調製物が前記ハイブリット細胞をスクリ ーニングするためのスクリーニング剤として使用される請求の範囲第５項記載の 方法。
7. ７．前記因子の精製が、 前記因子を有する細胞を生成させ、 前記細胞から前記因子を抽出し、 前記抽出物を陰イオン交換カラムクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグ ラフィ、ゲル濾過およびレクチン−セファロースクロマトグラフィに付して前記 因子の部分的に精製された調製物を得、 免疫吸着剤としてＣＲ１に対する抗体を使用し、前記調製物をイムノアフィニテ ィクロマトグラフィに付し、前記イムノアフィニティクロマトグラフィの流出物 を陰イオン交換クロマトグラフィに付して前記因子を塩勾配を使用して溶離させ 、 前記因子を高性能液体クロマトグラフィにより精製し、それにより、精製された 因子を硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタ ーンブロッティングにより試験することができる程度に等質とする、ことからな る請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．崩壊加速因子をその不純な調製物から精製するための方法であって、 免疫吸着剤として前記因子に対する結合を逆転させることのできるモノクローン 抗体を使用するイムノクロマトグラフィに前記因子の不純な細胞遊離調製物を載 せ、前記カラムを洗浄して、前記因子をカラムに結合させたまま、夾雑する不純 物を除去し、 前記精製された因子をカラムから回収する、ことからなる方法。
9. ９．前記因子と結合する前記因子に対する一以上のモノクローン抗体を免疫吸着 剤として使用する請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．前記ＤＡＦに対する３つのモノクローン抗体のカクテルを免疫吸着剤とし て使用する請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．前記イムノアフィニティ工程に先立って、前記因子の前記調製物が陰イオ ン交換クロマトグラフィにより一部精製される請求の範囲第８項記載の方法。
12. １２．前記因子の前記細胞遊離調製物が前記因子の赤血球からの抽出物である請 求の範囲第８項記載の方法。
13. １３．表面崩壊加速因子を有する細胞の補体により崩壊を増大させるための方法 であって、前記方法が、前記細胞を前記細胞の一部に見られる細胞表面抗原に対 する第１の抗体に晒し、 前記細胞を崩壊加速因子に対するモノクローン抗体のプールに晒し、それにより 、前記抗体を細胞表面の崩壊加速因子に結合させ、こうして前記細胞を前記補体 および前記第１の抗体により崩壊しやすくし、 前記細胞を補体の存在に晒し、 前記補体が前記第１の抗体に結合した前記細胞部分を崩壊させるのを待つ、 ことからなる方法。
14. １４．選択された細胞を前記第１の抗体の存在に晒すことからなる請求の範囲第 １３項記載の方法。
15. １５．前記細胞を崩壊加速因子に対する前記抗体の共役体と前記第１の抗体との 存在に晒すことからなる請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．前記細胞が腫瘍細胞である請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．補体による攻撃に対する細胞の抵抗力を増大させるための方法であって、 前記方法が前記細胞の精製された崩壊加速因子による生体外でのインキュベーシ ョンからなる方法。