JPH09178740A - 糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとしての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 臨床検査領域に於いて、糖尿病または糖尿病
合併症の新規な臨床マーカーとして使用できる化合物を
提供する。 【解決手段】 タンパク質もしくはペプチドを構成する
アミノ酸、例えばリジンの側鎖アミノ基がカルボキシメ
チル化されたタンパク質もしくはペプチドまたはカルボ
キシメチルリジンからなる糖尿病または糖尿病合併症用
マーカーの使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は糖尿病または糖尿病
合併症用マーカーの使用に関する。更に詳しくは、特定
の置換基を有するタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸
から成る糖尿病または糖尿病合併症用マーカーの使用に
関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中のタンパク質はグルコースと非酵
素的に反応して糖化され、糖化タンパク質となることが
知られている。該糖化反応はメイラード反応と呼ばれ、
前期段階および後期段階の反応に分けられる。前期段階
の反応は、タンパク質の側鎖アミノ基やN末端アミノ基
と糖のカルボニル基が反応し、シッフ塩基を経由してア
マドリ転位化合物を生成するまでとされている。該前期
段階反応生成物としては、例えば、ヘモグロビンＡ１Ｃ
や糖化アルブミン等が知られており、糖尿病の臨床マー
カーとして用いられているのは周知の事実である。

【０００３】また、上記前期段階反応の後、生成したア
マドリ転位化合物は２つの方向に変化することが知られ
ている。１つは、蛍光性、褐色変化、或いは分子内また
は／および分子間架橋形成のうちの少なくとも１つを伴
う反応（以下、「後期段階反応Ａ」とも言う。）であ
り、もう１つは、酸素と遷移金属が関与する酸化的開裂
反応（以下、「後期段階反応Ｂ」とも言う。）である。

【０００４】ところで、メイラード反応の最終生成物を
ＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎ
ｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と呼ぶこともあるが、該ＡＧＥ
という用語は一般に上記の後期段階反応Ａに見られる３
つの特徴的な現象（蛍光性、褐色変化、或いは分子内ま
たは／および分子間架橋形成）の少なくとも１つを伴う
反応生成物を総称するものとして使用されることが多
く、上記３種類の現象のすべてを伴わない反応によって
生成したものまでを含めてＡＧＥと呼ぶか否かについて
は意見の分かれるところである。即ち、ＡＧＥの定義に
関しては、上記定義以外にも、インビトロでグルコース
とタンパク質を３７℃で６０日以上インキュベーション
したとき（メイラード反応のモデル反応）の生成物すべ
てをＡＧＥとするという説や該生成物のうち糖尿病合併
症を発症させるような生物学的活性を有するもののみを
ＡＧＥとするという説等があり、学会においてもその定
義が統一されていないのが現状である。本明細書におい
ては、上記のような混乱を避けるため、ＡＧＥという語
を使用する場合には、メイラード反応のうち蛍光性、褐
色変化或いは分子内または／および分子間架橋形成のう
ちの少なくとも１つを伴う反応生成物（即ち、後期段階
反応Ａの生成物）のみを指してＡＧＥと称する。

【０００５】上記後期段階反応Ａの生成物、即ちＡＧＥ
は、複数の化合物の集合体であると考えられている。現
在のところ、ＡＧＥの構造体としては、ピラリン、ペン
トシジン、クロスリンＡ＆Ｂ、或いはＸ１等が提唱され
ており、これらの定性、定量は蛍光強度の測定、或いは
抗原抗体反応により行われている。また、ＡＧＥを生成
する後期段階反応Ａに関しては、該反応が生体内で起こ
り、血管障害合併症の発症に関与しているとの報告がな
され（Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ，ｖｏｌ３１４，ｐ４０３，１９８６）、ＡＧＥ
は糖尿病患者における合併症の発症と進展に関与するも
のとして注目されるようになっている。そして、ＡＧＥ
には糖尿病合併症の発症と進展に関与する生物学的活性
があるという報告もなされている（森崎ら、最新医学、
第４９巻、２４８頁、１９９４年）。

【０００６】一方、メイラード反応の後期段階のもう一
つの反応（後期段階反応Ｂ）生成物については、Ｎ−ε
−カルボキシメチルリジン（ε位のアミノ基がカルボキ
シメチル化されたリジン。以下、「ＣＭＬ」と略すこと
もある。）が同定され（Ａｈｍｅｄ，Ｍ．Ｕ．，ｅｔ
ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ２６１，ｐ４８８９，１９８
６）、老人や糖尿病患者のレンズタンパク質、皮膚コラ
ーゲン等に存在していることが報告されている（Ｄｕｎ
ｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，ｖｏｌ３０，ｐ１２０５，１９９１）。また、牛血
清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略す。）の側鎖アミ
ノ基の水素がカルボキシメチル基で置換された(以下、
「ＣＭ化」と略すこともある。)ものはＡＧＥと抗ＡＧ
Ｅ抗体の反応を強く阻害するとの報告もある（第５５回
アメリカ糖尿病学会議抄録集ｐ１１５Ａ，１９９５）。

【０００７】しかしながら、後期段階反応Ｂの生成物の
生物学的活性についての報告例はなく、また、糖尿病患
者、或いは腎症や網膜症等の合併症を発症している糖尿
病患者（以下、「糖尿病合併症患者」ともいう。）と健
常者における生体内、特に体液中の後期段階反応Ｂ生成
物濃度の違い等も明らかにはなっておらず、その使用に
おいて有効性、特に糖尿病または糖尿病合併症用マーカ
ーとしての使用の有効性は認識されていなかった。即
ち、ＡＧＥを糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとし
て使用する有効性は、最近、明らかになりつつあるが、
ＣＭＬ、ＣＭ化タンパク質またはＣＭ化ペプチド（以
下、単に「ＣＭＬ等」ともいう。）の糖尿病または糖尿
病合併症用マーカーとして使用する場合、その有効性は
認識されていなかった。更に、これらの物質が糖尿病合
併症の原因物質か、或いは糖尿病合併症により蓄積した
物質かも明確ではなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、後期段
階反応Ｂの生成物が糖尿病合併症の一原因物質ではない
かと考え、該生成物がＡＧＥと同様の生物学的活性を有
し、また、糖尿病患者或いは糖尿病合併症患者と健常者
の生体内、特に体液中において該生成物濃度に有意な差
が認められるのであれば糖尿病または糖尿病合併症用マ
ーカーとして使用できるのではないかと考えた。従っ
て、本発明の課題（目的）は、ＣＭＬ等がＡＧＥと同様
の生物学的活性を有することを確認し、更に、糖尿病患
者或いは糖尿病合併症患者と健常者の間で、生体内、特
に体液中のＣＭＬ等濃度に有意な差が認められることを
確認し、ＣＭＬ等が糖尿病または糖尿病合併症用マーカ
ーとなりうることを実証すること、換言すればＣＭＬ等
の新規な用途を見出すことである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意検討した結果、ＣＭＬ等はＡＧＥ
と同様の生物学的活性を有し、更に、糖尿病患者或いは
糖尿病合併症患者と健常者の間で、血液中のＣＭＬ等濃
度に有意な差が認められることを確認し、糖尿病または
糖尿病合併症用マーカーとして有効に使用できることを
見い出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】即ち、本発明は、Ｎ−ε−カルボキシメチ
ルリジン、タンパク質を構成するアミノ酸単位の少なく
とも一部の側鎖アミノ基がカルボキシメチル化されたカ
ルボキシメチル化タンパク質、またはペプチドを構成す
るアミノ酸単位の少なくとも一部の側鎖アミノ基がカル
ボキシメチル化されたカルボキシメチル化ペプチドの糖
尿病もしくは糖尿病合併症用マーカーとしての使用であ
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に述べ
るが、本発明で使用する物質、製法は下記に限定される
ものではない。

【００１２】本発明で用いるタンパク質としては特に限
定されず、例えばアルブミン、ヘモグロビン、β２ミク
ログロブリン、ヒストン、プロラミン等の単純タンパク
質、コラーゲン、γグロブリン、赤血球膜タンパク質等
の糖タンパク質、低密度リポタンパク質や高密度リポタ
ンパク質等のリポタンパク質、トランスフェリンやセル
ロプラスミン等の金属タンパク質等の複合タンパク質が
挙げられる。

【００１３】また、本発明で用いるペプチドとしては、
オリゴペプチドでもポリペプチドでも良く、例えば、上
記タンパク質の分解産物、上記タンパク質の特定の領域
を人工的に合成したもの、前駆体タンパク質から限定加
水分解によって生合成されたもの等が挙げられる。

【００１４】上記タンパク質もしくはペプチドを構成す
るアミノ酸の側鎖アミノ基またはリジンの側鎖アミノ基
をカルボキシメチル化（ＣＭ化）する方法、即ち、上記
各アミノ基の水素を−ＣＨ2−ＣＯＯＨ基に置換する方
法は、公知の方法が何ら制限無く使用される。例えば
「新生化学実験講座１、タンパク質４」（日本生化学会
編、第１３〜１６頁、東京化学同人、１９９１年３月２
０日発行）に記されている還元アルキル化法のように、
グリオキシル酸（ＣＨＯ−ＣＯＯＨ）の如きアルデヒド
化合物とタンパク質またはペプチドをホウ酸緩衝液やリ
ン酸緩衝液等の水溶液に溶解し、水素化ホウ素ナトリウ
ムや水素化シアノホウ素ナトリウム等の水素化物還元剤
の存在下でｐＨ８〜１０で反応させればよい。これより
高いｐＨだとタンパク質等が変性する恐れがあり、これ
より低いｐＨだと水素化物還元剤が不安定になる。該反
応を特異的、且つ定量的に進行させるために、反応温度
は０〜１０℃で行うのがよい。得られたＣＭ化されたタ
ンパク質またはＣＭ化されたペプチドは一般に水に可溶
で、アセトン、アルコール、硫酸アンモニウム、重金属
塩等の添加で沈澱する。また、上記のＣＭ化されたタン
パク質またはＣＭ化されたペプチドの検出には、アミノ
基を検出する方法以外の既知の方法であれば良く、例え
ば紫外吸収法、色素結合法、フェノール試薬法等が挙げ
られる。なお、上記方法においては一般に、タンパク
質、脂質、糖質等、アミノ基の存在する物質はＣＭ化さ
れやすいが、タンパク質もしくはペプチドにおいては、
リジンの側鎖或いはＮ末端が選択的にＣＭ化されやす
い。特に、タンパク質もしくはペプチド１分子にＮ末端
のアミノ基は１つしか存在しないが、リジンの側鎖アミ
ノ基は複数個存在する場合が多く、カルボキシメチル基
をタンパク質もしくはペプチドにより多く導入するため
には該タンパク質もしくはペプチドを構成するアミノ酸
がリジンであることが好適である。

【００１５】また、ＣＭＬについては、リジンを原料と
して上記のようなＣＭ化を行って得ることもできるが、
上記方法で得られたＣＭ化タンパク質もしくはＣＭ化ペ
プチドを強酸を用いて加水分解することによって得るこ
ともできる。

【００１６】このような方法によって得られたＣＭＬ等
は、透析、遠心濃縮、或いは液体クロマトグラフィー等
によって精製した後に、生物学的活性の測定に供され
る。

【００１７】ＣＭＬ等が糖尿病または糖尿病合併症用マ
ーカーとなり得るか否かは、上記方法で得られたＣＭＬ
等を生体或いは生体成分に作用させたときに、腎症、網
膜症、動脈硬化症等の糖尿病合併症が発症するか否かで
判断することができる。例えば、モデル細胞にＣＭＬ等
を作用させ、腎症や動脈硬化症の一因とされている毛細
管の閉塞促進に関与している凝固能、網膜症の発症と進
展に関与している透過性等を測定すればよい（森崎ら、
最新医学、第４９巻、２４８頁、１９９４年）。

【００１８】凝固能を測定するためには、例えば線溶能
を有する内皮細胞のトロンボモジュリンの活性を測定す
ればよい。該活性の測定には、ＣＭ化したタンパク質を
内皮細胞に作用させた後、トロンビンとプロテインＣを
添加し、生成した活性化プロテインＣを測定する等の公
知の方法が問題なく使用される。

【００１９】透過性を測定するためには、例えばＣＭ化
したタンパク質の内皮細胞への取り込み量を測定すれば
よく、標識したＣＭ化したタンパク質を内皮細胞に添加
して培養し、内皮細胞に取り込まれた該ＣＭ化したタン
パク質量を測定する等の公知の方法が用いられる。

【００２０】後述する実施例にも示されるように、本発
明で使用するＣＭＬ等は上記のような測定において生物
学的な活性を示す。更に、糖尿病患者や糖尿病合併症患
者の体内に存在するＣＭＬ等の濃度は健常者のそれに比
べて有意に高かったことから（図２参照）、本発明で使
用するＣＭＬ等は、臨床検査の領域において、糖尿病ま
たは糖尿病合併症のマーカーとなりうる。即ち、腎糸球
体やコラーゲン等の組織、或いは尿、血液等の体液中の
ＣＭＬ等の濃度を測定することにより、糖尿病にかかっ
ているか否かを判断したり、糖尿病の進行度合いや糖尿
病合併症発症の可能性を予測したりすることが可能とな
る。

【００２１】生体内のＣＭＬ等の濃度（例えば、血液中
や尿中のＣＭ化タンパク質濃度）を測定する方法は特に
限定されず、ＣＭＬ等を検出する公知の方法が任意に採
用できる。検出方法を例示すれば、抗原抗体反応にて生
体内のＣＭ化タンパク質或いはＣＭ化ペプチドを検出す
る方法、液体クロマトグラフィーにてＣＭＬ等を検出す
る方法、ＣＭ化タンパク質或いはＣＭ化ペプチドを加水
分解して液体クロマトグラフィー／質量分析にてＣＭＬ
を検出する方法、ＣＭ化タンパク質或いはＣＭ化ペプチ
ドを加水分解してガスクロマトグラフィー／質量分析に
てＣＭＬを検出する方法等が挙げられる。

【００２２】かかるＣＭＬ等は糖尿病または糖尿病合併
症の罹患の有無あるいはその程度等を判定、予測する診
断用マーカーとして使用できる。また、糖尿病または糖
尿病合併症の予防薬あるいは治療薬等の薬効の評価用マ
ーカーとして使用できる。

【００２３】

【発明の効果】本発明で使用されるＣＭＬ等は糖尿病合
併症の発症と進展に関与していることが明確になったの
で、該ＣＭＬ等は、臨床検査の領域において糖尿病また
は糖尿病合併症の新規な臨床マーカーとして使用できる
ことが明らかとなった。このことは、糖尿病または糖尿
病合併症の診断において、上記新規マーカーを利用した
新たな診断システムの構築の可能性を意味するものであ
り、その工業的意義は大きい。

【００２４】

【実施例】以下に本発明をより具体的に説明するために
実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって限定
されるものではない。

【００２５】実施例１ タンパク質の側鎖アミノ基をＣＭ化するために、ｐＨ９
に調整した１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（Ｆｒａ
ｃｔｉｏｎ Ｖ、シグマ社製）１ｍｌに、ｐＨ９に調整
した０．２５Ｍのグリオキシル酸（シグマ社製）１ｍｌ
を混合し、０℃で１２時間放置した。その後、１ｍｇの
水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更に１２時間放
置した。

【００２６】また、対象として、グリオキシル酸を添加
しないこと以外は同様の方法でヒト血清アルブミンを処
理した。

【００２７】上記の各処理後のヒト血清アルブミンのＣ
Ｍ化率を、未反応アミノ基をトリニトロベンゼンスルホ
ン酸（以下ＴＮＢＳと略す）を用いて次のような方法に
より測定して求めた。

【００２８】即ち、前記各試料０．５ｍｌを０．１Ｍの
四ほう酸ナトリウムを含む０．１Ｍの水酸化ナトリウム
水溶液０．５ｍｌに各々加えた。次いで、再結晶化し、
希塩酸で洗浄した１．１ＭのＴＮＢＳを２０μｌ加え、
攪拌した。３０分後に１．５ｍＭの亜硫酸ナトリウムを
含む９８．５ｍＭのリン酸二水素ナトリウムを２ｍｌ加
えて反応を停止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定したと
ころ、ＣＭ化ヒト血清アルブミンの吸光度は０．０３で
あり、グリオキシル酸処理をしていないヒト血清アルブ
ミン（対象）の吸光度は１．２５であった。上記のいず
れのヒト血清アルブミンも含まない系で同様の測定を行
ったところ、吸光度は０．０３であったので、ＣＭ化ヒ
ト血清アルブミンのＣＭ化率は１００％であることが解
った。

【００２９】かかる方法で得られたＣＭ化ヒト血清アル
ブミンは、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４℃
にて２日間透析され、未反応のグリオキシル酸や水素化
シアノホウ素ナトリウムを除去した後に、血液凝固能の
亢進、即ち毛細管の閉塞促進を調べるためにトロンボモ
ジュリン活性の測定に供された。測定は、次のようにし
て行った。

【００３０】セミコンフルエントなヒト動脈内皮細胞
（大日本製薬社製）に１０μＭになるように上記のＣＭ
化ヒト血清アルブミンを添加し、３７℃で２０時間培養
した。この培養したヒト動脈内皮細胞をアール平衡塩溶
液で洗浄した後、１Ｕ／ｍｌとなるようにトロンビン、
および１ｍｇ／ｍｌとなるようにプロテインＣを加え、
更に３７℃で１５分間培養した。このヒト動脈内皮細胞
を含む培養液にアンチトロンビンＩＩＩを加え、活性化
プロテインＣの形成を停止した後に、リジン-プロリン-
アルギニン-パラニトロアニリドから成る基質を１ｍＭ
になるように添加した。５分後、および１０分後の４０
５ｎｍの吸光度を測定し、その吸光度差を求めた。動脈
内皮細胞由来のタンパク質１ｍｇ当たりの吸光度差は、
後述する比較例１で求めた吸光度差を１００％とする
と、ＣＭ化ヒト血清アルブミンのそれは６０％であっ
た。

【００３１】このことは、ＣＭ化ヒト血清アルブミンが
トロンボモジュリン活性を４０％低下させることを表
し、ひいては線溶能の低下、即ち血液凝固能の亢進によ
り毛細管の閉塞を促進させることを意味する。また、後
述する参考例１に示すように、参考例１で得られたＡＧ
Ｅはトロンボモジュリン活性を８０％低下させることか
ら、本ＣＭヒト血清アルブミンは、該ＡＧＥと同様の毛
細管の閉塞促進性を有することが明らかである。

【００３２】比較例１ 実施例１で作製したグリオキシル酸処理をしていないヒ
ト血清アルブミン（対象）を実施例１と同様の方法で透
析した後、実施例１と同様にしてトロンボモジュリン活
性の測定を行った。このときの５分後の４０５ｎｍの吸
光度と１０分後の４０５ｎｍの吸光度の差は０．９１５
であり、この値を１００％とした。

【００３３】参考例１ ０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに６０ｍ
ｇのヒト血清アルブミンと１．７Ｍのグルコースを加
え、０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌した後、３７
℃で３ヶ月間放置し、ＡＧＥを得た（蛍光性、褐色変
化、および分子内或いは分子間架橋形成を確認してい
る。）。実施例１においてＣＭ化ヒト血清アルブミンの
代わりに上記方法で得たＡＧＥを用いたこと以外は、す
べて同様の方法でトロンボモジュリン活性の測定を行っ
た。

【００３４】その結果は、比較例１で求めた吸光度差を
１００％としたときの上記ＡＧＥのトロンボモジュリン
活性に基づく吸光度差の相対比は２０％であった。これ
は、ＡＧＥがトロンボモジュリン活性を８０％低下させ
ることを表している。

【００３５】実施例２ タンパク質であるヒトトランスフェリンの側鎖アミノ基
をＣＭ化するために、ｐＨ９に調整した１ｍｇ／ｍｌの
ヒトトランスフェリン（和光純薬工業（株）社製）１ｍ
ｌに、ｐＨ９に調整した０．２５Ｍのグリオキシル酸
（シグマ社製）１ｍｌを混合し、０℃で１２時間放置し
た。その後、１ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを
加え、更に１２時間放置した。また、対象として、グリ
オキシル酸を添加しないこと以外は同様の方法でヒトト
ランスフェリンを処理した。

【００３６】上記ＣＭ化ヒトトランスフェリンおよびグ
リオキシル酸処理をしていないヒトトランスフェリンを
それぞれ０．２ｍｌのバイオライト（レンジｐＨ３−１
０、バイオラッド社製）、３ｍｌのグリセロールおよび
６．８ｍｌの蒸留水から成る水溶液で５倍に希釈し、各
希釈液の内の１０μｌをそれぞれ等電点電気泳動に使用
した。等電点電気泳動はｐＨ３−１０用の市販ゲル（テ
フコ社製）にて、陰極液に０．０５Ｍの水酸化ナトリウ
ム、陽極液に０．０１Ｍのリン酸を使用して、１００Ｖ
で３０分、２００Ｖで３０分、５００Ｖで６０分泳動し
た。電気泳動の結果、ＣＭ化ヒトトランスフェリンの等
電点は４．６〜４．９であり、グリオキシル酸処理をし
ていないヒトトランスフェリンの等電点は５．２〜５．
５であった。この結果は、上記ＣＭ化処理によってヒト
トランスフェリンの側鎖アミノ基にカルボキシメチル基
が導入されていることを示唆している。

【００３７】かかる方法で得られたＣＭ化ヒトトランス
フェリンは、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４
℃にて２日間透析され、未反応のグリオキシル酸や水素
化シアノホウ素ナトリウムを除去した後に、単球への透
過性（網膜症の発症及び進展に関与している）を測定す
るために、取り込み量の測定に供された。該取り込み量
の測定は、次のような方法によって行った。

【００３８】マウスの単球由来の細胞株ＲＡＷ２６４．
７細胞を２×１０５個ずつ１２穴プレートに播き、１０
％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で３７℃にて１８時
間培養した。次いで培地を除去した後、リン酸緩衝液で
１回洗浄し、３％のＢＳＡを含む１ｍｌのＤＭＥＭ培地
に交換した。３７℃にて１時間培養した後に、125Ｉで
標識したＣＭ化ヒトトランスフェリンを１０μＭになる
ように添加し、更に３７℃で１２時間培養した。125Ｉ
で標識したＣＭ化ヒトトランスフェリンは、２．５μｇ
のＣＭ化ヒトトランスフェリン１０μｌに０．５ｍＣｉ
のＮａ125Ｉ水溶液を５μｌ加え、１５分間反応させて
作製した。１２時間の培養の後、１％ＢＳＡを含むリン
酸緩衝液で３回洗浄し、更にリン酸緩衝液で３回洗浄し
た。次いで、０．１Ｍの水酸化ナトリウム１ｍｌを加
え、３７℃にて１時間培養した後に細胞を剥がして、シ
ンチレーションカウンターで放射能を測定した。マウス
単球由来のタンパク質１ｍｇ当たり０．４μｇのＣＭ化
ヒトトランスフェリンがマウス単球に取り込まれた。後
述する比較例２に示されるように、ＣＭ化されていない
ヒトトランスフェリンは単球にほとんど取り込まれず、
一方、ＣＭ化ヒトトランスフェリンは単球に取り込まれ
たことから、ＣＭ化ヒトトランスフェリンが網膜症の発
症や進展に関与している単球への透過性を亢進すること
が明らかになった。

【００３９】また、後述する参考例２の結果から、本実
施例のＣＭ化ヒトトランスフェリンは参考例１で得られ
たＡＧＥと同様、単球への透過性を亢進することが明ら
かである。

【００４０】比較例２ 実施例２で対象として得たグリオキシル酸処理をしてい
ないヒトトランスフェリンを実施例２と同様の方法で透
析した後、実施例２と同様の方法で単球への取り込み量
を測定した結果、マウス単球由来のタンパク質１ｍｇ当
たりに取り込まれたヒトトランスフェリンは０．０５μ
ｇ以下であった。

【００４１】参考例２ 実施例２でＣＭ化ヒトトランスフェリンの代わりに参考
例１で得られたＡＧＥを用いたこと以外は、すべて同様
の方法で単球への取り込み量の測定を行った。その結
果、マウス単球由来のタンパク質１ｍｇ当たりに取り込
まれたＡＧＥは１．０μｇであった。

【００４２】実施例３ （１） ＣＭ化タンパク質に対する抗体の作成 体重が２ｋｇ以上のウサギに、実施例１で作成したＣＭ
化ヒト血清アルブミンを抗原として以下の要領で免疫し
た。

【００４３】２ｍｇ／ｍｌになるように調製した該抗原
溶液０．５ｍｌに、フロイントの完全アジュバント０．
５ｍｌを加えたものをウサギの耳静脈に注射した。その
後、２週間おきに２ｍｇ／ｍｌの該抗原０．２５ｍｌに
フロイントの不完全アジュバント０．２５ｍｌを加えた
ものを追加免疫した。この間、ＣＭ化ヒト血清アルブミ
ンに対する抗体が産生されたか否かを確認するために、
２週間に１回ウサギの外縁耳静脈から部分採血した。６
週間後、ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体が産生
されたことを酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法で確認し、
全採血した。

【００４４】（２） アフィニティ精製カラムの作成 ２５ｍｌのアフィゲル１５（バイオラッド社製）を７５
ｍｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した
後、１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン溶液を６２．
５ｍｌ加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。次いで、
未反応のヒト血清アルブミンを濾過にて除去し、１Ｍの
エタノールアミンを３０ｍｌ加え、室温で緩やかに攪拌
し、未反応のＮ−ヒドロキシサクシイミドエステルをブ
ロッキングした。該ヒト血清アルブミンを固定化した支
持体をカラムに詰め、２８０ｎｍの吸光度が０になるま
でイオン交換水で洗浄した。更に、０．１５Ｍの塩化ナ
トリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
でカラムを平衡化した。

【００４５】（３） ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対す
る抗体のアフィニティ精製 作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体を１ｍ
ｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含
む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したも
のを、１００ｍｇ程度になるように該アフィニティ精製
カラムにアプライした。次いで、２８０ｎｍの吸光度が
０になるまで前記リン酸緩衝液を流速０．５ｍｌ／ｍｉ
ｎで流した。カラムに結合しなかった抗体をＣＭ化ヒト
血清アルブミンに対する抗体として回収した。２８０ｎ
ｍの吸光度が０になったところでリン酸緩衝液から０．
１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に換え、カラムに
結合している抗体を溶離させ、０．１５Ｍの塩化ナトリ
ウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でカ
ラムを平衡化し、回収した抗体を再度カラムにアプライ
し、カラムに結合しなかった抗体を回収した。この操作
を、更に１回繰り返し、ビオチン標識用の抗体に供され
た。

【００４６】（４） ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対す
る抗体のビオチン標識 精製した抗体のビオチン標識はプロテインビオチレーシ
ョンシステム（ギブコ社製）を用いて行った。

【００４７】精製したＣＭ化ヒト血清アルブミンに対す
る抗体を１．５ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍの塩
化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）で希釈または濃縮した溶液に、０．０５Ｍになるよ
うに炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。次
いで、該抗体溶液６．７ｍｌに、説明書に従って作成し
た５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＢ−ＮＨＳエステル溶液２６μ
ｌを加え、室温で１時間緩やかに攪拌し、０．１１Ｍに
なるように塩化アンモニウムを加えて反応を停止させ
た。その後、本キットに付属のカラムで抗体溶液を脱塩
した。更に、キット付属のＡｖｉｄｉｎ／ＨＡＢＡで導
入されたビオチンのモル数を計算したところ、ＣＭ化ヒ
ト血清アルブミンに対する抗体１モルに対してビオチン
は１４モル結合していた。

【００４８】（５） ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対す
る抗体の抗原特異性 ＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原特異性は
競合法ＥＬＩＳＡにて確認した。

【００４９】１μｇ／ｍｌとなるように０．１５Ｍの塩
化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）（以下ＰＢＳと略す）で希釈したＣＭ化ヒト血清ア
ルブミンに対する抗体に、作成したＣＭ化ヒト血清アル
ブミンをそれぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌ
となるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置
し、ＣＭ化ヒト血清アルブミンで阻害された抗体溶液と
して使用した。

【００５０】ＣＭ化ヒト血清アルブミンの調製と同様の
方法で、ヘモグロビン（シグマ社製）より作成したＣＭ
化ヘモグロビンを調製した。該ＣＭ化ヘモグロビンを１
μｇ／ｍｌのＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体溶
液に、それぞれ０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌと
なるように添加した。この溶液を３７℃で１時間放置
し、ＣＭ化ヘモグロビンで阻害された抗体溶液として使
用した。

【００５１】競合法ＥＬＩＳＡを行うにあたり、作成し
たＣＭ化ヒト血清アルブミンを１μｇ／ｍｌとなるよう
にＰＢＳで希釈した。次いで、上記希釈したＣＭ化ヒト
血清アルブミン溶液を９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ
社製）に１ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃
で１時間放置し、該ＣＭ化ヒト血清アルブミンをイムノ
プレートに固定した。１時間後、イムノプレートに結合
していないＣＭ化ヒト血清アルブミンを除去し、０．５
％のゼラチンを含むＰＢＳを１ウェル当たり１００μｌ
アプライし、３７℃で１時間放置し、ＣＭ化ヒト血清ア
ルブミンが結合していない部分をブロッキングした。１
時間後、該ゼラチン溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し
た後、上記濃度のＣＭ化ヒト血清アルブミンで阻害され
た抗体溶液、又は上記濃度のＣＭ化ヘモグロビンで阻害
された抗体溶液を１ウェル当たり１００μｌアプライ
し、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗
浄し、１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼで標識さ
れた抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（コスモバイオ社製）を１
ウェル当たり１００μｌアプライし、３７℃で１時間放
置した。更に、ＰＢＳで３回洗浄し、アルカリホスファ
ターゼ基質キット（バイオラッド社製）を用いて能書に
従い調製した基質溶液を１ウェル当たり１００μｌアプ
ライした。室温で５分間放置した後、０．４Ｍの水酸化
ナトリウム溶液を１ウェル当たり１００μｌ加え、アル
カリホスファターゼの反応を停止させ、４０５ｎｍの吸
光度を測定した。その結果を表１および図１に示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】この結果から、作成したＣＭ化ヒト血清ア
ルブミンに対する抗体は、ＣＭ化ヒト血清アルブミンの
みならず、ＣＭ化ヘモグロビンでもＣＭ化ヒト血清アル
ブミンとＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗体の抗原
抗体反応が阻害されたことから、ＣＭ化ヘモグロビンと
も反応性を示すことが示唆された。

【００５４】（６） 糖尿病患者由来血液中のＣＭ化ヘ
モグロビンの測定 合併症を発症していない糖尿病患者１５人よりＥＤＴＡ
−２Ｋを含む真空採血管にて採血した血液５０μｌを、
２５０μｌの生理食塩水で１回洗浄した後、１ｍｌの精
製水を加え溶血させたものを被検体とした。該患者の平
均年齢は５５．７歳であった。

【００５５】被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定はド
ットブロッティング法にて行った。ヘモグロビン濃度を
シアンメトヘモグロビン法にて測定した後、該ヘモグロ
ビンが５００ｎｇとなるようにドットブロッティング装
置（バイオラッド社製）を用いてＰＶＤＦ膜（バイオラ
ッド社製）に吸着させた。該膜を１０％のスキムミルク
を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に室温で
１時間浸せきし、該膜を取り出し、前記ビオチン標識し
た１μｇ／ｍｌのＣＭ化ヒト血清アルブミンに対する抗
体溶液を５ｍｌ加えた。室温で１時間のインキュベーシ
ョンの後に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回
洗浄した。次いで、該膜にアビジン−ペルオキシダーゼ
標識ビオチン複合体溶液（ベクタステインＡＢＣキッ
ト：フナコシ社製）を５ｍｌ加え、室温で１時間のイン
キュベーションした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含
む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該
膜を３回洗浄した後、ＥＣＬウエスタンブロッティング
検出試薬（アマシャム社製）を２ｍｌ加えた。該膜にお
ける発光強度の検出は、バイオラッドＧＳ−３６３モレ
キュラーイメージャーを用いて行った。

【００５６】対象として市販のヘモグロビン（シグマ社
製）を被検体として上記と同様の方法にてＣＭ化ヘモグ
ロビンの測定を行った。その結果を表２に示す。

【００５７】

【表２】

【００５８】また、上記市販ヘモグロビンの発光強度を
１として、上記糖尿病患者由来のヘモグロビンの発光強
度を、被検体１つが白抜きの丸１つに対応するように図
２にプロットした。

【００５９】実施例４ 実施例３で糖尿病患者由来血液の代わりに、糖尿病の他
に腎症または網膜症を併発している糖尿病合併症患者１
２人から得た血液を被検体としたこと以外は、実施例３
の方法に従って被検体中のＣＭ化ヘモグロビンの測定を
行った。その結果を表３に示す。

【００６０】

【表３】

【００６１】上記患者の平均年齢は５６．５歳であっ
た。実施例３と同様、上記市販ヘモグロビンの発光強度
を１として、上記糖尿病合併症患者由来のヘモグロビン
の発光強度を、被検体１つが白抜きの丸１つに対応する
ように図２にプロットした。

【００６２】比較例３ 実施例３で糖尿病患者由来血液の代わりに、糖尿病では
ない健常者４７人から得た血液を被検体としたこと以外
は、実施例３の方法に従って被検体中のＣＭ化ヘモグロ
ビンの測定を行った。その結果を表４に示す。

【００６３】

【表４】

【００６４】健常者の平均年齢は５２．３歳であった。
実施例３と同様、上記市販ヘモグロビンの発光強度を１
として、上記健常者由来のヘモグロビンの発光強度を、
被検体１つが白抜きの丸１つに対応するように図２にプ
ロットした。

【００６５】健常者群と実施例３で測定した糖尿病患者
群の発光強度を統計学的に比較（ｔ検定）したところ、
危険率５％未満で、糖尿病患者群の発光強度の方が健常
者群の発光強度に比べて有意に高かった。このことは、
糖尿病患者由来の血液中には、健常者由来の血液中より
も、有意にＣＭ化ヘモグロビンが多いことを意味する。

【００６６】また、健常者群と実施例４で測定した糖尿
病合併症患者群の発光強度をｔ検定にて比較したとこ
ろ、危険率５％未満で、糖尿病合併症患者群の発光強度
の方が健常者群の発光強度に比べて有意に高かった。こ
のことは、糖尿病合併症患者由来の血液中には、健常者
由来の血液中よりも、有意にＣＭ化ヘモグロビンが多い
ことを意味する。

【００６７】上記の結果からも、ＣＭＬ等が糖尿病また
は糖尿病合併症用マーカーとしての使用が有効であるこ
とが明確になった。

【００６８】更に、実施例３で測定した糖尿病患者群の
発光強度と実施例４で測定した糖尿病合併症患者群の発
光強度をｔ検定にて比較したところ、危険率５％未満
で、糖尿病合併症患者群の発光強度の方が健常者群の発
光強度に比べて有意に高かった。このことからも、ＣＭ
Ｌ等が糖尿病の進行度合いや糖尿病合併症発症の可能性
を判断する臨床マーカーとしても使用できることが明ら
かとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本図は、作成したＣＭ化ヒト血清アルブミンに
対する抗体の抗原特異性を競合法ＥＬＩＳＡにて調べた
結果で、縦軸が４０５ｎｍの吸光度、横軸が各阻害剤の
添加量である。

【図２】本図は、健常者と糖尿病患者、および糖尿病合
併症患者の血液中のＣＭ化ヘモグロビン濃度との関係を
示すグラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ−ε−カルボキシメチルリジン、タン
   パク質を構成するアミノ酸単位の少なくとも一部の側鎖
   アミノ基がカルボキシメチル化されたカルボキシメチル
   化タンパク質、またはペプチドを構成するアミノ酸単位
   の少なくとも一部の側鎖アミノ基がカルボキシメチル化
   されたカルボキシメチル化ペプチドの糖尿病もしくは糖
   尿病合併症用マーカーとしての使用。
2. 【請求項２】 カルボキシメチル化タンパク質およびカ
   ルボキシメチル化ペプチドのカルボキシメチル化された
   アミノ酸単位がリジンである請求項１の使用。
3. 【請求項３】 マーカーが診断用もしくは薬効評価用で
   ある請求項１の使用。