JP2001508864A - ペプチドの測定により生物の状態を検出する方法 - Google Patents

ペプチドの測定により生物の状態を検出する方法

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Abstract

(57)【要約】 生物の状態の指標となる高分子量及び低分子量ペプチドを含有する前記生物のサンプルについてペプチドの測定をすることにより前記生物の状態の検出の方法であって、― 低分子量ペプチドが直接検出及び特徴づけられ、かつ― 参照に関連付けられる方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドの測定により生物の状態を検出する方法 本発明は、生物の検体中のペプチドを測定することにより前記生物の状態を検出 する方法に関する。 生物の状態を検出するために多くの分析的方法が使用されている。従って、例え ば、高等な生物の診断において病理学的な結果が得られている場合には、原因に 対する治療を開発するために症状に基づいて病理学的な変化の原因を推測するこ とが試みられる。更に、対応する遺伝子分析を行うことで病理学的な可能性のあ る進展を示し得る個々の相違点を発見することができるようにするために、生物 のゲノムを配列決定し、かつ「野生型ゲノム」を確立することにより平均的な「健 康な」生物の参照(リファレンス)を作成するための研究が行われている。最初の 方法論的研究の欠点は、この方法における診断は既に仮説に基づいているため、 仮説なしの(偏見なしの)診断を行うことができないことである。第２の方法の欠 点は、遺伝子障害に帰する重要な又はその全ての疾病を診断するのは当分の間無 理であることである。第２の方法のもう一つの欠点は、遺伝子における変異は必 ずしも関連する表現型の発現を起こすとは限らないことである。 従って、上記の欠点を有さない、特に仮説なしの診断を行うことができる普遍的 に使用可能な診断方法を提供することが望まれている。加えて、その診断方法は 、普遍的に使用可能であり、高度に発展した生物に限らず、下等な生物の状態の 検出にも適用することが可能でなければならない。加えて、確立することが容易 で、公知の技術を用いて行うことができなければならない。 従って、本発明の目的は上記のような方法を提供することにある。 驚くべきことに、本発明の目的は請求項１に記載の特徴を有する方法により単純 なやり方で達成された。従属項は、本発明の方法の好ましい態様に関する。 生物の状態を検出するための本発明の方法は、試験される生物のサンプルを採る ことから始まる。このサンプルは生物全体でも良い。サンプルは、低分子量のペ プチドを含んでいなければならず、その低分子量ペプチドは、低分子量のペプチ ドと共に含まれる高分子量ペプチド又はタンパク質と相互作用していてはならな い。本発明によれば、低分子量ペプチドは直接検出され、特徴付けられ、生物の 状態の指標としての役目を果たす。単一のペプチドを測定技術により直接検出す ること、幾つかのペプチドを測定技術により検出すること、又はサンプルに含ま れる全ての低分子量ペプチドを測定技術により検出することも可能である。従来 の分析又は診断方法、例えば、ゲル電気泳動又は２次元電気泳動及び、例えば、 臨床的な診断方法とは違い、本発明の方法は高分子量構造、例えばタンパク質を 分析するものではない。ペプチドホルモン等の測定のためのラジオイムノアッセ イ又は他の競合するアッセイのような公知の診断方法とは異なり、本発明によれ ば、低分子量ペプチドは、幾つかの測定技術によって、上記方法のように間接的 にではなく、直接検出される。特定の対照に対応する横断面(クロスセクション) における低分子量ペプチドの分布は参照(リファレンス)として使用される。 本発明の方法では、試験されるサンプルはその状態が検出される生物の組織又は 流動体サンプルから誘導されるか、生物そのもの又はその一部分でもよい。下等 生物が検査される場合、生物そのものが好ましくはサンプルとして使用される。 そのような下等生物には、特に、単細胞生物、例えば原核生物又は単純な真核生 物、例えば、酵母菌又は他の微生物が含まれる。 本発明によれば、測定に使用される低分子量ペプチドは、その分子量が30,000ダ ルトン以下であることが好ましい。最低分子量は実際的には重要ではないが、ジ ペプチドが本発明において検出することができる低分子量ペプチドの最小の限界 である。特に好ましくは、低分子量ペプチドの分子量は100から10,000ダルトン である。 必要があれば、例えば、測定の設定の変更により、サンプルの測定に影響を与え ると考えられる高分子量ペプチド又はタンパク質及び他のバイオポリマーをサン プルから除去することも有効である。これは、特に、本発明により使用される測 定方法により高分子量ペプチド化合物が包含されない場合には必要はない。 好ましくは、本発明においては、質量分析が低分子量ペプチドを検出するために 使用される。特に好ましいのは、MALDI法(マトリックスで補助されたレーザーデ ソープションイオン化質量分析(matrix assisted laser desorption ionazation mass spectroscopy))と呼ばれるものである。方法として質量分析が使用される 場合、低分子量ペプチドを特徴付けるために前記質量分析により得られるデータ 、例えばそれらの分子量を使用することが好ましい。特別な状況においては、他 のパラメーター、例えば、ペプチドの電荷、クロマトグラフィックカラムにおけ る特徴的な溶出時間、低分子量ペプチドのフラグメントパターン、低分子量ペプ チドの質量及び電荷の組み合わせを分析することも可能である。 生物の状態の検出に関連した付加的な疑問がある場合は、サンプルを幾つかに分 配し、サンプルを異なる性質又は異なる測定設定において分析し、生物の状態を 検出することも有効である。 生物は、特に、原核生物、真核生物、多細胞生物、組織培養物からの細胞、動物 又は人間の細胞を含む。従って、本発明により遺伝子的に技術改良された又はト ランスフォームされた及び/又は適当な状態にされた生物の状態を試験すること も可能である。これは、特に、トランスフォームされた生物によって、例えば、 好ましくない又は予期しない性質、例えば毒性を示すペプチドの形成によって構 築されたかもしれない予期しない又は好ましくない性質を確認するためにトラン スフォームされた生物を試験するために有効である。 特に、薬剤の投与、遺伝子治療、感染中、化学物質に接する作業場において、試 験動物、特にトランスジェニック動物及びノックアウト変異体において、故意に 又は故意にではなく行われた生物の操作(コンディションニング)が、生物の状態 に影響を与える場合がある。特に、上記のような方法においては、例えば、上記 測定のうち１つの前及びその工程中に生物から年代順のサンプルを採取すること による個体内又は個体間での比較、又は処理していない対照生物との比較は、あ る状態において予測した又は望んでいる変化が実際に起こっているのが、及びそ れに加えて又はその代わりに、予測していない、望んでいない又は望んでいる変 化(これらの変化は本発明の方法により検出される)が起こっているのかを、確認 のために使用することができる。 従って、本発明の方法は、例えば、臨床的研究、全ての種類の薬剤試験での毒物 学的試験に付加するため、分解生成物の分析/検出のため、遺伝子生成物の同定 のために有用である。 獣医学及び人の医学において、本発明の方法は、仮説に基づくことなく対応する 生物の状態の検出を可能にするという事実からのその顕著な重要性を得た。従っ て、予想した考えに基づく確認のアッセイを行うのではなく、検査された生物の 状態の本当の全体像が得られる。特異的(differential)ペプチド表示と呼ばれる 本発明の方法は、特定のペプチドパターンが健康な生物に存在し、それを参照標 準として使用することができるという事実に基づいている。ここで、個体のペプ チドの状態が記録され、その参照と比較されれば、病理学的な状態の可能性のあ る最初の指標を提供する偏差が検出される。病気を有する個体の対応するサンプ ルから得られた類似の病理的状態と比較することにより確認された偏差を検出す ることにより、前記個体サンプルのペプチドパターン中の偏差の単純な比較及び 示された臨床的な症状を有する偏差への対応による分析から、各疾病を直接特定 することが可能になる。 本発明によれば、特に、以下のように行うことができる。体液及び組織の抽出物 の限外濾過物は、参照サンプルを調製するために最初に使用される。濾過物のペ プチドの回収及びそれらのフラクションへの分離は、例えば、低分子量ペプチド フラクションを収集することにより行う。ペプチドフラクションの特徴づけは、 例えば、クロマトグラフィー又は質量分析により検出することができるペプチド の溶出状況及び分子量により遂行される。例えば、既知の疾病を病む患者からの 限外濾過物が使用され、健康な参照体の前もって確認されたスペクトルと比較さ れる場合、偏差パターンはそれぞれのペプチド混合物の状態に対する特定の疾病 の割り付けを可能にする。従って、この方法は、それ自身従来の操作、例えば、 病理学的な変化を示している適切なペプチドパターンを即時に呼び出すことによ り使用することもできる。場合によっては、これは、それぞれの疾病の１つのペ プチドの特徴であるかもしれない。例えば、特定の臨床的症状を確認できる患者 のサンプルが分析され、その疾病の原因となる仮説が存在する場合、この特定の ペプチドは本発明の分析において呼び出され、その結果が陽性である場合、適当 な治療学的なスキームが確立される。従って、最初に患者からサンプルを採り、 本発明の方法により状態を記録し、そして、病理学的な状態を示す偏差の存在が 明らかになれば、一般の臨床的アッセイとして繰り返し使用されるそれ自身公知 の確認アッセイにより対照(control)測定を行うか、又は病理学的な状態の指標 の特異的なスクリーニングにより前記ような対照測定を行う。 ペプチドは当業者に良く知られた方法、例えば、個々の出発物質の限外濾過より 回収することができる。それを行う時、本発明で請求する範囲内、即ち、ジペプ チドのサイズと最大で30,000ダルトンとの間の分子除外サイズを有するフィルタ ーを使用する。個々の膜を適当に選択することにより、特定の分子量を有するフ ラクションを得ることも可能になる。好ましくは、0.2mlから50リットルの濾過 物が濾過により得られ、濾過の直後に、例えば、希塩酸を用いた酸性化によりpH を２から４に調整される。前記分量は、健康な個体からの参照サンプルを作成す るために、又はペプチドデータベースを構築するための疾病特異的ペプチドマー カーを検出するために、プールされたサンプルを試験するのに特に用いられる。 限外濾過の後、濾過物に存在するペプチドは、クロマトグラフィックな材料、特 にカチオン交換体、例えば、フラクトゲル、アニオン交換体-フラクトゲルTMAE 、及び逆相(RP)材料への吸着により回収され、その後直線勾配又はステップ勾配 により溶出される。更なる精製のためには、他のクロマトグラフィック分離、特 に逆相材料による分離を所望により行うことができる。 ペプチドフラクションの測定は、好ましくは、質量分析、特にMALDI MS(マトリ ックするにより補助されたレーザーデソープションイオン化質量分析)又はESI M S(エレクトロスプレーイオン化MS(electrospray ionization MS))を用いて行わ れる。これらが、ペプチド分析に使用することができる方法である。これは、好 ましくは、ミクロボア(Microbore)逆相分離及び質量分析のオンラインでの組み 合わせ(LC-MSカップリング)を含む。得られたデータから、好ましい標識パラメ ーターとして溶出の挙動、分子量及びシグナルの強度に基づいて多次元の表が作 成される。しかし、上記の方法を用いて検出することができる他の定量値につい ても記録する。 上記の工程により得られた既知の基礎的な疾病を有する患者についてのデータは 、同様に得られた健康体参照群のデータと比較される。質的な変化(例えば、新 規ペプチドの発生又はペプチドの欠損)及び量的な変化(個々のペプチドの発生の 増加又は減少)の両方が検出される。必要があれば、比較分析により特定された 標的は更に精製され、当業者に知られたペプチド化学の方法により同定される。 得られた配列情報は、その後タンパク質及び核酸データベースと比較され、続い て文献のデータと比較される。検査された疾病についての提供されたペプチドの 関連は、機能についての研究及び適当な患者群についてのスクリーニングにより 確認される。 実施例１ 体液の使用：血液濾過物(血液濾過物、HF) １．HFの回収 HFは、選択された患者又は検体から、当業者に知られている技術により行われる 動脈-静脈又は静脈-静脈血液濾過により回収された。HFの回収は、慢性腎疾患患 者が日常的に行っているものと原理的には同様の方法で行われた。動脈からの排 液及び静脈からの送液(動脈-静脈血液濾過)、又は静脈排液及び静脈送液(静脈- 静脈血液濾過)により、患者の血液は、30kDaまでの分子除去サイズを有する血液 フィルター(例えば、ヘモフロー(Hemoflow)F 60又はヘモフローHF 80 S、Fresen ius，BadHomburg;ヘモフローFH 77 H及びヘモフローHF 88 H、Gambro)を介して 、血液濾過装置(例えば、Hemoprozessor、Sartorius、Gottingen；AK 10 HFM、G ambro、Hechingen)の補助により送られる。患者から採取された濾過物の体積は 、電解質溶液と置換される(例えば、SH 01、SH 05、SH 22、SH 29、Schiwa、Gla ndorf)。 本発明の方法によれば、診断的な血液濾過は、補助を用いて一回の血液濾過で１ から30リットルのHFを患者から得るために行われる。タンパク質分解が起こるの を防ぐために、血液濾過物は、即座に希釈された酸(例えば、１M HCl)によってp H値が２から４の間になるように調整され、4℃に冷却される。 ２．HFペプチドの回収とフラクションへの分離 2.1段階ごとの溶出によるペプチド抽出 10リットルの血液濾過物は脱イオン化された水で伝導率が6mS/cmになるように希 釈され、塩酸を用いてそのpH値が2.7に調整された。そして、HFはクロマトグラ フィックカラムに載せられた。HFペプチドの結合の後、結合したペプチドは増加 するpH値を有する７つの緩衝液を用いてpH段階溶出により溶出された。 クロマトグラフィーの条件： アプリケーション時の流速：100ml／min 溶出時の流速：30ml／min 検出:214、280nm カラム：ヴァンテージ(アミコン、Witten)、半径6cm×充填の高さ7cm カラム材料；フラクトゲル(Faktogel)TSK SP 650 M（Merck、Darmstadt） 機器：BioCAD 250、Perseptive Biosystems、Wiesbaden-Nordenstadt 溶出物１から７は、別々に回収された。 2.2第二クロマトグラフィーによる分離 溶出物１から７は別々に逆相カラムを用いたクロマトグラフィーにかけられた。 クロマトグラフィーの条件： アプリケーション時の流速：10ml／min 溶出時の流速：４ml／min 検出：214nm カラム：HPLCスチールカラム、半径1cm、充填の高さ12.5 カラムの材料：Source RPC 15μｍ（Pharmacia、Freiburg） 機器：BioCAD、Perseptive Biosystems、Wiesbaden-Nordenstadt 溶出物は4mlのフラクションとして回収された。 ３．ペプチドフラクションのマッピング 3.1 2.2で得られたフラクションのアリコットをマイクロボア(Microbore)逆相カラム に載せ、勾配を付けて溶出した。検出はUV検出器で行われ、接続されたエレクト ロスプレー質量分析器で検出された。 クロマトグラフィーの条件： アプリケーション時の流速：20μl/min 溶出時の流速：20μl/min 検出：220nm カラム：C18 AQS、３μm、120 A、半径1mm、長さ10cm(YMC、Schermbeck) 機器：ABI 140 Bデュアル溶媒デリバリーシステム 緩衝液A：0.06%トリフルオロ酢酸水溶液 緩衝液B：A中80%アセトニトリル 勾配：90分で0% Bから100% B 接続された質量分析器 エレクトロスプレーインターフェイスを有するAPI III(Perkin-Elmer、Weiterst adt) 陽イオンモード 測定範囲：m/zは300から2390 スキャン時間：７秒 スキャンウィンドウ：0.25m/z データーの取得は、MacSpec又はMultiViewソフトウェア(Perkin-Elmer) により行われた。 3.2個々のフラクションのMALDI MS測定 2.2で得られたフラクションのアリコットは、異なるマトリックス物質、例えば 、L-(-)-フラクトースを添加したもの等を用いてMALDI MSで測定された。 生のデータから、多次元表がスキャン数、シグナル強度及び計算された後のスキ ャンの多電荷イオンからの質量を考慮して作成された。 ４．比較分析 4.1新規若しくは欠損ペプチド、又は定量において明らかに逸脱したものの特定 ペプチドマップとして参照される3.3で得られたデータのセットを比較すること により、質的及び／又は量的な偏差が作成された。対照及びサンプルを考慮し、 個々のデータセット又はデータセットのセットが比較に使用された。 4.2特定された標的のペプチド-化学による特徴づけ 特定された標的は、収集した原材料(例えば、血液濾過物の大量の調製物)から、 ペプチド混合物からペプチドを分離するのに一般的に用いられる当業者に知られ た様々なクロマトグラフィック分離技術（逆相、イオン交換、サイズ除去、疎水 性相互作用等）を用いて特定可能な分量で精製された。フラクションのそれぞれ のクロマトグラフィック分離の後、標的はフラクション中でESI MS、MALDI MS 又はLC MSを用いて特定された。この工程は、所望の特定要素、即ち、溶出時間 及び分子量を持つ純粋な生成物が得られるまで、様々なクロマトグラフィーのパ ラメーターを用いて繰り返された。この後で部分的な又は完全なアミノ酸配列又 はフラグメントパターンが決定される。続いて、部分的な又は完全な配列又はフ ラグメントパターンの特定を目的として、データベースの比較が既知のデータベ ースを用いて行われた(Swiss-Prot及びEMBL-Pepted-und Nucleinsaure-Datenban k)。もし、データベースに該当するものがなくても、一次的な構造は明らかにさ れる。 実施例２ 体液の使用：腹水(ascitic fluid) 1．腹水の回収 腹水が様々な疾病(悪性腫瘍、肝臓障害等)における管外エクスデイト(exsudate) として形成される。本方法によれば、10ml及び10リットルの間の腹水がパンクシ ョン(punction)により得られ、タンパク質分解を避けるために即座に希釈酸(例 えば、1M HCl)によりpH値を2.0から4.0の間に調整し、4℃に冷却される。除去サ イズ30kDaのセルローストリアセテート膜（Sartocon mini-apparatus、Sartoriu s）を用いて限外濾過し、濾過物は更にペプチドの原料として使用される。 ３．腹水ペプチドの回収及びフラクションへの分離 2.1勾配溶出によるペプチド抽出 ５リットルの腹氷濾過物はpH2.0に調整され、プレパラティブ逆相カラムを通し て分離された。 クロマトグラフィーの条件 アプリケーション時の流速：40ml／min 溶出時の流速：40ml／min 検出：214nm、280nm カラム：Waters cartridge System、半径4.7cm、充填の高さ30cm カラムの材料：Vydac RP-C18、15-20μm 機器：BioCAD、Perseptive Biosystems、Wiesbaden-Nordenstadt 緩衝液A：0.1%トリフルオロ酢酸水溶液 緩衝液B：A中80%アセトニトリル 勾配：3000mlの0% Bから100% B 溶出物は50mlのフラクションに収集された。 更なる特徴づけの工程は実施例１と同様である。 実施例３ 体液の使用：尿 1．尿の回収 尿は患者からのカテーテル尿又は同時(spontaneus)尿として0.5から50リットル の量で直接回収され、タンパク質分解を避けるために希釈酸(例えば、１M HCl) を用いて即座にpH値を2.0から4.0の間に調整し、4℃に冷却される。30kDaの除去 サイズを有するセルローストリアセテート膜(Sartocon miniapparatus、Sartori us)を通しての限外濾過の後、濾過物は更にペプチドの原料として使用された。 ４．尿ペプチドの回収及びフラクションへの分離 2.1段階ごとの溶出によるペプチド抽出 10リットルの尿濾過物は伝導率が６mS／cmになるように水を用いて希釈し、HCl を用いてpH2.7に調整した。尿濾過物はその後クロマトグラフィックカラムに載 せられた。ペプチドの結合の後、結合したペプチドは生理食塩水の勾配を用いて 溶出される。 クロマトグラフィーの条件： アプリケーション時の流速：100ml／min 溶出時の流速：30ml／min 検出：214nm カラム：Vantage(Amicon、Witten)、半径６cm×充填高さ７cm カラムの材料：Merck Fraktogel TSK SP 650 M 機器：BioCAD 250、Perseptive Biosystems、Wiesbaden−Nordenstadt 緩衝液A：50mM NaH2PO4、pH3.0 緩衝液B：A中1.5M NaCl 勾配：2000mlの0% Bから100% B 溶出物は200mlの10つの集合として回収する。 2.2第二クロマトグラフィック分離 フラクションは別々に逆相カラムを通してクロマトグラフィーにかけた。 クロマトグラフィーの条件： アプリケーション時の流速：10ml／min 溶出時の流速：4ml／min 検出：214nm カラム：HPLCスチールカラム、半径１cm、充填の高さ12.5cm カラムの材料：Pharmacia Source RPC 15μm 機器：BioCAD、Perseptive Biosystems、Wiesbaden−Nordenstadt 緩衝液A：0.1%のトリフルオロ酢酸水溶液 緩衝液B：A中80%のアセトニトリル 勾配：200mlの0% Bから100% B 溶出物は4mlのフラクションとして回収された。 更なる特徴づけの工程は実施例１と同様である。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年４月２３日（１９９８．４．２３） 【補正内容】 請求の範囲： １． 仮説に頼る必要のない、生物の状態の指標となる高分子量及び低分子量ペ プチドを含有する前記生物のサンプルについてペプチドの測定をすることに より前記生物の状態を検出する方法であって、 ― 低分子量ペプチドは直接検出され、特徴づけされ、 ― 参照と関連付けられる方法。 ２．前記サンプルが前記生物からの組織若しくは流動体、又は生物そのもの、ま たはそれらの組み合せである請求項１に記載の方法。 ３．前記測定に使用される前記低分子量ペプチドが30,000ダルトン以下の分子量 を有する請求項１又は２に記載の方法。 ４．前記測定に使用する前記低分子量ペプチドが少なくともジペプチドの分子量 に対応する分子量を有する請求項３に記載の方法。 ５．前記測定に使用する前記低分子量ペプチドが100から10,000ダルトンの分子 量を有する請求項３及び／又は４に記載の方法。 ６．サンプルの記録において、前記高分子量ペプチドを前記低分子量ペプチドの 測定の前に分離するが、又は測定若しくは評価に関して考慮せず残す請求項 １から５の少なくとも１項に記載の方法。 ７．前記低分子量ペプチドの検出が質量分析により行われる請求項１から６の少 なくとも１項に記載の方法。 ８．前記低分子量ペプチドがそれらの分子量の測定を介して特徴づけられる請求 項１から７の少なくとも１項に記載の方法。 ９．前記低分子量ペプチドの測定の前に、前記サンプルを異なるフラクションに 分離し、そのフラクションが異なる条件において測定される請求項１から８ の少なくとも１項に記載の方法。 １０． 前記生物が原核生物、真核生物、多細胞生物、組織培養物からの細胞、 動物及び人間の細胞を含む請求項１から９の少なくとも１項に記載の方法。 １１． 前記サンプルが遺伝子的に技術改良された又はトランスフォームされた 及び／又はコンディショニングされた生物から誘導される請求項１から10の 少なくとも１項に記載の方法。 １２． 生物の状態の検出が、参照状態からの偏差を明らかにするために、仮説 に基づく必要なしに、生物の全体的な状態の検査及び記録のために用いられ る請求項１から11の少なくとも１項に記載の方法。 １３． トランスフォームされた生物の状態の検出が、原因として代謝の変化に 関連するトランスフォメーションに関連したペプチドの発生を明らかにする ためのトランスフォームされた生物の変化を明らかにするために、仮説に基 づく必要なしに、生物の全体的な状態の試験及び記録のために用いられる請 求項１から１１の少なくとも１項に記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 シュレイダー ミハエル ドイツ連邦国、ハノーファー Ｄ―30625、 フェオドール―リネン―シュトラーセ 31 (72)発明者 オピッツ ハンス ゲオルグ ドイツ連邦国、ハノーファー Ｄ―30625、 フェオドール―リネン―シュトラーセ 31

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 生物の状態の指標となる高分子量及び低分子量ペプチドを含有する前記生 物のサンプルについてペプチドの測定をすることにより前記生物の状態を検 出する方法であって、 ― 低分子量ペプチドは直接検出され、特徴づけされ、 ― 参照と関連付けられる方法。 ２．前記サンプルが前記生物からの組織若しくは流動体、又は生物そのもの、ま たはそれらの組み合せである請求項１に記載の方法。 ３．前記測定に使用される前記低分子量ペプチドが30,000ダルトン以下の分子量 を有する請求項１又は２に記載の方法。 ４．前記測定に使用する前記低分子量ペプチドが少なくともジペプチドの分子量 に対応する分子量を有する請求項３に記載の方法。 ５．前記測定に使用する前記低分子量ペプチドが100から10,000ダルトンの分子 量を有する請求項３及び／又は４に記載の方法。 ６．サンプルの記録において、前記高分子量ペプチドを前記低分子量ペプチドの 測定の前に分離するが、又は測定若しくは評価に関して考慮せず残す請求項 １から５の少なくとも１項に記載の方法。 ７．前記低分子量ペプチドの検出が質量分析により行われる請求項１から６の少 なくとも１項に記載の方法。 ８．前記低分子量ペプチドがそれらの分子量の測定を介して特徴づけられる請求 項１から７の少なくとも１項に記載の方法。 ９．前記低分子量ペプチドの測定の前に、前記サンプルを異なるフラクションに 分離し、そのフラクションが異なる条件において測定される請求項１から８ の少なくとも１項に記載の方法。 １０． 前記生物が原核生物、真核生物、多細胞生物、組織培養物からの細胞、 動物及び人間の細胞を含む請求項１から９の少なくとも１項に記載の方法。 １１． 前記サンプルが遺伝子的に技術改良された又はトランスフォームされた 及び／又はコンディショニングされた生物から誘導される請求項１から10の 少なくとも１項に記載の方法。 １２． 生物の状態の検出が、参照状態からの偏差を明らかにするために、仮説 に基づく必要なしに、生物の全体的な状態の検査及び記録のために用いられ る請求項１から11の少なくとも１項に記載の方法。 １３． トランスフォームされた生物の状態の検出が、原因として代謝の変化に 関連するトランスフォメーションに関連したペプチドの発生を明らかにする ためのトランスフォームされた生物の変化を明らかにするために、仮説に基 づく必要なしに、生物の全体的な状態の試験及び記録のために用いられる請 求項１から１１の少なくとも１項に記載の方法。
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