JP2008058161A - 子宮体癌の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】未だ見出されていない子宮体癌の特異的腫瘍マーカーとなり得る生体要素を見出し、これを基とする子宮体癌を検出する手段を提供すること。
【解決手段】血液検体中のアポリポタンパク質Ａ−Ｉを検出し、当該アポリポタンパク質の量が減少している場合に、これを検体提供者における子宮体癌の存在の指標とすることを特徴とする子宮体癌の検出方法を提供することにより、上記課題を解決し得ることを見出した。
【選択図】 なし

Description

本発明は、癌の検出手段、より詳細には、子宮体癌に対する特異的腫瘍マーカーに関する発明である。

子宮癌は、女性では、胃癌、乳癌に次いで多い癌であり、子宮頸癌と子宮体癌に大別される。本発明に直接的に関連する子宮体癌は、子宮癌の中でも比較的発症頻度の低い癌として知られていたが、近年、その頻度が急激に高くなっていることが問題視されている。

子宮体癌は、子宮体部に発生する癌で、広義には、子宮内膜に発生する子宮内膜癌と、子宮筋に発生する子宮肉腫の両者を含むが、一般的には子宮内膜癌を意味するものである。本発明では、子宮内膜癌を子宮体癌として定義する。

子宮体癌の初期症状は、不正性器出血（特に閉経期後）が挙げられるものの、比較的緩慢であり、早期発見が難しい癌の一つである。

子宮体癌の診断としては、子宮内膜細胞診検査、子宮内膜組織検査、子宮内膜全面掻爬・子宮鏡検査、超音波・ＣＴ・ＭＲＩ等による画像診断が、必要に応じて組み合わせて行われている。

癌の診断手段のうち、近年極めて有力な手段となりつつあるものとして、いわゆる腫瘍マーカーが挙げられる。腫瘍マーカーは、特定の腫瘍の存在に対応して、血液中や尿中において特徴的な挙動を示す生体物質である。腫瘍マーカーの定量を行い、その定量値を指標とすることにより、特定の腫瘍の存在を検出することができるので、腫瘍マーカーは、その簡便性から、当該特定腫瘍の早期発見に大いに貢献するものである。例えば、子宮頸癌等の腫瘍マーカーとして、SCC等が知られている。また、卵巣癌の腫瘍マーカーとして、CA125、α−フェトプロテイン、LDH、CEA、CA72-4、CA19-9等が知られている。

しかしながら、子宮体癌に対する特異的な腫瘍マーカーは、現在のところ知られておらず、上述したように、既存の子宮体癌に対する検査手段は手軽とはいえない。このことが、子宮体癌の早期発見を妨げる原因の一つであることは明らかである。

子宮体癌の早期発見は、患者の命を救うことになるのみならず、出産の望みをつなぐことになる。すなわち、子宮体癌の治療の原則は手術療法であることから、かつ、子宮全摘出＋付属器（卵巣・卵管）切除＋骨盤及び傍大動脈リンパ節郭清が原則であり、特に、閉経前の女性の場合、治療と同時に出産の望みが絶たれることになる。しかしながら、ごく初期段階（異型子宮内膜腺癌(Grade I）の臨床進行期Ｉａ)であれば、子宮温存療法を選択することも可能であるが、この段階の子宮体癌を発見するためには、鋭敏な腫瘍マーカーによる診断の助けを借りることが必要となる。

よって、本発明の課題は、未だ見出されていない子宮体癌の特異的腫瘍マーカーとなり得る生体要素を見出し、これを基とする子宮体癌を検出する手段を提供することにある。

本発明者は、この課題の解決に向けて検討を重ねた結果、驚くべきことに、血中タンパク質のうち、アポリポタンパク質Ａ−Ｉの減少を指標とすることにより、被験者の子宮体癌を高い精度で検出することが可能であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、血液検体中のアポリポタンパク質Ａ−Ｉを検出し、当該アポリポタンパク質の量が減少している場合に、これを検体提供者における子宮体癌（本発明では子宮内膜癌を意味するものである）の存在の指標とすることを特徴とする、子宮体癌の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。

血液検体とは、被験者から採取された血液又はその処理物のことを意味するものであり、動脈血であっても、静脈血であってもよいが、通常は、静脈血、特に、末梢静脈血を用いる。また、本発明にて用いる血液検体は、真空採血又はシリンジ採血等により、常法により全血を採取することができる。本検出方法においては、全血、血漿、及び、血清のうち、血清を用いることが好適である。

アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（以下、アポＡ−Ｉともいう）は、２４３個のアミノ酸からなる分子量約２８０００のタンパク質である。小腸および肝臓で２６７アミノ酸からなるアポＡ−Ｉ前駆体(preproapoA-I)として合成され、細胞内や血中で切断され、成熟型になることが知られている。

アポＡ−Ｉは、血清脂質の一つであるＨＤＬの構造維持に不可欠の成分として知られている。また、遊離コレステロールをエステル型に変換させる酵素ＬＣＡＴ(lecithin cholesterol acyltransferase)の活性化作用を有することが知られている。ＬＣＡＴは、主としてＨＤＬ上で作用し、コレステロール逆転送系において重要な役割を果たしている酵素である。

いずれにしても、血中のアポＡ−Ｉが子宮体癌のネガティブな指標（その血中濃度の減少が、子宮体癌の存在についての指標となること）であることは、全く新規かつ予想外の事実である。

本検出方法を行うには、血液検体におけるアポＡ−Ｉを定量することが必要となる。かかる定量方法は、既存の検出方法を用いて行うことができる。

例えば、免疫比濁法（ＴＩＡ法）等を挙げることができる。これらの方法において用いる、アポＡ−Ｉに対する抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）は、常法により製造して用いることが可能であり、市販品も好適に用いることができる。また、市販のアポＡ−Ｉ定量検出用のキットを用いて、本検出方法を行うことも可能である。

本検出方法においては、被験者の血中（血液検体中）のアポＡ−Ｉの定量値が、減少している場合に、被験者の子宮体癌の可能性を検出することが可能である。「減少」とは、被験者の血中のアポＡ−Ｉの定量値が、健常人女性の年齢に応じた標準値（一例として、１４１±２３mg/dl程度：２０〜６０歳女性）よりも減少している場合や、同一人の定期検診において、前回よりも明らかにアポＡ−Ｉの定量値が減少している場合等が挙げられる。

なお、アポＡ−Ｉの定量値が減少することが関連する他の症例として、Ｉ型高脂血症、ＩＶ型高脂血症、Ｖ型高脂血症、虚血性心疾患等が挙げられるので、アポＡ−Ｉの定量値が減少している女性被験者においては、これらの疾患と共に、または、他の高脂血症等の診断指標と組み合わせることによって、これらの他の疾患罹患の可能性を除いた上で、被験者における子宮体癌についての可能性を想定することが可能である。

本発明により、アポリポタンパク質Ａ−Ｉの定量値の減少を指標として、子宮体癌を高精度で検出し得る、子宮体癌の検出方法が提供される。

以下、本発明の具体的な形態を記載するが、かかる記載により本発明の範囲が限定されるものではない。

本発明者らは、以前に子宮体癌の血中マーカーを見出すために、飛行時間型質量分析計とプロテインチップを組み合わせた、Ciphergen Biosystems社製のプロテインチップシステムを用いて、子宮体癌患者等の血液検体を用いて、血中タンパク質の解析を行った。このプロテインチップシステムは、固相担体に捕捉させたタンパク質に対してレーザー光線を照射することにより、当該タンパク質をイオン化した状態で当該固相担体から離脱させ、当該離脱タンパク質を、飛行時間型質量分析計にて検出することが可能なシステムである。このプロテインチップシステムによる検出により、子宮体癌患者中の分子量１０００〜２０００００Daの範囲のタンパク質の質量数と発現強度を測定し、当該発現パターンを健常人におけるパターンと比較して見出される差異を指標として、当該被験者における子宮体癌を検出することが可能であることを見出した。本発明は、この検出方法をさらに発展させ、上記質量分布を構成する特定のピークタンパク質のさらなる解析を行うことにより完成されたものである。

以下に、参考例として上記プロテインチップシステムによる解析の内容を開示し、これを基に、さらに本発明の実施例についても開示する。当然、これらの開示例は、本発明を具体的に説明することを目的としたものであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。

［参考例］ プロテインチップシステムによる子宮体癌患者の血液検体の解析
（１）血液検体
初期の被験者候補として、子宮体癌群２６例（ステージＩ〜IV）と、健常人群２５例について、腕末梢静脈血管から採血を行い、常法により血清を調製した。目視によるチェックとプロテインチップ［陽イオン交換チップ（CM１０）］にてヘモグロビンピークを指標とした溶血チェックを行った（100 mM Sodium Acetate, pH4）。

子宮体癌群は、再発・ケモ中の３例とステージIVの2例、そして健常人群との年齢の差を考慮し、最高齢の１例の計６例を除いた２０例を選択した。健常人サンプルは４０代の中からヘモグロビンの影響が認められた２例と、子宮体癌群サンプルとの年齢の差を減少させるため、若年齢の方から３例の計５例を除いた２０例を選択した。

このようにして選択された子宮体癌群と健常人群のそれぞれ２０例の血清を検体とした。当該血清検体は、解析を行うまで、一旦、凍結状態として保存を行った。解析時に氷上で融解し、20000xgにて10分間遠心した後、上清を回収した。前分画は96ウェルフォーマットフィルタープレート上で処理し、全ての上清の回収工程を、DPC Micromix 5 shakerを搭載したBiomek2000 Laboratory Work Station(Beckman Coulter社)を用いて行った。このようにして、上清として得られた血清サンプル20μLに、変性バッファーU9(9M urea, 2%CHAPS, 50mM Tris-HCl, pH9)30μLを加え、4℃で20分間振とうした。次いで、BioSepra Q Ceramic HyperDF（陰イオン交換樹脂）は50mM Tris-HCl,pH9にて前もって平衡化し、50% slurryに調製した。このレジン180μLを、フィルタープレートの各ウェルに加え、U1バッファー(U9バッファーを50mM Tris-HCl, pH9にて9倍希釈したもの)200μLで3回、平衡化を行った。上記のU9で変性させた血清サンプルをレジンに加え、サンプルウェルをU1バッファー50μLで共洗いし、併せてレジンに加え、４℃にて３０分間振とうした後、非吸着画分を回収し、50mM Tris-HCl, pH9, 0.1%OGP 100μLをレジンに加えた。この洗浄液を回収し、非吸着画分と合わせ、Fraction１とした。この後、pH7,5,4,3の段階的なpH勾配によってタンパク質を溶出させた(各溶出バッファー, 100μL×2)。なお、この段階的なタンパク質溶出工程のうち、pH7における溶出は、溶出バッファー（50mM HEPES with 0.1% OGP pH7）にて行い、pH5における溶出は、溶出バッファー(100mM NaAcetate with 0.1% OGP pH5)にて行い、pH4における溶出は、溶出バッファー(100mM NaAcetate with 0.1%OGP pH4)にて行い、pH3における溶出は、溶出バッファー(50mM NaCitrate with 0.1% OGP pH3)にて行った。最後に、レジンに強固に結合したタンパク質を有機溶媒(33.3% isopropanol/16.7% acetonitrile/0.1% trifluoracetic acid)で溶出した。

（２）プロテインチップへの試料の吸着
プロテインチップに固定化された固相担体としては、陽イオン交換樹脂（CM10）（結合・洗浄バッファー：100mM NaAcetate pH4）、同（結合・洗浄バッファー：50mM HEPES pH7）、銅イオン修飾担体(IMAC30)（結合・洗浄バッファー：50mM NaPhosphate, pH7.0, 0.5M NaCl）、及び、逆相担体(H50)（結合・洗浄バッファー：50mM HEPES pH7）を用いた。すべての条件で、シナピン酸 (sinapinic acid：SPA)とCHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)の２種をマトリクス分子として使用した。また、分注等の操作は、全てBiomek2000(Beckman Coulter社)を用いて行った。

陽イオン交換チップ(CM10)
陽イオン交換基（Carboxymethyl基）を有するＣＭ１０チップ（Ciphergen Biosystems社）に、結合・洗浄バッファー（100mM Sodium Acetate, pH4と100mM Sodium Acetate, pH7の２種類を使用）を150μL/spot添加して、5分間室温にて振とうし、当該バッファーを取り除いた。この操作を2回繰り返し、チップ表面を平衡化させた。次に、各フラクション10μLに結合・洗浄バッファー90μLを加えて10倍に希釈した後、チップに添加して30分間室温にて振とうしながら、サンプル中のタンパク質をチップ表面に吸着させた。結合・洗浄バッファーを150μL/spot添加して、5分間室温にて振とうし、チップ表面を洗浄した。これを3回繰り返して非吸着成分を取り除いた後に、200μL/spotのMilliQ水で2回脱塩処理を行った。チップは風乾した後に50%飽和シナピン酸(sinapinic acid:SPA)、あるいは、50%飽和CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)を、1μL/spot添加後、風乾を行った。この添加・風乾の操作を2回繰り返した。

銅イオン修飾チップ(IMAC30)
銅イオンをチップ表面に固定化するため、nitrilotriacetic acid基を有するＩＭＡＣ ３０チップ（Ciphergen Biosystems社）に、100mM CuSO₄を50μL/spot添加し、10分間室温にて振とうした後に、200μL/spotのMilliQ水で2分間・2回洗浄、さらに0.1M Sodium Acetate, pH4を50μL/spot添加し、5分間室温にて振とうした後に、200μL/spotのMilliQ水で2分間洗浄を行った。

次に、結合・洗浄バッファーを150μL/spot添加して、5分間室温にて振とうし、当該バッファーを取り除いた。この操作を2回繰り返し、チップ表面を平衡化させた。次に、各フラクション10μLに結合・洗浄バッファー90μLを加えて10倍に希釈した後、チップに添加して30分間室温にて振とうしながら、サンプル中のタンパク質をチップ表面に吸着させた。

結合・洗浄バッファーを150μL/spot添加して、5分間室温にて振とうし、チップ表面を洗浄した。これを3回繰り返して非吸着成分を取り除いた後に、200μL/spotのMilliQ水で脱塩処理を行った。チップは風乾した後に、50%飽和シナピン酸(sinapinic acid:SPA)、あるいは、50%飽和CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)を、1μL/spot添加後、風乾を行った。この添加・風乾の操作を2回繰り返した。

逆相チップ(H50)
炭素原子数６〜１２のアルキル基を有するＨ５０チップ（Ciphergen Biosystems社）に、結合・洗浄バッファーを150μL/spot添加して、5分間室温にて振とうし、当該バッファーを取り除いた。これを2回繰り返し、チップ表面を平衡化させた。次に、各フラクション10μLに結合・洗浄バッファー90μLを加えて10倍に希釈した後、チップに添加して30分間室温にて振とうしながら、サンプル中のタンパク質をチップ表面に吸着させた。結合・洗浄バッファーを150μL/spot添加して、チップ表面を洗浄、非吸着成分を取り除いた後に、200μL/spotのMilliQ水で脱塩処理を2回行った。チップは風乾した後に50%飽和シナピン酸(sinapinic acid:SPA)あるいは50%飽和CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)をlμL/spot添加後、風乾を行った。この添加・風乾の操作を2回繰り返した。

（３）測定・データ解析
プロテインチップは、Ciphergen Biosystems社のプロテインチップリーダーModel PBS-IICにより測定を行った。データ取得はProteinChip Software version3.2により行った。Optimization Rangeは、低分子領域データとして3000-10000m/z、高分子領域データとして10000-30000m/z、最高測定分子量は、低分子領域データとして100000m/z・高分子領域データとして200000m/zとした。１サンプルあたり２点アッセイを行い、ピーク強度の平均値で解析を行った。

データ解析は、CiphergenExpress^TMDataManager version3.0より行った。測定されたスペクトルからベースライン補正を行った後、分子量校正を行った。分子量校正に用いたタンパク質は表１に示した。

次に、Total Ion Current(TIC)Normalizationにより正規化処理を行った。解析対象はSignal/Noise（S/N）が２より大きいピークとし、サンプル間でのピークパターン比較、群間でのピーク強度の値を用いたu-検定(ｐ値による解析)を行った。

マルチマーカー解析としては、階層的クラスター解析、主成分分析(CiphergenExpress^TMDataManager version3.0)、Biomarker Patterns Software version5.0を用いたClassification解析をおこなった。

（４）結果
（Ａ）シングルマーカー解析
データ解析の流れを図１に示した。まず、上述のように、S/N>2を示した9175ピークを対象にして単変量解析（Mann-Whitney u-test）を行い、p値<0.05の1436ピークを選択した。次に、これらの中からノイズや個体差によるピークを取り除き、マーカー候補とした。

子宮体癌群サンプルで強度が増加しているピーク
子宮体癌群サンプルで、健常人群サンプルに比べて強度が増加しているピークとして、陽イオン交換チップにて捕捉され得る、平均質量数が、６４９３Da（６４９３Da＃１：ｐH7の緩衝液で平衡化した陽イオン交換チップにて捕捉されたもの。６４９３Da＃２：ｐH４の緩衝液で平衡化した陽イオン交換チップにて捕捉されたもの。以下、＃１と＃２は同様の意味で用いる。）６４８７Da（＃１，＃２）、３２４４Da、６６９１Da（＃１，＃２）、６６８４Da（＃１，＃２）、３３４３Da（＃１，＃２）、及び、１９３１８Da、のピークに該当する強度の増加が認められた。

（ａ）６４９３Daタンパク質（図２〜３）
図２は、上記のｐＨ９のバッファーを用いて調製したＦｒ１画分を、陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はSPA(LOW）］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が６４９３Daのタンパク質（６４９３Da＃１）量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。また、図３は、図２に示した系において、結合・洗浄バッファーをｐＨ４の結合・洗浄バッファーに代えて捕捉されたタンパク質（６４９３Da＃２）についての結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。両系とも、子宮体癌群において、６４９３Daタンパク質が有意に増加していることが、これらの図面において明確に示されている。

よって、ｐＨ７又はｐＨ４の緩衝液で平衡化された陽イオン交換チップに捕捉され得る６４９３Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが、明らかになった。

（ｂ）６４８７Daタンパク質（図４〜５）
図４は、上記のｐＨ９のバッファーを用いて調製したＦｒ１画分を、陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が６４８７Daのタンパク質（６４８７Da＃１）量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。また、図５は、図４に示した系において、結合・洗浄バッファーをｐＨ４の結合・洗浄バッファーに代えて捕捉されたタンパク質（６４８７Da＃２）についての結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。両系とも、子宮体癌群において、６４８７Daタンパク質が有意に増加していることが、これらの図面において明確に示されている。

よって、ｐＨ７又はｐＨ４の緩衝液で平衡化された陽イオン交換チップに捕捉され得る６４８７Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが、明らかになった。

（ｃ）３２４４Daタンパク質（図６）
図６は、上記のｐＨ９のバッファーを用いて調製したＦｒ１画分を、陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が３２４４Daのタンパク質量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。子宮体癌群において、３２４４Daタンパク質が有意に増加していることが、当該図面において明確に示されている。

よって、ｐＨ７の緩衝液で平衡化された陽イオン交換チップに捕捉され得る３２４４Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが、明らかになった。

（ｄ）６６９１Daタンパク質（図７〜８）
図７は、上記のｐＨ９のバッファーを用いて調製したＦｒ１画分を、陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はSPA(LOW）］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が６６９１Daのタンパク質（６６９１Da＃１）量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。また、図８は、図７に示した系において、結合・洗浄バッファーをｐＨ４の結合・洗浄バッファーに代えて捕捉されたタンパク質（６６９１Da＃２）についての結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。両系とも、子宮体癌群において、６６９１Daタンパク質が有意に増加していることが、これらの図面において明確に示されている。

よって、ｐＨ７又はｐＨ４の緩衝液で平衡化された陽イオン交換チップに捕捉され得る６６９１Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが、明らかになった。

（ｅ）６６８４Daタンパク質（図９〜１０）
図９は、上記のｐＨ９のバッファーを用いて調製したＦｒ１画分を、陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が６６８４Daのタンパク質（６６８４Da＃１）量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。また、図１０は、図９に示した系において、結合・洗浄バッファーをｐＨ４の結合・洗浄バッファーに代えて捕捉されたタンパク質（６６８４Da＃２）についての結果を示した図面（Group box and whiskers plot とROC plot）である。両系とも、子宮体癌群において、６６８４Daタンパク質が有意に増加していることが、これらの図面において明確に示されている。

よって、ｐＨ７又はｐＨ４の緩衝液で平衡化された陽イオン交換チップに捕捉され得る６６８４Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが、明らかになった。

（ｆ）３３４３Daタンパク質（図１１〜１２）
図１１は、上記のｐＨ９のバッファーを用いて調製したＦｒ１画分を、陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が３３４３Daのタンパク質（３３４３＃１）量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。また、図１２は、図１１に示した系において、結合・洗浄バッファーをｐＨ４の結合・洗浄バッファーに代えて捕捉されたタンパク質（３３４３Da＃２）についての結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。両系とも、子宮体癌群において、３３４３Daタンパク質が有意に増加していることが、これらの図面において明確に示されている。

よって、ｐＨ７又はｐＨ４の緩衝液で平衡化された陽イオン交換チップに捕捉され得る３３４３Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが、明らかになった。

（ｇ）１９３１８Daタンパク質（図１３）
図１３は、上記のｐＨ５のバッファーを用いて調製した画分を、陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はSPA(HIGH）］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が１９３１８Daのタンパク質量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plot
とROC plot）である。子宮体癌群において、１９３１８Daタンパク質が有意に増加していることが、当該図面において明確に示されている。

よって、ｐＨ７の緩衝液で平衡化された陽イオン交換チップに捕捉され得る１９３１８Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが、明らかになった。

以上、図２〜１３に示したように、子宮体癌群における、陽イオン交換チップにて捕捉され得る、平均質量数が、６４９３Da（＃１，＃２）、６４８７Da（＃１，＃２）、３２４４Da、６６９１Da（＃１，＃２）、６６８４Da（＃１，＃２）、３３４３Da（＃１，＃２）、及び、１９３１８Da、のピークは、それぞれ有意差をもって、コントロール群よりも強いピークとして認められた。この結果より、これらのピークに相当する血中タンパク質のうち１種以上を選んで、そのピーク（血中存在量）の増大を、標準値（健常人におけるピーク値）との比較において検出指標とすることにより、鋭敏に子宮体癌を検出することが可能であることが判明した。これらのうち、３３４３Daタンパク質と、６６８４Daタンパク質と、６６９１Daタンパク質では、＃１と＃２の双方とも、P値＜０．０００００１と極めて高い有意差を示した。

子宮体癌群サンプルで強度が減少しているピーク
子宮体癌群サンプルで、健常人群サンプルに比べて強度が減少しているピークとして、平均質量数が、５６２５Da、９３７０Da、及び、２８１６５Daのピークに、該当する強度の減少が認められた。

（ａ）５６２５Daタンパク質（図１４）
図１４は、上記のｐＨ４の結合・洗浄バッファーを用いて調製した画分を、銅イオン修飾チップ［IMAC30：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が５６２５Daのタンパク質量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。子宮体癌群において、５６２５Daタンパク質が有意に減少していることが、当該図面において明確に示されている。

よって、銅イオン修飾チップにて捕捉され得る５６２５Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが明らかになった。

（ｂ）９３７０Daタンパク質（図１５）
図１５は、上記のｐＨ４の結合・洗浄バッファーを用いて調製した画分を、銅イオン修飾チップ［IMAC30：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が９３７０Daのタンパク質量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。子宮体癌群において、９３７０Daタンパク質が有意に減少していることが、当該図面において明確に示されている。

よって、銅イオン修飾チップにて捕捉され得る９３７０Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが明らかになった。

（ｃ）２８１６５Daタンパク質（図１６）
図１６は、上記のｐＨ４の結合・洗浄バッファーを用いて調製した画分を、銅イオン修飾チップ［IMAC30：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の平均質量数が２８１６５Daのタンパク質量の分布を、コントロール（健常人）群と子宮体癌群との間で比較した結果を示した図面（Group box and whiskers plotとROC plot）である。子宮体癌群において、２８１６５Daタンパク質が有意に減少していることが、当該図面において明確に示されている。

よって、銅イオン修飾チップにて捕捉され得る２８１６５Daタンパク質は、本検出方法において子宮体癌のマーカーとして用いることが可能であることが明らかになった。

以上図１４〜１６に示したように、子宮体癌群における、銅イオン修飾チップにて捕捉され得る、平均質量数が、５６２５Da、９３７０Da、及び、２８１６５Daのピークは、それぞれ有意差をもって、コントロール群よりも弱いピークとして認められた。この結果より、これらのピークに相当する血中タンパク質のうち１種以上を選んで、そのピーク（血中存在量）の減少を、標準値（健常人におけるピーク値）との比較において検出指標とすることにより、鋭敏に子宮体癌を検出することが可能であることが判明した。

（Ｂ）マルチマーカー解析
階層的クラスター解析
階層的クラスター解析とは、多変量解析の手法の一つであり、類似度を指標として対象を分類する解析手法である。いくつのグループに分かれるのかを事前に想定せず、また、対象に関する予備知識（例えば、癌患者であるとか、健常人であるとかの情報）なしで分類を行うことを特徴とする。

本実施例においては、P値が0.05以下のピークのうちノイズピークを除いた全試験条件の７０１ピークの高さ（当該ピークに相当するタンパク質の存在量）を基準として、コントロール群と子宮体癌群からなる上述した全４０検体を解析した。その結果、コントロール群と子宮体癌群が明確に異なったグループに分類された。よって、子宮体癌と健常人の血清で存在量が有意に異なるタンパク質を指標として階層的クラスター解析を行うことにより、子宮体癌患者と健常人とを判別可能であることが示された。

主成分分析
主成分分析とは、多変量解析の手法の一つであり、対象に関連する多くの変数から、それらの特徴を要約・総合化するような少量の変数を合成する分析手法である。例えば、解析対象となる人の血清中の各タンパク質の発現量情報から、それらの特徴を表現するような少数の変数を合成することができる。これらの合成された変数を組み合わせることにより、対象がどのように分類されるのかを知ることができる。本実施例の場合、P値が0.05以下のピークのうちノイズピークを除いた全試験条件の７０１ピークの高さ（当該ピークに相当するタンパク質の存在量）から、表２に示すPercent varianceの高い上位3つの主成分１(PCAcomp1)、主成分２(PCAcomp2)、主成分３(PCAcomp3)が新たに合成され、これらを組み合わせて解析を行った。各主成分において寄与率（Importance)の高いピークを上位10までリストアップした（表２）。その結果、PCAcomp1と3の組み合わせ、PCAcomp2と3の組み合わせ、およびPCAcomp1,2,3の組み合わせで、コントロール群と子宮体癌群を分類することができた。よって、血液検体における特定分子量間のタンパク質の質量分布のパターンについて、主成分分析を行うことにより、子宮体癌を検出可能であることが示された。

また、上述した１５種類のピーク群［６４９３Da（＃１，２）、６４８７Da（＃１，２）、３２４４Da、６６９１Da（＃１，２）、６６８４Da（＃１，２）、３３４３Da（＃１，２）、１９３１８Da、５６２５Da、９３７０Da、及び、２８１６５Daの分子量分布中心を示すピーク群］のみを使用して、上記と同様の主成分分析を行った。その結果、この場合においても、コントロール群と子宮体癌群を分類することができた。

Classification解析
Classification解析は、多変量解析の手法の一つである。すでにいくつかのグループに分類されている対象を解析することにより、グループを判別するためのルールを構築し、また、そのルールを用いて新たな対象がどのグループに属するのかを予測するための解析手法である。本実施例の場合は、Biomarker Patterns Software version5.0を用いてClassification解析を行った。具体的には、P値が0.05以下のピークのうちノイズピークを除いた全試験条件の７０１ピークの高さ（当該ピークに相当するタンパク質の存在量）を基準として、コントロール群と子宮体癌群とを判別するルールを構築した。

１）コントロール群と子宮体癌群の2群解析によるP値が0.05以下のピークからノイズピークを除いたCHCA条件のみを使用してClassification解析を行った。最も高い診断効率を示したルールは、シングルマーカー解析時にCandidate Peakに選ばれているMW3343のみを用いて判別するというルールで、Specificity90%、Sensitivity95%、という高い精度で診断可能であった。しかし、さらに例数を増やして解析することにより、MW3343のみによる判別よりも有効なマルチマーカーによる判別ルールが生成される可能性が高いと考えられる。

２）コントロール群と子宮体癌群の2群解析によるP値が0.05以下のピークでノイズピークを除いた全試験条件の701ピークを使用してClassification解析を行った。最も高い診断効率を示したルールは、シングルマーカー解析時にCandidate Peakに選ばれているMW3343のみを用いて判別するというルールで、Specificity90%、Sensitivity95%、という高い精度で診断可能であった。しかし、さらに例数を増やして解析することにより、MW3343のみによる判別よりも有効なマルチマーカーによる判別ルールが生成される可能性が高いと考えられる。

３）上記の１５種類のCandidate Peakのみを使用してClassification解析を行った。最も高い診断効率を示したルールは、シングルマーカー解析時にCandidate Peakに選ばれているMW3343のみを用いて判別するというルールで、Specificity90%、Sensitivity95%、という高い精度で診断可能であった。しかし、さらに例数を増やして解析することにより、MW3343のみによる判別よりも有効なマルチマーカーによる判別ルールが生成される可能性が高いと考えられる。

まとめ
上述したシングルマーカー解析及びマルチマーカー解析を行うことにより、子宮体癌群とコントロール群を分類分け可能であることが示された。これらの解析により、血液検体中のタンパク質における分子量１０００〜３００００Daの範囲のタンパク質の質量数と発現強度を測定し、当該発現パターンを健常人におけるパターンと比較して見出される差異を指標として、当該被験者における子宮体癌を検出することが可能であることが明らかになった。

［実施例］
本発明においては、上述した各ピークのうち、子宮体癌患者において減少することが認められたピークタンパク質である、（２）２８１６５Daタンパク質（以下、２８kDaタンパク質ともいう）と（１）９３７０Daタンパク質（以下、９．３kDaタンパク質ともいう）についてのさらなる解析を行い、その本体がアポＡ−Ｉであることを明らかにした。

（Ａ）２８ｋDaタンパク質の解析
（１）陰イオン交換レジンによる粗分画
陰イオン交換レジンに血清を吸着させて、ｐＨを段階的に変えて溶出することにより、粗分画を行った。

具体的には、血清を変性バッファー(9M urea,2％CHAPS,50mM Tris-HCl,pH9)を用いて変性させた後、陰イオン交換レジン(Q Ceramic hyperD F:BioSepra社)にアプライした。次いで、ｐＨを段階的に変えて溶出を行った。最後に、有機溶媒を用いて溶出を行った。溶出は、下記の溶出バッファー（９ml×２回）にて行った。

ｐＨ９：５０mM Tris-HCl＋０．１％ＯＧＰ(1-o-n-Octyl-8-D-glucopyranosideの略称)
ｐＨ７：５０mM HEPES＋０．１％ＯＧＰ
ｐＨ５：１００mM Na Acetate＋０．１％ＯＧＰ
ｐＨ４：１００mM Na Acetate＋０．１％ＯＧＰ
ｐＨ３：５０mM Na Citrate＋０．１％ＯＧＰ
Organic solvent:３３％isopropanol,１７％acetonitril,０．１％ＴＦＡ

得られた画分を銅修飾チップにて測定して、目的のタンパク質の存在を確認した。

（２）アルブミン・ＩｇＧ除去処理
上記の工程において、銅イオン修飾チップにて２８kDaのピークが確認されたフラクション３５０μlに対して、１M リン酸ナトリウム（pH7）１５０μlを添加し、pHを中性に調整した。次いで、PureSpinA-Iのプロトコルに従って、サンプル処理を行った。次いで、処理サンプルを限外濾過(VIVA Spin 30K：VIVA SCIENCE社製)にて、総量を２５μlへと濃縮を行った。

（３）電気泳動による精製
上記の濃縮サンプルに対して、１２％isocratic acrylamide gelを電気泳動ゲルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い（ＣＢＢ染色）、分離タンパク質の精製を行った。電気泳動の結果、２８kDaにピークタンパク質を認め、これを常法により抽出を行った。この抽出タンパク質を目的とするピークタンパク質として、下記の同定作業を行った。

（Ｂ）２８kDaピークタンパク質の同定
（１）ペプチドマスフィンガープリンティングによる同定
上記の２８kDaピークタンパク質に対して、トリプシン処理（ｐＨ８、３７℃、１６時間）を行い、かかる消化物に対して、ペプチドマスフィンガープリンティングによる同定を行った。この同定作業には、ＰＣＩ−Ｑstar（ＰＣＩ：Ciphergen Biosystems社製、Ｑstar：Applied Biosystems社製）（質量分析計であるＱstarに、アダプターであるＰＣＩを装着したもの、これによりＱstarでプロテインチップ測定が可能となる）を用い、解析にはMascotを用いた。

ペプチドマスフィンガープリンティングは、タンパク質をプロテアーゼで消化し、生じた断片の質量数をもとにして、データベース検索によりタンパク質を同定する方法である。データベース内の各タンパク質の配列から予想される消化断片の質量数と照合することにより、タンパク質の同定を行うことができる。

（２）タンデムマス解析による同定
上記の２８kDaピークタンパク質のトリプシン消化物の５種に対して、タンデムマス解析を行った。

この同定作業には、ＰＣＩ−Ｑstar（ＰＣＩ：Ciphergen Biosystems社製、Ｑstar：Applied Biosystems社製）を用い、解析にはMascotを用いた。

タンデムマス解析では、２つの質量分析部を直列に結合した装置を使用する。２つの質量分析部の間には衝突室が設けられている。１つ目の質量分離部では、特定の分子量の分子を選択することが可能であり、衝突室で不活性ガスを衝突させて選択された分子を分離し、分解により生じた産物の分子量を、２つ目の質量分析部で検出する。この分解産物の分子量の情報からアミノ酸配列に関する情報を得ることが可能となり、データベース内のタンパク質の配列と照合することにより同定を行うことができる。

その結果、図１７に示す、全長ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（２４３アミノ酸：一文字表示）の、四角で囲んだ部分のペプチドが、タンデムマス解析により同定された。

（３）結論
上記（１）（２）の結果により、２８kDaピークタンパク質は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉであると同定された。アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、２４３アミノ酸からなる分子量２８kDaのタンパク質であり、今回、マーカーとして得られた２８kDaピークタンパク質の分子量はこれと一致する。よって、２８kDaのマーカーは全長のアポリポタンパク質Ａ−Ｉであると結論付けられる。

よって、前述のように、２８kDaピークタンパク質として同定されたアポリポタンパク質Ａ−Ｉの血中濃度の減少を指標として、被験者（血液検体提供者）の子宮体癌を検出することが可能であることが見出された。

（Ｃ）９．３kDaタンパク質の解析
（１）陰イオン交換レジンに血清を吸着させて、ｐＨを段階的に変えて溶出することにより、粗分画を行った。

具体的には、血清を変性バッファー(9M urea,2％CHAPS,50mM Tris-HCl,pH9)を用いて変性させた後、陰イオン交換レジン(Q Ceramic hyperD F:BioSepra社)にアプライした。次いで、ｐＨを段階的に変えて溶出を行った。最後に、有機溶媒を用いて溶出を行った。溶出は、下記の溶出バッファー（９ml×２回）にて行った。

ｐＨ９：５０mM Tris-HCl＋０．１％ＯＧＰ
ｐＨ７：５０mM HEPES＋０．１％ＯＧＰ
ｐＨ５：１００mM Na Acetate＋０．１％ＯＧＰ
ｐＨ４：１００mM Na Acetate＋０．１％ＯＧＰ
ｐＨ３：５０mM Na Citrate＋０．１％ＯＧＰ
Organic solvent:３３％isopropanol,１７％acetonitril,０．１％ＴＦＡ

得られた画分を銅修飾チップにて測定して、目的のタンパク質の存在を確認した。

（２）陰イオン交換スピンカラムによる分画
上記の工程において、銅イオン修飾チップにて９．３kDaのピークが確認されたｐＨ５のフラクションについて、陰イオン交換スピンカラムを用いて塩濃度を段階的に変えることにより分画を行った。

具体的には、陰イオンスピンカラム（Ｑ ceramic hyperD F：BioSepra社）に対して、上記ピークフラクション（１８ml）を、５０mM Tris-HCl pH8で４０ml（pH８)に調製して、これをアプライした。溶出は、下記の溶出バッファー（１ml×５）にて行った。

０mM：５０mM Tris-HCl pH8
５０mM：５０mM Tris-HCl pH8＋５０mM NaCl
１００mM：５０mM Tris-HCl pH8＋１００mM NaCl
１５０mM：５０mM Tris-HCl pH8＋１５０mM NaCl
２００mM：５０mM Tris-HCl pH8＋２００mM NaCl
５００mM：５０mM Tris-HCl pH8＋５００mM NaCl
１M：Tris-HCl pH8＋１M NaCl

その結果、５０mM NaClフラクションからターゲットピークが検出された。

（３）固相抽出（C18）による分画
上記の陰イオン交換スピンカラムによる分画により得られた、５０mM NaClフラクション５mlを、Sep−Pak C18（Waters社製）にアプライした。溶出は、下記の溶出バッファー（１００μl×２）にて行った。

０％：０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
２０％：２０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
３０％：３０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
３５％：３５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
４０％：４０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
５０％：５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
７０％：７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
９０％：９０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ

その結果、５０〜７０％アセトニトリルフラクションからターゲットピークが検出された。

（４）ゲル濾過ＨＰＬＣによる精製
上記の固相抽出分画により得られた、５０％アセトニトリル画分２００μlを、ゲル濾過ＨＰＬＣによる精製を行った。使用カラムは、Superdex Peptide 10/300 GL（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で、溶出バッファーとしては、６０％アセトニトリル／０．１％TFAを用い、溶出速度は、０．２ml／分で行い、０．２ml毎に分画を行った。図１８は、このゲル濾過ＨＰＬＣの検量線であるが、上記のターゲットタンパク質の分子量（約９３００Da）からすると、ターゲットピークは６９分当たりに認められることが予想されたが、実際には、当該ターゲットピークは、５５分画分において検出された（図１９）。これは、上記の検量線において２７〜２８kDaに相当し、さらに、逆相チップを用いて、多価チャージの出やすいＣＨＣＡを用いて測定を行った場合には９．３kDaのピークは認められたが、多価チャージの出にくいＳＰＡを用いて測定を行った場合には、当該ピークは観察されなかった。このことは、９．３kDaのピークが２８kDaのタンパク質のピークのトリプルチャージであることを示唆するものである。

さらに、電気泳動を行い、２８ｋDaのバンドを切り出して、Ciphergen Biosystems社のプロテインチップリーダーModel PBS-IIcによる測定を行ったところ、２８ｋDaのピークに加えて９．３ｋDaのピークが観察された。さらに、この２８ｋDaのタンパク質を、ペプチドマス解析によって同定したところ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉであることが確認された。以上の結果から、９．３ｋDaのターゲットピークが、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのトリプルチャージ（＋３）であることが確定した。

シングルマーカー解析におけるデータ解析の流れを図式化して示した図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はSPA(LOW）］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の６４９３Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はSPA(LOW）］とｐＨ４の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の６４９３Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の６４８７Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ４の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の６４８７Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の３２４４Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はSPA(LOW）］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の６６９１Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はSPA(LOW）］とｐＨ４の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の６６９１Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の６６８４Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ４の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の６６８４Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の３３４３Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ４の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の３３４３Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 陽イオン交換チップ［CM10：マトリクス分子はSPA(HIGH）］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の１９３１８Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 銅イオン修飾チップ［IMAC30：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の５６２５Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 銅イオン修飾チップ［IMAC30：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の９３７０Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 銅イオン修飾チップ［IMAC30：マトリクス分子はCHCA］とｐＨ７の結合・洗浄バッファーで処理して測定を行った場合の２８１６５Daのタンパク質を示すピークについて解析した結果を示す図面である。 アポリポタンパク質Ａ−Ｉのアミノ酸配列（一文字表記）において、タンデムマス解析により同定されたペプチドを示した図面である。 ２８kDaピークタンパク質についてのゲル濾過ＨＰＬＣの検量線である。 逆相チップによりターゲットピークを確認した結果を示す図面である。

Claims (2)

1. 血液検体中のアポリポタンパク質Ａ−Ｉを検出し、当該アポリポタンパク質の量が減少している場合に、これを検体提供者における子宮体癌の存在の指標とすることを特徴とする、子宮体癌の検出方法。
2. 血液検体が、血清検体であることを特徴とする、請求項１記載の子宮体癌の検出方法。