CZ294729B6 - Způsob in vitro zjišťování stavu organismu stanovením peptidů - Google Patents

Způsob in vitro zjišťování stavu organismu stanovením peptidů Download PDF

Info

Publication number
CZ294729B6
CZ294729B6 CZ1999491A CZ49199A CZ294729B6 CZ 294729 B6 CZ294729 B6 CZ 294729B6 CZ 1999491 A CZ1999491 A CZ 1999491A CZ 49199 A CZ49199 A CZ 49199A CZ 294729 B6 CZ294729 B6 CZ 294729B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
molecular weight
peptides
organism
low molecular
sample
Prior art date
Application number
CZ1999491A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ49199A3 (cs
Inventor
Peter Schulz-Knappe
Michael Schrader
Hans-Georg Opitz
Wolf-Georg Prof.Dr. Forssmann
Original Assignee
Biovision Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26028345&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ294729(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE1996132521 external-priority patent/DE19632521A1/de
Application filed by Biovision Ag filed Critical Biovision Ag
Publication of CZ49199A3 publication Critical patent/CZ49199A3/cs
Publication of CZ294729B6 publication Critical patent/CZ294729B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Způsob in vitro zjišťování stavu organismu stanovením peptidů ve vzorku získaného z organismu, přičemž vzorek obsahuje nízkomolekulární peptidy s molekulovou hmotností maximálně 30 000 Da jako indikátor stavu organismu. Způsob spočívá v přímé detekci a charakterizaci nízkomolekulárních peptidů s molekulovou hmotností do 30 000 Da, výsledky se porovnávají s referenčním standardem. S výhodou je molekulová hmotnost nízkomolekulárních peptidů 100 Da až 10 000 Da, jejich stanovení se provádí hmotovou spektrometrií.ŕ

Description

Způsob in vitro zjišťování stavu organismu stanovením peptidu
Oblast techniky
Předmětem předloženého vynálezu je způsob in vitro zjišťování stavu organismu stanovením peptidů ve vzorku z organismu.
Dosavadní stav techniky
Pro zjišťování stavu organismu se používají různé analytické metody. Tak například při diagnostice vyšších organismů se u patologických nálezů usiluje o nalezení příčin patologických změn, za účelem vyvinutí kauzální terapie. Dále je vyvíjena snaha seřazením genomů organismů a ustanovením genomů původního typu („Wildtyp-Genom“) vyvinout referenční průměrný genové analýzy zjišťovat individuální odchylky, které mohou ukazovat na možný patogenní vývoj. Nevýhodou prvního metodického přistupuje, že nelze provádět diagnostiku bez přijímání hypotéz, neboť se provádí diagnóza, která je založena na předpokladech. Nevýhodou druhého způsobu je, že po dlouhou dobu není možné diagnostikovat důležité nebo dokonce všechny nemoci spojené s genetickými dysfunkcemi. Další nevýhodou posledně uvedené metody může také být to, že mutace genu nevede nutně k vyjádření v příslušném fenotypu.
Podstata vynálezu
Bylo by tedy žádoucí poskytnout univerzálně použitelný diagnostický postup, který umožňuje vyhnout se popsaným nevýhodám, a zejména provádět diagnostiku bez přijímání hypotéz. Diagnostický způsob by měl být kromě toho univerzálně použitelný, neměl by být omezen na více vyvinuté systémy, ale měl by být použitelný také pro zjišťování stavu nižších organismů. Měl by být snadno ustavitelný a proveditelný pomocí o sobě známých technik.
Cílem vynálezu je poskytnout takovýto způsob.
Tento technický problém je překvapivě vyřešen jednoduchým způsobem znaky nároku 1. Závislé nároky se týkají výhodných provedení způsobu podle vynálezu.
Způsob in vitro zjišťování stavu organismu podle vynálezu vychází z toho, že se vyšetřovanému organismu odebere vzorek. V případě nižších organismů může být vzorkem i celý organismus. Vzorek musí obsahovat nízkomolekulámí peptidy s molekulovou hmotností maximálně 30 000 Da, přičemž nevadí, když vedle nízkomolekulámích peptidů obsahuje také vysokomolekulámí peptidy nebo proteiny. Nízkomolekulámí peptidy se přitom podle vynálezu přímo zjišťují a charakterizují a slouží jako indikátor stavu organismu. Přitom je také možné přímým měřením zjišťovat jednotlivé peptidy nebo více peptidů nebo dokonce všechny nízkomolekulámí peptidy, které jsou technicky měřitelné a nacházejí se ve vzorku. Na rozdíl od obvyklých analytických nebo diagnostických metod, jako například gelové elektroforézy nebo dvourozměrné elektroforézy a například klinických diagnostických metod, se zde nevyšetřují vysokomolekulámí struktury, jako například proteiny. Na rozdíl od známých diagnostických metod, jako například radioimunologíckých zkoušek nebo jiných konkurenčních zkoušek pro měření peptidických hormonů a podobně, se podle vynálezu nízkomolekulámí peptidy přímo technicky zjišťují, nikoliv nepřímo, jako je tomu u uvedených metod. Jako referenční vzorek slouží rozdělení nízkomolekulárních peptidů v reprezentativní řezu definovaných kontrol.
Při způsob podle vynálezu mohou vyšetřované vzorky tkání nebo tekutin pocházet z organismu, jehož stav se vyšetřuje, nebo může být vzorkem organismu sám nebo jeho části. V případě vyšetřování nižších organismů s výhodou slouží jako vzorek organismu samotný. Jako nižší
- 1 CZ 294729 B6 organismy přicházejí v úvahu zejména jednobuněčné, jako prokaryotické systémy nebo jednoduché eukaryotické systémy, například kvasinky nebo jiné mikroorganismy.
Jak již bylo uvedeno výše, nízkomolekulární peptidy, které se používají pro měření podle vynálezu, mají molekulovou hmotnost maximálně 30 000 Da. Spodní mez není sama o sobě rozhodující, avšak tuto spodní mez nízkomolekulámích peptidů, detekovaných podle vynálezu, představují dipeptidy. Zvláště vhodné jsou molekulové hmotnosti nízkomolekulámích peptidů 100 Da až 10 000 Da.
Je-li požadováno, například v důsledku změněného měřicího uspořádání, může být výhodné odstranit ze vzorku vysokomolekulární peptidy nebo proteiny, jakož i jiné biopolymery, které mohou interferovat s měřením. To není třeba zejména tehdy, když použité měření metody tyto peptidy s vyšší molekulovou hmotností nezachycují.
S výhodou se podle vynálezu pro zjišťování nízkomolekulámích peptidů používá hmotové spektroskopie.
Zvláště se přitom osvědčila takzvaná MALDI-metoda (Matrix Assisted Laser Desorpcion Ionization) hmotové spektroskopie. Používá-li se metoda hmotové spektrometrie, doporučuje se použít pro charakterizaci nízkomolekulámích peptidů data, stanovitelná hmotovou spektroskopií, jako například jejich molekulovou hmotnost. Je také možné, za jistých okolností, analyzovat jiné parametry, jako například náboj peptidů nebo charakteristický retenční čas na chromatografícké koloně nebo fragmentový vzor nízkomolekulámího peptidů nebo kombinaci hmotnosti a náboje nízkomolekulámích peptidů.
Podle dalších kritérií, které mohou být ještě spojeny se zjišťováním stavu organismu, může být výhodné vzorek rozdělit na více frakcí a pro zjištění stavu organismu analyzovat vzorky podle různých zadání nebo s různým technickým uspořádáním.
Jako organismus přicházejí zejména prokaryoty, eukaryoty, mnohobuněčné organismy, buňky z tkáňových kultur, buňky ze zvířat a lidí. Tak je podle vynálezu umožněno vyšetřovat stav geneticky změněných nebo transformovaných a/nebo upravených organismů. To může být výhodné zejména při kontrolních zkouškách transformovaných systémů pro zjištění, do jaké míry se v transformovaných organismech případně vyvinuly neočekávané nebo nežádoucí vlastnosti, například tím, že se tvoří peptidy, které ukazují na nežádoucí nebo nečekané vlastnosti, jako například toxické vlastnosti.
Zejména může každá vědomá nebo nezáměmá manipulace (úprava) organismu jeho stav ovlivnit, ať je to v rámci podávání medikamentů, genové terapie, při infekcích, na pracovišti kontaktem s chemickými látkami, u pokusných zvířat, zejména transgenových zvířat a knock-out mutantů. Zejména při těchto pokusech se může kontrolovat, například prostřednictvím chronologického odběru vzorku z jednoho organismu před a v průběhu některého z výše uvedených opatření nebo prostřednictvím srovnání s neošetřenými kontrolními organismy, zda skutečně nastaly předpokládané, požadované změny ve stavu a zde kromě nich nebo na místo nich nenastaly nepředpokládané, nežádoucí nebo také žádoucí změny, které se bez přijímání hypotéz zjišťují způsobem podle vynálezu.
Způsob podle vynálezu je tedy vhodný také například pro doplnění klinických studií, toxikologických vyšetřování při testování medikamentů všeho druhu, pro analýzu/zjišťování produktů odbourávání, pro identifikaci genových produktů.
Ve veterinární a humánní medicíně nabývá způsob podle vynálezu mimořádného výzkumu tím, že umožňuje zjištění stavu příslušného organismu. Způsob podle vynálezu, který je možné označit za diferenciální peptidový obraz, přitom vychází z toho, že ve zdravém organismu je přítomen určitý peptidový vzor, který může sloužit jako referenční standard. Jestliže se zazname
-2 CZ 294729 B6 ná peptidový stav individua a porovná se s referenčním vzorkem, získá se první známka možného patogenního stavu. Naleznou-li se odchylky, zjištěné porovnání s podobnými patogenními stavy z příslušných vzorků nemocných objektů, je možno přímo z analýzy identifikovat příslušnou nemoc prostřednictvím srovnání odchylek v peptidovém vzorku ze vzoru ve vzorku individua a přiřazením odchylek chorobnému obrazu příslušného onemocnění.
Podle vynálezu se přitom může postupovat zejména následovně. Pro výrobu referenčního vzorku se použijí nejprve ultrafiltráty z tělních tekutin a tkáňových extraktů. Při získávání peptidů a jejich rozdělení na frakce se získají například nízkomolekulámí peptidové frakce. Charakterizace peptidových frakcí se může provádět například na základě referenčního chování a molekulární hmotnosti, které jsou stanovitelné pomocí chromatografíe nebo hmotové spektroskopie. Použijeli se například ultrafiltrát pacientů, kteří trpí známým onemocněním, a srovná se s předem stanoveným spektrem zdravým referenčních objektů, je možné na základě odchylného vzoru přiřadit stavu peptidové směsi příslušné specifické onemocnění. Tento způsob se může použít také o sobě známým způsobem tak, že se například bezprostředně vyhodnocuje příslušný peptidový vzor indikující patogenní změny. V jednotlivém případě to dokonce může být peptid charakteristický pro příslušnou nemoc. Analyzuje-li se např. vzorek z jednoho pacienta vykazujícího určitý chorobný obraz a existuje hypotéza o příčině tohoto onemocnění, je možno například tento specifický peptid rovněž podrobit analýze podle vynálezu a při pozitivním výsledku sestavit příslušný plán terapie. Je samozřejmě možné, nejdříve pacientovi odebrat vzorek, způsobem podle vynálezu zaznamenat stav, a poté při stanovení přítomnosti odchylky ukazující na patogenní stav buď prostřednictvím o sobě známých ověřovacích zkoušek provést kontrolních měření, nebo provést kontrolní měření specifickým vyhodnocením indikátoru patogenního stavu.
Peptidy se přitom mohou získávat způsobem odborníkovi známým, jako například ultrafíltrací příslušného výchozího materiálu. Přitom se používají filtry s výstupní molekulární velikostí, která leží v oblasti pokrývané vynálezem, tedy mezi dipeptidy a maximálně 30 000 Daltony. Prostřednictvím vhodné volby příslušné membrány je možno volit také určité frakce molekulové hmotnosti. S výhodou se v rámci filtrace získává 0,2 ml až 501 filtrátu, který se případně hned po ukončení filtrace nastavuje zředěnou kyselinou solnou na hodnotu pH 2 až 4. Uvedená množství slouží zejména k vyšetřování nashromážděných vzorků, pro vytvoření referenčních vzorků zdravých objektů popř. pro určení peptidových markantů specifických pro nemoc pro vytvoření databanky peptidů.
Peptidy přítomné ve filtrátu po ultrafíltrací se získávají adsorpcí na chromatografických materiálech, zejména kationtoměničích, jako například Fractogel, aniontoměničích, jako Fractogel TMAE a materiálech pro reverzní fázi, a následnou elucí s lineárními gradienty nebo stupňovitými gradienty. Pro další čištění se mohou popřípadě provádět další chromatografické separace, zejména v reverzní fázi.
Zjištění peptidových frakcí se s výhodou provádí prostřednictvím hmotové spektrometrie, zejména MALDI-MS (matrix assisted laser desorption ionisation mass spectrometry) nebo ESI-MS (elektro spray ionisation-MS). To jsou metody použitelné k analýze peptidů. Přitom se s výhodou pracuje s on-line připojením kapilární separace v reverzní fázi a hmotové spektrometrii (LC-MS spojení). Ze získaných dat se sestaví vícedimenzionální tabulky podle retenčního chování, molekulové hmotnosti a intenzity signálu jako výhodných hlavních parametrů. Mohou se však zjišťovat také jiné veličiny, měřitelné uvedenými metodami.
Data o pacientech se známým základním onemocněním, získaná výše uvedenými kroky, se porovnávají se stejným způsobem získanými daty zdravé referenční populace. Přitom se stanoví jako kvalitativní změny (např. přítomnost nového peptidů nebo chybění peptidů), tak i kvantitativní změny (zvětšený popřípadě zmenšený výskyt jednotlivých peptidů). Tyto, srovnávací analýzou definované cíle mohou být, je-li třeba, vyčištěny a identifikovány prostřednictvím metod chemie peptidů odborníkovi známých. Získané sekvenční informace se pak mohou porovnat s databankou proteinů a nukleových kyselin, jakož i následně s literárními daty. Rele-3 CZ 294729 B6 vance těchto peptidů vzhledem k vyšetřovanému onemocnění je ověřena funkcionálními studiemi a porovnáváním na vhodných skupinách pacientů.
Příklady provedení
Příklad 1
Použití tělních tekutin, zde: krevní filtrát (hemofíltrát, HF)
1. Získávání HF
HF se získává při arterio-venózní nebo veno-venózní hemofíltraci technikami odborníkovi známými u vybraných pacientů nebo zkušebních objektů. Získávání HF se provádí způsobem, který se v zásadě provádí rutinně u pacientů s chronicky nemocnými ledvinami. Přes arteriální odvod a venózní přívod (arterio-venózní HF) nebo venózní odvod a venózní přívod (venovenózní HF) se krev pacientů vede s podporou hemofiltrátového přístroje (např. hemoprozessor, Sartorius, Gottingen; AK 10HFM, Gambro, Hechingen) před hemofiltr (např. Hemoflow F 60 nebo Hemoflow HF 80 S, Fresenius, Bad Homburg; Hemoflow FH 77 H a Hemoflow HF 88 H, Gambro), který má výstupní molekulární velikost než asi 30 kDa. Objem filtrátu odebraný pacientovi se substituuje roztokem elektrolytu (např. SH 01, SH 05, SH 22, SH 29, Schiwa, Glandorf).
V rámci předloženého vynálezu se provádí diagnostická hemofiltrace s cílem získat od pacienta v průběhu hemofiltrace 1 až 30 1 HF. Hemofíltrát se pro zamezení proteolýzy ihned upraví zředěnou kyselinou (např. 1M HCi) na hodnotu pH mezi 2 a 4 a ochladí se na 4 °C.
2. Získávání HF-peptidů a separace na frakce
2.1. Extrakce peptidů stupňovitou elucí
1 hemofíltrátu se zředí deionizovanou vodou na vodivost 6 mS/cm a pomocí kyseliny solné se nastaví pH na 2,7. Hemofíltrát se pak vede na chromatografíckou kolonu. Po navázání HF-peptidů se navázané peptidy eluují při odstupňovaném pH. Přitom se použije 7 pufrů s narůstajícím pH.
Chromatografické podmínky:
průtok při zachycování: lOOml/min průtok při eluování: 30 ml/min detekce: 214, 280 mm kolona: Vantage (Amicon, Witten) 6 cm průměr x 7 cm plnicí výška náplňový materiál. Fraktogel TSK SP 650 M (Měrek, Darmstadt) zařízení: BioCAD 250, Perspektivě Biosystems, Wiesbadan-Nordenstadt.
-4CZ 294729 B6
pufr pH tlumící látka molarita
eluční pufr 1 3,6 kyselina citrónová 0,1
eluční pufr 2 4,5 kyselina octová 0,1
eluční pufr 3 5,0 kyselina jablečná 0,1
eluční pufr 4 5,6 kyselina jantarová 0,1
eluční pufr 5 6,6 dihydrofosforečnan sodný 0,1
eluční pufr 6 7,4 fosforečnan sodný 0,1
eluční pufr 7 9,0 uhličitan amonný 0,1
Eluáty 1-7 se odděleně sbírají.
2.2 Druhá chromatografícká separace
Eluáty 1 áž 7 se podrobí chromatografíi na koloně s reverzní fází.
Chromatografícké podmínky:
průtok při zachycování: 10 ml/min průtok při eluování: 4 ml/min detekce: 214 nm kolona: ocelová kolona pro HPC1, 1 cm průměr x 12,5 cm plnící výška náplňový materiál: Source RPC 15 pm (Pharmacia, Freiburg) zařízení: BioCAD, Perspektivě Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt.
Eluát se sbírá ve 4ml frakcích.
3. Mapování peptidových frakcí
3.1 Alikvotní množství frakcí získaných v 2.2. se vnese do kapilární kolony pro reverzní fázi a gradientně se eluuje. Detekce se provádí pomocí UV-detektoru a on-line pomocí elektrosprayhmotového spektrometru.
Chromatografícké podmínky:
průtok při zachycování: 20 ml/min průtok při eluování: 20 ml/min detekce: 220 nm kolona: Cl8 AQS, 3 pm, 120 A, 1 mm průměr, 10 cm délka (YMC, Schermbec) zařízení: ABI 140 B Duál sorvent Delivery Systém pufr A: 0,06% kyselina trifluoroctová ve vodě pufr B: 80% acetonitril v A gradient: 0 % B až 100 % B během 90 min
On-line hmotová spektrometrie:
API III s elektrospray-interface (Perkin-Elmer, Weitrestadt)
-5CZ 294729 B6 pozitivní iontový mod měřicí rozsah: m/z 300 až 2390 skenovací doba: 7 s skenovací okno: 0,25 m/z
Zpracování dat se provádí pomocí softwaru McSpec nebo MultiView (Perkin Elmer).
3.2 MALDI-MS měření jednotlivých frakcí
Alikvotní množství frakcí získaných v 2.2. se měří s různými matricovými látkami např. s přídavkem L-(-)fukózy pomocí MALDI-MS.
Z primárních dat se sestaví vícedimenzionální tabulka zahrnující skenovací číslo, intenzitu signálu a po výpočtu hmoty násobně nabitých iontů skenu.
4. Srovnávací analýza
4.1. Identifikace nových peptidů, chybějících peptidů nebo peptidů se značně změněným množstvím
Prostřednictvím srovnání datových dat získaných v 3.3., které je možno nazývat peptidovými mapami, se stanoví kvalitativní rozdíly. Ve vztahu ke kontrolám a vzorkům se používají pro srovnání jednotlivé datové sady nebo také skupiny datových sad.
4.2. Peptidová chemická charakterizace identifikovaných cílů
Ze získaných výchozích materiálů (např. velkopreparace hemofiltrátu) se identifikované cíle vyčistí v množství, která dovolují identifikaci. K tomu se používá různých odborníkovi známých chromatografických separačních technik (reverzní fáze, výměna iontů, vylučování preparativní chromatografie, hydrofobní interakce atd.), které se obecně používají k separaci směsí peptidů. Po každé chromatografické separaci se ve frakcích pomocí ESI-MS, MALDI-MS nebo také LC-MS cíle znovu identifikují. Tyto postupy se při měnění chromatografických parametrů opakují tak často, že je k dispozici čistý produkt s požadovanou specifikací, tzn. retenčním časem a molekulovou hmotností. Potom následuje určení dílčí nebo úplné sekvence aminokyselin nebo vzoru fragmentu. Následně se provede porovnání se známými databankami (Swiss-Prot a EMBL-Peptid und Nucleinsaure-Databan) s cílem identifikace dílčí nebo úplné sekvence nebo vzoru fragmentu. Neexistuje-li záznam v databance, následuje zjištění primární struktury.
Příklad 2
Použití těchto tekutin, zde: ascitická tekutina
1. Získávání ascitické tekutiny
Ascitická tekutina se tvoří jako extravaskulámí exsudát při různých onemocněních (maligní tumor, poruchy jater atd.). V rámci předloženého způsobu se punkcí získá 10 ml až 10 1 ascitické tekutiny a poté se pro zamezení proteolýzy ihned pomocí zředěné kyseliny (např. 1M HC1) nastaví pH na 2,0 až 4,0 a ochladí se na 4 °C. Po ultrafiltraci přes membránu z triacetátu celulózy s výstupní molekulární velikostí 30 kDa (Sartocon-Mini-Apparatur, Sartorius) se filtrát dále použije jako zdroj peptidů.
-6CZ 294729 B6
2. Získávání peptidů z ascitické tekutiny a separace na frakce
2.1. Extrakce peptidů stupňovitou elucí
1 filtrátu ascitické tekutiny se nastaví n pH 2,0 a separuje se na preparativní koloně s reverzní fází.
Chromatografické podmínky:
průtok při zachycování: 40 ml/min průtok při eluování: 40 ml/min detekce: 214, 280 nm kolona: Waters Kartuschensystem, 4,7 cm průměr, 30 cm plnící výšky náplňový materiál: Vydac RP-C18, 15 až 18 gm zařízení: BioCAD, Perspektivě Biosystems, Weiesbaden-Nordenstadt.
pufr A: 0,1% kyselina trifluoroctová ve vodě pufr B: 80% acetonitril v A gradient: 0%Bažl00%Bv 3000 ml
Eluát se shromažďuje v 50ml frakcích.
Další průběh charakterizace odpovídá příkladu 1.
Příklad 3
Použití tělních tekutin, zde: moč
1. Získávání moči
Moč se získá přímo katétrem nebo jako spontánní moč pacienta v množství 0,5 až 10 1 tekutiny a poté se pro zamezení proteolýzy ihned pomocí zředěné kyseliny (např. 1M HC1) nastaví pH na 2,0 až 4,0 a ochladí se na 4 °C. Po ultrafiltraci přes membránu ztriacetátu celulózy s výstupní molekulární velikostí 30 kDa (Sartocon-Mini-Apparatur, Sartorius) se filtrát dále použije jako zdroj peptidů.
2. Získávání peptidů z moči a separace na frakce
2.1. Extrakce peptidů stupňovitou elucí
1 filtrátu moči se vodou zředí na vodivost 6 mS/cm nastaví se pH 2,7. Filtrát moči se poté uvede na chromatografickou kolonu. Po navázání peptidů se navázané peptidy eluují gradientem kuchyňské soli.
Chromatografické podmínky:
průtok při zachycování: 100 ml/min průtok při eluování: 30 ml/min detekce: 214 nm, kolona: Vantage (Amicon, Witten) 6 cm průměr x 7 cm plnící výšky náplňový materiál: Měrek Fraktogel TSK SP 650 M zařízení, BioCad 250, Perspektivě Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt.
-7 CZ 294729 B6 pufr A: 50 mM NaH2PO4 pH 3,0 pufr B: 1,5 M NaCl v A gradient: 0 % B až 100 % B v 2000 ml
Eluát se shromáždí v 10 nádobách po 200 ml.
2.2. Druhá chromatografícká separace
Frakce se podrobí chromatografíi na koloně s reverzní fází.
Chromatografícké podmínky:
průtok při zachycování: lOml/min průtok při eluování: 4 ml/min detekce: 214 nm kolona: ocelová kolona pro HPCL, 1 cm průměr x 12,5cm plnící výšky náplňový materiál: Source RPC 15 pm zařízení: BioCad, Perspektivě Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt.
pufr A: 0,1% kyselina trifluoroctová ve vodě pufr B: 80% acetonitril v A gradient: 0 % B až 100 % B ve 200 ml.
Eluát se sbírá ve 4 frakcích.
Další průběh charakterizace odpovídá příkladu 1.

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob in vitro zjišťování stavu organismu měřením peptidů ve vzorku získaného z organismu, přičemž vzorek obsahuje nízkomolekulární peptidy s molekulovou hmotností do 30 000 Da jako indikátor stavu organismu, vyznačující se tím, že se přímo detekují a charakterizují nízkomolekulární peptidy s molekulovou hmotností do 30 000 Da a porovnávají se s referenčním standardem.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vzorkem je tkáňový nebo tekutinový vzorek z organismu nebo v případě nižších organismů organismus sám, nebo jejich kombinace.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že nízkomolekulární peptidy použité pro měření mají molekulovou hmotnost alespoň takovou, která odpovídá dipeptidům.
  4. 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že nízkomolekulární peptidy použité pro měření mají molekulovou hmotnost lOODa až 10 000 Da.
  5. 5. Způsob podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že před měřením nízkomolekulárních peptidů se vysokomolekulární peptidy odseparují nebo se k jejich obsahu při vyhodnocování vzorku nepřihlíží.
  6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5,vyznačující se tím, že zjišťování nízkomolekulárních peptidů se provádí hmotovou spektrometrií.
    -8CZ 294729 B6
  7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že nízkomolekulámí peptidy se charakterizují na základě měření molekulové hmotnosti.
  8. 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že před měřením nízkomolekulárních peptidů se vzorek rozděluje na různé frakce a měření se provádí za různých podmínek.
  9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že organismem jsou prokaryonty, eukaryonty, mnohobuněčné organismy, buňky s tkáňových kultur, buňky ze zvířat a lidské buňky.
  10. 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že vzorek pochází z geneticky změněných nebo transformovaných a/nebo upravených organismů.
CZ1999491A 1996-08-13 1997-08-13 Způsob in vitro zjišťování stavu organismu stanovením peptidů CZ294729B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE1996132521 DE19632521A1 (de) 1996-08-13 1996-08-13 Verfahren zur Gewinnung von Peptiden aus Köperflüssigkeiten und Geweben sowie Zellüberständen und zur Identifikation von krankheitsrelevanten Peptidmarkern
DE19725362 1997-06-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ49199A3 CZ49199A3 (cs) 2000-04-12
CZ294729B6 true CZ294729B6 (cs) 2005-03-16

Family

ID=26028345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1999491A CZ294729B6 (cs) 1996-08-13 1997-08-13 Způsob in vitro zjišťování stavu organismu stanovením peptidů

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6875616B1 (cs)
EP (1) EP0922226B2 (cs)
JP (1) JP2001508864A (cs)
CN (1) CN1233326A (cs)
AT (1) ATE234469T1 (cs)
AU (1) AU720626B2 (cs)
CA (1) CA2263443C (cs)
CZ (1) CZ294729B6 (cs)
DE (1) DE59709517D1 (cs)
DK (1) DK0922226T3 (cs)
EA (1) EA001033B1 (cs)
ES (1) ES2191175T3 (cs)
IS (1) IS4971A (cs)
PL (1) PL186810B1 (cs)
PT (1) PT922226E (cs)
WO (1) WO1998007036A1 (cs)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936424B1 (en) 1999-11-16 2005-08-30 Matritech, Inc. Materials and methods for detection and treatment of breast cancer
DE10021737C2 (de) * 2000-05-04 2002-10-17 Hermann Haller Verfahren und Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines Protein- und/oder Peptidmusters einer Flüssigkeitsprobe, die dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wird
US6693080B2 (en) 2001-04-30 2004-02-17 Syn X Pharma Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1521 daltons
US7015004B2 (en) * 2001-11-23 2006-03-21 Syn X Pharma, Inc. Inter-alpha trypsin inhibitor biopolymer marker indicative of insulin resistance
US6627606B2 (en) 2001-04-30 2003-09-30 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1465 daltons
US6627607B2 (en) 2001-04-30 2003-09-30 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1845 daltons
US6756476B2 (en) 2001-04-30 2004-06-29 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2021 daltons
US6617308B2 (en) 2001-04-30 2003-09-09 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1865 daltons
US7087435B2 (en) 2001-04-30 2006-08-08 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2753 daltons
US20040198950A1 (en) 2001-04-30 2004-10-07 George Jackowski Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1518 daltons
US6620787B2 (en) 2001-04-30 2003-09-16 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2267 daltons
US20020160420A1 (en) * 2001-04-30 2002-10-31 George Jackowski Process for diagnosis of physiological conditions by characterization of proteomic materials
US6599877B2 (en) 2001-04-30 2003-07-29 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1020 daltons
US7294688B2 (en) 2001-04-30 2007-11-13 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1348 daltons
US6602855B2 (en) 2001-04-30 2003-08-05 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1449 daltons
US6677303B2 (en) 2001-04-30 2004-01-13 Syn X Pharma Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1097 daltons
US6890763B2 (en) 2001-04-30 2005-05-10 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1350 daltons
US7008800B2 (en) 2001-04-30 2006-03-07 Artemis Proteomics, Ltd. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1077 daltons
US7314717B2 (en) 2001-04-30 2008-01-01 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1562 daltons
US6703366B2 (en) 2001-04-30 2004-03-09 George Jackowski Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1,896 daltons
US6593298B2 (en) 2001-04-30 2003-07-15 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1690 daltons
US6620786B2 (en) 2001-04-30 2003-09-16 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having molecular weight of 2937 daltons
US20020160533A1 (en) 2001-04-30 2002-10-31 George Jackowski Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular of weight of 1525 daltons
US6627608B2 (en) 2001-04-30 2003-09-30 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1206 daltons
DE10123711A1 (de) * 2001-05-15 2003-02-27 Wolfgang Altmeyer Verfahren zur Bestimmung der Herkunft biologischer Materialien
US7132244B2 (en) * 2001-11-21 2006-11-07 Syn X Pharma, Inc. Betaine/GABA transport protein biopolymer marker indicative of insulin resistance
US7314762B2 (en) 2001-11-21 2008-01-01 Nanogen, Inc. Apolipoprotein biopolymer markers indicative of insulin resistance
US7179610B2 (en) 2001-11-23 2007-02-20 Nanogen Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers indicative of insulin resistance
US7074576B2 (en) 2001-11-23 2006-07-11 Syn X Pharma, Inc. Protein biopolymer markers indicative of alzheimer's disease
US7179606B2 (en) 2001-11-23 2007-02-20 Syn X Pharma, Inc. IG heavy chain, IG kappa, IG lambda biopolymer markers predictive of Alzheimer's disease
US7122327B2 (en) 2001-11-23 2006-10-17 Nanogen Inc. Biopolymer markers indicative of type II diabetes
US20030100014A1 (en) * 2001-11-23 2003-05-29 George Jackowski Apolipoprotein biopolymer markers predictive of type II diabetes
US7094549B2 (en) 2001-11-23 2006-08-22 Syn X Pharma, Inc. Fibronectin biopolymer marker indicative of insulin resistance
JP2005510716A (ja) * 2001-11-23 2005-04-21 シン．クス ファーマ、インコーポレイテッド インスリン耐性を示すグロビンバイオポリマーマーカー
US7097989B2 (en) 2001-11-23 2006-08-29 Syn X Pharma, Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers predictive of type II diabetes
US7026129B2 (en) * 2001-11-23 2006-04-11 Syn X Pharma, Inc. IG lambda biopolymer markers predictive of Alzheimers disease
US7135297B2 (en) 2001-11-23 2006-11-14 Nanogen Inc. Protein biopolymer markers indicative of insulin resistance
US6890722B2 (en) 2001-11-23 2005-05-10 Syn X Pharma, Inc. HP biopolymer markers predictive of insulin resistance
US7052849B2 (en) 2001-11-23 2006-05-30 Syn X Pharma, Inc. Protein biopolymer markers predictive of insulin resistance
US7179605B2 (en) 2001-11-23 2007-02-20 Nanogen Inc. Fibronectin precursor biopolymer markers indicative of alzheimer's disease
US7125678B2 (en) 2001-11-23 2006-10-24 Nanogen, Inc. Protein biopolymer markers predictive of type II diabetes
JP2006522340A (ja) 2003-04-02 2006-09-28 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 質量分析データの分析法
DE10341193A1 (de) * 2003-09-06 2005-03-31 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Vorrichtung und Verfahren zur quantitativen Auswertung der in einer Körperflüssigkeitsprobe enthaltenden Polypeptide sowie Marker zur Erkennung von pathologischen Zuständen
WO2006044666A2 (en) * 2004-10-15 2006-04-27 Northeastern University Detection of disease associated proteolysis by direct mass spectrometry analysis of low molecular weight peptides
WO2009016431A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Digilab, Inc. Sample preparation method and apparatus
EP2364447B1 (en) * 2008-10-31 2019-06-12 Biomerieux, Inc Method for the identification of microorganisms
MX2011004108A (es) * 2008-10-31 2011-08-15 Bio Merieux Inc Metodos para la separacion, caracterizacion y/o identificacion de microorganismos utilizando espectrometria de masas.
WO2010062349A1 (en) * 2008-10-31 2010-06-03 Biomerieux, Inc. Methods for separation and characterization of microorganisms using identifier agents
ES2821376T3 (es) 2012-03-30 2021-04-26 Bd Kiestra Bv Selección automática de microorganismos e identificación usando MALDI

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5537944A (en) * 1978-09-09 1980-03-17 Seiichi Shibata Diagnosis chemical and diagnosis method of kidney disease
EP0651816A4 (en) * 1992-07-15 1995-10-25 Univ South Florida LEVELS OF CCK PEPTIDES IN BLOOD IN RELATION TO THE TREATMENT OF PANIC EARTHS.
US5492834A (en) * 1993-07-09 1996-02-20 Beckman Instruments, Inc. Method of sample preparation for urine protein analysis with capillary electrophoresis
DE4427531A1 (de) * 1994-08-04 1996-02-08 Forssmann Wolf Georg Humanes zirkulierendes beta-Defensin hBD-1
JP3579549B2 (ja) * 1995-10-24 2004-10-20 株式会社トクヤマ 糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとしての使用

Also Published As

Publication number Publication date
CZ49199A3 (cs) 2000-04-12
IS4971A (is) 1999-02-10
US6875616B1 (en) 2005-04-05
CN1233326A (zh) 1999-10-27
EP0922226B2 (de) 2008-06-25
PT922226E (pt) 2003-07-31
ATE234469T1 (de) 2003-03-15
CA2263443C (en) 2004-03-30
DK0922226T3 (da) 2003-07-07
ES2191175T3 (es) 2003-09-01
WO1998007036A1 (de) 1998-02-19
CA2263443A1 (en) 1998-02-19
AU4298897A (en) 1998-03-06
PL186810B1 (pl) 2004-02-27
DE59709517D1 (de) 2003-04-17
EA199900196A1 (ru) 1999-06-24
PL331612A1 (en) 1999-08-02
EP0922226B1 (de) 2003-03-12
JP2001508864A (ja) 2001-07-03
EP0922226A1 (de) 1999-06-16
AU720626B2 (en) 2000-06-08
EA001033B1 (ru) 2000-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ294729B6 (cs) Způsob in vitro zjišťování stavu organismu stanovením peptidů
JP6596555B2 (ja) 癌療法を示すためのｓｒｍアッセイ
EP3260866B1 (en) Novel biomarkers for cognitive impairment and methods for detecting cognitive impairment using such biomarkers
JP6670288B2 (ja) 化学療法標的に対するｓｒｍアッセイ
EP2659267B1 (en) C-met protein srm/mrm assay
KR101645841B1 (ko) 인간 폐조직 병변의 지표가 되는 인간 혈청 내 단백질의 동정
EP3088899B1 (en) Biomarkers for psychiatric diseases including cognitive impairment and methods for detecting psychiatric diseases including cognitive impairment using the biomarkers
US20160313343A1 (en) SRM Assay for PD-L1
JP2013534315A (ja) ｃ−Ｓｒｃ選択反応モニタリングアッセイ
JPWO2010004962A1 (ja) 線維筋痛症の検査法
US10203336B2 (en) SRM/MRM assay for the tyrosine-protein kinase receptor UFO (AXL) protein
EP3819639B1 (en) Sugar chain specific to prostate cancer, and test method using same
KR20190080973A (ko) GTPase KRas 단백질(KRas)에 대한 SRM/MRM 검정
Stanley et al. Clinical proteomics and technologies to define and diagnose heart disease
KR20190100450A (ko) 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 8(cd30) 단백질에 대한 srm/mrm 검정

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20080813