MX2011004108A - Metodos para la separacion, caracterizacion y/o identificacion de microorganismos utilizando espectrometria de masas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para separar, caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra de prueba. El método de la invención comprende un paso opcional de lisis para lisar células no de microorganismos que pueden estar presentes en una muestra de prueba, seguido por un paso subsiguiente de separación. El método puede ser útil para la separación, caracterización y/o identificación de microorganismos de muestras complejas tal como medios de cultivo que contienen sangre. La invención proporciona además la interrogación de la muestra de microorganismos separados por espectrometría de masas para producir un espectro de masas del microorganismo y para caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra usando el espectro de masas, obtenido.

Description

MÉTODOS PARA. LA SEPARACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y/O IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO ESPECTROMETRÍA DE MASAS Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos y sistemas para detectar, aislar y/o identificar microorganismos en una muestra. En particular, la presente invención se refiere a un método para la caracterización y/o identificación rápida de un microorganismo usando espectrometría de masas.

Antecedentes de la Invención La detección de microorganismos patógenos en fluidos biológicos se debe realizar en el más corto tiempo posible, en particular en el caso de septicemia para la cual la mortalidad permanece alta a pesar de la amplia variedad de antibióticos que están disponibles a los doctores. La presencia de agentes biológicamente activos tal como un microorganismo en el fluido corporal de un paciente, especialmente sangre, se determina en general usando botellas de cultivo de sangre. Las infecciones de la corriente sanguínea se asocian con alta morbilidad y mortalidad, aún los actuales métodos de diagnóstico, de cultivo seguido por identificación bioquímica y prueba de susceptibilidad a antibióticos, pueden tomar varios días en realizarse. Típicamente, se inicia la terapia empírica en base a los síntomas clínicos, y los resultados de la prueba impactan sólo decisiones clínicas cuando falla la terapia inicial. La capacidad para caracterizar infecciones de la corriente sanguínea en el espacio de las primeras pocas horas, de manera preferente en el espacio de una hora después de un resultado positivo de cultivo sanguíneo reforzará significativamente la pertinencia clínica de la información diagnóstica proporcionada. Se han propuesto métodos de amplificación molecular para cumplir con esta necesidad, pero permanecen serios retos a este planteamiento. El caldo de cultivo sanguíneo positivo representa en sí mismo una población naturalmente amplificada de microorganismos con potencial de uso en una variedad de pruebas rápidas de identificación (ID) .

Las pruebas de ID, fenotípicas, automatizadas, tradicionales, tal como los sistemas VitekMR, Phoenix"11 y MicroscanMR, o pruebas fenotípicas manuales tal como API requieren que los microorganismos estén en una fase apropiada de crecimiento y libres de medios de interferencia y productos sanguíneos a fin de proporcionar resultados contundentes. Estos sistemas usan colonias cultivadas del caldo positivo durante 18-24 horas en medio colocado en placa. Sin embargo, en un esfuerzo para obtener resultados más rápidos, algunos laboratorios han reportado el uso de estos sistemas con microorganismos aislados de botellas de cultivo sanguíneo positivo. Estas pruebas directas de la botella no son apropiadas para todos los microorganismos (por ejemplo, cocos Gram-positivos) , no se validan por los productores de pruebas, y en general toman 3-8 horas en proporcionar resultados. Se necesitan urgentemente pruebas más rápidas y más ampliamente específicas a fin de proporcionar al facultativo con resultados clínicamente pertinentes en el espacio de las primeras pocas horas, de manera preferente en el espacio de una hora después de un resultado de cultivo, positivo.

Los métodos espectrométricos de masas tienen el potencial de permitir la identificación de microorganismos de forma muy rápida, pero pueden encontrar interferencia de muchos compuestos presentes en los medios líquidos de cultivo microbiológico y en muestras clínicas tal como sangre o combinaciones de los mismos. Los métodos más comúnmente empleados para recuperar microorganismos directamente del caldo de cultivo sanguíneo positivo son centrifugación diferencial de dos pasos y centrifugación en un tubo separador de suero.

Se han descrito otros métodos de separación, caracterización y/o identificación de microorganismos, que incluyen : La patente de los Estados Unidos No. 6,177,266 describe un método para la clasificación quimiotaxonomica de bacterias con géneros, especies y biomarcadores específicos de la cepa generados por análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización por desorpción láser asistida con matriz (MALDI -TOF-MS) de ya sea extractos de proteína celular o de células enteras.

En la patente de los Estados Unidos No. 7,070,739 se presenta un método para extraer, separar y purificar microbios incluyendo virus por ultracentrifugación bidimensional directamente de fluidos corporales o tejido homogeneizado . En un primer paso de centrifugación, se remueven todas las partículas que tienen una velocidad de sedimentación mayor que aquella de los microbios que se van a identificar. En el segundo paso de ultracentrifugación, se usa el bandeo isopícnico en líquidos rellenos para formar un gradiente de densidad de intervalo amplio, usando tubos de centrífuga, aserrados, especiales. De acuerdo a la patente, la técnica de separación se puede usar para detectar partículas bandeadas por dispersión de luz o fluorescencia usando tintes específicos de ácido nucleico, y para recuperar las partículas bandeadas en volúmenes muy pequeños para la caracterización por espectrometría de masas de subunidades de proteína viral y partículas virales intactas, y por determinación citométrica de flujo de fluorescencia tanto de la masa de ácido nucleico como de las masas de fragmentos producidos por enzimas de restricción.

La Publicación de Solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2007/0175278 describe el uso de un medio de cultivo líquido para cultivar una muestra de interés, que incluye por ejemplo sangre, orina, heces, catéteres intravenosos, etc., líneas de producción industrial, sistemas de agua, un producto alimenticio, un producto cosmético, un producto farmacéutico y una muestra forense. De manera subsiguiente, los microorganismos se pueden recolectar del medio líquido por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo por centrifugación. Los microorganismos concentrados entonces se pueden transferir al material portador, opcionalmente después del secado, para obtener un espectro vibracional . La solicitud de patente analiza varios métodos para identificar y clasificar microorganismos, incluyendo espectroscopia vibracional, tal como espectroscopia Raman.

Sin embargo, estos métodos tienen varias desventajas cuando se intenta separar y caracterizar microorganismos de muestras complejas tal como medios de cultivo que contienen sangre. Las preparaciones microbianas resultantes contienen frecuentemente células sanguíneas rojas contaminantes, plaquetas, partículas de lípidos, enzimas de plasma y desechos celulares, que pueden provocar resultados pobres. Estos métodos también son muy intensivos de labor e inseguros debido a los pasos que pueden dar por resultado exposición a aerosol de patógenos potencialmente peligrosos al usuario. Se necesitan métodos simples, seguros y confiables para aislar microorganismos de caldo de cultivo sanguíneo y otras muestras complejas que están libres de estos materiales de interferencia y son compatibles con tecnologías rápidas de identificación.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos para aislar, caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra. Los métodos permiten la caracterización y/o identificación de microorganismos más rápidamente que las técnicas anteriores, dando por resultado diagnósticos más rápidos (por ejemplo, en un sujeto que tiene o se sospeche que tiene septicemia) e identificación de materiales contaminados (por ejemplo, materias alimenticias y productos farmacéuticos) . Los pasos comprendidos en los métodos de la invención, de obtener una muestra a la caracterización y/o identificación de microorganismos, se pueden llevar a cabo en un cuadro de tiempo muy corto para producir información accionable clínicamente pertinente, por ejemplo, en menos de aproximadamente 120 minutos.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo de una muestra de prueba, que comprende: (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar de forma selectiva las células que no son de microorganismos en la muestra de prueba para producir una muestra lisada; (c) separar los microorganismos de los otros componentes de la muestra lisada para formar una muestra aislada de microorganismos; (d) interrogar la muestra aislada de los microorganismos por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación del espectro de masas medido con los espectros de masas de referencia y/o con masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o para identificar un microorganismo de un cultivo sanguíneo, que comprende: (a) obtener una muestra un cultivo sanguíneo que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar selectivamente las células no de microorganismo en la muestra para producir una muestra lisada; (c) estratificar la muestra lisada en un cojín de densidad en un recipiente sellado; (d) centrifugar el recipiente para separar los microorganismos de los otros componentes de la muestra y para formar un sedimento de microorganismo; (e) interrogar la muestra aislada de los microorganismos por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas del microorganismo; y (f) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación del espectro de masas medido con los espectros de masas de referencia y/o con masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo, que comprende: (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) estratificar la muestra de prueba sobre un cojín de densidad en un recipiente; (c) centrifugar el recipiente para separar los microorganismos de otros componentes de la muestra de prueba y formar un sedimento de microorganismos; (d) interrogar el sedimento por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación del espectro de masas medido con los espectros de masas de referencia y/o con masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos.

En una modalidad, la separación se lleva a cabo al estratificar la muestra de prueba sobre un cojín de densidad en un recipiente y al centrifugar el recipiente para sedimentar los microorganismos en tanto que el medio de muestra de prueba permanece en la parte superior del cojín de densidad.

En una modalidad, los métodos comprenden un paso de recuperar el sedimento de microorganismos, volver a suspender el microorganismo, remoción de una muestra de la suspensión para introducción en el espectrómetro de masas y realizar un análisis de masas en la muestra.

En otra modalidad, los métodos comprenden además un paso de recuperar el sedimento de. microorganismo, resuspender el microorganismo y realizar pruebas adicionales de identificación o caracterización (por ejemplo, resistencia a fármacos, factores de virulencia, antibiogramas) .

La presente invención se explica en mayor detalle en las figuras de la presente y la descripción expuesta más adelante .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra los espectros de masas de varios microorganismos procesados y recuperados de cultivo sanguíneo .

La Figura 2 muestra los espectros de masas de cinco aislados de S. aureus procesados y recuperados de caldo de cultivo sanguíneo.

La Figura 3 muestra una comparación de los espectros de masas de E. coli directamente de placas de agar y de E. coli procesado de caldo de cultivo sanguíneo, de acuerdo con la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se puede incorporar en diferentes formas y no se debe considerar como limitada a las modalidades expuestas en la presente. Más bien, estas modalidades se proporcionan de modo que esta descripción será cabal y completa, y dará a conocer completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica. Por ejemplo, las características ilustradas con respecto a una modalidad se pueden incorporar en otras modalidades, y las características ilustradas con respecto a una modalidad particular se pueden suprimir de esa modalidad. Además, serán evidentes para los expertos en la técnica numerosas variaciones y adiciones a las modalidades sugeridas en la presente en vista de la presente descripción, que no se aparten de la presente invención.

A menos que se definan de otro modo todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por el experto en la técnica a la cual corresponde esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención de la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no se propone que sea limitante de la invención.

Definiciones Como se usa en la presente, "un", "una", o "el", "la" puede significar uno o más de uno. Por ejemplo, "una" célula puede significar una célula individual o una multiplicidad de células.

También como se usa en la presente, "y/o" se refiere a, y abarca cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los puntos listados, asociados, así como la carencia de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o") .

Adicionalmente , el término "aproximadamente", como se usa en la presente cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad de un compuesto o agente de esta invención, dosis, tiempo, temperatura, y similares, se propone que abarque variaciones de 20 %, ± 10 %, + 5 %, ± 1 %, ± 0.5 %, o aún ± 0.1 % de la cantidad especificada.

Como se usa en la presente, el término "microorganismo" se propone que abarque organismos que en general son unicelulares, que se pueden multiplicar o manejar en el laboratorio, incluyendo pero no limitado a, bacterias Gram-positivas o Gram-negativas , levaduras, mohos, parásitos y mollicutes. Los ejemplos no limitantes de bacterias Gram-negativas de esta invención incluyen bacterias de los siguientes géneros: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia , Proteus, Campylobacter, Haemophilus , Morganella , Vibrio, Yersinia , Acinetobacter, Stenotrophomonas , Brevundimonas , Ralstonia , Achromobacter, Fusobacterium, Prevotella , Branhamella , Neisseria , Burkholderia , Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella , Aeromonas, Moraxella , Brucella, Pasteurella, Providencia, y Legionella. Los ejemplos no limitantes de bacterias Gram-positivas de esta invención incluyen bacterias de los siguientes géneros : Enterococcus, Streptococcus , Staphylococcus , Bacillus, Paenibacillus , Lactobacillus, histeria, Peptostreptococcus , Propionibacterium, Clostridium, Bacteroides , Gardnerella , Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus , Mycobacteria y Corynebacteria . Los ejemplos no limitantes de levaduras y mohos de esta invención incluyen aquellos de los siguientes géneros: Candida, Cryptococcus, Nocardia, Penicillium, Alternaría , Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium, Saccharomyces y Trichosporon . Los ejemplos no limitantes de parásitos de esta invención incluyen aquellos de los siguientes géneros: Trypanosoma , Babesia, Leishmania , Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca, y Naegleria . Los ejemplos no limitantes de mollicutes de esta invención incluyen aquellos de los siguientes géneros: Mycoplasma y Ureaplasma .

En una modalidad, como se describe adicionalmente en detalle en la presente, los microorganismos de una muestra o medio de crecimiento se pueden separar e interrogar para caracterizar y/o identificar el microorganismo presente en la muestra. Como se usa en la presente, el término "separar" se propone que abarque cualquier muestra de microorganismos que se haya recuperado, concentrado o de otro modo separado de su estado original o de un medio de cultivo o de crecimiento. Por ejemplo, de acuerdo con esta invención, se pueden separar microorganismos (por ejemplo, como una muestra separada) de un no microorganismo o componentes de no microorganismo que de otro modo pueden interferir con la caracterización y/o identificación. El término puede incluir una capa de microorganismos intercalados entre dos capas diferentes, por ejemplo, microorganismos recolectados en la parte superior de un cojín de alta densidad después de la centrifugación, o una capa de microorganismos recolectados en una superficie sólida (por ejemplo, una membrana de filtro) . El término también puede incluir una colección de microorganismos que han pasado parcialmente a través de una capa (por ejemplo, un cojín de densidad). Como tal, una muestra separada de microorganismos puede incluir cualquier colección o capa de microorganismos y/o componentes de los mismos que están más concentrados que, o de otro modo separado de, la muestra original , y puede variar desde una aglomeración densa cerradamente empacada de microorganismos a una capa difusa de microorganismos. Los componentes de microorganismos que pueden estar comprendidos en una forma o muestra separada incluyen, sin limitación, pilli, flagelos, fimbrias, y cápsulas en cualquier combinación. Los componentes no de microorganismo que se separan de los microorganismos pueden incluir células no de microorganismos (por ejemplo, células sanguíneas y/o otras células de tejido) y/o cualquier componente de los mismos .

En aún otra modalidad, como se describe en detalle adicional en la presente, los microorganismos de una muestra o medio de crecimiento se pueden aislar e interrogar para caracterizar y/o identificar el microorganismo presente en la muestra. Como se usa en la presente, el término "aislado" se propone que abarque cualquier muestra de microorganismos que se a purificado al menos parcialmente de su estado original, o de un medio de cultivo o crecimiento, y cualquier no microorganismo o componentes de no microorganismo contenidos en el mismo. Por ejemplo, de acuerdo con esta invención, los microorganismos se pueden aislar de (por ejemplo, como una muestra aislada) de no microorganismos o componentes de no microorganismos que de otro modo pueden interferir con la caracterización y/o identificación. Los componentes de no microorganismo que se separan de los microorganismos pueden incluir células no de microorganismos (por ejemplo, células sanguíneas y/o otras células de tejido) y/o cualquier otro componente de los mismos .

En aún otra modalidad, como se describe en detalle adicional en la presente, los microorganismos de una muestra o medio de crecimiento se pueden sedimentar e interrogar para caracterizar y/o identificar el microorganismo presente en la muestra. Como se usa en la presente, el término "sedimento" se propone que abarque cualquier muestra de microorganismos que se ha comprimido o depositado de una masa de microorganismos. Por ejemplo, los microorganismos de una muestra se pueden comprimir o depositar en una masa en el fondo de un tubo por centrifugación, u otros métodos conocidos en la técnica. El método incluye una colección de microorganismos (y/o componentes de los mismos) en el fondo y/o lados de un recipiente después de la centrifugación.

Los componentes de microorganismos que pueden ser comprendidos en un sedimento incluyen, sin limitación, pilli, flagelos, fimbrias, y capsulas en cualquier combinación. De acuerdo con esta invención, los microorganismos se pueden sedimentar (por ejemplo, como un sedimento de microorganismos, sustancialmente purificado) de no microorganismos o componentes de no microorganismo que de otro modo pueden interferir con la caracterización y/o identificación. Los componentes de no microorganismo que se separan de los microorganismos pueden incluir células de no microorganismos (por ejemplo, células sanguíneas y/o otras células de tejido) y/o cualquiera de los componentes de los mismos .

Como se usa en la presente, el término "cojín de densidad" se refiere a una solución que tiene una densidad completamente homogénea.

La presente invención proporciona métodos para aislar, caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra. Además, el método puede ser particularmente útil para la separación, caracterización y/o identificación de microorganismos de muestras complejas tal como medio de cultivo que contiene sangre. Los métodos rápidos también permiten la caracterización y/o identif cación de microorganismos más rápidamente que las técnicas anteriores, dando por resultado diagnósticos más rápidos (por ejemplo, en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene septicemia) y caracterización/identificación de materiales contaminados (por ejemplo, materias alimenticias y productos farmacéuticos) . Los pasos comprendidos en los métodos de la invención, desde obtener una muestra a la caracterización/identificación de microorganismos, se pueden llevar a cabo en un cuadro de tiempo muy corto para obtener información demandable clínicamente pertinente. En ciertas modalidades, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo en menos de aproximadamente 120 minutos, por ejemplo, en menos de aproximadamente 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ó 1 minuto. La rapidez tremenda del método de la invención representa una mejora con respecto a los métodos anteriores. Los métodos se pueden usar para caracterizar y/o identificar cualquier microorganismo como se describe en la presente . En una modalidad, el microorganismo es una bacteria. En otra modalidad, el microorganismo es una levadura, en otra modalidad, el microorganismo es un moho. En una modalidad adicional, el microorganismo es un parásito. En otra modalidad, el microorganismo es un mollicute. Adicionalmente, los métodos de la invención se pueden automatizar de forma completa, reduciendo de este modo el riesgo de manejar materiales infecciosos y/o de contaminar las muestras.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo de una muestra de prueba, que comprende: (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar selectivamente las células no de microorganismo en la muestra de prueba para producir una muestra lisada; (c) separar los microorganismos de otros componentes de la muestra lisada para formar una muestra aislada de microorganismos; (d) interrogar la muestra aislada de los microorganismos por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación del espectro de masas medido con los espectros de masas de referencia y/o con masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para caracterizar y/o para identificar un microorganismo de un cultivo sanguíneo, que comprende: (a) obtener una muestra un cultivo sanguíneo que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) estratificar la muestra lisada en un cojín de densidad en un recipiente sellado; (c) centrifugar el recipiente para separar los microorganismos de los otros componentes de la muestra y para formar un sedimento de microorganismo; (d) interrogar la muestra aislada de los microorganismos por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación del espectro de masas medido con los espectros de masas de referencia y/o con masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos.

En otra modalidad de la invención, los métodos comprenden recuperar el sedimento de microorganismos formados durante el paso de separación o una porción del mismo del recipiente de separación antes de la interrogación de los microorganismos. Por ejemplo, después de la formación del sedimento, los ruidos se pueden aspirar del sedimento y el sedimento se puede resuspender en un medio adecuado (por ejemplo, un medio en el cual sean viables los microorganismos) . Los microorganismos resuspendidos se pueden remover del recipiente de separación. Los microorganismos entonces se pueden interrogar para caracterización y/o identificación, por ejemplo, en la suspensión o después de que se han re-sedimentado . En otras modalidades, los microorganismos resuspendidos se pueden interrogar en el recipiente de separación, por ejemplo, en la suspensión o después de que se han re-sedimentado. En una modalidad adicional, los microorganismos recuperados del sedimento se pueden usar directamente para interrogación adicional (por ejemplo, espectrometría de masas) sin que se suspendan .

Muestras Las muestras que se pueden probar (es decir, una muestra de prueba) por los métodos de la invención incluyen muestras tanto clínicas como no clínicas en los cuales esté o se pueda sospechar la presencia y/o crecimiento de microorganismos, así como muestras de materiales que se prueban por rutina u ocasionalmente para la presencia de microorganismos. La cantidad de muestra utilizada puede variar grandemente debido a la versatilidad y/o sensibilidad del método. La preparación de la muestra se puede llevar a cabo por varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica aunque una de las ventajas de la presente invención es que se pueden probar tipos de muestras complejas, tal como por ejemplo, sangre, fluidos corporales y/o otras sustancias opacas, utilizando directamente el sistema con poco o ningún pre-tratamiento extensivo. En una modalidad, la muestra se toma de un cultivo. En otra modalidad, la muestra se toma de un cultivo microbiológico (por ejemplo, un cultivo sanguíneo) . En otra modalidad, la muestra se sospecha de, o se conoce que, contiene microorganismos en la misma .

Las muestras clínicas que se pueden probar incluyen cualquier tipo de muestra típicamente probada en laboratorios clínicos o de investigación, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, plasma, fracciones sanguíneas, ruido de articulaciones, orina, semen, saliva, heces, fluido cerebroespinal, contenidos gástricos, secreciones vaginales, homogenados de tejido, aspirados de médula ósea, homogenados óseos, esputo, aspirados, algodones frotados y enjuagues en algodón frotado, otros ruidos corporales, y similares. En otra modalidad, la muestra clínica se puede cultivar, y se usa una muestra de cultivo.

La presente invención encuentra uso en la investigación así como en aplicaciones veterinarias y clínicas. Los sujetos adecuados de los cuales se pueden obtener muestras clínicas en general son sujetos mamíferos, pero puede ser cualquier animal . El término "mamífero" como se usa en la presente incluye, pero no se limita a, humanos, primates no humanos, ganado, ovejas, cabras, cerdos, caballos, gatos, perros, conejos, roedores (por ejemplo, ratas o ratones), etc. Los sujetos humanos incluyen sujetos neonatos, infantes, juveniles, adultos y geriátricos. Los sujetos de los cuales se pueden obtener muestras incluyen, sin limitación, mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces.

Las muestras no clínicas que se pueden probar también incluyen sustancias, que abarcan, pero no se limitan a, materias alimenticias, bebidas, productos farmacéuticos, cosméticos, agua (por ejemplo, agua para beber, agua no potable y agua residual) , lastres de agua salada, aire, suelo, aguas residuales, material vegetal (por ejemplo, semillas, hojas, tallos, raíces, flores, frutas), productos sanguíneos (por ejemplo, plaquetas, suero, plasma, reacciones de células sanguíneas blancas, etc.), muestras de tejido u órganos donadores, muestras de guerra biológica, y similares. El método también es particularmente bien adecuado para la prueba en tiempo real para monitorizar niveles de contaminación, control de proceso, control de calidad y similares en escenarios industriales. En otra modalidad, la muestra clínica se puede cultivar, y se usa una muestra de cultivo.

En una modalidad de la invención, se obtienen muestras de un sujeto (por ejemplo, un paciente) que tiene o se sospecha que tiene una infección microbiana. En una modalidad, el sujeto tiene o se sospecha que tiene septicemia, por ejemplo, bacteremia o fungemia. La muestra puede ser una muestra sanguínea directamente del sujeto. La muestra puede ser de un cultivo sanguíneo cultivado de una muestra de la sangre del paciente, por ejemplo, un cultivo sanguíneo BacT/ALERTMR . La muestra de cultivo sanguíneo puede ser de un cultivo sanguíneo positivo, por ejemplo, un cultivo sanguíneo que indica la presencia de un microorganismo. En ciertas modalidades, la muestra se toma de un cultivo sanguíneo positivo dentro de un tiempo corto después de que se vuelve positiva, por ejemplo, en el espacio de aproximadamente 6 horas, por ejemplo, en el espacio de aproximadamente 5, 4, 3, ó 2 horas, o en el espacio de aproximadamente 60 minutos, por ejemplo, aproximadamente 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ó 1 minuto. En una modalidad, la muestra se toma de un cultivo en el cual los microorganismos están en fase logarítmica de crecimiento. En otra modalidad, la muestra se toma de un cultivo en el cual los microorganismos están en una fase estacionaria.

La presente invención proporciona alta sensibilidad para la detección, caracterización y/o identificación de microorganismos. Esto permite la detección, caracterización y/o identificación sin tener primero que ir a través de los pasos de aislar los microorganismos al cultivarlos en un medio sólido o semisólido, y muestrear las colonias que crecen. De esta manera, en una modalidad de la invención, la muestra no es de una colonia microbiana (por ejemplo, bacterias, levadura o moho) cultivada en una superficie sólida o semisólida. De esta manera, en una modalidad de la invención, la muestra no es de una colonia microbiana (por ejemplo, bacterias, levadura o moho) en una superficie sólida o semisólida.

El volumen de la muestra debe ser suficientemente grande para producir una muestra aislada de microorganismos 0 un sedimento de microorganismos que se pueden interrogar después de que se lleve a cabo el paso de separación/aislamiento de los métodos de la invención. Los volúmenes apropiados dependerán de la fuente de la muestra y del nivel anticipado de microorganismos en la muestra. Por ejemplo, un cultivo sanguíneo positivo contendrá un mayor nivel de microorganismos por volumen que una muestra de agua para beber que se va a probar para contaminación, de modo que se puede necesitar un volumen más pequeño del medio de cultivo sanguíneo en comparación a la muestra de agua para beber. En general, el tamaño de muestra puede ser menos de aproximadamente 50 mi, por ejemplo, menos de aproximadamente 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ó 1 mi. En ciertas modalidades, el tamaño de muestra puede ser aproximadamente 1 mi, por ejemplo, aproximadamente 0.75, 0:.5 ó 0.25 mi. En ciertas modalidades, en las cuales se lleva a cabo la separación a una microescala, el tamaño de muestra puede ser menos de aproximadamente 200 µ? , por ejemplo, menos de aproximadamente 150, 100, 50, 25, 20, 15, 10 ó 5 µ? . En algunas modalidades (por ejemplo, cuando se espera que la muestra comprenda un pequeño número de microorganismos) , el tamaño de muestra puede ser de aproximadamente 100 mi o más, por ejemplo, aproximadamente 250, 500, 750 ó 1000 mi o más .

Paso Opcional de Lisis En algunas modalidades, después de obtener una muestra, el siguiente paso del método de la presente invención es lisar selectivamente células indeseadas que pueden estar presentes en la muestra, por ejemplo, células sanguíneas y/o células de tejido. Las células se pueden lisar para permitir la separación de microorganismos de otros componentes de la muestra. La separación de microorganismos de otros componentes impide la interferencia durante el paso de interrogación. Si las células no de microorganismo no se espera que estén presentes en la muestra o no se espera que interfieran con el paso de interrogación, pueden no necesitarse llevar a cabo el paso de lisis. En una modalidad, las células que se van a lisar son células no de microorganismo que están presentes en la muestra y las células de no microorganismo que pueden estar presentes en la muestra se lisan. Sin embargo, en algunas modalidades, la lisis selectiva de las clases específica de microorganismos puede ser deseable y de esta manera se lleva a cabo de acuerdo a los métodos descritos en la presente y como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede lisar selectivamente una clase de microorganismos indeseados, por ejemplo, se lisa levadura en tanto que no se lisa bacterias o viceversa. En otra modalidad, los microorganismos deseados se lisan a fin de separar un componente subcelular particular de los microorganismos, por ejemplo, membranas u organelos celulares. En una modalidad, se lisan todas las células no microbianas. En otras modalidades, una porción de las células no microbianas se lisan, por ejemplo, suficientes células para impedir la interferencia con el paso de interrogación. La lisis de las células se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica que es efectivo para lisar de manera selectiva células con o sin microorganismos de lisis, incluyendo, sin limitación, además de una solución de lisis, tratamiento con ultrasonido, choque osmótico, tratamiento químico y/o una combinación de estos.

Una solución de lisis es una que es capaz de lisar células, por ejemplo, células no de microorganismo (por ejemplo, al solubilizar membranas de células eucarióticas) y/o células de microorganismo. En una modalidad, la solución de lisis puede comprender uno o más detergentes, una o más enzimas, o una combinación de uno o más detergentes y una o más enzimas, y puede incluir además agentes adicionales. En una modalidad, el detergente puede ser un detergente lítico no desnaturalizante tal como TritonMR, X-100 TitonMR X-100-R, TritonMR X-114, NP-40, Genapol1 C-100, GenapolMR X-100, IgepalMR CA 630, ArlasolveMR200, BrijMR 96/97, CHAPS, octal-ß-?-glucopiranosido, saponina, y éter monododecílico de nonaetilenglicol (C12E9, polidocenol) . Opcionalmente , los agentes líticos desnaturalizantes se pueden incluir, tal como dodecil sulfato de sodio, N-laurilsarcosina, desoxicolato de sodio, sales biliares, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, SB3-10, SB3-12, amidosulfobetaina-14, y C7BzO. Opcionalmente, también se pueden incluir solubilizadores, tal como BrijMR 98, BrijMR 58 Brij 35, TweenMR 80, Tween^O, PluronicMR L64 , PluronicMR P84, sulfobetaínas no detergentes (NDSB 201) , anfipoles (PMAL-C8) , y metil- -ciclodextrina. Típicamente, los detergentes y solubilizadores no desnaturalizantes se usan a concentraciones por arriba de su concentración micelar crítica (CMC) , en tanto que se pueden adicionar detergentes desnaturalizantes a concentraciones por abajo de su CMC. Por ejemplo, los detergentes líticos no desnaturalizantes se pueden usar a una concentración de aproximadamente 0.010 % a aproximadamente 10 %, por ejemplo, de aproximadamente 0.015 % a aproximadamente 1.0 %, por ejemplo, de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 0.5 %, por ejemplo, de aproximadamente 0.10 % a aproximadamente 0.30 % (concentración final después de dilución con la muestra) En otra modalidad, se pueden preferir detergentes de polioxietileno. El detergente de polioxietileno puede comprenderle la estructura Ci2-i8/E9-io, en donde C12-18 denota una longitud de cadena de carbonos de 12 a 18 átomos de carbono y E9-10 denota de 9 a 10 grupos guía hidrófilos de oxietileno. Por ejemplo, el detergente de polioxietileno se puede seleccionar del grupo que consiste de BrijMR97, BrijMR 96V, GenapolMR C-100, GenapolMR X-100, éter monododecílico de nonaetilenglicol (polidocanol) , o una combinación de éstos.

Las enzimas que se pueden usar en las soluciones de lisis incluyen, sin limitación, enzimas que digieren ácidos nucleicos y otros materiales que contaminan la membrana (por ejemplo, proteinasa XXIII, Dasa, neuraminidasa, polisacaridasa, GlucanexMR, y PectinexMR) . Otros aditivos que se pueden usar incluyen, sin limitación, agentes reductores tal como 2 -mercaptoetanol (2 -Me) o ditiotreitol (DTT) y agentes estabilizadores tal como magnesio, pirubato y humectantes. La solución de lisis se puede amortiguar a cualquier pH que es adecuado para lisar las células deseadas, y dependerá de múltiples factores, incluyendo sin limitación, el tipo de muestra, las células que se van a lisar, y el detergente usado. En algunas modalidades, el pH puede estar en un intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 13, por ejemplo, de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 13, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 13. Los amortiguadores adecuados de pH incluyen cualquier amortiguador capaz de mantener un pH en el intervalo deseado, por ejemplo, aproximadamente CAMPS 0.05 M a aproximadamente 1.0 M.

En una modalidad, la muestra y la solución de lisis se muestran y luego se incuban durante un tiempo suficiente para que se presente la lisis y solubilización de las membranas celulares, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 segundos, o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ó 20 minutos o más tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 5 minutos, o aproximadamente de 1 segundo a aproximadamente 2 minutos. El tiempo de incubación dependerá de la concentración de la solución de lisis, por ejemplo, la concentración de detergente y/o enzimas. En general, los amortiguadores de lisis, más suaves, requerirán más tiempo y una dilución mayor de la muestra para solubilizar completa células no microbianas. La concentración de la solución de lisis se puede seleccionar en base a los microorganismos que se conoce o que se sospecha que están en la muestra. Para microorganismos que son más susceptibles a lisis, se puede usar una solución suave de lisis. La lisis puede tomar lugar a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45°C, por ejemplo, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 40°C, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C. En una modalidad, la solución de lisis se puede cargar en una jeringa y la muestra entonces se puede aspirar en la jeringa tal que se presente el mezclado de incubación dentro de la jeringa. En una modalidad, la solución de lisis se puede cargar en una jeringa y la muestra entonces se puede aspirar en la jeringa tal que se presente el mezclado de incubación dentro de la jeringa.

En algunas modalidades, las condiciones de lisis (por ejemplo, la solución o el tiempo de incubación) , así como los pasos de separación y/o interrogación, pueden ser suficientes para aniquilar algunos o todos los microorganismos en la muestra. Los métodos de la presente invención son altamente versátiles y no requieren que todos los microorganismos estén vivos para qué se presente el aislamiento e identificación. En ciertas modalidades, algunos o todos los microorganismos pueden estar muertos, con la muerte que se presenta antes, durante y/o después de que se lleven a cabo los pasos de los métodos.

Los detalles y descripción adicionales de los amortiguadores de lisis contemplados en la práctica de esta invención se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos, pendiente, número de serie , presentada el 30 de octubre de 2009, titulada "Methods for Isolation and Identification of Microorganisms" , los contenidos de la cual se incorporan en la presente como referencia.

Paso de Separación El siguiente paso del método de la presente invención (por ejemplo, el paso después de que se ha lisado la muestra, si se realiza un paso de lisis) es un paso de separación. El paso de separación se puede llevar a cabo para separar los microorganismos de otros componentes de la muestra (por ejemplo, no microorganismos o componentes de los mismos) y para concentrar los microorganismos en un sedimento que se puede interrogar para propósitos de identificación y caracterización. La separación no tiene que ser completa, es decir, no requiere que se presente 100 % de separación. Todo lo que se requiere es que la separación de los microorganismos de los otros componentes de la muestra sea suficiente para permitir la interrogación de los microorganismos sin interferencia sustancial de los otros componentes. Por ejemplo, la separación puede dar por resultado un sedimento de microorganismos que es al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % puro o mayor.

En una modalidad, la separación se lleva a cabo por un paso de centrifugación en el cüal se coloca la muestra (por ejemplo, una muestra lisada) en la parte superior de un cojín de densidad en un recipiente de separación y el recipiente se centrifuga bajo condiciones que permitan que se aislen los microorganismos (por ejemplo, los microorganismos pueden formar un sedimento en el fondo y/o lados del recipiente) . De acuerdo a esta modalidad, otros componentes de la muestra (por ejemplo, no microorganismos o componentes de los mismos que pueden estar presentes en el medio de muestra) están en la parte superior del cojín de densidad o dentro de la porción superior del cojín de densidad. En general, se puede usar cualquier recipiente conocido para el paso de separación. En una modalidad, el recipiente de separación en el dispositivo de separación descrito en la solicitud de Patente de los Estados Unidos, relacionada, no. de serie , titulada "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms" , presentada el 30 de octubre del 2009. Este paso de separación aisla los microorganismos de los materiales en la muestra, tal como el medio, desechos celulares y/o otros componentes que pueden interferir con la interrogación de los microorganismos (por ejemplo, por fluorescencia intrínseca) . En una modalidad, el cojín de densidad también sirve para separar microorganismos vivos de microorganismos muertos (que no pasa a través del cojín de densidad) . En otra modalidad, el co ín de densidad. No comprende un gradiente de densidad, ya sea antes o después de la centrifugación. En otras palabras, el recipiente de separación no se centrifuga durante una cantidad suficiente de tiempo y/o aceleración para que el material que constituye el cojín de densidad forme un gradiente de densidad .

La densidad del cojín se selecciona tal que los microorganismos en la muestra pasen a través del cojín en tanto que los otros componentes de la muestra (por ejemplo, caldo de cultivo sanguíneo, desechos celulares) permanezcan en la parte superior del cojín o no pasen por completo a través del cojín de densidad. El cojín de densidad también se puede seleccionar para separar microorganismos vivos (que pasan a través del cojín) de microorganismos muertos (que no pasan a través del cojín). Las densidades adecuadas dependerán del material usado en el cojín de densidad y de la muestra que se va a separar. En una modalidad, la densidad del cojín está en el intervalo de aproximadamente 1.025 a aproximadamente 1.120 g/ml, por ejemplo, aproximadamente 1.030 a aproximadamente' 1.070 g/ml, de aproximadamente 1.040 a aproximadamente 1.060 g/ml o cualquier intervalo entre aproximadamente 1.025, a aproximadamente 1.120 g/ml. En otra modalidad, la densidad del cojín es de aproximadamente 1.025, 1.030, 1.035, 1.040, 1.045, 1.050, 1.055, 1.060, 1.065, 1.070, 1.075, 1.080, 1.085, 1.090, 1.095, 1.100, 1.105, 1.110, 1.115 ó 1.120 g/ml .

El material para el cojín de densidad puede ser cualquier material que tenga el intervalo apropiado de densidad para los métodos de esta invención. En una modalidad, el material es sílice coloidal. La sílice coloidal puede estar no revestida (por ejemplo, LudoxMR (W.R. Grace, CT) ) o está revestida, por ejemplo, con silano (por ejemplo, PureSpermMR (Nidacon Int'l, Suecia) o IsolateMR (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) ) o polivinilpirrolidona (por ejemplo, PercollR, PercollMR Plus (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) ) . En una modalidad, se selecciona la sílice coloidal que exhibe la menor interferencia con la interrogación espectroscópica, por ejemplo, el material con la fluorescencia intrínseca más baja. La sílice coloidal se puede diluir en cualquier medio adecuado para formar la densidad apropiada, por ejemplo, soluciones salinas balanceadas, solución salina fisiológica, y/o sacarosa 0.25 . Las densidades adecuadas se pueden obtener con sílice coloidal a una concentración de aproximadamente 15 % a aproximadamente 80 % v/v, por ejemplo, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 65 % v/v. Otro material adecuado para cojines de densidad es un agente de contraste, yodado, por ejemplo, iohexol (OmnipaqueMR NycoPrepMR, o NycodenzMR) e iodixanol (VisipaqueMR o OptiPrepMR) . Se pueden obtener densidades adecuadas con iohexol o iodixanol a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 % p/v, por ejemplo, de aproximadamente 14 % a aproximadamente 18 % p/v, para muestras de cultivo sanguíneo. Se puede usar sacarosa como un cojín de densidad a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 % p/v, por ejemplo, de aproximadamente 15 % a aproximadamente 20 % p/v, para muestras de cultivo sanguíneo. Otros materiales adecuados que se pueden usar para preparar el cojín de densidad incluyen aceites de baja viscosidad y alta densidad, tal como aceite de inmersión de microscopio (por ejemplo, Type DF; Cargille Labs, New Cork) , aceite mineral (por ejemplo, DrakeolMR 5, Draketex 50, PeneteckMR; Penreco Co., Pennsylvania) , aceite de silicón (polidimetilsiloxano) , aceite de fluorosilicón, gel de silicón, metrizoato-FicollMR (LymphoPrepR) , por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 75 % a aproximadamente 100 % para muestras de cultivo sanguíneo, diatrizoato-dextrano (PolymorphoPrep"1*) , por ejemplo, a una concertación de aproximadamente 25 % a aproximadamente 50 % para muestras de cultivo sanguíneo, carboximetil-celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, óxido de polietileno (alto peso molecular), PluronicMR F127, PluronicMR F68, mezclas de compuestos Pluronicm, ácido poliacrílico, alcohol polivinílico reticulado, polivinil-pirrolidina reticulada, metacrilato de éter metílico de PEG, pectina, agarosa, xantano, gelan, PhytagelMR, sorbitol, FicollMR (por ejemplo, FicollMR 400 a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 15 % para muestras de cultivo sanguíneo) , glicerol, dextrano (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 15 % para muestras de cultivo sanguíneo) , glicógeno, cloruro de cesio (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 15 % a aproximadamente 25 % para muestras de cultivo sanguíneo) , fluidos de perfluorocarburo (por ejemplo, perfluoro-n-octano) , fluidos de hidrofluorocarbono (por ejemplo, Vertrel XF) , y similares, así como los bien conocidos en la técnica. En una modalidad, el cojín de densidad se selecciona de uno o más de sílice coloidal, iodixanol, iohexol , cloruro de cesio, metrizoato-FicolMR, diatrizoato-dextrano, sacarosa, FicolMR 400 y/o dextrano en cualquier combinación. El cojín de densidad también se puede constituir en una combinación de materiales, por ejemplo, una combinación de sílice coloidal y aceite. Ciertas combinaciones de los compuestos anteriores pueden ser benéficas para los pasos de separación y lectura de la presente invención.

El volumen/peso del cojín de densidad debe ser suficiente para lograr la separación de los microorganismos de otros componentes de muestra. El volumen dependerá del tamaño y forma del recipiente de separación. En general, se puede usar un volumen de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 mi, por ejemplo, de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 1 mi, por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mi a 0.5 mi . Si la separación se realiza a microescala, el volumen del cojín de densidad puede ser de aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, por ejemplo, de aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 µ? . El volumen de la muestra colocada o estratificada en la parte superior del cojín de densidad debe ser suficiente para proporcionar suficientes microorganismos para producir un sedimento adecuado para interrogación. En general, cualquier volumen que se ajuste en el recipiente se puede usar. Por ejemplo, se puede usar un volumen de aproximadamente 0.1 mi a aproximadamente 5 mi , por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mi a aproximadamente 1 mi, por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mi a aproximadamente 0.5 mi . Si la separación se realiza a una microescala, el volumen de la muestra puede ser aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, por ejemplo, aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 µ? . El espacio disponible del recipiente para la muestra dependerá de la muestra dependerá del tamaño y de la forma del recipiente. En algunas modalidades, se puede colocar una capa intermedia (líquida o sólida) en la parte superior del cojín de densidad antes de que la muestra se coloque o estratifique en la parte superior a fin de impedir cualquier mezclado del cojín de densidad y de la muestra. En una modalidad, la capa intermedia pueden ser cuentas, de polietileno. En otra modalidad, se puede colocar una pequeña burbuja de aire entre el cojín de densidad y la muestra para impedir el mezclado. En una modalidad adicional, el cojín de densidad se puede estratificar en la parte superior de un material de alta densidad (por ejemplo, un fluido de perfluorocarburo) tal que los microorganismos pasen a través del cojín de densidad durante la separación y se recolecten en la entrecara entre el cojín de densidad y el material de alta densidad.

En una modalidad de la invención, el recipiente de separación se centrifuga en un rotor giratorio de modo que los microorganismos formen un sedimento directamente en el fondo del recipiente. El recipiente se centrifuga a una aceleración suficiente durante un tiempo suficiente para que los microorganismos se separen (por ejemplo, un sedimento formado) de los otros componentes de la muestra. La aceleración de centrifugación puede aproximadamente 1,000 x g a aproximadamente 20,000 x g, por ejemplo, aproximadamente 2,500 x g a aproximadamente 15,000 x g, por ejemplo, de aproximadamente 7,500 x g a aproximadamente 12,500 x g, etc. El tiempo de centrifugación puede ser de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 30 minutos, por ejemplo, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 15 minutos, por ejemplo, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos. La centrifugación se puede llevar a cabo a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45°C, por ejemplo, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 40°C, por ejemplo, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C. En una modalidad, el recipiente de separación comprende un cierre, y el cierre se aplica al siguiente para formar un sello hermético antes de la centrifugación. La presencia de un cierre disminuye los riesgos de manejar microorganismos que son o pueden ser infecciosos y/o peligrosos, así como el riesgo de contaminar la muestra. Una de las ventajas de los métodos de la invención es la capacidad de llevar a cabo cualquiera o más de los pasos de los métodos (por ejemplo, lisis, separación, interrogación, y/o identificación) con los microorganismos en un recipiente sellado (por ejemplo, un recipiente herméticamente sellado) . Los presentes métodos, que comprenden el uso de sistemas automatizados, evitan riesgos a la salud y de seguridad asociados con el manejo de microorganismos altamente virulentos, tal como se presenta con la recuperación de microorganismos de muestras de la prueba directa. En una modalidad, el recipiente no se centrifuga durante un tiempo suficiente y/o con una fuerza suficiente para que se forme un gradiente de densidad dentro del cojín de densidad. La presente invención no comprende la ultracentrifugación de muestras, ¡ por ejemplo, centrifugación a fuerzas mayores de aproximadamente 100,000 x g. Adicionalmente , la presente invención no comprende sedimentación isopícnica (equilibrio) o bandeo.

El recipiente de separación puede ser cualquier recipiente con volumen suficiente para retener un cojín de densidad en una muestra. Como se señala en la presente, el dispositivo de separación descrito en la solicitud de Patente de los Estados Unidos relacionada, No. de serie , titulada "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Miicroorganisms" , presentada el 30 de octubre del 2009, que se puede usar en la práctica de esta invención. En una modalidad, el recipiente se ajusta o se puede ajustar en un rotor de centrifuga. El volumen del recipiente puede ser de aproximadamente 0.1 mi a aproximadamente 25 mi, por ejemplo, de aproximadamente 1 mi a aproximadamente 10 mi, por ejemplo, de aproximadamente 2 mi a aproximadamente 8 mi . Si la separación se hace a una microescala, el volumen del recipiente puede ser aproximadamente 2 µ? a aproximadamente 100 µ?, por ejemplo, de aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 µ?. En una modalidad, el recipiente tiene un diámetro interno amplio en una porción superior para mantener la muestra y la mayoría del cojín de densidad, y un diámetro interno más estrecho en una porción inferior donde se recolecta el sedimento de los microorganismos. La porción estrecha puede tener un diámetro interno de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.12 pulgadas (0.1016 a 0.3048 cm) , por ejemplo, de aproximadamente 0.06 a aproximadamente 0.10 pulgadas (0.1524 a 0.254 cm) , por ejemplo aproximadamente 0.08 pulgadas (0.2032 cm) . La porción amplia puede tener un diámetro interno de aproximadamente 0.32 a aproximadamente 0.40 pulgadas (0.8128 a 1.016 cm) , por ejemplo de aproximadamente 0.34 a aproximadamente 0.38 pulgadas (0.8636 a 0.9652 cm) , por ejemplo de aproximadamente 0.36 pulgadas (0.9144 cm) . Para separaciones a microescala, los diámetros internos pueden ser aún más pequeños. Por ejemplo, el diámetro interno de la porción estrecha puede ser aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.04 pulgadas (0.00254 a 0.1016 cm) , por ejemplo, de aproximadamente 0.002 a aproximadamente 0.01 pulgadas (0.00508-0.0254 cm) una porción de diámetro interno ahusado puede conectar las porciones superior e inferior. La porción ahusada puede tener un ángulo de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 grados, por ejemplo, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 grados. En una modalidad, la porción estrecha inferior es menor que la mitad de la altura total del recipiente, por ejemplo, menor de aproximadamente 40 %, 30 %, 20 % ó 10 % de la altura total del recipiente. El recipiente puede tener un dispositivo de cierre unido o se puede roscar para aceptar un dispositivo de cierre (por ejemplo, una tapa) tal que el recipiente se pueda sellar herméticamente durante la centrifugación. En ciertas modalidades, el recipiente se diseña tal que la muestra o sedimentos de microorganismos se pueda recuperar fácilmente, u obtener o remover de otro modo el recipiente después de la separación, ya sea manualmente o de una manera automatizada (de modo que los técnicos no se expongan a los contenidos del recipiente) . Por ejemplo, el recipiente puede comprender una porción removible o una porción separable que contiene el sedimento y que se puede separar del resto del recipiente. En otra modalidad, el recipiente puede comprender medios para el acceso al sedimento después de la separación, tal como uno o más orificios o superficies permeables para la inserción de una jeringa u otro dispositivo de muestreo o para extraer el sedimento. En una modalidad, el recipiente puede ser un tubo, por ejemplo, un tubo de centrífuga. En otra modalidad, el recipiente puede ser un chip o una tarjeta. En una modalidad, el recipiente es un recipiente independiente, es decir, un dispositivo para separar una muestra individual. En otras modalidades, el recipiente es parte de un dispositivo que comprende dos o más recipientes de separación tal que se pueden separar múltiples muestras al mismo tiempo. En una modalidad, el dispositivo comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84, 96 ó más recipientes de separación.

En otra modalidad, la separación se lleva a cabo por un paso de filtración en el cual se coloca la muestra (por ejemplo, una muestra lisada) en un dispositivo adaptado con un filtro selectivo o filtro ajustado con tamaños de poro que retienen los microorganismos. Los microorganismos retenidos se pueden lavar al pasar suavemente un amortiguador adecuado a través del filtro. Los microorganismos lavados entonces se pueden interrogar directamente en el filtro y/o recuperar para interrogación al muestrear directamente la superficie del filtro o al volver a enjuagar el filtro con amortiguador acuoso adecuado .

Paso de Interrogación En una modalidad, la muestra o sedimento se recupera y/o resuspende y opcionalmente se remueve del recipiente de separación antes de la interrogación. En otra modalidad, la muestra o sedimento se recupera y/o re-suspende después de la interrogación in si tu y entonces se lleva a cabo la interrogación adicional. Por ejemplo, las técnicas tal como pruebas de aglutinación en látex o pruebas de identificación fenotípica automatizada que se pueden aplicar a los microorganismos aislados pero no a un sedimento de microorganismos se pueden llevar a cabo en los microorganismos recuperados y/o re-suspendidos .

Después de que se ha re-suspendido la muestra, se remueve una porción de la muestra de la suspensión y se coloca sobre una placa para la introducción en un espectrómetro de masas. Una sustancia altamente absorbente se deposita en la parte superior de la muestra (por ejemplo, matriz) este material tiene un coeficiente de absorción óptica muy alto con respecto a la frecuencia láser que se usa para ionizar la muestra (por ejemplo, para un láser de nitrógeno, la longitud de onda de emisión es 337 nm de modo que el material absorbente tendrá un gran coeficiente de absorción a una longitud de onda de 337 nm) . Después de que se ha secado la muestra y la sustancia absorbente, la placa se inserta en un espectrómetro de masas. Después de el tiempo requerido para bombear hacia abajo la muestra (es decir, remover los gases atmosféricos de la muestra de modo que esté en un ambiente de 10-5 a 10-7 torr) , la muestra se introduce en la cámara de ionización del espectrómetro de masas. La muestra se alinea con el sistema. Cuando se logra la alineación óptima, se impulsa el láser de nitrógeno. La absorción de la energía láser por la matriz hace que se separe de la superficie de la placa debido a la alta energía depositada. Como un efecto secundario, las porciones de la célula de microorganismo también se evaporan y ionizan en el proceso. Estos iones se aceleran a una energía cinética conocida por la generación de un campo electrostático entre la placa y la entrada al tubo de vuelo del espectrómetro de masas (es decir, esta porción del sistema es el discriminador de masa/carga) . Todos los iones individualmente cargados, a pesar de la masa, tendrán la misma energía cinética en la entrada al tubo de vuelo, pero tendrán velocidades que son inversamente proporcionales a sus masas. De aquí, los iones mueven hacia abajo el tubo de vuelo hacia el detector, y los iones más ligeros arribarán antes que los iones más pesados (el tubo de vuelo es el discriminador de masa/carga) . El detector genera una carga eléctrica cada vez que un ion impacta el detector. La salida del detector se digitaliza y la salida presenta la relación de masa/carga en un eje y el número de impactos en el otro eje. En otras modalidades, los microorganismos en el sedimento se pueden interrogar usando técnicas de espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas de MALDI-TOF, espectrometría de masas de ionización por electro-rociado con desorción (DESI) , espectrometría de masas de GC, espectrometría de masas de LC, espectrometría de masas de ionización de electro-rociado (ESI) y espectrometría de tubo de flujo iónico seleccionado (SIFT) .

De acuerdo a la invención, se toman mediciones de control para microorganismos conocidos, permitiendo de esta manera la correlación de los datos medidos de prueba con la caracterización de los microorganismos de interés usando varios métodos matemáticos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los datos de muestra se pueden comparar con las mediciones de línea base o de control utilizando sistemas de software conocidos por los expertos en la técnica. De manera más particular, los datos se pueden analizar por varios métodos de análisis multivariable , tal como por ejemplo, Análisis Discriminante General (GDA) , Análisis Discriminante de Mínimos Cuadrados Parcial (PLSDA) , Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales, Análisis de Componentes Principales (PCA) , Análisis de Factores Paralelos (PARAFAC) , Análisis de Redes Neurales (NNA) y/o Máquina de Vectores de Soporte (SVM) . Estos métodos se pueden usar para clasificar microorganismos desconocidos de interés en grupos pertinentes en base a la nomenclatura existente, y/o en grupos que se presentan de forma natural en base al metabolismo, patogenicidad y/o virulencia del microorganismo al diseñar el sistema para monitorizar, detectar y/o caracterizar el microorganismo como se describe anteriormente.

En aún otra modalidad, las mediciones no espectroscopicas del sistema de detección, tal como tiempos de detección y velocidades de crecimiento se pueden usar para ayudar en la caracterización y/o identificación de microorganismos de la muestra o sedimento aislado. Adicionalmente, las mediciones tomadas de una imagen fotográfica de la región inferior del dispositivo de separación pueden proporcionar información valiosa de la identidad del producto aislado, tal como tamaño, forma, color y densidad del sedimento.

En algunas modalidades de la invención, la caracterización y/o identificación de los microorganismos en la muestra o sedimento aislado no necesita comprender la identificación de una especie exacta. La caracterización abarca la categorización o clasificación amplia de partículas biológicas así como la identificación real de una especie única. La clasificación del microorganismo de una muestra o sedimento aislado puede comprender la determinación de características fenotípicas y/o morfológicas para el microorganismo. Por ejemplo, la caracterización de las partículas biológicas se puede lograr en base a diferencias observables, tal como, composición, forma, tamaño, agrupación y/o metabolismo. En algunas modalidades, la clasificación de las partículas biológicas de interés puede no requerir conocimiento previo de las características de una partícula biológica determinada sino sólo requerir correlaciones consistentes con mediciones empíricas haciendo de esta manera a este método en general y más fácilmente adaptable que los métodos que se basan en eventos específicos de unión o en reacciones metabólicas. Como se usa en la presente "identificación", significa determinar a qué familia, género, especie y/o cepa corresponde un microorganismo previamente desconocido. Por ejemplo, la identificación de un microorganismo previamente desconocido a la familia, género, especie y/o nivel de cepa.

En algunos casos, la caracterización abarca modelos de clasificación que proporcionan suficiente información útil para que se tome una acción. Como se usa en la presente, los modelos preferidos de clasificación comprenden agrupar en uno o más de lo siguiente: (1) Grupos Gram; (2) Grupos Gram Clínicos; (3) Grupos Terapéuticos; (4) Grupos Funcionales y (5) Grupos de Fluorescencia Intrínseca Natural . (1) Grupos Gram : Dentro de la clasificación de Grupos Gram, se pueden colocar microorganismos en una de tres categorías de clasificación amplia en base a su reacción de tinción Gram y tamaño total, estos grupos se seleccionan de uno o más de lo siguiente: (a) microorganismos Gram-positivos que manchan azul oscuro con la tinción Gram; (b) microorganismos Gram-negativos que manchan rojo con la tinción Gram; y (c) células de levadura que manchan azul oscuro con la tinción Gram, pero son células grandes redondeadas que se distinguen de bacterias por sus características morfológicas y por su tamaño. (2) Grupos Gram Clínicos: Los Grupos Gram se pueden dividir adicionalmente en varias categorías secundarias que representan características morfológicas distintivas. Estas categorías secundarias comprenden toda la información clínica pertinente reportada por un técnico laboratorista experimentado, proporcionando de este modo un mayor nivel de identificación que una reacción Gram positiva o negativa. Esta clasificación particular es muy útil debido a que elimina cuestiones a cerca de depender de la calidad de una tinción Gram y/o el nivel de habilidad del técnico que lee la embarradura al proporcionar la información equivalente clínicamente pertinente con un sistema automatizado. De manera más específica, las categorías secundarias de los microorganismos en base a este modelo de clasificación se pueden seleccionar de uno o más de lo siguiente: (a) cocos, que son células redondeadas pequeñas; (b) diplococos, que son dos células redondeadas pequeñas unidas conjuntamente; (c) varillas, que son de forma rectangular; y (d) bacilos, que son de forma de varilla. Los ejemplos de estas categorías secundarias que se pueden determinar por información morfológica adicional incluyen: (i) cocos Gram-positivos; (ii) cocos Gram-positivos en cadenas; (iii) cocos Gram-positivos en agrupaciones (es decir, agrupaciones "tipo uva"); (iv) diplococos Gram-positivos; (v) varillas Gram-positivas ; (vi) varillas Gram-positivas con endosporas; (vii) varillas Gram-negativas ; (viii) cocobacilos Gram-negativos ; (ix) diplococos Gram- negativos; (x) levadura; y (xi) hongos filamentosos. (3) Grupos Terapéuticos: Los grupos terapéuticos comprenden múltiples especies microbianas que, cuando se aislan de tipos particulares de especie, se tratan con la misma clase de antibióticos o mezcla de antibióticos (por ejemplo, como se describe en "Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008") . En muchos casos, no se requiere identidad a nivel de especie por el facultativo para permitir un cambio de la terapia empírica inicial a una terapia más dirigida debido a que se puede tratar más de una especie con la misma elección de antibióticos. Este nivel de clasificación coloca correctamente estos microorganismos de "mismo tratamiento" en categorías terapéuticas individuales. Los ejemplos de este nivel de caracterización incluyen la capacidad de distinguir especies Enterobacterianas altamente resistentes (EB) de especies EB sensibles (EnteroJacter spp. de E. coli) , o especies Candida resistentes a fluconazol (C. glabrata y C. kruzei) de especies Candida sensibles (C albicans y C. parapsilosis) , y demás. (4) Grupos Funcionales : De acuerdo a la invención, también se pueden colocar microorganismos en varios grupos en base a una mezcla de características metabólicas, virulentas y/o fenotípicas. Los organismos no termentadores se pueden distinguir claramente de los termentadores. Adicionalmente, las especies de microorganismo que producen hemolisinas se pueden agrupar de manera separada de las especies no hemolíticas. En algunos casos, estos grupos representan categorías amplias que a nivel de género (por ejemplo, coliformes, varillas no termentadoras Gram-negativas) , algunos al nivel del género (por ejemplo, Enterococcus , Candida) , y algunos con discriminación más cercana al nivel de especie (por ejemplo, estafilococos negativos a coagulasa, estreptococos alfa-hemolíticos , estreptococos beta-hemolíticos, estafilococos positivos a coagulasa, es decir, S. aureus) .

Además de medir las propiedades intrínsecas de los microorganismos para propósitos de identificación, los métodos de la presente invención pueden comprender además el uso de agentes identificadores adicionales para ayudar en el proceso de separación y/o identificación. Los agentes que se unen a microorganismos específicos, tal como ligandos de afinidad, se pueden usar para separar microorganismos, para identificar una clase o especie de microorganismo (por ejemplo, a través de la unión a un receptor o proteína de superficie, única) y/o para identificar una característica del microorganismo (por ejemplo, resistencia a antibiótico) . Los agentes identificadores útiles incluyen, sin limitación, anticuerpos monoclonales y policlonales y fragmentos de los mismos (por ejemplo, anti-Eap para la identificación de S. aureus) , sondas de ácido nucleico, antibióticos (por ejemplo, penicilina, vancomicina, polimixina B) , aptámeros, miméticos peptídicos, proteínas de unión derivadas de fagos, lectinas, biomarcadores de inmunidad innata al hospedador (proteínas de fase aguda, proteínas de unión a LPS, CD14, lectina de unión a mañosa, receptores tipo cuota) , péptidos de defensa del hospedador (por ejemplo, defensinas, catelicidinas , proteogrinas , magaininas) , bacterocinas (por ejemplo, lantibióticos , tal como nisina, mersacidina, epidermina, gallidermina, y plantaricina C, y péptidos de clase II), bacteriófagos, y tintes selectivos para ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, polisacáridos , cápsulas/babaza o proteínas, o cualquier combinación de éstos. Si el agente en sí mismo no da una señal detectable, el agente se puede marcar para proporcionar una señal detectable, tal como al conjugar el agente a un compuesto compatible con la matriz. El agente se puede adicionar a los microorganismos en cualquier paso de los métodos de la invención, por ejemplo, cuando la muestra se obtiene, durante la lisis, y/o durante la separación. En algunas modalidades, la presencia del agente del sedimento se puede determinar durante la interrogación del sedimento. Otros agentes identificadores útiles incluyen, substratos para enzimas microbianas, agentes quelantes, y compuestos tóxicos.

En un aspecto de la invención, el método puede comprender además el paso de recuperar el sedimento de microorganismos y realizar pruebas adicionales. En una modalidad, el sedimento se puede recuperar al aspirar el medio de muestra y el co ín de densidad. En otra modalidad, el sedimento se puede recuperar al insertar una jeringa en el recipiente y al aspirar el sedimento en tanto que permanecen intactos el medio de muestra y el cojín de densidad. El sedimento recuperado entonces se puede re-suspender en un medio adecuado, por ejemplo, solución salina. Una vez resuspendido, los microorganismos se pueden someter a cualquier prueba adicional que se desee, como es conocerá por los expertos en la técnica y como se describe anteriormente. En particular, cualquier prueba que requiera muestras limpias de microorganismos se puede llevar a cabo con los microorganismos resuspendidos . En algunas modalidades, se pueden realizar pruebas adicionales de identificación. Los ejemplos de pruebas de identificación incluyen VitekMR 2, pruebas de ácido nucleico amplificado y no amplificado (NAT) , ensayo de aglutinación en látex y cromogénico, inmunoensayos (por ejemplo, empleando anticuerpos marcados y/o otros ligandos) , espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas MALDI-TOF) y/u otras técnicas ópticas tal como espectroscopia infrarroja (FTIR) o espectroscopia Raman. También se pueden realizar pruebas adicionales de caracterización, tal como resistencia a antibióticos y/o otros fármacos. La caracterización adicional puede ser parte de una prueba que se inició durante los pasos iniciales de separación e identificación del método. Por ejemplo, la detección de S. aureus resistente a meticilina puede empezar al adicionar penicilina marcada, a la muestra, antes de la separación de los microorganismos. Una vez que se ha recuperado y resuspendido el sedimento, se puede determinar el nivel de penicilina unida.

En un aspecto de la invención, algunos o todos los pasos del método se pueden automatizar. La automatización de los pasos de los métodos no sólo permite que se prueben más rápidamente más muestras, sino que también reduce los riesgos de errores humanos en el manejo de muestras que pueden contener microorganismos dañinos y/o infecciosos.

En ciertas modalidades de la invención, los métodos también se pueden usar para detectar la presencia de microorganismos en una muestra de prueba. En estas modalidades, los métodos comprenden los pasos: (a) obtener una muestra de prueba; (b) lisar opcionalmente células én la muestra para producir una muestra lisada; y (c) separar los microorganismos de otros componentes de la muestra para formar un sedimento de microorganismos ; en donde la presencia de un sedimento indica que los microorganismos están presentes en la muestra de prueba. En una modalidad, el sedimento se detecta a simple vista. En otras modalidades, como se describe en la presente el sedimento se puede re-suspender, remover y someter a interrogación por espectrometría de masas .

En algunas modalidades, los métodos de detección se pueden usar para monitorizar muestras para contaminación por microorganismos, por ejemplo, materias alimenticias, productos farmacéuticos, agua para beber, etc. En una modalidad, los métodos se pueden llevar a cabo de una manera repetitiva para monitoreo constante de contaminación, por ejemplo, una vez al mes, una vez a la semana, una vez al día, una vez cada hora, o en cualquier patrón de tiempo. En otra modalidad, se pueden probar las muestras conforme se necesite, por ejemplo, cuando se sospecha la contaminación. En modalidades adicionales, los métodos de detección se pueden usar para buscar la presencia de microorganismos en muestras clínicas, por ejemplo, cultivos sanguíneos. Por ejemplo, se puede remover una muestra de un cultivo sanguíneo en ciertos puntos de tiempo y el método de detección se lleva a cabo en la muestra para determinar si es positivo el cultivo sanguíneo. En una modalidad se puede tomar una muestra en un punto de tiempo establecido después de la inoculación del cultivo, por ejemplo, 24 horas después de la inoculación, para determinar si es positivo el cultivo sanguíneo. En otra modalidad, se pueden tomar muestras del cultivo sanguíneo regularmente, por ejemplo, cada 12, 6, 4, o 2 horas o cada 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, o 5 minutos, para identificar cultivos sanguíneos positivos dentro de un tiempo corto de que son detectablemente positivos. En ciertas modalidades de los métodos de detección, el paso de detección se puede seguir opcionalmente por métodos de identificación como se describe en la presente.

En un aspecto de la invención, se pueden automatizar algunos o todos los pasos de método. La automatización de los pasos de los métodos permite que un mayor número de muestras se prueben más eficientemente y reduce los riesgos de errores humanos en el manejo de muestras que pueden contener microorganismos peligrosos y/o infecciosos. Sin embargo, de mayor importancia, la automa ización puede dar resultados críticos en cualquier momento del día o noche sin retraso. Varios estudios han mostrado que la identificación más rápida de los microorganismos que provocan sepsis con relación a con cuidado mejorado del paciente, estancia más corta en hospital y menores costos totales.

Los detalles y descripción adicional del método para caracterizar y/o identificar microorganismos, de acuerdo con la presente invención, se describen en las solicitudes de patente de los Estados Unidos, pendientes, números de serie y , ambas presentadas el 30 de octubre de 2009, tituladas "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy", y "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Raraan Spectroscopy" , respectivamente, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente como referencia.

La presente invención se detalla adicionalmente en los siguientes ejemplos, que se ofrecen a manera de ilustración y no se proponen para limitar la invención de ninguna manera. Se utilizan técnicas normales bien conocidas o las técnicas descritas específicamente más adelante.

E emplos Ejemplo 1. Método de lisis-centrifugación para Identificación de Microorganismos de Cultivos sanguíneos por Espectrometría de masas de MALDI-TOF Se "sembraron" microorganismos a un bajo inoculo en botellas BacT/ALERTMR SA que contienen 10 mi de sangre humana. Se removieron muestras de caldo de cultivo sanguíneo de las botellas en el espacio de unos pocos minutos de que se marcaron positivos por el Sistema de Detección Microbiana BacT/ALERTMR 3D. Las muestras de caldo se procesaron para separar microorganismos de los componentes de sangre medios que pueden interferir con el análisis subsiguiente como sigue: Se combinaron 4.0 mi de caldo de cultivos sanguíneos recientemente positivos con 2.0 mi de Amortiguador de Lisis (Brij" 97 al 0.45 % en CAPS 0.3M, pH 11.7), se mezclaron por vórtice durante 5 segundos y luego se incubaron en un baño de agua a 37°C durante 90 segundos. Después de la incubación, se estratificaron 0.95 mi del producto lisado en la parte superior de 0.5 mi de cojín de densidad (Iohexol al 14 % p/v, Pluronic F-108 al 0.005 % en Hepes 10 mM, pH 7.4) en cada uno de los cuatro tubos cónicos de centrífuga de 1.5 mL. Los cuatro tubos entonces se centrifugaron durante 2 minutos a 10,000 g a 25°C para sedimentar (asentar) los microorganismos a través del cojín de densidad. Los medios y la sangre lisada permanecieron por arriba del cojín.

Al término del ciclo de centrífuga, el sobrenadante se removió y los microorganismos sedimentados (asentados) en cada tubo se re-suspendieron con 10 µ? de agua purificada. Los microorganismos re-suspendidos de los cuatro tubos se mezclaron en un tubo limpio y se mezclaron suavemente. El volumen de cada espécimen procesado entonces se ajustó de modo que la densidad óptica a 660 en nm (AS6o) de la suspensión final fue igual a 20/cm. Los especímenes procesados ya sea se almacenaron a 2-8°C para la prueba el mismo día, o se tomaron en alícuota y se congelaron a -70°C para la prueba en una fecha posterior.

Ejemplo 2. Análisis de Especímenes de Microorganismos Procesados de Cultivos Sanguíneos Positivos con Lisis-Centrifugación por MALDI-TOF MS Especímenes procesados de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 1 se descongelaron rápidamente a 37 °C (si estaban previamente congelados) , se mezclaron suavemente, y luego se diluyeron a la concentración de uso (1:4, 1:8 y 1:16) en agua purificada. Se aplicó 1.0 µ? de cada espécimen diluido en duplicado a una placa objetivo de MALDI-TOF. A uno de cada uno de los duplicados, se adicionó 1.0 µ? de ácido fórmico al 50 %. Todos los especímenes aplicados se dejaron secar a temperatura ambiente, y luego se aplicó 1.0 µ?. de solución de matriz. La matriz consistió de una mezcla 50:50 de Alfa-Ciano (solución de ácido alfa-ciano-4 -hidroxicinámico, AnagnosTec GmbH, Alemania) y DHB (ácido 2 , 5-dihidroxibenzoico, AnagnosTec GmbH, Alemania) .

Para comparación, los aislados microbianos correspondientes se cultivaron en medio de agar que fue apropiado para las especies, y se envararon directamente en la placa objetivo de MALDI-TOF en duplicado. Los microorganismos en uno de los puntos duplicados se re-suspendieron in situ con 1.0 µL de agua purificada, seguido por 1.0 µL de ácido fórmico al 50 %. Ambos puntos de un aislado dado se dejaron secar, y luego a cada uno se adicionó 1.0 µ??? de mezcla de matriz.

Después de que todos los especímenes de microorganismos se han secado completamente, se adquirieron los espectros de masas de MALDI-TOF para cada uno sobre un intervalo de masa/carga de 2000-34,000 en un Espectrómetro de Masas Axima Assurance MALDI-TOF (Shimadzu Biotech North America, Maryland) .

Los espectros representativos de masas de microorganismos seleccionados, recuperados de cultivos sanguíneos positivos, se muestran en las Figuras 1-3. El intervalo de masa/carga en las figuras se ha reducido por claridad, pero los mismos hallazgos ilustrados en esas figuras se mantienen para todos los intervalos de masa.

La Figura 1 muestra los espectros de microorganismos procesados de cultivos sanguíneos sembrados de cinco aislados clínicos promediados por claridad de ilustración, para cada una de las cuatro especies. Las diferencias marcadas en la presencia o ausencia de picos a una relación dada de masa/carga son fácilmente evidentes y características para estos organismos. No son comunes los picos de masa/carga a todos los espectros, lo que indica que pocas, si las hay, masas potencialmente oscuras están presentes como resultado del remanente del medio de sangre o cultivo después del procesamiento de acuerdo con la presente invención.

La Figura 2 muestra los cinco espectros de masas, individuales de los aislados de S. aureus que se mostraron promediados en la Figura 1. Los cinco espectros muestran la consistencia del espectro de masa para este microorganismo a través de diferentes aislados clínicos, aún cuando se cultivan en diferentes cultivos sanguíneos con diferentes donadores sanguíneos .

La Figura 3 muestra los espectros promediados de los cinco aislados de E. coli mostrados en la Figura 1 en comparación a los espectros de los mismos cinco asilados muestreados directamente de colonias cultivadas en medios de agar (Agar de Soya Tríptico con Sangre de Oveja al 5 %, bioMérieux Inc.). La similitud de los espectros de masa muestra que el procesamiento de los cultivos sanguíneos remueve de manera eficiente materiales que1 no son de origen microbiano, en tanto que conserva aquellas masas que son específicas al microorganismo.

Ejemplo 3. Identificación de Especímenes de Microorganismos Procesados de Cultivos Sanguíneos Positivos con Lisis- Centrifugación por MALDI-TOF MS y una Base de Datos de Identificación de Microorganismos, Comercialmente Disponible Ciento veintitrés aislados de microorganismos se cultivaron, procesaron y analizaron por masa como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Los microorganismos comprendieron 14 especies de bacterias y levaduras comúnmente detectadas en los cultivos sanguíneos clínicos.

Después de la adquisición de cada espectro de masas, una tabla de picos de masa se introdujo en el software de identificación de microorganismos "Saramis" (AnagnosTec GmbH, Alemania) para análisis. Este software está integrado en una base de datos de Espectros de Masas de MALDI-TOF recolectados de microorganismos cultivados en agar .

La Tabla 1 muestra los resultados de todos los aislados cultivados tanto en el cultivo sanguíneo como en el medio de agar en paralelo de los mismos cultivos de siembra. Los resultados en la Tabla 1 se tabulan para todos los cultivos, aunque la concentración celular en la suspensión final de algunos aislados estuvo por abajo de la concentración objetivo especificada en el Ejemplo 1. En los casos donde la concentración celular fue menor de 20 % del valor objetivo, estos aislados se removieron de la tabulación y los resultados de los aislados restantes se recopilan en la Tabla 2. En la práctica, se pueden compensar cultivos de bajo número celular al reducir el volumen de resuspensión de sedimento o al procesar un mayor volumen de caldo de cultivo.

Las columnas "Corregir a Especie" en las Tablas 1 y 2 se refieren al número de aislados en donde al menos uno, y usualmente más, de los espectros de un conjunto de puntos objetivo para un aislado dado se identifica correctamente como una especie individual, o como un grupo de dos a tres especies cercanamente relacionadas, a un nivel de confianza de al menos 90 %. Igualmente, el aislado se considera que se identifica de manera correcta a nivel de Género o Familia si los espectros corresponden a la base de datos con al menos 90 % de confianza al Género o Familia correcta, pero sin indicación de la especie. Las columnas "No/Errónea ID" son los aislados que produjeron Espectros de Masas que en general fueron de demasiada baja calidad para un a ID adecuada, que da por resultado una identificación no confiable, o raramente, una identificación falsa. Estos criterios se juzgaron que son razonables para este estudio, pero el software permite al usuario experto la latitud para ajustar los criterios apropiados de confianza de identificación para las necesidades individuales.

El éxito de la identificación microbiana por la presente invención, casi 95 % correcto a nivel de especie, es claramente superior a estudios previos llevados a cabo con métodos de procesamiento anteriormente conocidos en donde se ha reportado < 76 % de identificación correcta (ver, por ejemplo, MAIER, T. et . al,. "Rapid Identification of Bacteria from Blood Cultures Using MALDI-TOF MS" , Poster ICAAC 48th Annual Meeting, 2008; ver también por ejemplo, Drake et al., "MALDI-TOF Mass Spectrometry Based Identification of Clinically Important Microorganisms", ASMS Poster, Philadelphia 2009) . Se puede usar cualquier número de modelos matemáticos o bases de datos de espectros para la identificación de microorganismos a partir de cultivo sanguíneo, pero estos resultados con una base de datos comercial muestran mejor que microorganismos procesados del caldo de cultivo por la presente invención están suficientemente libres de picos de masa contaminantes para corresponder una base de datos cultivada en agar de espectros de colonias "puras" .

Tabla 1 : Todos los Aislados Correcto a Correcto a No/Errónea N Especie Género/Familia ID Cultivo 112 116 (94.3%) 7 (5.7%) 123 Sanguíneo (91.1%) Colonias 113 118 (95.9%) 5 (4.1%) 123 en Agar (91.9%) Tabla 2 : Aislados que Cumplen con los Criterios de Masa Celular Los ejemplos anteriores son ilustrativos de la presente invención, y no se van a considerar como limitantes de la misma. La invención se define por las siguientes reivindicaciones, con los equivalentes de las reivindicaciones que se incluyen en la presente. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, publicaciones de patente, y cualquier otra referencia citada en la presente se incorporan como referencia en sus totalidades para las enseñanzas pertinentes al enunciado y/o párrafo en el cual se presenta la referencia.

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo de una muestra de prueba, caracterizado porque comprende : (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar de forma selectiva las células que no son de microorganismos en la muestra de prueba para producir una muestra lisada; (c) separar los microorganismos de los otros componentes de la muestra lisada para formar una muestra aislada de microorganismos; (d) interrogar la muestra aislada de los microorganismos por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación del espectro de masas medido con los espectros de masas de referencia y/o con masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una porción de la muestra de microorganismos aislados del paso (c) se recupera y se coloca en un sustrato portador antes del paso (d) de interrogación .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de separación en el paso (c) es centrifugación.

. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de separación en el paso (c) es filtración.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una porción de la muestra de microorganismos aislados del paso (c) se coloca directamente en un sustrato portador durante la separación antes del paso (d) de interrogación.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la espectrometría de masas se selecciona del grupo que consiste de espectrometría de masas de MALDI-TOF, espectrometría de masas de ionización por electro-rociado de desorción (DESI) , espectrometría de masas de GC, espectrometría de masas de LC, espectrometría de masas de ionización de electro-rociado (ESI) y espectrometría de tubo de flujo iónico seleccionado (SIFT) .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en base a una o más características fenotípicas y/o morfológicas .

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en uno o más modelos de clasificación seleccionados del grupo que consiste de Grupos Gram, Grupos Gram Clínicos, Grupos Terapéuticos y Grupos Funcionales.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los microorganismos se identifican a nivel de género, a nivel de especie o a nivel de cepa.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (b) de lisis selectiva se realiza usando una solución de lisis que comprende uno o más detergentes .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el uno o más detergentes se seleccionan del grupo que consiste de TritonR, X-100 Tritón MR X-100-R, TritonMR X-114, NP-40, GenapolMR C-100, GenapolMR X-100, IgepalMR CA 630, ArlasolveMR200 , BrijMR 96/97, CHAPS, octil- ß-D-glucopiranosido, saponina, y éter monododecílico de nonaetilenglicol (C12E9, polidocenol) , dodecil sulfato de sodio, N-laurilsarcosina, desoxicolato de sodio, sales biliares, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, SB3-10, SB3-12, amidosulfobetaina-14, y C7BzO, BrijMR 98, Brij R 58, BrijMR 35, TweenMR 80, TweenMR20, PluronicMR L64, Pluronic P84, sulfobetaínas no detergentes (NDSB 201), anfipoles (PMAL-C8) , y metil - ß-ciclodextrina .

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el detergente es un detergente de polioxietileno que comprende la estructura .

13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el detergente de polioxietileno se selecciona del grupo que consiste de BrijMR 97, Brij R 96V, GenapolMR C-100, GenapolMR X-100, y polidocenol.

14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la solución de lisis comprende además una o más enzimas y la una o más enzimas que comprenden una mezcla de una o más proteinaceas o una o más nucleasas .

15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la solución de lisis comprende uno o más agentes amortiguadores.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra lisada se estratifica en un cojín de densidad en un recipiente y en donde el recipiente se centrifuga para formar un sedimento de microorganismos.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el cojín de densidad comprende uno o más de sílice coloidal, agentes de contraste yodados, sacarosa, aceite de inmersión de microscopio, aceite mineral, aceite de silicón, aceite de fluorosilicón, gel de silicón, metrisoato-FicollMR, diatrizoato-dextrano, carboximetil-celulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, óxido de polietileno (alto peso molecular) PluronicMR F127, PluronicMR F68, ácido poliacrílico, ' alcohol polivinílico reticulado, polivinil-pirrolidina reticulada, metacrilato de éter metílico de PEG, pectina, agarosa, xantano, gelan, PhytagelMR, sorbitol, FicollMR, glicerol, dextrano, glicógeno, cloruro de cesio, fluidos de perfluorocarburo, fluidos de hidrofluorocarbono, y combinaciones de los mismos.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de prueba es una muestra de cultivo que se conoce que contiene microorganismos.

19. Un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo de un cultivo sanguíneo, caracterizado porque comprende : (a) obtener una muestra un cultivo sanguíneo que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) lisar selectivamente células no de microorganismos en la muestra para producir una muestra lisada; (c) estratificar la muestra lisada en un cojín de densidad en un recipiente sellado; (d) centrifugar el recipiente para separar los microorganismos de otros componentes de la muestra y formar un sedimento de microorganismo; (e) interrogar la muestra aislada de los microorganismos por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas del microorganismo; y (f) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación del espectro de masas medido con espectros de masas de referencia y/o con las masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos.

20. Un método para caracterizar y/o identificar un microorganismo, caracterizado porque comprende: (a) obtener una muestra de prueba que se conoce que contiene o que puede contener microorganismos; (b) estratificar la muestra de prueba sobre un cojín de densidad en un recipiente; (c) centrifugar el recipiente para separar los microorganismos de otros componentes de la muestra de prueba y formar un sedimento de microorganismos; (d) interrogar el sedimento por espectrometría de masas para adquirir un espectro de masas del microorganismo; y (e) caracterizar y/o identificar el microorganismo en la muestra aislada por comparación del espectro de masas medido con los espectros de masas de referencia y/o con las masas conocidas o previstas de componentes celulares de microorganismos conocidos.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque al menos una porción del sedimento de microorganismos del paso (c) se recupera y coloca en un sustrato portador antes del paso (d) de interrogación.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la espectrometría de masas se selecciona del grupo que consiste de espectrometría de masas de MALDI-TOF, espectrometría de masas de ionización por electro-rociado de desorción (DESI) , espectrometría de masas de GC, espectrometría de masas de LC, espectrometría de masas de ionización de electro-rociado (ESI) y espectrometría de tubo de flujo iónico seleccionado (SIFT) .

23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el cojín de densidad se selecciona del grupo que consiste de sílice coloidal, agentes de contraste yodados, sacarosa, aceite de inmersión de microscopio, aceite mineral, aceite de silicón, aceite de fluorosilicón, gel de silicón, metrisoato-FicollMR, diatrizoato-dextrano, carboximetil-celulosa, hidroxipropil -metilcelulosa, óxido de polietileno (de alto peso molecular) PluronicMR F127, Pluronic^ F68, ácido poliacrílico, alcohol polivinílico reticulado, polivinil -pirrolidina reticulada, metacrilato de éter metílico de PEG, pectina, agarosa, xantano, gelan, PhytagelMR, sorbitol, FicollMR, glicerol, dextrano, glicógeno, cloruro de cesio, fluidos de perfluorocarburo, fluidos de hidrofluorocarbono, y combinaciones de los mismos.

24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en base a una o más características fenotípicas y/o morfológicas .

25. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los microorganismos se caracterizan en uno o más modelos de clasificación seleccionados del grupo que consiste de Grupos Gram, Grupos Gram Clínicos, Grupos Terapéuticos y Grupos Funcionales.

26. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los microorganismos se identifican a nivel de género, a nivel de especie o a nivel de cepa.

27. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la muestra de prueba es una muestra de cultivo que se conoce que contiene microorganismos.