CN107236782A - 革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法 - Google Patents

革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法 Download PDF

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CN107236782A CN201710414324.3A CN201710414324A CN107236782A CN 107236782 A CN107236782 A CN 107236782A CN 201710414324 A CN201710414324 A CN 201710414324A CN 107236782 A CN107236782 A CN 107236782A
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杨启文
周梦兰
徐英春
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

一种革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；把分离胶管放置到离心机中，离心机在4000g的离心力的作用下离心10min；在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；将1ml菌悬液转移至1.5mlEP管中，往EP管中加入200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；获得的菌悬液通过化学试剂处理后进行直接MALDI‑TOF质谱鉴定，有效避免了现有技术中整个过程耗时长的缺陷。

Description

革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法
技术领域
本发明涉及革兰氏阴性菌阳性血培养技术领域，具体涉及一种革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法。
背景技术
现有的革兰氏阴性菌阳性血培养的鉴定方法是：血培养仪阳性报警后按传统流程处理，涂片革兰染色、显微镜观察、转种血或巧克力平板在厌氧或需氧条件下培养24-48h获得纯菌落后，再使用现有的基于生化反应或免疫学方法的商品化仪器如Vitek 2Compact、API 20C和BD PhoenixTM-100等进行鉴定。
但是目前这样的方法需要将阳性血培养液转种至培养基上，培养孵育至肉眼可见的单个纯菌落后，再挑选单个纯菌落通过后续的方法进行鉴定，整个过程耗时较长(约24h-48h)。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，有效避免了现有技术中整个过程耗时长的缺陷。
为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法的解决方案，具体如下：
一种革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，具体步骤如下：
步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；
步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在离心力的作用下离心10min；
步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；
步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；
步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5ml EP管中，往EP管中加入200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；
步骤6：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤7：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；
步骤8：接着在室温条件下把该EP管静置10min；
步骤9：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤10：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；
步骤11：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置；
步骤12：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；
步骤13：取1μl EP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪中进行质谱分析。
所述步骤2中的离心机在离心力的作用下的离心力大小为4000g。
所述步骤4中的用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜的吹吸次数为5-10次。
所述步骤11中所述的再在室温的条件下把EP管静置的时间为5-10min。
本发明的有益效果为：
本发明的革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶的方法不需要将阳性血培养液转种至培养基上至生长出单个菌落，再通过后续的方法进行鉴定，而是将阳性血培养液进行分离胶前处理后直接质谱鉴定，整个过程耗时约30-40min，大大缩短了鉴定流程，同时节约了人力物力。
附图说明
图1是本发明的嵌接设备的结构示意图；
图2是本发明的第一嵌接部的结构示意图；
图3是本发明的第二嵌接部的部分截面示意图；
图4是本发明的嵌接设备的剖视图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明做进一步地说明。
实施例1
革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，具体步骤如下：
步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；
步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在离心力的作用下离心10min；
步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；
步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；
步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5ml EP管中，往EP管中加入200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；
步骤6：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤7：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；
步骤8：接着在室温条件下把该EP管静置10min；
步骤9：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤10：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；
步骤11：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置；
步骤12：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；
步骤13：取1μl EP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪中进行质谱分析。
所述步骤2中的离心机在离心力的作用下的离心力大小为4000g。
所述步骤4中的用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜的吹吸次数为5次。
所述步骤11中所述的再在室温的条件下把EP管静置的时间为5min。
本实施例的有益效果为：
本实施例的革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶的方法不需要将阳性血培养液转种至培养基上至生长出单个菌落，再通过后续的方法进行鉴定，而是将阳性血培养液进行分离胶前处理后直接质谱鉴定，整个过程耗时30min，大大缩短了鉴定流程，同时节约了人力物力。
实施例2
革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，具体步骤如下：
步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；
步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在离心力的作用下离心10min；
步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；
步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；
步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5ml EP管中，往EP管中加入200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；
步骤6：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤7：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；
步骤8：接着在室温条件下把该EP管静置10min；
步骤9：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤10：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；
步骤11：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置；
步骤12：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；
步骤13：取1μl EP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪中进行质谱分析。
所述步骤2中的离心机在离心力的作用下的离心力大小为4000g。
所述步骤4中的用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜的吹吸次数为8次。
所述步骤11中所述的再在室温的条件下把EP管静置的时间为8min。
本实施例的有益效果为：
本实施例的革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶的方法不需要将阳性血培养液转种至培养基上至生长出单个菌落，再通过后续的方法进行鉴定，而是将阳性血培养液进行分离胶前处理后直接质谱鉴定，整个过程耗时35min，大大缩短了鉴定流程，同时节约了人力物力。
实施例3
革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，具体步骤如下：
步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；
步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在离心力的作用下离心10min；
步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；
步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；
步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5ml EP管中，往EP管中加入200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；
步骤6：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤7：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；
步骤8：接着在室温条件下把该EP管静置10min；
步骤9：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤10：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；
步骤11：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置；
步骤12：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；
步骤13：取1μl EP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪中进行质谱分析。
所述步骤2中的离心机在离心力的作用下的离心力大小为4000g。
所述步骤4中的用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜的吹吸次数为10次。
所述步骤11中所述的再在室温的条件下把EP管静置的时间为10min。
本实施例的有益效果为：
本实施例的革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶的方法不需要将阳性血培养液转种至培养基上至生长出单个菌落，再通过后续的方法进行鉴定，而是将阳性血培养液进行分离胶前处理后直接质谱鉴定，整个过程耗时40min，大大缩短了鉴定流程，同时节约了人力物力。
实施例4
革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，具体步骤如下：
步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；
步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在离心力的作用下离心10min；
步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；
步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；
步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5ml EP管中，往EP管中加入200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；
步骤6：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤7：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；
步骤8：接着在室温条件下把该EP管静置10min；
步骤9：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤10：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；
步骤11：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置；
步骤12：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；
步骤13：取1μl EP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪中进行质谱分析。
所述步骤2中的离心机在离心力的作用下的离心力大小为4000g。
所述步骤4中的用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜的吹吸次数为10次。
所述步骤11中所述的再在室温的条件下把EP管静置的时间为10min。本
实施例的有益效果为：
本实施例的革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶的方法不需要将阳性血培养液转种至培养基上至生长出单个菌落，再通过后续的方法进行鉴定，而是将阳性血培养液进行分离胶前处理后直接质谱鉴定，整个过程耗时40min，大大缩短了鉴定流程，同时节约了人力物力。
还有就是，所述离心机包括支架，所述支架为长方体状，而支架直接放置在地面上往往容易受潮，为了防潮，往往支架的底壁同放置在地面的长方体状的不锈钢底座的顶壁相连接，支座的底壁同长方体状的不锈钢底座的顶壁相连接的结构是通过所述支座的底壁与所述不锈钢底座的顶壁来相连接，所述支座的底壁与所述不锈钢底座的顶壁相连接的结构为一般为须在所述不锈钢底座的顶壁上设置定位口，再经过丝杆自上而下依次穿过所述底座的底壁和熔接固定在定位口中的丝母旋紧连接，以此来完成所述底座的底壁与所述不锈钢底座的顶壁相连接,此种结构不光加大了制造费用，且带有装配准确度低、视觉效果不佳。
所述离心机的支座的底壁同放置在地面的长方体状的不锈钢底座的顶壁相连接的结构为所述支座的底壁与所述不锈钢底座的顶壁经由嵌接设备S00相连接；
所述嵌接设备S00含有第一嵌接部S0与第二嵌接部T0；
所述第一嵌接部S0固联在所述不锈钢底座的顶壁，所述第二嵌接部T0固联在所述支座的底壁；
所述第一嵌接部S0的上部为长方体板，所述第一嵌接部S0的下部为拱状体，所述拱状体的顶端与长方体板的底壁相固联，所述拱状体的底端与所述不锈钢底座的顶壁相固联，在所述长方体板的顶壁上开有直至所述拱状体内部的嵌接孔S1，所述嵌接孔S1的顶端接口S11在所述长方体板的顶壁上；
所述第二嵌接部T0的上部为圆柱状柱体，所述圆柱状柱体的顶端固联在所述底座的底壁，所述圆柱状柱体的底端为玻青铜材料的嵌接头T1，所述嵌接头T1嵌接进所述嵌接孔S1中，另外所述嵌接孔S1的顶端接口S11对所述嵌接头T1进行阻挡，所述嵌接头T1的外表面在嵌接进或退出所述嵌接孔S1期间能够合拢。
所述第一嵌接部S0的所述嵌接孔S1为球弧状结构，所述嵌接头T1的外表面的轮廓也为球弧状结构。
所述第一嵌接部S0的所述嵌接孔S1的轮廓也可以为若干段弧段状拱起光滑连接而成，还可以为圆台状，而所述嵌接头T1的外表面也与所述第一嵌接部S0的所述嵌接孔S1的轮廓形状相同。
所述嵌接头T1含有若干环绕连接在所述第二嵌接部T0的圆柱状柱体底部上的玻青铜材料的拱状嵌接片T11，所述拱状嵌接片T11等距环绕在所述第二嵌接部T0的圆柱状柱体底部上，所有所述拱状嵌接片T11的外表面一起形成所述嵌接头T1的外表面。
所述嵌接孔S1含有在所述嵌接孔S1内的底部表面S12与所述嵌接孔S1内的边部表面S13，所述嵌接孔S1内的底部表面S12同所述嵌接孔S1的顶端接口S11相向而对，所述嵌接孔S1内的边部表面同所述嵌接孔S1内的底部表面S12相联接，另外所述嵌接孔S1内的边部表面S13到所述嵌接孔S1的顶端接口S11的结构为渐缩状结构。
所述嵌接孔S1内的底部表面S12为球弧状，所述嵌接孔S1内的边部表面S13含有顺序相连的圆筒状分部S13S与圆台状分部S13T，所述圆筒状分部S13S的底部和所述嵌接孔S1内的底部表面S12相连，所述圆台状分部S13T的上部和所述嵌接孔S1的顶端接口S11相连，所述圆台状分部S13T就是所述渐缩状结构。
另外，所述第一嵌接部S0与所述不锈钢底座的顶壁为一次成型整体结构，所述第二嵌接部T0与所述底座为一次成型整体结构。
在所述玻青铜材料的嵌接头T1嵌接进所述嵌接孔S1期间，所述玻青铜材料的嵌接头T1的外表面逐步合拢来由所述嵌接孔S1的顶端接口S11伸进，而在所述玻青铜材料的嵌接头T1退出所述第一嵌接部S0的嵌接孔S1期间，所述玻青铜材料的嵌接头T1的外表面逐步合拢来由所述嵌接孔S1的顶端接口S11退出，因此第一嵌接部S0与第二嵌接部T0结合更牢靠，另外装配准确度高，易于高效装配和拆除。
以上以附图说明的方式对本发明作了描述，本领域的技术人员应当理解，本公开不限于以上描述的实施例，在不偏离本发明的范围的情况下，可以做出各种变化、改变和替换。

Claims (4)

1.一种革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1：抽取3.5ml血培养阳性液至3.5ml分离胶管中；
步骤2：把分离胶管放置到离心机中，离心机在离心力的作用下离心10min；
步骤3：在勿碰触分离胶管中的分离胶的表面菌膜的条件下对血培养阳性液进行吸弃上清；
步骤4：用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜，以此来让菌膜悬浮在无菌双蒸水中形成菌悬液；
步骤5：将1ml菌悬液转移至1.5ml EP管中，往EP管中加入200μl且浓度百分比为10％的SDS，把EP管放置在涡旋振荡仪上进行涡旋震荡1min后，再在室温的条件下把EP管静置5min；
步骤6：把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤7：往EP管底的沉淀中加入浓度百分比为75％的乙醇700μl构成第一混合物，然后对该第一混合物进行吹吸混匀；
步骤8：接着在室温条件下把该EP管静置10min；
步骤9：将EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；
步骤10：继续让离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心1min，在勿触碰EP管底的沉淀的条件下吸弃上清；然后把该EP管放置在生物安全柜中且在室温条件下静置5min，吹干EP管内的物质中的残留乙醇使得残留乙醇完全挥发；
步骤11：往EP管底的沉淀中加入15μl且浓度百分比为70％的甲酸来形成第二混合物，然后对第二混合物进行吹吸混匀，再在室温的条件下把EP管静置；
步骤12：往EP管中加15μl乙腈来形成第三混合物，然后对第三混合物进行吹吸混匀，再把EP管放入离心机中，离心机在13000rpm的转速的条件下进行离心2min；
步骤13：取1μl EP管中的上清滴于靶板，在室温条件下把靶板晾干；加1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，把靶板放入Bruker质谱仪中进行质谱分析。
2.根据权利要求1所述的革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，其特征在于，所述步骤2中的离心机在离心力的作用下的离心力大小为4000g。
3.根据权利要求1所述的革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，其特征在于，所述步骤4中的用1ml无菌双蒸水反复吹吸分离胶表面的菌膜的吹吸次数为5-10次。
4.根据权利要求1所述的革兰氏阴性菌阳性血培养分离胶及化学试剂前处理方法，其特征在于，所述步骤11中所述的再在室温的条件下把EP管静置的时间为5-10min。
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