RU2661108C1 - Способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии - Google Patents
Способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2661108C1 RU2661108C1 RU2017102864A RU2017102864A RU2661108C1 RU 2661108 C1 RU2661108 C1 RU 2661108C1 RU 2017102864 A RU2017102864 A RU 2017102864A RU 2017102864 A RU2017102864 A RU 2017102864A RU 2661108 C1 RU2661108 C1 RU 2661108C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- maldi
- leptospira
- serovars
- strains
- serovar
- Prior art date
Links
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 claims abstract description 8
- XCSQXCKDEVRTHN-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-1,4-diene-1-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CCC=CC1 XCSQXCKDEVRTHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 19
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 16
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 14
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 9
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 206010024238 Leptospirosis Diseases 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AAXCQFOXUJMCCW-PETQGJDISA-N LPS core Chemical compound O([C@H]1[C@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@H]([C@@H]([C@@H](CO[C@]2(O[C@@H]([C@@H](OC3[C@H]([C@@H](OC4[C@H]([C@@H](OC5[C@@H]([C@@H](O[C@@H]6[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)OC6[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]6[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)O5)O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](O)COC5[C@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]([C@@H](O)CO)O5)O)O4)O)[C@H](OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCCN)[C@@H]([C@@H](O)CO)O3)O)[C@H](O[C@]3(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@]4(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OCCN)C4)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C3)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C2)[C@@H](O)CO)C(O)=O)O1)OP(O)(O)=O)OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1O AAXCQFOXUJMCCW-PETQGJDISA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical group NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940114055 beta-resorcylic acid Drugs 0.000 description 1
- UIAFKZKHHVMJGS-UHFFFAOYSA-N beta-resorcylic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1O UIAFKZKHHVMJGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012855 volatile organic compound Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области микробиологии. Предложен способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira с помощью масс-спектрометрии. Способ включает прямое нанесение целых бактериальных клеток на MALDI мишень с использованием в качестве матрицы 2,5-дигидробензойной кислоты. Спектрометрию проводят в линейном положительном режиме работы MALDI-TOF масс-спектрометра в диапазоне соотношения масса/заряд 600-6000 Да. Идентификация изолятов осуществляется путем сопоставления значений молекулярных масс повторяющихся субъединиц О-антигенов в их спектральных профилях с таковыми у референсных штаммов, являющихся специфическими маркерами сероваров. Изобретение обеспечивает быстрое проведение серотипирования штаммов лептоспир, выделенных от больных людей, инфицированных животных или из окружающей среды. 3 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к исследованию бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии для осуществления быстрого типирования их сероваров и может быть использовано в микробиологической практике для типирования сероваров лептоспир, выделенных от больных лептоспирозом людей, инфицированных животных или из окружающей среды.
Серовары являются внутривидовыми таксономическими единицами грамотрицательных бактерий рода Leptospira. Основой серотипирования является О-антиген, входящий в состав липополисахаридов (ЛПС) клеточной стенки грамотрицательных бактерий и отвечающий за их серологическое разнообразие. Типирование сероваров имеет практическое значение, позволяющее определять источник инфекции и осуществлять эпидемиологический контроль над ее распространением.
Известны стандартные способы идентификации сероваров бактерий рода Leptospira, базирующиеся на классических серологических методах, таких как реакция микроскопической агглютинации (РМА) и тест перекрестной агглютинации абсорбции [Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний лептоспирозами. Методические указания 3.1.1128-02. Минздрав России. Москва 2002, 44 с.].
К недостаткам этого способа следует отнести:
- серотипирование изолятов лептоспир является специализированной процедурой, выполняющейся в референсных центрах;
- большая трудоемкость и большая длительность исследования;
- требует наличия моноспецифических сывороток, получаемых при иммунизации кроликов соответствующими сероварами лептоспир, или мышиных моноклональных антител к О-антигенам;
- к большинству существующих сероваров соответствующие антисыворотки отсутствуют, т.к. патогенные виды Leptospira насчитывают более 250 сероваров, что ограничивает возможности этих методов по типированию эпидемиологически важных штаммов [Cerqueira G.M., Picardeau М.A. Century of Leptospira strain typing. Infect Genet Evol. 2009, 9:760-768].
Альтернативно предприняты попытки применения молекулярно-генетических методов идентификации сероваров, основанных на секвенировании кластера генов в локусе rfb хромосомы, кодирующих ферменты, которые ответственны за синтез и сборку полисахаридных частей ЛПС [Bezerra da Silva, J., Carvalho, E., Hartskeerl, R.A. et al. Evaluation of the Use of Selective PCR Amplification of LPS Biosynthesis Genes for Molecular Typing of Leptospira at the Serovar Level. Current Microbiology 2011, 62: 518-52. doi:10.1007/s00284-010-9738-7].
Однако полученные в настоящее время данные определения полиморфизма генов биосинтеза О-антигенов являются недостаточно убедительными и требуют дальнейшего развития молекулярных методов с целью расшифровки генетической основы антигенного разнообразия ЛПС для идентификации сероваров.
Развитие техники матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии позволило анализировать биологически активные вещества и предложить способы быстрой и точной идентификации микроорганизмов [Holland RD, Wilkes JG, Rafii F, et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 1996, 10:1227-32; патенты US 6177266 B1, ЕР 0922295].
Метод основан на мягкой ионизации и десорбции молекул исследуемых образцов микроорганизмов, нанесенных на MALDI пластину с добавлением матрицы, как источника ионов, при воздействии лазерного излучения и с последующим анализом полученных белковых масс-спектров. По сравнению с традиционными или молекулярно-генетическими методами, MALDI-TOF масс-спектрометрия является быстрым, точным и экономически эффективным методом идентификации бактерий и грибов, который стал широко использоваться в рутинных исследованиях клинических микробиологических лабораторий. [Sauer S, Kliem М. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nature Rev Microbiol 2010, 8:74-82; Carbonnelle E, Mesquita C, Bille E, Day N, Dauphin B, Beretti J-L, et al. MALDI-TOF mass spectrometry tools for bacterial identification in clinical microbiology laboratory. Clin Biochem. 2011, 44:104-109; Seng P., Drancourt M., Gouriet F. et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 2009, 49:543-51].
Общими признаками этих способов являются следующие характеристики:
- осуществляют спектрометрию целых бактериальных клеток или клеточных экстрактов в линейном положительном режиме MALDI-TOF масс-спектрометра в диапазоне масса/заряд (m/z) от 2000 до 20000 Da;
- в качестве матрицы используется α-циано-4-гидроксикоричная кислота;
- идентификация микроорганизмов происходит путем сопоставления сгенерированного списка масс пиков исследуемого образца с данными библиотеки эталонных спектров в таксономических базах;
- выявляют уникальный для каждого микроорганизма набор клеточных белков в виде спектральных профилей, представленных преимущественно пиками белков рибосомального происхождения;
- дифференциация бактериальных штаммов осуществляется на уровне рода и вида аналогично методам генотипирования [Rettinger A., Krupka I., 
K. et al. Leptospira spp. strain identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene sequencing and multi locus sequence typing (MLST). BMC Microbiology 2012, 12:185]
Кроме протеомного подхода получения MALDI-TOF масс-спектрометрических профилей бактерий предложен метод идентификации грамотрицательных бактерий, основанный на анализе профилей эндотоксинов бактерий [патент WO/2014/035270], выбранный за прототип. Этот способ имеет следующие характеристики:
- профили эндотоксинов получают масс-спектрометрией клеточных экстрактов или препаратов бактерий, обработанных протеолитическим ферментом в отрицательном режиме MALDI-TOF спектрометра в диапазоне m/z 700-4000 Da;
- в качестве матрицы используется 2,4-дигидроксибензойная кислота;
- результирующие профили эндотоксинов бактерий состоят из спектральных сигналов неоднородных молекул олигосахаридов сердцевины, являющихся одним из компонентов ЛПС. Различие молекул консервативных олигосахаридов сердцевины ЛПС, в соответствии с данным изобретением, обусловлено нестехиометрическим замещением фосфатными группами, фосфоэтаноламином и остатками сахаров;
- идентификация грамотрицательных бактерий осуществляется путем сравнения профиля эндотоксина, полученного от исследуемого бактериального образца, с эталонными профилями эндотоксинов, занесенных в базу данных.
Данный способ позволяет осуществлять дифференциацию R форм (не содержащие О-антиген) и S форм грамотрицательных бактерий по спектральным сигналам, полученным от олигосахаридов сердцевины ЛПС и липоолигосахаридов (ЛОС), а также внутривидовую дифференциация штаммов грамотрицательных бактерий на уровне хемотипов.
Недостатком прототипа является то, что
- режим отрицательной ионизации MALDI-TOF масс-спектрометрометра не позволяет получать профили полисахаридного компонента ЛПС в спектрах грамотрицательных бактерий, а именно повторяющихся олигосахаридных субъединиц О-антигена, ответственного за серологическую специфичность;
- проводить идентификацию бактерий на уровне сероваров.
Настоящее изобретение относится к идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, а более конкретно к типированию сероваров бактерий рода Leptospira, которое основано на распознавании О-антигенов, представляющих собой боковые полисахаридные цепи ЛПС клеточных стенок бактерий и состоящих из повторяющихся специфических олигосахаридных субъединиц, которые содержат от 3-х до 6-ти сахаров. Применение данного изобретения позволит расширить круг задач решаемых с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии в области микробиологии, а именно быстрого проведения серотипирования штаммов лептоспир, выделенных от больных лептоспирозом людей и инфицированных животных без использования трудоемких классических серологических методов, что в конечном итоге будет способствовать повышению эффективности эпидемиологического мониторинга заболеваемости лептоспирозом.
Сущность изобретения заключается в получении и анализе спектральных профилей бактерий рода Leptospira, получаемых MALDI-TOF масс-спектрометрией целых бактериальных клеток, нанесенных на MALDI пластину с использованием 2,5-дигидробензойной кислоты в качестве матрицы, в линейном положительном режиме работы спектрометра в диапазоне соотношения масса/заряд 600-6000 Дальтон. Заявляемое изобретение отличается от прототипа тем, что предусматривает определение значений молекулярных масс ионов, повторяющихся О-специфических субъединиц полисахаридных цепей ЛПС, в спектрах референсных штаммов лептоспир в качестве критерия идентификации сероваров. Способ включает в себя приготовление бактериальной пробы для MALDI-TOF масс-спектрометрии, получение спектральных профилей образцов, определение значений молекулярных масс повторяющихся субъединиц в спектральных профилях референсных штаммов лептоспир и идентификацию сероваров изолятов путем сопоставления молекулярных масс субъединиц в их спектральных профилях с таковыми у референсных штаммов. Методика идентификации сероваров бактерий рода Leptospira с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии заключается в следующем:
- образец получают путем прямого нанесения пробы бактериальных клеток исследуемого штамма на MALDI мишень с последующим наслоением поверх пробы 1 мкл ДГБ матрицы, представляющей собой раствор 2,5-дигидробензойной кислоты концентрацией 20 мг/мл 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты в воде;
- образец подвергают спектрометрии в линейном положительном режиме работы MALDI-TOF масс-спектрометра, оснащенного ультрафиолетовым азотным лазером, в диапазоне соотношения масса/заряд 600-6000, соответствующем сигналам получаемых от ионов олигосахаридных субъединиц полисахаридов бактериальной клеточной поверхности;
- получают спектральный профиль образца, представляющий собой сумму ионов, полученных от 500-1000 лазерных вспышек, выполненных в разных местах одной и той же лунки MALDI мишени;
- анализируют полученный спектральный профиль и вычисляют значения молекулярных масс ионов повторяющихся О-специфических субъединиц для каждого образца. Величина молекулярной массы ионов повторяющихся О-специфических субъединиц (М), полученная от референсного штамма лептоспир, считается специфическим маркером серовара, к которому относится референсный штамм;
- идентификацию сероваров лептоспир, выделенных от больных людей, инфицированных животных и из окружающей среды, производят путем сопоставления и нахождения совпадающих значений молекулярных масс ионов повторяющихся О-специфических субъединиц в спектральном профиле исследуемого образца с величинами специфических маркеров сероваров М±1%, полученных от референсных штаммов.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на Фиг. 1 представлены профили масс-спектров четырех референсных штаммов Leptospira spp., относящихся к сероварам pomona (A), mozdoc (Б), castellon (В) и copenhageni (Г), с указанием расположения повторяющихся О-специфических олигосахаридных субъединиц и значений их молекулярных масс ионов для каждого серовара.
Фиг. 2 демонстрирует сравнение спектральных профилей повторяющихся субъединиц полисахаридных цепей О-антигенов у референсного штамма, относящегося к серовару grippotyphosa (А), и штамма, выделенного от больного (Б).
Фиг. 3 демонстрирует сравнение спектральных профилей повторяющихся субъединиц полисахаридных цепей О-антигенов у референсного штамма, относящегося к серовару canicola (А), и штамма, выделенного от собаки (Б).
Примеры вариантов осуществления заявляемого способа:
Пример 1. Определение величин молекулярной массы повторяющихся О-специфических олигосахаридных субъединиц в масс-спектрах референсных штаммов Leptospira spp., относящихся к сероварам pomona, mozdoc, castellon и copenhageni.
Клетки четырех референсных штаммов Leptospira spp. из коллекции Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера, используемых в РМА, выращенные в жидкой питательной среде с добавлением 5% сыворотки кролика при 28°С в течение не менее 14 суток, дважды отмывали от среды фосфатно-солевым буфером и деионизированной водой. Образцы клеток из осадков каждой культуры наносили на поверхность лунок 96-местной стальной MALDI мишени (Bruker Daltonik, Германия). После высыхания на образцы наслаивали по 1 мкл ДГБ матрицы. Масс-спектры образцов были получены в режиме положительных ионов спектрометра "Microflex LRF" (Bruker Daltonik, Германия) в диапазоне m/z от 600 до 6000 Да с помощью программного обеспечения "FlexControl" 3.3 (Bruker Daltonik, Германия). Анализ повторяющихся олигосахаридных субъединиц в полученных спектральных профилях и вычисление величин специфических маркеров сероваров осуществляли с помощью программного обеспечения "FlexAnalysis" 3.3. (Bruker Daltonik, Германия). В представленных спектрах (Фиг. 1) в диапазоне m/z от 600 до 6000 Да присутствовали ионы повторяющихся олигосахаридных субъединиц, происходящих от молекул полисахаридных О-антигенов, значения молекулярных масс которых различаются в зависимости от типа серовара. Так, величина специфического маркера серовара pomona (А) составила М=711 Да, что соответствует тетрасахаридной субъединице, для серовара mozdoc (Б) молекулярная масс олигосахаридной единицы составила М=567 Да, что соответствует молекуле трисахарида, а для сероваров castellon (В) и copenhageni (Г) величины М=1015 Да и М=1036 Да соответствуют гексасахарным субъединицам О-специфических полисахаридов.
Пример 2. Идентификация серовара штамма Leptospira spp., выделенного от больного лептоспирозом человека, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Спектральные профили образцов бактериальных клеток штамма, выделенного от больного, и референсного штамма, относящегося к серовару grippotyphosa, относительно которого предварительно был серотипирован изолят методом перекрестной агглютинации абсорбции, получали способом, описанным выше в Примере 1. На Фиг. 2 продемонстрировано сравнение спектральных профилей референсного штамма (А) и исследуемого штамма изолята (Б). На представленных спектрах видно, что молекулярная масса олигосахаридной единицы в спектре штамма изолята М=750,5 Да совпадает с величиной М=750±3,7 Да специфического маркера серовара grippotyphosa референсного штамма. Полученное значение молекулярных масс ионов соответствует тетрасахаридной структуре олигосахаридных субъединиц у серовара grippotyphosa.
Пример 3. Идентификация серовара штамма Leptospira spp., выделенного от инфицированной собаки, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Спектральные профили образцов бактериальных клеток штамма, выделенного от собаки, и референсного штамма, относящегося к серовару canicola, на уровне которого предварительно был серотипирован изолят методом перекрестной агглютинации абсорбции, получали способом, описанным выше в Примере 1. На Фиг. 3 продемонстрировано сравнение спектральных профилей референсного штамма (А) и исследуемого штамма изолята (Б). На представленных спектрах видно, что молекулярная масса олигосахаридной единицы в спектре штамма изолята М=926 Да совпадает с величиной М=929±4,6 Да специфического маркера серовара canicola референсного штамма. Полученное значение молекулярных масс ионов соответствует пентасахаридной структуре олигосахаридных субъединиц серовара canicola.
Сравнение измеренных значений молекулярных масс ионов повторяющихся субъединиц в масс-спектрах исследуемых образцов с величинами специфических маркеров сероваров референсных штаммов, которые служат в качестве эталонов (таблица 1), позволяет идентифицировать штаммы изолятов на уровне сероваров.
Claims (1)
- Способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira, включающий приготовление проб исследуемых штаммов на MALDI мишени, проведение MALDI-TOF масс-спектрометрии образцов штаммов изолятов и образцов референсных штаммов Leptospira spp., получение и анализ спектральных профилей образцов, идентификацию серовара исследуемого штамма, отличающийся тем, что приготовление проб осуществляют путем прямого нанесения целых бактериальных клеток на MALDI мишень с использованием в качестве матрицы 2,5-дигидробензойной кислоты, проводят спектрометрию в линейном положительном режиме работы MALDI-TOF масс-спектрометра в диапазоне соотношения масса/заряд 600-6000 Да, определяют значения молекулярных масс олигосахаридных субъединиц О-антигенов в спектрах референсных штаммов лептоспир, являющихся специфическими маркерами сероваров лептоспир, идентификацию серовара изолята осуществляют путем сопоставления значений молекулярных масс повторяющихся субъединиц в его спектральном профиле с таковыми у референсных штаммов и по совпадению значений молекулярных масс повторяющихся субъединиц делают вывод о принадлежности изолята к тому серовару, с величиной специфического маркера которого определено совпадение.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017102864A RU2661108C1 (ru) | 2017-01-27 | 2017-01-27 | Способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017102864A RU2661108C1 (ru) | 2017-01-27 | 2017-01-27 | Способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2661108C1 true RU2661108C1 (ru) | 2018-07-11 |
Family
ID=62916829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017102864A RU2661108C1 (ru) | 2017-01-27 | 2017-01-27 | Способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2661108C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7684934B2 (en) * | 2003-06-06 | 2010-03-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pattern recognition of whole cell mass spectra |
| RU2519650C2 (ru) * | 2008-10-31 | 2014-06-20 | Биомерьё, Инк. | Способы разделения, характеристики и(или) идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии |
-
2017
- 2017-01-27 RU RU2017102864A patent/RU2661108C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7684934B2 (en) * | 2003-06-06 | 2010-03-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pattern recognition of whole cell mass spectra |
| RU2519650C2 (ru) * | 2008-10-31 | 2014-06-20 | Биомерьё, Инк. | Способы разделения, характеристики и(или) идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ДЕМИДОВ Е.А. И ДР., "Применение МАЛДИ времяпролетной масс-спектрометрии для идентификации микроорганизмов".//Вавиловский журнал генетики и селекции, 2013, т.17, N4/1, с.758-764. * |
| ЗУЕВА Е.В. И ДР., "Типирование изолятов летоспир методом МАLDI-TOF масс-спектрометрии".//Инфекция и иммунитет, 2016, т.6, N3, с.254. * |
| ЗУЕВА Е.В. И ДР., "Типирование изолятов летоспир методом МАLDI-TOF масс-спектрометрии".//Инфекция и иммунитет, 2016, т.6, N3, с.254. ДЕМИДОВ Е.А. И ДР., "Применение МАЛДИ времяпролетной масс-спектрометрии для идентификации микроорганизмов".//Вавиловский журнал генетики и селекции, 2013, т.17, N4/1, с.758-764. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| De Carolis et al. | Application of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology | |
| Krásný et al. | Identification of bacteria using mass spectrometry techniques | |
| Rettinger et al. | Leptospira spp. strain identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene sequencing and multi locus sequence typing (MLST) | |
| Lartigue | Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for bacterial strain characterization | |
| JP5754742B2 (ja) | 質量分析によって少なくとも一つの微生物を特徴づける方法 | |
| US10774361B2 (en) | Microbe identification by mass spectrometry and infrared spectrometry | |
| CN106199003A (zh) | 基于飞行时间质谱原理的微生物肽质量指纹图谱库的构建方法 | |
| Dekker et al. | MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory | |
| Rams et al. | Phenotypic identification of Porphyromonas gingivalis validated with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry | |
| JP2012519479A (ja) | 液体培地中の病原菌の同定方法 | |
| US20170292142A1 (en) | Rapid Detection of Bacteria using Mass Spectrometric Analysis | |
| GB2480136A (en) | Method for the mass spectrometric detection of bacteria | |
| Barreiro et al. | Nonculture‐based identification of bacteria in milk by protein fingerprinting | |
| CN102520055A (zh) | 食品和动物产品常见致病菌的maldi-tof-ms数据库的构建方法 | |
| CN111239235A (zh) | 一种巴尔通体菌株maldi-tof ms的数据库建立方法和鉴定方法 | |
| Karamonová et al. | The potential of matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry for the identification of biogroups of Cronobacter sakazakii | |
| RU2661108C1 (ru) | Способ идентификации сероваров бактерий рода Leptospira методом MALDI-TOF масс-спектрометрии | |
| Gant et al. | Present and Future Perspectives on Mass Spectrometry for Clinical Microbiology | |
| CN103344695B (zh) | 钩端螺旋体快速质谱检测试剂盒 | |
| Zimmermann | Maldi‐ToF | |
| Afanas’ ev et al. | MALDI-ToF mass spectrometric analysis for the identification of plague, cholera, and tularemia causative agents | |
| El Behiry et al. | Phenotypical and mass spectral assessment methods for identification of some contagious mastitis pathogens | |
| CN116337986B (zh) | 一种基于maldi-tof ms的肯塔基沙门氏菌的快速鉴定方法 | |
| Tsuchida | Application of MALDI-TOF for bacterial identification | |
| Gudlavalleti et al. | Application of atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for rapid identification of Neisseria species |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200128 |