KR101380974B1 - 질량 분광법에 기반한 페니실륨 종들의 화학적 분류 방법 및 그 마커 - Google Patents

질량 분광법에 기반한 페니실륨 종들의 화학적 분류 방법 및 그 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질량 분광법에 기반한 페니실륨 종들의 화학적 분류 방법 및 그 마커에 관한 것이다.

Description

질량 분광법에 기반한 페니실륨 종들의 화학적 분류 방법 및 그 마커{Mass spectrometry based chemotaxonomic classification of Penicillium species and marker for chemotaxonomic classification of Penicillium species}
본 발명은 질량 분광법에 기반한 페니실륨 종들의 화학적 분류 방법 및 그 마커에 관한 것이다.
일반적으로 Penicillium은 전 세계적으로 200 종 이상의 분포를 나타내는 가장 잘 알려진 진균류 중에 하나이다. 한국에서는 약 60 종의 Penicillium이 발견되었고, 이 중에서 10 종이 식물의 저장 병과 관련이 있는 것으로 보고되었다. 저장된 과채류에서 분리된 주된 Penicillium 종들은 P. echinulatum, P. expansum, P. oxalicum, 및 P. solitum이고 그들은 양파, 사과, 배, 밀감류 과일과 같은 많은 과채류에 손해를 야기한다(Kim, J.H., Lee, W.H., Cheong, S.S., Choi, J.S., Ryu, J., Choi, Y.G., 2002. Identification and characteristics of Penicillium spp. isolated from postharvest decay of pear. Res. Plant Dis. 8, 107-112).
그러나 종들 간에 많은 변이가 있기 때문에 Penicillium 종들을 분류하는 것은 용이하지 않고 따라서 이들 종들의 명확한 동정을 가능하게 하는 시스템이 필요하다. 또 일부 식물 유래 Penicillium 종들은 식물 뿐만 아니라 곰팡이 독소인 patulin과 citrinin 같은 대사체를 생성하여 동물에게도 피해를 야기한다. 동물에게 피해를 야기하는 특정 종의 Penicillium의 능력은 여러 종들을 명확하게 분류하고 종 특이적인 대사체를 동정하는 것이 매우 중요하게 한다. 전통적인 Pencillium의 분류학적 분류는 이 방법이 Penicillium에 대해서는 명확하게 정의되지 않은 유성세대(teleomorphic) 상태 및 형태학적 기준과 같은 정보에 의존하기 때문에 어렵다.
Penicillium 종들을 분류하기 위하여, 대사체 프로파일링(화학적분류), DNA 지문분석(fingerprinting), 및 생리학적 및 형태학적 분석과 같은 여러 방법들이 사용되었다. 이 방법들 중에서, 화학적분류 즉 대사체 기반 분류 방법이 Ascomycota의 분화에서 큰 가치를 나타내었다(Hettick, J.M., Green, B.J., Buskirk, A.D., Kashon, M.L., Slaven, J.E., Janotka, E., Blachere, F.M., Schmechel, D., Beezhold, D.H., 2008. Discrimination of Penicillium isolates by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2555-2560).
비록 많은 연구자들이 대사체들과 분류학적 분화가 상관관계가 있을 수 있다는 것을 시사하였지만 Penicillium 종들에서 대사체 프로파일링 및 분류에 대해서는 거의 연구된 것이 없으며 특히 한국에서 식물체 유래된 Penicillium 종들에서는 그러한 연구가 없었다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 새로운 페니실륨을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 새로운 페니실륨을 동정하는 마커 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 페니실륨을 액체 크로마토그래피/전기 분무 이온화 탠덤 질량 분광법(LC-ESI-MS), 기체 크로마토그래피 이온 트랩 질량 분광법(GC-IT-MS) 및 다변량(multivariate) 통계 분석을 사용하여 대사체 프로파일에 기초하여 분류하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 페니실륨은 P. echinulatum, P. expansum, P. oxalicum, 및 P. solitum으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 종인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 페니실륨 균주를 액체 크로마토그래피/전기 분무 이온화 탠덤 질량 분광법(LC-ESI-MS), 기체 크로마토그래피 이온 트랩 질량 분광법(GC-IT-MS) 및 다변량(multivariate) 통계 분석을 사용하여 대사체 프로파일을 수행한 결과, 베르미쿠리디올(vermiculidiol), 멜레그린(meleagrin), 옥사린(oxaline), 그란디코린(glandicolin), 그란디코린 B, 및 세카로닉산(secalonic acid) D이 상대적으로 높게 검출되는 경우에 Penicillium oxalicum으로 동정하는 것을 특징으로 하는 페니실륨 균주를 분류하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 베르미쿠리디올(vermiculidiol), 멜레그린(meleagrin), 옥사린(oxaline), 그란디코린(glandicolin), 그란디코린 B, 및 세카로닉산(secalonic acid) D으로 구성된 Penicillium oxalicum 동정용 마커 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 페니실륨 균주를 액체 크로마토그래피/전기 분무 이온화 탠덤 질량 분광법(LC-ESI-MS), 기체 크로마토그래피 이온 트랩 질량 분광법(GC-IT-MS) 및 다변량(multivariate) 통계 분석을 사용하여 대사체 프로파일을 수행한 결과, 글루콘산(gluconic acid), 안드라스틴(andrastin) A, 안드라스틴 B, 및 안드라스틴 C, 및 채토그로보신(chaetoglobosin) C이 상대적으로 높게 검출되는 경우에 Penicillium expansum으로 동정하는 것을 특징으로 하는 페니실륨 균주를 분류하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 글루콘산(gluconic acid), 안드라스틴(andrastin) A, 안드라스틴 B, 및 안드라스틴 C, 및 채토그로보신(chaetoglobosin) C으로 구성된 Penicillium expansum 동정용 마커 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 페니실륨 균주를 액체 크로마토그래피/전기 분무 이온화 탠덤 질량 분광법(LC-ESI-MS), 기체 크로마토그래피 이온 트랩 질량 분광법(GC-IT-MS) 및 다변량(multivariate) 통계 분석을 사용하여 대사체 프로파일을 수행한 결과, 살리실산(salicylic acid), D-(+)-글루콘산(gluconic acid) δ-락톤(lactone), 글루콘산, D-갈락토스, 및 아라비노-헥손산(hexonic acid) γ-락톤이 상대적으로 높게 검출되는 경우에 Penicillium expansum으로 동정하는 것을 특징으로 하는 페니실륨 균주를 분류하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 살리실산(salicylic acid), D-(+)-글루콘산(gluconic acid) δ-락톤(lactone), 글루콘산, D-갈락토스, 및 아라비노-헥손산(hexonic acid) γ-락톤으로 구성된 Penicillium expansum 동정용 마커 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 4 Penicillium 종(17 균주)를 액체 크로마토그래피/전기 분무 이온화 탠덤 질량 분광법(LC-ESI-MS), 기체 크로마토그래피 이온 트랩 질량 분광법(GC-IT-MS) 및 다변량(multivariate) 통계 분석을 사용하여 대사체 프로파일(chemotaxonomy)에 기초하여 분류하였다.
LC-ESI-MS-기반 계통수(dendrogram)는 Penicillium oxalicum이 다른 3종으로부터 분리된다는 점에서 인터널 전사된 스페이서(internal transcribed spacer;ITS)-기반 계통수와 유사하였다. 게다가, vermiculidiol, meleagrin, oxaline, glandicolin A 및 B, 및 secalonic acid D는 부분 최소 자승 판별 분석(partial least squares discriminant analysis;PLS-DA)에 의하여 Penicillium 종들의 판별이 가능하게 하는 대사체로 동정되었다.
P. expansum, P. echinulatum, 및 P. solitum에 의하여 생성된 종 특이적인 대사체의 측정은 3 종이 서로 다르다는 것을 나타내었다. 반면에, GC-IT-MS-기반 계통수는 P. expansum이 다른 3종과 구별되게 명백하게 분류되었고 이 결과는 4 종의 항산화 활성과 상관관계가 있었다: P. expansum은 다른 3종보다 더 높은 래디컬 소거 활성(radical scavenging activity)을 가졌다. P. expansum에서 더 높은 양으로 생성된 대사체는 gluconic acid (12, 29, 33); andrastin A (16), B (15), 및 C (17); chaetoglobosin C (14), 일 군의 당(31, 32); 및 salicylic acid (28)이었다.
본 발명의 결과는 대사체 기반된 화학분류(chemotaxonomy)이 분류 방법 뿐만 아니라 종 특이적인 활성의 평가를 위한 도구로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
대사체 프로파일링의 기반한 Penicillium 종들의 화학적분류
4 종의 Penicillium 종들의 대사체들을 LC-ESI-MS 및 GC-IT-MS에 의하여 분석하였다. PLS-DA 스코어 도면이 그 종들이 대사체들에서 변이의 생성에 기반하여서 구분될 수 있다는 것을 시사하였다. PLS1 및 PLS2을 종들 사이의 차이를 육안화하기 위하여 선택하였고, 각각 LC-ESI-MS 및 GC-IT-MS 분석에서 24.7% 및 32.4%의 설명된 변이를 포함하였다(도 2).
계통발생수(phylogenetic tree)는 4 종과 17 균주들의 Penicillium에서 ITS1, 5.8 S, 및 ITS2 리보좀 DNA 서열의 기초하에 확립되었다(도 1A). 그 계통발생수는 두 특징적인 가지로 나누어졌고; 한 가지는 P. solitum, P. echinulatum, 및 P. expansum (subgenus Penicillium)을 포함하고 다른 가지는 P. oxalicum (subgenus Furcatum)으로 구성되었다.
대사체 플로파일에 대한 PLS-DA 스코어 도는 HCA에 의하여 나타내었다.LC-ESI-MS. 및 GC-IT-MS.기반 화학적분류 HCA를 사용하여 구축된 계통수를 도 1B 및 C에서 나타내었다.
그 LC-ESI-MS 기반 계통수는 ITS-기반 계통수와 유사한 패턴을 가졌다. 양 계통수에서, P. oxalicum를 다른 3종과 명확하게 구분되었다. 나머지 3 종 중에서, P.expansum는 다른 두 종들(P. echinulatum 및 P.solitum)과 구분되었고, P. echinulatum는 P. solitum와 구분되었다. GC-IT-MS 기반 계통수의 결과는 ITS-기반 계통수와 일치하지 않았다(도 1C). GC-IT.MS-기반 계통수에서, P.expansum는 다른 3 종들과 명확하게 구분되었고 본 발명자들은 GC-IT-MS 분석의 PLS-DA 스코어 도와 동일한 결과를 얻었다(도 2B).
여러 균주들에서 명확하게 분류된 2차 대사체의 동정
각 종들을 구분하는 변수를 결정하기 위하여 4 Penicillium 종들의 대사체 프로파일을 PLS-DA 모델에 의하여 분석하였다. LC-ESI-MS 기반된 계통수에 따른 각 군들에 의하여 구별된 대사체들을 LC-tandem-MS 및 Q-TOF MS 분석을 사용하여 동정하였다(표 2). 추정 화합물들의 MS/MS 패턴들을 MS 프론티어 소프트웨어 및 공개된 논문들로부터 가공적인 MS/MS 패턴과 매치되었다. 그 대사체들의 동위원소 패턴 및 정확한 MS를 추천된 화학적 조성물, i-Fit 값 (<1.0), 및 에러 ppm(<5.0)과 비교하였다. 그 i-Fit 값 및 에러 ppm은 각각 추정 화합물의 정확한 MS의 동위원소 패턴 및 에러 범위에 기초한다. 이들 두 값들을 타겟 화합물들을 동정하는데 사용할 수 있다. P. oxalicum 및 다른 세 종들(P. echinulatum, P. solitum, 및 P. expansum) 사이의 대사체 패턴을 PLS-DA (R2X=0.155, Q2=0.749)에 의하여 분석하였고 11 개의 현저하게 다른 대사체들을 선택하였다: vermiculidiol (8), meleagrin (6), oxaline (7), glandicolin A (5), glandicolin B (4), secalonic acid D (10)(도 3에서 나타낸 숫자로 기재된 화학적 구조에 해당하는 화합물들), 및 다섯개의 미동정된 대사체들.
P.expansum 및 다른 2 종(P. echinulatum 및 P. solitum) 사이에 PLS-DA에서, PLS-DA (R2X=0.12, Q2=0.824)에 의하여 구분된 그 대사체들은 gluconic acid (12); andrastin A (16), andrastin B (15), 및 andrastin C(17); chaetoglobosin C (14); 및 하나의 미동정된 대사체. Cyclopenol (18), phomopsolide D (20)이었고, 7 개의 미동정된 대사체들이 PLS-DA (R2X=0.115, Q2=0.758)에 의하여 P. echimulatum 및 P. solitum 사이에서 차이가 있었다.
PLS-DA에 의한 선택된 대사체들의 생성 및 동정은 표 3에 나타내었다. GC-IT-MS 기반 계통수에서, P. expansum 및 다른 3 종들(P. oxalicum, P.echinulatum, 및 P. solitum)을 PLS-DA (R2X=0.315, Q2=0.792)에 의하여 분석하였고, 구별된 대사체들을 여러 화합물들의 특성의 인 하우스 라이브러리를 사용하고 그들의 MS/MS 패턴과 매칭하여서 동정하였다.
본 발명자들은 salicylic acid(28), D-(+)-gluconic acid δ-lactone (29), L-gluconic acid, lactone (30),D-galactose (31), arabino-hexonic acid, γ-lactone (32), D-gluconic acid (33), 및 하나의 미동정된 대사체를 동정할 수 있었다. 세 종들인, P. oxalicum, P. echinulatum, 및 P. solitum은 한 군집에 포함될 수 있었고 이들 종들의 TICs는 GC-IT-MS 분석에서 유사하였다(데이터 도시 안 함).
Penicillium 종들의 추출물의 항산화 활성 및 대사체들의 생성
17 균주들의 Penicillium의 항산화 활성 및 대사체 기반된 계통수 사이의 관계를 결정하기 위하여, 4 종의 Penicillium의 추출물의 ABTS 자유기 소거 활성을 측정하였다(도 4). P. expansum의 자유기 소거 활성이 다른 3 종들의 것보다 현저하게 높았다. LC-ESI-MS 및 GC-IT-MS 데이터로부터 Penicillium 종들에 의하여 생성된 대사체들의 양을 각각 도 5A 및 B에서 나타내었다. 10 개의 화합물들이 다른 종들에서 보다 P. expansum에서 더 많은 양 생성되었다.
Figure 112012062049895-pat00001
표 1은 LC-IT-MS 및 UPLC-Q-TOF-MS 데이터에 기반한 페니실륨 종의 분류로부터 동정된 바이오마커를 나타낸 표임.
Figure 112012062049895-pat00002
표 2는 LC-IT-MS 및 UPLC-Q-TOF-MS에 의하여 분류와 관련된 페니실륨 종에 의한 바이오마커의 생산과 관련된 표임.
Figure 112012062049895-pat00003
표 3은 GC-IT-MS-기반 분류로부터 바이오마커의 동정을 나타낸 표이다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 대사체 기반된 계통수를 개재하였고 4 종의 Penicillium 종들의 항산화 활성이 부분적으로 대사체 기반 화학적분류와 일치한다는 것을 발견하였다. 본 발명의 이러한 결과들은 2차 대사체 기반된 화학적분류가 분류방법뿐만 아니라 종 특이적인 활성을 분석하는 방법으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 1은 (A) 리보좀 DNA 서열들의 ITS 부위의 인접 조이닝 분석으로부터 시사된 계통발생수. Penicillium 균주들에서 나타난 (B) LC-ESI-MS. 및 (C) GC-IT-MS 기반된 계보적 군집 분석(hierarchical clustering analysis;HCA)은 호모로고스 대사체 프로파일링에 의하여 그룹화하였다.
도 2는 Penicillium 종들의 LC-ESI-MS (A) 및 GC-IT-MS (B) 데이터세트로 유래한 부분 최소 자승 구분 분석(PLS-DA). 적색, P. expansum; 녹색,P. echinulatum;황색, P. oxalicum; 청색, P. solitum.
도 3은 Penicillium 종들에 의하여 생성된 구분되는 대사체들의 구조들이 LC-ESI-MS 기반된 분류와 관련이 있다는 것을 나타냄. 괄호 안에 화합물들의 숫자들은 표 1, 2 및 3에서 언급한 것과 동일하다.
도 4는 Penicillium 종들의 ABTS 자유기 소거 활성(%)을 나타냄. 1, P. oxalicum;2, P. expansum; 3, P. echinulatum; 및 4, P. solitum. 그 데이터들을 Duncan's 다중 범위 테스트를 수반하는 one-way ANOVA로 통계학적 유의성에 대해서 평가하였다. 다른 글자를 가지는 평균들 예를 들어, ‘a’ 또는‘b’는 통계적으로 다르다는 것이다.
도 5는 (A) LC-ESI-MS 및 (B) GC-IT-MS 분석에서 P. expansum에 의하여 생성된 주된 대사체들의 박스 및 휘스커 도. 1, P. oxalicum; 2, P. expansum; 3, P. echinulatum; 및 4, P.solitum. 그 데이터들을 Duncan's 다중 범위 테스트를 수반하는 one-way ANOVA로 통계학적 유의성에 대해서 평가하였다. 괄호 안에 화합물들의 숫자들은 표 1, 2 및 3에서 언급한 것과 동일하다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명에 사용된 HPLC-급 워터, 메탄올 및 acetonitrile은 Burdick and Jackson (Muskegon, MI, USA)으로부터 구입하였고. 몰트 추출물 아가(MEA)는 Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)으로부터 구입하였다. 분석 등급의 formic acid, pyridine, methoxyamine hydrochloride 및 N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
또 Penicillium 균주들은KACC (Korean Agricultural Culture Collection, 대한민국, 수원시)로부터 구입하였다. 모든 배양들은 MEA 상에서 28℃에서 유지하였다. 모든 Penicillium 균주들을 MEA 플레이트 상에서 3일간 배양하였고 어린 균사(직경 6 mm) 조각들을 새 MEA 플레이트 상에 위치시켰다. 17 균주들의 Penicillium을 배양 12일 후에 추출하였고 이들 균주들로부터 유래한 추출물들을 LC/GC-MS 및 UPLC-Q-TOF MS 분석에 사용하였다.
실시예 1: 진균류 대사체의 추출
Penicillium 추출물을 제조하기 위하여, 3 mL의 에틸 아세테이트를 네 개의 6-mm 아가 피스에 첨가한 후 9시간 동안 rotary shaker Q4를 사용하여 200 rpm에서 혼합하였다(Nielsen et al., 1999). 그 추출물을 증류하여서 건조하였고 다시 메탄올에 녹인 후 LC-ESI-MS 분광기에 주사하기 전에 일회용 0.45-μm polytetrafluoroethylene (PTFE) 필터를 사용하여 여과하였다.
LC-ESI-MS 분석에 사용된 추출물들을 증류하고 GC-IT-MS 분석을 위하여 유도체화하였다. 재건조된 샘플들을 100 μL의 methoxyamine hydro-chloride in pyridine (20 mg/mL)에서 녹인 후 30℃에서 90 분간 가열하였다. 다음, 10분 후, 100 μL의 BSTFA를 첨가한 후 샘플을 37℃에서 30분간 가열하였다. 최종적으로 그 산물들을 PTFE 필터를 통하여 여과하고 GC-IT-MS 분석에 사용하였다.
실시예 2: Penicillium 종 대사체의 분석
LC - ESI - MS 분석
액체 크로마토그래피 분석을 LC 펌프(Varian 212), 광다이오드 어레이 디텍터(ProStar 335) 및 오토 샘플러(ProStar 410)로 구성된 Varian 500MS ion trap mass spectrometer (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)에서 수행하였다. 그 LC 시스템은 100x2.0 mm 크기 및 3-μm 입자 크기를 측정하는 C18 컬럼을 갖추었다(Varian Inc., Palo Alto, CA, USA). binary 이동상은 0.1% formic acid (v/v)를 가지는 아세토나이트릴 및 워터로 구성되었다. 이동상의 초기 조건은 2분간 10% acetonitrile이었고, 구배는 28분 동안 점차적으로 100% acetonitrile로 증가시켰다. 구배는 100% acetonitrile에서 5분간 유지한 후 아세토나이트릴을 0.06분 동안 급격하게 감소시키고 5분 동안 10%에서 유지시켰다. 10 마이크로리터의 각 샘플을 주사하고 그 이동 속도를 0.2 mL/min에서 유지시켰다. ESI-MS를 100.1000 m/z 범위 내에서 네가티브 모드로 수행되었다. 런닝 파라미터는 다음과 같았다: 건조 온도, 350 ℃; 니들 전압, 5 kV; 모세관 전압, 70 V;건조 가스 압력(질소) 10 psi, 및 nebulizer 가스 압력(공기) 35 psi. 네가티브 및 포지티브 모드 MS 스캐닝에서 사용된 것과 동일한 조건에서 스캔 다입 터보 데이터 의존적인 스캐닝(DDS)를 사용하여 MSn 분석을 수행하였다.
UPLC -Q- TOF -MS( Ultra performance liquid chromatography quadruple time-of-flight mass spectrometry ) 분석
선택된 대사체의 분자량을 정확하게 측정하기 위하여, UPLC-Q-TOF-MS 분석을 UPLC Acquity 시스템을 가지는 Waters Micro-mass Q-TOF Premier(Waters, Milford,MA, USA)를 사용하여 수행하였다. UPLC 시스템은 100x2.1 mm 및 1.7 μm 입자 크기를 가지는 Acquity UPLC BEH C18 컬럼(Waters,Milford, MA, USA)을 포함하였다. 이동 상은 LC-ESI-MS 시스템에서 사용된 것의 변형된 버젼이었다. 이동 상의 초기 조건은 0.3분 동안 0% acetonitrile이었고, 구배는 3분 동안 30% acetonitrile로 점차적으로 증가시킨 후 40% acetonitrile로 1 분 동안 증가시킨 후 8분 동안 100% acetonitrile로 증가시켰다. 이동 상을 2분 동안 100% acetonitrile에서 유지시키고 2분 동안 0% acetonitrile을 수반하였다. 5 마이크로리터의 샘플을 주사하고 이동 속도를 0.3 mL/min에서 유지시켰다. 전자 스프레이 이온화를 100.1000 범위의 m/z 내에서 네가티브 및 포지티브 모드에서 수행하였다. 오퍼레이팅 파라미터는 다음과 같았다: 이온 소스 온도, 200 ℃; 콘 가스 속도, 50 L/h; 용해 가스 속도, 600 L/h; 모세관 전압, 2.8 kV; 및 콘 전압 35 V까지.
실시예 3: Penicillium 균주들의 추출물의 ABTS( azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ) diammonium salt ) 자유기 소거 활성
17 Penicillium 균주들로부터 유래한 각 추출물의 자유기 소거 활성을 Re et al. (Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice-Evans, C., 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 26, 1231.1237)에 기재된 것과 같은 프로토콜을 사용하여 측정하였다. ABTS 자유기 소거 활성을 결정하기 위하여, 7 mM ABTS (ammonium salt)을 0.15 M NaCl을 포함하는 0.1 M potassium phosphate 버퍼(pH 7.4)에서 녹인 후 2.45 mM potassium persulfate를 처리하였다. 그 청색-녹색 ABTS 자유기 용액의 농도는 734 nm에서 0.650±0.020 (평균±SD) 흡광도로 보정하였다.
20 μL의 각 조 추출물을 180 μL의 ABTS 자유기 용액에 첨가한 후, 그 샘플을 7분 동안 37℃에서 암 조건에서 배양하고 734 nm에서 흡광도 감소를 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek Instruments)를 사용하여 측정하였다. 대조군 샘플을 20 μL의 메탄올 및 180 μL의 ABTS 용액을 포함하였다. 그 결과를 Penicillium 균주들로부터 유래한 메탄올 추출물의 자유기 소거 활성의 퍼센트로 표현하였다. 통게적으로 유의적인 차이(p<0.05)를 Duncan's multiple-range 테스트를 사용하여 측정하였다. 모든 실험들을 3회 반복적으로 수행하였다.
실시예 4: 데이터 가공
LC-ESI-MS 데이터를 Varian MS Workstation 6.9 소프트웨어(Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. LC-ESI-MS 네가티브 모드 크로마토그램 raw 데이터 파일을 Vx Capture software 2.1 (Adron Systems LLC, Laporte, MN, USA)를 사용하여 네트위크 커먼 데이터 형태(netCDF, *.cdf)로 전환하였다. 그 netCDF 파일을 자동적으로 배열되고 MetAlign 소프트웨어 패키지(http:// www.metalign.nl) (Lommen, A., 2009. MetAlign: interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Anal. Chem. 81, 3079.3086. 438)를 사용하여 질량 분광기 데이터세트와 비교하였다. MetAlign 파라미터는 다음과 같이 세팅하였다;1.0의 피크 기울기 팩터, 2.0의 피크 역치 팩터, 15의 피크 역치 및 7.0의 절반 높이에서 평균 피크 넓이이고, 이것은 LC-MS에 대해서 100에서 1000의 질량 범위 및 2에서 35분의 정체 시간(retention time)에 해당된다. *.csv 파일 아웃풋은 정체 시간을 가지는 명목 질량 피크 강도 데이터를 포함하고 그 값은 다변량(multivariate) 분석을 위한 Excel 데이터 쉬트로 전달되었다.
실시예 5: 통계적 분석
다변량 통계 분석을 SIMCA-P+ 12.0 (Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 수행하였다. Log10-변환 MS 데이터를 통계 분석을 위한 unit variance (UV) 스케일링에 중심을 둔 평균이었다.
부분 최소 자승 구분 분석(partial least squares discriminant analysis;PLS-DA)을 Penicillium 균주들의 분포를 관찰하기 위하여 사용하였다. Hierarchical clustering analysis (HCA)을 호모로고스 대사체 프로파일링에 따라서 Penicillium 균주들을 그룹으로 나누었다. HCA를 사용하여 나누어지고 supervised PLS-DA에 의하여 분석된 두 군들을 도 2(B, C)에서 나타내었다. 포텐셜 변수들을 projection (VIP) 값들(VIP, >1.0) 및 p-value(p<0.05)에 중요한 변수에 기반하여 선택하였다. 대샤체 기반 계통수에 기반한 두 군들 사이의 p-값은 Stastistica 7 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA)를 사용하여 결정하였다. 대사체들의 생성은 유의적인 차이를 나타내었고 그것은 LC/GC-MS의 TIC(total ion chromatogram)에서 확인하였다. LC-ESI MS에 관련된 대사체들을 Dictionary of Natural Products 2008(Taylor & Francis, Boca Raton, FL, USA), Antibase 3.0 (CambrigeSoft Corporation, Cambridge, MA, USA), 및 공개된 논문에서 화합물들의 것과 이들 화합물에 대한 분자량, 정체 시간, UV 스펙트럼, MSn 절편 패턴 분석 및 고 해상 질량 데이터(Q-TOF-MS)들과 비교하여 동정하였다. GC-IT-MS-기반된 계통수에서 구별된 대사체들을 인 하우스 라이브러리, NIST(National Institute for Standards and Technology) Chemistry WebBook, 및 일부 표준 화합물들의 특성에서 화합물들에 대한 것들과 이들 화합물과 관련된 데이터를 비교하여 동정하였다. 각 대사체들의 MSn 절편 패턴을 Mass frontier 소프트웨어 4.0 (HighChem, Bratislava, Slovakia)를 사용하여 절편의 시물레이션화된 특성과 비교하였다.
실시예 6: 유전적 정보
Penicillium 종들의 리보좀 DNA의 ITS1, 5.8 S, 및 ITS2 부위에 대한 서열들을 KACC(Korean Agricultural Culture Collection; 대한민국)로부터 수집하였고 일부 알려지지 않은 균주 서열을 마크로젠(대한민국, 서울)에 의한 서비스에 의하여 수행되었다. 그 서열들을 배열하고 MEGA 4 (The center for evolutionary functional genomics the Biodesign Institute, Tempe, AZ, USA)에서 분석하였고, 계통발생수를 최대 composite likelihood를 가지는 인접 조이닝 알고리즘을 사용하여 추론하였다. 그 클러스터의 안정성을 1000 bootstrap 복제로 측정하였다. 계통발생수에서 거리는 DNA 서열 및 그 예측되는 진화 관계에서 차이로 나타내었다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 페니실륨 균주를 액체 크로마토그래피 바이너리 용매 전달 시스템, 포토다이오드 어레이 디텍터, 및 오토샘플러로 구성된 MS 이온-트랩 질량 분광기를 사용하여 분석하는 과정에서 페니실륨 균주의 대사체 샘플들을 C18 컬럼을 사용하여 크로마토그래피를 수행하며, 바이너리 이동상은 0.1% 포름산(v/v)를 가지는 아세토나이트릴 및 워터로 구성되며, 이동상의 초기 조건은 2분간 10% 아세토나이트릴이고, 구배는 28분 동안 점차적으로 100% 아세토나이트릴로 증가시키며, 구배는 100% 아세토나이트릴에서 5분간 유지한 후 아세토나이트릴을 0.06분 동안 감소시키고 5분 동안 10%에서 유지시키며, 이동 속도를 0.2 mL/분에서 유지시키며, ESI-MS를 100.1000 m/z 범위 내에서 네가티브 모드로 수행하고, 런닝 파라미터는 건조 온도, 350 ℃; 니들 전압, 5 kV; 모세관 전압, 70 V;건조 가스 압력(질소) 10 psi, 및 네뷸라이저 가스 압력 35 psi 조건에서 수행하며, 얻어진 질량 스텍트럼 데이터를 통한 대사체 프로파일을 수행한 결과, .베르미쿠리디올(vermiculidiol), 멜레그린(meleagrin), 옥사린(oxaline), 그란디코린(glandicolin), 그란디코린 B, 및 세카로닉산(secalonic acid) D이 검출되는 경우에 Penicillium oxalicum으로 동정하는 것을 특징으로 하는 페니실륨 균주를 분류하는 방법.
  3. 페니실륨 균주를 고분해능질량분석기/액체크로마토그래피를 사용하여 분석하는 과정에서 고분해능 액체크로마토그래피 C18 컬럼을 사용하며, 이동 상의 초기 조건은 0.3분 동안 0% 아세토나이트릴이고, 구배는 3분 동안 30% 아세토나이트릴로 점차적으로 증가시킨 후 40% 아세토나이트릴로 1 분 동안 증가시킨 후 8분 동안 100% 아세토나이트릴로 증가시키며, 이동 상을 2분 동안 100% 아세토나이트릴에서 유지시키고 2분 동안 0% 아세토나이트릴을 수반하며, 이동 속도를 0.3 mL/분에서 유지시키며, 전자 스프레이 이온화를 100.1000 범위의 m/z 내에서 네가티브 및 포지티브 모드에서 수행하며, 오퍼레이팅 파라미터는 이온 소스 온도, 200 ℃; 콘 가스 속도, 50 L/h; 용해 가스 속도, 600 L/h; 모세관 전압, 2.8 kV; 및 콘 전압 35 V까지인 조건에서 수행하며, 얻어진 질량 스텍트럼 데이터를 통한 대사체 프로파일을 수행한 결과, 글루콘산(gluconic acid), 안드라스틴(andrastin) A, 안드라스틴 B, 및 안드라스틴 C, 및 채토그로보신(chaetoglobosin) C이 검출되는 경우에 Penicillium expansum으로 동정하는 것을 특징으로 하는 페니실륨 균주를 분류하는 방법.
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