KR20040012854A - 미생물의 동정 방법 - Google Patents

Abstract

많은 미생물 종간의 구조적 유사성을 근거로 미생물의 용균물로부터 분리된 바이오마커의 질량분석법을 이용하여 미지의 미생물을 신속하게 동정하는 방법. 또한, 상기 바이오마커, 특히 Hsp60이 개시된다.

Description

미생물의 동정 방법 {Identifying micro-organisms}

세균 및 바이러스와 같은 잠복적인 병원성 유기체를 신속하게 동정할 수 있는 필요가 있는 많은 상황들이 있다. 현재의 실험 방법은 전형적으로 유기체를 배양하고 면역진단 시험의 이용, 또는 조직 검체의 준비 및 특정한 염색 및/또는 면역조직화학적 기술의 이용과 관계있다. 상기 기술들은 기껏해야 수시간, 유기체를 배양하여야 하는 경우는 수일을 요구한다. PCR과 같은, DNA-근거한 동정법도 감도가 보다 좋지만, 수시간을 필요로 하며 게다가 상당한 실험 설비 및 전문 기술을 요구한다.

특이적 폴리클로날 항혈청이나 모노클로날 항체를 이용하여 특이적 미생물을 동정하는 것이 표준 기술이다. 면역조직화학법은 조직에 존재하는 유기체의 동정을 가능케하며, 효소-연결된 면역흡착 검정법(ELISA)와 같은 기술은 체액중에서 병원체 또는 이들로부터 유래된 항원을 검출하는데 사용된다. 그러나, 다른 진단 기준(통상의 상황)에 의해 제시된 특정 병원체의 존재를 확인하는데만 사용되지 않는한, 상기 진단 기술은 일군의 상이한 특이적 항체의 사용을 요구하며 많은 잠재적 표적으로부터 특정 병원체의 동정에 대해서는 적절치 않다. 세포 성분의 면역친화성 정제법이 또한 본 분야에 잘 공지되어 있으나, 이는 보통 관련된 유기체의 정보를 요구하기 때문에, 일반적으로 동정 목적을 위해 유용한 기술이 될 수 없다.

미생물을 동정하기 위해 교차 반응 혈청의 사용은 전에 보고된 바 있다[참고 : Bonenberger et al., 2001]. 상기 경우는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 BCG 균주에 대한 폴리클로날 항혈청이 생검표본중에서 아주 다양한 미생물을 염색하기 위해서 사용되었다. 상기 기술은 개개의 특이적 유기체의 동정을 허용하지 않으나, 세균, 진균 및 원생생물 병원체의 범위를 속단위로 염색하였다.

최근 몇년동안에 질량분석법(MS)이 생물학적 용도에 점차 증가하여 사용되어 왔다. 새로운 개발로 인하여 커다란 생물학적 분자들을 분석할 수 있었다[참고 : Bakhtier and Tse, 2000]. 특히, 매트릭스-보조된 탈착 이온화(MALDI) 및 전자분무 MS가 이들의 비교적 약한 이온화 방법으로 단백질 검출에 특히 적절하다[참고 : Rowley et al., 2000]. 보다 최근에, 이온 트랩 MS의 도입도 특히 소량이 이용가능한 경우, 생물학적 분자의 혼합물을 분석하는데 필요한 시간을 단축하였다[참고 : Henderson et al., 1999].

WO 00/29987(Demirev /University of Maryland)에서는 미생물의 다양한 성분의 분자량을 측정하고 미생물을 동정하기 위해 데이터베이스를 탐색하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 다량의 정보를 처리해야 하고 유사한분자량의 많은 성분들을 서로 구별해야하는 단점을 갖고 있다. 유익한 바이오마커의 예비선별에 의해 질량분석법을 단순화하고자 한 시도는 없다.

WO 96/37777(Nelson et al)에서는 질량분석법을 이용한 항체/항원 분석물을 분석하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 당해 특허원의 목적은 특이적 항체 및/또는 항원의 유무를 결정하고, 존재하는 경우 그 양을 측정하는데 있다. 미지의 유기체를 정확히 동정하기 위해 사용될 수 있는 방법은 제안된 바 없다.

특이적 모노클로날 항체와 면역친화성 정제의 사용과 병용하여, MS는 많은 분자들의 구조적으로 상세한 지도화를 가능하게 하였다[참고 : Downard, 2000]. 특히, 분리된 분자의 MS 분석전에, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 관심있는 분자의 분석이, 예를 들어, 칼넥신과 같은 많은 단백질에 대하여 실시되어 왔다[참고 : Yamashita et al., 1999]. 일부 경우, 면역친화성에 의해 정제된 단백질은 이후에 규명된 펩티드의 세트를 생성하기 위해 효소 분해가 되고, 이어서 MS에 의해, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애의 Ty1 Gag 단백질이 분석된다[참고 : Yu et al., 1998]. Lacey 등(2001)은 트랜스페린의 이종성을 결정짓는 탄수화물 변형의 구조를 설정하기 위해 면역친화성 정제에 이어서 MS 분석법에 의해서 트랜스페린의 동종형의 분석을 보고한다. 그러나, 상기는 동일한 아미노산 서열을 분자에 결합하는 특이적 항-트랜스페린 폴리클로날 항체의 사용을 포함한다. 분자들간의 차이는 당단백질의 탄수화물 부분내에 존재하였고 항체는 교차반응하지 않았다.

공통적인 구조적 특징을 수반하는 분자들의 친화성 정제는 고정된 항체외의 다른 리간드로 실시할 수 있으며 본 분야에 널리 공지된 기술이다. Bundy 및 Fenselau(2001)은 다양한 미생물로부터 다양한 탄수화물 복합체를 포획하기 위하여렉틴 및 렉틴 분자를 발현하는 세균을 포획하기 위하여 규명된 탄수화물 모두의 사용을 보고한다. 이후에 포획된 분자 또는 산 가수분해에 의해 이로부터 유래된 펩티드는 MS에 의해 분석되었다. 비록 이들이 후속 MS 분석을 위해 다양한 분자를 포획하기 위해 사용된 일반적인 리간드로서 기술될 수 있을지라도, 상기 방법은 미지의 유기체를 동정하는데 사용된 것이 아니다. 상기 응용을 위해 적합한 바이오마커의 선별은 없었다. 상기 바이오마커가 어떻게 동정될 것인가에 관하여 어떠한 교시도 없다. 제안된 리간드가 특이적 바이오마커의 정제를 가능케하기에 충분한 특이성을 갖거나 사용된 바이오마커가 본 발명에서 요구되는 유기체의 필요한 다양성을 따라 일관되게 존재한다는 제안도 없다. 바이오마커중 하나 또는 소규모 세트의 사용은 광범위한 미생물의 신속한 동정을 가능하게 할 수 있다는 제안도 없다.

비록 실험실 세팅에서 병원체의 보다 신속한 동정이 자체로 유리할 수 있을 지라도, 사람의 평상시 전염병 또는 동물 질환 모두와 생물학적 무기의 방어 조치의 일환으로 전시에서 사용될 수 있는 휴대용 야외 시스템이 추가적으로 필요하다. 이 점에 있어서, 페스트나 탄저균과 같은 병원체가 침략자에 의해 사용될 수 있으며, 전형적으로 에어로졸로 살포될 수 있다. 레이저 장비는 에어로졸의 존재를 검출하기 위해서 사용될 수 있으나, 이는 단순히 허위 무기로 살포된 물의 분무일 수 있다[참조 : Willeke and Baron, 1993]. 야외에서, 생물학적 무기일 것으로 추정되는 살포 물질의 정확한 동정을 신속히 할 수 있는 것이 필요하다. 이온 트랩 MS 기반으로 한 세균의 동정 방법이 전에 보고된 바 있다[참고 : Krishnamurthy etal., 1999]. 상기 경우에 역상 미세관 크로마토그래피에 의해 분리한 후, 완전한 세균은 직접 분석되고, 생성된 스펙트럼에 근거하여 순수하게 동정되었다. 비록 저자가 야외용으로서 장비의 소형화 가능성을 제시하고 있으나, 필요한 MS 분석법을 단순화하고 상기 분석법이 광범위한 유기체의 신속한 동정을 실용화할 수 있도록 하기 위해서 임의의 형태의 면역친화성 선별의 사용에 관한 제안은 없다. 게다가, 바이오마커로 사용하기 위한 특이적 단백질의 동정에 관하여 언급이 없고, MS 스펙트럼이 상이한 환경 조건에서 수득한 재현성에 관한 고려가 없다. 사용된 바이오마커를 특성화하지 않고서, 상기 기술은, 예를 들면, 이온화 특징에서 바이오마커의 행동에 일관성이 결여되기 쉬우며, 이는 추가로 신뢰성을 떨어뜨린다.

바이러스 단백질의 직접적인 MS 분석이 또한 보고된 바 있으나(WO 99/58727), 친화성 정제 또는 공통된 바이오마커의 사용이 제안되지 않았다. 또한 세균 세포 용균물의 MS 분석이 보고되었다[참고 : Chong et al., 1997]. 세균 샘플은 MALDI-TOF MS에 의한 분석이전에 구아니디늄 하이드로클로라이드 및 트리톤 X-100으로 용해되었다. 임의 형태의 친화성 정제도 사용되지 않았으며 그 목적은 미지의 유기체를 동정하는 것이 아니라, 대장균에서 단백질 합성을 유도하고 억제하는 것을 파악하는 것이었다.

본 발명은 세균과 같은 미생물의 신속한 동정 방법에 관한 것이다.

본 발명은 하기 도면을 참고로 하여, 실시예로서 기술될 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 방법을 이용한 시스템에서 작용 요소의 배치도이다.

도 2는 다양한 잠복적인인 병원성 세균으로부터의 Hsp60 단백질의 분자량을 비교한 그래프이다.

도 3은 프란시셀라 툴라렌시스 및 부르콜데리아 슈도말레이로부터의 재조합 Hsp60 단백질에 대한 모노클로날 IgG₁A57-E4의 결합 친화성의 간접 ELISA 측정치를 보여준다.

도 4는 브루셀라 아보르투스 및 스타필로코커스 에피더미디스의 HSp60 단백질의 Arg-C 분해물로부터 발생한 펩티드 지문의 그래프 비교이다.

도 5는 사람 Hsp60과 비교한 잠복적인 병원성 미생물의 범위로부터 아데닐 키나제의 분자량을 비교한 그래프이다.

본 발명은 미생물을 구성하는 다수의 단백질로부터 추출된 한개 이상의 단백질의 분자량을 결정함을 포함하는 미생물을 동정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 전형적으로 미생물을 구성하는 수천개의 모든 단백질에 대하여, 단백질의 비교적 아주 작은 선별, 하물며 한개 이하의 선별을 평가함으로써 동정할 수 있다는 발견을 기초로 한 것이다. 많은 단백질, 흔히 세포내에서 일부 산재해있고 생명 대사 기능을 수행하는 단백질이 광범위한 종들을 따라 고도로 구조적으로 보존되어 있음은 본 분야에서 널리 공지되어 있다. 상기 단백질이 공통된 대사 경로를 공유하는 상이한 종들에서 아주 유사한 기능을 수행한다는 사실은 기능적 특성이 의존하는 구조적 특징을 보존하기 위한 진화적 압력을 초래한다. 상기의 고도로 보존된 단백질은 당화(예, 트리오스 포스페이트 이소머라제) 및 뉴클레오타이드 대사(예, 아데닐레이트 키나제)와 같은 기본적인 세포 과정과 연관된 효소, DNA 폴리머라제 및 열 쇼크 단백질을 포함한다.

보존된 상기 단백질의 영역은 아미노산 서열에서 고도의 상동성을 보여준다. 결과적으로, 이들은 교차 반응하는 항체와 결합할 수 있는 공통된 면역학적 에피토프를 보유함으로써, 단일 모노클로날 항체가 다양한 종으로부터 상기 한 보존된 단백질의 임의의 계열을 동정하거나 분리하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우, 단일 항체가 그러한 널리 보존된 에피토프와 결합할 수 있으므로써 많은 종으로부터 단백질을 분리하는데 유용할 수 있다. 그러나, 많은 경우에 동일하거나 다른 단백질상의 상이한 에피토프와 결합하는 많은 상기 항체들은 동정가능한 종의 수를 최대화하고 미검출되어 잔존하는 미생물의 확률을 최소화하기 위해, 병합하여 사용될 수 있다. 놀랍게도, 그들의 고도로 보존된 구조에도 불구하고, 본 발명은 상기 단백질간의 작은 차이가 분자량의 정확한 결정에 의해서 유래되는 것으로부터 신속하고 일관된 동정을 허용한다는 것을 증명한다. 질량분석법으로 얻은 결과는 그들로부터 유래된 단백질 또는 펩티드사이의 단일 아미노산 차이를 쉽게 동정할 수 있다. 따라서, 공통된 에피토프를 갖는 고도로 보존된 단백질의 친화성 정제와 후속적으로 상기 단백질 또는 이들로부터 유래된 펩티드의 질량분석의 조합은 그들이 수득된 것으로부터의 미생물을 동정하는 신속하고 신뢰성 있는 방법의 기초를 형성할 수 있다. 상기 방법에 사용된 단백질 또는 다른 생물학적 분자들은 바이오마커로 공지되어 있다.

이 방법은 공지된 바이오마커의 정확한 분자량을 이들이 유래된 것으로부터의 종과 연루시킨, 바이오마커들의 데이터베이스의 이용성에 의해 좌우된다. 일부 경우, 한 종, 아종 또는 균주의 명백한 동정을 위한 하나 이상의 바이오마커를 사용할 필요가 있을 수 있다. 상기 데이터베이스는 일정 조건하에서 연관된 미생물을 성장시키고, 2D-겔 전기영동과 전체 미생물 세포 용균물에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 프로테옴(proteomes)을 지도화함으로써 생성된다. 하기 기준에 따라 선별된 관심있는 마커들은 신속하게 동정될 수 있고, 이들의 분자량은 질량분석법으로 정확하게 결정될 수 있으며, 분자량은 데이터베이스에 입력될 수 있다.

바이오마커의 선별에 중요한 인자는 이들의 질량이 세포주기와 같은 가변 인자 또는 온도 또는 영양분 이용성과 같은 성장 조건과 무관하게 일정하여야 한다는 것이다. 상기는 조건들이 연관된 유기체에 대해 전혀 최상이지 않은 환경하에서, 생물학적 무기와 같은 미생물, 및 유전자 발현 또는 해독후 변형의 패턴에 변화를 줄 수 있는 스트레스에 반응하는 미생물의 동정과 특히 연관이 있다. 따라서 비록인산화, 지질화 또는 리보실화와 같은 변형이 알려져 있고 일관된 것인 경우, 동정을 위한 상기 분자의 사용을 배제하지 않더라도, 그들이 일시적으로 상기와 같은 변형에 의해 변형되지 않는것이 바람직하다. 바이오마커는 또한 모든 조건에서, 동정을 실현하기에 충분히 많은 양으로 추출하고 분리하기에 충분히 높은 수준으로, 항상 발현되어야 한다.

상기를 고려하여, 열 쇼크 단백질(Hsp) 분자 계열이 특히 적합한 바이오마커이다. Hsp60과 같은 분자는 종간에 고도로 보존되어 있고, 해독후 변형되지 않으며 일관되고 산재하여 발현된다. 사실, 이들의 발현은, 세포의 스트레스와 연관이 있기 때문에, 유기체가 차선의 환경 조건에 있을 경우 증가된다. 보조-샤페로닌 Hsp10(GroES)와 함께 Hsp60(GroEL, 샤페로닌)은 정확한 삼차 구조로의 미성숙 폴리펩티드의 ATP-의존, 해독후 폴딩뿐만 아니라 정확한 천연 형태로 비-천연 단백질의 재폴딩에 연루되어 있다[참고 : Sigler et al., 1998].

미생물의 한 범위로부터 적절한 바이오마커를 분리하기 위해 교차 반응하는 항체의 사용에 부가하여, 다른 리간드는 상기 바이오마커의 친화성 포획을 위해 사용될 수 있다. 렉틴은 탄수화물 변형에서 특이적 구조 특징을 수반하는 당지질의 당단백질을 포획하기 위해 사용될 수 있다. 고정된 핵산은 DNA-결합 단백질을 포획하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 사용된 리간드에 따라, 일반적인 DNA-결합 단백질(예, 폴리머라제)이거나 서열-특이적 결합 단백질(예, 전사 인자 또는 제한 엔도뉴클레아제)일 수 있다. 또한 고정된 RNA 압타머 및 리보자임은 특이적 표적 구조를 결합하기 위해 사용될 수 있다[참고 : Hoffman et al., 2001]. 합성 염료리간드는 보조인자 결합 포켓과 같은 공통된 구조 특징을 공유한 다양한 분자와 결합할 수 있다[참조: Affinity Chromatography: principles and methods, Pharmacia LKB Biotechnology, 1988]. 한 예로서, Cibacron Blue F3G-A는 다양한 NAD 또는 NADP-요구 효소 및 본 발명에서 유용한 보존된 바이오마커인, 아데닐레이트 키나제와 같은 아데닐릴 기질에 대해 특이성을 갖는 효소와 결합한다.

교차반응하는 항체 또는 일부 다른 일반적인 결합 리간드를 이용하여 세포 용균물로부터 하나 이상의 고도로 보존된 바이오마커의 면역친화성 정제 후 이어서 사용된 하나 이상의 바이오마커를 질량 분광 분석, 바람직하게는 데이터베이스를 참고로 하여 이온 트랩 질량분석법에 의한 조합은 다양한 용도에서 미생물을 동정하는 신속하고, 신뢰성 있으며, 재생가능한 방법을 제공한다.

대안적 양태에서, 포획된 바이오마커는 사용된 효소 및 기록된 종들로부터의 후보 분자의 공지된 아미노산 서열과 일치하는 펩티드의 예상가능한 세트를 생산하기 위해서 효소적으로 분해될 수 있다. 생산된 질량 스펙트럼은 이들의 기원이 되는 바이오마커의 특징적인 지문이며 연관된 유기체의 동정을 위한 데이터베이스와 교차참조될 수 있다. 고정된 효소의 사용은 자동화 공정을 단순화하고 또한 분석하고자 하는 펩티드 혼합물에 존재하는 효소 분자의 복잡성을 줄이는 편리한 방법이다.

생물학적 교전에 대한 역-측정 용도의 경우, 세포를 농축하고 용균시켜서 환경을 샘플링하고, 관심있는 바이오마커(들)를 친화성 정제하며, 상기 바이오마커를 용출하고, 이들을 질량분석기로 옮기며, 수득된 질량 스펙트럼을 기록하고, 스펙트럼을 데이터베이스에서 최적으로 일치시키며, 마지막으로 이 정보를 검출된 유기체의 동정을 수득하기 위해 교차-참고하는 전체 과정이, 휴대용 유니트에서 자동화할 것으로 예상된다. 포획된 바이오마커의 효소적 분해와 같은 추가 단계는 목적하는 동정이 첫번째 분석으로부터 얻어지지 않는 경우 자동적으로 사용될 것이다. 친화성 정제 단계로부터 최초 용출물의 비율은 상기 목적을 위해 유지될 것이다. 정확한 사용에 따라, 궁극적인 판독이 유기체 또는 이의 균주의 정확한 동정이 될 수 있다. 교전에서 사용하는 경우, 간단하게 "안전" 또는 "불안전" 판독이 적절할 수 있다.

추가적 자동 유니트가 다른 용도를 위해 고안될 수 있다. 예를 들면, 병원 및 실험실용으로서 혈액 또는 조직 샘플의 분석을 위한 벤치-탑 유니트.

따라서, 본 발명은 둘 이상의 미생물 속에 속하는 종중 다수종으로부터 유래된 바이오마커의 종 상동체가 실질적으로 구조적으로 유사하여, 상기의 구조적 유사성이 미생물의 상이한 종으로부터 상기 바이오마커의 분리를 가능케하며 상기 속에 속하는 미생물의 각 종으로부터 유래된 각 바이오마커가 특정 분자량을 가짐을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다.

바람직하게는, 상기 바이오마커는 단백질이고 상기 구조적 유사성이 아미노산 서열의 실질적인 유사성으로 이루어짐을 특징으로 한다. 또한 상기 미생물은 세균인 것이 바람직하다.

바람직하게는, 상기 바이오마커는 적어도 3 종의 상동체가 면역친화성 크로마토그래피에 의한 분리를 허용하는 한개 이상의 공통된 에피토프를 공유함을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 한개 이상의 공통된 에피토프가 5 종 이상에 의해 공유된다. 더 더욱 바람직하게는, 바이오마커는 열 쇼크 단백질이며, 가장 바람직하게는 Hsp60이다.

대안적으로는, 상기 바이오마커는 아데닐레이트 키나제일 수 있다.

또한, (a) 둘 이상의 미생물 속에 속하는 종중 다수종으로부터 유래된 바이오마커의 종 상동체가 실질적으로 구조적으로 유사하여, 상기 구조적 유사성이 미생물의 상이한 종으로부터 상기 바이오마커의 분리를 가능케하며 상기 속에 속하는 미생물의 각 종으로부터 유래된 각 바이오마커가 특정 분자량을 가짐을 특징으로 하는 바이오마커를 동정하는 단계,

(b) 상기 바이오마커를 구조적 유사성의 영역에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계,

(c) 상기 바이오마커의 분자량을 질량분석법에 의해 측정하는 단계,

(d) 데이터베이스를 참고로 하여 수득한 분자량 데이터의 조합을 분석하고 그럼으로써 존재하는 미생물의 종을 유추하는 단계를 포함하는 미생물의 동정 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 바이오마커는 세포 용균물로부터 분리된다.

더욱 바람직하게는, 상기 바이오마커는 면역친화성 크로마토그래피를 이용하여, 가장 바람직하게는 다양한 미생물 종으로부터 유래된 마커 분자상에 존재하는 교차 반응하는 에피토프와 특이적으로 결합하는 고정된 항체에 의해 분리된다.

대안적으로, 상기 방법은 분자량을 질량분광기에 의해서 결정하기 전에 분리된 바이오마커를 규정된 단편으로 절단하는 부가적 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 바이오마커의 상기 절단은 효소적 분해를 이용하여 달성된다.

바람직하게는, 바이오마커 또는 이의 단편의 분자량의 측정은 이온 트랩 질량분석법을 이용한다.

또한, (a) 한개 이상의 독소를 친화성 크로마토그래피로 분리하는 단계,

(b) 상기 독소(들)의 분자량을 질량분석법으로 측정하는 단계, 및

(c) 데이터베이스를 참고로 하여 수득한 분자량 데이터의 조합을 분석하고, 그럼으로써 존재하는 독소(들)의 실체를 유추하는 단계를 포함하는, 거대분자 독소의 동정 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 (a) 상기 바이오마커 또는 독소를 분리하는 수단,

(b) 상기 바이오마커 또는 독소의 분자량을 결정할 수 있는 질량분석기를 포함한 유니트,

(c) 수득한 데이터를 공지된 분자량의 데이터베이스와 정합시키고, 그럼으로써 검출된 미생물 또는 독소의 실체를 유추할 수 있는 데이터 처리 도구를 포함하는, 상기 방법 중 어느 것의 자동 수행을 위한 장치를 포함한다.

대안적으로는, 상기 장치는 추가로 상기 바이오마커를 절단할 수 있는 하나 이상의 고정된 단백질분해 효소를 포함한 유니트를 포함한다.

정의

본원에 사용된 용어 "바이오마커"는 그의 검출 또는 정량이 잠재적 생물학적위험을 동정하는 수단으로서 사용될 수 있는 환경적인 생화학적 변수를 의미한다. 상기 경우에서, 이는 구체적으로, 광범위한 미생물로부터 분리될 수 있고 상기 미생물을 동정하는데 사용될 수 있는, 단백질을 포함한 구조적으로 보존된 생물학적 거대분자를 특이적으로 지침한다.

본원에 사용된 용어 "친화성 크로마토그래피"는 "정제될 분자가 불용성 지지체상(매트릭스)에 고정된 상보적인 결합 물질(리간드)에 의해 특이적으로 및 가역적으로 흡착되는 흡착 크로마토그래피의 한 유형"을 의미한다[참조: Affinity Chromatography: principles and methods, Pharmacia LKB Biotechnology, 1988].

본원에 사용된 용어 "면역친화성 크로마토그래피"는 고정된 리간드가 항체 또는 이의 에피토프-결합 유도체인 친화성 크로마토그래피의 한 형태를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "종 상동체"는 상이한 종으로부터의 균등한 유전자 또는 유전자 산물을 의미한다. 상기 상동체는 균등한 기능을 수행하며 아미노산 수준에서 어느 정도의 서열 유사성을 공유한다. 본원에서, 연관된 유기체사이에 진화적 관계는 가정되지 않았다.

실시예 1 자동 샘플링 및 동정 시스템

도 1을 참고로 하여, 진공 장치(도시되지 않음)는 병원성 세균을 함유할 것으로 예상되는 에어로졸의 샘플을 포획하기 위해 사용된다. 담체 액체와 혼합된 에어로졸 및 현탁액은 샘플러(2)를 경유하여 시스템(1)에 주입된다. 여기로부터, 현탁액은, 초음파가 현탁액중의 모든 세균의 세포벽을 분쇄하며, 그럼으로써 세균의 구성 단백질이 용균물로 방출되도록 하기 위해 사용되는 초음파기(4)에 전달된다. 불가피하게, 용균물은 또한 파편을 함유할 것이며, 초음파기(4)의 하류는 필터(5)가 위치하여, 불필요한 물질의 통과를 방지한다. 일부 경우, 용균이 면역친화 단계의 흐름을 방해해서는 안될지라도, 세정제의 사용으로 개선될 수 있을 것이다. 적합한 순한 비이온성 세정제가 본 분야에 널리 공지되어 있고 폴리옥시에틸렌-계 세정제(예, 트리톤 X-100 및 X-114, Nonidet P40 및 Brij 계열) 및 n-옥틸α-D-글루코피라노사이드가 포함된다.

이어서 현탁액에 존재하는 경우 하나 이상의 세균 바이오마커가 분리되는 면역친화성 모듈(6)이 위치한다. 모듈(6)내에는 상기 바이오마커(들)에 대해 특이적인 하나 이상의 고정된 항체가 존재한다. 그럼으로써 통과하는 용균물중의 바이오마커는 결합하는 한편, 남은 액체는 통과하고 버려진다. 상기 단계는 연관된 바이오마커를 분리할뿐만 아니라, 아주 묽은 용균물일 수 있는 것으로부터 이들을 효과적으로 농축시킨다. 용균물을 통해 세척한 후, 용출 완충액의 소량을 유니트에 적용하여, 결합된 바이오마커를 제거한다.

방출된 바이오마커는 탈염기(8)로 전달되고 바이오마커는 탈염된 후 개개 분자량이 결정되는 이온 트랩 질량분석기(10)를 통과된다. 수득한 분자량의 조합은 이후의 임의의 정합을 동정할 수 있도록 세균에 있어서의 관련 바이오마커의 분자량에 대한 데이터베이스와 교차-참고된다. 결과는 특이적 동정일 수 있거나 작동자에게 상기 영역이 "안전"이거나 "불안전"이며 적절한 보호 조치의 필요성이 간단히통고될 수 있다.

바이오마커 단백질이 개별 분석을 위해 지나치게 큰 경우, 용출된 단백질은 단백질은 효소 분해기(12)를 경유하여 이들의 아미노산 서열에서 예측가능한 지점에서 절단되며 생성된 펩티드가 분석되는 탈염기(8)로 이송될 수 있다. 생산된 펩티드 분자량의 패턴은 상기 예상된 펩티드의 데이터베이스와 비교되는 경우 진단적이다(참조: 실시예 3).

실시예 2 잠복적인 병원성 세균을 동정하기 위한 바이오마커로서의 Hsp60의 용도

광범위한 유기체로부터의 Hsp60의 평균분자량은 (존재하는 이소토프의 혼합물에 대해 교정된) 공지된 아미노산 서열로부터 상당한 정도의 정밀도로 예상될 수 있고 적절히 정제된 재조합 단백질을 사용하여 직접 측정할 수 있다. 비록 Hsp60이 단지 세균만이 아니고 많은 종에서 고도로 보존되고 있지만, 질량분석법은 고도로 정밀하게 질량을 측정하여 3의 질량 단위의 적은 정도로 상이한 단백질 분자들까지 구별해 준다. 상기와 같은 측정치와 공지된 값의 데이터베이스의 비교는, 표 1에 수록된 바와 같이 관련된 종의 동정을 허용한다.

Hsp60 Mr	세균
58015.3 Da	클라미디아 트라코마티스
57301.7 Da	프란시셀라 툴라렌시스
57154.8 Da	살모넬라 타이피뮤리움
56757.3 Da	부르콜데리아 슈도말레이

도 2는 광범위한 유기체의 Hsp60 분자량을 비교한 그래프이며, 많은 종들이 질량분석기로 측정된 바와 같이 Hsp60 분자량을 근거로 순수히 동정될 수 있음을 증명한다.

그러나, 일부 유사한 질량으로 혼동을 일으킬 수 있는 다른 단백질들의 배경을 줄이기 위하여, 관련된 바이오마커의 친화성 정제가 바람직하다. Hsp60의 경우, 교차반응하는 항체를 이용하여 세포 용균물로부터 단백질을 면역친화성 정제하는 것이 가능하다. 예로서, 모노클로날 항체 A57-E4(Affinity Bioreagents Inc.)는 보르데텔라 페르투시스, 부르콜데리아 세파시아, 부르콜데리아 슈도말레이, 클라마이디아 트라코마티스, 클라마이도필라 뉴모니애, 클라마이도필라 시타시, 콕시엘라 부르네티, 헤모필루스 인플루엔자, 에쉐리키아 콜라, 플란시셀라 툴라렌시스, 클렙시엘라 뉴모니애, 레지오넬라 뉴모필라, 나이세리아 메닝지티디스, 슈도모나스 아에루지노사, 살모넬라 타이피, 비브리오 콜레라, 예르시니아 엔테로콜리티카를 포함한, 많은 잠복적인 병원성 유기체의 Hsp60에 존재하는 직선상 에피토프 RGIDKA와 결합한다.

따라서 상기 항체의 사용은 광범위한 잠복적인 병원체로부터 Hsp60의 정제 및 이들 병원체의 동정을 가능케 한다. 프란시셀라 툴라렌시스 및 부르콜데리아 슈도말레이의 Hsp60 단백질에 대한 상기 항체의 결합은 도 3에 도시된 바와 같이 표준 색체계 간접 ELISA에 의해 검증 및 정량되었다.

500 미만 분자량의 펩티드 배제.

* 동위원소로 교정된 평균질량 (M+H)

500 미만 분자량의 펩티드 배제.

* 동위원소로 교정된 평균질량 (M+H)

실시예 3 트립신 분해에 의해 Hsp60으로부터 유래된 Hsp60 펩티드 지도

상기 표 2 및 표 3에 수록된 바와 같이, 유사한 총 분자량의 밀접하게 연관된 Hsp60 단백질들의 효소적 분해는 질량분석법에 의해 나타낼 수 있는 펩티드의 독특한 패턴을 산출한다. 트립신은 펩티드를 아르기닌과 라이신 잔기의 카르복실-펩티드 연결 지점에서 절단한다(후속 잔기가 프롤린인 경우는 제외). 0.01%의 분자량 정밀도를 허용하는, 소수 펩티드들은 너무 유사하여 구별이 곤란하다(박스로표시된 부분). 다른 경우로서, 일부 아주 작은 펩티드는 동일한 조성을 공유하므로서 동일 분자량을 가지며, 단일 유리 아미노산이 절단으로부터 기인한다. 이 조차 허용하는, 각 펩티드 세트는 단백질의 기원이 되는 특이적 유기체를 진단하는 특정 지문을 구성한다.

실시예 4 브루셀라 아보르투스와 스타필로코커스 에피더미디스로부터 유래된 Arg-C Hsp60 펩티드의 비교

명칭 자체가 제시하는 것처럼, 엔도펩티다제 Arg-C(클로스트리페인)은 아르기닌의 카르복시-펩티드 결합을 절단한다. 도 4는 브루셀라 아보르투스와 스타필로코커스 에피더미디스로부터 Hsp60의 Arg-C 분해로부터 수득된 펩티드 지문을 비교한 그래프이다. 도 3에서 보는 바와 같이, 상기 유기체로부터 전체 Hsp60 단백질의 분자량은 유사하다(N-말단 메티오닌을 포함하여, 각각 57649 및 57529). 그러나, 수득된 펩티드 세트는 연관된 유기체에 대해 아주 독특하고 특징적이다.

실시예 5 진단 바이오마커로서의 아데닐레이트 키나제의 용도

도 5는 다양한 미생물(세균 및 원생생물 기생충 시스토조마 만소니)로부터 고도의 보존된 세포내 효소 아데닐레이트 키나제뿐만 아니라 사람 단백질의 분자량을 비교한 것이다. 아데닐레이트 키나제는 아데노신 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트사이의 가역적 포스포트랜스퍼라제 반응을 촉매하는 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제이다. 상기 효소는 다양한 세포 대사 과정뿐만 아니라 RNA와 DNA 합성에 필요한 뉴클레오타이드의 합성에 중요한 역할을 한다. 아데닐레이트 키나제는 종간에 고도로 보존되어 있고 각 종들은 분자량에 의해 구별되는 특정한 단백질을 갖고 있다는 점에서, 본 발명에 유용한 바이오마커의 기준을 충족한다. 상기 효소는 또한 일관되게 발현되며 대사에 필수적이다.

실시예 6 전자분무 질량분석법에 의한 전체 Hsp60 바이오마커의 분자량 측정으로부터 대장균의 동정

본 발명의 실례를 증명하기 위해, 전자분무 질량분석과 함께 항-Hsp60 면역친화성 컬럼은 하기와 같이 세균을 동정하기 위해서 사용되었다.

방법

항체 컬럼의 제조

리간드(모노클로날 항체 A57-E4 (Affinity Bioreagents Inc.))는 컬럼에 결합시키기 전에 0.2M NaHCO₃, 0.5M NaCl, pH 8.3 (결합 완충액)에 투석되었다. 최적 용적은 1 ml이고 최적 농도는 1 내지 10 mg/ml이엇다.

Fast Flow Hi-Trap 컬럼(Pharmacia Biotech)에서 1 ml NHS-활성화된 세파로즈 4가 사용되었다. 상기 컬럼은 3 x 2 ml 용적의 1 mM HCl로 저장 용액(이소프로판올)을 제거하기 위해서 세척되고, 유속은 매트릭스의 압축을 방지하기 위해 2초에 한 방울이하로 유지되었다. 컬럼에 리간드 용액이 주입되었고 30분 동안 실온에서 항온처리되었다. 컬럼은 0.5M 에탄올아민, 0.5M NaCl, pH 8.3(완충액 A) 및0.1M 아세테이트, 0.5M NaCl, pH 4.0(완충액 B)로 교대 세척(3 x 2 ml의 완충액 A, 3 x 2 ml의 완충액 B에 이어서 3 x 2 ml의 완충액 A)에 의해서 세척되고 불활성화되었다. 이후, 컬럼은 0.1 %(w/v) 나트륨 아지드가 함유된 포스페이트 완충액에서 평형화되고 저장되었다.

샘플 정제 방법

모든 샘플은 AKTA 프라임 시스템(Pharmacia Biotech)상의 NHS-활성화된 컬럼에 걸렸다. 샘플은 20 mM 인산나트륨 pH7.5에서 로딩되고 pH8.0 또는 pH2.0의 3M 요소에서 용출되었다. 1 ml의 샘플 용적은 샘플 루프를 통해 컬럼에 로딩되고 불순물은 5 ml의 인산염 완충액으로 세척되었다. 6 ml의 용출 완충액은 컬럼을 통해 이송되고 최초 1 ml의 완충액은 유동시켜 버리고 후속적으로 유동한 2 ml는 수거되어 전자분무 질량분석에 사용되었다. 컬럼은 다음 샘플의 제조를 위해 4 ml 인산염 완충액, 10 ml 3M 요소 및 이후에 10 ml 인산염 완충액으로 차례로 세척함으로써 재생되었다. 모든 단계의 유속은 1 ml/min이었다.

질량분석 실험 절차

면역친화성 컬럼으로부터의 용출물은 2 ml 분획으로 수거되고 4℃에 밤새 저장되었다. 샘플은 2 ml 홀딩 루프내로 주입되었다. 이후에 홀딩 루프의 내용물은 C8 카트리지(Hichrom)에 20%B(A=물중의 0.1% TFA; B=아세토니트릴/물 90/10중의 0.1% TFA)중에서 1 ml/min의 유속으로 로딩되었다. 완충염을 제거하기 위해서 세척 후 단백질은 25 ul/min의 유속으로 90%B를 사용하여 Quattro II 텐덤 사극 질량분석기(Micromass UK Ltd)로 용출되었다. 연속 방식으로 획득되었다. 스캔 범위는 스캔당 5s에서 m/z 700-2000이었다. 모세관 전압은 3kV이었고 콘 전압은 스캔된 m/z 범위에 걸쳐 33V로부터 74V로 올렸다. 소스 온도는 80℃였고 LM Res와 HM Res는 모두 15.5로 설정되었다. 카트리지로부터의 용출 피크는 지속시간이 약 1분이었다. 상기 장치는 말 심장 마이오글로빈을 사용하여 조정되었다.

결과

항체와 Hsp60 바이오마커의 교차반응성

도 6에 도시된 바와 같이, 표준 결합 검정은 많은 세균 종으로부터의 Hsp60이 클라미디아 트라코마티스 Hsp60에 대해 발생하고 보존된 에피토프(RGIDKA)와 결합하는 모노클로날 항체와 교차반응함을 증명한다. 결합 곡선은 상기 항체가 세균 종들로부터의 Hsp60 바이오마커의 면역정제에 적합하다는 것을 가리킨다.

분자량에 의한 대장균 Hsp60 K12의 동정

도 7은 질량 스펙트럼이 세균 단백질이 로딩된 항-Hsp60 면역친화성 컬럼으로부터의 용출물로부터 검출된다는 것을 보여준다. 57203.1 ±1.8 Da에 표시된 분자량 피크는 Bruland 등(1995)에 의해 보고된 대장균 K12 변이체로부터 유래된 Hsp60의 것과 일치한다. Swiss-Prot 데이터베이스 입력번호 P06130에 상세히 기재된, 표준 대장균 Hsp60 분자량은 57137 Da이다. 그러나, Bruland 등에 의해 보고된 변이체는 두개의 변이 A261L 및 1266M을 가지며, 이들은 함께 57197의 예상된 분자량을 제공한다. 이는 장치의 공지된 분자량 정밀도(±0.01%) 범위내 이며 유기체뿐만 아니라 개개 균주 및/또는 돌연변이체의 명백한 동정을 허용한다.

참고자료

Claims (17)

1. 둘 이상의 미생물 속에 속하는 종중 다수종으로부터 유래된 바이오마커의 종 상동체가 실질적으로 구조적으로 유사하여, 상기 구조적 유사성이 미생물의 상이한 종으로부터 상기 바이오마커의 분리를 가능케하며 상기 속에 속하는 미생물의 각 종으로부터 유래된 각 바이오마커가 특정 분자량을 가짐을 특징으로 하는 바이오마커.
2. 제1항에 있어서, 바이오마커가 단백질이고 구조적 유사성이 아미노산 서열의 실질적인 유사성으로 이루어짐을 특징으로 하는 바이오마커.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물이 세균임을 특징으로 하는 바이오마커.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 항에 있어서, 3개 종 이상의 상동체가 면역친화성 크로마토그래피에 의한 분리를 허용하는 한개 이상의 공통된 에피토프를 공유하는 것을 특징으로 하는 바이오마커.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 열 쇼크 단백질임을 특징으로 하는 바이오마커.
6. 제6항에 있어서, Hsp60임을 특징으로 하는 바이오마커.
7. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 아데닐레이트 키나제임을 특징으로 하는 바이오마커.
8. (a) 둘 이상의 미생물 속에 속하는 종중 다수종으로부터 유래된 바이오마커의 종 상동체가 실질적으로 구조적으로 유사하여, 상기 구조적 유사성이 미생물의 상이한 종으로부터 상기 바이오마커의 분리를 가능케하며 상기 속에 속하는 미생물의 각 종으로부터 유래된 각 바이오마커가 특정 분자량을 가짐을 특징으로 하는 바이오마커를 동정하는 단계,

   (b) 상기 바이오마커를 구조적 유사성의 영역에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계,

   (c) 상기 바이오마커의 분자량을 질량분석법에 의해 측정하는 단계,

   (d) 데이터베이스를 참고로 하여 수득한 분자량 데이터의 조합을 분석하고 그럼으로써 존재하는 미생물의 종을 유추하는 단계를 포함하는, 미생물의 동정 방법.
9. 제8항에 있어서, 바이오마커가 세포 용균물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 미생물의 동정 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 바이오마커가 면역친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리된 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 고정된 항체가 다양한 미생물 종으로부터 유래된 마커 분자상에 존재하는 교차반응성 에피토프와 특이적으로 결합하는 방법.
12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 질량분석법에 의해 분자량을 결정하기 전에 분리된 바이오마커를 규정된 단편으로 절단하는 추가의 단계에 의해 특징지워지는 방법.
13. 제12항에 있어서, 바이오마커의 절단이 효소 분해의 수단으로 달성됨을 특징으로 하는 방법.
14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커 또는 이의 단편의 분자량 측정이 이온 트랩 질량분석에 의해 달성되는 방법.
15. (a) 한개 이상의 독소를 친화성 크로마토그래피로 분리하는 단계,

    (b) 상기 독소(들)의 분자량을 질량분석법으로 측정하는 단계,

    (c) 데이터베이스를 참고로 하여 수득한 분자량 데이터의 조합을 분석하고 그럼으로써 존재하는 독소(들)의 실체를 유추하는 단계를 포함하는, 거대분자 독소의 동정 방법.
16. (a) 바이오마커 또는 독소를 분리하는 수단,

    (b) 상기 바이오마커 또는 독소의 분자량을 결정할 수 있는 질량분석기를 포함한 유니트,

    (c) 수득한 데이터를 공지된 분자량의 데이터베이스와 정합시키고, 그럼으로써 검출된 미생물 또는 독소의 실체를 유추할 수 있는 데이터 처리 도구를 포함하는, 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법의 자동 수행을 위한 장치.
17. 제11항에 따른, 바이오마커를 절단할 수 있는 한개 이상의 고정된 단백질분해 효소를 포함한 추가의 유니트를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.