JP4512745B2 - 細胞の分離、同定装置及び方法 - Google Patents
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(1) 電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの末端から順次排出される試料液とMALDI-MS法に用いるマトリックス溶液と接触させ混和させる手段、及び該混和された状態で試料液を断続的あるいは連続的に塗布するためのMALDI質量分析計用プレートを兼ねたサンプルプレートを有する装置を用いて、細胞の分離及び同定を行う方法であって、以下の工程からなる方法。
a)細胞混合物試料液を電気泳動用キャピラリーに導入する工程、
b)上記マトリックス溶液の溶媒が、細胞壁または細胞膜の一部または全部を破壊し、細胞内バイオマーカーの抽出を行う単一または複数種の混合溶媒であって、該マトリックス溶液と、キャピラリー電気泳動により分離され該キャピラリーの末端から細胞別に順次排出された細胞試料液とを混和させて、細胞別にバイオマーカーを抽出する工程、
c)上記マトリックス溶液と混和された状態の抽出されたバイオマーカーを含む試料液を上記サンプルプレート上に断続的あるいは連続的に塗布する工程、
d)サンプルプレート上の試料中のバイオマーカーをMALDI質量分析計により質量分析し、細胞を同定する工程。
(2) サンプルプレートが少なくとも表面導電性であることを特徴とする、上記(1)に記載の方法。
(3) 上記(1)に記載の装置が、サンプルプレートをXYの2軸方向あるいはさらにZ軸方向に位置制御する手段を有していることを特徴とする、上記(1)に記載の方法。
(4) 上記(1)に記載の装置が、MALDI-MS法に用いるマトリックス溶液導入口を有し、かつ内部に電気泳動用キャピラリーが貫通するコネクタと、コネクタ内部と連通し、該キャピラリー周囲を囲暁するように設けた上記マトリックス溶液供給用チューブを有することを特徴とする、上記(1)に記載の方法。
(5) 上記(1)に記載の装置が、キャピラリー途中に該キャピラリー中を移動する細胞の検出器を設け、該検出器の検出信号に基づき電気泳動用キャピラリーの開放端から排出する該細胞の排出時間を決定し、該排出時間にあわせてMALDI-MS法に用いるマトリックス溶液を供給する手段を有することを特徴とする上記(1)に記載の方法。
(6) 検出器がUV検出器あるいはLIF検出器であることを特徴とする、上記(5)に記載の方法。
(7) サンプルプレートと該電気泳動用キャピラリーの間にマトリックス溶液を送液して液滴を形成することにより、該キャピラリー内の泳動液と該サンプルプレートとを導通させ、電気泳動力により該サンプルプレート上に細胞試料液を連続あるいは断続的に排出させることを特徴とする、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
すなわち、本発明は、以下a)〜c)の工程により細胞を分離し、分取した細胞をd)の工程により同定する方法、並びにこのために使用する装置に関する。
a)細胞含有試料液を電気泳動用キャピラリーに導入する工程。
b)電気泳動用キャピラリーの開放端から排出する細胞試料液とMALDI-MS法に用いるマトリックス溶液とを接触させて混和する工程。
c)MALDI質量分析計用プレートを兼ねるサンプルプレートに上記マトリックス溶液と混和された状態で細胞試料液を断続的あるいは連続的に塗布する工程。
d)サンプルプレート上の塗布された試料をMALDI質量分析計により分析する工程。
本発明は、電気泳動により、分離された細胞をMALDI質量分析計により分析し、同定するが、この同定においては細胞内のバイオマーカー(ペプチド、タンパク質、脂質、糖質など)をMALDI-MS法により質量分析するため、MALDI質量分析に使用するマトリックスを可溶化し、マトリックスが結晶化するために十分な揮発性があることが要求される他、細胞を同定するために、さらに、細胞壁又は細胞膜の一部又は全部を破壊し、また細胞内バイオマーカー(ペプチド、タンパク質、脂質、糖質など)の抽出が可能であることが必要となる。
このような溶媒としては、例えばアセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、イソプロパノール等の溶媒が挙げられる。
本発明においては、単一の溶媒を使用しても良く、また、上記要件を満たすものであれば複数種混合した溶媒を使用しても良い。
また、該サンプルプレート上にあらかじめ揮発性有機溶媒(例えばアセトン等)に溶解したマトリックスを塗布しておいてもよい。この塗布面上に細胞溶出液を排出させることにより質量分析において感度のよい測定が可能となる。
MALDI-MS法及び装置は、上記したように、マトリックス・試料混合物にパルスレーザー照射し、生じた脱離イオンを、飛行時間型、四重極型、イオントラップ型、セクター型、フーリエ変換型、若しくはこれらの複合型からなる質量分離部により分離するものであり、本発明はこれらのいずれであっても使用できるが、これらの中では,パルスレーザー照射により生じたイオンのほぼ全てを質量分離及び検出し、かつ測定質量範囲に原理上制限のない飛行時間型が好ましい。
また、電界を形成する溶液としては、例えばTris緩衝液、HEPES緩衝液、Tris−ホウ酸−EDTA緩衝液、酢酸−酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸緩衝液、アンモニア系緩衝液等がある。
本発明の分離、同定に用いられる細胞の種類は、電気泳動により細胞表層電荷及び細胞表層イオン雰囲気に依存して、電気泳動液の中で、移動度を変えるものがすべて対象となる。細胞の分離は上記泳動用キャピラリー中のそれぞれの細胞の移動度の違いによって定まるため、分取の目的に従って泳動条件を設定し、細胞の移動度の差によりキャピラリー排出末端に泳動される時間を適宜設定して、塗布することができる。
また、この検出器を備える位置は電気泳動用キャピラリーの排出端に近い側が好ましい。泳動条件により細胞ごとの泳動時間は一定であるので、この検出器で泳動する細胞を検知した後、この成分が排出する時間を正確に予測することができる。例えば、検出器による検出信号に基づき、一定時間後にマトリックス溶液供給手段を作動させて、細胞試料液とマトリックス溶液を接触させて混和することができる。
このようなマトリックス溶液供給手段としては、例えば、マトリックス溶液導入口を有し、かつ内部に電気泳動用キャピラリーが貫通するコネクタと、コネクタ内部と連通し、該キャピラリー周囲を囲暁するように設けた上記マトリックス溶液供給用チューブからなる手段が挙げられる。このような手段によれば、キャピラリー末端から排出される細胞試料溶液は、キャピラリー末端においてマトリックス溶液と接触し混和される。
炭酸アンモニウム−アンモニア緩衝液等が挙げられる。そして、容器1中の正負の電極2と、サンプルプレート電極6の間に電圧が印加される。この電圧は通常1−20kV程度である。キャピラリー3内で混合物が電気泳動することによって、試料である細胞が分離し、各細胞試料が通過したことが検出器4で検出される。その後一定時間の後に細胞試料はキャピラリー3の一端から排出される。このとき、コネクタ8においてマトリックスを含む溶液を送液ポンプ等により送液用チューブ9から導入し、キャピラリー3の末端で混和する。位置制御機構7はプレート5をXYの2軸方向に位置制御する機能を持っており、プレートをX、Y軸方向に移動させることにより、プレート上に細胞試料液とマトリックス溶液の混和物が、所定のパターンで断続的あるいは連続的に塗布することが可能となる。計測・制御装置10は正負の電極間に泳動電圧を供給する。また、検出器4の出力を変換して分離対象細胞の有無と通過時刻を計測し、その排出時間に合わせてマトリックス溶液をキャピラリー排出末端に供給し、細胞試料液と接触させ混和させる。
酢酸菌(Acetobacter aceti JCM7641とGluconobacter oxydans JCM7642)の同定を行った。20mM炭酸アンモニウム−アンモニア緩衝液(pH = 9.1)に各々の酢酸菌(〜1010 cells/mL)を混合分散させ、測定試料とした。試料導入は容器1から落差法で行い、5 cm, 20 sの導入で2.8 nL(プラグ長0.14 cm)の注入量とした。キャピラリー3は全長60 cm、内径 50 mmとした。キャピラリー3の途中にUV検出器4(日本分光社製CE-870、測定波長600 nm)を配し、キャピラリー3の外部から泳動する細胞を検出できるようにした。試料の導入端から検出器4までのキャピラリーの長さは約30cm、検出器4からプレート5までの長さを約30cmとした。容器1を泳動液(20mM 炭酸アンモニウム−アンモニア緩衝液)で満たし、正電極2を差し込み、プレート5を負電極6とし、その両電極間に10.0 kVの電圧を印加した。また,送液用チューブ9から15mg CHCAを50%アセトニトリル及び1%トリフルオロ酢酸溶液1.0mLに溶解した溶液を流速0.5mL/minで送液し、マトリックス供給用チューブ末端から、マトリックス溶液を流出させた。図3には電場を印加してからの検出器4による測定結果を示す。また、位置制御機構7は電場印加と同時に作動し、0.17cm/minの速度でX軸方向に移動させた。その結果、10分間の電位印加による電気泳動の結果をプレート5上に長さ2.3cmで展開した。
実施例1で得た分離試料をMALDI-MSとしてApplied Biosystems社製 Voyager DE-PROを用いて測定した。図3において各々の酢酸菌(Acetobacter aceti JCM7641とGluconobacter oxydans JCM7642)由来と考えられるピークに相当する部分について質量分析を行った結果を図4に示す。その結果、それぞれの部分で各々の酢酸菌のバイオマーカーと思われるマススペクトルが得られた。
2 正電極
3 キャピラリー(細管)
4 検出器(UV検出器)
5 プレート
6 負電極
7 位置制御機構
8 コネクタ
9 送液用チューブ
10 計測・制御装置
11 マトリックス供給用チューブ
Claims (7)
- 電気泳動用キャピラリー、該キャピラリーの末端から順次排出される試料液とMALDI-MS法に用いるマトリックス溶液と接触させ混和させる手段、及び該混和された状態で試料液を断続的あるいは連続的に塗布するためのMALDI質量分析計用プレートを兼ねたサンプルプレートを有する装置を用いて、細胞の分離及び同定を行う方法であって、以下の工程からなる方法。
a)細胞混合物試料液を電気泳動用キャピラリーに導入する工程、
b)上記マトリックス溶液の溶媒が、細胞壁または細胞膜の一部または全部を破壊し、細胞内バイオマーカーの抽出を行う単一または複数種の混合溶媒であって、該マトリックス溶液と、キャピラリー電気泳動により分離され該キャピラリーの末端から細胞別に順次排出された細胞試料液とを混和させて、細胞別にバイオマーカーを抽出する工程、
c)上記マトリックス溶液と混和された状態の抽出されたバイオマーカーを含む試料液を上記サンプルプレート上に断続的あるいは連続的に塗布する工程、
d)サンプルプレート上の試料中のバイオマーカーをMALDI質量分析計により質量分析し、細胞を同定する工程。 - サンプルプレートが少なくとも表面導電性であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の装置が、サンプルプレートをXYの2軸方向あるいはさらにZ軸方向に位置制御する手段を有していることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の装置が、MALDI-MS法に用いるマトリックス溶液導入口を有し、かつ内部に電気泳動用キャピラリーが貫通するコネクタと、コネクタ内部と連通し、該キャピラリー周囲を囲暁するように設けた上記マトリックス溶液供給用チューブを有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の装置が、キャピラリー途中に該キャピラリー中を移動する細胞の検出器を設け、該検出器の検出信号に基づき電気泳動用キャピラリーの開放端から排出する該細胞の排出時間を決定し、該排出時間にあわせてMALDI-MS法に用いるマトリックス溶液を供給する手段を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 検出器がUV検出器あるいはLIF検出器であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- サンプルプレートと該電気泳動用キャピラリーの間にマトリックス溶液を送液して液滴を形成することにより、該キャピラリー内の泳動液と該サンプルプレートとを導通させ、電気泳動力により該サンプルプレート上に細胞試料液を連続あるいは断続的に排出させることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
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Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0399866U (ja) * | 1990-01-30 | 1991-10-18 | ||
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JP2002236108A (ja) * | 2001-02-09 | 2002-08-23 | Japan Science & Technology Corp | 試料分取方法及びそのための装置 |
WO2003071263A1 (en) * | 2002-02-19 | 2003-08-28 | Genome Institute Of Singapore, National University Of Singapore | Device for isoelectric focussing |
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JP2000502443A (ja) * | 1995-12-11 | 2000-02-29 | ノースイースタン ユニバーシティ | 毛管電気泳動を使用して新規の治療コンパウンド類のための天然物サンプルのスクリーニング |
JP2003529044A (ja) * | 1999-04-20 | 2003-09-30 | ターゲット ディスカバリー, インコーポレイテッド | ポリペプチドフィンガープリント法、代謝プロファイル、およびバイオインフォマティクスデータベース |
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JP2002236108A (ja) * | 2001-02-09 | 2002-08-23 | Japan Science & Technology Corp | 試料分取方法及びそのための装置 |
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