JP2003529044A - ポリペプチドフィンガープリント法、代謝プロファイル、およびバイオインフォマティクスデータベース - Google Patents

ポリペプチドフィンガープリント法、代謝プロファイル、およびバイオインフォマティクスデータベース

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JP2003529044A JP2000612736A JP2000612736A JP2003529044A JP 2003529044 A JP2003529044 A JP 2003529044A JP 2000612736 A JP2000612736 A JP 2000612736A JP 2000612736 A JP2000612736 A JP 2000612736A JP 2003529044 A JP2003529044 A JP 2003529044A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、生物学的サンプルに対してプロテオミクスおよび代謝プロファイルを行うための、方法、組成物、装置、およびコンピューターデータ検索システムを提供する。１つの装置は、サンプル容器（５０）、複数の分離キャピラリー（５４、６４、７４）、複数の画分収集デバイス（６０、７０）、検出器（７８）、および分析機（８２）を備える。また本発明は、複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液からポリペプチド種を分離し、そして該ポリペプチド種を同定するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、１９９９年４月２０日に出願の米国仮出願第６０／１３０，２３８
号の優先権を主張する。本発明はまた以下に関連する：１９９８年２月２４日に
出願の米国仮出願第６０／０７５，７１５号；２０００年２月２５日に出願した
同時係属米国出願番号０９／５１３，４８６（「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ Ｖｉａ Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００２００Ｕ
Ｓを有する）；２０００年２月２５日に出願した米国同時係属出願番号０９／５
１３，３９５（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００３００ＵＳを有
する）；２０００年２月２５日に出願した同時係属米国出願第０９／５１３，９
０７（「Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅ
ｍ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００１００ＵＳを有す
る）；２０００年４月１９日に出願した同時係属米国出願第 （「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
Ａｎａｌｙｓｅｓ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００４
００ＵＳを有する）；および２０００年４月１９日に出願した同時係属ＰＣＴ出
願番号 （「Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ａｍｐｌｅ」と表題を付けられ、代理人整理番号０２０４４４−０００５００Ｕ
Ｓを有する）。これらの全ては、本明細書中でその全体を参考として援用される
。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、タンパク質分離およびプロテオミクス、代謝産物のプロファイリン
グ、バイオインフォマティックス、医薬、およびコンピューターデータベースの
分野に関する。
【０００３】 （発明の背景） ゲノム検索および示差的な遺伝子発現分析の目的は、遺伝子発現と特定の細胞
状態（例えば、疾患状態、特定の発生段階、特定の環境刺激への暴露から生じる
状態、および治療的処置に関する状態）との間の相関関係を作ることである。こ
のような相関関係は、疾患、細胞発生、および細胞分化の機構における重要な洞
察、ならびに新規の治療薬、薬物標的、および疾患マーカーの同定における重要
な洞察を提供する可能性を有する。遺伝子発現パターンの相関関係はまた、疾患
および生物の代謝における類似の洞察（これは、農作物、トランスジェニック種
の開発の速度を増すために、および生物産物の収量または所望の代謝活性を増大
させるための生物の代謝操作のために用いられ得る）を提供するために用いられ
得る。
【０００４】 多くの機能的ゲノム研究は、特定の条件および状態に対応する細胞応答を提示
するようなｍＲＮＡレベルの変化に焦点をあわせる。しかし、最近の研究では、
しばしば、ｍＲＮＡレベルにより測定されるような遺伝子発現と、形成される実
際に活性な遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質）と
の間に弱い相関関係が存在することが実証されている。［４］この発見は、驚く
べきことではない。なぜならば、多くの因子（翻訳効率、代謝回転、細胞外発現
または区画化、および翻訳後の修飾における差異を含む）が、転写制御に関係な
くタンパク質レベルに影響するからである。従って、この証拠は、機能的ゲノム
が実際のタンパク質レベルを測定すること（すなわち、プロテオミクス法を利用
すること）により、核酸ベースの方法を用いるよりもむしろ、最も良く達成され
ることを示す。しかし、機能的ゲノム分析のためのタンパク質の成功した使用は
、細胞または組織サンプルにおいて発現される個々のタンパク質の再現性のある
定量および同定を必要とする。
【０００５】 それは、代謝制御が細胞および組織において実行されるタンパク質レベルであ
る。健康な組織と罹患した組織との間のタンパク質発現のレベルの比較、または
病原性微生物株と非病原性微生物株との間のタンパク質発現のレベルの比較は、
新規の薬物化合物または農作物の発見および開発の速度を増し得る。疾患組織ま
たは処置を受けている生物から切除された組織におけるタンパク質発現パターン
の分析はまた、疾患状態または処置ストラテジーの有効性の診断学として役立ち
得、そして個々の患者についての適切な処置様式および治療選択肢に関する予後
情報を提供し得る。
【０００６】 多くのタンパク質は、異なる細胞において様々なレベルで発現される。組織ま
たは細胞サンプルから、従来の技術を用いて抽出されたタンパク質は、最初に、
ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動、あるいはアフィニティー技術により
個々のタンパク質に分離されなければならない。その後、個々のタンパク質レベ
ルが、あるサンプル内で、および異なる組織供給源から得られるサンプルにわた
り比較され得る。いつでも細胞により発現されるタンパク質の数に起因して、複
数の電気泳動技術（例えば、等電点後のポリアクリルアミドゲルを介する電気泳
動）が、所定のサンプルに含まれる個々のタンパク質の全てを単離するために、
しばしば適用され得る。
【０００７】 いくつかの技術が、以下を含む分離後に存在する各タンパク質の相対量を定量
するために用いられている：色素（例えば、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅおよ
びＦａｓｔ Ｇｒｅｅｎ）を用いる、コロイド物質（例えば、金または銀染色）
を用いる、または放射性化合物（例えば、３５Ｓメチオニン、または１４Ｃアミ
ノ酸、あるいは３Ｈ−ロイシン）の添加による細胞合成の間のタンパク質の事前
標識による、ポリアクリルアミドゲルで分離されたタンパク質を染色すること。
染色技術は、貧弱な定量結果を生じる。なぜならば、様々な量の染色物が、各タ
ンパク質内に取りこまれ、そして染色されたタンパク質は、ゲルまたはエレクト
ロブロット基材の染色されたバックグラウンドに対して、分離されなければなら
ないからである。放射性標識は、分離の前にタンパク質にのみ適用されるので、
これらは、染色技術のバックグラウンドの問題を克服する。しかし、ヒト被験体
に放射性化合物を摂取させること、または管理されていない原野の環境（例えば
、作物）において放射性物質を取り扱うことは、このアプローチの有効性を制限
する。染色技術および放射性標識技術の両方はまた、検出を達成するために異常
に長い時間を必要とする。ゲルの染色および脱色は、数時間を必要とする拡散律
速プロセスである。放射性標識は、写真フィルムまたはリン光スクリーンに標識
したゲルを数時間から数日間（定量的イメージを生じる放射性崩壊プロセスを待
つ間）露光させることにより定量されなくてはならない。ゲルにおけるタンパク
質の直接的赤外分光光度呼びかけ（ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）もまた、定量的
タンパク質発現データを提供するための方法として以前に用いられている。しか
し、このアプローチから可能なこの定量的解析は、ゲルの厚さにおける変動、お
よびゲルの間のタンパク質スポットの差次的な拡散（局所濃度の変化）により、
不利に影響される。さらに、赤外におけるタンパク質の比較的低い吸収断面積は
、敏感な検出を制限する。タンパク質発現パターンの分析は、多くの適用のため
に十分な情報を提供しない。
【０００８】 いくつかの方法がまた、タンパク質が分離されるとすぐに、タンパク質を同定
するために提唱されている。最も一般的な方法としては以下が挙げられる：記録
された分離座標データ（例えば、注釈付２−Ｄゲルイメージデータ）またはコン
トロールサンプルから得られる分離座標に対して個々のタンパク質の分離座標（
例えば、等電点および見かけの分子量）を照会すること、得られたペプチドフラ
グメントの質量の測定と組み合わせたタンパク質の化学分解消化または酵素分解
消化を行うこと、およびこのペプチドの質量フィンガープリントを、予想される
ペプチドの質量フィンガープリントと相関させること。予想されるペプチドの質
量フィンガープリントは以下に起因する：１組の公知のタンパク質の予想遺伝子
配列（Ｊａｍｅｓ，Ｐ．Ｍ．Ｑｕａｎｄｒｏｎｉ，Ｅ．Ｃａｒａｆｏｌｉおよび
Ｇ．Ｇｏｎｎｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
，１９５：５８−６４（１９９３）；Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．、Ｓ．Ｓｐｅｉｃｈ
ｅｒ、Ｐ．Ｒ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＴ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：３９７−４０８（１９９３）を参照のこと）、ゲノ
ムデータベースから得られる予想配列と比較される部分的タンパク質配列の生成
（Ｍａｎｎ，Ｍ．，ＩＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ学会，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（
１９９７年１１月１０〜１１日）でのポスター発表；Ｗｉｌｍ，Ｍ．，Ａ．Ｓｈ
ｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ｔ．Ｈｏｕｔｈａｅｖｅ，Ｓ．Ｂｒｅｉｔ，Ｌ．Ｓｃｈｗｅ
ｉｇｅｒ，Ｔ．ＦｏｔｓｉｓおよびＭ．Ｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３７９：４６
６−４６９（１９９６）；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ，Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｃ．Ｂｅａ
ｖｉｓおよびＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：９８−９２（１
９９３）を参照のこと）、またはこれらの方法の組み合わせ（Ｍａｎｎ，Ｍ．，
ＩＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ学会，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９７年１１月１
０〜１１日）でのポスター発表；Ｗｉｌｍ，Ｍ．，Ａ．Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，
Ｔ．Ｈｏｕｔｈａｅｖｅ，Ｓ．Ｂｒｅｉｔ，Ｌ．Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ，Ｔ．Ｆｏ
ｔｓｉｓおよびＭ．Ｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３７９：４６６−４６９（１９９
６）；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ，Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｃ．ＢｅａｖｉｓおよびＳ．Ｂ
．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：９８−９２（１９９３）を参照のこ
と）。最近の研究は、タンパク質が、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）（これは、
ゲノムデータベースから決定される理論的配列を照会することが可能である）と
呼ばれる部分配列の決定を介してのみ明白に同定され得ることを示す（Ｃｌａｕ
ｓｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｓ．Ｃ．Ｈａｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．Ｗｅｂｂ
，Ｌ．Ｅ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｈ．Ｍ．Ｔｒａｎ，Ｌ．Ｂ．Ｅｐｓｔｅｉｎ，およ
びＡ．Ｌ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ），９２：５０７２−５０７６（１９９５）；Ｌｉ，Ｇ．，Ｍ．Ｗａｌｔ
ｈａｎ，Ｎ．Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｕｎｗｏｒｔｈ，Ａ．Ｔｒｅｓｔｏｎ
およびＪ．Ｎ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：
３９１−４０２（１９９７）を参照のこと）。しかし、８〜１８時間が、現在、
従来技術により単一のタンパク質サンプルについてＰＳＴを生成させるために必
要とされる（この時間の実質的部分は、分離方法による引き続く配列決定に適切
な形態でのタンパク質サンプルの回収に充てられる）（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，
Ａ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９３：１４４
４０−１４４４５（１９９６）；Ｍａｒｋ，Ｊ．，ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ Ｓｅｍｉ
ｎａｒ Ｓｅｒｉｅｓでのポスター発表，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｈｉｇ
ｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄ
ｉｓｃｏｒｖｅｒｙ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ（１９９８年３月）。これ
は、組織から分離されたタンパク質の全ての同定に、時間と費用のかかる努力を
強いる。これは、機能的ゲノムについてのそれらの利点にもかかわらず、プロテ
オミクス法のより広範な用途を制限し、そして現在利用可能なゲノムデータベー
ス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ
ｂａｓｅ）に類似した、プロテオミクスデータベースの開発を阻止している。
【０００９】 従って、細胞、組織、および器官のタンパク質発現パターン（「タンパク質フ
ィンガープリント」）を同定および定量するための現在の方法は、十分な分解能
、精度、および/または感度に欠ける。本発明は、当該分野で公知の方法におい
て欠けているこれらの特徴を扱う。
【００１０】 （ポリペプチド分離法：キャピラリー電気泳動） 二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動は、現在、細胞または組織サンプルから単離さ
れた個々のタンパク質を分離するための、最も広範に適用される方法である［５
、６、７］。この証拠は、タンパク質ゲルイメージデータベース（例えば、ＮＩ
Ｈにより維持されるＰｒｏｔｅｉｎ−Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）の増
加（２０を超える）をみればわかる［８］。これらのデータベースは、種々の組
織から調製されるゲルにおけるタンパク質の同定を補助するために、参照２−Ｄ
ゲルのイメージを提供する。
【００１１】 キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、異なる型の電気泳動であり、そして電場が
印加されるキャピラリー内の混合物中の成分を分離することを伴う。電気泳動を
行うために用いられるキャピラリーは電解質で満たされ、そしてサンプルは種々
の方法（例えば、水圧、電気浸透誘導流（ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃａｌｌ
ｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｏｗ）、および界面活性剤導電輸送（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ））を用いてキャピラリーの一方の末端に
導入される。次いで、キャピラリーの末端は、アノード溶液およびカソード溶液
と接触させて配置され、キャピラリーを横切って電圧が印加される。正に荷電し
たイオンが、カソードの方向に引き寄せられる一方、負に荷電したイオンは、ア
ノードの方向に引き寄せられる。最も高い移動度を有する種は、キャピラリーマ
トリクスを介して最も速く移動する。しかし、各々の種の溶出の順序は、キャピ
ラリーのいずれの末端から種が溶出するとしても、その見かけの移動度に依存す
る。見かけの移動度は、電気泳動マトリクスにおける種の電気泳動移動度および
キャピラリーに対する電気泳動マトリクス自身の移動度の合計である。電気泳動
マトリクスは、キャピラリーに渡る水圧勾配、または電気浸透誘導流（電気浸透
流）により移動し得る。
【００１２】 多数の異なる電気泳動法が存在する。キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ
）は、分析物のその等電点（すなわち、分析物が正味の電荷を有さないｐＨ）に
従うｐＨ勾配においてタンパク質のような分析物を分離することに関する。第２
の方法である、キャピラリーゾーン電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＣＺＥ）は、それらの固有の電荷対質量比
に基づいて分析物を分画する。キャピラリー電気泳動（ＣＧＥ）は、それらの分
子量に従ってタンパク質を分離するように設計される。（一般的な電気泳動、な
らびに詳細なＣＩＥＦおよびＣＺＥの総説については、例えば、Ｐａｌｍｉｅｒ
ｉ，Ｒ．およびＮｏｌａｎ，Ｊ．Ａ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａ
ｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，第１３章、３２５−３６８頁（１９９４）（一般
的電気泳動）；Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎ
ｇ ｉｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」，ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａ
ｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，第４章、３２５−３６８頁（１９９４
）；およびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ＣＲＣ Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，第１２章、２８
７−３２３頁（１９９４）を参照のこと）。これらの全ての参考文献は、本明細
書中でその全体が参考として援用される。
【００１３】 ２−Ｄゲル電気泳動は、広範に実施されるが、いくつかの制限が、機能的ゲノ
ム検索におけるその有用性を制限する。第１に、２Ｄ−ゲルは、空間的分解能に
制限があるので、平均的な細胞において発現される多数のタンパク質（１０００
〜１０，０００のタンパク質）を分離することが困難である。非常に大量のタン
パク質は、キャピラリー等電点電気泳動における両性担体（ｃａｒｒｉｅｒ ａ
ｍｐｈｏｌｙｔｅ）勾配を湾曲させ、サイズ篩電気泳動法（例えば、２−Ｄゲル
電気泳動の二次元目およびＣＧＥ）のゲルマトリクスにおける叢生（ｃｒｏｗｄ
ｉｎｇ）を生じ、従って分離されたタンパク質の空間的パターンを再現不可能に
する［２０、２１および２２］。非常に大量のタンパク質はまた、ゲルにおいて
沈殿し得、そして分画されるタンパク質の縞をつくる（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）［
２０］。架橋密度の変化およびキャストゲルにおける電場強度は、分離されるタ
ンパク質の空間的パターンをさらに湾曲させ得る［２３、２４］。別の問題は、
バックグラウンドの高度な染色およびゲル染色の制限されたダイナミックレンジ
および画像化技術に起因して、ゲルにおける非常に大量のタンパク質の近隣の少
量のタンパク質を分離することが出来ないことである［２５、２２］。染色に伴
う制限はまた、再現可能でかつ定量可能なタンパク質濃度の値を得ることを困難
にする。いくつかの最近の実験では、例えば、研究者は、類似の条件下で泳動し
た３７のゲルにおいて形成されたスポットの、試験スポットのわずか６２％を一
致させ得た［２１；２８、２９もまた参照のこと］。さらに、多くのタンパク質
は、アクリルアミドゲルトと適合性の緩衝液中に可溶性ではないか、またはその
高い分子量に起因して有効にゲルに進入することに失敗する［２６、２７］。
【００１４】 従って、キャピラリー電気泳動の現在用いられる方法は、細胞または組織サン
プルの詳細なタンパク質発現フィンガープリントを提供するそれらの有用性に関
して、有意な制限を与える。
【００１５】 （タンパク質種同定／タンパク質配列タグ） タンパク質の電気泳動移動度または等電点に基づくタンパク質の特徴づけと対
照的に、組織または細胞サンプルにおいて発現されるタンパク質種を同定するた
めのアプローチは、サンプルから精製されるタンパク質由来の部分的または完全
なペプチド配列情報を得ることである。しかし、いうまでもなく、このアプロー
チは、明白な配列決定を可能にするように個々のタンパク質を単離するために、
大規模でかつしばしば問題のある精製工程を必要とするように、骨の折れるもの
でありかつ制限された感度のアプローチであり、そして多くの場合、非常に大量
ではなく、そして／または夾雑タンパク質種がないように容易に精製可能ではな
いタンパク質について容易に実現可能ではない。
【００１６】 一次のアミノ酸配列または部分的配列（すなわち、タンパク質配列タグ「ＰＳ
Ｔ」）が決定され、その結果、異なる分離座標で見えるタンパク質に関するタン
パク質発現パターンの変化に基づいて判断が下され得ることが重要である。タン
パク質は、細胞または組織によりタンパク質に及ぼされる翻訳後の修飾の程度に
依存して、ある分離座標を超えて見え得る。タンパク質についての分離座標はま
た、遺伝子変異に起因して変化し得る。任意の所定の分離座標でのタンパク質の
相対的量の変化はまた、遺伝子の発現の調節の変化に起因する。分離されたタン
パク質の各々を明白に同定することによってのみ、異なるサンプルにわたるタン
パク質発現における任意の変化に基づく判断が導きだされ得る。
【００１７】 いくつかの方法は、以前、分離されるタンパク質の配列またはタンパク質配列
タグを決定するために提唱されている。これらとしては、以下が挙げられる：連
続回のＮ末端またはＣ末端標識、次いで標識アミノ酸の遊離および測定、一度に
１つのアミノ酸のタンパク質のエキソタンパク質分解消化、大きなタンパク質の
より小さいペプチドへのエンドタンパク質分解消化、次いでＮ末端標識およびＣ
末端標識、そしてアミノ酸決定、ならびに質量分析のフラグメント化パターン認
識。連続標識および消化技術（例えば、エドマン分解）は、たとえ自動化されて
も、時間を消費する。なぜならば、このプロセスは、十分に大きなタンパク質配
列タグが蓄積されるまでに、多くのサイクルを繰り返さなくてはならないからで
ある。間違いの伝達（すなわち、各回における不完全な標識か、標識アミノ酸の
不完全な遊離か、またはその両方のいずれかに由来する）はまた、これらの技術
を用いて決定され得るタンパク質配列の長さを制限する。より完全なタンパク質
配列が、連続標識および消化化学の適用の前に、初めに、エンドプロテアーゼを
用いてタンパク質をより小さなフラグメントに切断することにより得られ得るが
、これもまた、タンパク質フラグメントを再分離または精製する時間と労力のか
かる工程（通常、電気泳動分離技術の再適用による）を導入する。本来のタンパ
ク質におけるこれらのペプチドフラグメントの配列順序を決定することはまた、
さらなる問題を提示し得る。カルボキシ末端メトキシ標識の臭化シアン消化物は
、大きなタンパク質の臭化シアン消化により形成される他のフラグメントからＣ
末端ペプチドフラグメントを同定するために用いられている。
【００１８】 （質量分析によるタンパク質配列決定） 質量分析技術は、より伝統的な方法を超えるその速さの利点により、ますます
、タンパク質同定に適用されている。エレクトロスプレーおよびマトリクス支援
レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓ
ｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＭＡＬＤＩ）は、タンパク質分析に
適用される最も一般的な質量分析技術である。なぜならば、大きな低揮発性の分
子種を、最も良くイオン化し得るからである。２つの基本的なストラテジーが、
分離後のタンパク質のＭＳ同定のために提唱されている：１）質量プロフィール
フィンガープリント（「ＭＳフィンガープリント」）および２）ＭＳ／ＭＳ（「
ＭＳ／ＭＳ配列決定」）による１つ以上のペプチドドメインの配列決定。ＭＳフ
ィンガープリントは、インタクトなタンパク質のタンパク質分解消化により生成
されるいくつかのペプチドの質量を正確に測定し、そしてこのペプチド質量フィ
ンガープリント用いて、公知のタンパク質についてのデータベースを検索するこ
とにより達成される。ＭＳ／ＭＳ配列決定は、ＭＳ／ＭＳ装置の四重極（ｑｕａ
ｄｒａｐｏｌｅ）における、配列特異的フラグメント化イオンの生成により消化
されるタンパク質消化に由来するペプチドの、１つ以上のＰＳＴの実測に関する
。これらの技術の両方における改良点はまた、サイン検出を達成するために必要
な個々のタンパク質の量を低下させる。
【００１９】 １つのアプローチにおいて、タンパク質は、ペプチドを形成するために配列特
異的部位で化学分解（例えば、臭化シアン）消化されるか、または酵素分解（例
えば、トリプシン）消化される。切断の特異性は、ＭＳにより引き続いて決定さ
れ得る再現性のある質量のペプチドを生じる。次いで、個々のタンパク質から検
出される質量分析のペプチドパターンは、公知の配列を有する精製タンパク質か
ら生成されるか、または予想される消化パターンに基づく理論的タンパク質配列
にから予想される類似のパターンのデータベースと比較される。次いで、未知の
タンパク質の正体は、そのペプチド質量フィンガープリントと最も良く一致する
公知のタンパク質であると推測される。
【００２０】 歴史的に、エドマン分解のような技術は、タンパク質配列決定に広範に用いら
れている。しかし、衝突解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓ
ｏｃｉａｔｉｏｎ）ＭＳ法（ＭＳ／ＭＳ配列決定）は、急速に進化しており、そ
してより速く、かつ必要とするタンパク質がエドマン分解技術よりも少ないこと
がわかっている。ＭＳ配列決定は、ＭＳのイオン化ゾーンにおいてより高い電圧
を用いて、タンパク質分解物から単離された単一のペプチドを無作為にフラグメ
ント化することによるか、またはより代表的には、イオントラップ（四重極）に
おける衝突解離を用いるタンデムＭＳによるかのいずれかで、達成される。しか
し、タンパク質配列決定に対するＣＩＤ法の適用は、タンパク質が初めに化学分
解消化されるか、または酵素分解消化されることを必要とする。
【００２１】 いくつかの技術が、ＭＳ／ＭＳ配列決定のために用いられるペプチドフラグメ
ントを選択するために用いられ得る。これには、以下が挙げられる：四重極ＭＳ
ユニットにおける親ペプチドフラグメントイオンの蓄積、ＥＳ−ＴＯＦ ＭＳ検
出と組み合わせたキャピラリー電気泳動分離、または他の液体クロマトグラフィ
ー分離。ペプチドのアミノ酸配列は、得られたペプチドのＭＳフラグメント化パ
ターンにおいて観察される分子量の差異から、ＭＳにおいて個々のアミノ酸残基
と関連する公開された質量を用いて推論され、そして半自動ペプチド配列決定ア
ルゴリズム（ｓｅｍｉ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）へとコードされる。このアプローチにおいて、
配列決定されたペプチドは、代表的には、質量分析器の四重極に蓄積される。次
いで、ＣＩＤは、天然の衝突気体（代表的には、Ａｒ）を、ペプチドイオンとの
高エネルギー衝突をさせるためにこのイオントラップへと注入することにより達
成される。これらの衝突のいくつかは、ペプチド骨格の切断、およびより小さな
イオン（これは、それらの異なる質量により、比率を変化させ、四重極を離れそ
して検出される）の生成を生じる。ペプチド切断反応の大多数は、比較的小数の
経路で起こり、非常に大量の特定の型の切断イオンを生じる。次いで、ペプチド
配列は、検出される非常に大量のペプチドフラグメントの見かけの質量から推論
される。
【００２２】 質量分析は、それが、タンパク質のより小さいフラグメントへのエンドタンパ
ク質分解（例えば、トリプシン消化）または化学分解（例えば、臭化シアン）切
断の有無で、電気泳動分離技術と有効に組み合わせられ得るという、さらなる利
点を有する。しかし、未知のタンパク質のタンパク質配列またはタンパク質配列
タグを、直接決定することを以前に記載している、質量分析技術はない。さらに
、混合されたタンパク質サンプルから多数のタンパク質を分離するために用いら
れる電気泳動方法と直接組み合わせることを以前に記載している、ＭＳ配列決定
技術はない。
【００２３】 例えば、ＭＳ／ＭＳ実験において陽イオンモードで獲得される単離された１４
２５．７Ｄａペプチド（ＨＳＤＡＶＦＴＤＮＹＴＲ）の質量スペクトルにおいて
、完全なペプチド１４２５．７Ｄａと次に大きな質量フラグメント（ｙ11、１２
８８．７Ｄａ）との間の差異は、１３７Ｄａである。これは、アミド結合で切断
されるＮ末端ヒスチジン残基の予想される質量に対応する。このペプチドについ
て、完全な配列決定は、ペプチド骨格に沿ってほとんどの全ての残基でのペプチ
ド切断に対応する非常に多量のフラグメントイオンの生成の結果として実行でき
る。ペプチドのいずれかの末端を含む、本質的に完全な組の正に荷電したフラグ
メントイオンの生成は、Ｎ末端残基およびＣ末端残基（それぞれ、ＨおよびＲ）
の両方の塩基性の結果である。塩基性残基が、Ｎ末端またはＣ末端（特に、Ｒ）
に配置される場合、ＣＩＤスペクトルにおいて生じるイオンのほとんどは、塩基
性残基を含む。なぜならば、正電荷がこの部位に本質的に局在するからである。
これは、スペクトルの結果を非常に単純化する。なぜならば、これらの塩基性部
位は、限定されたシリーズの特定の娘イオンへのフラグメント化に向けられるか
らである。塩基性残基を欠くペプチドは、配列決定をより困難にする、より複雑
な混合物のフラグメントイオンへとフラグメント化する傾向にある。
【００２４】 この考えを広げて、他のものは、Ｎ末端へ強い正電荷を付着させることが、Ｎ
末端での塩基性残基の存在にかかわらず、ＣＩＤ実験において親ペプチドから完
全なシリーズのＮ末端フラグメントイオンの生成を検出するためのアプローチに
有効であることを実証した。理論的に、全てのフラグメントイオンは、固定荷電
基（ｆｉｘｅｄ−ｃｈａｒｇｅｄ ｇｒｏｕｐ）により方向付けられた電荷リモ
ート（ｃｈａｒｇｅ−ｒｅｍｏｔｅ）フラグメント化により生成される。ペプチ
ドは、現在、いくつかのクラスの固定荷電基（ジメチルアルキルアンモニウム、
置換ピリジニウム、４級ホスホニウム、およびスルホニウム誘導体を含む）を用
いて修飾されている。最も望ましい標識の特徴は、これらが容易に合成され、ペ
プチドのイオン化の効果を増大させ、そして（最も重要なことは）不利な標識の
フラグメント化を最小にする特定のフラグメントイオンシリーズの形成を指向す
ることである。これらの基準を満たす最も望ましい誘導体は、４級ホスホニウム
誘導体を有するジメチルアルキルアンモニウムクラスの誘導体（唯一、それらの
より困難な合成により望ましくない）である。置換ピリジニウム誘導体は、アル
キルアンモニウム誘導体とは対照的に高エネルギーＣＩＤにより良く適する。
【００２５】 ペプチド分析のいくぶんかの進歩にも関わらず、タンパク質の同定は、プロテ
オミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）の分野における主要なボトルネックであり、
その予測されたゲノム配列から単独の精製タンパク質の同定を可能にするのに十
分な長さのタンパク質配列タグを産生するために、１８時間までが必要とされる
。明白なタンパク質同定がタンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を産生することによっ
て達成され、ＰＳＴは現在、ＭＳ／ＭＳ装置の四重極（ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ）
における衝突誘導分離によって優先的に達成される。より大きなペプチドおよび
タンパク質のイオン化効率の限定は、ＭＳ技術の内因性の検出感度を制限し、そ
して低い存在量のタンパク質の同定のためのＭＳの使用を阻害する。飛行時間（
ＴＯＦ）検出の質量の正確さの制限はまた、ＭＳ／ＭＳ配列決定の有用性を束縛
し得、タンパク質分解手段および化学分解手段によって、配列決定に先だって、
より扱いやすいペプチドに、タンパク質が消化されることを要求する。明らかに
、迅速かつ費用に効果的なタンパク質配列決定技術は、プロテオミクス研究のス
ピードを改善し、かつ費用を下げる。最後に、伝統的なタンパク質分離技術にお
いて使用される分離薬剤および緩衝液はしばしば、ＭＳ同定方法と両立しない。
【００２６】 （タンパク質サンプルの標識） 健康な組織および罹患した組織より得たタンパク質発現レベルの相関関係は、
プロテオミクス研究の基礎である。組織サンプルまたは細胞サンプルより抽出さ
れたタンパク質は、代表的に、ゲル電気泳動によって個々のタンパク質に分離さ
れなければならず（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌ，Ｐ．Ｈ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２５０：４００７（１９７５）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｄ．Ｆ．，ら，Ａ
ｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７３：４２４（１９８８）；Ｈｕｈｍｅｒ，Ａ．
Ｆ．Ｒ．，ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：２９Ｒ−５７Ｒ（１９９７）；Ｇ
ａｒｆｉｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２：４２
５（１９９０）），ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．，ら，「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ
ｉｓ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，」：ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第８章，第１８５頁−第２０６頁（ＣＲＣ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）；Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓ
ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ，」：
ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第４章，第９５頁−
第１０９頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ， １９９４）
；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．，「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，」：ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１２章，第２８７頁−３２３頁（ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）；Ｐａｌｍｉｅｒｉ，
Ｒ．およびＮｏｌａｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」：ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａ
ｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ，第１３章，第３２５頁−第３６８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）），またはアフィニティー技術（Ｎｅｌｓｏｎ，
Ｒ．Ｗ．，「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌ
ｙｓｉｓ，」ＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された
論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）；Ｙｏｕｎｇ，
Ｊ．，「Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，」ＣＨＩ Ｇｅｎｏｍｉ
ｃｓ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，
Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９９８年２月１４−１５日））、その後
、それらの相対的な発現レベルの定量化および、比較サンプルからのレベルと比
較する。最も一般的に使用されるプロテオミクス方法は、ゲル内に存在するタン
パク質レベルを定量するための染色技術および画像処理技術を使用する２−Ｄゲ
ル電気泳動である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．およびＮ．Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ，「Ｔｗｅｎｔｙ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕ
ｒｅ，」Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１７：４４３（１９９６））。しか
し、存在量の低いタンパク質の検出（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．，「Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓ
ｍｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，」ＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅ
ｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−
１２日）；ＭｃＫｅｅ，Ａ．，「Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ，」Ｂ
Ｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏ
ｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）およびタンパク質染色技術およ
び定量化技術の再現性（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、ＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで
提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ，（１９９８年６月１１−１２日）；
ＭｃＫｅｅ．Ａ．，「Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ」ＢＣ Ｐｒｏｔ
ｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，Ｃ
Ａ（１９９８年６月１１−１２日）；ＩＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆ
ｅｒｅｎｃｅで提示された、ＢｉｏＲａｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ
ＦＸ ａｎｄ ＰＤＱｕｅｓｔ ２−Ｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ ｓｅｍｉｎａｒ，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）
；Ｆｒａｎｚｅｎ，Ｆ．，ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：５８２
（１９９７））が、予測を検証した。
【００２７】 ネイティブなヒト組織サンプルから直接にタンパク質発現レベルを分析可能な
自動化された、定量的および再現性のシステムの開発が、比較タンパク質発現デ
ータを産生し、そしてこれらのデータの質を潜在的に改善するために必要とされ
る時間と費用に顕著に影響すると期待される。標識された２−Ｄ電気泳動システ
ムの開発は、タンパク質疾患データベースのより迅速な蓄積を可能にし、そして
さらに新しい疾患標的の同定の速度を増す。
【００２８】 ２−Ｄゲルのゲルの再現性の問題にも関わらず、プロテオミクス研究の重要性
が既に十分に確立されている。Ｓｔｅｉｎｅｒおよびその共同研究者は、ラット
肝臓組織における２つの前臨床の薬剤候補の毒性を理解するためのプロテオミク
スの使用を報告した（Ｓｔｅｉｎｅｒ，「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｍｅｔｈｏｄｓ
ｔｏ ｐｒｏｆｉｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｏｘｉｃｉｔｙ」ＩＢ
Ｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文、Ｃｏｒｏ
ｎａｄｏ、ＣＡ，１９９８年６月１１−１２日、を参照のこと）。最近、Ａｒｎ
ｏｔｔは、タンパク質の発現が、うっ血性心不全にける肥大に関連しそうである
タンパク質の同定を報告したが、任意のこれらのタンパク質が適切な薬剤標的で
あるのかを決定されるべきままである（Ａｒｎｏｔｔ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉ
ｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍ
ｅｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒ
ｔ ｆａｉｌｕｒｅ」ＩＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで
提示された論文，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ，１９９８年６月１１−１２日、を参
照のこと）。Ｗｉｔｚｍａｎｎらは、インビトロ組織切片で観察される１，３，
５−トリニトロベンゼンおよび１，３−ジニトロベンゼンの毒物学のよりよい理
解のためにウシ精巣のプロテオミクス研究の使用を報告する（Ｗｉｔｚｍａｎｎ
，ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：６４２（１９９７）を参照のこ
と）。Ｆｒａｎｚｅｎらは、悪性ヒト乳癌についてのマーカーを同定するための
プロテオミクス分析の使用を報告する（Ｆｒａｎｚｅｎら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｓｉｓ，１８：５８２（１９９７）を参照のこと）。
【００２９】 プロテオミクス研究は、また同定される別のプロセスにおいて、タンパク質が
分解することもまた必要とする。ゲノムデータベースから決定された理論的な配
列に参照することを可能にするＰＳＴの定量を通じてタンパク質は明白に同定さ
れ得るのみであると、Ｃｌａｕｓｅｒらは示唆している（Ｃｌａｕｓｅｒ，ら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９２：５０７２−５０７
６（１９９５）を参照のこと）。比較理論的ペプチド質量データ−ベースのサイ
ズが増加するにつれて変性されたＭＳフィンガープリントによる個々のタンパク
質の信頼できる同定を見出すことによって、Ｌｉらはこの主張を検証したようで
ある（Ｌｉ，ら，Ｅｌｅｃｒｅｓｉｓ １８：３９１−４０２（１９９７）を参
照のこと）。ゲル内の最も存在量の多いタンパク質についてペプチドマップを得
たのみであったことを、Ｌｉらはまた報告した。なぜなら、ＭＳの感度の限界の
せいであり、レーザー脱離ＭＡＬＤＩ方法論で補助されたマトリックスが、以前
に報告された方法に渡って検出感度を改善することが実証されたにも関わらずで
ある。明らかに、迅速かつ費用に有効なタンパク質配列決定技術は、プロテオミ
クス研究のスピードを改善し、かつ費用を下げる。
【００３０】 歴史的に、Ｅｄｍａｎ分解のような技術は、タンパク質配列決定に広く使用さ
れていた；Ｓｔａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：
１０３−１２０（１９７２）；Ｎｉａｌｌ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，２７：９４２−１０１１（１９７３）；Ｇｒａｙ，：Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１２１−１３７（１９７２）；Ｓｃｈ
ｒｏｅｄｅｒ，：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１３８
−１４３（１９７２）；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ，ＮＹ，１９８４）；Ｎｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ，ｉｎ：Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：６０−９９（１９７２）；およびＴ
ｈｉｅｄｅ，ら．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３５７：６５−６９（１９９５）を参
照のこと。しかし、衝突誘導解離質量分析（ＭＳ）による配列決定方法（ＭＳ／
ＭＳ配列決定）は、急速に発展し、そしてより迅速であることを証明し、さらに
Ｅｄｍａｎ技術ほどタンパク質を必要としない。Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．，
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９３：１４４４０−
１４４４５（１９９６）；Ｗｉｌｍ，ら，Ｎａｔｕｒｅ，３７９：４６６−４６
９（１９９６）；Ｍａｒｋ，Ｊ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａ
ｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＳ／ＭＳ，」ＰＥ／Ｓｃｉ
ｅｘ Ｓｅｍｉｎａｒ Ｓｅｒｉｅｓで提示された論文，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｕｔｏｍａ
ｔｅｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ
ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ（１９９８年
３月）；およびＢｉｅｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１９３：４５５−４７９（１９９０）を参照のこと。
【００３１】 ２つの基礎的なストラテジーが、タンパク質混合物から分離した後のタンパク
質のＭＳ同定について提唱されている：１）質量プロフィールフィンガープリン
ト（「ＭＳ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」，Ｊａｍｅｓ，ら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９５：５８−６４（１９９３
）およびＹａｔｅｓ，ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：３９７−４０８
（１９９３）を参照のこと）、および２）ＭＳ／ＭＳによる１以上のペプチドド
メインの配列決定（「ＭＳ／ＭＳ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」，Ｗｉｌｍ，ら，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３７９：４６６−４６９（１９９６）；Ｃｈａｉｔ，ら，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２６２：８９−９２（１９９３）；およびＭａｎｎ，Ｍ．，ＩＢＣ Ｐ
ｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，Ｂｏｓｔｏｎ，
ＭＡ（１９９７年１１月１０−１１日）を参照のこと）。インタクトなタンパク
質のタンパク質分解消化によって産生された、いくつかのペプチドの正確に測定
された質量、およびペプチド質量フィンガープリントを有する公知のタンパク質
についてデータベースの検索によってＭＳフィンガープリントは達成される。Ｍ
Ｓ／ＭＳ配列決定は、ＭＳ／ＭＳ装置の四重極における配列特異的フラグメンテ
ーションイオンの生成によってタンパク質の１以上のＰＳＴの実際の決定を含む
。
【００３２】 プロテオミクスデータへの増加する需要の点から、複合タンパク質サンプルの
分離および配列決定のための方法が必要とされる。さらに、複合体サンプルにお
けるタンパク質の分離と配列決定をさらに容易にするために、新しいタンパク質
標識方法が必要とされる。驚くべきことに、本発明は、タンパク質混合物の標識
のための新しい方法を提供する。本明細書中に記載される技術は、タンパク質同
定および疾患状態または発生科学に対するタンパク質発現の相関関係のプロセス
の速度を増す。
【００３３】 （代謝分析） 生化学研究における１つの目的は、細胞、組織および特定の細胞または組織状
態（例えば、疾患状態、特定の発生段階、特定の環境刺激への曝露から生じる状
態および治療処置と関連する状態）における特定の分子の存在、非存在、濃度、
変換率、または輸送率の間の相関関係を発達することである。このような相関関
係は、疾患、細胞発生および分化のメカニズム、ならびに新しい治療的、薬剤標
的および／または疾患マーカーの同定における顕著な洞察を提供するための可能
性を有する。
【００３４】 ゲノムに基づいた研究は、このような研究で取られるアプローチの１つの型の
例である。代表的に機能的ゲノムは、特定の条件または状態への細胞性応答の示
す際のｍＲＮＡレベルの変化に集中する。しかし、ｍＲＮＡレベルによって測定
される遺伝子発現と生成された活性な遺伝子産物（すなわちｍＲＮＡによってコ
ードされるタンパク質）との間の低い相関関係がしばしば存在することを、最近
の研究は実証した。この知見は、特に驚くべきことではない。なぜなら多くの因
子（翻訳効率、回転率、細胞外発現または分画化における差、および翻訳後修飾
を含む）が、転写調節のタンパク質レベルに独立して影響するからである。
【００３５】 別のアプローチは、プロテオミクスであり、用語が示唆するように、これは、
種々の細胞の状態において存在するタンパク質に焦点を合わせる。特にタンパク
質活性が、タンパク質をコードするｍＲＮＡの濃度以外の因子をしばしば決める
ことを示唆することが記載された知見を考慮して、プロテオミクス研究を行う理
論的根拠は、部分的に、細胞生物学の特定の局面が、核酸レベルよりもタンパク
質レベルの項目表（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）を考慮することにより、よりよく理解
され得るという見地に基づく。
【００３６】 核酸またはタンパク質のいずれかに主に集中するかわりに、本発明は、異なる
アプローチをとり、そして細胞性代謝を通じて形成された細胞に存在する代謝を
調べる。このようなアプローチは、メトミクス（ｍｅｔｏｍｉｃｓ）と呼ばれる
。より具体的には、メトミクスは、代謝フラックスの研究および生物（または細
胞の集団あるいは組織）の生理的状態の機能としてのこれらのフラックスの変化
の研究に関する。メトミクス研究は、例えば、生物または細胞集団の生理学的状
態における変化を生じるか、または変化の結果として起こる特定の代謝パターン
を同定することを含み得る。メトミクス研究は、タンパク質およびｍＲＮＡの発
現パターンにおける変化に相関し得、また生物または細胞集団の生理学的状態に
おける変化から生じる。
【００３７】 代謝は、細胞の維持および増殖を一緒に支持する異化（エネルギーおよび前駆
体産生）および同化（生合成）の酵素学的な経路の複雑なネットワークからなる
。この酵素学的反応のネットワークを通じた化合物の流れは、細胞周期（Ｉｎｇ
ｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，ら，Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｃｅｌｌ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，
ＭＡ，（１９８３））食餌、細胞外栄養素の有用性、および細胞性ストレスへの
曝露（例えば、化学的毒素および生化学的毒素または感染因子で異なる。調節に
おける主要な代謝経路および因子は、任意の一般的な生化学の教科書（例えば、
Ｖｏｅｔ，Ｄ．およびＶｏｅｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ
．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８１）；およびＷｈｉｔｅ
，Ａ．，ら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第６版
．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９７８），これら
の各々は、その全体が参考として援用される）を含む）において議論される。
【００３８】 代謝は、異なる条件および刺激に適応可能でなければならないので、細胞は、
代謝を調節するために自由に種々のメカニズムを有する。例えば、特定の調節メ
カニズムは、割合を調節し、この割合で代謝産物は細胞に入る。非常にわずかな
物質は、細胞膜を超えて拡散可能であるので、このような調節は代表的に、細胞
の活性または受動的輸送メカニズムの１つを経由して生じる。
【００３９】 輸送調節に加えて、多くの異なるメカニズムは、代謝経路の一部である酵素の
活性を調節するために機能し得る。例えば、酵素によって産生される産物は、フ
ィードバック阻害を経由して酵素の活性を調節するために作用し得る。酵素はま
た、アロステリックな部位（すなわち、酵素の活性部位以外の部位）に結合する
リガンドによって調節され得る。アロステリックな調節が急速な時間の応答（新
しいタンパク質の誘導および合成について要求されるより短い時間、１０分未満
）、ならびにバックグラウンドの要求における変化に対する酵素活性の調節（フ
ィードバック調節）において重要であることが示唆される（Ｃｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ
．，ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｇｕｌ
ａｔｉｏｎ．，２７：３（１９８５）；Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．，ら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２１７：２２０（１９８２）；Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．および
Ｃｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，１３：５３（１９７８））。アロステリック調節は
、細菌がそれらの環境を検出するために使用する主要な方法であり、既に合成さ
れたタンパク質の活性の調節およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびリプ
レッサータンパク質の調節を介した新しいタンパク質合成を誘発することの両方
による（Ｍｏｎｏｄ，Ｊ．，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：３０６（１９６
３））。アロステリック調節は、多量体タンパク質（いくつかのサブユニットは
、一致した様式で働く）に関連し得るか、および／または調節カスケード内に関
連し得る：（１）異なる調節リガンドが活性に影響するために、より多くの部位
を提供するために（２）応答の割合を拡大するために（３）応答の大きさを拡大
するために、および／または（４）応答の感度を拡大するために、関連し得る（
Ｃｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ．，ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．，２７：３（１９８５）；Ｋｏｓｈｌａｎｄ，
Ｄ．Ｅ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１７：２２０（１９８２）；Ｓｔａｄｔｍａ
ｎ，Ｅ．Ｒ．およびＣｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉ
ｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，１３：５３（１９７８））。
【００４０】 発現の調節は、別の代謝調節メカニズムを成す。小数のタンパク質をコードす
る一致した遺伝子のセットは、オペロンと呼ばれる同じ転写調節配列下で、しば
しば組織化される。しかし、必要な順応できる変化が、多数のタンパク質の誘導
を伴う場合、多くのこのようなオペロンはレギュロンに連結され得る。例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、後の刺激は、括弧内に示される多くのタンパク質を誘導
する：（ａ）熱ショック（１７のタンパク質）、（ｂ）窒素飢餓、（５以上のタ
ンパク質）（ｃ）リン酸塩飢餓（８２以上のタンパク質）、（ｄ）浸透ストレス
（１２以上のタンパク質）、および（ｅ）ＳＯＳ応答（１７タンパク質）（Ｎｅ
ｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら．（編），
第３頁，Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
， ＤＣ．，（１９８７）；Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．およびＶａｎ Ｂｏ
ｇｅｌｅｎ，Ｒ．Ａ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（編）．，第１
３３４頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７）；Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｂ
．およびＮｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄ
ｔ（編），第１３１８頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７）；（Ｖａｎ
Ｂｏｇｅｌｅｎ，Ｒ．Ａ．，ら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１１：１１
３１（１９９０））；Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａ
ｒｄｔ（編），第１３２６頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７））；（
Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｍ．Ｆ．ら，Ｃｅｌｌ，１４：７５３（１９８５）；およ
びＷａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｃ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（編），第１３
４６頁，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７）を参照のこと）。従って、レ
ギュロンは、細胞が、時折一致した様式で、特定の刺激に応答するために必要で
あるが、個々の調節に独立して応答するために、他の時必要である遺伝子を調節
することを可能にする（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅ
ｉｄｈａｒｄｔら．（編），第３頁，Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，（１９８７））。
【００４１】 分解は、代謝を調節するための別の調節メカニズムである。ほとんどのタンパ
ク質が、少なくとも安定した増殖の条件下で非常に安定であり、おそらく、細胞
がそれらを作るためにとても高い犠牲を払うからである。しかし、幾人かの研究
者は、不安定な（６０分以下の半減期を示す）限定されたクラスの細胞性タンパ
ク質（細菌の指数関数的増殖の間に存在する合計のタンパク質の１０〜３０％）
を観察した。このクラスのタンパク質は、任意の増殖ダウンシフトおよび指数関
数的増殖の間の１０時間以内に迅速に回転するようである（Ｎａｔｈ，Ｋ．およ
びＫｏｃｈ，Ａ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６：６９５６（１９７
１）；Ｓｔ．Ｊｏｈｎ，Ａ．Ｃ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，１４３：１２２３（１９８０））。少なくともこれらの不安
定なタンパク質のいくつかは、エネルギーおよび栄養素がダウンシフトの間、タ
ンパク質合成系のタンパク質（例えば、リボソームタンパク質）である（Ｄａｖ
ｉｓ，Ｂ．Ｄ．，ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６：４３９（１９８６）
）；Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，ら，Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒ
ｌａｎｄ，ＭＡ，（１９８３）；Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｈ．Ｂ．およびＯｋａｍｕ
ｒａ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０：４４２（１９７２））。この
結論は、タンパク質合成タンパク質のユニットあたりのタンパク質合成の見かけ
の速度は、低い増殖速度で減少するが、しかし誘導酵素の始めの合成に必要な時
間は、すべての増殖速度で一定であるという観察から引き出される（Ｉｎｇｒａ
ｈａｍ，Ｊ．Ｌ．，ら，Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃ
ｅｌｌ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ
，（１９８３））。
【００４２】 異なる細胞状態および代謝の間の相互関係、およびメトミクスの焦点は、ゲノ
ミクス（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）とプロテオミクスとで異なるという事実が与えられ
、本発明は、細胞内の細胞状態と生体分子のと間の相関関係の新しい洞察を得る
ためにメトミクス研究を利用する。
【００４３】 （コンピューターデータベースおよびバイオインフォマティクス） 生物学的サンプルから関連するおよび／または絶対的な存在比の種々の分子お
よび高分子種を同定および／または定量するために記載された方法は、とりわけ
、病的状態、疾患の素因（ｐｒｅｄｏｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、薬剤試験、治療的
モニタリング、遺伝子疾患原因連結、免疫および生理学的状態の相関関係の同定
と関連付けられる過剰の情報を提供する。これらの方法によって産生される大量
の生データは、手動のレビューおよび高スピードのコンピューターを使用してプ
ロセスする前のデータの無い分析に十分に適さないので、生体分子情報を指数付
けおよび検索するためのいくつかの方法が提案されている。米国特許第６，０２
３，６５９号および同第５，９６６，７１２号は、生体分子配列情報を保管する
ために関係のデータベースシステムを開示する。このシステムの様式は、配列が
目録作成され、そして１以上のタンパク質機能階層に従って検索されることを可
能にする。米国特許第５，９５３，７２７号は、フォーマットに情報を含む配列
記録を有する関係のデータベースを開示する。このフォーマットは、部分的な長
さのＤＮＡ配列の収集が、目録作製され、そして部分的な長さの配列の収集から
全長配列を得るために１以上の配列決定プロジェクトとの関連に従って検索され
ることを可能にする。米国特許第５，７０６，４９８号は、キー配列と標的配列
との間の類似度の程度に基づいて遺伝子データベース内の配列データ項目に類似
の遺伝子配列を検索するための遺伝子データベース検索システムを開示する。米
国特許第５，５３８，８９７号は、クローズネスオブフィット（ｃｌｏｓｅｎｅ
ｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）測定を使用する実験的に誘導された質量スペクトルを有す
る予測質量スペクトルの比較によってコンピューターデータベース内のアミノ酸
配列を同定するためにペプチドの質量分析フラグメンテーションパターンを使用
する方法を開示した。米国特許第５，９２６，８１８号は、オンライン分析プロ
セシング（ＯＬＡＰ）として記載される多次元データ分析のための機能性を含む
多次元データベースを開示する。ＯＬＡＰは、１より多い強化経路または次元に
従って計画された、かつ実際のデータの強化を伴う。米国特許第５，２９５，２
６１号は、ハイブリッドデータベース構造を報告する。このデータベース構造に
おいて、各データベース記録のフィールドは、２つのクラス、ナビゲーショナル
データおよびインフォメーショナルデータに分けられる。これらのクラスは、階
層的なトポロジーマップに保存されたナビゲーショナルフィールドを有する。こ
のトポロジーマップは、ツリー構造としてか、または２以上のこのようなツリー
構造の混同として見られ得る。
【００４４】 上記データベース技術は、取り戻せる形態での組み込み、分析および目録作成
ために必要な完全な解決、本明細書中で開示され、そして相関関係を提供するた
めの分析方法よって得られる潜在的に有用な情報の富およびこのような情報と医
学的条件などとの間の特徴的な連結を提供しない。
【００４５】 （タンパク質発現データベースの適用） 現存するタンパク質発現プロファイリング技術の限定された有用性は、タンパ
ク質発現情報の小さなかつ不完全なデータベースを完全に得たが、この技術は、
より高解像度のタンパク質発現データセットの理論的な使用であり、それらは新
しい技術または改善された技術の点から利用可能になるとみなされている。
【００４６】 高分解能、高感度のタンパク質発現プロファイリング方法およびデータセット
が当該分野で利用可能となった場合、診断、治療、薬剤開発、バイオセンサー開
発、および他の関連した領域における顕著な進歩が可能である。例えば、多重疾
患マーカーは、疾患条件および段階のよりよい確認のために同定され、そして利
用され得る（米国特許第５，６７２，４８０号；同第５，５９９，６７７号；同
第５，９３９，５３３号；および同第５，７１０，００７号を参照のこと）。細
胞下の毒物学的な情報は、より直接の薬物構造および活性相関について産生され
得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅ
ｏｍｉｃｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
，」ＩＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで提示された論文，
Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ（１９９８年６月１１−１２日）を参照のこと）。細胞
下の毒物学的情報はまた、生物学的センサーデバイスにおいて、化学曝露のあり
得る毒物学的効果およびあり得るおとり（ｔｏｌｌｅｒａｂｌｅ）曝露閾値を予
測するために利用され得る。（米国特許第５，８１１，２３１号を参照のこと）
。
【００４７】 本発明は、組成物、方法、装置、および複数のポリペプチド種（例えば、細胞
、組織、および細菌、植物および動物の器官）を含むサンプルからのハイスルー
プット、高分解能および感受性タンパク質発現プロファイリングおよび関連局面
のためのコンピューターに基づいたデータベースシステム、およびその使用を提
供する。
【００４８】 本明細書中に議論される文献の引用は、もっぱら本適用の出願日前のそれらの
開示のために提供される。発明前の効力によってこのような開示の日付を早めな
いために、本発明者らが表題を付けた承認として解釈されるものは本明細書中に
はない。
【００４９】 （発明の要旨） 本発明は、生物学的な高分子（ポリペプチドを含む）を分離するための電気泳
動方法および装置、質量分析を使用するポリペプチドの部分的配列または完全配
列を決定するための方法、電気泳動方法と質量分析によるポリペプチド配列決定
を組み合わせた方法、サンプル（１または複数）からタンパク質発現フィンガー
プリントデータセットを作製するために、上記を使用する方法、および種々の使
用（診断、治療、薬剤発見、薬剤開発、バイオアッセイによる環境モニタリング
、毒素定量化、バイオセンサー開発、遺伝子治療、薬理学的モニタリング、違法
な薬剤試験、導入遺伝子、代謝工学、および本明細書中に記載されるか、または
本明細書に存在する教示によって当業者に明白な関連する使用を含むが、これら
に限定されない）のために上記タンパク質発現フィンガープリントデータセット
を使用するためのコンピューターに基づいたデータベースクエリ（ｑｕｅｒｙ）
および検索システムを提供する。本発明はまた、これらの方法、装置、組成物、
およびコンピューター処理されたデータセット紹介および検索システムの各々の
使用を提供する。
【００５０】 １つの局面において、本発明は、複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液か
らあるポリペプチドを分離し、そしてそのポリペプチド種を同定するための方法
を提供し、この方法は、この複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液をキャピ
ラリー電気泳動装置で電気泳動して、ポリペプチド種を分離および溶出し、それ
によりそのタンパク質種を、少なくとも１つの第１の生物物理的パラメーター（
これはタンパク質種を識別する）に基づいて分離する工程；および溶出したポリ
ペプチド種の質量分析フラグメンテーションにより、少なくとも１つの分離され
たタンパク質種を同定するポリペプチド配列タグ（「ＰＳＴ」）を得る工程を包
含する。この方法の変形物において、少なくとも２つのキャピラリー電気泳動法
が、１つ以上の溶出されたポリペプチド種の質量分析フラグメンテーションの前
に引き続いて使用される。この方法の変形物において、適切な質量分析標識が、
質量分析フラグメンテーションの前にポリペプチドに共有結合される。この方法
の変形物において、ＰＳＴは、溶出されたポリペプチド種のカルボキシおよび／
またはアミノ末端配列のアミノ酸残基の少なくとも２つ、好ましくは、３または
４個のアミノ酸残基を含む。この方法の一実施形態において、サンプル溶液中に
存在するポリペプチド種の少なくとも７５％が、分離され、そしてＰＳＴ測定に
より同定される。この方法の一実施形態において、サンプル溶液中に存在する少
なくとも５，０００個の固有ポリペプチド種が、分離され、そしてＰＳＴ測定に
より同定され；好ましくは７，５００以上の固有ポリペプチド種が分離され、そ
してこの方法で同定され得る。この方法の一実施形態において、サンプル溶液中
のポリペプチド種は、組織、器官または細胞集団のサンプルから得られる天然に
存在するポリペプチドである。
【００５１】 １つの局面において、本発明は、細胞集団またはその抽出物を含むタンパク質
を含むサンプルから、タンパク質発現プロフィールを得る方法を提供し、この方
法は、以下の工程を包含する：第１のキャピラリー電気泳動装置で、細胞集団か
ら得られる複数のタンパク質種を含む溶液を電気泳動し、それによりこのタンパ
ク質種を、少なくとも１つの第１の生物物理的パラメーター（これはタンパク質
種を識別する）に基づいて分離する工程、この第１の電気泳動装置からの画分を
溶出し、そしてこの画分を、別々に第２のキャピラリー電気泳動装置で電気泳動
し、それによりこのタンパク質種を、少なくとも１つの第２の生物物理的パラメ
ータ（これはタンパク質種を識別する）に基づいて分離する工程、およびこのタ
ンパク質種を溶出し、そして質量分析フラグメンテーションにより、そのサンプ
ルから複数のタンパク質種のＰＳＴを同定する工程。一実施形態において、サン
プルから分離された少なくとも１，０００個のタンパク質が、ＰＳＴ測定により
同定され；一実施形態において、サンプルから分離された少なくとも５，０００
〜７，５００以上のタンパク質が、ＰＳＴ測定により同定される。変形物におい
て、２つのサンプルが用いられ、第１のサンプルは標準（コントロールまたは正
常）細胞集団由来であり、第２のサンプルは試験細胞集団由来であり；試験細胞
集団は、例えば、以下であり得るが、これらに限定されない：標準細胞集団とは
異なる組織型の細胞、標準細胞と同じ組織型の病理細胞、毒物学的または薬理学
的薬剤に暴露されたが、標準細胞と同じ組織型を有する処理細胞、標準細胞と異
なる継代レベルもしくは年齢、または複製潜在性を有する細胞、あるいは第１の
細胞サンプルと第２の細胞サンプルとの間のタンパク質発現プロフィールの差異
を確認しようとしている当業者に明らかな任意の他の変形物。一実施形態におい
て、試験細胞集団は、推定腫瘍性病巣の生検であり、そして標準細胞集団は、同
じ組織学的器官の非腫瘍性組織を明らかに取り囲む生検であり、この両方の生検
はヒト患者、動物または植物（例えば、根頭癌腫）から得られる。
【００５２】 本発明は、タンパク質の混合物を分離するための様々な電気泳動法および装置
を提供する。これらの方法は、複数のキャピラリー電気泳動法を連続して実施す
る工程を包含し、ここで、最初の方法以外の各方法についてのサンプルは、上記
の工程由来のタンパク質のサブセット（例えば、上記の工程により分離したタン
パク質を含む画分）のみを含む。電気泳動の間、溶出を制御するための様々な技
術を使用することによって、これらの方法は、組織およびネイティブの細胞から
得られるような複雑な混合物においてでさえ、タンパク質を分離し得る。様々な
標識スキームおよび検出方法を利用して、特定の方法は、分離したタンパク質の
各々の量についての定量的情報を提供し得る。このような情報は、特定の条件下
で発現されるタンパク質が特徴付けおよび分類されるタンパク質のデーターベー
スの開発において使用され得る。異なる型の細胞または組織の間で差示的に発現
されるタンパク質を同定するための比較研究はまた、本発明の方法と共に行われ
得る。これらの方法はまた、診断的研究、構造活性研究、および代謝工学研究に
おいて使用され得る。
【００５３】 一般に、これらの方法は、複数の電気泳動法を連続して行う工程を包含する。
一連の各方法は、複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動して、複数の分離
したタンパク質を得る工程を包含する。電気泳動されるサンプルは、上記の一連
の方法（サンプルが全てのタンパク質を含む初期のサンプルであるシリーズの第
１の方法を除く）により同時に分離された複数のタンパク質のサブセットのみを
含む。最後の電気泳動法により分離したタンパク質は、次いで、様々な技術を使
用して検出される。
【００５４】 電気泳動法は典型的に、キャピラリー電気泳動法（例えば、キャピラリー等電
点集束電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、および
キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ））であるが、これらの方法は同様に、他の
キャピラリー電気泳動法に受け入れられる。これらの方法の特定の順序は変わり
得る。典型的に、これらの方法は、異なる特徴（例えば、サイズ、電荷、等電点
）に基づいてタンパク質を分離する電気泳動法の組み合わせを利用する。
【００５５】 特定の方法において、タンパク質は標識され、その結果、分離されたタンパク
質は容易に検出され、そしてシグナル対ノイズ比を増加する。また、標識化によ
り、特定の方法が、最終の電気泳動方法から得られる分離されたタンパク質が定
量化されるように実施され得る。定量化により、サンプル中、または異なるサン
プル中のタンパク質の相対存在比が決定され得る。特定の方法において、タンパ
ク質が標識される時期は、キャピラリーゾーン電気泳動による電気泳動の前にな
るように選択される。特定の残基を選択的に標識することによって、キャピラリ
ーゾーン電気泳動の間のタンパク質の分解は増加され得る。
【００５６】 分離、定量および再現性は、様々な技術を利用して、電気泳動法の間、タンパ
ク質の溶出を制御することによって高められる。用いられる特定の溶出技術は、
部分的に、特定の電気泳動法に依存する。しかし一般に、水力学、塩可動化、ｐ
Ｈ可動化、および電気浸透流が、各電気泳動分離の最後に、分離されたタンパク
質を制御的に溶出するために利用される。
【００５７】 いくつかの方法は、電気泳動分離後に、さらなる分析を提供する。このタイプ
の分析は変わり、そして例えば、赤外線分光法、核磁気共鳴分光法、ＵＶ／ＶＩ
Ｓ分光法、完全配列決定または部分配列決定を含む。特定の方法において、最終
画分中のタンパク質は、分離されたタンパク質のそれぞれについて、少なくとも
部分的な配列を決定する（すなわち、タンパク質配列タグを決定する）ために、
質量分光法によりさらに分析される。
【００５８】 従って、特定の他の方法は、１つ以上のキャピラリー電気泳動法を実施する工
程を包含し、この１つ以上の方法の各々は、（ｉ）キャピラリー内に含まれる電
気泳動媒体中の複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動する工程、および複
数の画分を取り除き、回収する工程を包含し、各画分は電気泳動工程の間に分離
されたタンパク質を含む。一連の工程の各々は、タンパク質の元の混合物を含む
サンプルを用いて行われる第１の電気泳動法以外、上記の電気泳動法において回
収された画分由来のサンプルを用いて行われる。最後の電気泳動法を行う前に、
最初のサンプル中のタンパク質が標識される（すなわち、標識工程が全ての電気
泳動分離の前に起こる）か、または最後の電気泳動法の前に回収された画分中に
含まれるタンパク質が標識される。最後の電気泳動法が実施され、そしてその最
終方法を実施するために使用されたキャピラリー内またはそこから除去した分離
されたタンパク質が、検出器で検出される。それ故、この検出器は最終方法で使
用されたキャピラリー内の分離されたタンパク質を検出するように適合されるか
、またはその分離されたタンパク質がキャピラリーから溶出されると、その分離
されたタンパク質を検出するように、キャピラリーとラインで接続される。いく
つかの場合において、検出されたタンパク質は定量化され、そして相対存在比を
決定し、各分離されたタンパク質のタンパク質配列を確立するために、質量分光
法によりさらに分析される。
【００５９】 １つの局面において、本発明は、タンパク質の一部を配列決定するための方法
を提供し、この方法は、以下： （ａ）タンパク質をＣ末端またはＮ末端標識部分と接触させて、標識をタンパ
ク質のＣまたはＮ末端に共有結合し、そして標識タンパク質を形成する工程；お
よび （ｂ）標識タンパク質を、質量分析フラグメンテーション法を使用して分析し
、少なくとも２つのＣ末端または２つのＮ末端残基の配列を決定する工程、を包
含する。
【００６０】 実施形態の一群において、この方法は、以下： （ｃ）少なくとも２つのＣ末端または２つのＮ末端残基の配列を使用すること
によって、タンパク質を同定し、遺伝子配列データのデーターベースから予測タ
ンパク質配列を検索する工程、をさらに包含する。
【００６１】 変形物において、この方法は、以下： （ｄ）１つ以上の分離座標（すなわち、配列決定の前にタンパク質を分離する
ために使用される生物学的パラメーターの適切な値）、例えば、見かけの分子量
、等電点、または電気泳動易動度を使用することによって、タンパク質をさらに
同定する工程、をさらに包含する。
【００６２】 別の変形物において、この方法は、以下： （ｅ）タンパク質の他の既知の生物学的または測定可能な生物物理的パラメー
タ（例えば、抽出される細胞または組織型、細胞下の局在化、全または部分アミ
ノ酸組成、化学消化または酵素的消化から得られる任意のペプチドの質量）を使
用することによって、タンパク質をさらに同定する工程、をさらに包含する。
【００６３】 変形物において、この方法は、反応性衝突気体の使用による、質量分析計にお
ける標識タンパク質の補助断片化をさらに包含する。代表的な反応性気体には、
ヒドラジン、臭化シアン、過酸化水素、オゾン、および過酢酸が挙げられ得る。
他の類似の反応性気体が当業者に明らかである。
【００６４】 別の変形物において、この方法は、イオン化ゾーンに高エネルギー物質を注入
することによる、質量分析計での標識タンパク質の補助フラグメンテーションを
さらに包含する。高エネルギー物質には、プラズマまたはコロナ放電において形
成される過渡的成分、β放射体または電子ビームによる高エネルギー電子、５６
０ｎｍの最小波長のレーザーまたは高強度光源による高エネルギー光子が挙げら
れ得る。他の高エネルギー物質が当業者に明らかである。
【００６５】 別の局面において、本発明は、タンパク質混合物中のタンパク質の一部を配列
決定するための方法を提供し、この方法は、以下： （ａ）タンパク質混合物を、Ｃ末端またはＮ末端標識部分と接触させて、標識
を、タンパク質のＣまたはＮ末端に共有結合して、標識タンパク質混合物を形成
する工程； （ｂ）この標識タンパク質混合物中の個々の標識タンパク質を分離する工程；
および （ｃ）質量分光法により、工程（ｂ）由来の標識タンパク質を分析して、少な
くとも２つのＣ末端または２つのＮ末端残基の配列を決定する工程、を包含する
。
【００６６】 実施形態の一群において、この方法は、以下： （ｄ）少なくとも２つのＣ末端または２つのＮ末端残基の配列を、標識タンパ
ク質の分離座標および配列のタンパク質末端位置と組み合わせて使用することに
よって、タンパク質を同定して、遺伝子配列データーのデーターベースから予測
タンパク質配列を検索する工程、をさらに包含する。
【００６７】 上記の方法の各々において、イン−ソース（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ）フラグメン
テーションによる非タンパク質分解性タンパク質配列決定法の使用は、従来のＭ
Ｓ／ＭＳ配列決定アプローチをこえる利点を提供する。１つの特定の利点は、タ
ンパク質消化工程の排除および四極への低揮発性ペプチドイオンの蓄積の必要性
の排除に起因する時間の節約である。別の利点は、質量スペクトルの低末端で作
用することにより得られる改良された絶対的な質量精度に起因して、より少ない
配列あいまい性が生じることである。さらに別の利点は、よりエネルギー性のイ
オン化条件を使用し、そして１つ以上の荷電基を標識フラグメントに付加するこ
とにより、より良いイオン化効率および対応する検出感度が生じることである。
「かたい（ｈａｒｄ）」電荷からなる荷電基は、テトラアルキル−またはテトラ
アリール−アンモニウム、テトラアルキル−またはテトラアリール−ホスホニウ
ム、Ｎ−置換ピリジニウム、あるいはテトラアルキル−またはテトラアリール−
ボレート種のような永久的にイオン化された基である。荷電基はさらに、「やわ
らかい（ｓｏｆｔ）」電荷からなり、これはカルトキシレート、ホスホネート、
スルホネート、アルキルアンモニウム、ピリジニウム種のような、プロトンを受
容または供与して、イオン化されるイオン化可能基である。この方法は、連続し
たタンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を提供し、このＰＳＴは、遺伝子配列情報また
はｍＲＮＡ配列情報を含むコンピューターデーターベースの問い合わせによる明
白なタンパク質の同定のために使用され、ＰＳＴに対応する天然に存在するコー
ド配列を確立するか、またはポリメラーゼ連鎖反応増幅または核酸ハイブリダイ
ゼーション技術によるネイティブの細胞または組織サンプルから対応するｃＤＮ
Ａを単離するのに有用な、Ｎ末端またはＣ末端核酸プローブを生成し得る。
【００６８】 本発明は、電気泳動分離およびその後のタンパク質の配列決定をする際、その
タンパク質の増加した定量のために適切な化学標識の同定および使用方法をさら
に提供する。一実施形態において、単一の化学標識は：（ｉ）タンパク質上の１
級アミノまたはカルボン酸官能基（Ｎ末端およびＣ末端を含む）と反応し、（ｉ
ｉ）検出感度を上げ、そして（ｉｉｉ）質量分析器によるフラグメンテーション
の間に生成するＮまたはＣ末端標識ペプチドフラグメントに固有の質量サインを
提供する、基を含む。変形物において、この標識は、同位体的に異なる標識の混
合物からなり得、その結果、固有の質量サインは、質量スペクトルにおいて単一
の荷電状態の１つ以上の原子により分離される各ペプチドフラグメントにつき、
２つ以上のピークからなる。別の変形物において、この固有の質量サイン成分お
よび検出増加成分は、１つおよび同一であり得る。別の実施形態において、化学
標識は、部分切断、および／またはタンパク質定量のためのその使用の後、かつ
タンパク質配列決定のためのその使用の前の付加により、改変され得る。１つの
変形物において、標識の付加または切断は、最後のキャピラリー分離工程と質量
分析器への注入との間の除去および移送の間、溶液中で行われる。別の変形物に
おいて、標識の付加または切断は、質量分析器におけるイオン化の間、気相で行
われる。
【００６９】 本発明は、揮発性緩衝液および界面活性剤を最終キャピラリー電気泳動法に導
入して、分離および質量分析検出法の直接結合を容易にする方法をさらに提供す
る。揮発性緩衝液は、質量分析器中のタンパク質またはペプチドのイオン化を妨
害する揮発性有機化合物に対してプロトンを容易に受容または供与するアニオン
およびカチオンからなる塩である。例示的な例には、酢酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、または炭酸水素アンモニウム、Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸ア
ンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ピリジウム、およびＮ−モルホ
リノエタンスルホン酸ピリジウムが挙げられる。揮発性界面活性剤の例示的な例
には、ドデシルスルフェート、および少なくとも５個の炭素原子を有する脂肪族
炭化水素の部分的にフッ素化またはペルフルオロ化されたカルボン酸、スルホン
酸またはリン酸の、アンモニウム、ピリジニウム、テトラメチルアンモニウム、
およびトリメチルアンモニウム塩が挙げられる。多くの他の例が当業者に明らか
である。
【００７０】 本発明は、現在のＭＳベースのタンパク質配列決定技術に関連する多くの難点
（例えば、イオン化の非効率およびフラグメント質量の不正確さを含む）を克服
する。本発明の方法は、好ましくは、タンパク質分解または化学分解消化の必要
性を排除するため、本発明の方法は、従来の方法を使用して得られ得る時間から
有意に減少したタンパク質配列決定時間を提供する。さらに、配列決定されてい
るタンパク質は、本発明の方法を使用して高度にフラグメンテーションされるた
め、イオン化効率および得られるフラグメントの揮発性は、親タンパク質のそれ
より高く、従って、従来の方法をこえて改良された検出感度を導く。
【００７１】 本発明は、タンパク質サンプル中の複数の異なるタンパク質を標識する方法を
提供し、この方法は、タンパク質サンプルを、固有のイオン質量サイン成分、定
量検出成分および反応性官能基を含む標識試薬と接触させて、標識を複数の異な
るタンパク質の少なくとも一部分に共有結合する工程を包含する。好ましくは、
このタンパク質サンプルは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも１０
個、より好ましくは、少なくとも５０個、そしてさらにより好ましくは、少なく
とも１００個の異なるタンパク質を含む。本明細書中で使用されるタンパク質サ
ンプルは、好ましくは、生物学的サンプル（例えば、細胞、組織、細菌の体液お
よび器官、植物、動物、ならびにヒト）由来である。
【００７２】 本明細書中で使用される標識試薬は、固有のイオン質量サイン成分、定量検出
成分、および反応性官能基を有する。好ましい定量検出成分は、放射性同位体、
蛍光残基および発光団から選択される。他の検出増強成分は、質量分析イオン化
チャンバにおけるフラグメンテーション条件下で、正電荷または負電荷のイオン
種を与える基である。適切な基には、４級アンモニウム、４級ホスホニウム、な
らびに４級アリールおよびアルキルボレート基が挙げられる。好ましい反応性官
能基は、１級アミンと反応性の官能基、およびカルボン酸と反応性の官能基から
選択される。適切なアミン反応性基には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルおよびイソチオシアネートが挙げられる。適切なカルボン酸反応性基には、カ
ルボジイミド化学および無水物化学により結合した１級アミンが挙げられる。好
ましい固有イオン質量サイン成分は、２０個の天然のアミノ酸のいずれかの残基
質量に一致しないタンパク質フラグメントに質量を与える基である。さらに好ま
しい固有イオン質量サイン成分は、約１００原子から約７００原子のタンパク質
フラグメントに質量を与える基である。さらに他の好ましい固有イオン質量サイ
ン成分は、標識試薬にある比の安定同位体、好ましくは、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、お
よび37Ｃｌのような安定同位体を組み込む基である。より好ましくは、標識に組
み込まれる安定同位体の数は、標識の同位体リッチの形態と標識の同位体が乏し
い形態との間の、５〜２０原子の質量単位の差を与えるのに十分である。最も好
ましくは、標識の同位体リッチの形態と同位体が乏しい形態の比は、ほぼ等モル
である。
【００７３】 本発明は、目的の代謝物を精製および検出する際有用性を有する装置および方
法を提供する。この精製および検出方法により、どのように目的の代謝物の様々
なパラメーター（例えば、代謝物濃度および／またはフラックス）が、異なる細
胞状態または異なる刺激への暴露の関数として変動するかを決定し得る。従って
、これらの方法を使用して、特定の細胞状態または刺激に関連する代謝物をスク
リーニングし得る。このような情報を使用して、異なる細胞状態および／または
特定の刺激に対する応答に特徴的な代謝の「フィンガープリント」または「プロ
フィール」を開発し得る。この情報をまた使用して、メトミック（ｍｅｔｏｍｉ
ｃｓ）データーベースを開発し得る。一旦、相関が確立されると、本発明の特定
の方法を利用して、特定の状態についてスクリーニングし得る。例えば、いくつ
かの方法は、個体をスクリーニングして、それらの代謝プロフィールと疾患のあ
る個体および／または健康な個体のものとの間の類似性に基づいて、特定の疾患
を有するかまたはその危険のある個体を同定する。
【００７４】 より詳細には、本発明は、様々な分離方法を含む。特定の方法は、複数のキャ
ピラリー電気泳動法を連続して実施する工程を包含する。一連の方法の各々は、
複数の代謝物、および潜在的に目的の１つ以上の標的分析物を含むサンプルを、
複数の分離された代謝物が得られるように電気泳動する工程を包含する。各方法
において電気泳動されるサンプルは、サンプルが初期のサンプルであるシリーズ
の第１の方法を除く、このシリーズの直前に記載した方法により分離される複数
の代謝物のサブセットのみを含む。最終の電気泳動法により分離された代謝物を
含む画分は、標的分析物の存在を決定するために分析される。このシリーズ内の
キャピラリー電気泳動法は、キャピラリー等電点集束電気泳動、キャピラリーゾ
ーン電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動からなる群から選択される。
【００７５】 特定の局面において、本発明は代謝経路を分析するための様々な方法を提供す
る。特定の方法は、安定同位体で標識した基質を被験体に投与する工程を包含し
、この基質中の同位体の相対同位体存在比は、基質の投与の前に知られている。
次いで、被験体は、１つ以上の標的代謝物を形成するように、この標識基質を少
なくとも部分的に代謝するのに十分な時間放置される。次いで、被験体から採取
されたサンプル中の複数の標的分析物中の同位体の存在比が決定され、その結果
、各標的分析物のフラックスについての値が確認され得る。フラックス値が決定
される複数の標的分析物は、基質および／または１つ以上の標的代謝物のいずれ
かである。標的分析物中の同位体の存在比は、同位体リッチの同位体対より豊富
な同位体の比（例えば、12Ｃ／13Ｃ、14Ｎ／15Ｎ、16Ｏ／18Ｏ、および34Ｓ／32 Ｓ）を決定し得る分析器を使用して決定される。このような分析器の例には、質
量分光器、赤外線分光器および核磁気共鳴分光器が挙げられる。
【００７６】 標的分析物中の同位体の存在比および対応するフラックス値を決定する前に、
典型的に、標的分析物は、サンプル中の他の成分から少なくとも部分的に分離さ
れる。一般に、これは、複数の電気泳動分離法を連続して行うことによって達成
され、その結果、１つの方法の後に得られる画分由来のサンプルは、引き続く電
気泳動法に使用される。用いられる実際の電気泳動法は変わり得るが、典型的に
、キャピラリー等電収点集束電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャ
ピラリーゲル電気泳動を含む。いくつかの場合において、電気泳動法の分離およ
び溶出条件は、１つ以上のクラスの代謝物（例えば、タンパク質、多糖類、炭水
化物、核酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂肪、脂肪酸、および有
機酸）について別の画分が得られるように制御される。標的分析物が属するクラ
スの成分を含む画分を簡単に分析し得るため、これは分析を簡単にする。
【００７７】 本発明はまた、被験体由来のサンプルが以前に得られた代謝経路を分析するた
めの分析方法を提供する。このような例において、特定の方法は、被験体から得
られるサンプル中に含まれる他の成分から、複数の標的分析物を少なくとも部分
的に分離する工程を包含する。この標的分析物は、安定同位体で標識された基質
、および／または被験体による基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝物を含
む。各標的分析物のフラックス値は、被験体に投与される前の基質中の同位体存
在比の知識から、および標的分析物中の同位体の存在比を決定することによって
、決定される。
【００７８】 様々な細胞状態（例えば、特定の疾患）と関連する代謝物を同定するために代
謝物をスクリーニングするための方法はまた、本発明に含まれる。特定のスクリ
ーニング方法は、安定同位体で標識した基質を、試験被験体およびコントロール
被験体に投与する工程を包含し、基質中の同位体の相対同位体存在比は知られて
おり、そして試験被験体は研究中の疾患を有する。標識基質は、試験被験体およ
びコントロール被験体により少なくとも部分的に代謝されて、１つ以上の標識代
謝物を形成する。投与および静置工程が行われる条件は、それらが試験被験体お
よびコントロール被験体について同一であるように制御される。サンプルは、試
験被験体およびコントロール被験体から得られ、そして標的分析物中の同位体の
相対存在比が決定されて、各標的分析物のフラックス値を得る。試験被験体およ
びコントロール被験体のフラックス値が比較され、試験被験体中の標的分析物の
フラックス値、およびコントロール被験体の対応するフラックス値における差は
、このような分析物が、研究されている疾患を潜在的に妨害することを示す。
【００７９】 サンプルが以前に入手された場合、特定のスクリーニング方法は、疾患を有す
る試験被験体由来のサンプルを分析する工程を包含し、このサンプルは、この試
験被験体に投与される安定した同位体で標識した基質および／またはこの基質の
被験体による代謝から得られる１つ以上の標的代謝産物を含み得る。この基質に
おける同位体の相対的な同位体存在度は、投与の時点で既知であり、そしてこの
分析する工程は、このサンプルにおける複数の標的分析物における同位体の同位
体存在度を決定し、各々の標的分析物のフラックスについての値を決定する工程
を包含する。この試験被験体における標的分析物についてのフラックス値は、コ
ントロール被験体に対するフラックス値と比較され、フラックス値の差は、この
ような分析物がその疾患と関係があることを示す。
【００８０】 別の局面において、本発明は、疾患の存在についてスクリーニングするための
方法を含む。これらの方法の確信は、安定な同位体で標識された基質を試験被験
体に投与する工程を包含し、この基質における相対的な同位体の存在度は、既知
である。十分な時間は、この標識された基質がこの試験被験体によって少なくと
も部分的に代謝されることを可能し、その疾患に関連する公知の１つ以上の標的
代謝産物を形成する。複数の電気泳動法は、この試験被験体から得られるサンプ
ルにおける他の生物学的成分由来の複数の標的分析物を少なくとも部分的に分離
するために連続して実行され、この標的分析物は、この基質および／または１つ
以上のこの標的代謝産物を含む。この標的分析物のフラックス値は、この分析物
における同位体の存在度から決定される。
【００８１】 この方法は、サンプルが提供される場合、単純化される。このような例におい
て、特定の方法は、試験被験体由来のサンプルを分析する工程を包含し、このサ
ンプルは、試験被験体に投与される安定な同位体で標識した基質および／または
この基質のこの試験被験体による代謝から得られる１つ以上の標的代謝産物を含
み、この基質における同位体の相対的な同位体存在度は、投与の時点で既知であ
る。この分析する工程自体は、このサンプルにおける複数の分析物における同位
体の存在度を決定し、各々の分析物のフラックスの値を決定する工程を包含し、
この複数の分析物は、この基質および／または１つ以上の標的代謝産物を含む。
各々の標的分析物について、この決定されたフラックス値は、同一の標的分析物
の対応する参照フラックス値と比較され、疾患の試験被験体の危険度を評価する
。この参照値は、健康状態または疾患状態の代表であり得る。
【００８２】 本発明は、細胞型、組織、または病理学的サンプルの高分解能タンパク質発現
フィンガープリントを同定する方法を提供し、この方法は、細胞サンプルのタン
パク質含有抽出物を得る工程およびこの抽出物を第１のキャピラリー電気泳動装
置を用いて電気泳動する工程、そこからタンパク質含有画分を溶出する工程、第
２のキャピラリー電気泳動装置でこのタンパク質含有画分を電気泳動する工程（
またはそれを複数、平行して）、およびフラグメント質量分析法配列決定によっ
てタンパク質の種類を同定し、複数のタンパク質の種類のＰＳＴを得る工程、な
らびにそれによって得られたＰＳＴの集合を含むデータセット（またはフィンガ
ープリント記録）を集計する工程を包含する。この方法のバリエーションは、タ
ンパク質の種類の定量的検出およびデータセットを集計する工程を包含し、ここ
で第２のキャピラリー電気泳動から溶出した複数のタンパク質の種類の、相対的
な存在度および／または絶対量は、ＰＳＴ同定を用いて相互作表される。代表的
な実施形態は、最後のキャピラリー電気泳動の工程の前にタンパク質含有画分に
おけるタンパク質への質量分析法標識の付着を含む。バリエーションにおいて、
２つより多いキャピラリー電気泳動の工程が用いられる；１つ実施形態において
、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）は、第１のキャピラリー電気泳動で
あり、そして第２のキャピラリー電気泳動は、キャピラリーゾーン電気泳動（Ｃ
ＺＥ）またはキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）のいずれかである。この方法
は、実質的に任意の代謝産物または代謝産物の集合（代謝産物フィンガープリン
ト）が、タンパク質発現フィンガープリントに加えて、または、これの代わりに
測定され得るように、改変され得る。このような改変において、このサンプルは
、測定されるべき代謝産物の種類を含み、そしてこのサンプルにおける代謝産物
の種類を定量するための検出および分離装置；代謝産物フィンガープリントを実
行するための適切な装置および方法論が本明細書中に記載される。
【００８３】 タンパク質発現フィンガープリントは、特定の識別子（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ
）（これは、ＰＳＴおよび／または電気泳動移動度データおよび／またはｐＩお
よび／またはキャピラリー電気泳動によって確認可能な任意のその他の生物物理
学的特性、および／または電気泳動前のこのサンプルの起源によって既知の任意
のその他の生物物理学的特性、および／または任意のその他の測定可能な生物物
理学的特性）を有する、各々の少なくとも１００個のタンパク質の種類のアレイ
含み、必要に応じて、定量データを用いる相互作表を含み、これは、このサンプ
ルにおける各々の種類の相対的存在度および／または絶対的存在度を示す。タン
パク質発現フィンガープリント記録は、サンプル供給源を示すデータおよび必要
に応じてその他の生物情報学的データ（病理学的状態、年齢、病歴など）に対し
て相互作表されたタンパク質発現フィンガープリントを含む。同様に、代謝産物
フィンガープリントは、少なくとも３つの代謝産物（各々５，０００ダルトン未
満の分子量）の種類のアレイを含み、そしてポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド以外であり、各々の代謝産物は、相対的存在度または絶対的存在度、１つ以上
のその他の測定される代謝産物との相対比、出現または消失の速度などを示すデ
ータに対して相互作表される特定の識別子を有する。
【００８４】 バリエーションにおいて、本発明は、コンピューターデータベースを産生する
方法を提供し、この方法は、コンピューター検索可能形態において各々のタンパ
ク質発現フィンガープリント記録が得られる、タンパク質含有サンプルの供給源
を特定するデータを用いて相互作表されるタンパク質発現フィンガープリント記
録の集合を、分類するためのコンピューターおよびソフトウェアを含む。バリエ
ーションにおいて、少なくとも１つの供給源は、病理学的障害でない既知の組織
サンプル由来である。バリエーションにおいて、少なくとも１つの供給源は、既
知の病理学的組織標本であり、例えば、ウイルスなどの感染因子を含む腫瘍性傷
害または組織標本であるが、これらに限定されない。バリエーションにおいて、
タンパク質発現フィンガープリント記録は、サンプルにおける各々のタンパク質
の種類に関する少なくとも以下のパラメータを相互作表する：（１）特定の同定
コード（これは、ＰＳＴおよび／または特徴的な電気泳動分離座標を含み得る）
；（２）サンプル供給源；必要に応じて（３）このサンプルにおいて存在するタ
ンパク質の種類の絶対量および／または相対量、必要に応じて（４）アミノ末端
またはカルボキシ末端の翻訳後修飾の存在または非存在、および／または必要に
応じて（５）タンパク質およびＰＳＴを同定するために用いられる元の電気泳動
図および／または質量スペクトル。データベースは、複数のタンパク質発現フィ
ンガープリント記録を含み、その各々は、１つのサンプルまたはその部分画分由
来のタンパク質発現フィンガープリントを示す。
【００８５】 本発明はまた、コンピューターデータ保存装置におけるこのようなポリペプチ
ドフィンガープリントの集合の保存および検索を提供し、これは、磁気ディスク
、光学ディスク、光磁気ディスク、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＧＲＡＭ、ＳＤＲＡ
Ｍ、ＲＤＲＡＭ、ＤＤＲ ＲＡＭ、磁気バブルメモリーデバイス、およびその他
のデータ保存デバイスを含み得、これは、ＣＰＵレジスタおよびオンＣＰＵデー
タ保存アレイを含む。代表的には、このポリペプチドフィンガープリント記録は
、磁化可能媒体上で磁気ドメインのアレイにおいてビットパターンとしてか、ま
たは荷電状態またはトランジスタゲート状態のアレイとして（例えば、ＤＲＡＭ
デバイスにおけるセルのアレイとして）保存される（例えば、各々のセルは、ト
ランジスタおよび荷電保存領域で構成され、これは、このトランジスタ上であり
得る）。本発明は、このような保存デバイスを提供し、そしてコンピューターシ
ステムは、その上に建てられ、サンプル供給源を用いて相互作表される少なくと
も１００個のタンパク質の種類の特定の識別子を含む、タンパク質発現フィンガ
ープリント記録をエンコードするビットパターンを含む。本発明は、関連ポリヌ
クレオチド配列または関連ポリペプチド配列を同定する方法を提供し、この方法
は、コンピューター保存デバイスまたはデータベースに保存してあるか、または
これから検索されるＰＳＴ配列と少なくとも１つの他の配列との間のコンピュー
ター比較を実行する工程を包含する；このような比較は、配列分析もしくは比較
アルゴリズムまたはそのコンピュータープログラム実施形態（例えば、ＦＡＳＴ
Ａ，ＴＦＡＳＴＡ，ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ）を含み得、そして／またはこの比
較は、標本のポリヌクレオチドサンプルから決定される配列のプールにおけるＰ
ＳＴ配列の相対量の比較であり得る。本発明はコンピューターシステムを提供し
、本発明の方法によって得られる、少なくとも１００個のタンパク質発現フィン
ガープリント記録を有する、データベースをエンコードするビットパターンを有
する保存デバイス、ならびに所定の遺伝子配列またはタンパク質配列に対する配
列アラインメントおよび比較のためのプログラムを含む。本発明はまた、磁気デ
ィスク（例えば、ＩＢＭ互換性（ＤＯＳ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｗｉｎ
ｄｏｗｓ９５／９８／２０００、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴ（登録商標）、ＯＳ／２
））のフロッピー（登録商標）ディスク、またはその他のフォーマット（例えば
、Ｌｉｎｕｘ、ＳｕｎＯＳ、Ｓｏｌａｒｉｓ、ＡＩＸ、ＳＣＯ Ｕｎｉｘ、ＶＭ
Ｓ、ＭＶ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈなど）のフロッピーディスクまたはハード（固定
化、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ）ディスクドライブを提供し、これは、タンパク質発
現フィンガープリント記録をエンコードするビットパターンを含む；しばしば、
このディスクは、本発明のタンパク質発現フィンガープリント記録以外の、ポリ
ヌクレオチド配列および／またはポリペプチド配列をエンコードする少なくとも
１つの他のビットパターンを含む（代表的には、コンピューター化配列分析、比
較、または相対的定量化法において検索および処理に適切なファイルフォーマッ
トにおいて）。本発明はまた、ネットワークを提供し、これは、データリンクを
介してリンクされる複数のコンピューターデバイス（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ
ケーブル（同軸または１０ＢａｓｅＴ）、電話線、ＩＳＤＮ線、ワイアレスネッ
トワーク、光ファイバー、またはその他の適切なシグナル伝達媒体）を含み、こ
れによって少なくとも１つのネットワークデバイス（例えば、コンピューター、
ディスクアレイなど）は、本発明のタンパク質発現フィンガープリント記録をエ
ンコードするビットパターンを含む磁気ドメイン（例えば、磁気ディスク）およ
び／または荷電ドメイン（例えば、ＤＲＡＭセルのアレイ）のパターンを含む。
本発明はまた、本発明のタンパク質発現フィンガープリント記録を伝送するため
の方法を提供し、これは、それを生成するために使用される方法論によって独特
に決定され、この方法は、電子通信デバイス（例えば、モデム、ＩＳＤＮターミ
ナルアダプター、ＤＳＬ、ケーブルモデム、ＡＴＭスイッチなど）上での電子シ
グナルを生成する工程を包含し、これによってこのシグナルは、それぞれ、タン
パク質発現フィンガープリント記録を（自然の状態または暗号化されたフォーマ
ットの状態で）エンコードするビットパターンか、本発明の方法によって得られ
る複数のタンパク質発現フィンガープリント記録を含むデータベースを含む。
【００８６】 本発明は、本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープリント
記録のＰＳＴ配列のアレイおよびその他のデータ構造を含むデータベースに対し
てクエリポリペプチド配列またはクエリポリヌクレオチド配列を比較するため、
およびクエリ配列に対する配列同一性の程度およびギャップの重要性に基づいて
データベース配列をランク付けするためのコンピューターシステムを提供する。
中央プロセッサは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアライメントおよび
／または比較のためのコンピュータープログラムをロードおよび実行するために
初期設定される。少なくとも４個のアミノ酸または少なくとも１２個のヌクレオ
チドを含むクエリ配列は、Ｉ／Ｏデバイスを介して中央プロセッサに入力される
。コンピュータープログラムの実行は、データファイルから配列データを検索す
る中央プロセッサを生じる。このデータファイルは、その記録のためのポリペプ
チド配列データを含む、タンパク質発現フィンガープリント記録またはその一部
の二進法記述を含む。この配列データまたは記録およびこのコンピュータープロ
グラムは、２次メモリーに伝送され得る。この２次メモリーは、代表的には、ラ
ンダムアクセスメモリー（例えば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＧＲＡＭ、またはＳ
ＤＲＡＭ）である。配列は、クエリ配列に対する配列同一性の程度に従ってラン
ク付けされ、そして結果は、Ｉ／Ｏデバイスを介して出力される。例であって、
そして本発明を限定するのでなく、中央プロセッサは、従来のコンピューターで
あり得る（例えば、Ｉｎｔｅｌ Ｐｅｎｔｉｕｍ、ＰｏｗｅｒＰＣ、Ａｌｐｈａ
、ＰＡ−８０００、ＳＰＡＲＣ、ＭＩＰＳ ４４０００、ＭＩＰＳ １００００
、ＶＡＸなど）；プログラムは、市販または公のドメイン分子生物学ソフトウェ
アパッケージ（例えば、ＵＷＧＣＧ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓ
ｏｆｔｗａｒｅ，Ｄａｒｗｉｎ，ｂｌａｓｔｎ）であり得る；データファイルは
、光学ディスクまたは磁気ディスク、データサーバー、メモリーデバイス（例え
ば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＧＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、ＥＰＲＯＭ、バブルメモリ
ー、フラッシュメモリーなど）であり得る；Ｉ／Ｏデバイスは、ビデオディスプ
レイおよびキーボード、モデム、ＩＳＤＮターミナルアダプター、Ｅｔｈｅｒｎ
ｅｔポート、パンチカード読み取り機、磁気ストリップ読み取り機、またはその
他の適切なＩ／Ｏデバイスを含むターミナルであり得る。
【００８７】 本発明は、本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープリント
データベースに対してクエリポリペプチド配列またはクエリポリヌクレオチド配
列あるいは問い合わせたタンパク質発現フィンガープリントを比較するため、な
らびに発現されたタンパク質の種類の類似性の程度およびサンプルにおける相対
的存在度および／または絶対的存在度に基づいてデータベース配列をランク付け
するためのコンピュータープログラムを提供する。最初の工程は、クエリポリヌ
クレオチド配列またはクエリポリペプチド配列、あるいは本発明の方法によって
得られるタンパク質発現フィンガープリント記録のインプットである（Ｉ／Ｏデ
バイスを介するインプット）。データファイルは、そのクエリに対する比較のた
めのタンパク質発現フィンガープリント記録の集合を検索するためにアクセスさ
れる；この集合は、本発明の方法によって得られるタンパク質発現フィンガープ
リント記録を含む。個々にまたは集合的に配列またはタンパク質発現フィンガー
プリント集合のその他の相互作表される情報は、クエリ配列または問い合わせた
発現記録に最適に一致される（例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ
のアルゴリズム、もしくはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム、
または当業者によって得られ得るその他の適切なアルゴリズムによって）。一旦
、整列または一致されると、配列またはフィンガープリント類似性の割合は、各
々の整列された配列または一致された配列において計算され、クエリ配列または
クエリフィンガープリントと比較してタンパク質発現フィンガープリント記録集
合において各々の配列またはフィンガープリントについての類似性値を生じる。
配列は、クエリ配列またはクエリフィンガープリントに対する配列同一性または
加重一致の高い順にランク付けされ、従って記録の集合において最も一致したも
のに対する配列またはフィンガープリントの相対的なランク付けが作製される。
決定がなされる：より大きな配列またはフィンガープリント記録が、このデータ
ファイルに存在する場合、さらなる配列／フィンガープリントまたはそのサブセ
ットが検索され、そしてこのプロセスが繰り返される；さらなる配列／フィンガ
ープリントが、このデータファイルに存在しない場合、ランク付けされた配列／
フィンガープリントは、Ｉ／Ｏデバイスを介され、それによってクエリ配列また
はフィンガープリントに最適に一致され、そしてこれらと比較される、このデー
タファイルの配列／フィンガープリント中の配列／フィンガープリントの相対的
なランキングが示される。
【００８８】 本発明はまた、上記のコンピューターシステムの使用を提供し、これは、以下
を含む：（１）コンピューター、（２）本発明の方法によって得られるタンパク
質発現フィンガープリント記録の集合をエンコードする保存されたビットパター
ン（これはこのコンピューター内に位置され得る）、（３）配列またはフィンガ
ープリントの比較（例えば、クエリ配列またはフィンガープリント情報を含むデ
ータファイル）および（４）アラインメントおよび比較のためのプログラム（代
表的には、計算された類似性値に基づく比較の結果の順番を用いて）。１つの実
施形態において、ニューラルネットワークパターン一致／認識ソフトウェアは、
使用者による経験的データ入力を用いるバックプロパゲーションに基づいてフィ
ンガープリント記録を同定および一致するために学習（ｔｒａｉｎ）される。記
載されたコンピューターシステムおよび方法は、タンパク質発現フィンガープリ
ントの集合に対するクエリタンパク質発現フィンガープリントの相対的な関係の
同定を可能にする；好ましくは、全てのタンパク質発現フィンガープリント（ク
エリおよびデータベース）は、本発明の方法によって得られる。
【００８９】 本発明はまた、１つ以上の以下のような情報データに対して相互作表されるツ
リーベースの階層ナビゲーション領域か、そうでない階層ナビゲーション領域の
形態において複数のタンパク質フィンガープリント記録および／または代謝産物
フィンガープリント記録を含む、データベースを含むコンピューターシステムを
提供する：医療記録、患者の病歴、患者の医学診断試験結果、患者の名前、患者
の性別、患者の年齢、患者の遺伝子プロフィール、患者の診断関連群コード、患
者の治療、日時、患者の生命徴候、患者の薬物アッセイの結果、患者の血縁関係
の医学的情報、およびその他の患者の類似の医学的、生物学的、および生理学的
な情報（これらから、タンパク質フィンガープリント記録および／または代謝産
物フィンガープリント記録データを生成するために使用されるサンプルが得られ
る）１つの実施形態において、本発明の方法によって得られるタンパク質発現フ
ィンガープリントおよび／または本発明の方法によって得られる代謝産物発現フ
ィンガープリントを含む、ナビゲーション領域を有するハイブリッドデータ構造
を有するデータベースを含むコンピューターシステムが、本明細書中に記載の医
学的情報を含む、同一の記録または関連する記録の情報分野にリンクするために
使用される；このデータ構造は、米国特許第５，２９５，２６１号（これは、本
明細書中で参考として援用される）における概要に準拠し得る。
【００９０】 本発明はまた、所定の疾患または医学的状態、疾患に対する傾向、生理学的状
態についての特有症候である、予測または所定のタンパク質発現プロフィール一
致を有する、データベース記録を抜き出するために学習されたニューラルネット
ワークを使用するコンピューターおよびプログラムを含むコンピューターシステ
ムを提供する。例示的な実施形態において、患者由来の血液サンプルまたは細胞
サンプルは、本発明の方法に従って分析され、所定のタンパク質発現記録を提供
し、この記録は、データベースクエリとして、学習されたニューラルネットワー
クに入力される。このニューラルネットワークは、タンパク質発現フィンガープ
リントデータ（ナビゲーション領域）と医学データ（情報領域）との間の相関的
なニューラル関係を確立するために複数の所定のデータベース記録において予め
学習されており、その結果、このクエリは、患者のタンパク質発現フィンガープ
リントを有する学習されたニューラルネットワークにおいて最も高い相関関係で
ある医学状態を同定する。この方法は、あるいは、またはさらに、クエリ代謝産
物プロフィール記録を、患者の代謝産物プロフィールフィンガープリントを有す
る学習されたニューラルネットワークにおいて最も高い相関関係である医学状態
にリンクされるデータベース代謝産物プロフィールフィンガープリント記録にリ
ンクする、学習されたニューラルネットワークを用いて代謝産物プロフィールフ
ィンガープリント記録のデータベースを問い合わせるために血清、血液、または
その他の細胞サンプルから得られる所定の代謝産物プロフィールフィンガープリ
ント記録を使用し得る。
【００９１】 本発明はまた、患者の血清、血液、またはその他の細胞サンプルから得られ、
そして本発明の方法に従って分析されたタンパク質発現フィンガープリントデー
タセットを含む、１つの領域または複数の領域を有する記録を含むデータベース
を使用する、コンピューターおよびプログラムを含むコンピューターシステムを
提供し、そしてさらに症状、医学的状態、病歴、またはその他の異なる診断情報
に関連する患者から得られたデータ（これらは、インターネットまたはその他の
ＴＣＰ／ＩＰあるいは関連するネットワークシステムへの回路を介して入力され
得る）を含む、１つ以上の領域を有する記録を含むデータベースを使用する、コ
ンピューターおよびプログラムを含むコンピューターシステムを提供する。
【００９２】 本発明は、開示された方法、組成物、装置、ソフトウェア、およびそれによっ
て得られる情報の使用を提供する。
【００９３】 本発明の性質および利点のさらなる理解は、本明細書および図面の残りの部分
の言及によって明らかになる。
【００９４】 （詳細な説明） （定義） 他に定義されない場合、本明細書中で使用される、全ての技術および科学用語
は、本願発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を一
般に有する。一般に、本明細書中で使用される命名法および以下に記載される分
子生物学、有機化学の実験手段は、当該分野において、周知であり、そして一般
に使用されるものである。標準的な技術が、核酸およびペプチド合成に使用され
る。一般に、酵素反応および精製工程が、工業用指針書に従って実施される。こ
の技術および手順は、当該分野において従来の方法および文書全体に渡って提供
される種々の一般的参照（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９
）Ｃｏｌｄ ＳＰｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（これは、本明細書中で参
考として援用される）を参照のこと）に従って、一般に実施される。本明細書に
おいて使用される命名法および分析化学の実験手順、ならびに以下に記載される
有機合成は、当該分野で公知であり、そして使用されるものである。標準技術ま
たはその改良は、化学合成および化学分析のために使用される。
【００９５】 本明細書中で参照される代謝化合物の種々のクラスの議論は、任意の一般的な
生化学の教科書（この教科書としては、例えば、Ｖｏｅｔ，Ｄ．およびＶｏｅｔ
，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，第２版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆ
ｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８１）；ならびにＷｈｉｔｅ，Ａ．ら，Ｐｒｉｎｃｉｐ
ｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第６版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ
Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９７８）（これらの各々は、その全体が参考とし
て援用される）が挙げられる）に見出され得る。
【００９６】 「核酸」は、単鎖または２重鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド
またはリボヌクレオチドポリマーである。
【００９７】 「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド
塩基の単鎖または２重鎖のポリマーを言う。
【００９８】 本明細書中で使用されるように、用語「タンパク質」、「ペプチド」および「
ポリペプチド」は、交換可能に使用され、そしてアミノ酸残基のポリマーを言う
。一般的な概説のために、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ ＣＨＥＭＩＳＴＲ
Ｙ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥ
ＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒ
ｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６７頁（１９８３）（これは、そ
の全体が参考として援用される）。本明細書に使用されるように、２０種の従来
のアミノ酸およびその略語は、従来の用法に従う（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編）
Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ（１９９１））。本明細書中で使用されるポリペプチドの表示法
では、標準的な用法および慣習に従って、左側の方向は、アミノ末端方向であり
、そして右側の方向は、カルボキシ末端方向である。
【００９９】 「炭水化物」は、多価アルコールのアルデヒドまたはケト誘導体を言う。この
用語は、単糖類、寡糖類、および多糖類を含む。「寡糖類」および「多糖類」は
、単糖類残基の縮合によって形成される。寡糖類は、比較的限定された数の単糖
類残基を含み、代表的には、二糖、三糖、四糖および五糖を含む。多糖類は、同
じ型（ホモ多糖類）または２以上の型（ヘテロ多糖類）の多くの単糖類の縮合に
よって形成される高分子量のポリマーである。多糖類の分子量は、百万ダルトン
の範囲であり得る。炭化水素の特異的な例としては、グルコース、ガラクトース
、キシロース、フルクトース、スクロース、およびグリコーゲンが挙げられる。
用語「単糖」は、代表的に、単糖類を言う。
【０１００】 用語「脂質」は、一般的に、非極性溶媒によって動物または植物の細胞から抽
出される物質を言う。この分類に入る物質としては、脂肪酸、脂肪（例えば、モ
ノ、ジおよびトリアシルグリセリド、ホスホグリセリド、スフィンゴリピド、ワ
ックス、テルペンおよびステロイド）が挙げられる。脂質はまた、他のクラスの
分子と組み合わされて、リポタンパク質、リポアミノ酸、リポ多糖類およびプロ
テオリピドが得られる。
【０１０１】 「脂肪酸」は、一般的に、片方がカルボン酸基で終結している長鎖の炭化水素
（例えば、６〜２８個の炭素原子）をいうが、炭化水素の鎖は、２、３個の炭素
長程度の短さであり得る（例えば、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸）。最も代表
的には、炭化水素の鎖は、未分枝の非環式であり、そして偶数の炭素原子を含む
が、いくつかの天然に存在する脂肪酸は、奇数の炭素原子を有する。脂肪酸の特
定の例としては、カプロン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステ
アリン酸およびアラキジン酸が挙げられる。この炭化水素の鎖は、飽和または不
飽和のいずれかであり得る。
【０１０２】 「脂肪」は、特定のクラスの脂質であり、そして脂肪酸とグリセロールとのエ
ステルである。脂肪としては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリドおよ
びトリアシルグリセリドが挙げられる。
【０１０３】 「ヌクレオシド」は、Ｎ−グリコシル結合によってプリンまたはピリミジンに
結合された糖の化合物（代表的には、リボースまたはデオキシリボース）である
。
【０１０４】 「ヌクレオチド」は、窒素性塩基（代表的には、プリンまたはピリミジン塩基
）が、Ｃ（１’）糖残基に連結されるペントース糖のリン酸エステルを言う。最
も代表的には、ヌクレオチドは、リン基に結合したヌクレオシドである。
【０１０５】 用語「ステロイド」は、生体の代謝物の一部である、四環系のシクロペンタフ
ェナントレン骨格を含む、大きなクラスの化合物を言う。特定の例は、コレステ
ロールである。
【０１０６】 用語「化合物」または「成分」は、生体または細胞内に見出される分子量に関
係い分子を言う。化合物または成分は、基質または代謝物と同じクラスの化合物
由来であり得る。
【０１０７】 「有機酸」は、１以上のカルボン酸基を有する任意の有機分子を言う。有機酸
は、変化する長さであり得、そして飽和または不飽和であり得る。有機酸の例と
しては、クエン酸、ピルビン酸、スクシン酸、リンゴ酸、マレイン酸、オキサル
酢酸、およびケトグルタル酸が挙げられるが、これらに限定されない。有機酸は
、カルボン酸基（例えば、ヒドロキシル、カルボキシルおよびホスフェートが挙
げられる）に加えて、他の官能基を含み得る。
【０１０８】 本明細書において、物体に適用する際に使用する場合、用語「天然に存在する
」とは、物体が天然に見出され得る事実を言う。例えば、天然の供給源から単離
され得、そして実験室で人間によって意図的に改変されいない生物（ウイルスを
含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する
。一般に、用語天然に存在するは、種に典型的であるような、非病理学的（所望
されない）個体に存在するような物体を言う。
【０１０９】 用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、特異的に局在化した化合物のアレ
イ（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ、ポリヌクレオチドアレイ、および／
またはコンビナトリアル小分子アレイ）、生物学的高分子、バクテリオファージ
ペプチドディスプレイライブラリー、バクテリオファージ抗体（例えば、ｓｃＦ
ｖ）ディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディスプレイライブラリー
、あるいはバクテリア、植物、真菌、または動物（特に哺乳動物）の細胞または
組織のような生物学的物質から作製される抽出物を示すために、本明細書中にお
いて使用される。
【０１１０】 本明細書中で使用されるように、「実質的に純粋」は、存在する主な種であり
（すなわち、モルを基準として、溶媒の種および金属イオンを除いて、組成物中
で他の種よりもより豊富である種）、そして好ましくは、実質的に純粋なフラク
ションは、その物体の種が、存在する全ての種の中で少なくとも５０％（モルを
基準として）を含む、組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物
中に存在する全ての種の約８０％〜９０％を超えて含まれる。より好ましくは、
この物体種は、本質的に均一（汚染種は、従来の検出方法によって、組成物中で
検出され得ない）に精製される。ここで、この組成物は、本質的に単一の種から
なる。
【０１１１】 本明細書中で使用されるように、「正常な血液」または「正常なヒトの血液」
は、活性腫瘍性疾患またはリンパ球増殖の他の疾患、あるいは腫瘍性疾患を発生
する同定された素因を有さない、健康なヒトの個体からの血液を言う。同様に、
「正常な細胞」、「正常な細胞試料」、「正常な組織」、および「正常なリンパ
節」は、活性腫瘍性疾患またはリンパ球増殖の他の疾患を有さない、健康なヒト
の個体から得られるそれぞれの試料を言う。
【０１１２】 本明細書において使用されるような「特徴的濃度」、「特徴的量」、および「
特徴的染色パターン」は、それぞれ、腫瘍性疾患（例えば、癌、肉腫、または白
血病）の発生に対して、病理学的（例えば、腫瘍性、老齢化、免疫不全、神経変
性、炎症など）状態または素因の存在を示す、試料中のタンパク質またはタンパ
ク質フィンガープリント（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）の濃度、量、または局在化
パターンを言う。特徴的量は、予想および／または遡及される統計学的な臨床研
究によって確立される、正常な臨床学的な値の範囲を超える細胞または細胞の試
料での、タンパク質またはタンパク質発現フィンガープリント特性の量である。
一般に、腫瘍性疾患（例えば、癌、肉腫、または白血病）を有する個体は、正常
で未疾患の個体に特徴付けられる濃度範囲を超える細胞または組織試料中で、予
め決められたタンパク質、または適切なタンパク質発現フィンガープリントの量
を示す。代表的には、この特徴的濃度は、平均的な正常値を超える、少なくとも
約１つの標準偏差であり、より一般的には、その特徴的濃度は、平均的な正常値
またはそれを超える、少なくとも約２つの標準偏差である。しかし、本質的に、
全ての臨床診断試験は、偽陽性および偽陰性のいくらかの割合を生じる。診断ア
ッセイの感度および選択性は、診断物および任意の関連する調節要求を満足する
ために十分でなければならない。一般に、本発明の診断方法は、疾患候補者のよ
うな個体を同定するために使用され、資格のある健康専門家によってなされる疾
患の鑑別診断におけるさらなるパラメータを提供する。
【０１１３】 用語「統計学的相関」は、例えば、カイ２乗解析、ＡＮＯＶＡまたは多変量解
析を含む、任意の統計学的試験によって測定されるような、２つの変数または２
つのパラメータ間の統計学的な関連を言う。１つのパラメータ（例えば、代謝物
のフラックスの値）と第２パラメータ（例えば、疾患状態）との間の相関は、偶
然（Ｐ値）によって生じる結果の可能性が、予め決定されたレベル（例えば、０
．０５）よりも低い場合、統計学的に有意であると考えられる。用語「統計学的
に有意な差異」は、０．２５未満、好ましくは０．０５未満、そして最も好まし
くは０．０１未満の統計学的に信頼あるレベルＰを言う。
【０１１４】 本明細書中で使用される場合、「生理学的状態」は、温度、ｐＨ、イオン強度
、粘度、および生化学的なパラメータを言い、これは、生存可能な生物に適合性
であり、そして／または代表的には、生存可能に培養された酵母菌または哺乳動
物の細胞の細胞内に存在する。例えば、代表的な実験室の培養条件下で増殖した
酵母菌の細胞内の状態は、生理学的状態である。インビトロ転写カクテルに対し
て、適切なインビトロ反応状態は、生物学的状態である。一般に、インビトロの
生物学的状態は、５０〜２００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ６．５〜８．
５、２０〜４５℃、および０．００１〜１０ｍＭの２価のカチオン（例えば、Ｍ
ｇ++、Ｃａ++）；好ましくは、約１５０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ７．
２〜７．６、５ｍＭの２価のカチオンを含み、そして、しばしば、０．０１〜１
．０パーセントの非特異的タンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含む。非イオン性界
面活性剤（Ｔｗｅｅｎ，ＮＰ−４０，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）は、しばしば
、一般的に約０．００１〜２％、代表的に０．０５〜０．２％（ｖ／ｖ）で存在
し得る。特定の水性状態は、従来の方法に従って、開業医によって選択され得る
。一般的な指針として、以下の緩衝水溶液状態が、適切であり得る：１０〜２５
０ｍＭのＮａＣｌ、５〜５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ５〜８（２価のカチ
オンおよび／または金属キレートおよび／または非極性界面活性剤および／また
は膜断片および／またはアンチフォーム（ａｎｔｉｆｏｒｍ）剤および／または
シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の最適な添加）。
【０１１５】 本明細書中で使用されるように、用語「マルチマー」は、ダイマーおよびより
高次の複合体（トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、
オクタマーなど）を含む。「ホモマルチマー」は、同じサブユニット種からなる
複合体を言う。「ヘテロマルチマー」は、１個以上のサブユニット種からなる複
合体を言う。
【０１１６】 用語「アルキル」は、分枝または非分枝の、飽和または不飽和の一価の炭化水
素基を言及するために本明細書中に使用され、一般に、約１〜３０個の炭素、好
ましくは、４〜２０個の炭素、より好ましくは、６〜１８個の炭素を有する。ア
ルキル基が１〜６個の炭素原子を有する場合、これを「低級アルキル」と呼ぶ。
安定なアルキル基は、例えば、１以上のメチレン基、メチン（ｍｅｔｈｉｎｅ）
基および／またはメチン（ｍｅｔｈｙｎｅ）基を含む構造を含む。分枝構造は、
ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、２−エチルプロピルなどに類似した分
枝モチーフを有する。本明細書中で使用される場合、この用語は、「置換アルキ
ル」および「環式アルキル」を含有する。
【０１１７】 「置換アルキル」は、低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン（すなわち
、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3））、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アル
キルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリ
ールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和および不飽和の環
状炭化水素、複素環などのような１以上の置換基を含む、まさに記載されるよう
なアルキルを言及する。これらの基は、アルキル部分の任意の炭素または置換基
に結合され得る。
【０１１８】 用語「アリール」は、芳香族置換基を言及するために本明細書において使用さ
れる。これは、一緒になって融合されるか、メチレンまたはエチレン部分のよう
な共通の基に共有結合されるか、または連結される、単一の芳香族環または複数
の芳香族環であり得る。この共通の結合基はまた、ベンゾフェノールのようなカ
ルボニルであり得る。この芳香族環としては、とりわけ、フェニル、ナフチル、
ビフェニル、ジフェニルメチルおよびベンゾフェノンが挙げられ得る。用語「ア
リール」は、「アリールアルキル」および「置換アリール」を含む。
【０１１９】 「置換アリール」は、１以上の置換基（例えば、低級アルキル、アシル、ハロ
ゲン、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、ア
ルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプト、ならび
に飽和および不飽和の環状炭化水素（これは、芳香族環に融合されるか、メチレ
ンまたはエチレン部分のような共通の基に共有結合されるか、または連結される
））を含む、まさに記載されるようなアリールを言及する。この連結基はまた、
シクロヘキシルフェニルケトンのようなカルボニルであり得る。用語「置換アリ
ール」は、「置換アリールアルキル」を含む。
【０１２０】 用語「アリールアルキル」は、「アリール」のサブセットを言及するために、
本明細書において使用される。このアリール基は、本明細書中で定義されるよう
なアルキル基によって別の基に結合される。
【０１２１】 「置換アリールアルキル」は、「置換アリール」のサブセットを定義する。こ
の置換アリール基は、本明細書中で定義されるようなアルキル基によって別の基
に結合される。
【０１２２】 用語「アシル」は、ケトン基−Ｃ（Ｏ）Ｒを記載するために使用する。Ｒは、
本明細書中で定義されるような、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは
置換アリールである。
【０１２３】 用語「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、およびヨウ素原子を言及するため
に本明細書中で使用される。
【０１２４】 用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を言及するために本明細書中で使用される。
【０１２５】 用語「アミノ」は、−ＮＲＲ’に使用され、ここで、ＲおよびＲ’は、独立し
て、Ｈ、アルキル、アリールまたはその置換されたアナログである。「アミノ」
は、２級アミンおよび３級アミンを意味する「アルキルアミノ」およびＲＣ（Ｏ
）ＮＲ’基を意味する「アシルアミノ」を含む。
【０１２６】 用語「アルコキシ」は、−ＯＲ基を言及するために本明細書で使用される。Ｒ
は、アルキルまたその置換されたアナログである。適切なアルコキシ基としては
、例えば、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどが挙げられる。
【０１２７】 本明細書において使用されるように、用語「アリールオキシ」は、炭素原子に
よって直接別の基に連結される芳香族基を意味する。この用語は、「置換アリー
ルオキシ」部分を含み、芳香族基は、上記のように「置換アリール」で置換され
る。例示的なアリールオキシ部分としては、フェノキシ、置換フェノキシ、ベン
ジルオキシ、フェネチルオキシなどが挙げられる。
【０１２８】 本明細書中で使用されるように、「アリールオキシアルキル」は、本明細書で
定義されるように、酸素原子を介してアルキル基に結合される結合される、芳香
族基を定義する。用語「アリールオキシアルキル」は、「置換アリールオキシア
ルキル」部分を含み、ここで、芳香族基は、記載されるように「置換アリール」
で置換される。
【０１２９】 本明細書中で使用されるように、用語「メルカプト」は、一般構造−Ｓ−Ｒの
部分を定義する。ここで、Ｒは、本明細書中で記載されるように、水素、アルキ
ル、アリール、または複素環である。
【０１３０】 用語「飽和環状炭化水素」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチ
ルなどのような基およびこれらの構造の置換されたアナログを意味する。このよ
うな環状炭化水素は、単環および多環構造であり得る。
【０１３１】 用語「不飽和環状炭化水素」は、シクロペンタン、シクロヘキサンなど、およ
びその置換されたアナログのような、少なくとも１つの２重結合を有する、一価
の非芳香族基を記載するために使用される。これらの環状炭化水素は、単環また
は多環構造であり得る。
【０１３２】 本明細書において使用される、用語「ヘテロアリール」は、芳香族環の１以上
の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄のようなヘテロ原子によって置換される、
芳香族環を言及する。ヘテロアリールは、単一の芳香族環、複数の芳香族環、ま
たは１以上の非芳香族環に結合された１以上の芳香族環であり得る構造を言う。
多環を有する構造において、この環は、一緒に融合されるか、メチルまたはエチ
ル部分のような共通基に共有結合されるか、または連結され得る。共通の連結基
はまた、フェニルピリジルケトンのような、カルボニルであり得る。本明細書中
において使用されるように、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイ
ミド、ピラゾール、インドール、フランなどのような環、またはこれらの環のベ
ンゾ融合アナログが、用語「ヘテロアリール」によって定義される。
【０１３３】 「ヘテロアリールアルキル」は、「ヘテロアリール」のサブセットを定義し、
ここで、本明細書において定義されるようにアルキル基は、ヘテロアリール基を
別の基に連結する。
【０１３４】 「置換へテロアリール」は、まさに記載されるようなヘテロアリールを言及し
、ここで、ヘテロアリール核は、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハ
ロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、ア
シルアミノ、アシルオキシ、メルカプトなどのような１以上の官能基で置換され
る。従って、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾー
ル、インドール、フランなどのような複素環式環の置換アナログ、またはこれら
の環のベンゾ融合アナログは、用語「置換へテロアリール」によって定義される
。
【０１３５】 「置換へテロアリールアルキル」は、上記のような「置換へテロアリール」の
サブセットを言及し、本明細書中に定義されるようなアルキル基は、ヘテロアリ
ールを別の基に連結する。
【０１３６】 用語「複素環」は、１〜１２個の炭素原子および環中に窒素、硫黄または酸素
から選択される１〜４のヘテロ原子の、単環または複数の縮合環を有する、一価
の飽和または不飽和の非芳香族基を記載するために本明細書中で使用される。こ
のような複素環は、例えば、テトラヒドロフラン、モルホリン、ピペリジン、ピ
ロリジンなどである。
【０１３７】 本明細書中に使用されるような用語「置換複素環」は、「複素環」のサブセッ
トを記載する。ここで、複素環核は、１以上の官能基（例えば、低級アルキル、
アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、ア
ルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプトなど）で
置換される。
【０１３８】 用語「複素環式アルキル」は、「複素環」のサブセットを定義する。ここで、
本明細書に定義されるアルキル基は、複素環式基を別の基に連結する。
【０１３９】 （Ｉ．概要） 本発明は、ネイティブな細胞および組織サンプルからの複合体混合物における
タンパク質の有意な分離を含む、タンパク質の分離を達成するための方法および
装置を提供する。本発明は、規定された画分を得るための制御された分画技術を
利用して一連で行われる複数の（典型的には、異なる）電気泳動方法を含む多次
元電気泳動法が、タンパク質の高分離を達成するために使用され得るという認識
に一部基づく。バリエーションにおいて、標識化および検出工程が、感受性を高
めるため、および分離されたタンパク質についての正確で、再現可能な定量的な
情報を得るために含まれ得る。別のバリエーションにおいて、緩衝系は、溶出液
を引き続く質量分光学的分析に適合させるために、揮発性の塩、有機溶媒、およ
び短命の（ｅｐｈｅｍｅｒａｌ）界面活性剤の使用によって、最後の分離工程に
おいて変更され得る。典型的には、電気泳動方法が、キャピラリー電気泳動方法
、特に、キャピラリー等電点（ＣＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺ
Ｅ）およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）の組み合わせである。
【０１４０】 いくつかの特徴によって、本方法が、制御され、再現性の様式で実施され得る
。例えば、一旦、タンパク質が、キャピラリーに含まれる電気泳動媒体において
分画するための機会を有すると、溶出条件があつらえられ（ｔａｉｌｏｒ）、そ
の結果、分離されたタンパク質が、画分に含まれるタンパク質が、例えば、特定
のｐＨ範囲、電気泳動移動性範囲、または分子量範囲内に入る規定された画分を
得るための制御された様式で溶出される。特定の方法において、タンパク質を分
離プロセスの選択された段階で標識し、標識されたタンパク質が、検出器を使用
して検出される。標識化は、低濃度で存在するタンパク質をより容易に検出する
ことを可能にし、信号対ノイズ比を増加させることによって再現性を増加する。
検出器は、タンパク質を、電気泳動キャビティー内において分離されるとき、ま
たはそれらがキャビティーから溶出されたのちに検出するために使用され得る。
標識化および検出の組み合わせはまた、分離されたタンパク質の定量化を可能に
する。バリエーションにおいて、標識化部分は、タンパク質のＮ末端またはＣ末
端に共有結合を与える成分、タンパク質の検出可能性を増加する少なくとも一つ
の成分、および必要に応じて、質量分光分析器においてタンパク質、またはタン
パク質の標識されたペプチドフラグメントに対して独特の質量サインを与える成
分からなる。
【０１４１】 さらなる情報が所望される場合、本方法は、電気泳動以外の技術によるさらな
る分析を含むために拡張され得る。例えば、特定の方法のバリエーションにおい
て、最終電気泳動方法から集められた画分は、さらなる情報（例えば、分子量、
および部分配列、化学的または酵素的に誘導されるペプチドの質量、および全ア
ミノ酸組成または部分アミノ酸組成）を得るために質量分光法によって個々に分
析される。バリエーションにおいて、最初のサンプルは、硫酸アンモニウム沈澱
、細胞分画、またはクロマトグラフィー手段（例えば、逆相、サイズ排除、アフ
ィニティーおよびイオン）によって分画される。さらなるバリエーションにおい
て、本方法に対するそれぞれの拡張のもとにある生物学的または生物物理学的な
パラメーターは、分離パラメーターとして組み込まれ得、本発明によって分離さ
れる任意のタンパク質種を利用し得、そして／またはこのようなタンパク質種の
データベースにおける方法によって分離されたタンパク質種の記載に注釈を付け
得る。
【０１４２】 定量的な検出および本方法を自動化する能力は、本方法が、種々のスクリーニ
ング、比較研究および診断研究に受け入れらることを意味する。例えば、本方法
は、比較タンパク質発現データを開発するために利用され得る。このような比較
研究は、特定の疾患のマーカー、医薬品および／または薬剤候補に対する潜在的
な標的を同定するために利用され得る。一旦、例えば、特定の疾患において選択
的に発現されるマーカーが同定されると、本発明の方法は、診断用途において利
用性を有する。バリエーションにおいて、本方法は、小型化された分離および検
出デバイスに組み込まれ得、ここで、複数のキャピラリー電気泳動方法が、診断
目的のために１つ以上のタンパク質マーカーを分離、検出、および定量化するた
めに使用される。本発明の方法はまた、異なる細胞、組織または生理学的な状態
から得られるタンパク質についての、例えば、等電点、見かけの分子量および相
対的な存在比の情報および部分的または完全なタンパク質配列情報を含むタンパ
ク質データベースを開発するために利用され得る。本方法はまた、構造／活性関
係についての研究、および特定の遺伝子を遺伝的に改変し、次いで、このような
改変が細胞のタンパク質発現に対してどのような効果を有するかを決定する代謝
操作調査における有用性を見出す。
【０１４３】 （ＩＩ．分離方法） （要約） 本発明は、タンパク質の混合物を分離するために種々の電気泳動方法および装
置を提供する。本方法は、複数のキャピラリー電気泳動方法を一連で行う工程を
包含し、ここで、最初の方法以外のそれぞれの方法に対するサンプルが、先の工
程から（例えば、先の方法からの分離されたタンパク質を含む画分から）タンパ
ク質のサブセットのみを含む。電気泳動の間の溶出を制御するための種々の技術
を使用することによって、本方法は、組織およびネイティブな細胞から得られる
ような複合体混合物においてさえタンパク質を分離し得る。種々の標識化スキー
ムおよび検出方法を利用して、特定の方法が、分離されたタンパク質のそれぞれ
の量についての定量的な情報を提供し得る。このような情報は、特定の条件下で
発現されるタンパク質が、特徴付けられ、目録を作られるタンパク質データベー
スの開発において使用され得る。異なるタイプの細胞または組織の間で示差的に
発現されるタンパク質を同定するための比較研究はまた、本発明の方法を用いて
行われ得る。本方法はまた、診断、構造活性および代謝操作研究において使用さ
れ得る。
【０１４４】 一般的に、本方法は、一連で複数の電気泳動方法を実施する工程を包含する。
一連のそれぞれの方法は、複数の分離されたタンパク質を得るために複数のタン
パク質を含むサンプルを電気泳動する工程を包含する。電気泳動されるサンプル
は、一連の直前の方法由来の複数の分離されたタンパク質のサブセットのみを含
む（サンプルが全てのタンパク質を含む最初のサンプルである一連のうちの最初
の方法である場合を除く）。次いで、最後の電気泳動方法からの分離されたタン
パク質は、種々の技術を使用して検出される。
【０１４５】 電気泳動方法は、典型的に、キャピラリー電気泳動方法、例えば、キャピラリ
ー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）および
キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）であるが、本方法は、他のキャピラリー電
気泳動方法も受け入れられる。本方法の特定の順序は変化し得る。典型的には、
本方法は、異なる特徴（例えば、サイズ、電荷、等電点）に基づいてタンパク質
を分離する電気泳動方法の組み合わせを利用する。
【０１４６】 特定の方法において、タンパク質は、分離されたタンパク質をより容易に検出
するために、タンパク質の電荷を変化させるために、それらの分離を容易にする
ために、そして／または信号対ノイズ比を増加するために標識化される。標識化
はまた、特定の方法が、最後の電気泳動方法から得られた分離されたタンパク質
が定量化されるように行われることを可能にする。定量化は、１つのサンプル中
のタンパク質の相対的な存在比、または異なるサンプル中のタンパク質の相対的
な存在比が決定されることを可能にする。特定の方法において、タンパク質が標
識化される時間は、キャピラリーゾーン電気泳動による電気泳動に先立つように
選択される。特定の残基を選択的に標識化することによって、キャピラリーゾー
ン電気泳動の間のタンパク質の分離が増加し得る。
【０１４７】 分離、定量化および再現性は、電気泳動方法の間のタンパク質の溶出を制御す
るための種々の技術を利用することによって、高められる。使用される特定の溶
出技術は、特定の電気泳動方法に一部依存する。しかし、一般的に、水力学、塩
移動性、ｐＨ流動性（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および電気浸透フローは、そ
れぞれの電気泳動分離の最後において分離されたタンパク質を制御可能に溶出す
るために利用される。
【０１４８】 いくつかの方法は、電気泳動分離の後にさらなる分析を提供する。分析のタイ
プは変化し得、これには、例えば、赤外分光法、核磁気共鳴分光法、ＵＶ／ＶＩ
Ｓ分光法、蛍光分光法、および完全なまたは部分的な配列決定が挙げられる。特
定の方法において、最後の画分におけるタンパク質は、さらに分離されたタンパ
ク質のそれぞれの少なくとも部分配列を決定するために（すなわち、タンパク質
配列タグを決定するために）質量分光法によって分析される。
【０１４９】 従って、特定の他の方法は、１つ以上のキャピラリー電気泳動方法を実施する
工程を包含し、１つ以上の方法のそれぞれが、（ｉ）キャピラリー内に含まれる
電気泳動媒体内の複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動する工程、および
（ｉｉ）複数の画分を取り除き収集する工程であって、それぞれの画分が、電気
泳動工程の間に分離されるタンパク質を含む工程、を包含する。一連のそれぞれ
の方法は、先行する電気泳動方法において集められた画分からのサンプルを用い
て行われる（タンパク質の元の混合物を含むサンプルで行われる最初の電気泳動
方法の場合を除く）。タンパク質は、最後の電気泳動方法を行う前に標識化され
る。最初のサンプルのタンパク質のいずれかが、標識化される（すなわち、標識
化が全ての電気泳動に先行する）か、集められた画分に含まれるタンパク質が、
最後の電気泳動方法の前に標識化される。最後の電気泳動方法が行われ、そして
最後の方法を行うために利用されるキャピラリー内の分離されたタンパク質また
はそこから除去された分離されたタンパク質が、検出器で検出される。従って、
検出器は、最後の方法で使用されるキャピラリー内の分離されたタンパク質を検
出するために適合されるか、または分離されたタンパク質がキャピラリーから溶
出するとき、分離されたタンパク質を検出するためにキャピラリーとインライン
で接続される。いくつかの場合において、検出されたタンパク質は定量化され、
そしてさらにそれらの相対的な存在比を決定するために、そして／またはそれぞ
れの分離されたタンパク質のタンパク質配列タグを確立するために質量分光法に
よって分析される。
【０１５０】 本発明は、ネイティブな細胞および組織サンプルから複合体の混合物中のタン
パク質の有意な分離を含む、タンパク質の分離を達成するための方法および装置
を提供する。本発明は、規定された画分を得るための制御された分画技術を利用
して一連で行われる複数の（典型的には、異なる）電気泳動方法を含む多次元電
気泳動法が、タンパク質の高分離を達成するために使用され得るという認識に一
部基づく。標識化および検出工程は、感受性を増加するため、タンパク質の分離
座標を変えるため、そして分離されたタンパク質についての正確で再現可能な定
量的な情報を得るために含まれ得る。典型的には、電気泳動方法は、キャピラリ
ー電気泳動方法、特に、キャピラリー等電点（ＣＩＥＦ）、キャピラリーゾーン
電気泳動（ＣＺＥ）およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）の組み合わせで
ある。
【０１５１】 いくつかの特徴によって、本方法が、制御され、再現性の様式で実施され得る
。例えば、一旦、タンパク質が、キャピラリーに含まれる電気泳動媒体において
分画するための機会を有すると、溶出条件があつらえられ、その結果、分離され
たタンパク質が、画分に含まれるタンパク質が、例えば、特定のｐＨ範囲、電気
泳動移動性範囲、または分子量範囲内に入る規定された画分を得るための制御さ
れた様式で溶出される。特定の方法において、タンパク質を分離プロセスの選択
された段階で標識し、標識されたタンパク質が、検出器を使用して検出される。
標識化は、低濃度で存在するタンパク質をより容易に検出することを可能にし、
信号対ノイズ比を増加させることによって再現性を増加する。検出器は、タンパ
ク質を、電気泳動キャビティー内で分離するとき、またはそれらがキャビティー
から溶出されたのちに検出するために使用され得る。標識化および検出の組み合
わせはまた、分離されたタンパク質の定量化を可能にする。標識化および分離の
組み合わせは、タンパク質の正味の電荷または溶解性を変化し得、それらの分離
座標、例えば、それらの分離順序、されらが集められる画分、および溶出時間の
変化を引き起こす。
【０１５２】 さらなる情報が所望される場合、本方法は、電気泳動以外の技術によるさらな
る分析を含むために拡張され得る。例えば、特定の方法において、最終電気泳動
方法から集められた画分は、さらなる情報（例えば、分子量、および部分配列）
を得るために質量分光法によって個々に分析される。
【０１５３】 定量的な検出および本方法を自動化する能力は、本方法が、種々のスクリーニ
ング、比較研究および診断研究に受け入れらることを意味する。例えば、本方法
は、比較タンパク質発現データを開発するために利用され得る。このような比較
研究は、特定の疾患のマーカー、医薬品および／または薬剤候補に対する潜在的
な標的を同定するために利用され得る。一旦、例えば、特定の疾患において選択
的に発現されるマーカーが同定されると、本発明の方法は、診断用途において利
用性を有する。本発明の方法はまた、異なる細胞、組織または状態のタンパク質
についての、例えば、分離座標、等電点、見かけの分子量および相対的な存在比
の情報を含むタンパク質データベースを開発するために利用され得る。本方法は
また、構造／活性関係についての研究、および特定の遺伝子を遺伝的に改変し、
次いで、このような改変が細胞のタンパク質発現に対してどのような効果を有す
るかを決定する代謝操作調査における有用性を見出す。
【０１５４】 （一般的な分離方法） 本発明の方法は、タンパク質の混合物を分離するために一連で行われる電気泳
動方法の組み合わせを利用する。本方法を、一連で行われると言う。なぜなら、
それぞれの方法において電気泳動されるサンプルが、先行する方法において電気
泳動されたタンパク質を含む溶液または画分由来であるからである（最初の電気
泳動方法で電気泳動されるサンプルを除く）。本明細書中で使用されるように、
用語タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは、相互に交換可能に使用され、
アミノ酸残基のポリマーを示す。この用語はまた、一つ以上のアミノ酸が対応す
る天然のアミノ酸の化学的アナログ（翻訳後プロセス（例えば、グリコシル化お
よびリン酸化）によって修飾されるアミノ酸を含む）であるアミノ酸ポリマーに
適用する。
【０１５５】 一連の電気泳動方法は、典型的には、一連のそれぞれの電気泳動方法について
適用されるサンプルのタンパク質が、物理的、時間的または空間的に単離または
分離され、複数の画分（それぞれが、適用されたサンプルのタンパク質のサブセ
ットのみを含む）を形成するような方法で行われる。従って、画分は、電気泳動
に供されたサンプル中の他のタンパク質から物理的、時間的または空間的に分離
された一つのタンパク質またはタンパク質の混合物を示す。分離されたタンパク
質は、電気泳動方法の間に他のタンパク質から分離された単一のタンパク質種ま
たはタンパク質の混合物を示し得る。ちょうど述べたように、種々の電気泳動方
法におけるサンプルは、このような画分から得られる（サンプルが分離されるべ
き全てのタンパク質を含む元のサンプルである最初の電気泳動方法を除く）。
【０１５６】 典型的には、一連のこれらの複数の電気泳動方法は、異なる特徴に従ってタン
パク質を分離する。例えば、一つの方法は、等電点に基づいてタンパク質を分離
し得（例えば、キャピラリー等電点電気泳動）、他の方法は、任意の所与のｐＨ
におけるそれらの本来のまたは誘導された（特定のイオン化可能なアミノ酸残基
への標識の適用による）電荷対質量比の基づいてタンパク質を分離し得（例えば
、キャピラリーゾーン電気泳動）、他の方法は、タンパク質のサイズに従って分
離する（例えば、キャピラリーゲル電気泳動）。一連の電気泳動方法によりタン
パク質を分離するこのようなアプローチは、本明細書において、「多次元」電気
泳動法と呼ばれ、ここで、それぞれの特定の電気泳動方法が、「次元」を構成す
る。
【０１５７】 種々の電気泳動方法を実施するために使用される装置が当該分野において公知
である。しかし、一般的に、図２Ａに示されるように、本発明の特定の方法に利
用される典型的なキャピラリー電気泳動システムの基本的な構成は、２つの端部
１０，１２を有するキャピラリー８を含む。１つの端部１０は、アノードレザバ
１８に含まれるアノード溶液またはアノード液１４と接触し、他の端部１２は、
カソードレザバ２０のカソード溶液またはカソード液１６と接触する。一つの電
極（アノード２２）が、アノード溶液１４と電気的連絡にあるように配置され、
第２の電極２４が、カソード溶液１６と電気的連絡にあるように配置される。キ
ャピラリー８のキャビティー２６は、電気泳動媒体で充填され、ある場合には、
ポリマーマトリクスを含み得る。本明細書中で使用される場合、用語アノードは
、陽性に荷電した電極を示す。従って、陰性に荷電した種が、電気泳動媒体を通
ってアノードに向かって動く。用語カソードは、陰性に荷電した電極をいい、陽
性に荷電した種が、この電極に向かって移動する。
【０１５８】 サンプルが、入口２８を介してキャピラリー８に導入され、電場が電源３２に
よって２つの電極２２、２４の間に印加されるとき、そこでタンパク質成分が分
離され、タンパク質が分離キャビティー２６内に含まれる電気泳動媒体内で分離
する。タンパク質成分は、電気浸透フロー（下記を参照のこと）のような種々の
パラメータ−を制御することによって、そして／またはレザバ溶液の１つまたは
両方の組成を変える（例えば、ｐＨまたは塩濃度を調節する）ことによって出口
３０を介してキャピラリーから制御可能に溶出され得る。典型的には、入口２８
および出口３０は、単に、サンプル、アノード液またはカソード液を含む容器へ
の容易な挿入を可能にするように形成されるキャピラリーの部分である。
【０１５９】 電気泳動が本発明の方法において行われる電気泳動デバイスを参照して使用さ
れる場合、用語「キャピラリー」は、便宜のために使用される。この用語は、電
気泳動が行われる特定の形状のキャビティまたはデバイスに限定されると解釈さ
れるべきではない。詳細には、キャビティは、円柱状の形状である必要はない。
任意の電気泳動方法に関して本明細書中で使用される場合、用語「キャピラリー
」は、少なくとも一つのセットの対向する面の間の内部寸法が、約２〜１０００
ミクロン、より典型的には、２５〜２５０ミクロンである他の形状を含む。本発
明の特定の方法に使用され得る非管状の配置の例は、Ｈｅｌｅ−Ｓｈａｗフロー
セルである。さらに、キャピラリーは、直線である必要はない；いくつかの場合
において、キャピラリーは、例えば、らせん構成に巻かれる。
【０１６０】 本発明の特定の方法に利用されるシステムの例は、図１に示される。この特定
の例は、３つの電気泳動方法（最初の方法、中間の方法、および最後の方法）が
連結されるシステムを示す。行われる特定の数の電気泳動方法は、変化し得るが
、本発明の方法は、少なくとも２つの電気泳動方法を含む。最も典型的には、本
方法は、２または３の電気泳動分離方法を利用する。
【０１６１】 図１に示され得るように、複数のタンパク質を含む最初のサンプルが、当該分
野で公知の多くの方法のいずれかを利用して、サンプル容器５０から第１のキャ
ピラリー５４の第１の分離キャビティーに、サンプル入口５２を介して導入され
る。適切な方法の例としては、減圧下でサンプルをサンプル入口５２に引き込む
（例えば、サンプル出口で減圧に引くことによる）工程またはサンプル容器５０
を加圧することによってサンプルをサンプル入口５２に押し入れる工程を包含す
る。電気移動（しばしば、動電学注入と呼ばれる）は、別の選択肢である。一旦
、最初のサンプルがサンプル入口５２に導入されると、サンプルは、第１のキャ
ピラリー５４内の第１の分離キャビティー内で電気泳動される。第１の分離キャ
ビティーは、最初のサンプル中のタンパク質が少なくとも部分的に分離される所
望の電気泳動媒体を含む。分離されたタンパク質を含む電気泳動媒体は、第１の
キャビティーから、典型的には、サンプルが導入される端部の反対の分離キャビ
ティーの端部の外に除去されるが、他の除去部位が利用され得る（下記を参照の
こと）。除去媒体は、出口５６を通って進行し、複数の画分として分離容器５８
に集められる。図１Ｂに示されるように、画分が集められる容器５８は、典型的
には、規定された画分（例えば、特定の容積の画分または選択されたｐＨ範囲を
カバーする画分）を集めるために１セットの容器５８を自動的に進行させ得る画
分収集デバイス（その一部が６０として示される）と関連する。
【０１６２】 次いで、第１の電気泳動方法から集められた画分由来のサンプルは、第２のサ
ンプル入口６２を介して上記のような技術を再び利用して、複数の容器５８の１
つから除去される。次いで、画分由来のサンプル中のタンパク質は、さらに、中
間電気泳動方法（図１に示される例において、第２の電気泳動方法）を行うこと
によってさらに分離され得る。サンプルは、入口６２を介して第２のキャピラリ
ー６４に導入され、そしてサンプル内のタンパク質は、さらに、第２のキャピラ
リー６４の第２の分離キャビティー内に含まれる電気泳動媒体内で分離され、次
いで、出口６６を介してキャビティから溶出される。第一の電気泳動分離のよう
に、分離されたかまたは部分的に分離されたタンパク質を含む電気泳動媒体は、
容器６８内の分離画分が、典型的に第２の画分収集デバイス（その一部が７０と
して示される）によって整列し進行するとき集められる。
【０１６３】 第２／中間方法に類似したプロセスは、最後の電気泳動方法（図１に示される
第３の電気泳動分離方法）の間に行われる。サンプルは、先行する方法の間に得
られる画分を含む容器６８から入り口７２を介して引き込まれ、そして適用され
るサンプルに含まれるタンパク質が、なおさらに電気泳動によって分離される第
３の電気泳動媒体を含む第３のキャピラリー７４の第３または最後の電気泳動キ
ャビティーに導入される。さらに単離されるタンパク質を含む第３の電気泳動媒
体が、実質的に出口７６を通って除去される。
【０１６４】 上記のように、図１に示される３つの電気泳動方法より多くが実施され得る。
このような方法は、基本的に、一回以上の第２／中間電気泳動分離に記載された
一般的な工程を繰り返す工程を包含する。
【０１６５】 最後の電気泳動分離に続いて、分離されたタンパク質を分析するための種々の
異なる選択肢が利用可能である。図１に示されるように、除去された電気泳動媒
体は、分離されたタンパク質を検出するために最後のキャピラリー７４の分離キ
ャビティと流体連絡する検出器７８を通って通過し得る。検出器７８または検出
器からの信号を受信し得る任意の定量化デバイス（図示しない）は、電気泳動媒
体の特定の部分または画分内のタンパク質の量を定量化するために使用され得る
。
【０１６６】 あるいは、またはさらには、最終キャピラリー７４または検出器７８から抜け
出している電気泳動媒体から画分を取り出し、そして電気泳動以外の同じ技術を
用いて分析器８２により分析し得る。このような技術の例としては、種々の分光
法（例えば、ＩＲ、ＵＶ／ＶＩＳおよびＮＭＲ）、および種々の質量分析法（例
えば、エレクトロスプレーイオン化飛行時間計測式［ＥＳＩ−ＴＯＦ］質量分析
）が挙げられる。質量分析データは、例えば、特定の画分内で、タンパク質の一
部の配列または全配列を推論する（すなわち、タンパク質配列タグを決定する）
ために利用され得る。図１は、サンプルがライン８０（破線で、この工程の至適
性質を示す）を介して別の分析器８２（例えば、質量分析計）に排出される状況
を示す。
【０１６７】 多数の他の形状が利用され得る。例えば、キャピラリーおよび検出器は、微小
流体チップ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ）（以下を参照のこと）内で
製造され得る。
【０１６８】 分離キャビティ−から分離したタンパク質を排出するために利用される特定の
溶出条件は、行われた電気泳動方法の型に依存し、そして本発明において代表的
に利用されるそれぞれの電気泳動方法については、以下により詳細に記載されて
いる。しかし、一般に、一旦、タンパク質が分離されれば、分離キャビティ−内
の条件は、必要に応じて調節され（または初期条件が選択され）、このキャビテ
ィ−からのタンパク質の選択的溶出または制御された溶出を達成する。例えば、
溶出は、カソード溶液またはアノード溶液に添加された塩により、もしくはその
溶液のｐＨを調節することにより、電気浸透流を調節することにより、流体力学
的圧力を加えることにより、または前述の組み合わせにより、達成され得る。
【０１６９】 本発明の方法を用いて、分離したタンパク質は、物理的に（例えば、図１に図
示されるような異なる容器への配置）、空間的に（例えば、分離キャビティ−中
に含まれる電気泳動媒体を通じた拡散）、および／または時間的に（例えば、異
なる時点で、キャピラリーからのサンプル溶出内の異なるタンパク質のそのよう
な溶出制御）、単離され得る。従って、本発明の方法は、溶出緩衝液の組成物の
関数および／または時間としてタンパク質の混合物を分離し得、そして、特定の
伝統的２次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動システムでそうであるように、タンパク質
の空間的分離に限定されない。制御された溶出に代わって、画分が、収集され得
、その結果、画分内のタンパク質は、例えば、ある範囲の等電点、電気泳動度、
または分子量の内におさまる。タンパク質の制御された溶出は、この方法が再現
可能な様式で実行され得ることを意味する。このような再現可能性は、例えば、
比較試験を実施するにおいて、そして診断適用において、重要である。
【０１７０】 分離されたタンパク質の溶出または排出の間、一般に、分離したタンパク質を
含む電気泳動媒体の一部のみが、代表的に任意の所定の画分中に収集される。こ
れは、特定の２−Ｄ方法と対照的である。この方法では、全ての分離タンパク質
を含むゲルを分離キャビティ−から滲出し、そして全てのタンパク質を含む滲出
されたゲルを、別の電気泳動分離を実行するために用いる。
【０１７１】 １つの電気泳動方法の結果で得られた、空間的に、物理的に、または時間的に
分離されたタンパク質を、次いで、引き続く電気泳動方法の間、この画分内に含
まれる、タンパク質のさらなる分離のために、サンプルの供給源として、用いる
。図１に示されるように、代表的には、異なる分離画分からのサンプルを、同じ
キャピラリー上で引き続き電気泳動する。通常は、異なる画分中に含まれるタン
パク質の重複がないように、先行しているサンプル中のタンパク質が分離キャビ
ティ−から実質的に排出されるまで、別のサンプルは加えない。同じカラムを通
る画分の引き続く溶出は、特定のスラブゲル電気泳動方法において問題であり得
る、架橋または電場強度中の差異から得られるバリエーションを有意に減少し得
るか、または排除し得る。それ故、引き続く分離がさらに、本発明の方法の再現
性を増強し得る。しかし、平行の様式で、他の方法が実行され得る。ここでは、
異なる画分からのサンプルが、分離キャピラリー上で電気泳動される。このアプ
ローチは、より迅速であることが意図されるべき分離を可能にする。しかし、複
数のキャピラリーの使用により、分離条件の可変性が増大し得、これにより異な
るサンプルの間の再現性をある程度まで減じる。
【０１７２】 特定の方法において、分離プロセスの選択された段階で、タンパク質を標識し
、次いで検出器を用いて検出する。標識可能タンパク質は、低濃度で存在しても
、より容易に検出され、そしてシグナル対ノイズ比を増大することにより再現性
を増強する。検出器を用いて、電気泳動キャビティー内で分離される場合に、ま
たはタンパク質がキャビティ−から溶出された後に、タンパク質を検出し得る。
標識および検出の組み合わせはまた、定量されるべきタンパク質を分離し得る。
標識が行われる方法全般における重要な点は、以下により詳細に議論されるよう
に、一部は実行される特定の電気泳動方法に依存する。しかし、概して、ゲルキ
ャピラリー電気泳動分離が行われる前に、標識は、代表的には行われる。しかし
、通常、キャピラリー等電点電気泳動が行われた後、前にではなく、標識は、行
われる。標識はまた、タンパク質上の正味の荷電およびその相対的電気泳動度を
改変する手段として、ゾーンキャピラリー電気泳動分離が行われる前に用いられ
得る。
【０１７３】 上記に注記されるように、本発明において利用されるいくつかのより通常に用
いられる電気泳動方法は、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリーゾーン電
気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動である。これらの方法の実行に関する特
定の論点は以下の節において記載される。
【０１７４】 （キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）） （一般） 等電点電気泳動は、タンパク質のような両性イオン物質がその等電点（ｐＩ）
に基いて分離される電気泳動方法である。ｐＩは、タンパク質のような両性種が
、正味の荷電を有さず、従って、電場インヒビターに供されても動かない、ｐＨ
である。本発明において、タンパク質は、電場内で、両性電解質または他の両性
物質を用いて生成されたｐＨ勾配内で分離され得る。アノードは、勾配の高いｐ
Ｈ側に配置され、そしてカソードは、勾配の低いｐＨ側に配置される。
【０１７５】 勾配内に導入されるタンパク質は、その等電点によりｐＨ勾配内に集中し、続
いてそこに止まる。ＣＩＥＦを実行するための一般的方法は、例えば、Ｋｉｌａ
ｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｃａｐｉｌｌ
ａｒｉｅｓ」ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，第４章、９５〜１０９頁（１９９４）；ならびにＳｃ
ｈｗａｒｔｚ，Ｈ．およびＴ．Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ，「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒ
ｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｐａｒｔ Ｎｏ．２６６９２３
（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，１９９４）；
Ｗｅｈｒ，Ｔ．Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｒ．，およびＺｈｕ，Ｍ．，「
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ」（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９９）（その全体が参考として
本明細書に援用されている）により記載されている。
【０１７６】 （システムおよび溶液） ＣＩＥＦは、主に低電流密度を用いる平衡技術であり、キャピラリーの加熱は
、代表的には問題ではない。従って、かなり大きいボア（ｂｏｒｅ）キャピラリ
ーが利用され得る。適切なサイズとしては、２〜６００μｍの内径を有するキャ
ピラリーが挙げられるがこれらに限定されない。しかし、より代表的には、２５
〜２５０μｍの内径を有するキャピラリーが利用される。比較的大きいボアキャ
ピラリーの使用は、この方法が比較的高いタンパク質負荷（これは、以下の寸法
において検出を容易にする）を用い得ることを意味する。ＣＩＥＦのこの特徴は
、このシリーズにおける最初のまたは１つの初期の電気泳動分離に十分適した方
法をもたらす。しかし、より小さい直径のキャピラリーは、温度のより注意深い
制御を可能にし、そしていくつかの方法において、改善されたシグナル検出を生
じる（例えば、蛍光標識されたタンパク質のレーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出に
より）。
【０１７７】 このキャピラリーは、異なる長さを有し得る。選択された長さは、必要な分離
の程度のような因子に一部は依存する。代表的には、キャピラリーは、約１０〜
１００ｃｍの長さであるが、いくらか短いキャピラリーおよび長いキャピラリー
が用いられても良い。キャピラリーが長いほど、代表的に、タンパク質混合物の
より良好な分離および改善された分離を生じるが、キャピラリーが長いほど、ま
た、タンパク質壁相互作用、およびより低い電場強度の機会を増大させる。結果
的に、キャピラリーの長さの上限が存在するようであり、これを越えると分離が
損なわれ得る。より長いキャピラリーは、低量のタンパク質を分離するにおいて
特定の用途であり得る。キャピラリーのサイズおよび長さに対するさらなるガイ
ダンスは、例えば、Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＪ．Ａ．Ｎｏｌａｎ，「Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏ
ｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐａｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉ
ｏｎｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｄｅｖｅｌｐｏｍｅｎｔ」ＣＲＣ Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１３章、３２５〜３６８頁（ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９４）に記載されている。
【０１７８】 一般に、キャピラリーは、融合シリカから構成される。しかし、可塑性キャピ
ラリーおよびＰＹＲＥＸ（登録商標）（すなわち、アモルファスガラス）が、特
定の方法において利用され得る。上記のように、キャピラリーは、円形または管
状形状を有する必要はない。他の形状（ここで、対向する面の間の内部距離はこ
の節で示した一般的範囲内である）がまた、用いられ得る。
【０１７９】 種々の異なるカソード溶液およびアノード溶液が用いられ得る。通常の溶液と
しては、アノード液として水酸化ナトリウム、およびカソード液としてリン酸が
挙げられる。同様に、多数の異なる両性電解質がｐＨ勾配を生成するために利用
され得る。これには、多くの市販の両性電界質溶液（例えば、ＢｉｏＬｙｔｅ，
Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ および Ｓｅｒｖａｌｙｔｅ）が挙げられる。両性電解
質および両性電解質勾配の幅の選択は、ＣＩＥＦ方法により達成される分離に影
響し得る。狭い両性電解質勾配により、分離における理論的プレートの数が増加
し、そしてこれは狭いｐＩ範囲にわたるより高い分解分離のために利点であり得
る。
【０１８０】 本発明の分離において利用されるＣＩＥＦ方法は、ポリマー性マトリックスを
含むキャピラリー中で、または溶液なし（すなわち、ゲルも他のポリマーマトリ
ックスもない）のキャピラリー中で実行され得る。ポリマーマトリックスは、代
表的に、緩徐な電気浸透流に添加される；しかし、ある場合には、ポリマーマト
リックスの封入は、より大きいタンパク質の動きを制限し得る（例えば、Ｐａｔ
ｔｏｎ，２６を参照のこと）。電気浸透流を制御するために、遊離の溶液の使用
することは、可能性として他の方法（例えば、キャピラリーコーティング、ゲル
プラグ、または誘導された電場）と組み合わせて、このような場合に好ましい。
【０１８１】 （サンプル調製） 代表的には、ＣＩＥＦにより電気泳動されるべきタンパク質サンプルは、サン
プルをキャピラリーにロードする前に、変成される。これにより、同じタンパク
質がすべて、同じ電荷を有し、従って同一のタンパク質が、潜在的にキャピラリ
ー内のマルチゾーン以外で同じ場所に集中することを確実にする。変性剤（例え
ば、尿素）非イオン性界面活性剤および両性イオン性界面活性剤（例えば、ＩＧ
ＥＰＡＬ ＣＡ−６３０または３−［｛３−コールアミドプロピル｝ジメチルア
ンモニオ］−１−プロパンスルホネート）をまた用いて、タンパク質沈殿を生じ
得る、タンパク質壁および／またはタンパク質間相互作用を抑制し得る。電気泳
動前にタンパク質を変成することの別の利点は、その結果が、代表的には変性条
件下で得られた保存用データと比較して用いられ得ることである。
【０１８２】 代表的な変性緩衝液としては、尿素および非イオン性界面活性剤または両イオ
ン性界面活性剤（変性剤として）が挙げられる；還元剤（例えば、ジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）またはメルカプトエタノール）は、代表的に、タンパク質中に
存在する任意のジスルフィド結合を還元するために、含まれる。用いられ得る、
尿素以外の変性剤としては、チオウレアおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
が挙げられるがこれらに限定されない。一般に、塩酸グアニジンは、非常に高い
イオン強度がサンプルに影響するので、変性剤として利用されない。例示的な中
性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンエーテル（「トリトン（ｔｒｉｔｏ
ｎ）」、例えば、ノナエチレングリコール オクチルシクロヘキシルエーテル（
「ＴＲＩＴＯＮ」Ｘ−１００）、ポリグリコールエーテル、特に、ポリアルキレ
ンアルキルフェニルエーテル、例えば、ノナエチレングリコールオクチルフェニ
ルエーテル（「ＮＯＮＩＤＥＴ」Ｐ−４０またはＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）
、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート（「ＴＷＥＥＮ」−２０）、ポリオキシエチレンエーテル、
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｃ12Ｅ23）（「ＢＲＩＪ」−３
５）、ポリオキシエチレンエステル、例えば、２１ステアリルエーテル（Ｃ18Ｅ23 ）（「ＢＲＩＪ」７２１）、Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ［３−グルコナミド−プロピル］
コールアミド（「ＢＩＧＣＨＡＰ」）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、グ
ルコシド、例えば、オクチルグルコシド，３−［｛３−コールアミドプロピル｝
ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートなどが挙げられる。
【０１８３】 変性剤および界面活性剤の至適量は、用いられる特定の界面活性剤に依存する
。一般に、変成するサンプル緩衝液は、１０Ｍまで（より代表的には、４〜８Ｍ
、そして最も代表的には６〜８Ｍ）の尿素を含む。適切な緩衝液（ならびにそこ
に含まれるための変性剤および非イオン性界面活性剤）の特定の例は、Ｈｏｃｈ
ｓｔｒａｓｓｅｒら［５］およびＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ［６］により記載されるも
のを含む。変性は代表的に、キャピラリーへの注入の前に９５℃で１０分間加熱
することにより進行される。サンプル緩衝液を変性するにおける調節は、生じる
任意の電気浸透流または加熱効果に対処するのに必要である場合になされる（例
えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ
Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃａｐｉｌｌａ
ｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，第４章、９５〜１０９頁（１９９４）
）。
【０１８４】 サンプル内のタンパク質の量は、変化し得、そして上記のように、用いられる
キャピラリーのサイズに一部は依存する。一般に、キャピラリーには、総タンパ
ク質の０．１〜５．０ｍｇをロードする。サンプルを、１つ以上の公知のｐＩ標
準でスパイクし、この方法の能力を評価する。
【０１８５】 （溶出） キャピラリーから出た、分離されたタンパク質を含む電気泳動媒体を溶出また
は排出するために、種々の技術が利用され得るが、これらの方法は３つの一般的
な範疇におさまる：流体力学的溶出、電気的溶出、および電気浸透流の制御。
【０１８６】 （流体力学的溶出／圧力溶出） 流体力学的溶出または圧力溶出は、キャピラリーの一端と接続された適切なポ
ンプを介して圧力を加える（または真空を引く）工程を包含する（例えば、Ｋｉ
ｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｃａｐｉ
ｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，第４章、９５〜１０９頁（１９９４）を参照のこ
と）。しかし、流体力学的溶出は、キャピラリー中に形成されるパラボリックフ
ローのプロフィールに起因して、バンドの広がりおよび分解の損失を生じ得る。
【０１８７】 （電気的溶出） 他の主なアプローチである電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）は、種
々の技術を包含し、そして一般に、十分に溶出をもたらすための分離キャビティ
−において、電気泳動媒体のいくつかのパラメーター（例えば、ｐＨ、イオン強
度、塩濃度）を変化させるため、カソードおよび／またはアノードで溶液を変更
する工程を包含する。
【０１８８】 （塩移動度） １つの電極溶出アプローチは、アノード液またはカソード液への塩の添加を包
含する。この塩は、塩が加えられるリザーバー内の酸性種または塩基性種と同じ
電荷の非酸性または非塩基性の対イオンを有しており、それによりこの対イオン
はリザーバーからキャピラリーに移動する。電気的中立が、キャピラリー内で維
持されなければならないので、対イオンのキャピラリーへの移動は、キャピラリ
ー内の水素または水酸化物の濃度の低下を生じ、従ってｐＨは上昇するか、また
は低下するかのいずれかである。この型の移動の理論的根拠は、Ｓ．Ｈｊｅｒｔ
ｅｎ，Ｊ．−Ｌ．Ｌｉａｏ，およびＫ．Ｙａｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，
３８７：１２７（１９８７）により記載されている。例えば、アノード液が水酸
緩衝液ナトリウムである場合（すなわち、塩基性種が水酸化物である）、次いで
、水酸化物以外の陰性に荷電した対イオンを有する塩が添加される（例えば、塩
化ナトリウム）。キャピラリーへの塩素イオンの移動は、キャピラリー内の水酸
化物の局所濃度を下げ、それにより、ｐＨを下げる。別の例として、カソード液
がリン酸である場合、次いで、水素以外の対イオンを有する塩が加えられる（例
えば、リン酸ナトリウム）。この場合、キャピラリー中へのナトリウムイオンの
移動は、キャピラリー内の水素の局所濃度を減じ、それによりｐＨを上昇させる
。ｐＨが添加された対イオンの存在に起因してキャピラリーの領域内で低下また
は上昇する場合、溶出が生じる。なぜなら、両性電解物質および集中されたタン
パク質は、その等電点に対応する新しく規定されたｐＨ領域に移動するからであ
る。流動のために用いられる塩の型および濃度の両方が、溶出されたタンパク質
ピークの分離に影響を有することが示された［Ｒ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｄｉａ
ｚ，Ｍ．Ｚｈｕ，およびＴ．Ｗｅｈｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．７７２
：１４５（１９９７）］。特に、塩化ナトリウムに代わって四ホウ酸ナトリウム
を、アノード液に添加することにより、分離されたタンパク質のより大きく増大
した分解能を得る。
【０１８９】 （ｐＨ移動） 本明細書において、「ｐＨ移動」と呼ばれる別の技術がまた、ＣＩＥＦ中にタ
ンパク質を溶出するために利用され得る。このアプローチにおいては、添加物を
カソード溶液またはアノード溶液のいずれかに添加し、溶液のｐＨを変更する。
しかし、塩移動と異なり、この添加物は、キャピラリー内で移動する移動性対イ
オンに寄与しない。ここで、リザーバーの１つまたは両方のｐＨにより再定義さ
れているｐＨ勾配の結果として溶出が生じる；従って、この再定義されたｐＨ勾
配におさまらないｐＩ値を有するタンパク質は、カソードリザーバーかまたはア
ノードリザーバーのいずれか中に溶出される。代表的に、アノード性移動のため
の技術は、以下のように進行する。カソード液としてリン酸を、そしてアノード
液として水酸化ナトリウムを用いて、一旦、タンパク質が３〜１０の代表的なｐ
Ｉ範囲に集中されれば、アノード性キャピラリー末端は、溶液を含むリザーバー
内に浸漬される。この溶液は、１０よりわずかに小さいｐＨである（例えば、９
．８５のｐＨを有する５０ｍＭイミダゾール（ｐＫａ ７））。次いで、このタ
ンパク質は、キャピラリー中に再集中させられ、これは、キャピラリーを通じた
電流の安定化により認識可能であり、ここでｐＩ範囲は３〜９．８５に規定され
る。９．８５〜１０の等電点を有する任意のタンパク質が、アノード液中に溶出
される。このプロセスは、ｐＨを９．８５よりわずかに低くさせる種を含むアノ
ード液で繰り返され得る。段階的様式において、ｐＨはｐＨ７まで低下させられ
つづけられ得、それにより７〜１０の範囲にわたる画分中の分離されたタンパク
質を収集する。この時点で、カソード性移動は、ｐＨを３から７に選択的に増加
するために漸増するｐＫａの酸でカソード液を置換することにより進行し得、こ
れにより、酸性範囲（ｐＨ３〜７）中の画分を収集する。画分の数は、所望の分
画分離に依存して変化し得る。代表的に、これらの画分は、０．０５〜０．５の
ｐＨの単位の差異により規定される。
【０１９０】 ｐＨ移動の技術は、キャピラリー内で平坦でない空間的勾配を生じ得る１つ以
上の高濃度のタンパク質を含むタンパク質サンプルに関して有用であり得る。ｐ
Ｈ移動を用いれば、リザーバーｐＨ値により規定されるｐＩ範囲未満かまたはそ
れ以上の等電点を有するタンパク質のみが溶出される。従って、この溶出は、キ
ャピラリーｐＨ勾配の形状における差異、またはキャピラリー内部の非平坦な空
間的勾配の存在にかかわらず、再現可能である。
【０１９１】 （電気浸透流（ＥＯＦ）） 電気浸透流（ＥＯＦ）の大きさを調整することは、前述の電気溶出方法（前記
参照）に有意に影響し、そして別の意味である。これにより溶出されたタンパク
質は、等電電気泳動分離の結果により選択的に排出され得る。ＥＯＦは、シリカ
キャピラリーの表面上のシラノール官能性のイオン化により生じさせられる。こ
のようなイオン化は、シリカキャピラリーの表面で電気泳動媒体中に水素（プロ
トン）の層を生じる。一旦、電場が印加されれば、水素の層は、基本的に、アノ
ードに移動する、液体の正に荷電されたカラムを構成する。これによりキャピラ
リー内の電気泳動媒体のバルク流が生じる。分析物のみかけの速度は、電気浸透
流および分析物の電気泳動移動度の合計に等しい。従って、ＥＯＦを制御するこ
とにより、当業者は、タンパク質がキャピラリーを通じて移動する速度を制御ま
たは調節し得る。ＣＩＥＦ方法においては、通常、ＥＯＦは、タンパク質がキャ
ピラリーから溶出し始める前に、注入されたサンプル内のタンパク質が集中する
のに十分な時間、置かれるように制御されるべきである。
【０１９２】 ＥＯＦを調節するために種々の技術が利用され得る。１つのアプローチは、種
々の薬剤でのキャピラリーの壁のコーティングを包含する。例えば、ガラスシリ
ケート表面に沿うＥＯＦは、表面シラノール基のかなりのパーセンテージをマス
クする中性シラン試薬でそれらをシラン処理することにより実質的に還元され得
る（例えば、ポリアルキルアミド、ポリエチレングリコールおよびポリエチレン
オキシド）。ＥＯＦの大きさは、陽性荷電基または陰性荷電基を含むシラン処理
試薬を用いることによりさらに制御され得る。陽性に荷電したコーティングを用
いて、表面の陰性荷電を取り消し、正味ゼロの表面荷電を達成し得、これにより
ＥＯＦはゼロに接近する。より高い陽性荷電密度でのコーティングを用いて、荷
電された表面材料についてＥＯＦの方向を逆にし得る。これは、陽性に荷電され
たサンプル種の正味の移動速度を遅くするのに有用であり得る。逆に、陰性に荷
電されたコーティングを用いて、表面上の陰性荷電の大きさを伝えるかまたは増
大して、陰性に荷電した種の正味の移動速度を増大する。代表的な陽性に荷電さ
れたコーティングとしては、例えば、ポリエチレンイミン、４級ポリエチレンイ
ミン、ポリ（Ｎ−エチルアミノアクリルアミド）およびキトサンを有するトリア
ルコキシシランが挙げられる。代表的な陰性に荷電されたコーティングとしては
、例えば、ポリ（メチルグルタメート）および２−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホネートポリマーのような材料を含む、カルボキシレートおよびス
ルホネートを有するトリアルコキシシランが挙げられる。荷電されたコーティン
グはまた、サンプル吸着を効果的に減少し得ること（特に、コーティングと同じ
荷電極性を有するサンプルについて）が認識される。
【０１９３】 分離媒体はまた、電気泳動の間のＥＯＦの還元を助けるため、分離キャビティ
−の壁を動的にコーティングするための可溶性薬剤を含み得る。このような可溶
性コーティング剤としては、例えば、４級アンモニウムコーティングポリマー、
メチルセルロース誘導体、セルロースアセテート、ポリエチレンオキシド、キト
サン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、
およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド
３ブロックコポリマーが挙げられる。代表的には、可溶性コーティング剤は、約
０．０５％〜約４％、そしてより代表的には、約１％〜約２％の濃度で含まれる
。
【０１９４】 ＥＯＦおよびサンプルの吸着はまた、分離媒体および泳動緩衝液中に適切な試
薬を含むことにより、調節され得る。例えば、陰性表面荷電は、培地中に陰イオ
ン性添加物（例えば、金属アミン複合体、アミンおよびポリアミン（例えば、プ
ロピルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン
、プトレシン、スペルミン、１，３−ジアミノプロパン、モルホリンなど））を
含むことによりマスクされ得る。電気泳動のｐＨで等電である、陰性に荷電した
基および陽性に荷電した基の両方を含む両イオン性種（例えば、トリアルキルア
ンモニウムプロピルスルホネート（ここで、アルキルは、メチル、エチル、プロ
ピルおよびより長いアルキル鎖である））がまた、用いられ得る。
【０１９５】 別のアプローチは、ＥＯＦに反対する電流の生成を包含する。代表的には、こ
れは、キャピラリーの外部表面に、金属（例えば、イリジウム酸化スズまたは銅
）の薄いフィルムを適用することにより達成される。フィルムに電流を流すこと
により、キャピラリー内への比較的小さい誘導電流を生じて、ＥＯＦを逆にする
（例えば、Ｓｃａｓｆｏｏｒｔ，Ｒ．Ｂ．Ｍ．，Ｓｃｈａｌａｕｔｍａｎｎ，Ｓ
．，Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅ，Ｊ．，およびｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ａ．，「Ｆ
ｉｅｌｄ−Ｅｆｆｅｃｔ Ｆｌｏｗ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆａ
ｂｒｉｃａｔｅｄ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｎｅｔｗａｒｋｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８
６：９４２〜８４５（１９９９）を参照のこと）。
【０１９６】 サンプルが導入される位置の上流位置に多孔性プラグを配置すること（上流と
は、キャピラリーを通じるタンパク質の流れの反対方向を言う）をまた利用して
、ＥＯＦを制御し得る。プラグの位置を示す例は、図２Ｂに例示されている。こ
こでは、キャピラリー１００が、一端でカソードリザーバー（示さず）から伸張
し、そして他の一端（示さず）でアノードリザーバーから伸張している。タンパ
ク質移動は、矢印１０２の方向である（すなわち、カソードからアノードの方向
）。
【０１９７】 理解されるように、多孔性プラグ１０４は、一旦キャピラリー１００に導入さ
れれば、サンプルの後縁（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｅｄｇｅ）１０６の上流になるよ
うに配置される。多孔性プラグ１０４は、代表的にはポリマー性物質から形成さ
れ、そして電気泳動の間、比較的定常のままである。プラグが形成され得る適切
な材料の例としては、ジアクリルアミド架橋を有するポリマー化アクリルアミド
およびアガロースが挙げられる。いかなる特定の理論により束縛されることも意
図しないが、多孔性プラグ１０４は、バルク液（プラグ１０４の非存在下ではア
ノードリザーバーの方へ移動する）の置き換えをブロックすることにより運動量
移行障壁として機能するようである。
【０１９８】 多量のタンパク質および／または多数の異なるタンパク質を含有する方法のよ
うな幾つかの方法において、ＥＯＦは、電気泳動媒体がＥＯＦのためにキャピラ
リーから溶出し始める前に、タンパク質が集中し得る非常に低いレベルにまで減
少されるべきである。特定の方法において、０．５×１０-6ｃｍ2／Ｖ−ｓ（ｐ
Ｈ８．６および２５ｍＭ ＴＲＩＳ−リン酸）のＥＯＦは、キャピラリーからサ
ンプルが溶出する前にタンパク質の必要な集中のための十分な時間を得ることが
、見出された。上に記載される方法は、ＥＯＦをこれらのレベルまで低下させ得
る。
【０１９９】 従って、上記アプローチは、異なる基準に従って画分が収集されることを可能
にする。例えば、電気溶出技術は、規定されたｐＨ範囲を有する画分を収集する
ために使用され得る。対照的に、ＥＯＦ溶出および圧力溶出は、溶出の時間に従
って、画分を分離するために使用され得る。他の技術はまた、ＣＩＥＦ後の分離
されたタンパク質を溶出するために利用され得る（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，
「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ
」， ｉｎ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｒ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，第４章、９５−１０９頁（１９９４））。制御された
溶出技術は、比較診断方法における重要な因子である再現性を向上するために有
用である。このような技術はまた、空間の分離に依存する方法と比較して、高い
含量のタンパク質の改良された許容度を提供する。
【０２００】 （キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）） （概要） キャピラリーゾーン電気泳動は、ゲルマトリクスを含まない自由溶液中で行な
われる電気泳動方法であり、分子の固有の電荷対質量比に基づく分子（例えば、
タンパク質）の分離を生じる。ＣＺＥ法に対する１つの利点は、典型的に水溶性
のゲルマトリクスと通常不適合である溶媒系を用いて泳動する能力である。非水
性または水混和性の溶媒系は、ゲル電気泳動法によって通常分離されない疎水性
の膜結合タンパク質の溶解度を改良するために使用され得る。この方法を実施す
るための一般的方法は、例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．の「Ｃａｐｉｌ
ｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ」 ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ Ｐｒ
ｅｓｓ Ｉｎｃ．，第１２章、２８７〜３２３頁（１９９４）；Ｊｏｒｇｅｎｓ
ｏｎ，Ｊ．Ｗ．およびＬｕｋａｃｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｊ．Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔ
．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｃｏｍｍｕｍ．，４：２３０（１９８１）；およびＪ
ｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．およびＬｕｋａｃｓ，Ｋ．Ｄ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．５３：１２９８（１９８１）に記載され、これらの各々は全体を通して参考
として援用される。
【０２０１】 （システムおよび溶液） 概して、ＣＩＥＦについて上に記載されたキャピラリーはまた、ＣＺＥ法を実
施するために適切である。しばしば、このキャピラリーは約５０〜１００ミクロ
ンの内径を有する。ＣＺＥでの分離が電荷対質量比に基づき、そしてタンパク質
の電荷が周囲の溶液のｐＨに依存するため、緩衝液組成およびｐＨは、分離に有
意に影響を及ぼす。ｐＨの極度（すなわち、２未満および１０より上）において
、典型的に、タンパク質の分離を達成することは困難である。なぜなら、全ての
残基が完全にプロトン化されるかまたは脱プロトン化されるかのいずれかであり
、多くのタンパク質は単位質量あたり同様の数の酸性残基および塩基性残基を有
するからである。選択性は、代表的には中間ｐＨで高められる。比較的高い割合
の酸性残基を有するタンパク質について、選択性はしばしばｐＨ４．５付近で高
められる。高濃度の塩基性残基を有するタンパク質について、選択性はｐＨ１０
付近で高められ得る。
【０２０２】 ＣＺＥにおいて、アノードおよびカソードの溶液は、代表的には同じである。
使用される緩衝液は、実質的に任意の緩衝液であり得、緩衝液の選択は、電気泳
動法が実施されるｐＨ範囲および検出器のノイズに及ぼす影響によって一部制御
される。低ｐＨで有用な緩衝液の例として、リン酸およびクエン酸が挙げられ、
これらに限定されず；高ｐＨで有用な緩衝液の例として、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉ
ｎｅ、ボレートおよびＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパン
スルホン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な緩衝液および緩衝
液添加剤に関するさらなるガイダンスは、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．「Ｃａ
ｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ」ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，第１２章、２８７〜３２３頁（１９９４）に記載される
。
【０２０３】 （溶出） 溶出は、ＣＩＥＦ（すなわち、圧力およびＥＯＦ）について上で記載される同
じ方法の幾つかを使用して達成され得る。ＣＩＥＦを用いた場合、ＥＯＦを制御
することは、装填されたサンプル内のタンパク質が分離する機会を有する前に、
タンパク質を含有する電気泳動媒体がキャピラリーからの溶出を妨げるための特
定の方法において重要であり得る。ＥＯＦは、ＣＩＥＦ法におけるＥＯＦを制御
するために使用される同じ方法を使用して制御され得る（例えば、キャピラリー
の内壁のコーティング、多孔性プラグの使用、およびＥＯＦを相殺するための誘
導電場の発生）。電気泳動媒体のｐＨおよびイオン強度を調整しそして慎重に選
択することは、使用され得る別の技術である。ＥＯＦは、比較的低いｐＨ（例え
ば、ｐＨ２−５、より典型的には約３−４）においてＣＺＥを行うことによって
、内部キャピラリー表面上のシラノール基のイオン化を生じるため、イオン化さ
れるシラノール基の数は減少される。このような減少は、ＥＯＦを低下させる。
完全な分離の前にサンプル溶出を回避するために、特定の分析においてＥＯＦは
１×１０-4ｃｍ2／Ｖ−ｓ未満（ｐＨ８．６および２５ｍＭ ＴＲＩＳ−リン酸
緩衝液において）に下げられるべきである。このレベルのＥＯＦは、ちょうど記
載した方法を使用して得られ得る。
【０２０４】 検出セクションおよび標識セクションにおいて以下により完全に記載される別
のアプローチは、キャピラリーにタンパク質を含むサンプルを注入する前に、サ
ンプル中のタンパク質を標識することである。アミノ基またはカルボキシル基の
ような特定の官能基と優先的に反応する標識を選択することによって、特定のタ
ンパク質の電荷対質量比は変更され得る。このような変更は、電気泳動中のタン
パク質の分離を改良し得、ならびにそれらの検出能を改良し得る。（以下の実施
例１および２を参照のこと）。
【０２０５】 （キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＦ）） （概論） キャピラリーゲル電気泳動は、ゲルマトリクスを通してふるい分けすることに
よって達成されるタンパク質の分離をいい、サイズによるタンパク質の分離を生
じる。１つの形式において、タンパク質はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で
変性され、その結果、質量対電荷比は、タンパク質の固有の質量対電荷比ではな
く、むしろこのアニオン性界面活性剤によって決定される［５０，２］。これは
、タンパク質の分離度に電荷が寄与することなく、専らサイズをもとに分離され
得る。一般的なＳＤＡ ＰＡＧＥ電気泳動法のキャピラリー電気泳動（ＣＧＥ）
への適用は、例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，「Ｆｒｅｅ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ｃｈｅｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｖ．，９：１２２（１
９６７）に記載される。
【０２０６】 （システムおよび溶液） キャピラリーの型およびそれらのサイズは、概して、ＣＺＥについて上に記載
される通りである。種々の異なる緩衝液が使用され得、Ｂｅｃｋｍｅｎによって
製造された「ｅＣＡＰ ＳＤＳ」緩衝液のような市販の緩衝液が挙げられる（ま
た、５１、３０、９および５を参照のこと）。種々の緩衝添加剤は、分離を増大
するために利用され得る。このような添加剤として、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、シクロヘキシルジエチルアミン、ジメトキシテトラエチレングリコールお
よび他のポリオール（例えば、エチレングリコールおよびポリエチレングリコー
ル）のような少量の有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、
［２］および［３］を参照のこと）。このような溶媒の使用は、水溶液中のタン
パク質の溶解度を改良し得、熱変性に対するタンパク質の安定性を向上し得、Ｃ
ＺＥおよびＣＧＥ［５３］中の電気浸透流を抑制し得［５２］、キャピラリー壁
の電気二重層の厚みを変更してタンパク質結合相互作用を阻害し得［４７］、そ
して電気浸透流を抑制するランニング緩衝液の粘性を増大し得る。使用される溶
媒は、キャピラリー内部のポリマーマトリクスと適合するべきである。
【０２０７】 等速電気泳動（ＩＰＥ）は、タンパク質の分離を増大するための特定の方法で
使用され得る。ＩＰＥの一般的議論については、例えば、Ｂ．Ｊ．Ｗａｎｄｅｒ
ｓおよびＥｖｅｒａｅｒｔｓ，Ｆ．Ｍ．，「Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｉｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」ＣＲＣ Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第５章，１１１〜１２７頁（１
９９４）を参照のこと（これは、全体を通して参考として援用される）。一定の
場強度下でキャピラリーを移動する荷電した分子の速度は、その相対的移動度に
依存し、これは、分子の質量／電荷、温度、およびその分子が通過する媒体の粘
性の関数である。しかし、適切な濃度の高移動性イオン上流のサンプルイオンの
非存在下で、一旦電場がキャピラリー内部で安定した状態に達すると、全てのイ
オンは、最終的に最も遅いイオンの速度で移動しなければならない。この状態は
、アニオンを先導緩衝液と末端緩衝液との界面においてそれらの相対移動度の順
にスタックさせる。
【０２０８】 ＳＤＳ変性状態下で、サンプル中に存在する全てのタンパク質は、ほぼ同一の
質量／電荷を有する。末端緩衝液中のより高い質量／電荷アニオンを使用するこ
とによって、キャピラリーを通して一定した遅い速度でタンパク質を移動し得る
。これは２つの影響を有する。第１に、タンパク質は、キャピラリー内のそれら
の有効濃度を増加する先導緩衝液の末端縁で「スタック」する。第２に、タンパ
ク質間の任意の分離は、サイズに基づいている。それ故に、ＩＰＥがサンプル「
スタッキング」のために使用されるハイブリッドＩＰＥ−ＣＧＥ法の使用は、幾
つかの方法における後のＣＧＥ分離において可能な分離を改良し得る。
【０２０９】 種々の末端緩衝液システムは、ＩＰＥ法と組み合わせて使用され得る。１つの
システムにおいて、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は、末端電解質として使
用される。なぜなら、それは高ｐＨ（＞６）で高い質量／電荷を有するためであ
る。０．０５Ｍのトリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）クエン
酸は、ｐＨ＝４．８において先導緩衝液として使用され、ｐＨ＝６．５において
中間スタッキング緩衝液として使用される。ＥＡＣＡはｐＨ６．５スタッキング
緩衝液中で非常に低い移動度を有するため、サンプルタンパク質は、始めに「ス
タック」するが、一旦、タンパク質が「スタック」し、ＥＡＣＡが低ｐＨ先導緩
衝液に達すると、ＥＡＣＡの移動度は、タンパク質の移動度をまさり、分離が開
始する（例えば、［５７］を参照のこと）。このシステムは、ハイブリッド単一
カラムＩＰＥ−ＣＰＡＧＥシステムを生成するために使用され得る。
【０２１０】 タンパク質の分離のためのＩＰＥ用の２つの緩衝液システムは、０．０１Ｍ酢
酸にサンプルを溶解する工程を包含し、これはまた、末端電解質として使用され
る。先導緩衝液およびバックグラウンド緩衝液は、ｐＨ４．４の０．０２Ｍトリ
エチルアミン−酢酸溶液である。末端緩衝液中のサンプルは、先導緩衝液とバッ
クグラウンド緩衝液との間に挟まれる。バックグラウンド緩衝液が末端緩衝液の
先導縁を追い越すまでＩＰＥを続け、押し越した時点でＩＰＥが停止し、そして
分離が始まる（例えば、［５８］を参照のこと）。
【０２１１】 任意のランニング緩衝液を用いて達成され得る別のＩＰＥアプローチは、より
低いイオン強度まで希釈されたランニング緩衝液にサンプルを溶解することであ
る。これによって、サンプルプラグが充填されたキャピラリー中の電気抵抗の増
加、およびサンプルマトリクス中に存在するイオンの、ランニング緩衝液境界へ
の対応するより速い移動をもたらす。サンプルマトリクスとランニング緩衝液と
の間の最適なイオン強度の差は、代表的には約１０倍である（例えば、［４３］
を御参照下さい）。
【０２１２】 （溶出） 概して、ＣＺＥについての溶出の議論をＣＧＥに適用する。溶出は、圧力およ
びＥＯＦを利用して達成され得る。ＣＩＥＦおよびＣＺＥを用いた場合、ＥＯＦ
を制御することは、適用されたサンプル内のタンパク質が分離の機会を有する前
に、タンパク質を含む電気泳動媒体が溶出するのを防ぐための特定の方法におい
て、重要であり得る。ＣＩＥＦおよびＣＺＥについて前述した方法は、所望のレ
ベルでＥＯＦを制御するために使用され得る。完全な分離の前にサンプル溶出を
防ぐために、特定の分析において、ＥＯＦは、１×１０−４ｃｍ2／Ｖ−ｓ未満
（ｐＨ８．６、２５ｍＭ ＴＲＩＳ−リン酸緩衝液）に下げられるべきである。
ＥＯＦは、例えば、緩衝液のｐＨの制御、相殺する誘導電場の発生、キャピラリ
ーコーティングおよび多孔性ゲルプラグによって、この範囲に下げられ得る。
【０２１３】 （検出工程との組み合わせ） 幾つかの例において、本発明の方法によって分離されたタンパク質は、質量分
析法によってさらなる分析に供される。このような例において、特定の標識は、
質量スペクトルの特定の部分へのマスフラグメントの分離を向上するために使用
され得る。このような方法における適切な標識は、２０００年２月２５日に出願
の、代理人整理番号０２０４４４−０００３００ＵＳを有する、表題「Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の同時係属出願番号
０９／５１３，３９５により完全に記載される。この出願は、本明細書中におい
て、全体を通して参考として援用される。
【０２１４】 検出されたシグナルの定量は、確立された方法に従って達成され得る。ピーク
高さおよびピーク面積は、代表的に、最終的な電気泳動的大きさに分離されたタ
ンパク質の各々の量を定量するために使用される。幾つかの方法において、ピー
ク高さ、ピーク半値幅、ピーク面積、および各ピークについての溶出時間が記録
される。ピーク形状（高さ対幅の比として決定される）は、分離方法の質の尺度
として使用され得る。この方法の分離能力は、タンパク質のＭＷを溶出時間で補
正することによって決定され得る（例えば、［３０］および［１１］）。各タン
パク質の平均ピーク幅で全体の泳動時間を割ることによって、この方法によって
分離され得るタンパク質の総数の評価（例えば、少なくとも１つのピーク幅によ
って分離されたタンパク質は、「分離された」タンパク質と考慮され得る）が得
られ得る。ＭＷ評価の再現性は、２つの方法によって決定され得る。１つの方法
において、１つの泳動から標準曲線を確立し、そしてその曲線を使用して各々の
後の泳動からの溶出時間に基づくＭＷを決定することによって、３つの反復泳動
における各タンパク質について決定された見かけのＭＷを比較した（例えば、［
２１］を参照のこと）。第２のアプローチにおいて、この方法の全体の誤差は、
全ての３つの反復泳動由来のデータを使用して作成した標準曲線の傾きの標準偏
差から決定した。
【０２１５】 本発明の特定の方法で使用され得る標識および直接検出アプローチは、従来の
２−Ｄゲルで使用される染色画像化方法と比較して、相対タンパク質発現レベル
の定量化の改良された再現性を生じ得る。染色技術は頻繁に定量性に乏しい結果
を生じる。なぜなら、種々の量の染色が各タンパク質に組み込まれ、その染色さ
れたタンパク質が、ゲルまたはエレクトロブロッティング基板の染色されたバッ
クグラウンドに対して検出されそして分離されなければならないためである。さ
らに、この方法が電気泳動法の組み合わせを使用するため、得られた２−Ｄゲル
画像データと直接比較できる電気泳動図がさらに得られる。これは、他の非電気
泳動をベースとする分離（例えば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）と比べて、この方法が２
−Ｄゲル情報と比較できることを意味する。
【０２１６】 （例示的システム） 本発明の方法は、種々の異なる電気泳動法に従う。規定された画分が空間的に
、物理的に、または時間によって分離される制御された溶出技術、および標識検
出方法は、多数の異なる電気泳動技術において使用され得る。上で述べたように
、連続して連結した電気泳動法の数は少なくとも２つであるが、複数の追加の電
気泳動法を含み得る。幾つかの例において、一連の中の各電気泳動法は異なり；
一方で、他の例における特定の電気泳動法は、異なるｐＨまたは分離マトリクス
状態で繰り返される。
【０２１７】 この方法の一般的適用性にも関わらず、上のＣＩＥＦで述べたように、ＣＺＥ
法およびＣＧＥ法は、本発明の方法に従って利用され得る電気泳動法の型の特定
の実施例である。特定の方法において、たった２つの方法が実施される。このよ
うな方法の例として、ＣＩＥＦがまず実施され、次いでＣＧＥが実施される方法
が挙げられる。標識は、代表的にはＣＩＥＦ後に実施され、ＣＧＥキャピラリー
からのタンパク質の溶出の後の検出を伴う。ＣＩＥＦキャピラリーから溶出する
タンパク質は、例えば、２１４ｎｍまたは２８０ｎｍにおいてＵＶ／ＶＩＳ分光
光度計を使用して検出され得る。別のシステムにおいて、第１の方法はＣＺＥで
あり、最終的方法はＣＧＥである。この配置を伴い、標識は代表的に、前述した
ように分離を高めるためにＣＺＥの前に実施される。検出は、概して、最終的な
電気泳動分離が完了するまで実施されない。第３の有用なアプローチは、始めに
ＣＩＥＦを行う工程、次いでＣＺＥおよびＣＧＥを行う工程を包含する。このよ
うなシステムのための標識は、代表的には、ＣＩＥＦの後でＣＺＥの前に行なわ
れる。全体の方法におけるこの時点での標識は、ＣＩＥＦパターン（前述を参照
のこと）の変更を回避し、ＣＺＥの間のより多くの分離を可能にする。検出は、
概して、ＣＧＥの終わり（すなわち、キャピラリー内に分離されたタンパク質を
有するか、またはタンパク質がキャピラリーから溶出された後）に行なわれる。
これらは、使用され得るシステムの特定の例であり；本発明がこれらの特定のシ
ステムに限定されないことは理解されるべきである。他の配置およびシステムは
、本明細書中に記載される技術およびアプローチを使用して発展され得る。
【０２１８】 （サンプル） 本発明の方法は、広範囲のサンプル型を用いて使用され得る。基本的に、任意
のタンパク質含有サンプルは、本明細書中に記載される方法を用いて使用され得
る。このサンプルは、比較的少数のタンパク質を含み得るか、または大多数のタ
ンパク質（例えば、細胞または組織サンプル内に発現された全てのタンパク質）
を含み得る。
【０２１９】 サンプルは、任意の生物から得られ得るか、または合成によって調製したタン
パク質の混合物であり得るか、またはそれらの組み合わせであり得る。従って、
適切なサンプルは、例えば、微生物（例えば、ウイルス、細菌および真菌）、哺
乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコ）、ヒト科（例え
ば、ヒト、チンパンジーおよびサル）および植物から得られ得る。サンプルの供
給源を規定するために使用される用語「被験体」として、例えば、上記供給源の
全てが挙げられる。用語「患者」は、ヒトおよび獣医学的被験体の両方をいう。
このサンプルは、組織または組織ホモジネートまたは生物の流体および細胞また
は細胞培養物由来であり得る。従って、例えば、サンプルは、全血、血清、精液
、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、頬、皮膚、髄液、組織生検または検死および髪
から得られ得る。サンプルはまた、エキソビボ細胞培養物（成長培地、組換え細
胞および細胞成分）由来であり得る。潜在的な薬物または薬物標的（下記を参照
のこと）を同定するための比較研究において、例えば、１つのサンプルは疾患細
胞から得られ得、別のサンプルは非疾患細胞から得られ得る。
【０２２０】 異なる電気泳動技術のためのサンプル調製は、上に記載される。サンプルが細
胞片または電気泳動中の分離を妨害する非タンパク質物質を含む場合、このよう
な物質は、種々の公知の分離技術（例えば、ふるい材料を通したサンプルの強制
押出し、濾過および遠心分離）のいずれかを使用して除去され得る。イオン強度
が特に高いサンプルは、透析および希釈および再濃縮のような確立された技術を
使用して脱塩され得る。
【０２２１】 サンプルが塩または他の妨害成分を含む幾つかの例において、緩衝液交換は、
ＩＰＥ「スタッキング」を改良し、そして電気泳動法のための溶出時間およびピ
ーク形状の再現性を改良するために、実施され得る。妨害成分を除去するために
透析を実施する１つの有用な方法は、スピン透析チューブ（Ｇｉｌｓｏｎ／Ａｍ
ｉｃｏｎ）の透析チャンバに直接に画分を収集することである。次いで、サンプ
ルは、スピン透析され得、そして１０倍希釈のランニング緩衝液に再懸濁し、一
連の次の電気泳動分離に利用される。この手順は、以下の利点を有する：（１）
ＣＩＥＦの場合において、より大きな容量の緩衝液が、各画分中のタンパク質を
希釈することなく、各画分の電気溶出の間に使用され得、（２）同じサンプル容
量が、二次元に注入される各画分について使用され得、そして（３）透析された
タンパク質は透析後ほとんど任意の緩衝液の容量に再懸濁され得るため、より少
量でより濃縮されたサンプル容量が二次元で使用され得る。
【０２２２】 （変形物） 本発明の方法は、一連の最後の電気泳動法で終了する必要はない。図１に示さ
れるように、分離されたタンパク質は、非電気泳動法によってさらに分析され得
る。このような方法の例として、赤外分光法、核磁気共鳴分光法、ＵＶ／ＶＩＳ
分光法および完全な配列決定法または部分的な配列決定法が挙げられる。現在の
電気泳動をベースとする方法を種々の質量分析法（ＭＳ）に組合せることは、実
施され得るさらなる分析の１つの特定の例である。種々の質量分析技術が使用さ
れ得、幾つかのＭＳ／ＭＳ法および電子スプレ−飛行時間ＭＳ法が挙げられる（
例えば、［６１］、［６２］、［６３］、および［６４］を参照のこと）。この
ような方法は、タンパク質配列タグ（タンパク質配列タグの議論については、例
えば、［６５］および［６６］を参照のこと）のような電気泳動法によって分離
されたタンパク質の少なくとも部分的な配列を決定するために使用され得る。本
明細書中に記載した電気泳動分離と質量分析との組み合わせに関するさらなる議
論は、１９９９年４月２０日出願の表題「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔ
ａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」の米国仮出願第６０／１３０，２３８号に記
載され、この出願は利益を請求し、全体を通して参考として援用される。本発明
の方法と組み合わせられ得る他の質量分析法は、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の、代理人整理番号０２０４４４−
０００３００ＵＳを有する同時係属中の米国出願第０９／５１３，３９５号、お
よび表題「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｖｉａ Ｍｕｌｔｉｄｉｍ
ｅｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」の、代理人整理番号０２
０４４４−０００２００ＵＳを有する同時係属中の米国出願第０９／５１３，４
８６号に記載され、両方とも２０００年２月２５日に出願され、両方とも全体を
通して参考として援用される。
【０２２３】 （微小流体システム） 別の変形物において、キャピラリーは、非常に小さなスケールで、サンプルの
最小量のみを必要とする本発明の分析を実施するために使用され得る微小流体デ
バイスの一部を形成するために、基板の一部であるか、基板内に形成され得る。
これらの方法において、サンプルの物理的画分は典型的には、収集されない。そ
の代わり、分離されたタンパク質は、空間的にまたは時間によって分離される。
微小流体チャネルまたはキャピラリーおよび種々の異なる設計内にサンプルを作
製し、移動させるための方法は、例えば、米国特許第５，８５８，１８８号；同
第５，９３５，４０１号；同第６，００７，６９０号；同第５，８７６，６７５
号；同第６，００１，２３１号；および同第５，９７６，３３６号で議論されて
おり、これらの全てはそれらの全体を通して参考として援用される。
【０２２４】 本発明の方法を用いて使用され得る一般的システム１５０の例は、図３Ａに示
される。キャピラリーまたはチャネルは、代表的に、平面の支持体または基板内
で形成されるかまたはエッチングされる。分離キャピラリー１５２は、アノード
液を含有するアノードリザバ１５４からカソードリザバ１５６まで延びる。この
アノードリザバ１５４およびカソードリザバ１５６は、それぞれ、アノード１５
８、カソード１６０と電気接続される。サンプル注入チャネル１６２は、分離キ
ャピラリー１５２に対してほぼ垂直に泳動し、一端は、アノードリザバ１５４の
僅かに下流の注入部位１６４で交差する。サンプル注入キャピラリー１６２の他
端は、サンプルリザバ１６６で終結し、これは、サンプルリザバ電極１６８と電
気接続している。検出器１７０は、分離キャピラリー１５２を通過する電気泳動
媒体と流体連絡するように位置付けられ、サンプル注入部位１６４の下流に、典
型的にカソードリザバ１５６の幾分上流に位置付けられる。この特定の配置にお
いて、画分はカソードリザバに引かれる。種々のチャネルを通過する電気泳動媒
体の移動は、１つ以上の電極１５８、１６０、１６８を介して、電場を選択的に
適用することによって制御される。電場の電極への適用は、種々のキャピラリー
内のＥＯＦの規模、従ってそれらを通る流れを制御する。
【０２２５】 別の形状の例を図３Ｂに図示する。このシステム１８０は、図３Ａに示される
システムに記載される要素を含む。しかし、この構成において、空間的または時
間的に分離された画分は、出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃ
を介した分離キャピラリー１５２に沿った複数の異なる位置で回収され得る。こ
れらのキャピラリーの各々は、それぞれ、緩衝液リザーバ１７６ａ、１７６ｂ、
１７６ｃを含み、そしてそれぞれ電極１７４ａ、１７４ｂ、１７４ｃと電気通信
する。分離キャピラリー１５２に沿った電気泳動媒体の移動および出口キャピラ
リー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃへのそこからの画分の回収は、分離キャ
ピラリー１５２に沿った電極および出口キャピラリー電極が活性化される制御に
よって制御され得る。あるいは、または加えて、種々の微流体弁が、出口キャピ
ラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃに配置されて、流れを制御し得る。代
表的には、さらなる検出器が、種々の出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよ
び１７２ｃに配置されて、これらのキャピラリーに回収された画分におけるタン
パク質を検出する。
【０２２６】 図３Ｂに図示される形状は、多くのことなる適用に使用され得る。この型のシ
ステムが適切な適用の一つの例は、試験されているサンプルの型が、良好に特徴
付けられている状況である。例えば、目的のタンパク質の特定の画分が以前に確
立されて、分離キャピラリー１５２の特定の位置で分画される場合、次いで、出
口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃが、目的のタンパク質画分の
選択的除去を可能にするような位置に配置され得る。
【０２２７】 さらに別の形状において、複数の出口キャピラリーは、アノードリザーバ１５
６付近の分離キャピラリーの末端（分離された画分の回収および輸送のための各
々の出口キャピラリー）から枝分かれする。この形状においてまた、分離キャピ
ラリーからの分画タンパク質の回収は、種々のキャピラリー内部のＥＯＦの調節
および／または微流体弁によって制御され得る。
【０２２８】 電気泳動分析を実施するに必要な他の構成要素は、支持体（例えば、上記で議
論されたリザーバ、検出器および弁を含む）にエッチングされ得る。
【０２２９】 （基板） 本発明の分析デバイスのキャピラリーネットワークまたはマイクロチャネルネ
ットワークが形成される基板は、広範な種々の材料（珪素、ガラス、融合シリカ
、結晶石英、融合石英および種々のプラスチックなどを含む）から作製され得る
。デバイスの他の構成要素（例えば、検出器および微流体弁）は、デバイスの特
定の使用、経済的懸念、溶媒適合性、光学的透明度、機械的強度および他の構造
的懸念に依存して、同じまたは異なる材料から作製され得る。一般的に、基板は
、非伝導材料から製造されて、種々のチャネルを介したサンプルの動電学的輸送
に適用されるべき比較的高い電場を与える。
【０２３０】 ポリマー性基板（例えば、プラスチック）の場合において、基板材料は、材料
が意図される使用に依存して、剛体、半剛体または非剛体、不透明体、半不透明
体または透明であり得る。本発明の電場に供する場合に低い表面電荷を有するプ
ラスチック、それ故、特に有益なプラスチックとしては、例えば、ポリメチルメ
タクリレート、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン
またはスチレンコポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリビニ
ルクロリド、ポリスルホンなどが挙げられる。
【０２３１】 光学検出器または視覚検出器を含むデバイスは、一般的に、透明な材料から少
なくとも部分的に作製されて、検出器による分離チャネル内部の構成要素の検出
を容易にする。
【０２３２】 （チャネル構造／形成） 本デバイスの基板に形成されたチャネルまたはキャピラリーの大きさおよび形
状は、本質的に任意の形状（半円形、円柱状、矩形および台形を含むが、これら
に限定されない）を有し得る。チャネルの深さは変化し得るが、約１０〜１００
ミクロンの傾向があり、最も代表的には、約５０ミクロンである。チャネルは、
２０〜２００ミクロンの幅の傾向がある。
【０２３３】 基板の表面に形成されたチャネルおよび他の要素の製造は、当該分野で公知の
任意の数の微作製（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ）技術によって行われ得
る。例えば、石版技術は、例えば、半導体製造業において確立された方法を使用
して、ガラス基板または石英基板の作製に利用され得る。写真平板マスキング、
プラズマまたはウエットエッチングおよび他の半導体プロセス技術が利用されて
、基板表面内または基板表面上の微小規模要素を作製し得る。あるいは、ミクロ
機械加工方法（例えば、レーザー穿孔、マイクロミリング（ｍｉｃｒｏｍｉｌｌ
ｉｎｇ）など）が利用され得る。プラスチックにチャネルおよび他の要素を調製
するための製造技術もまた確立されている。これらの技術は、例えば、微小規模
基板の大きなシートの生産ためのローリングスタンプ、またはポリマーマイクロ
キャスティング（ｍｉｃｒｏｃａｓｔｉｎｇ）技術を使用した、注入成型技術、
スタンプ成型方法を含み、ここで、基板は、マイクロマシン成型の内部で重合化
する。
【０２３４】 このような微流体デバイス（例えば、上記のデバイス）を使用するための他の
設計および方法に関するさらなる手引きは、例えば、米国特許第５，８５８，１
８８号；同第５，９３５，４０１号；同第６，００７，６９０号；同第５，８７
６，６７５号；同第６，００１，２３１号；および同第５，９７６，３３６号に
見出され得、これらのすべてがその全体において参考として援用される。 （質
量分析検出および配列決定） 変形物において、緩衝液システムは、揮発性の緩衝液塩、有機溶媒および短寿
命の（ｅｐｈｅｍｅｒａｌ）界面活性剤の使用を通した最後の分離工程において
変更されて、引き続く質量分析に適合する溶出剤を作製し得る。緩衝液塩は、イ
オン種を作製するためのプロトンを受容し得るかまたは拒否し得る、有機種およ
び無機種からなる。揮発性緩衝液塩は、水の蒸発に際して実質的に気相に蒸発す
る緩衝液塩のサブセットからなり、ここで、実質的に蒸発するとは、代表的には
、５０％を超える質量揮発性、より代表的には、８０％を超える質量揮発性およ
び最も代表的には、９０〜１００％の質量揮発性として規定される。例示的な例
としては、アンモニウム陽イオン、アルキルアンモニウム陽イオンおよびアリー
ルアンモニウム陽イオン、ピリジウム陽イオン、アルキルホスホニウム陽イオン
およびアリールホスホニウム陽イオン、ならびにアルキルスルホニウム陽イオン
およびアリールスルホニウム陽イオンの群、ならびにアルキルスルホネート陰イ
オンおよびアリールスルホネート陰イオン、アルキルホスホネート陰イオンおよ
びアリールホスホネート陰イオン、アルキルボラート陰イオンまたはアリールボ
ラート陰イオン、アルキルカルボキシレート陰イオンまたはアリールカルボキシ
レート陰イオン、ハロゲン化カルボキシレート陰イオン、炭酸塩陰イオンならび
に重炭酸塩陰イオンの群より選択される塩が挙げられる。例示的非代表的な例と
しては、ナトリウム陰イオンおよびカリウム陰イオン、またはハロゲン化物陰イ
オンおよび硫酸塩陰イオンの群より選択される、少なくとも１つの成分を有する
塩が挙げられる。
【０２３５】 はかない（ｅｐｈｅｍｅｒａｌ）界面活性剤は、気相に実質的に蒸発するか、
または水の蒸発に際して実質的に気相に蒸発する種を形成するように分解する、
陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、中性界面活性剤または双性イオ
ン性界面活性剤からなり、ここで、実質的に蒸発するとは、代表的には、５０％
を超える質量揮発性、より代表的には、８０％を超える質量揮発性および最も代
表的には、９０〜１００％の質量揮発性として規定される。例示的な陰イオンの
例としては、ドデシル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸アルキルアンモニウムま
たはドデシル硫酸アリールアンモニウム、ならびにアルキルアンモニウムパーフ
ルオロアルキルカルボキシレートが挙げられる。例示的な陽イオンの例としては
、アルキルアンモニウムカルボキシレート種またはアルキルホスホニウムカルボ
キシレート種が挙げられ、ここで、少なくとも１つのアルキル鎖が、代表的には
、５〜３０炭素長であり、そしてより代表的には、６〜１５炭素長であり、そし
て最も代表的には、１０〜１４炭素長である。
【０２３６】 （非電気泳動技術による予備分離） この方法はまた、電気泳動分離を開始する前の、非電気泳動技術による初期の
分離を含み得る。タンパク質を分離し得る本質的に任意の型の技術が利用され得
る。適切な方法としては、硫酸塩勾配、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィ
およびアフィニティクロマトグラフィでの分画が挙げられるがこれらに限定され
ない（重要だと考える他の技術を列挙されたい）。
【０２３７】 （例示的な有用性） 本発明の方法および装置は、分画されたタンパク質の溶出の制御ならびに種々
の標識および検出技術の利用によって、多くのタンパク質（例えば、同じ方法に
おける数百または数千のタンパク質）の検出、特徴付けおよび／または同定のた
めに利用され得る。結果的に、この方法は、種々の分析適用（例えば、外部刺激
の機能としての特定のタンパク質レベルのモニター、または同定の目的のための
複合体組成物における特定のタンパク質の検出）、臨床適用（例えば、正常な細
胞および組織ならびに患部細胞および組織の組成物の、検出および／またはモニ
ター、疾患の診断またはモニター、治療有効性および毒性試験についての薬物候
補物の試験）ならびに分子生物学および遺伝子研究（例えば、遺伝子産物の分子
発現レベルの特徴付けまたはモニター、ならびに特定の遺伝子の付加、変異、欠
失または切断の効果の決定）を含むがこれらに限定されない複数の有用性を有す
る。一般的に、この方法および装置は、プロテオソーム研究における有用性を有
する。
【０２３８】 より特に、本発明は、例えば、特定の条件下で発現されるタンパク質が、単離
され、計量され、そして同定されるタンパク質データベースの開発に使用され得
る。本明細書中に記載される制御された溶出および検出方法を使用して、特定の
方法が、分離されたタンパク質の種々の化学的および物理的特徴（ｐＩおよび／
または明らかな分子量ならびに／あるいはサンプル中のタンパク質の相対的存在
比を含むがこれらに限定されない）の決定および目録作製のために利用され得る
。この情報を、収集されたサンプルの供給源および方法に関する種々の情報と、
さらに相互参照し得る。このような情報の例としては、属、種、年齢、類、性別
、環境曝露条件、被験体の健康、組織型、サンプル収集方法および電気泳動前の
サンプル調製方法が挙げられる。
【０２３９】 この方法はまた、潜在的な薬物標的および／または候補物の同定のために利用
され得る種々の比較研究における有用性を有する。例えば、この方法は、正常細
胞と比較した場合、患部細胞において差次的に発現されるタンパク質を同定する
ために利用され得る。このように差次的に発現されたタンパク質は、薬物の標的
または潜在的療法として役立ち得る。関連した様式において、この方法が毒物学
研究において使用されて、特定の毒物に応答して差次的に発現されるタンパク質
を同定し得る。このように差次的に発現されたタンパク質は、特定の毒性化合物
またはチャレンジのための潜在的標的または潜在的解毒剤として役立ち得る。本
発明の検出および標識技術は、このような研究を容易にし得る。なぜなら、これ
らの技術は、低い存在比のタンパク質でさえも検出し、そして増大された再現性
が、異なるサンプル間の発現における実際の差の同定をより容易にするからであ
る。
【０２４０】 本発明の特定の方法を使用したプロテオーム研究は、遺伝子転写物の未成熟末
端または生じた遺伝子産物におけるアミノ酸置換を生じる変異を検出し得る。こ
の方法はまた、機能的ゲノムを使用して、容易には検出可能ではないかまたは検
出不可能である疾患に関連した翻訳後修飾事象を検出し得る。例えば、プロテオ
ーム方法は、タンパク質の折り畳み、グリコシル化パターン、リン酸化事象およ
び分解速度における差を検出し得る。
【０２４１】 比較研究の結果は、種々の診断適用に移行可能である。例えば、比較研究の間
に特定の疾患の特徴として同定された「マーカー」タンパク質または「フィンガ
ープリント」タンパク質が使用されて、マーカーに関連した疾患を有するか否か
を決定するために、個体を診断し得る。これらのマーカーはまた、医療用スクリ
ーニング試験に使用され得る。一旦、このようなタンパク質が同定されると、必
ずしもすべての画分を試験する必要はない。代わりに、マーカータンパク質を潜
在的に含む画分のみを試験する必要がある。この方法の再現性は、このような分
析を容易にする。チップまたは支持体（上記参照のこと）上に組み込まれたシス
テムについて、キャピラリーが、分離キャビティに沿った適切な位置に配置され
て、目的のマーカータンパク質を潜在的に含む関連した画分のみを回収し得る。
【０２４２】 診断適用の例として、プロテオーム分析は、免疫診断アッセイのための診断マ
ーカー（例えば、細胞表面抗原または血清タンパク質）の同定に利用され得る。
推定診断タンパク質の精製されたサンプルは、プロテオーム分析の間に回収され
、そしてタンパク質との特異的結合親和性を有する抗体を産生するために使用さ
れ得る。このような抗体は、免疫学的染色を通して、マーカータンパク質と疾患
との間の関連を理解するために使用されて、患部細胞にタンパク質を局在化し得
るか、またはタンパク質の存在について患者を迅速にスクリーニングし得、これ
は、疾患とのその統計学的関連を示す。
【０２４３】 本発明の方法は、構造活性研究の実施におけるさらなる有用性を有する。例え
ば、この方法は、タンパク質発現様式に対して特定の化学薬品またはその薬品の
組み合わせが有する効果を決定するために使用され得る。次いで、薬品または組
み合わせに対する変更がなされ得、そしてタンパク質発現が、もしあれば、変更
がタンパク質発現に対して有する効果を決定するために再評価され得る。このよ
うな研究は、例えば、初期の薬物スクリーニング試験の間に同定されたリード化
合物の誘導体の作製に有用であり得る。
【０２４４】 （ＩＩＩ．質量分析フラグメンテーション） 本発明の局面は、タンパク質配列決定のための新規の非タンパク質分解性質量
分析法の開発に属する。この方法は、独特の質量タグでのインタクトなタンパク
質のＮ末端またはＣ末端の標識、質量分析計のイオン化ゾーンにおけるインタク
トな標識化タンパク質のフラグメンテーション（供給源内（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ
）フラグメンテーション）、および生じた標識化ペプチド系列の質量ラダーから
の配列決定によって行われる。標識化ペプチドは、生じた質量スペクトルにおけ
る独特の質量サインによって、未標識のペプチドと区別される。いくつかの実施
形態において、このプロセスは、精製された標識化タンパク質について１分未満
で果たされ、現行のＭＳ／ＭＳタンパク質配列決定技術よりも５００〜１０００
倍迅速な方法をもたらす。
【０２４５】 標識化タンパク質は、ＭＳのイオン化ゾーンにおいて高度にフラグメンテーシ
ョンされる。これは、親タンパク質に関連して、生じた標識化ペプチドフラグメ
ントイオンの増大したイオン化効率および揮発性を導き、それ故、検出感受性全
体を改良する。この配列は、質量スペクトルの低い分子量末端から構築され、生
じた標識化ペプチドフラグメントから、より絶対的な質量精度およびより容易な
配列決定（ＱおよびＫ残基の分離を含む）を提供する。
【０２４６】 この技術についての適切な標識の選択は、いくつかの基準の考慮を必要とする
。第一に、標識は、ＭＳのフラグメンテーション条件に耐えるに十分に強くある
べきである。第二に、標識はまた、タンパク質骨格の内部切断から生成される任
意の未標識ペプチドから識別可能である、独特の質量／電荷（ｍ／ｚ）サインを
作製するべきである。第三に、標識はまた、安定度の高い荷電を保有して、フラ
グメンテーションが、非荷電のＮ末端およびＣ末端残基さえも含む高い存在比の
イオンを生成することを確実にし得る。天然のＮ末端アセチル化標識を保有する
グリコーゲンホスホリラーゼを使用した実施例６は、技術の普遍性を示す。
【０２４７】 一つの局面において、本発明は、タンパク質の一部分を配列決定するための方
法を提供し、この方法は、以下の工程： （ａ）Ｃ末端またはＮ末端標識部分とタンパク質を接触させ、タンパク質のＣ
末端またはＮ末端へ標識を共有結合させ、そして標識化タンパク質を形成する工
程；および （ｂ）質量分析フラグメンテーション方法を使用して標識化タンパク質を分析
し、少なくとも２つのＣ末端残基または少なくとも２つのＮ末端残基の配列を決
定する工程 を包含する。
【０２４８】 本発明のこの局面において、タンパク質は、本質的に任意の供給源から得られ
得る。好ましくは、タンパク質は、干渉成分を含まないように単離され、そして
精製される。単離されたタンパク質は、Ｃ末端またはＮ末端標識化部分と接触さ
れて、質量分析フラグメンテーション方法による分析に適した標識化タンパク質
を形成するように、タンパク質のＣ末端またはＮ末端へ標識を共有結合し得る。
【０２４９】 （標識化タンパク質） 一つの局面において、本発明は、タンパク質サンプルにおける複数の異なるタ
ンパク質の標識方法を提供し、この方法は、独特のイオン質量サイン成分、定量
検出成分および複数の異なるタンパク質の少なくとも一部分に標識を共有結合す
る反応性官能基を有する標識化因子とタンパク質サンプルを接触させる工程を包
含する。
【０２５０】 本発明のこの局面において、タンパク質は、本質的に任意の供給源から得られ
得る。好ましくは、タンパク質は、干渉成分を含まないように、少なくとも部分
的に単離されるか、または精製される。単離されたタンパク質は、標識化部分、
好ましくは、タンパク質の少なくとも一部分のＣ末端またはＮ末端に標識を共有
結合する、Ｃ末端またはＮ末端標識化部分と接触されて、さらなる精製および質
量分析フラグメンテーション方法による分析に適した、標識化タンパク質の混合
物を形成し得る。
【０２５１】 この直接的な検出を容易にするためのタンパク質の化学修飾は、特に、キャピ
ラリー電気泳動において実施されるタンパク質分離について新規ではない。Ｐａ
ｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＮｏｌａｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｐｉ
ｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎ
ｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」：ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１３章，３２５−３６８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂ
ｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）；Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ，Ｔ．ら、「Ｑｕ
ａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ
ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗ
ｉｔｈ ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｒｏｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎ
ｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＣＥ−ＬＩＦ−ＩＤ），Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ａ−１７９１Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ １９９５）；Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．お
よびＫ．Ｄ．Ｌｕｋａｃｓ，Ｊ．Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４：２３０（１９８１）；Ｂｏ
ｄｈｅ，Ａ．Ｍ．，ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４：３９−４３（１
９８７）；ならびにＧｕｚｍａｎ，Ｎ．Ａ．，ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．
，６０８：１９７−２０４（１９９２）を参照のこと。フルオレサミンは、電気
泳動後のゲルおよび電気泳動的転写（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）におけるタンパ
ク質の検出のために使用されている。Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｙｅ，Ｊ．，Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２：９−１９（１９８５）を参照のこと。し
かし、２−Ｄ電気泳動分離技術の後の検出を容易にするための複数のタンパク質
の直接的な蛍光標識は、以前に報告されていないようである。
【０２５２】 ＲｏｓｅおよびＪｏｒｇｅｎｓｅｎ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４４７：
１１７（１９８８））は、ｏ−フタルジアルデヒドを使用して、キャピラリー後
の蛍光検出を増大するために、キャピラリーゾーン電気泳動分離から流出物を誘
導体化した。Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔら（「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉ
ｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａ
ｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅ
ｄ ｆｌｕｒｏｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＣＥ−ＬＩ
Ｆ−ＩＤ），Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ａ−１７９１
Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ １
９９５））は、Ｃｙ５TMシアニン色素で標識された抗原（Ａｎ）（１：１のモル
比で）を使用した競合蛍光イムノアッセイ、およびヒト血清由来の免疫反応産物
のＣＥ分離後のレーザー誘導性蛍光（ＬＩＦ）検出を示した。Ｐｒｉｔｃｈｅｔ
ｔらは、競合ＣＥイムノアッセイを用いたアンギオテンシンＩＩ抗原（Ａｎ）に
ついての１０-9Ｍの検出感受性を報告する。ＣＥ−ＬＩＦ系の絶対的な検出感受
性は報告されていないが、報告された希釈因子（１０）および銀染色の比較可能
な感受性よりもほぼ３オーダーの大きさで良好な約１０6分子（平均４０ｋＤａ
のタンパク質と仮定）までの推定サンプルローディング（１０〜２０μＬ）から
推定され得る。
【０２５３】 化学的誘導体化の使用はまた、多くのタンパク質同定技術の基本である（Ｓｔ
ａｒｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１０
３−１２０（１９７２）；Ｎｉａｌｌ，Ｈ．Ｄ．，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｅｄ
ｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎａｔ
ｏｒ，」：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７：９４２−１０
１１（１９７３）；Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，２５：１２１−１３７（１９７２）；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｗ．Ａ．
，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：１３８−１４３（１９
７２）；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ，ＮＹ，１９８４）；Ｎｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５：６０−９９（１９７２））。ここで、Ｎ
末端またはＣ末端アミノ酸は、タンパク質から酵素学的または化学的に切断され
た後に実施されたクロマトグラフィ分析における検出を容易にする分子で共有結
合的に標識される。Ｗｕおよび共同研究者（Ｗｕ，ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２３５：１６１−１７４（１９９６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．およびＪ
．Ｗｕ，Ｐｏｌｙｍ．Ｐｒｅｐｒ．，３７：３１８（１９９６）），Ｄｅｎｓｌ
ｏｗおよびＮｇｕｙｅｎ（Ｄｅｎｓｌｏｗ，Ｎ．Ｄ．およびＨ．Ｐ．Ｎｇｕｙｅ
ｎ，：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖ
ＩＩ，Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．Ｒ．，編、２４１−２４８頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６））ならびにＭｉｎｇら（Ｍ
ｉｎｇ，Ｄ．，ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８：８０８−８１０（１９
９５））は、システイン基の数、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）に
よるタンパク質における位置の同定を容易にするための、システインおよびシス
テイン基の化学的誘導体化のための方法を報告した。ＭｕｒｐｈｙおよびＦｅｎ
ｓｅｌａｕ（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｃ．Ｍ．およびＣ．Ｆｅｎｓｅｌａｕ，Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．，６７：１６４４−１６４５（１９９５））は、内部生成されたすべ
てのカルボキシル末端ペプチドへ、３２の質量単位を添加するための臭化シアン
消化の間に生成された、ホモセリンラクトン残基のメタノリシスの使用を実証し
た。オリジナルのＣ末端を含むペプチドフラグメントは、メチルエステルに変換
され、その質量に１４Ｄａのみ付加し、それ故、ＭＳにおいて識別可能である。
Ｒｏｓｅら（Ｒｏｓｅ，Ｋ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５０：２５３−２
５９（１９８８））は、タンパク質のトリプシン消化が、Ｈ2 18Ｏ：Ｈ2 16Ｏの１
：１のモル比で行われる類似のアプローチを実証した。従って、内部生成によっ
て生じたトリプシンフラグメントのカルボキシル末端の半分が、18Ｏで標識され
、そして生じた質量スペクトルにおいて、独特の５０：５０の同位体分裂を示す
。オリジナルのカルボキシル末端は、未標識のままであり、そして容易に区別さ
れる。
【０２５４】 本発明は、非常に精密な分離後検出ならびに引き続く質量分析配列決定および
同定のためにタンパク質を同時に調製する、タンパク質またはタンパク質混合物
についての標識化手順に属し、これは、好ましくは、非タンパク質分解性であり
、そして非化学分解性である。本方法は、独特のイオン質量成分、定量検出成分
およびタンパク質（単数または複数）に結合するための反応性の官能基を有する
標識で、インタクトなタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端またはタンパク質混合
物のＮ末端もしくはＣ末端を標識することによって行われる。次いで、生じた標
識化タンパク質混合物は、本明細書中に記載された方法に従って分離され得、そ
して検出され得る。
【０２５５】 代表的には、これらの分離方法は、複数のキャピラリー電気泳動方法（次元（
ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ））を実施する工程を包含し、ここで、複数のタンパク質を
含むサンプルが、最後の電気泳動分離次元の前の次元において標識され、そして
標識化タンパク質検出および定量が、最後の電気泳動次元の終わりに実施される
。いくつかの実施形態において、タンパク質検出および定量は、レーザー誘導性
蛍光によって達成される。いくつかの実施形態において、このプロセスは、０．
０１〜０．００１ｎｇの標識化タンパク質の検出に帰し、現行のゲル染色技術よ
りも１０〜１００倍高い感受性の検出方法をもたらす。いくつかの実施形態にお
いて、このプロセスは、サンプルに含まれるタンパク質の相対的存在比における
１〜５％の標準偏差に帰し、現行のゲル染色技術よりも１０倍高いタンパク質存
在比の再現可能な測定をもたらす。
【０２５６】 タンパク質同定方法は、代表的には、質量分析計のイオン化ゾーンにおけるイ
ンタクトな標識化タンパク質をフラグメンテーションする工程（例えば、供給源
内フラグメンテーション）、および生じた標識化ペプチド系列の質量ラダーから
配列決定する工程を包含する。標識化ペプチドは、生じた質量スペクトルにおけ
る独特の質量サインによって、未標識ペプチドと区別される。いくつかの実施形
態において、このプロセスは、精製された標識化タンパク質について１分未満で
達成され、現行のＭＳ／ＭＳタンパク質配列決定技術よりも５００〜１０００倍
迅速な方法をもたらす。
【０２５７】 標識化タンパク質は、好ましくは標識の存在によって影響される様式で、ＭＳ
のイオン化ゾーンにおいて高度にフラグメンテーションされる。好ましい標識は
、親タンパク質に関連して、増大したイオン化効率および生じた標識化ペプチド
フラグメントイオンの増強した揮発性を導き、従って、検出感受性全体を改良す
る。タンパク質またはタンパク質配列タグの配列は、好ましくは、質量スペクト
ルの低い分子量末端から構築され、これまでの方法を超える利点（例えば、生じ
た標識化ペプチドフラグメントからのより絶対的な質量精度およびより容易な配
列決定（Ｑ残基およびＫ残基の分離を含む））を提供する。
【０２５８】 この技術についての適切な標識の選択は、いくつかの判断基準の考慮を必要と
する。第１に、標識は、好ましくは、ＭＳの断片化条件を残存するに十分に頑強
である。例えば、硫黄含有標識は、一般的に、それらの非硫黄含有類似体よりも
さほど頑強ではない。第２に、標識は、好ましくはまた、タンパク質バックボー
ンの内部分割から生成されるいかなる非標識ペプチドからをも識別可能である、
固有の質量／電荷（ｍ／ｚ）サインを作製する。第３に、標識はまた、定量的検
出増強成分（例えば、イオン化可能基または永続的にイオン化された基）を保有
して、断片化が、非荷電Ｎ末端残基およびＣ末端残基、および／または高感度で
光学的に検出され得る発色団基または蛍光団基さえも含む多量のイオンを生じる
ことを保証する。
【０２５９】 水性または水性／有機溶媒環境の混合物中における種々の薬剤でのタンパク質
の標識は、当該分野において公知であり、そして本発明を実施する際に有用な広
範な種々の標識化試薬および技術が、当業者に容易に利用可能である。例えば、
Ｍｅａｎｓら、ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴ
ＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９７１；Ｆ
ｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ；ＦＯＯＤ
，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰ
ＥＣＴＳ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１
９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２；Ｆｅｅｎｅｙら、ＦＯＯＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ
：ＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴ ＴＨＲＯＵＧＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＥＮ
ＺＹＭＡＴＩＣ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ 第１６０巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９７７；およびＨｅ
ｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６を参照のこと。
【０２６０】 標識化が実施され得、そしてＰＳＴは、タンパク質のＮ末端末またはＣ末端末
のいずれかから決定され得る。真核生物タンパク質の約５９〜９０％が、Ｎ末端
アセチル化されており、従って、Ｎ末端標識化に不応性ある。しかし、このよう
なタンパク質の天然のＮアセチル基は、時折、本発明の目的のための標識として
使用され得るが、これは、そのＮ末端の４残基以内において１以上のアミノ酸が
イオン化可能である（例えば、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、
アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基である）か、またはイオン化可能
であるように誘導体化され得る（例えば、チロシン残基、セリン残基、およびシ
ステイン残基）場合においてのみである。従って、Ｎ末端またはＣ末端のいずれ
かを標識するためのストラテジーは、任意の所定のタンパク質について非常に高
程度の配列決定能力を付与するために提供される。一旦、標識が選択されると、
逆重畳アルゴリズムを改変して、任意の改変残基に対応する質量について探索し
得る。
【０２６１】 上述のように、以下を考慮することが、標識化剤の選択に適切である： ｉ）標識の質量は、好ましくは、固有であり、そして好ましくは、低いバック
グラウンドを有するスペクトルの領域に、フラグメント質量をシフトさせる； ｉｉ）標識は、好ましくは、固定された正電荷または負電荷を含み、Ｎ末端ま
たはＣ末端での電荷の断片化を直接的に遠隔する； ｉｉｉ）標識は、好ましくは、断片化条件下で頑強であり、そして不都合な断
片化を受けない； ｉｖ）標識化化学は、好ましくは、一定範囲の条件（特に、変性条件）下で効
率的であり、それにより、再現可能かつ均一に、Ｎ末端またはＣ末端を標識する
； ｖ）標識されたタンパク質は、好ましくは、選り抜きのＭＳ緩衝系において可
溶性を維持する；そして ｖｉ）標識は、好ましくは、タンパク質のイオン化効率を増加させるか、また
は少なくともタンパク質のイオン化効率を抑制しない； ｖｉｉ）標識は、２以上の同位体的に異なる種の混合物を含み、各標識フラグ
メント位置において固有の質量分析パターンを生じ得る。
【０２６２】 標識選択の判断基準の観点から、好ましい標識部分は、検出増強成分、イオン
質量サイン成分、およびＣ末端またはＮ末端反応性官能基を有するものである。
この反応基は、他の２つの標識成分のいずれかまたは両方に、直接的に結合され
得る。
【０２６３】 別の実施形態では、反応性官能基は、検出増強成分およびイオン質量サイン成
分の１つまたは両方から、リンカーによって分離され得る。リンカーは、好まし
くは、化学的に安定であり、かつ不活性であるように、そして反応基と、タグの
他の２つの成分のうちの少なくとも１つとの効率的な分離を可能にするように、
設計される。本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、炭化水素鎖、最も好
ましくは、アリールまたはヘテロアリール環に連結された炭化水素鎖から構成さ
れ、そして好ましくは、イオン化可能基とそのイソチオシアネート基との間のさ
らなる分離を提供する。
【０２６４】 当業者に理解されるように、炭化水素鎖および改変された炭化水素鎖の実質的
に無限のアレイが、本発明において利用され得る。フェニル環に結合される好ま
しい炭化水素鎖は、アルカンのファミリーにおいて見出され得、特に好ましいリ
ンカーは、長さが２炭素原子〜約２０炭素原子の範囲である。本発明の好ましい
実施形態では、リンカーはフェネチル基である。
【０２６５】 （ＩＶ．標識成分および結合化学） （タンパク質混合物） 適切なタンパク質サンプルは、本質的に任意の生物学的サンプル（例えば、細
胞）または患者由来の組織サンプルから獲得され得る。好ましい実施形態では、
サンプルは、流体（例えば、血液、脳脊髄液など）中のヒト細胞または他の組織
（例えば、腫瘍の生検または検死サンプル由来の細胞のような）から得られる。
サンプルは、代表的に、ヒト患者から採取されるが、サンプルはまた、概して真
核生物（植物、脊椎動物、および無脊椎動物を含む）由来の細胞、そして特に哺
乳動物（イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、およびブタ）、そしてとりわけ、霊長類（
例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、マカク、およびヒヒ）、およびげっ歯類
（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）における細胞から調製され得る
。細菌培養物もまた、タンパク質サンプルの供給源として使用され得る。
【０２６６】 タンパク質サンプルを調製した細胞サンプルまたは組織サンプルは、代表的に
、例えば、癌または別の疾患を有すると疑われる患者から採取される。細胞サン
プルおよび組織サンプルを単離する方法は、当業者に周知であり、そしてこれに
は、吸引、組織切片化、針生検などが含まれるが、これらに限定されない。しば
しば、サンプルは、「臨床的サンプル」であり、これは、当業者に公知の任意の
標準的技術の使用に由来するサンプルである。例えば、宿主細胞を溶解して、フ
レンチプレス、均質化、および／または超音波処理によって、細胞質の成分を放
出し得る。次いで、ホモジネートは遠心分離され得る。
【０２６７】 ポリペプチドが、ペリプラズムにおいて形成された封入体を有するタンパク質
サンプルについて、この封入体は、しばしば、細胞内膜および／または細胞外膜
に結合し、従って、主に遠心分離後のペレット物質において見出される。次いで
、このペレット物質をカオトロピック剤（例えば、グアニジンまたは尿素）で処
理して、封入体を放出、分解、そして可溶化し得る。膜貫通タンパク質および脂
肪親和性タンパク質は、カオトロピック剤、界面活性剤および有機溶媒の使用を
通して、遠心分離後にペレット物質から可溶化され得る。次いで、これらの可溶
性形態のポリペプチドは、免疫沈降、酸沈降（例えば、５〜１０％のトリクロロ
酢酸）、硫安沈殿、溶媒沈殿、または他の当業者に公知の方法によって、単離さ
れ得る。タンパク質単離の他の方法が、例えば、Ｍａｒｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚ．１８２：２６４−２７５（１９９０）に記載される。
【０２６８】 封入体が宿主細胞のペリプラズムにおいて有意な程度には形成されない、タン
パク質およびポリペプチド混合物について、ポリペプチドは主に、細胞ホモジネ
ートの遠心分離後の上清において見出され、そしてポリペプチドは、種々の型の
クロマトグラフィー（免疫親和性、分子ふるい、および／またはイオン交換）、
および／または高速液体クロマトグラフィーのような方法を使用して、この上清
から単離され得る。いくつかの場合には、完全な精製のために、１つより多くの
これらの方法を使用することが好適であり得る。
【０２６９】 上記のようなタンパク質またはポリペプチド混合物の単離後に、タンパク質サ
ンプルは、代表的に、適切な緩衝溶液で希釈されるか、またはいくつかの場合に
おいては、濃縮され得る。任意の多くの標準的な緩衝溶液（種々の緩衝液（例え
ば、生理学的ｐＨでのホスフェート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
など）の１つを使用する）が、使用され得る。上述の供給源由来のタンパク質サ
ンプルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、または少なくとも
１００、もしくはそれより多いタンパク質を含み得る。
【０２７０】 （標識化剤） 種々の標識化剤が、本発明において有用である。適切な標識化剤の選択は、以
下から選択される、いくつかの判断基準の考慮を必要とする： ｉ）標識の質量は、好ましくは、固有であり、そして好ましくは、低いバック
グラウンドを有する質量スペクトルの領域に、フラグメント質量をシフトさせる
； ｉｉ）標識は、好ましくは、固定された正電荷または負電荷を含み、Ｎ末端ま
たはＣ末端での電荷の断片化を直接的に遠隔する； ｉｉｉ）標識は、好ましくは、断片化条件下で頑強であり、そして不都合な断
片化を受けない； ｉｖ）標識化化学は、好ましくは、一定範囲の条件（特に、変性条件）下で効
率的であり、それにより、再現可能かつ均一に、Ｎ末端またはＣ末端を標識する
； ｖ）標識されたタンパク質は、好ましくは、選り抜きのＣＥおよびＭＳ緩衝系
において可溶性を維持する；そして ｖｉ）標識は、好ましくは、タンパク質のイオン化効率を増加させるか、また
は少なくともタンパク質のイオン化効率を抑制しない； ｖｉｉ）標識は、２以上の同位体的に異なる種の混合物を含み、各標識フラグ
メント位置において固有の質量分析パターンを生じ得る。
【０２７１】 標識選択の判断基準の観点から、好ましい標識部分は、検出増強成分、イオン
質量サイン成分、およびＣ末端またはＮ末端反応性官能基を有するものである。
この反応基は、他の２つの標識成分のいずれかまたは両方に、直接的に結合され
得る。
【０２７２】 別の実施形態では、反応性官能基は、検出増強成分およびイオン質量サイン成
分の１つまたは両方から、リンカーによって分離される。リンカーは、好ましく
は、化学的に安定であり、かつ不活性であるように、そして反応基と、タグの他
の２つの成分のうちの少なくとも１つとの効率的な分離を可能にするように、設
計される。本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、炭化水素鎖もしくはポ
リエチレンオキシド鎖、または最も好ましくは、アリールまたはヘテロアリール
環に連結された炭化水素鎖またはポリエチレンオキシド鎖から構成され、そして
好ましくは、イオン化可能基と反応性官能基との間のさらなる分離を提供する。
【０２７３】 当業者に理解されるように、種々の炭化水素鎖および改変された炭化水素鎖が
、本発明において利用され得る。フェニル環に結合される好ましい炭化水素鎖は
、アルキレン基である。特に好ましいリンカーは、長さが２炭素原子〜約２０炭
素原子の範囲である。本発明の好ましい実施形態では、リンカーはフェネチル基
である。
【０２７４】 本発明は、より一般的に、以下を含む化学的標識部分を具現化する： （ｉ）検出増強成分、 （ｉｉ）質量分析法において固有のイオン質量サインを示し、そして標識化部
分に結合されたペプチドフラグメントにこのサインを付与する、成分、および （ｉｉｉ）特定の位置のタンパク質（最も好ましくは、タンパク質のＭ末端ア
ミンまたはＣ末端カルボキシル末端）に共有結合により化学薬剤を結合させる、
成分。
【０２７５】 この方法のバリエーションにおいて、標識化部分は、 （ｉｖ）少なくとも１つの電気泳動分離工程の前に、複数のタンパク質を含む混
合物中のすべてのタンパク質に結合される。
【０２７６】 この方法のバリエーションにおいて、標識化部分は、 （ｖ）タンパク質において内在する（またはネイティブな）電荷を変更し、電気
泳動モードにおいてその分離座標を変更する。
【０２７７】 この方法のバリエーションにおいて、標識部分の質量および／または電荷は、
（ｖｉ）最後の電気泳動工程における検出および定量化の後であって、かつタン
パク質の部分的配列決定のための質量分析法における使用の前に、１以上の成分
の付加または切断を通して変更される。
【０２７８】 １つの実施形態では、標識化部分は、電気泳動の間、標識化タンパク質の分離
の後に混合サンプル中に存在する大部分のタンパク質の相対量または絶対量を定
量するために使用される。蛍光、ＵＶ、または可視的色素、および放射性検出増
強成分が、その内在的に高い検出制限が理由で、この実施形態において典型的で
ある。蛍光構成成分は、これらの電気泳動単位の蛍光検出器の容易な利用可能性
が理由で、キャピラリー電気泳動分離について最も典型的である。放射性構成要
素は、電気泳動ゲルについてのリン光体スクリーンおよび写真フィルム検出技術
の容易な利用可能性が理由で、他のモードの電気泳動分離について最も典型的で
ある。ＭＳ検出についての最も典型的な検出増強成分は、荷電成分または容易に
イオン化可能な成分である。この実施形態のバリエーションにおいて、１より多
い検出増強成分が、標識化部分において使用され得る。
【０２７９】 別の実施形態では、標識化部分は、質量分析法においてタンパク質またはその
タンパク質に由来するフラグメント化ペプチドに対して、固有の質量サインを付
与し、その結果、その固有な質量サインを使用して、標識から伸長されている部
分的タンパク質配列を決定し得る。この方法のバリエーションにおいて、標識は
、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に結合されて、Ｎ末端またはＣ末端のタンパ
ク質配列の決定を可能にする。この方法のバリエーションにおいて、標識の固有
の質量サインは、検出増強成分およびタンパク質との反応後の反応成分の質量の
合計の関数として作成される。この方法のバリエーションにおいて、固有の質量
サインは、化学的部分の１以上の同位体を富化した改変体の混合物の使用によっ
て付与される。この方法のバリエーションにおいて、固有の質量サインは、化学
基の置換によって互いに異なる実質的に同一の化学的部分の混合物によって付与
される。別の実施形態では、同じ成分が、定量的検出のため、および固有のイオ
ン質量サインを提示するための両方のために使用され得る。このような構成成分
の例は、ナフタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｉｃ）構成要素（例えば、ダンシルク
ロリド中）（これは、質量分析法において蛍光性であり、かつイオン化される）
であるが、ナフタレン構成要素に限定されない。
【０２８０】 （イオン質量サイン成分） イオン質量サイン成分は、好ましくは、質量分析において固有のイオン質量サ
インを付与する標識化部分の部分である。標識のすべての構成要素原子の質量の
合計は、好ましくは、すべての可能なアミノ酸のフラグメントとは固有に異なる
。結果として、標識化アミノ酸およびペプチドは、生じた質量スペクトルにおけ
るそのイオン／質量パターンによって、非標識アミノ酸およびペプチドから容易
に識別可能である。好ましい実施形態では、イオン質量サイン成分は、質量分析
法フラグメント化の間に生成されるタンパク質フラグメントに質量を付与し、こ
れは、任意の２０個の天然のアミノ酸についての残基、もしくはａ−イオン質量
およびｂ−イオン質量（Ｎ末端配列決定について）、またはｙ−イオン質量（Ｃ
末端配列決定について）とは、一致しない。
【０２８１】 当業者によって理解されるように、偽性の質量スペクトルのピークは、標識さ
れていないアミノ酸およびペプチドのフラグメント化からのみならず、サンプル
および／またはマトリックス中の不純物からをも生じ得る。標識のイオン質量サ
インの異常をさらに増加させるために、そしてこの「ノイズ」に対して、所望さ
れる標識フラグメントのピークを同定するために、標識の質量を最適化すること
によって、よりスペクトルのノイズの少ない領域に標識フラグメントをシフトさ
せることが好適であり得る。例えば、標識質量が、１００ ａｍｕより高くそし
て７００ ａｍｕより低いイオンを生成することが好ましい。これは、低分子量
標識の分子量を増加させることによって、または高分子量標識において電荷の数
を増加させることによって実施され得る。
【０２８２】 標識化部分に対してより固有の質量サインを提供するための代替的方法は、標
識中に安定な同位体を組み込ませることである（例えば、Ｇｙｇｉら、Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９９４−９９９（１９９９）を参照のこと
）。例えば、標識化部分に８つの重水素原子を組み込ませること、および変性お
よび非変性標識の５０：５０混合物でタンパク質を標識することによって、結果
として生じた標識を含むわずかに荷電したフラグメントは、等しい強度の二重線
（１つは、非変性標識を有する種に対応する質量において、そして他方は、８
ａｍｕの種を有する変性標識を有する種に対応する質量において）として、容易
に同定される。好ましい実施形態では、質量の差異は、単一電荷状態において、
約１〜約２０ ａｍｕである。最も好ましい実施形態では、質量の差異は、単一
電荷状態において、約４〜約１０ ａｍｕである。
【０２８３】 標識化部分により固有の質量サインを提供するための別の方法は、標識にアル
キルおよび／またはアリール置換基混合物を組み込み、その結果、フラグメント
ピークの対応するセットが、質量分析において容易に認識可能であることである
。例えば、タンパク質は、トリメチルアンモニウム基を含む標識と、そのトリメ
チルアンモニウム基の場所にジメチルエチルアンモニウム基を含む同じ標識との
混合物で標識され得る。この標識部分は、配列中の各アミノ酸についての２つの
フラグメントイオンピークを生じ、これは、互いに対して１４ ａｍｕ程度異な
る。多くのこのような組み合わせが誘導され得ることが、当業者に明らかである
。
【０２８４】 （検出増強成分） 本明細書中で使用される場合、検出増強成分は、質量分析、他の分光学的方法
（例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ、ＥＳＲ、ＮＭＲなど）またはシンチレーション計数に
よるタンパク質フラグメントの検出および定量を容易にする標識化部分の部分を
いう。従って、１つの群の実施形態において、検出増強成分は、質量分析法イオ
ン化チャンバーにおけるイオン化条件下において、荷電性（正または負）のイオ
ン種を提供し得、その結果、タンパク質のイオン化効率が改善される。多くの検
出増強成分について、存在するイオン化種の量は、タンパク質を可溶化するため
に使用される媒体に依存する。好ましい検出増強成分（すなわち、正電荷または
負電荷を生じ得る種）は、以下の２つのカテゴリーに分類され得る：１）「硬い
（ｈａｒｄ）」電荷を保有する成分、および２）「軟らかい（ｓｏｆｔ）」電荷
を保有する成分。
【０２８５】 「硬い」電荷を保有する成分は、媒体のｐＨに関わらず、すべての条件下にお
いて、イオン化される原子の配置である。「硬い」の正に荷電した検出増強成分
としては、テトラアルキルアンモニウム基またはテトラアリールアンモニウム基
、テトラアルキルホスホニウム基またはテトラアリールホスホニウム基、および
Ｎ−アルキル化またはＮ−アシル化されたヘテロシクリルおよびヘテロアリール
（例えば、ピリジニウム）基が挙げられるが、これらに限定されない。「硬い」
の負に荷電した検出成分としては、テトラアルキルボラート基またはテトラアシ
ルボラート基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８６】 「軟らかい」電荷を保有する成分は、それぞれ特定のｐＨ（すなわち、塩基お
よび酸）においてイオン化される原子の配置である。本発明の状況において、「
軟らかい」の正電荷としては、８より高い、好ましくは１０より高い、そして最
も好ましくは１２より高いｐＫａを有するそれらの塩基である。本発明の状況に
おいて、「軟らかい」の負電荷としては、４．５未満、そして好ましくは２未満
、そして最も好ましくは１未満のｐＫａを有するそれらの酸である。極度なｐＫ
ａでは、「軟らかい」電荷は、「硬い」電荷としての分類に近づく。「軟らかい
」の負に荷電した検出増強成分としては、１°、２°、および３°アルキルまた
はアリールアンモニウム基、置換および非置換ヘテロシクリルおよびヘテロアリ
ール（例えば、ピリジニウム）基、アルキルまたはアリールＳｃｈｉｆｆ塩基ま
たはイミン基およびグアニジノ基が挙げられるが、これらに限定されない。「軟
らかい」の負に荷電した検出増強成分としては、アルキルカルボキシレート基ま
たはアリールカルボキシレート基、アルキルスルホネート基またはアリールスル
ホネート基、およびアルキルホスホネート基またはアルキルホスフェート基、あ
るいはアリールホスホネート基またはアリールホスフェート基が挙げられるが、
これらに限定されない。
【０２８７】 「硬い」および「軟らかい」荷電基の両方について、当業者に理解されるよう
に、これらの基は、対立電荷の対イオンが付随する。例えば、種々の実施形態に
おいて、正に荷電した基の対イオンとしては、低級アルキル有機酸（例えば、ア
セテート）、ハロゲン化有機酸（例えば、トリフルオロ酢酸）、およびオルガノ
スルホネート（例えば、Ｎ−モルホリノエタンスルホネート）のオキシアニオン
が挙げられる。負に荷電した基の対イオンとしては、例えば、アンモニウムカチ
オン、アルキルアンモニウムカチオンもしくはアリールアンモニウムカチオン、
およびアルキルスルホニウムカチオンまたはアリールスルホニウムカチオンが挙
げられる。
【０２８８】 標識の検出増強成分はまた、複数荷電であり得るか、または複数荷電になり得
る。例えば、複数の負電荷を有する標識は、１以上のわずかに荷電した種（例え
ば、カルボキシレート）を組み込み得るか、またはこれは、１以上の複数荷電し
た種（例えば、ホスフェート）を組み込み得る。本発明のこの実施形態の代表的
な実施形態において、複数のカルボキシレートを保有する種（例えば、ポリアミ
ノカルボキシレートキレート剤（例えば、ＥＤＴＰ、ＤＴＰＡ）のような）を、
タンパク質に結合させる。タンパク質および他の種にポリアミノカルボキシレー
トを結合させる方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｍｅａｒｅｓら
、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｈｅｌａｔｅ−Ｔａｇｇ
ｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」、ＭＯＤＩＦＩ
ＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ、ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ
ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴＳ；Ｆｅｅｎｅｙら編
、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２、第３７０〜３８７頁；Ｋａｓｉｎａら、Ｂｉｏｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ９：１０８〜１１７（１９９８）；Ｓｏｎｇら、Ｂｉ
ｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ８：２４９−２５５（１９９７）を参照のこ
と。
【０２８９】 類似の様式において、複数の正電荷を有する標識が購入され得るか、または当
業者に利用可能な方法を使用して調製され得る。例えば、２つの正電荷を保有す
る標識化部分は、ジアミン（例えば、エチレンジアミン）から、迅速かつ容易に
調製され得る。代表的な合成経路において、ジアミンは、当該分野において公知
の方法を使用して一保護（ｍｏｎｏｐｒｏｔｅｃｔ）され、そして保護されてい
ないアミン部分が、引き続いて１以上の正電荷を保有する種（例えば、（２−ブ
ロモエチル）トリメチルアンモニウムブロミド）（Ａｌｄｒｉｃｈ））でジアル
キル化される。当該分野において認知されている方法を使用した脱保護は、少な
くとも２つの正電荷を保有する反応性標識化種を提供する。複数荷電した標識化
種に対する多くのこのような単純な合成経路が、当業者に明らかである。別の実
施形態では、質量分析法検出増強成分は、揮発性の非水性溶媒においてタンパク
質の溶解度を増加させる成分からなり得る。
【０２９０】 荷電した標識が好ましいものの、中性であるが「軟らかい」電荷を保有するタ
ンパク質残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸、また
はアスパラギン酸）に密接に近い成分を、検出増強成分として使用し得る。この
場合、標識は、イオン化された基もイオン化可能な基も保有せず、そして検出の
増強は、イオン化可能な残基を中和し、そして揮発性有機溶媒の量を増加させる
ことによって引き起こされるタンパク質の揮発度の増加によって提供される。こ
のような成分が固有のイオン質量を保有する場合、これはまた、近位のタンパク
質残基が電荷を保有する場合にタンパク質配列タグを生成するために供され得る
。本発明の状況において、密接に近いとは、タンパク質の標識された末端から約
４残基以内、そしてより好ましくは、タンパク質の標識された末端の約２残基以
内として規定される。例としては、フェニルイソチオシアネートおよびＮ−アセ
チル基が挙げられる。
【０２９１】 別の実施形態のグループでは、検出増強成分は、例えば、分光法（例えば、Ｕ
Ｖ／Ｖｉｓ、蛍光、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）など）、
またはシンチレーション計数（放射性同位体の検出）などによって検出され得る
検出可能部分である。タンパク質が、ＵＶ／Ｖｉｓによって検出される場合、タ
ンパク質に発色団標識（例えば、フェニル、ナフチルなど）を結合させることが
、一般に所望される。同様に、蛍光分光法による検出について、発蛍光団は、好
ましくは、タンパク質に結合される。ＥＳＲについて、検出可能部分は、遊離ラ
ジカル（例えば、窒素酸化物基を含む部分）であり得る。タンパク質がＮＭＲ法
によって検出される場合、検出可能部分は、ＮＭＲアクセス可能な核（例えば、
フッ素、13Ｃなど）を富化され得る。
【０２９２】 現在好ましい実施形態において、検出可能な部分は、蛍光団である。多くの反
応性蛍光標識は、例えば、ＳＩＧＭＡ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓ
ａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅ
ｎｅ、ＯＲ）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖ
ｅｌａｎｄ、ＯＨ）、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ
ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当業者に公
知の他の多数の市販の供給源から市販されている。さらに、当業者は、特定の適
用のために適切な蛍光団を選択する方法を認識し、そして市販で容易には入手可
能ではない場合には、必要な蛍光団をデノボで合成し得るか、または市販の蛍光
化合物を合成により改変して、所望の蛍光標識に到達する。
【０２９３】 特定の検出可能なタグのために適切な蛍光団を選択するための、文献において
利用可能な多数の実用的なガイダンスが、以下の参考文献により例示されるよう
に、存在する：Ｐｅｓｃｅら編、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳ
ＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｗｈ
ｉｔｅら、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣ
ＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１
９７０）；など。文献はまた、蛍光分子および色素分子、ならびにこれらの関連
する光学特性の、徹底的な列挙を提供する参考文献を含む（例えば、Ｂｅｒｌｍ
ａｎ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ
ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ、第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、ＣＯＬＯＵＲ
ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬ
ＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６）；Ｂｉｓ
ｈｏｐ編、ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒ
ｄ、１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳ
ＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２）Ｐｒｉｎｇｓｈｅ
ｉｍ、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ（
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９４
９）；などを参照のこと）。さらに、分子に付加され得る容易に利用可能な反応
性基を介する共有結合のために、このような分子を誘導体化するための広範なガ
イダンスが、文献に存在する。
【０２９４】 蛍光団を他の分子に結合体化させるために利用可能な化学の多様性および有用
性は、蛍光団で誘導体化された核酸の調製についての文献の広範な本文により、
例示される。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（前出）；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第
３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３５１，７６０号を参
照のこと。従って、適切な蛍光団を選択すること、およびタンパク質またはポリ
ペプチドに蛍光団を結合体化させることは、十分に当業者の能力内である。
【０２９５】 タンパク質に直接付着される蛍光団に加えて、蛍光団はまた、間接的な手段に
より付着され得る。例示的な実施形態において、リガンド分子（例えば、ビオチ
ン）が、好ましくは、タンパク質に共有結合される。次いで、このリガンドは、
別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合し、これが、固有に検出可能で
あるか、または上記の蛍光団のようなシグナル系に共有結合するかの、いずれか
である。結合する界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）で変性された
タンパク質（例えば、多次元キャピラリー電気泳動分離のＣＧＥ段階において分
離されたもの）についての改変において、検出は、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅTM色素
およびＳｙｐｒｏTM色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）のよ
うな界面活性剤結合蛍光団を介してタンパク質に非共有結合される、検出増強成
分を用いて、容易にされ得る。これらの化合物は、いくつかの望ましい性質を有
し、以下が挙げられる：１）結合における、従ってタンパク質定量における、優
れた再現性、２）タンパク質型に依存しない、結合の一般性、ならびに３）色素
が界面活性剤により被覆されたタンパク質に結合した場合のみの、蛍光挙動。本
発明において、独自の質量表示成分が、共有結合を介して、Ｎ末端またはＣ末端
において、タンパク質に別々に結合され得る。
【０２９６】 適切な蛍光化合物（または蛍光団）としては、フルオレセインおよびその誘導
体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられ
る。本発明の方法とともに使用する、現在好ましい蛍光団は、フルオレセインお
よびローダミン色素である。これらの化合物の多くの適切な形態が、これらのフ
ェニル部分に置換基を有して広範に市販されており、この置換基を、タンパク質
に蛍光団を付着させるための結合官能基として使用し得る。好ましい蛍光化合物
の別の群は、アミノ基をα位またはβ位に有する、ナフチルアミンである。この
ようなナフチルアミノ化合物のうちで、１−ジメチルアミノナフチル−５−スル
ホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジ
ニル−６−ナフタレンスルホネートが挙げられる。他の適切な蛍光団としては、
３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン（例えば、９−イソチオ
シアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ）；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキ
サゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレ
ンなどが挙げられる。
【０２９７】 有用な蛍光検出可能部分は、これらを当該分野において公知の任意の様式（例
えば、光または電気化学的エネルギーによるものが挙げられる）で励起すること
により、蛍光するようにされ得る（例えば、Ｋｕｌｍａｌａら、Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３８６：１（１９９９）を参照のこと）。蛍
光標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、蛍光標識は、
蛍光団を適切な波長の光で励起させ、そして生じる蛍光を検出することにより、
検出され得る。蛍光は、写真フィルムによって、電気検出器（例えば、電荷結合
要素（ＣＣＤ）または光電子増倍など）の使用により、視覚的に検出され得る。
【０２９８】 任意の分離技術とＭＳ配列決定法との間の処理工程が少ないほど、そのタンパ
ク質はより迅速に同定され得、そしてプロテオーム研究の費用がより低くなる。
代表的な電気泳動緩衝液（例えば、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒら、Ａｎａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．、１７３：４２４（１９８８）、およびＯ’Ｆａｒｒｅｌ、Ｊ
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５０：４００７（１９７５））は、質量分析計中での
タンパク質のイオン化を抑制する成分（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液およびドデシル硫酸ナトリウム）を含む。これらの成分は、Ｍ
Ｓにおけるイオン化を抑制しない、他のより揮発性の成分（例えば、モルホリノ
アルキルスルホネート緩衝液および一時的な界面活性剤）と置換され得る。別の
実施形態において、サンプルは、重炭酸アンモニウム緩衝液または酢酸アンモニ
ウム緩衝液で希釈されて、質量分析計のための揮発性プロトン表面を提供する。
Ｗｉｌｍ，Ｍ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６８：１−８（１９９６）。別の実
施形態において、緩衝液交換は、サンプルが分離プロセスの出口からＭＳの入口
へと移送されるにつれて、クロマトグラフィー透析または接線流れ透析により、
実施される。
【０２９９】 （反応性基） 標識部分の第三の成分は、Ｎ末端アミノ酸基、Ｃ末端アミノ酸基、またはＮ末
端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸の別の成分と反応性である、官能基である。
【０３００】 反応性官能基は、標識薬剤またはタグの任意の位置に位置し得る。例えば、反
応性基は、アリール核上、またはアリール核に付着した鎖（例えば、アルキル鎖
）上に、位置し得る。反応性基が、アリール核に係留されたアルキル鎖、または
置換アルキル鎖に付着される場合には、この反応性基は、好ましくは、アルキル
鎖の末端位置に位置する。本発明の実施において有用な反応性基および反応のク
ラスは、一般に、生結合体化学の分野において周知のものである。現在好ましい
反応のクラスは、比較的マイルドな条件下で、水性溶媒または混合された水性／
有機溶媒の媒体中で、進行するものである。
【０３０１】 タンパク質中の一級アミノ基（Ｎ末端を含む）を標的とする、特に好ましい化
学としては、例えば以下が挙げられる：アリールフルオリド（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ
．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３９：５０７（１９４５）；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，
Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ＮＹ、１９８４）；Ｎ
ｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ，Ａ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、２５：６０−９９（１９７２）；およびＨｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．Ｗ．ら、Ａｒｃｈ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１１１：２０９−２２２（１９６５）を
参照のこと）、スルホニルクロリド（Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：１２１−１３７（１９７２））、シアネート
（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５
：１０３−１２０（１９７２））、イソチオシアネート（Ｎｉａｌｌ，Ｈ．Ｄ．
：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７：９４２−１０１１（１
９７３））、イミドエステル（Ｇａｌｅｌｌａ，Ｇ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．、６０：７１−８０（１９８２））、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
エステル（Ｌｏｍａｎｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０４：２４
３−２６１（１９７６））、Ｏ−アシルイソウレア（Ｌｏｍａｎｔ，Ａ．Ｊ．ら
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１０４：２４３−２６１（１９７６））、クロロカ
ーボネートおよびカルボニルアジド（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａ
ｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１
９７６）、アルデヒド（Ｎｏｖｏｔｎｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６３：４０
８（１９９１）およびＮｏｖｏｔｎｙら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、
４９９：５７９（１９９０））ならびにアルキルハライドおよび活性化アルケン
（Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
、２０：４１９−４２５（１９９１））。
【０３０２】 タンパク質のカルボキシル基と反応する化学成分の好ましい例は、以下である
：ベンジルハライド（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６）；Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４１−３４７（１９８６
）；およびＨｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、２５：４６８（１９７２））、カルボジイミド（Ｙａｍａｄａ，Ｈ．ら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０：４８３６−４８４２））（特に、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドを使用して安定化される場合（Ｇｒａｂａｒｅｋ，Ｚ．ら、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１３１−１３５（１９９０）を参照のこと））、
ならびに無水物（Ｗｅｒｎｅｒら、「Ａ Ｎｅｗ Ｓｉｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎｉｎｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙでのポスター紹介を参照のこと）。カルボジイミド／Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドのアプローチは、Ｃ末端のアミノ酸残基とともにカ
ルボキシル含有アミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）を
標識すると、予測される。しかし、無水物のアプローチを独自に使用して、タン
パク質のカルボキシル残基とＣ末端カルボキシル基との間を区別し得る。これら
および他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮ
ＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ
ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
１９９６；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴ
ＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１
９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２に記載される。
【０３０３】 反応性官能基は、これらがタグを構築するために必要な反応に関与しないか、
またはこの反応を妨害しないように、選択され得る。あるいは、反応性官能基は
、保護基の存在により反応に関与することから保護され得る。当業者は、特定の
官能基を保護して反応条件の選択した設定を妨害しないようにする方法を、理解
する。有用な保護基の例としては、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩ
ＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１を参照のこと。
【０３０４】 種々の官能基は、適切な付着のための条件を参照して、以下に記載される。当
業者は、確立された化学プロトコルに従って、記載される基の各々がさらに改変
されて、独自のイオン質量表示成分および定量検出成分を組み込むことを、理解
する。
【０３０５】 わずかにアルカリ性（ｐＨ８〜９）の溶液中では、サンガー試薬（１−フルオ
ロ−２，４−ジニトロベンゼン）は、一級アミンにより求核攻撃を受けて、安定
な二級アリールアミンを形成する（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎ
ｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９
７６））。サンガー試薬はまた、リジン残基のε−アミノ基、ならびにヒスチジ
ン残基およびチロシン残基と、ｐＨ１０および４０℃で反応する（十分に規定さ
れたラグ相の後でさえも）（Ｈｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．Ｗ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１１１：２０９−２２２（１９６５））。還元的アミノ
化（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６））をまた使用して、アル
デヒドおよびケトンを使用して、アミンの置換の程度を増加させ得る（Ｎｏｖｏ
ｔｎｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６３：４０８（１９９１）；Ｎｏｖｏｔｎｙ
ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４９９：５７９（１９９０））が、水
溶液中では効率が減少する。
【０３０６】 ダンシルクロリドは、アルカリ性ｐＨで、タンパク質中のアミンにより同様の
求核攻撃を受け、芳香族スルホンアミドを生成する（Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：１２１−１３７（１９７２）
）。しかし、スルホニルクロリドはまた、ｐＨに依存して、二級アミンと反応し
得る（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６）。芳香族成分は、反応
生成物の蛍光検出を可能にする。ダンシルクロリドはまた、リジンのε−アミノ
基と反応する（Ｇｒａｙ，Ｗ．Ｒ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、２５：１２１−１３７（１９７２））。
【０３０７】 シアン酸カリウムもまた、アルカリ性ｐＨにおいて、タンパク質のアミノ基を
標識するために使用され得る。Ｓｔａｒｋら（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：１０３−１２０（１９７２））を
参照のこと。同様に、フェニルイソチオシアネート（Ｎｉａｌｌ，Ｈ．Ｄ．、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７：９４２−１０１１（１９７
３））を使用して、アルカリ性ｐＨにおいて、タンパク質のアミノ基を標識した
。シアネートはＮ末端アミドを形成し、そしてイソチオシアネートはチアミドを
形成する。イソチオシアネートはまた、タンパク質への蛍光標識の付着のために
、通常使用される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）；Ｈａｕｇｌ
ａｎｄ，Ｒ．Ｐ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏ
ｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ、１９９６））。
【０３０８】 イミドエステルは、タンパク質の架橋（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１
９９５）；Ｈａｒｔｍａｎ，Ｆ．Ｃ．およびＦ．Ｗｏｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、
６：２４３９−２４４８（１９６７））のため、およびタンパク質への蛍光団ま
たは他の部分の結合体化のために、広く使用される（Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ
．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ
、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、１９９６））。アルカリ性ｐＨ（８〜９）における、タ
ンパク質上の一級アミンによる、イミドエステルの求核攻撃は、アミジン結合の
形成をもたらす（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｄ．Ｔ．およびＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、６７：１２６−１３２（
１９７５））。Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルもまた、
アミド結合を介する、タンパク質架橋およびタンパク質への標識の付着のために
、通常使用される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）；Ｈａｕｇｌ
ａｎｄ，Ｒ．Ｐ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏ
ｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ、１９９６））。ＮＨＳエステルは、リジ
ンの一級ε−アミノ基（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｐ．およびＩ．Ｐａｒｉｋｈ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１：２２９１−２２９９（１９７２））、およびタンパ
ク質のＮ末端のα−アミノ基（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９５））
に対して優れた特異性で反応し、他のアミン含有残基をインタクトなままにする
。イミジルエステルの加水分解の速度は、ｐＨにより制御される（Ｈｅｒｍａｎ
ｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９５））。
【０３０９】 ベンジルクロロカーボネート、ベンジルクロロホルメート、およびｔ−ブトキ
シカルボニルアジドは、ポリペプチド合成反応において、反応性アミン基をブロ
ックするために、通常使用される（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎ
ｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９
７６）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４１−３４
７（１９８６））。いずれも、アルカリ性条件下室温で、非常に効率的な誘導体
化薬剤である。いずれの試薬も、類似の酸不安定なアミドエステルを生じる。
【０３１０】 リジンのε−アミノ基は、上記例の全てのうちで、優先的に標識される。なぜ
なら、隣接するカルボニル基に近いことは、α−アミノＮ末端基の求核性を減少
させるからである（Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９７６））。アル
ギニンおよびヒスチジンにおいて追加される、アミンの共鳴安定化は、これらの
残基の反応性をＮ末端のα−アミノ基より低くし、そしてこれらの残基は、正し
い反応条件下で有意に標識されるとは、予測されない。
【０３１１】 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３
２：３４１−３４７（１９８６））は、カルボン酸イオンによるベンジルクロリ
ドの求核置換（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．およびＤ．Ｅ．Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｊｒ
．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５：４６８（１９７２）
）を、自分の古典的な固相ペプチド合成法において、利用した。このベンジルハ
ライド反応は、ベンジルエステルを形成する。
【０３１２】 カルボジイミドは、カルボキシル基と反応して、Ｏ−アシルイソウレア中間体
を形成し、これは、水溶液中では非常に不安定であるが、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドの添加により安定化されて、酸安定な中間体の形成をもたらし得、これ
は、アルカリ条件下で一級アミンと反応されて、アミドを生成し得る（Ｇｒａｂ
ａｒｅｋ，Ｚ．およびＪ．Ｇｅｒｇｅｌｙ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５
：１３１−１３５（１９９０））。カルボキシル末端（グルタミン酸残基および
アスパラギン酸残基）は全て、酸性ｐＨ（４．５〜５）において、タンパク質の
カルボジイミドを標的化する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９５））
。カルボジイミド化学は、過剰の一級アミンがタンパク質溶液に添加されて架橋
反応を阻害する場合にタンパク質のＣ末端を標識するため、またはＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド中間体を介するアミン含有蛍光分子の使用を包含する２段階プ
ロセスにおいて、有用であり得る。
【０３１３】 塩基（例えば、２，６−ルチジン）の存在下で、無水酢酸［Ｄｕｐｏｎｔら、
ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ，ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｂｉｏ．ｃｏｍ］は、自由な溶液中でかまたは固体支持
体（例えば、ポリビニリデンフルオリド）に固定されてかのいずれかで、タンパ
ク質のカルボキシ基と反応して、混合した無水物を形成する。得られるＣ末端α
−アミノ無水物は、環化して、オキサゾロン中間体を形成し得る。グルタミン酸
残基およびアスパラギン酸残基から形成される混合無水物は、環化しない。Ｃ末
端オキサゾロンは、塩基性条件下での引き続く求核付加に対して抵抗性であるが
、他の無水物は、そうではない。従って、カルボキシ残基は、Ｃ末端の前に、選
択的に保護され得る。次いで、酸（例えば、ＴＦＡ）の添加によりｐＨを低下さ
せ、引き続いて、適切な検出増強成分および独自の質量表示成分を担持する一級
アミンまたは他の求核剤を添加することにより、Ｃ末端が標識され得る。しかし
、このアプローチは、Ｃ末端残基がプロリンである場合には、役に立たない。
【０３１４】 表１は、本発明の標識において有用な多数の標識部分の非限定的列挙を提供す
る。
【０３１５】
【表１】 当業者は、標識技術が、多数の標識部分について容易に利用可能であることを
理解する。Ｎ末端標識基（ダンシルクロリド）およびＣ末端標識基（カルボジイ
ミド）の例を、これらの使用のより完全な説明を参照して、本発明の例示として
提供する。これら２つの標識部分に焦点を当てることは、本発明の例示の明瞭化
のためであり、本発明の範囲を限定しない。
【０３１６】 ダンシルクロリドは、アルカリ性ｐＨにおいて、タンパク質中のアミンによる
求核攻撃を受け、芳香族スルホンアミドを生成する。しかし、スルホニルクロリ
ドはまた、ｐＨに依存して、二級アミンとも反応し得る。この芳香族構築物は、
反応生成物の分光学的（例えば、蛍光）検出を可能にする。ダンシルクロリドは
また、リジンのε−アミノ基と反応する。α−アミンとε−アミンとの間のｐＫ
の差を利用して、これらの基のうちの１つを他のものより優先的に改変し得る。
【０３１７】 カルボジイミドは、カルボキシル基と反応して、Ｏ−アシルイソウレア中間体
を形成し、これは、水溶液中で非常に不安定であるが、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドの添加により安定化されて、酸に対して安定な中間体の形成をもたらし得
、これは、一級アミンと反応されて、アミドを生成し得る。カルボキシル末端（
グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基）は全て、酸性ｐＨ（４．５〜５）
において、タンパク質のカルボジイミドを標的化する。カルボジイミド化学は、
タンパク質のＣ末端を標識するために、有用である。カルボジイミド化学を利用
する場合には、過剰のアミンがタンパク質溶液に添加されて、架橋反応を阻害す
ることが、一般に好ましい。別の例示的な実施形態において、タンパク質アミン
は、２工程プロセスで標識される；アミン含有蛍光分子が、タンパク質のＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド中間体またはタンパク質に付着されたスペーサーアーム
を介して、タンパク質に係留される。
【０３１８】 （合成） 一旦、反応性基、リンカー、およびイオン化可能基が選択されると、最終化合
物が、標準的な有機化学反応を利用して、当業者により合成される。本発明にお
いて使用するために好ましい化合物は、ＰＥＴＭＡ−ＰＩＴＣ、または類似の薬
剤である。この化合物は、カップリングにおいて、フェニルイソチオシアネート
の優れた特徴を維持する。さらに、この化合物は、分析方法における標識として
、良好に作用する。なぜなら、フェニル環の電子構造が、エチルリンカーにより
四級アンモニウム基から十分に分離され、従って四級アンモニウム基により妨害
されずにイソチオシアネートが反応することを可能にするからである。ＰＥＴＭ
Ａ−ＰＩＴＣ、Ｃ５ ＰＥＴＭＡ−ＰＩＴＣおよびＰＩＴＣ−３１１の調製は、
Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら、米国特許第５，５３４，４４０号（１９９６年７月９日
発行）に記載される。
【０３１９】 上記標識薬剤の基準を満足する、他の適切な市販の標識としては、スルホフェ
ニルイソチオシアネート、Ｎ−アミノプロピルピリジン（カルボジイミド化学を
介してＣ末端に付着される）、および図１〜３に示す種が挙げられる。図１およ
び２は、ＮＨＳ−エステル、イソチオシアネートおよびスルホニルクロリドの反
応性基を保有する、カチオン性およびアニオン性の蛍光Ｎ末端標識の例を示す。
例は、「かたい」および「やわらかい」正電荷（例えば、「かたい」電荷は、ジ
アルキルアンモニウム（ｉｍｍｏｎｉｕｍ）により表され、そして「やわらかい
」電荷は、アニリニウムにより表される）（図３０）ならびに「やわらかい」負
電荷（すなわち、スルホネートおよびカルボキシレート）（図３１）の両方を含
む。図３２は、カルボジイミドまたは無水物のアプローチによるＣ末端標識のた
めに使用され得る、一級アミノ基を保有する、カチオン性およびアニオン性の両
方の蛍光標識の例を示す。図１〜３の標識の全ては、２００以上のＭＷを有する
；従って、アミノ酸の一価に荷電したフラグメントの最小質量は、約２２９であ
り、これは、グリシンのａ−イオン（２９）と標識の重量（２００）との質量の
和である。アミノ酸の最大フラグメント（すなわち、トリプトファンのｙ−イオ
ン）は、約２０５の質量を有するので、示される全ての標識は、より高い質量の
、従って天然に存在するアミノ酸の質量とは独自に異なる質量の、最初の目的の
フラグメントを生成する。好ましい実施形態において、より高い分子量を有して
示される標識（例えば、ＭＷ＞５００のフルオレセイン誘導体）は、フラグメン
ト質量を少なくとも５００以上までシフトさせ、これは、擬似汚染およびマトリ
ックスのピークに占有される傾向のある、ＭＳにおける低ｍ／ｚ範囲を回避する
。
【０３２０】 （標識手順） 適切な標識部分を選択して、この標識をタンパク質に付着させるための条件は
、タンパク質のＮ末端またはＣ末端が均一に標識されること、ならびに標識され
たタンパク質が適切なＣＥ緩衝系およびＭＳ緩衝系に可溶なままであることを、
確実にするべきである。代表的に、標識は、変性条件下（例えば、界面活性剤ま
たは８Ｍ尿素）で実施される。界面活性剤および尿素の両方は、ＭＳイオン化を
抑制する。この方法の改変において、標識されたタンパク質の迅速な清掃および
適切なＭＳ緩衝液への移動を提供する技術もまた、使用されるべきである。この
方法の別の改変において、これらの改変剤は、標識後に実施される電気泳動分離
工程の間に、標識されたタンパク質から本来分離される。
【０３２１】 記載したように、電気泳動緩衝液中に存在するいくらかの塩（例えば、ＴＲＩ
ＳおよびＳＤＳ）ならびに尿素は、標識タンパク質のイオン化を抑制し得、そし
て配列分析を潜在的に混乱させる小さな質量／電荷のイオンを生成し得る。従っ
て、スピン透析手順を使用して、ＭＳ分析の前に、緩衝液系を迅速に交換し得る
。あるいは、脱塩カラム（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅにより販売されるＺｉｐ
ＴｉｐTMチップ）を、サンプルの清掃および緩衝液交換のために、使用し得る。
脱塩されたサンプルを、ＷｉｌｍおよびＭａｎｎにより記載されたように、最小
量のメタノールを添加した０．１Ｍ重炭酸アンモニウム中、またはＭａｒｋによ
り記載されたように、最小量のアセトニトリルを添加した０．０１Ｍ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（０．１％ギ酸を含む）に再懸濁させ得る（「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＳ／
ＭＳ」、ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ Ｓｅｍｉｎａｒ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｕｔｏ
ｍａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆ
ｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ（１９９
８年３月）に示される論文を参照のこと）。
【０３２２】 化合物のカップリング速度は、この化合物がポリペプチドの配列決定に適切で
あることを保障するように試験され得る。一般に、カップリング速度が速いほど
、化合物はより好ましい。５０℃〜７０℃にて２〜１０分の間のカップリング速
度が、特に好ましい。同様に、速い反応速度もまた好ましい。なぜなら、延長し
た時間にわたって反応混合物に曝すことにより、ペプチド結合を加水分解し得る
か、またはポリペプチド残基との役に立たないかつ再現性のない副反応を生じる
からである（これは、質量分析デコンボルーション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏ
ｎ）を複雑にし得る）。
【０３２３】 別の好ましい実施形態において、タンパク質混合物のうちの１以上の成分が、
標識がポリペプチドに結合される前に、固体支持体に可逆的に結合される。種々
の材料（例えば、多数の樹脂、膜または紙を含む）が、固体支持体として使用さ
れ得る。これらの支持体は、切断可能な官能基を取り込むようにさらに誘導体化
され得る。この目的のために使用され得る、多数の切断可能基としては、ジスル
フィド（−Ｓ−Ｓ−）、グリコール（−ＣＨ［ＯＨ］−ＣＨ［ＯＨ］−）、アゾ
（−Ｎ＝Ｎ−）、スルホン（−Ｓ［＝Ｏ］−）、およびエステル（−ＣＯＯ−）
の連結が挙げられる（Ｔａｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
９１：５８０（１９８３）を参照のこと）。特に好ましい支持体としては、Ｓｅ
ｑｕｅｌｏｎ ＴＭ（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇ
ｔｏｎ，Ｍａｓｓ）のような膜が挙げられる。これらの支持体の構築のための代
表的な材料としては、とりわけ、ポリスチレン、多孔性ガラス、ポリビニリジン
フルオリドおよびポリアクリルアミドが挙げられる。特に、ポリスチレン支持体
としては、とりわけ、（１）（２−アミノエチル）アミノメチルポリスチレン（
Ｌａｕｒｓｅｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８８：５３４４（１９９６）を
参照のこと）；（２）アリールアミノ基を有する、番号（１）と類似するポリス
チレン（Ｌａｕｒｓｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：８９（１９７１
）を参照のこと）；（３）アミノポリスチレン（Ｌａｕｒｓｅｎら、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．２１：６７（１９７２）を参照のこと）；および（４）トリエチレン
テトラミンポリスチレン（Ｈｏｒｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６：２８５（１
９７３）を参照のこと）が挙げられる。多孔性ガラス支持体としては、（１）３
−アミノプロピルガラス（Ｗａｃｈｔｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５：９７
（１９７３）を参照のこと）；および（２）Ｎ−（２−アミノエチル）−３−ア
ミノプロピルガラス（Ｂｒｉｄｇｅｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０：１５９（１
９７５）を参照のこと）が挙げられる。これらの誘導体化された多孔性ガラス支
持体のｐ−フェニレンジイソチオシアネートとの反応は、活性化されたイソチオ
シアネートガラスを生じる（Ｗａｃｈｔｅｒら（前出）を参照のこと）。ポリア
クリルアミドベースの支持体（架橋されたβ−アラニルヘキサメチレンジアミン
ポリジメチルアクリルアミド（Ａｔｈｅｒｔｏｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．６４
：１７３（１９７６）を参照のこと）およびＮ−アミノエチルポリアクリルアミ
ド（Ｃａｖａｄｏｒｅら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．６６：１５５（１９７６）を参
照のこと）を含む）もまた、有用である。
【０３２４】 当業者は、上記の固体支持体にポリペプチドをカップリングさせる適切な化学
を容易に利用する（一般には、ＭａｃｈｌｅｉｄｔおよびＷａｃｈｔｅｒ，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：［２９］Ｎｅｗ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ
ｉｎ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ２６３〜２７７（１
９７４）を参照のこと）。好ましい支持体およびカップリング方法としては、Ｅ
ＤＣカップリングを用いるアミノフェニルガラス繊維紙（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら
，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８７：５６〜６５（１９９０）を参照のこと）
；ＤＩＴＣガラス繊維（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６８６
０〜６８６７（１９８８）および膜ポリビニリジンフルオリド（ＰＶＤＦ）（Ｉ
ｍｍｕｂｉｌｏｎ Ｐ ＴＭ，Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒ
ｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ）、およびＳｅｑｕｅＮｅｔ ＴＭ化学（Ｐａｐｐｉ
ｎら，ＣＵＲＲＥＮＴ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＨＥＭＩ
ＳＴＲＹ，Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ Ｊ．（編）１９１〜２０２頁，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０）を参照のこと）の使用が
挙げられる。
【０３２５】 本発明の実施において、固体支持体へのポリペプチドの結合は、ポリペプチド
と固体支持体との間の共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用のいずれ
かによって生じ得る。固体支持体へのポリペプチドの非共有結合については、こ
の固体支持体は、ポリペプチドが非共有結合的相互作用によって固体支持体に結
合するように選択される。例えば、ガラス繊維固体支持体は、ポリペプチドを非
共有結合する固体支持体表面を提供するために、ポリブレン（ポリマー性４級ア
ンモニウム塩）（Ｔａｒｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４：６２２（１９
７８）を参照のこと）でコーティングされ得る。他の適切な吸着性固体相は、市
販されている。例えば、溶液中のポリペプチドは、合成ポリマー（例えば、ポリ
ビニリジンジフルオリド（ＰＶＤＦ，Ｉｍｍｕｏｂｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）またはカチオン性表面ででコーテ
ィングされたＰＶＤＦ（Ｉｍｍｕｂｉｌｏｎ ＣＤ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ．Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ））上に固定され得る。これらの支持体は、ポ
リブレンを用いて、または用いずに使用され得る。あるいは、ポリペプチドサン
プルは、電気ブロッティング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）と呼ばれるプ
ロセスによってポリアクリルアミドから直接的にポリペプチドを抽出することに
よって、配列決定のために調製され得る。電気ブロッティングプロセスは、溶液
中に存在し得る他のペプチドからのペプチドの単離を排除する。適切な電気ブロ
ッティング膜としては、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎおよびＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ＣＤ（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）が挙げられる。
【０３２６】 より最近、化学反応が非共有結合性疎水性相互作用によって固体支持体上に固
定されたポリペプチド上で実行されることを可能にする自動化方法が、開発され
ている。このアプローチにおいて、水性緩衝液中のサンプル（これは、塩および
変性剤を含み得る）は、固体支持体を含むカラムに圧力により充填される。次い
で、結合したポリペプチドは、妨害成分を取り除くために圧力によりリンスされ
、標識に直ちに使用できる結合したポリペプチドを残す（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａ
ｃｋａｒｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｂｒｏｃｈｕｒｅ ２３−５０９１−５１６８Ｅ
（１９９２年１１月）およびＨｏｒｎ，米国特許第５，９１８，２７３号（１９
９９年６月２９日）を参照のこと）。
【０３２７】 結合したポリペプチドは、ポリペプチドの末端アミノ酸と標識部分との間でカ
ップリングが生じるに十分な条件および時間で反応される。支持体の物理特性は
、特定の標識部分に対して反応条件を最適にするように選択され得る。例えば、
ＰＥＴＭＡ−ＰＩＴＣの強力な極性の性質は、ポリペプチドの共有結合に影響す
る。好ましくは、ポリペプチドのアミノ基とのカップリングは、例えば、有機塩
基（例えば、トリメチルアミンまたはＮ−エチルモルフィン）の存在下で、塩基
性条件下で生じる。好ましい実施形態において、この標識は、５％ Ｎ−エチル
モルフィンのメタノール：水（７５：２５ｖ／ｖ）の存在下で、結合したペプチ
ドと反応させられる。結合様式のために、過剰の試薬、カップリング塩基および
反応副生成物は、標識されたポリペプチドを取り出して、そして質量分析によっ
て配列決定する前に、非常に極性の洗浄溶媒によって除去される。種々の試薬（
例えば、メタノール、水、メタノールと水との混合液、またはアセトンを含む）
が、洗浄溶媒として適切である。
【０３２８】 より極性が低い試薬（例えば、ＰＩＴＣ−３１１）は、好ましくは、疎水性非
共有結合性相互作用によって固体支持体に結合したポリペプチドと反応され得る
。この場合において、より極性の低い洗浄液（例えば、ヘプタン、酢酸エチルお
よびクロロホルム）が、好ましい。洗浄サイクルの後に、標識されたポリペプチ
ドは、５０％〜８０％の水性メタノールまたはアセトンを含む溶媒での溶出によ
って固体支持体から分離される。
【０３２９】 標識反応が、完全に、溶液相で行われる場合、反応混合液は、好ましくは、精
製サイクル（例えば、透析、ゲル透過クロマトグラフィーなど）に供される。
【０３３０】 タンパク質を標識するためのなお他の条件は、例えば、Ｍｅａｎｓら，ＣＨＥ
ＭＩＣＡＬ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｈｏｌｄｅ
ｎ−Ｄａｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９７１；Ｆｅｅｎｅｙら，ＭＯＤ
ＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮ
ＡＬ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴＳ，Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，１９８巻，Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１
９８２；Ｆｅｅｎｅｙら，Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮ
Ｔ ＴＨＲＯＵＧＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ ＭＯＤ
ＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉ
ｅｓ，１６０巻，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９７７；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣ
ＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６に見出され得る。
【０３３１】 標識が、行われ得、そしてＰＳＴが、タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいず
れかから決定され得る。約５９〜９０％の真核生物タンパク質は、Ｎ末端がアシ
ル化されており（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，１９８４を参照のこと）、それによってＮ末端標識に抵
抗性である。しかし、このようなタンパク質の天然Ｎアセチル基は、時折、本発
明の目的のための標識として使用され得るが、Ｎ末端の４残基以内の１以上のア
ミノ酸のみが、イオン性であるか（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、
アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸残基である）、またはイオン性に誘導体
化され得る（例えば、チロシン、セリン、およびシステイン残基）。従って、Ｎ
末端もしくはＣ末端のいずれかを標識するストラテジーが、任意の所定のタンパ
ク質に対して最大の程度の配列決定能力を与えるように提供される。
【０３３２】 （標識されたタンパク質の配列決定） 別の局面において、本発明は、タンパク質混合物中の一部のタンパク質を配列
決定するための方法を提供する。この方法は、以下を含む： （ａ）タンパク質混合物と、Ｃ末端もしくはＮ末端標識部分とを接触させ、この
タンパク質のＣ末端もしくはＮ末端に標識を共有結合させて、そして標識された
タンパク質混合物を形成する工程； （ｂ）タンパク質混合物中の個々の標識されたタンパク質を分離する工程；およ
び （ｃ）質量分析方法によって工程（ｂ）からの標識されたタンパク質を分析して
、少なくとも２個のＣ末端残基もしくは２個のＮ末端残基の配列を決定する工程
。
【０３３３】 実施形態の１つの群において、この方法は、さらに以下を含む： （ｄ）遺伝子配列データのデータベースから推定タンパク質配列を検索するため
に、標識タンパク質の分離座標およびこの配列のタンパク質末端位置と組み合わ
せて、少なくとも２個のＣ末端残基もしくは２個のＮ末端残基の配列を使用する
ことによってタンパク質を同定する工程。
【０３３４】 （分離） 好ましい実施形態において、タグ化手順は、タンパク質の混合物において行わ
れる。タグ化手順の後に、タンパク質の混合物は、分離プロセスに供される。こ
の手順は、好ましくは、タンパク質混合物の個々の画分への分離を可能にする。
各画分は、好ましくは、実質的に、タンパク質混合物のうちの唯一の標識された
タンパク質に富む。
【０３３５】 本発明の方法は、ポリペプチドの配列を決定するために利用される。本発明の
好ましい実施形態において、このポリペプチドは、「実質的に純粋」である。こ
れは、このポリペプチドが約８０％均質、および好ましくは約９９％以上均質で
あることを意味する。当業者に周知の多くの方法が、そのアミノ酸配列を決定す
る前に、ポリペプチドを精製するために利用され得る。代表的な例としては、Ｈ
ＰＬＣ、逆相液体高速クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動、
クロマトグラフィー、または任意の多数のペプチド精製方法が挙げられる（一般
には、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹ
ＳＩＳとの表題の一連の巻を参照のこと）。キャピラリー電気泳動、および特に
、多次元キャピラリー電気泳動（例えば、同一人に譲渡された同時継続米国特許
出願第０９／５１３，４８６号（表題「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｖｉａ Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓ」（代理人書類番号０２０４４４−０００２００ＵＳおよび２０００年２月２
５日出願））に記載されるもの）の使用が、さらにより好ましい。
【０３３６】 実質的に純粋なポリペプチドは、本明細書中に記載される方法に好ましくは利
用されるが、ポリペプチド混合物の配列を決定することもまた可能である。簡潔
には、１つの実施形態において、混合物中のペプチドのうちの１つペプチドの観
察された質量に等しい算定された質量を有する、全てのハイポセティカル配列を
決定するために、アルゴリズムが利用される。Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １：１０８３〜１０９１（１９９２）を参照のこと。次い
で、このようなアルゴリズムを利用するペプチドのタンデム型質量スペクトルに
おいて、これらの配列の各々がこのフラグメントイオンを十分に説明する方法に
従う利益を、これらの配列に与え、この混合物内のポリペプチドの配列が、容易
に決定され得る。上記のように、本明細書中の方法は、健常な組織サンプルまた
は病んだ組織サンプル由来のタンパク質を同定するために特に有用である。実施
形態の１つの群において、この方法は、健常組織サンプル由来のタンパク質の混
合物および病んだ組織サンプル由来のタンパク質の混合物の両方に適用される。
従って、本発明のこの局面に使用されるタンパク質混合物は、本質的に任意の供
給源から入手され得る。組織サンプルからタンパク質を単離する方法は、周知で
ある。
【０３３７】 本発明において、誘導体化された末端アミノ酸を有するポリペプチドは、質量
分析器によって配列決定される。種々の質量分析器が、本発明において使用され
得る。代表的な例としては、三重極質量分析器（磁気セクター（ｍａｇｎｅｔｉ
ｃ ｓｅｃｔｏｒ）機器）（磁気タンデム型質量分析器，ＪＥＯＬ，Ｐｅａｂｏ
ｄｙ，Ｍａｓｓ）；イオンスプレー質量分析器（Ｂｒｕｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｃ
ｈｅｍ．５９：２６４２〜２６４７（１９８７）；電気スプレー質量分析器（Ｆ
ｅｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：６４〜７１（１９８９）；レーザー脱離飛
行時間型（ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ
）質量分析器（Ｋａｒａｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９〜２３０１
（１９８８））、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器（Ｅ
ｘｔｒｅｌ Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｍａｓｓ）が挙げられる。好
ましい実施形態において、電気スプレー質量分析器（ＭａｒｉｎｅｒTMモデル、
ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
）は、誘導体化された末端ポリペプチドをフラグメント化するために利用され、
そして５０ｐｐｍよりも良好な質量精度を備える飛行時間型検出器が、標識され
たフラグメントの質量から配列を決定するために使用される。
【０３３８】 当業者は、本発明の方法を使用して得られた配列情報が、タンパク質の可能性
のあるアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）数をなおさらに減少させる分析下
でタンパク質の他の特徴と組み合わされ得ることを理解する。従って、好ましい
実施形態において、本発明の方法は、タンパク質配列タグからの情報を、１以上
の他のタンパク質特徴と組み合わせて、タンパク質を同定する。配列データを補
充するに有用なデータとしては、アミノ酸組成、特定の残基（例えば、システイ
ン）の数および同一性、切断情報、タンパク質分解による（例えば、トリプシン
による）ペプチド質量およびまたは化学分解によるペプチド質量、細胞内位置、
ならびに分離座標（例えば、保持時間、ｐＩ、２−Ｄ電気泳動座標など）が挙げ
られるがこれらに限定されない。タンパク質を同定するために本発明のＰＳＴか
らの情報と組み合わされ得る、特定のタンパク質またはタンパク質のクラスに特
徴的な他の形態は、当業者に明らかである。特定のタンパク質に特徴的なデータ
の主体が、より包括的になるにつれ、分析下のタンパク質が、より短いタンパク
質配列タグを使用して同定され得る。
【０３３９】 従って、さらなる好ましい実施形態において、タンパク質の１以上の特徴に関
する情報は、約４個のアミノ酸の長さ、より好ましくは約３個のアミノ酸の長さ
、より好ましくはなお約２個のアミノ酸の長さのＰＳＴからの情報と組み合わさ
れ、 このタンパク質を同定するために使用される。 本発明の材料、方法およびデバイスは、以下の実施例によってさらに例示される
。これらの実施例は、本願発明を例示するために提供されるが、制限するために
提供されない。
【０３４０】 従って、さらに好ましい実施形態において、タンパク質の１以上の特徴に関す
る情報は、約４個のアミノ酸の長さ、より好ましくは約３個のアミノ酸の長さ、
より好ましくはなお約２個のアミノ酸の長さのＰＳＴからの情報と組み合わされ
、 このタンパク質を同定するために使用される。
【０３４１】 （Ｖ．代謝物プロファイリング（メトミクス（ｍｅｔｏｍｉｃｓ）） （総論） 本発明は、代謝分析を行うための方法および装置（目的の代謝物を精製するた
めの方法、特定の疾患と相関する代謝物を同定するスクリーニング方法、および
疾患を有する個体または疾患に対する感受性を有する個体を同定するための診断
スクリーニング方法を含む）を提供する。
【０３４２】 本発明の特定の方法は、連続して実行される複数の電気泳動方法を使用して種
々の代謝物を分離するための電気泳動方法を提供する。このような分離方法は、
種々の代謝分析を行うために利用され得る。例えば、本発明の特定の分析方法は
、安定な同位体で標識された基質を被験体に投与する工程を包含する。投与前の
この基質の同位体の組成および富化は、公知である。基質が利用されることを可
能にする時間を待った後に、サンプルは、被験体から抜き取られ、そして複数の
標的検体、基質を含む標的検体および／またはこの基質から形成された１以上の
標的代謝物の同位体組成を決定するために使用される。代表的には、サンプルは
、異なる時点で被験体から得られ、そして同位体の量が、各サンプル中の標的検
体について決定される。この様式において、この基質の同位体組成は、各標的被
験体についての流動値が決定されることを可能にする時間の関数として測定され
得る。種々の方法が、標的検体中の同位体の相対同位体量を決定するために利用
され得る。この方法としては、核磁気共鳴分析、赤外線分析および質量分析が挙
げられる。
【０３４３】 特定の代謝物の濃度に焦点を合わせる特定の他の方法とは異なり、本発明の特
定の方法は、単一の濃度値ではなく流動を決定するために設計される。これは、
この方法を単純化する。なぜなら、流動値は、絶対濃度値を決定することではな
く、標的検体中の同位体標識の相対量から決定され得るからである。さらに、流
動の決定は、簡単な濃度決定から観察され得ない特定の生物学的プロセスに対す
る洞察を提供する。例えば、濃度値は一定であるようであるが、流動は、実際に
は変化してい得る。任意の代謝物の濃度は、その代謝物の形成、変換、および輸
送に関与する全ての反応の速度によって決定される。従って、代謝物の形成およ
び除去（変換または輸送）の両方に関与する任意の２つの特定の反応（流動）に
おける増加は、この代謝物の同じみかけの濃度を生じ得る。流動は、多数の異な
る刺激に応答して変化され得、それによって特定の細胞状態の感度のよい指標と
して作用し得る。例えば、流動は、生理学的状態のような因子に、毒素および環
境的な侵襲に対して曝されることに、ならびに感染、癌、炎症および代謝におけ
る遺伝子ベースの欠損のような種々の疾患状態に応答して変化され得る。従って
、流動は、多様な細胞状態または他の方法によって必ずしも検出可能ではない状
態を検出するために使用される。
【０３４４】 本発明のいくつかの方法において、被験体から得られるサンプルは、検体中の
同位体の同位体量を決定する前に精製される。この精製手順は、目的の標的検体
由来の細胞中の他の成分を少なくとも部分的に除去するために使用される。代表
的には、これは、連続して行われる複数の電気泳動方法（すなわち、多次元）に
より、サンプル中の成分を分離することによって達成される。
【０３４５】 特定の方法は、本発明の電気泳動分離局面と、本発明の特定の質量分析技術と
を組み合わせる。このような処理は、比較的限定された数の標的検体を含むサン
プルが質量分析器に直接的に注入されて、目的の種々の標的検体における同位体
量を決定するように、比較的複雑なサンプルが、複雑性において十分に低減され
ることを可能にする。このようなシステムは、代謝サンプルのハイスループット
分析を可能にするために自動化され得る。
【０３４６】 種々の標的検体について決定された流動値は、種々の異なる適用に使用され得
る。例えば、種々の被験体についての、または種々の生理条件（例えば、病んで
いるか、または正常な）についての流動値が、データベースへの入力として直接
的に使用され得る。流動値はまた、種々のスクリーニング適用に用いられ得る。
例えば、試験被験体からの流動値は、疾患に対する潜在的マーカー（すなわち、
この疾患と相関するようである代謝物）を同定するために、病んだ被験体につい
て対応する流動値と比較され得る。流動値の群は、異なる細胞状態についての「
フィンガープリント」を開発するために使用され得る。一旦、疾患状態と１以上
の代謝物との間の相関性がなされると、試験被験体についての流動値は、異なる
疾患を有する個体についての流動値と比較され得る。試験被験体と病んでいる被
験体との間に統計学的に有意な差異がないことは、試験被験体が疾患を有するか
、または疾患に対する感受性があることを示す。代謝流動における変化は、代謝
分岐点にて単一の基質から生成される代替的な検体の相対量における変化として
、および単一の基質の連続的な変換から生じる検体が生成される速度として表さ
れる。
【０３４７】 （方法） （Ａ．概論） 組織、細胞集団または生物を供給することによって、同位体に富む基質および
細胞中の非同位体代謝物に対する同位体代謝物の経時的な比率を追跡して、細胞
性代謝の量的状況を生成し得る。相対的な代謝流動は、異なる同位体の相対量を
検出し得る種々の異なる検出器（例えば、質量分析）を使用して、任意の所定の
時間で、正常な検体に対する同位体に富む検体の量の比率を決定することによっ
て確認され得る。各々の代謝分岐点にて、分岐点の各々の側における非同位体生
成物に対する同位体生成物の相対的な比率は、代謝経路の各々の分岐に転じた代
謝物の流動の指標を提供する。パルス（ｐｕｌｓｅ）標識した培養物における直
線的な代謝経路に沿う同定可能な代謝物における同位体の比率の変化速度の追跡
は、この経路の各段階を介しての代謝物の流動の評価を提供する。代謝物は、ゆ
っくりとした反応速度段階の前に同位体に富むようになり、そしてこれらの段階
の直後では同位体を欠乏したままである。一旦、毒性チャレンジまたは感染によ
って誘導されるような細胞性代謝における特定の変化が、本明細書中に記載され
る技術を使用して同定されると、これらの代謝変化の特定の診断マーカーとして
使用され得る、同位体に富む化合物を合成し得る。ここでは，基質は、特定の疾
患状態に応答して代謝されるのみであるか、または代謝され得ない（例えば、米
国特許第４，８３０，０１０号；同第５，５４２，４１９号；６，０１０，８４
６号および同第５，９２４，９９５号を参照のこと）。
【０３４８】 （Ｂ．被験体への標識された基質の投与） （１．被験体の型） 本明細書中で使用される場合「被験体」とは、一般的には、代謝分析を行うた
めにサンプルが採取された、任意の生きている生物をいう。被験体としては、微
生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、カビおよび真菌）、動物（例えば、ウシ
、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコ）、ヒト上科（例えば、ヒト、チーパン
ジー、およびサル）ならびに植物が挙げられるがこれらに限定されない。この用
語は、トランスジェニック種およびクローン化種を含む。この用語はまた、調査
の下に代謝プロセスを行うために培養され得る細胞培養物または組織培養物を含
む。用語「患者」とは、ヒトおよび獣医学的被験体の両方をいう。
【０３４９】 被験体が細胞集団または細胞培養物である場合には、当該分野で公知の標準的
細胞培養系のいずれかが、使用され得る。適切な細胞型の例としては、哺乳動物
細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２およびＢａＦ
３細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、ならびに昆虫細胞（例えば、Ｓ
ｆ９）が挙げられるがこれらに限定されない。細胞培養に関するさらなる指針は
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲ
ＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に提供される。
【０３５０】 （２．基質の型） 本明細書中で使用される場合、用語「基質」は、化学種が被験体に投与される
状況において使用されるときには、目的の被験体によって代謝され得る任意の種
をいう。例示的な基質としては、タンパク質、糖質、アミノ酸、ヌクレオチド、
ヌクレオシド、核酸、脂肪、脂肪酸およびステロイドが挙げられるがこれらに限
定されない。「代謝物」とは、被験体に投与された基質の酵素による変換（この
変換は、被験体の代謝プロセスの一部として生じる）から誘導された生成物をい
う。「標的代謝物」は、分析における研究下の代謝物（例えば、流動値が決定さ
れるべきである代謝物）である。
【０３５１】 安定な同位体で標識された基質とは、対応する天然に存在する基質に見出され
る同位体とは有意に異なる安定な同位体の分布を有する基質をいう。用語、安定
な同位体とは、放射性ではない元素の同位体をいう。本発明の方法に代表的に使
用される同位体としては、13Ｃ、2Ｈ、15Ｎ、18Ｏおよび34Ｓが挙げられる。従
って、基質が13Ｃで標識される場合、この基質としては、炭素同位体の混合物（
ここで13Ｃ同位体は、その天然の量よりも大きな検出可能なレベルの量で基質中
に取り込まれている）が挙げられる。質量分析による13Ｃの検出については、こ
のレベルは、この基質に存在する全てのＣ原子のうち、２〜１００％、および好
ましくは１０〜１００％である（すなわち、この基質中の原子は、示される富化
パーセントを集合的に有する）。15Ｎで標識された基質については、検出可能な
レベルは、０．７５〜１００％の15Ｎ、およびより好ましくは４〜１００％の15 Ｎである。18Ｏで標識された基質については、検出可能なレベルは、０．４〜１
００％の18Ｏ、および好ましくは２〜１００％の18Ｏである。34Ｓで標識された
化合物については、検出可能なレベルは、８．４〜１００％の34Ｓ、および好ま
しくは４２〜１００％の34Ｓである。いくつかの場合には、この所望される量の
レベルは、同位体に富む基質と富んでいない基質とを混合することによって得ら
れる。
【０３５２】 （２．基質の量） 添加される基質の量は、いくつかの因子に依存して変更する。しかし、一般に
、基質は、安全および有効量で添加される。本明細書中で使用される場合、用語
「安全および有効量」は、基質の量が十分であり、その結果同位体存在量または
少なくとも、同位体存在量の比が、えり抜きの検出器を用いて決定され得るが、
基質は、過度の有害な副作用を引き起こすほどには高くない。従って、投与され
る量は、適切なリスク対利益比で釣り合うべきである。例えば、基質が13Ｃを用
いて標識される場合、次いで基質は、十分な量で患者に投与され、その結果、標
的分析物における13Ｃ／12Ｃの比が、決定され得る。しかし、投与される基質の
量は、望まない副作用（例えば、毒性、刺激またはアレルギー反応）を引き起こ
す量より少ない。この安全および有効量は、得られるサンプル（例えば、気体ま
たは液体および／または獲得部位）の性質および量、試験被験体の重量、および
基質における同位体の相対濃度のような因子に依存する。
【０３５３】 （３．投与の様式） 代表的に、既知の量の標識化基質および非標識化基質の両方の混合物が、被験
体に投与される。この混合物は、５〜９５％の間の標識化基質の相対存在量を含
み得る。より好ましくは、混合物は、２５〜７５％の間の標識化基質を含む。最
も好ましくは、この混合物は、約等モルの比の標識化基質および非標識化基質を
含む。
【０３５４】 特定の方法において、基質は、パルスとして被験体に投与される。パルス添加
またはパルス標識は、同位体的な標識化基質の調節された添加をいい、ここで、
同位体の相対的同位体存在量は公知である。長いパルスは、パルスの時間から開
始する、特定の生体分子の正味の合成比を見積もるのに使用され得る。この場合
、以前の生物体量は標識を含まず、しかし、新しい生物体量は、基質における標
識の同位体存在量に比例して、同位体を蓄積し始める。パルスの持続時間が、目
的の基質および標的分析物の代謝回転に比較して長い場合、正味の合成比が、測
定される。短いパルス（代謝回転率より有意に短い）は、分解および再循環の原
因とはならず、一方向の合成比の見積もりを提供する。
【０３５５】 基質が被験体に投与される様式は変更し得るが、基質が、適切な時間枠内で代
謝され得るような方法で投与されるべきである。基質は、実質的な純形態または
、組成物の一部として投与され得る。薬学的に受容可能な成分が、投与される基
質の代謝を妨げない限り、組成物としては、この薬学的に受容可能な成分を含み
得、この成分としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：希釈剤、乳
化剤、結合剤、潤滑剤、着色料、風味および甘味料。このような任意の成分の援
用における案内は、例えば、以下に記載される：Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｌ．Ｌ
ａｃｈｍａｎら、編）１９７６；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５）；およびＬ
ａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）（これ
らの各々が、その全体において、参考として援用される）。
【０３５６】 ある場合、基質は、固体形態（例えば、固体錠剤、カプセル、粉末、丸剤顆粒
）で、または液体溶液（例えば、乳剤、懸濁液）の一部として経口的に投与され
る。錠剤の形態に形成された場合、基質に対するキャリアとして、以下が使用さ
れ得る：賦形剤（例えば、ラクトース、スクロース、塩化ナトリウム、グルコー
ス、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、お
よびリン酸カリウム）；結合材（例えば、水、エタノール、プロパノール、単純
シロップ剤、グルコース溶液、デンプン溶液、ゼラチン溶液、カルボキシメチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびポリビ
ニルピロリドン）；崩壊薬（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
カルボキシメチルセルロースカルシウム、置換の程度が低いヒドロキシプロピル
セルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天粉末、ラミナラン（ｌ
ａｍｉｎａｒａｎ）粉末、重炭酸ナトリウム、および炭酸カルシウム）；界面活
性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナ
トリウム、およびステアリン酸モノグリセリド）；改変阻害剤（例えば、スクロ
ース、ステアリン、カカオバター、および硬化油）；吸着促進剤（例えば、第四
アンモニウム塩基、およびラウリル硫酸ナトリウム；湿潤剤（例えば、グリセリ
ンおよびデンプン）；吸着剤（例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベン
トナイト、およびコロイドケイ酸）；および潤滑剤（例えば、精製タルク、ステ
アラート、ホウ砂およびポリエチレングリコール）。さらに、錠剤が、通常の錠
剤コーティングに供された錠剤（例えば、シュガーコートされた錠剤、ゼラチン
コードされた錠剤、腸溶性錠剤、フィルムコートされた錠剤、または二重錠剤お
よび多層錠剤）に、必要に応じて形成され得る。
【０３５７】 ピルの形態に形成する場合、基質のキャリアとして、以下が使用され得る：賦
形剤（例えば、グルコース、ラクトース、デンプン、カカオバター、硬化植物油
、カオリン、およびタルク）；結合剤（例えば、アラビアゴム、トラガカント粉
末、ゼラチン、およびエタノール）；および崩壊薬（例えば、ラミナランおよび
寒天）。
【０３５８】 基質単独、または他の適切な成分と組み合わせて、エアゾル処方物にもまた作
製され（すなわち、それらは「噴霧」され得る）、吸入を介して投与され得る。
エアゾル処方物は、加圧された受容可能な噴霧体（例えば、ジクロロジフルオロ
メタン、プロパン、窒素）中に置き換えられ得る。
【０３５９】 直腸投与に適切な処方物としては、例えば、坐剤ベースと共に詰められた活性
成分からなる、坐剤が挙げられる。適切な坐剤ベースは、天然または合成トリグ
リセリド、アルカン、ポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール
、高級アルコールのエステル、ゼラチン、および半合成グリセリドが挙げられる
。さらに、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびアル
カンを含むベースと基質の組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用する
こともまた可能である。
【０３６０】 非経口投与（例えば、関節内（連結部（ｊｏｉｎｔ）中の）経路、静脈内経路
、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、および皮下経路によるような）に適切な
基質の処方物としては、水性溶液および非水性溶液、等張性滅菌注射溶液（これ
は、抗酸化薬、緩衝液、静菌薬、および意図された受容者の血液と等張な処方物
を与える溶質を含み得る）、ならびに水性懸濁液および非水性懸濁液（懸濁剤、
溶解剤、増粘剤、安定薬、および保存薬を含み得る）が挙げられる。本発明の実
施において、組成物は、例えば、静脈内注入、、経口的に、局所的に、腹腔内に
、膀胱内に、または髄腔内により、投与され得る。組成物が、滅菌状態で、実質
的に等張として、そして、米国医薬品局の優良製造規則（ＧＭＰ）の規定に全て
従って処方される。
【０３６１】 基質が細胞集合に投与される場合、細胞は、代表的には、等張で、富化された
基質を含む混合物中に懸濁される。混合物は、代表的には水性溶液であり、そし
て他の栄養素もまた含み得る。細胞の数に依存して、細胞が、例えば、標準培地
フラスコ中またはマイクロタイタープレートのウェル内に懸濁され得る。
【０３６２】 （Ｂ．サンプルコレクション） （１．サンプルソースおよび型） 上記のように、本発明の方法は、本質的に、任意の生きている生物体における
代謝を分析するために使用され得る。サンプルは、組織または組織ホモジネート
、生物体または細胞または細胞培養物の液体に由来し得る。一般に、サンプルは
、生物体の体液から得られ得る。このような液体としては、以下にが挙げられる
が、これらに限定されない：全血、血漿、血清、精液、唾液、尿、汗、髄液、唾
液、消化液、汗、脳脊髄液、および涙液。ある場合、サンプルは、糞便物質（ｆ
ｅｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）、頬、皮膚、組織生検、または検死および髪から
得れられる。サンプルはまた、エキソビボ細胞培養物（増殖培地、組換え細胞お
よび細胞成分を含む）に由来し得る。潜在的薬物または薬物標的（以下を参照の
こと）を同定するための比較研究において、あるサンプルは、病気の被験体また
は細胞から得られ得、そして別のサンプルは、例えば、病気でない被験体または
病気でない細胞から得られ得る。
【０３６３】 （２．収集選択） ある方法は、被験体から血液のサンプルを回収する工程を包含する。全血が使
用される場合、サンプルは代表的には、当業者に公知の任意の方法（例えば、サ
ンプルの凍結／解凍を含む）により、溶解される。尿は、清潔な容器中に被験体
の尿を採取することにより採取され得る。ある場合、サンプルは、固体の呼吸か
ら得られる（例えば、標的代謝産物が二酸化炭素である場合）。種々の異なるデ
バイスおよび方法が、呼吸サンプルを採取するために開発された。例えば、被験
体の呼吸が、被験体に伸び得る収集バッグ（例えば、バルーン）を膨らまさせる
ことにより捕捉され得る。次いで、サンプルが、後の貯蔵および／または輸送の
ために、市販の貯蔵容器に移され得る（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓ
ｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙにより製造されたＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ）。他の呼吸収集
デバイスは、米国特許第５，９２４，９９５号および同第５，１４０，９９３号
に記載される（これらは、その全体が参考として援用される）。組織サンプルが
、生検により得られ得る。
【０３６４】 細胞培養または組織培養の場合、細胞は、遠心分離または濾過により収集され
、次いで、標準的なプロトコルに従って（例えば、音波破砕、ブレンディング、
加圧、凍結融解および変性）、溶解される。あるいは、細胞が収集され得、そし
て三塩化酢酸の添加（５〜１０％重量／容積の最終濃度まで）、または他の膜溶
解溶媒（例えば、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、アセトン、およ
びエタノール）の類似の使用により溶解され得る。このような膜溶解溶媒が使用
され、膜分子成分を沈殿させ得、そして後の電気泳動分離技術に対する前駆体と
しての小分子代謝産物を選択的に可溶化し得る。
【０３６５】 （Ｃ．標的分析物分離） （１．予備精製） サンプルの複雑性（すなわち、サンプル内の成分の数および異なる型）に依存
して、標的分析物（すなわち、基質および／または標的代謝産物）が、サンプル
内の他の成分から、最初少なくとも部分的に精製される。サンプルが、細胞の破
片または分離を妨げ得る他の物質を含む場合、このような物質は、種々の公知の
分離技術（例えば、サンプルを、強制的にふるい材料に通す、濾過、遠心分離（
例えば、密度勾配遠心分離）、および種々のクロマトグラフィー方法（例えば、
ゲル濾過、イオン交換または親和性クロマトグラフィー））のいずれかを使用し
て除去され得る。
【０３６６】 多くの高分子（例えば、タンパク質および核酸）は、細胞を溶解し、そして冷
トリクロロ酢酸（例えば、氷上に３０分間、５〜１０％ＴＣＡ重量／容積）を用
いて溶解された細胞を処理することにより高分子を定量的に沈殿することによっ
て、小分子（例えば、ヌクレオチド、アセチルＣｏＡ、単糖類および二糖類、ア
ミノ酸）から分離され得るが、細胞中の小分子のほとんどが、可溶性のままであ
る。さらなる分離方法が、例えば、ＨａｎｓｏｎおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（Ｈａ
ｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ａ．、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｒ
ｈａｒｄｔら（編）、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂａｉｏｌ．、Ｗａｓｈｉｎｇ
ｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．頁３２８（１９８１））により、議論される。
【０３６７】 （２．多次元電気泳動） 一旦、このような最初の精製工程が完了されると（必要な場合）、標的分析物
が、連続して実施される複数の電気泳動方法を実施することにより、代表的にさ
らに精製される。最適な実施について、イオン強度が特に高いサンプルが、電気
泳動方法を実施する前に、確立された技術（例えば、透析、希釈および再集権化
（ｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））を用いて、脱塩化され得る。この方法は
、連続して実施されると言われる。なぜなら、各方法において電気泳動されるサ
ンプルは、最初の電気泳動方法において電気泳動されるサンプルは例外として、
先行する方法において電気泳動された成分を含む溶液または画分にお由来するか
らである。異なる電気泳動方法の各々が、「次元」とみなされる。従って、この
連続は、「多次元」分離を構成する。
【０３６８】 一連の電気泳動方法が、この一連の各電気泳動方法のために注入されたサンプ
ルの成分が単離されるかまたは物理的に、時間的にもしくは空間的に分解される
ような方法において代表的に実施され、複数の画分を形成し、この画分の各々は
、サンプル中に含まれる成分の１つのサブセットのみを含む。従って、画分は、
電気泳動に供されるサンプルの他の成分から、物理的に、時間的にまたは空間的
に分解される成分または成分の混合物を含む溶液をいう。それゆえに、分解され
た成分は、電気泳動方法の間に、他の成分から分離された、単一の成分または成
分の混合物をいい得る。少し注釈をつける場合、種々の電気泳動方法におけるサ
ンプルは、最初の電気泳動方法（これにおけるサンプルは、分離されるべき全て
の成分を含む本来のサンプルである）は例外として、このような画分から得られ
る。
【０３６９】 代表的には、一連のこれらの複数の電気泳動方法は、異なる特性に従って成分
を分離する。例えば、ある方法は、等張点に基づいて成分を分離し得（例えば、
キャピラリー等電点電気泳動）、他の方法は、任意の所定のｐＨで、それらの内
因性または誘導性（特定のイオン化群に対する標識の適用を通じ）の荷電対質量
比に基づいて成分を分離し得るが（例えば、キャピラリーゾーン電気泳動）、一
方、他の方法は、 成分のサイズに従って分離する（例えば、キャピラリーゲル
電気泳動）。
【０３７０】 種々の電気泳動方法を実施するために使用される装置は、当該分野で公知であ
る。しかし、一般に、そして図２Ａにおいて示されるように、本発明の特定の方
法において利用される代表的なキャピラリー電気泳動系の基本的な構成は、２つ
の末端１０、１２を有するキャピラリー８を含む。一方の末端１０は、アノード
リザーバー１８に含まれるアノード溶液すなわちアノード液（ａｎｏｌｙｔｅ）
１４と接触し、そしてもう一方の末端１２は、カソードリザーバー２０において
カソード溶液すなわちカソード液（ｃａｔｈｏｌｙｔｅ）１６と接触する。１つ
の電極（アノード）２２は、アノード溶液１４と電気的連絡をとるように位置さ
れ、そして第二の電極２４は、カソード溶液１６と電気的連絡をとるように位置
される。キャピラリー８のキャビティー２６は、電気泳動媒体で満たされ、これ
はある場合、ポリマーマトリックスを含み得る。本明細書中で使用される場合、
用語アノードは、正に荷電した電極をいう。従って、負に荷電した種は、アノー
ドに向かって、電気泳動媒体を介して移動する。用語カソードは、負に荷電した
電極をいい；正に荷電した種は、この電極に向かって移動する。アノード液は、
アノードが浸された溶液であり、そしてカソード液は、カソードが浸された溶液
である。
【０３７１】 サンプルは、入口２８を介してキャピラリー８中に導入され、そしてそこで成
分が、電源３２によって２つの電極２２、２４との間に電界が印加されると分解
され、そしてこの成分が、分離キャビティー２６内に含まれる電気泳動媒体内で
分離する。成分は、電気浸透流のような種々のパラメーターを制御することによ
り（以下を参照のこと）、および／またはリザーバー溶液の１つまたは両方の成
分を変化させる（例えば、ｐＨまたは塩濃度を調整する）ことにより、出口３０
を介してキャピラリーから制御可能に溶出され得る。代表的には、入口２８およ
び出口３０は、サンプル、アノード液またはカソード液を含む容器中に、容易に
挿入が可能なように形成されたキャピラリーの単純な部分である。
【０３７２】 電気泳動が本発明の方法において実施される電気泳動デバイスに関連して使用
される場合の用語「キャピラリー」は、利便性のために使用される。この用語は
、電気泳動が実施されるキャビティーまたはデバイスの特定の形を制限するため
に解釈されるべきでない。特に、キャビティーは、形が円筒形である必要はない
。任意の電気泳動方法に関して、本明細書中で使用されるような、用語「キャピ
ラリー」は、少なくとも一組の対向面との間の内部寸法が、およそ２〜１０００
ミクロンであり、より代表的には、２５〜２５０ミクロンである他の形を含む。
本発明の特定の方法において使用され得る非環状配置の例は、Ｈｅｌｅ−Ｓｈａ
ｗフローセル（ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ）である（例えば、米国特許第５，１３３，
８４４号；およびＧｕｐｔａ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆ
ａｃｅ Ｓｃｉ．２２２：１０７−１１６（２０００）を参照のこと）。さらに
、キャピラリーは、線状である必要はなく；ある場合、キャピラリーは、例えば
、らせん状の構成で巻かれる。
【０３７３】 本発明の特定の方法を用いて利用される系の例は、図１に例示される。この特
定の例は、３つの電気泳動方法（最初、中間および最終方法）が関連する系を示
す。本発明の方法は、一般に、少なくとも２つの電気泳動方法を含むが、実施さ
れる電気泳動方法の特定の数は変更し得る。最も代表的には、この方法は、２つ
または３つの電気泳動分離方法を利用する。
【０３７４】 図１に示され得るように、複数の成分を含む最初のサンプルは、サンプル容器
５０から当該分野で公知の多数の方法のいずれかを利用して、サンプル入口５２
を介して、第一のキャピラリー５４の第一の分離キャビティー中に導入される。
適切な方法の例としては、真空下でサンプル入口５２中にサンプルを引く工程（
例えば、サンプル出口において、真空を引くことにより）または、サンプル容器
５０に加圧することによりサンプル入口５２にサンプルを押す工程が挙げられる
。動電学的注入としばしばいわれる電気移動法は、別の選択である。一旦、最初
のサンプルがサンプル入口５２に導入されると、次いでサンプルは、第一のキャ
ピラリー５４内の第一の分離キャビティー内に電気泳動される。第一の分離キャ
ビティーは、最初のサンプル中の成分が少なくとも部分的に分解さえる所望の電
気泳動媒体を含む。他の回収部位が利用され得る（以下を参照のこと）が、分解
成分を含む電気泳動媒体は、第一のキャビティーから回収される（代表的には、
サンプルが導入される末端に対向する分離キャビティーの末端から外へ）。回収
された媒体は、出口５６を通って移動し、そして複数の画分として、分離容器５
８に回収される。図１Ｂで示されるように、画分が回収される容器５８は、代表
的に、規定された画分（例えば、特定の容量の画分または選択されたｐＨ範囲を
含むこと）を回収するための一組の容器５８を自動的に進行させることが可能な
画分回収デバイス（６０で示される部分）と関連される。
【０３７５】 次いで、第一の電気泳動方法から回収された画分由来のサンプルが、第２のサ
ンプル入口を介して、前出の記載されたような技術を再度利用して、複数の容器
５８の１つから回収される。次いで、画分からのサンプルの成分は、中間電気泳
動方法を実施することによりさらに分解され得る（図１において示される例にお
ける、第２の電気泳動方法）。サンプルが、入口６２を介して、第２のキャピラ
リー６４中に導入され、そしてサンプル内の成分は、さらに第２のキャピラリー
６４の第２の分離キャビティーに内に含まれる電気泳動媒体内で分離し、次いで
、出口６６を介してキャビティーから溶出する。第一の電気泳動分離と同様に、
分解または部分的に分解された成分を含む電気泳動媒体が、代表的に、第２の画
分回収デバイス（７０で示される部分）により整列され、そして前進された容器
６８内に、分離画分として収集される。
【０３７６】 第２／中間方法と類似のプロセスが、最終電気泳動方法（図１において示され
る第３の電気泳動分離方法）の間、実施される。サンプルが、先行の方法の間に
得られる画分を含む容器６８から入口７２を介して引かれ、そして適用されたサ
ンプルに含まれる成分が、電気泳動によりさらに分離される第３の電気泳動媒体
を含む第３のキャピラリー７４の第３または最終電気泳動キャビティーに導入さ
れる。さらに単離されたタンパク質を含む、第３の電気泳動媒体が、引き続き出
口７６を通して回収される。
【０３７７】 上記のように、図１において示される３つより多い電気泳動方法が、実施され
得る。このような方法は、本質的に、第２／中間電気泳動分離について、上記の
一般的工程を１回以上繰り返すことを含む。
【０３７８】 最終的電気泳動分離後、分解された成分を分析するための種々の異なる選択が
、利用可能である。図１に示されるように、回収される電気泳動媒体は、最後の
キャピラリー７４の分離キャビティーと液体連絡して、任意の検出器７８を通過
して、分解された成分（例えば、標識化タンパク質）を検出し得る。検出器７８
または検出器（示されていない）からのシグナルを受けることが可能な、任意の
、量を定めるデバイスが、電気泳動媒体の特定の部分または画分内の成分の量を
定量化するために使用され得る。検出器はまた、同様に、他のカラムの後の分離
の進行をモニターするために使用され得る。
【０３７９】 画分が、最終キャピラリー７４または検出器７８を終えた電気泳動媒体から採
取され、そして分析器８２により分析され、画分内の成分の分子量を決定する。
特に、分析器が、標的分析物における富化された同位体の存在量を決定するため
に使用され得る。下記のように、種々の分析器および技術が、この決定をするた
めに利用され得る。例えば、分析器８２は、質量分析計または赤外分光計であり
得る。質量分析データは、例えば、画分内の種々の成分の質量を決定するために
利用され得る。標識化分析物および非標識分析物の比は、質量分析において標識
化標的分析物または非標識化標的分析物についての相対シグナル強度から決定さ
れ得る。
【０３８０】 分離キャビティーから分解された成分を回収するのに利用される特定の溶出条
件は、実施される電気泳動方法の型に依存し、そして本発明において代表的に利
用される電気泳動方法の各々について、以下でより十分に記載される。しかし、
一般に、一旦成分が分離キャビティー内に分解されると、キャビティー内の条件
が、キャビティーからの成分の選択的または制御された溶出を達成するのに必要
なように（または選択された最初の条件のように）調整される。例えば、溶出は
、塩をアノード溶液またはカソード溶液に添加するか、またはそれらの溶液のｐ
Ｈを調整することにより、電気浸透流を調節することにより、流体力学上の圧力
または前述の組み合わせを適用することにより達成され得る。
【０３８１】 本発明の方法を用いて、分解された成分が、物理的に（例えば、図１に例示さ
れるような異なる容器中へ配置）、空間的に（例えば、分離キャビティーに含ま
れる電気泳動媒体全体に広がる）および／または時間的に（例えば、溶出を制御
して、サンプル内の非常に異なる成分が、異なる時間において、キャピラリーか
ら溶出する）単離され得る。従って、本発明の方法は、溶出緩衝液および／また
は溶出時間の構成の関数として、成分の混合物を分離し得る。この方法は、成分
の空間的な分離に制限されず、特定の伝統的なゲル電気泳動系（例えば、タンパ
ク質分離のための２−Ｄゲル電気泳動系または核酸分離のためのパルス化電界（
ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ）および連続（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ゲル系）、ま
たは２次元薄層クロマトグラフィー（２−Ｄ ＴＬＣ）方法（小分子代謝産物分
離のため）である。代わりに、制御された溶出により、画分が制御され、画分内
の成分が、例えば、等電点および電気泳動の代謝産物の範囲内におちる。成分の
制御された溶出は、方法が、再現可能な様式において実施され得ることを意味す
る。このような再現性は、例えば、比較研究および診断上の適用において重要で
ある。
【０３８２】 分離成分の溶出または回収の間、一般に、分離された成分を含む電気泳動媒体
の一部分のみが、代表的に、任意の所定の画分において収集される。これは、全
ての分離された成分（例えば、タンパク質）を含むゲルが、分離キャビティーか
ら押し出され、そして全ての成分を含む押し出されたゲルが、別の電気泳動分離
を実施するために使用される特定の二次元方法と対照をなす。これはまた、全て
の代謝産物が、１つの溶媒系を用いた系列におけるマトリックスについての、そ
の代謝産物の相対親和性により分離され、そして第一の溶媒系の流れの方向に垂
直に適用される第二の溶媒系により変更された親和性に基づいて表される。
【０３８３】 次いで、１つの電気泳動方法の結論で得られた、空間的、物理的、または時間
的に分離された成分は、引き続く電気泳動方法の間の画分中に含まれる成分のさ
らなる分離のためのサンプルの供給源として使用される。図１に例示されるよう
に、異なる分離された代表的なサンプルは、同じキャピラリー上で連続して電気
泳動される。通常、先行するサンプル中の成分が十分に分離キャビティーから引
き出されるまで、別のサンプルは適用されない。その結果、異なる画分中に含ま
れる成分の重複は存在しない。同じカラムを通しての画分の連続的な溶出は、特
定のスラブゲル電気泳動方法において問題を生じ得る架橋または電場の違いから
生じる変化を有意に減少および除去し得る。従って、連続的分離は、本発明の方
法の再現性をさらに増強し得る。しかし、他の方法は、並行様式で実行され得、
ここでは、異なる画分からのサンプルは、分離キャピラリー上で電気泳動される
。このアプローチは、分離がより迅速に完了することを可能にする。しかし、複
数のキャピラリーの使用は、分離条件の可変性を増大させ得、それによって、異
なるサンプル間のある程度の再現性を減少させる。
【０３８４】 特定の方法において、類似の成分を含むプールが得られるような電気泳動方法
が実行される。例えば、最初のまたは最初の数回の電気泳動方法の後に、主とし
て関連する成分（例えば、主にタンパク質、ポリサッカリド、核酸、アミノ酸、
ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴサッカリド、リン酸化モノ−またはオリゴ
サッカリド、脂肪、脂肪酸、または有機酸）を含む少なくとも１つのプールが得
られるように、電気泳動条件は制御され得る。関連する成分のプールは、細胞中
の成分の異なるクラスの区別可能な特徴でキャピラリー分離することによって得
られ得る。例えば、いくつかの成分のクラスは、主として、一価で荷電している
（例えば、リン酸化モノ−またはオリゴサッカリド）が、他は主として双生イオ
ン性である（例えば、アミノ酸、タンパク質、ヌクレオチド、およびいくつかの
脂肪）。ＣＩＥＦは、異なる双生イオン成分を分離するために使用され得、そし
てまた、双生イオン種を非双生イオンから分離するために使用され得る。大きな
成分（例えば、タンパク質）は、ＣＧＥを用いて、より小さな成分（例えば、ア
ミノ酸、モノ−およびジサッカリド、ならびにヌクレオシド）から分離され得る
。ｐＨおよび緩衝液条件の慎重な選択を通して、種々の成分上の電荷を制御し得
、そしてＣＺＥによって、異なる電荷対分子量を有する成分の分離をもたらし得
る。例えば、特定の成分と選択的に複合体形成する特定の緩衝液が、選択された
成分に所望の電荷を導入するために利用され得る。このような緩衝液の例は、ホ
ウ酸緩衝液であり、これは、使用されて炭水化物に複合体形成し得、それによっ
て、サンプル中に存在する炭水化物に負電荷を付与する。電気泳動方法に関する
さらなる詳細は以下に示される。
【０３８５】 電気泳動条件を制御して、最初に、複合体混合物を成分のクラスのプールに分
離することによって、分析を顕著に単純化させ得る。例えば、目的の代謝産物が
炭水化物であった場合、炭水化物のプールが得られるように条件を適切に制御す
ること（例えば、ホウ酸緩衝液を使用すること）によって、化合物の他のクラス
を含む画分を無視し得る。従って、引き続く電気泳動による分離は、目的のプー
ルからのサンプルを用いて単純に行われ得る。あるいは、類似の化合物のプール
が十分に小さい場合、プールの個々の成分は、電気泳動による分離後に、質量ス
ペクトル分析手段によって完全に分離され得る。同様に、一旦特定の代謝産物に
対する条件が確立したならば、種々の電気泳動方法から得られたすべての画分を
分析する必要はない。この方法の再現性によって、目的の標的分析物を含むこと
が以前に確立された画分に隣接して得られたいくつかの画分からのみ、サンプル
をとることが可能になる。それにも関わらず、特定の方法が自動化され得るので
、最初のスクリーニング試験の間でさえ、例えば、すべての最終画分を迅速に分
析し得る、目的の分子量フラグメントについてのシグナルを同定するために質量
スペクトルをスキャンすることさえ、コンピュータープログラムの使用を通して
自動化されて、分析をスピードアップし得る。
【０３８６】 （Ｄ．定義） 一旦標的分析物がサンプル中の他の分子から少なくとも部分精製されたならば
、代謝されていない基質および／または標的分析物中の同位体の相対量が決定さ
れる。代表的には、これは、より豊富な同位体に対する、富化された同位体の比
（例えば、12Ｃ／l3Ｃ、l4Ｎ／Ｉ５Ｎ、16Ｏ／18Ｏ、および34Ｓ／32Ｓ）を決定
する工程を包含するが、他の量の測定もまた決定され得る。
【０３８７】 富化された安定な同位体の濃度の測定は、種々のオプションに従ってなされ得
る。１つのアプローチは、質量スペクトル分析によって同位体レベルの相対的な
量を決定することである。標的分析物は、基質の分子量対電荷比に従って、質量
スペクトルにおいて別個のシグナルを生成する。存在する異なる同位体型につい
てのこの相対的なシグナル強度は、サンプル中の分析物の絶対的な濃度に関わら
ず、各標的分析物の異なる同位体型の相対的な量を計算することを可能にする。
【０３８８】 質量スペクトル分析によって種々の生物学的分子を分析するための方法が確立
された。質量スペクトル分析は、比較的低分子（例えば、ヌクレオシド、ヌクレ
オチド、モノ−およびジサッカリド）ならびに比較的高分子の分子量を決定する
ための公知の方法に従って使用され得る。例えば、質量スペクトル分析は、タン
パク質の同定にますます適用されている。エレクトロスプレーおよびマトリック
ス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、タンパク質分析のために適用さ
れる最も一般的に使用される質量スペクトル技術である。なぜなら、これらは、
大きな、低揮発性分子種をイオン化するのが最も可能であるからである。
【０３８９】 ＤＮＡの場合において、ＤＮＡは、加水分解の標準的な方法を用いて、デオキ
シリボヌクレオチドに加水分解され得る。例えば、ＤＮＡは、酵素的に（例えば
、ヌクレアーゼまたはホスファターゼを用いて、または非酵素的に、酸、塩基、
または他の化学的加水分解の方法を用いて）分解され得る。あるいは、インタク
トなＤＮＡポリマーが分析され得る。次いで、デオキシリボヌクレオチドが、標
準的な技術（例えば、トリメチルシリル、メチル、アセチル、および関連する誘
導体または直接プローブ挿入）を用いて質量スペクトル分析のために調製され得
る。
【０３９０】 以下の主要なクラスの代謝産物のために、以下の供給源は、このような分子の
質量スペクトル分析のさらなる手引きを提供し、その全体が参考として援用され
る：（１）脂質（例えば、Ｆｅｎｓｅｌａｕ、Ｃ．「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏ
ｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｓ」、ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、５４１：１−７（１９９４
）を参照のこと）；（２）揮発性代謝産物（例えば、Ｌａｕｒｉｔｓｅｎ，Ｆ．
Ｒ．およびＬｌｏｙｄ，Ｄ．「Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｏ
ｌａｔｉｌｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」ＡＣＳ Ｓｙｍｐｌ Ｓｅｒ．，５４１：９１−１０６
（１９９４）を参照のこと）；（３）炭水化物（例えば、Ｆｏｘ，Ａ．およびＢ
ｌａｃｋ，Ｇ．Ｅ．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅ
ｒｉａ」ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．５４１：１０７−１３１（１９９４）を参
照のこと）；（４）核酸（例えば、Ｅｄｍｏｎｄｓ，Ｃ．Ｇ．ら、「Ｒｉｂｏｎ
ｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｓ」ＡＣＳ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．，５４１：１４７−１５８（１
９９４）を参照のこと）；ならびに（５）タンパク質（例えば、Ｖｏｒｍ，Ｏ．
ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖｅｒｙ Ｈｉｇｈ
Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ
Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｍａｄｅ ｂｙ Ｆａｓｔ Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ」Ａｎ
ａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：３２８１−３２８７（１９９４）；ならびにＶｏｒｍ，
Ｏ．およびＭａｎｎ，Ｍ．「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍａｓｓ Ａｃｃｕｒａｃｙ
ｉｎ Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／
Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔ
ｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐ
ｅｃｔｒｏｍ．５：９５５−９５８（１９９４）を参照のこと）。質量スペクト
ル分析に関するさらなる詳細は、以下に示される。
【０３９１】 標識された二酸化炭素（［13Ｃ］ＣＯ2）もまた、質量スペクトル分析を用い
て検出され得る。このようなアプローチは、例えば、Ｅｗｉｎｇ，Ｇ．Ｗ．、Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ、第４版（１９７５）；およびＫｌｅｉｎ，Ｐ．ら「Ｓｔａｂｌｅ Ｉ
ｓｏｔｏｐｅｓ ａｎｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｎｕｔ
ｒｉｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ２１：１５５−１６６（１９８４）（こ
れらの両方は、その全体が参考として援用される）によって記載される。
【０３９２】 質量スペクトルによる検出に対する代替としては、赤外（ＩＲ）スペクトル分
析または核磁気共鳴スペクトル分析（ＮＭＲ）を用いて同位体標識を検出するこ
とである。種々の標的分析物（例えば、二酸化炭素を含む）がこのアプローチを
用いて検出され得る。同位体分析を行うためのＩＲ法およびＮＭＲ法は、例えば
、米国特許第５，３１７，１５６号；Ｋｌｅｉｎ， Ｐ．ら、Ｊ． Ｐｅｄｉａ
ｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ
４：９−１９（１９８５）；Ｋｌｅｉｎ， Ｐ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ １１：３４７−３５２
（１９８２）；および日本国特許公開番号６１−４２２１９および５−１４２１
４６（これらのすべては、その全体が参考として援用される）において議論され
る。
【０３９３】 特定の方法において、電気泳動方法によって部分的にまたは完全に精製された
標的分析物は、引き続いて標的分析物の同位体組成物を分析するための適切な検
出器に直接輸送される。いくつかの方法において、サンプルは、最終的な電気泳
動による分離の間に収集された個々の画分から引き出され、そして質量スペクト
ル分析装置に直接注入されて、相対量を決定する。
【０３９４】 （Ｅ．フラックスの決定） 一般的に、任意の所定の経路における各反応工程を通しての代謝産物のフラッ
クスは、正方向の反応および逆方向の反応の相対的な速度に依存する。本明細書
中で使用される場合、フラックスとは、時間およびサンプルサイズの関数として
標的分析物の濃度の変化の速度をいう。任意の単一の代謝転換を通しての代謝フ
ラックスは、以下の式に従って、時間（ｔ）に対する同位体標識された分析物の
相対的な量（ＲＡｔ）の変化から決定され得る：
【０３９５】
【数１】 ここでＲＡｓｓは、長時間での標識された代謝産物の相対的な量である。相対
的な量（ＲＡ）は、標的分析物中の同位体標識の量の比から決定された、同位体
標識された基質および／または標的代謝産物（すなわち、標的分析物）の相対的
な濃度である。いくつかの実施形態において、同位体の量に関する定常状態は、
被験体に投与された最初の基質中の既知の比に等しいとみなされ得、その結果、
単一のサンプルのみが代謝フラックスを決定するために必要とされる。別の実施
形態において、同位体の量に関する定常状態は、異なる時間の点において取られ
たサンプルから取られた２以上の相対量の測定についての上記の式の同時の解か
ら予測され得る。別の実施形態において、同位体の量に関する定常状態は、長時
間で取られたサンプルから直接測定され得る。
【０３９６】 上記の式の代替的な型が使用されて、同位体標識した分析物または同位体標識
した基質の相対量の減少後の基質の枯渇から分析物のフラックスを決定し得るこ
とは、当業者には明らかである。この代替的な型は以下であり：
【０３９７】
【数２】 ここで、ＲＡｏは、相対量を変化させる基質の投与の前の同位体標識した分析
物の最初の相対量である。１つの実施形態において、ＲＡｏは、新規な基質の投
与の前に直接測定される。別の実施形態において、ＲＡｏは、変化の前に投与さ
れた基質中の相対的な同位体量と同じであることが仮定される。
【０３９８】 ｎに分枝した代謝経路のネットワーク中の代謝分枝（ｉ）に、基質の相対的な
代謝フラックスが、任意の時点（ｔ）（好ましくは、長時間（すなわち、定常状
態で））で代謝経路の各分枝（ｊ）の下流の分析物中に見られる、同位体標識し
た分析物の相対量の比から決定され、これは、以下の式に従う：
【０３９９】
【数３】 フラックスを決定するために、代表的には、異なるあらかじめ決定された時点
で１以上のサンプルが被験体から引き出される。次いで、サンプルは、処理され
、必要に応じて精製され、次いで、上記のように分析して、サンプリング時点（
ｔ）で標的分析物中の同位体標識の相対濃度についての１以上の値を決定する。
次いで、これらの値は、上記に示した式中で使用されて、複数の標的分析物の各
々についてフラックス速度を決定し得る。いくつかの例において、フラックスを
決定するために使用される標的分析物は、すべての有機化合物である（すなわち
、分析物は、例えば、二酸化炭素を含まない）。
【０４００】 より正確なフラックスの決定および見積もられたフラックスの標準誤差もまた
、統計学的曲線の適合または当該分野で一般的に公知であるパラメーター適合法
［例えば、Ｚａｒ，Ｊ．Ｈ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
，（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ，
１９７４）］、および異なる時点で取られた複数のサンプルから得られた同位体
比データを用いて作製され得ることは、当業者に明らかである。
【０４０１】 経路を通した代謝フラックスは、経路中で工程を決定する速度に依存する。こ
れらの工程は、経路における引き続く工程よりも遅いため、速度を決定する工程
の産物は、それが反応物と平衡し得る前に除去される。フラックスおよびその決
定のための方法についてのさらなる手引きは、例えば、Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ，Ｅ
．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．４３：１８３−２０５（１９７
８）；Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ，Ｅ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．
４１：６１−１１０（１９７６）；ならびにＮｅｗｓｈｏｌｍｅ，Ｅ．Ａ．およ
びＳａｒｔ．，Ｃ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第
１章および第３章、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ（１９
７３）によって提供される。
【０４０２】 （Ｖ．標識された代謝基質の合成） 同位体標識された生物学的化合物の合成は、種々の異なる型の化合物（例えば
、核酸、タンパク質、炭水化物、ならびに解糖およびタンパク質の代謝経路中間
体）について十分に確立されている。核酸を同位体標識するための方法は、例え
ば、米国特許第６，０１０，８４６号において議論されており；炭水化物の標識
化は、米国特許第４，６５６，１３３号において議論されており；そして解糖中
間体を標識するための方法は、米国特許第５，４３９，８０３号において議論さ
れている。これらの文献のすべては、その全体が参考として援用される。
【０４０３】 いくつかの例において、同位体標識された生物学的化合物は、１以上の安定な
同位体が富化された食餌を生きた生物に与えること、同位体で富化された食餌の
天然の代謝産物から得られる、所望の同位体が富化された化合物を収集し、そし
てそれを精製することによって得られる。あるいは、同位体が富化された物質は
、同位体が富化された前駆体から化学的に合成され得る。メトミックス（ｍｅｔ
ｏｍｉｃｓ）研究のための多くの適切な物質（例えば、［13−Ｃ］脂肪酸、［2
Ｈ，13Ｃ，および15Ｎ］アミノ酸、［13Ｃおよび2Ｈ］ペプチド、および［13Ｃ
および15Ｎ］ヌクレオチド）は、商業的な供給源（例えば、Ｉｓｏｔｅｃ（Ｍｉ
ａｍｉｓｂｕｒｇ，ＯＨ），ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃｏｓ
ｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ），およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ））から入手可能である。
【０４０４】 （ＶＩ．代謝産物プロファイリングのためのキャピラリー電気泳動方法） （Ａ．代謝産物についてのキャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）） （１．一般論） 等電点電気泳動は、双性イオン物質（例えば、タンパク質、ヌクレオチド、ア
ミノ酸、およびいくつかの脂肪）がその等電点（ｐＩ）に基づいて分離される電
気泳動方法である。ｐＩは、双性イオン種（例えば、タンパク質）が正味の電荷
を有さず、従って、電場に供された場合に動かない。本発明において、双性イオ
ン種は、両性電解質を使用して生成されたｐＨ勾配中で分離され得るか、または
他の両性電解質性物質は、電場中で分離され得る。カソードは、勾配の高ｐＨ側
に配置され、そしてアノードは、勾配の低ｐＨ側に配置される。
【０４０５】 双性イオン種は、その等電点に従って、ｐＨ勾配中の勾配の中心に導入され、
ついでそこにとどまる。次いで、中心に集められた成分は、以下に記載されるよ
うに選択的に溶出され得る。ＣＩＥＦを実行するための一般的方法は、例えば、
Ｋｉｌａｒ，Ｆ．「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｃａｐ
ｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．第４章、９５−１０９頁（１９９４）；ならびに
Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｈ．およびＴ．Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａ
ｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｐａｒｔ Ｎｏ．２６６９２
３ （Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，１９９
４）；Ｗｅｈｒ，Ｔ．，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｒ．、およびＺｈｕ，
Ｍ．「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ」（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９９）によって記載さ
れており、これらは、本明細書中において、その全体が参考として援用される。
【０４０６】 （２．システムおよび溶液） ＣＩＥＦは、主として、低い電流密度を用いる平衡技術であり、キャピラリー
の加熱は問題ではない。従って、完全に大きなボアキャピラリーが利用され得る
。適切なサイズには、２〜６００μｍの内径を有するキャピラリーが含まれるが
これに限定されないが、より代表的には、２５〜２５０μｍの内径を有するキャ
ピラリーが使用され得る。比較的大きなボアキャピラリーの使用が、この方法が
比較的高いサンプル負荷量を使用し得、このことが引き続く次元における検出を
容易にする。このＣＩＥＦの特徴は、一連の電気泳動による分離の最初または初
期の１つについて十分に適切な方法にする。しかし、より小さな直径のキャピラ
リーは、温度をより伸長に制御し得、そして、いくつかの方法において、改善さ
れたシグナル検出を生じる（例えば、蛍光標識したタンパク質のレーザー誘導蛍
光（ＬＩＦ）検出）。
【０４０７】 キャピラリーは、種々の長さを有し得る。選択される長さは、因子（例えば、
必要とされる分離の程度）に部分的に依存する。代表的には、キャピラリーは、
約１０〜１００ｃｍ長であるが、いくぶん短いキャピラリーおよびいくぶん長い
キャピラリーが使用され得る。より長いキャピラリーは、代表的には、より良好
な分離および改善された複合体混合体の分離を生じるが、より長いキャピラリー
はまた、サンプル中の種とキャピラリー壁の種との間の相互作用のためのより多
くの機会、およびより低い電場の強さを与える。結果として、分解能が失われ得
るキャピラリーの長さの上限が存在する傾向にある。より長いキャピラリーは、
少ない量の化合物の解像における特定の使用用であり得る。キャピラリーのサイ
ズおよび長さについてのさらなる手引きは、例えば、Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．お
よびＪ．Ａ．Ｎｏｌａｎ「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ」：ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１
３章、３２５−３６８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９
９４）に記載される。
【０４０８】 一般的に、キャピラリーは、融合シリカから作られるが、プラスチックキャピ
ラリーおよびＰＹＲＥＸ（登録商標）（すなわち、アモルファスガラス）が特定
の方法において使用され得る。上述のように、キャピラリーは、円形または管状
の形状を有する必要はない。他の形状（ここで、対向する面間の内部寸法は、こ
の節に記載される一般的範囲にある）もまた使用され得る。
【０４０９】 種々のアノード溶液およびカソード溶液が使用され得る。一般的な溶液には、
カソード液として水酸化ナトリウムおよびアノード液としてリン酸が含まれる。
同様に、多数の異なる両性電解質が使用されて、ｐＨ勾配を生成し得る。これに
は、多数の市販の両性電解質（例えば、ＢｉｏＬｙｔｅ、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ
およびＳｅｒｖａｌｙｔｅ）が含まれる。両性電解質の選択および両性電解質勾
配の幅は、ＣＩＥＦ法によって達成された分解能にインパクトを与え得る。狭い
両性電解質勾配は、理論的なプレートの数を増大し、そして狭いｐＩの幅にわた
る高分解能の分離についての利点を有し得る。
【０４１０】 本明細書の分離において使用されるＣＩＥＦ法は、ポリマー性マトリックスを
含むか、または遊離の溶液を含むキャピラリー中で行われ得る（すなわち、ゲル
またはタンパク質のポリマー性マトリックスがない）。ポリマーマトリックスは
、代表的には、電気浸透流を示すように添加される；しかし、いくつかの例にお
いて、ポリマー性マトリックスを含むことは、より大きなタンパク質の移動を制
限し得る（Ｐａｔｔｏｎ，Ｗ．Ｆ．「Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａ
ｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｔｅ
ｏｍｉｃｓ」、ＩＢＣ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃｏｒ
ｏｎａｄｏ，ＣＡ（Ｊｕｎｅ １１−１２，１９９８）において提示された論文
）。遊離の溶液の使用は、電気浸透流を制御するために、おそらく他の方法（例
えば、キャピラリーコーティング、ゲルプラグ、または誘導された電場）と組み
合わせる場合において好ましい。
【０４１１】 （３．代謝産物プロファイリングのためのサンプル調製） いくつかの例において、ＣＩＥＦによって電気泳動されるサンプルは、特定の
高分子（特にタンパク質）を変性させるために、変性剤に供せられる。このこと
は、同じ成分がすべて同じ電荷を有し、従って、同一の成分が、キャピラリー中
の複数のゾーンに潜在的にあるのではなく、むしろ同じ位置に集中することを確
証する。変性剤（例えば、尿素）、非イオン性界面活性剤、および双性イオン性
界面活性剤（例えば、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０または３−［｛３−コルアミ
ドプロピル｝ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）もまた、タン
パク質沈殿を生じ得る、タンパク質と壁面の相互作用およびタンパク質とタンパ
ク質の相互作用を抑制するために使用され得る。電気泳動の前にサンプル中の他
を変性させることの利点は、結果が、代表的に変性条件下で得られた記録されて
いるデータと比較して使用され得ることである。
【０４１２】 代表的な変性緩衝液には、変性剤として、尿素および非イオン性界面活性剤ま
たは双性イオン性界面活性剤が含まれ；還元剤（例えば、ジチオスレイトール（
ＤＴＴ）またはメルカプトエタノール）は、代表的には、タンパク質に存在する
ジスルフィド結合を還元するために含まれる。尿素の他にさらに使用され得る変
性剤には、チオ尿素およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が含まれるがこれら
に限定されない。一般的に、塩酸グアニジンは、変性剤としては使用されない。
なぜなら、これは、非常に高いイオン強度をサンプルに与えるからである。典型
的な中性のデタージェントには、ポリオキシエチレンエーテル（「トリトン」）
（例えば、ノナエチレングリコールオクタシクロヘキシルエーテル（「ＴＲＩＴ
ＯＮ」Ｘ−１００））、ポリグリコールエーテル、特に、ポリアルキレンアルキ
ルフェニルエーテル（例えば、ノナエチレングリコールオクチルフェニルエーテ
ル（「ＮＯＮＩＤＥＴ」Ｐ−４０またはＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０））、ポリ
オキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレート（「ＴＷＥＥＮ」−２０））、ポリオキシエチレンエーテル（例え
ば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｃ12Ｅ23）（「ＢＲＩＪ」−３５）
）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、２１ステアリルエステル（Ｃ18Ｅ23 ）（「ＢＲＩＪ」７２１））、Ｎ，Ｎ−ビス［３−グルコンアミド−プロピル］
コルアミド（「ＢＩＧＣＨＡＰ」）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、グル
コシド（例えば、オクチルグルコシド）、３−［｛３−コルアミドプロピル｝ジ
メチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートなどが含まれる。
【０４１３】 変性剤およびデタージェントの最適量は、使用される特定のデタージェントに
依存する。一般的に、変性サンプル緩衝液は、１０Ｍまでの尿素（より代表的に
は、４〜８Ｍ、そして最も好ましくは、６〜８Ｍ）を含む。適切な緩衝液の特定
の例（ならびにそこに含まれる変性剤および非イオン性界面活性剤）は、Ｈｏｃ
ｈｓｔｒａｓｓｅｒら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：４２４（１９８８
））およびＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７（
１９７５））によって記載されたものを含む。変性は、代表的には、キャピラリ
ーへの注入前に９５℃で１０分間の加熱によって進行する。サンプル緩衝液を変
性させる際の調整は、電気浸透流および生じる加熱の効果をしとめるために必要
に応じてなされる（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏ
ｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ」ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、第４章、９５ー１
０９頁を参照のこと）。
【０４１４】 注入されるサンプルの量は、使用されるキャピラリーのサイズに一部依存して
上記のように変化し得る。一般的に、キャピラリーは、サンプルの０．１〜５．
０ｍｇでロードされる。サンプルは、１以上のｐＩスタンダードでスパイクされ
、この方法の性能を評価し得る。
【０４１５】 （４．溶出） 種々の技術を使用して、分離された化合物を含む電気泳動媒体を、溶出するか
、またはキャピラリーから引き出すが、これらの方法は、３つの一般的なカテゴ
リーに分かれる：水力学的な溶出。電気溶出、および電気浸透流の制御である。
【０４１６】 （ａ．水力学的／圧力溶出） 水力学的／圧力溶出は、キャピラリーの一端に接続した適切なポンプを介して
、圧力を適用する（または、真空に吸引する）工程を含む（例えば、Ｋｉｌａｒ
，Ｆ．「Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｃａｐｉｌｌａｒ
ｉｅｓ」ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．第４章、９５−１０９頁（１９９４）を参照のこと）。しか
し、 水力学的溶出は、キャピラリー中に形成される放物線的な流れのプロフィールに
起因して、バンドを広くし得、そして分解能の損失を引き起こし得る。
【０４１７】 （ｂ．電気溶出） 電気溶出（他の主要なアプローチ）は、種々の技術を包含し、そして一般に、
溶出を行うために、十分に、分離キャビティ中の電気泳動媒体のいくつかのパラ
メーター（例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度）を変更するためにアノードおよ
び／またはカソードで溶液を変化させる工程を含む。
【０４１８】 （塩流動） １つの電気溶出アプローチは、塩のカソード液（ｃａｔｈｏｌｙｔｅ）または
アノード液（ａｎｏｌｙｔｅ）への添加を含み、この塩は、リザバ内の酸性種ま
たは塩基性種と同じ電荷の非酸性対イオンまたは非塩基対イオンを有する。この
塩はリザバに添加され、その結果、対イオンはリザバからキャピラリーに移動す
る。電気的中性がキャピラリー内で維持されなくてはならないので、対イオンの
キャピラリーへの移動は、キャピラリー内でのプロトンまたは水酸化物の濃度の
減少を生じ、従って、ｐＨが上昇するか、または低下するかのいずれかである。
このタイプに流動についての理論的基礎は、Ｓ．Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．−Ｌ．Ｌ
ｉａｏ，およびＫ．Ｙａｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３８７：１２７（１
９８７）によって記載される。例えば、カソード液が、水酸化ナトリウムである
（すなわち、塩基性種が水酸化物である）場合、水酸化物以外の負に荷電した対
イオンを有する塩が添加される（例えば、塩化ナトリウム）。塩化物イオンのキ
ャピラリーへの移動は、キャピラリー内での水酸化物の局所濃度を減少させ、そ
れによって、ｐＨを減少させる。別の例として、アノード液がリン酸である場合
、プロトン以外の対イオンを有する塩が添加される（例えば、リン酸ナトリウム
）。この例において、ナトリウムイオンのキャピラリーへの移動は、キャピラリ
ー内のプロトンの局所濃度を減少させ、それによってｐＨを増加させる。添加さ
れた対イオンの存在に起因するキャピラリーの領域内で、ｐＨが増加または減少
するにつれて溶出が起こる。なぜなら、両性電解質および濃縮された（ｆｏｃｕ
ｓｅｄ）成分が、それらの等電点に対応する新たに規定されたｐＨ領域に移動す
るからである。流動のために使用される塩のタイプおよび濃度の両方が溶出した
化合物ピークの分解能に対して影響することが示されている（例えば、Ｒ．Ｒｏ
ｄｒｉｇｕｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｍ．Ｚｈｕ，およびＴ．Ｗｅｈｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ．Ａ，７７２：１４５（１９９７）を参照のこと）。例えば、塩化ナ
トリウムの代わりに四ホウ酸ナトリウムのカソード液への添加は、分離されるタ
ンパク質の非常に増加した分解能を生じる。
【０４１９】 （ｉｉ．ｐＨ流動） 本明細書中で、「ｐＨ流動」として参照される別の技術のまた、ＣＩＥＦの間
に化合物を溶出するために利用され得る。このアプローチにおいて、添加物が、
溶液のｐＨを変更するために、アノード溶液またはカソード溶液のいずれかに添
加される。しかし、塩流動とは異なり、添加物はキャピラリーに移動する可動対
イオンに寄与しない。ここで、溶出が、リザバの１つまたは両方のｐＨによって
再規定されるｐＨ勾配の結果として起こる；従って、この再規定されたｐＨ勾配
の外側にあるｐＩを有する成分は、アノードリザバまたはカソードリザバのいず
れかに溶出される。代表的に、カソード流動についての技術は以下のように進行
する。一旦、成分が濃縮されると（例えば、アノード液としてリン酸およびカソ
ード液として水酸化ナトリウムを使用する３〜１０のｐＩ範囲において）、カソ
ードキャピラリー端部は、１０より少し低いｐＨを有する溶液（例えば、９．８
５のｐＨを有する５０ｍＭイミダゾール（ｐＫａ ７））を含むリザバに浸され
る。次いで、これらの成分は、キャピラリー中に再濃縮され、キャピラリーを通
る電流の安定化によって認識可能となり、ここで、ｐＩ範囲は、３〜９．８５に
よって規定される。９．８５〜１０の等電点を有する任意の化合物は、カソード
液に溶出される。このプロセスは、ｐＨを９．８５より少し低くさせる種を含む
カソード液で繰り返され得る。段階的な様式で、ｐＨは、ｐＨ７に減少されつづ
け得、それによって、７〜１０の範囲を補う画分に分離した成分を回収する。こ
の点において、アノード流動は、ｐＨを３から７に選択的に増加させるために、
アノード液を増加したｐＫａの酸と置きかえることによって進行し得、それによ
って、酸性範囲（ｐＨ３〜７）の画分を回収する。画分の数は、所望の分別分解
能に依存して変化し得る。代表的に、これらの画分は、０．０５〜０．５ｐＨ単
位の差によって規定される。
【０４２０】 ｐＨ流動の技術は、キャピラリーの内部の不均一な空間勾配を引き起こし得る
、高濃度の１以上の成分（例えば、タンパク質）を含むサンプルに対して有用で
あり得る。ｐＨ流動を使用して、リザバｐＨによって規定されるｐＩ範囲より下
か、または上である等電点を有する成分のみが溶出される。従って、この溶出は
、キャピラリーのｐＨ勾配の形状における差異またはキャピラリー内部の不均一
な空間勾配の存在に関わらず、再現性がある。
【０４２１】 （ｃ．電気浸透流（ＥＯＦ）） 電気浸透流（ＥＯＦ）の大きさを調節することは、先の電気溶出法（前出を参
考のこと）に有意に影響し、そして分離された成分が等電濃縮分離の結果の際に
選択的に引かれ得る別の方法である。ＥＯＦは、シリカキャピラリーの表面上の
シラノ−ル官能基のイオン化によって発生する。このようなイオン化は、シリカ
キャピラリーの表面での電気泳動媒体中のプロトンの層を生じる。一旦、電場が
印加されると、プロトンの層は、本質的に、カソードに向かって移動する流体の
正に荷電したカラムを構成し、それによってキャピラリー内に電気泳動媒体のバ
ルクフロー（ｂｕｌｋ ｆｌｏｗ）を引き起こす。成分の見かけの速度は、電気
浸透流とそれらの電気泳動移動度との合計に等しい。従って、ＥＯＦを制御する
ことによって、成分がキャピラリーを通って動く速度を制御または調節し得る。
ＣＩＥＦ法において、一般にＥＯＦは、タンパク質が、キャピラリーから溶出し
始める前に、濃縮するのに十分な時間、注入されたサンプル内にあるようにさせ
るように制御されなくてはならない。
【０４２２】 種々の技術が、ＥＯＦを制御するために利用され得る。１つのアプローチは、
キャピラリーの壁を種々の薬剤でコーティングする工程を含む。例えば、シリケ
ートガラス表面に沿ったＥＯＦは、表面シラノール基（例えば、ポリアクリルア
ミド、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンオキシド）の相当な割合をマ
スクする中性のシラン試薬を用いて、それらをシラン処理することによって実質
的に減少され得る。ＥＯＦの大きさは、正または負に荷電した基を含むシラン処
理試薬を使用してさらに制御され得る。正に荷電したコーティングを使用して、
ゼロの正味の表面電荷を与えるために、表面の負の電荷を無効にし得、その結果
、ＥＯＦはゼロに近づく。より高い正電荷密度を有するコーティングを使用して
、荷電した表面物質に対してＥＯＦの方向を逆にし得る。このことは、正に荷電
したサンプル種の正味の移動速度を遅くするために有用であり得る。逆に、負に
荷電したコーティングを使用して、表面の負の電荷の量に付与するかまたは増加
させ得、その結果、負に荷電した種の正味の移動速度を増加させる。代表的な正
に荷電したコーティングには、例えば、ポリエチレンイミン、四級化ポリエチレ
ンイミン、ポリ（Ｎ−エチルアミノアクリルアミド）およびキトサンを有するト
リアルコキシシランが挙げれらる。代表的な負に荷電したコーティングには、例
えば、カルボキシレートおよびスルホネート（ポリ（メチルグルタメート）およ
び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネートポリマーのような物質
を含む）を有するトリアルコキシシランが挙げられる。荷電したコーティングは
また、特にコーティングと同じ電荷極性を有するサンプルに対して、サンプル吸
着を効果的に減少させ得る。
【０４２３】 分離媒体はまた、電気泳動の間にＥＯＦを減少させることを助けるために、分
離キャビティの壁を動力学的にコーティングするための可溶性薬剤を含み得る。
このような可溶性コーティング剤には、例えば、以下が挙げられる：四級化アン
モニウム含有ポリマー、メチルセルロース誘導体、酢酸セルロース、ポリエチレ
ンオキシド、キトサン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ
エチレンイミン、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリ
エチレンオキシドトリブロックコポリマー。代表的に、可溶性コーティング剤は
、約０．０５％〜約４％、より代表的には約１％〜約２％の濃度で含まれる。
【０４２４】 ＥＯＦおよびサンプル吸着はまた、分離媒体およびランニング緩衝液に適切な
試薬を含むことによって調節され得る。例えば、負の表面電荷は、媒体中にカチ
オン性添加物（例えば、金属アミン錯体、アミン、およびポリアミン（例えば、
プロピルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミ
ン、プトレシン、スペルミン、１，３−ジアミノプロパン、モルホリンなど））
を含ませることによってマスクされ得る。電気泳動のｐＨで等電である負および
正に荷電した基の両方を含む両性イオン種（例えば、トリアルキルアンモニウム
プロピルスルホネート（ここで、アルキルは、メチル、エチル、プロピル、およ
びより長いアルキル鎖である））もまた、使用され得る。
【０４２５】 別のアプローチは、ＥＯＦと反対方向の電流の発生を含む。代表的に、これは
、キャピラリーの外部表面に金属（例えば、イリジウムスズ酸化物または銅）の
薄層を適用することによって達成される。電流のフィルムへの適用は、キャピラ
リー内に比較的小さな誘導電流を発生させ、ＥＯＦを逆にする（例えば、Ｓｃｈ
ａｓｆｏｏｒｔ，Ｒ．Ｂ．Ｍ．，Ｓｃｈｌａｕｔｍａｎｎ，Ｓ．，Ｈｅｎｄｒｉ
ｋｓｅ，Ｊ．，およびｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ａ．，「Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆ
ｅｃｔ Ｆｌｏｗ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ
Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：９４２−９
４５（１９９９）を参照のこと）。
【０４２６】 サンプルが導入される場所よりも上流（上流とは、キャピラリーを通る成分の
流れとは反対の方向をいう）の位置に多孔性プラグを配置することはまた、ＥＯ
Ｆを制御するために利用され得る。プラグの位置を示す例が、図２Ｂに示され、
ここで、キャピラリー１００が、一方の端部において、アノードリザバ（示さず
）から延び、他方の端部においてカソードリザバから延びる（示さず）。成分移
動は矢印１０２の方向である（すなわち、アノードからカソードの方向）。
【０４２７】 理解されるように、多孔性プラグ１０４は、一旦キャピラリー１００」に導入
されると、サンプルの後縁１０６の上流であるように位置決めされる。多孔性プ
ラグ１０４は、代表的に、ポリマー材料から形成され、電気泳動の実施の間比較
的定常のままである。プラグが形成され得る適切な材料の例には、ジアクリルア
ミド架橋剤およびアガロースと重合されたアクリルアミドが挙げられる。任意の
特定の理論によって縛られることは意図されないが、多孔性プラグ１０４は、プ
ラグ１０４が存在しない場合に、カソードリザバに向かって移動するバルク流体
の置換をブロックすることによって運動量移動バリアとして機能する。
【０４２８】 いくつかの方法（例えば、大量の特定の成分（例えば、タンパク質）および／
または大量の異なる成分を含む方法）において、ＥＯＦは、非常に低いレベルに
減少されて、電気泳動媒体が、ＥＯＦのためにキャピラリーから溶出し始める前
に、成分が濃縮する機会を可能にしなければならない。特定の方法において、＝
０．５×１０-6ｃｍ2／Ｖ−ｓのＥＯＦ（ｐＨ８．６において、そして２５ｍＭ
ＴＲＩＳ−ホスフェート）は、サンプルがキャピラリーから溶出する前に、タン
パク質の必要な濃縮のための十分な時間を可能にすることが見出されている。上
記の方法は、ＥＯＦをこれらのレベルに減少させ得る。
【０４２９】 従って、先のアプローチは、異なる基準に従って、画分が回収されることを可
能にする。例えば、電気溶出技術を使用して、規定されたｐＨ範囲を有する画分
を回収し得る。対照的に、ＥＯＦ溶出および圧力溶出を使用して、溶出時間に従
って、画分を分離し得る。他の技術もまた、ＣＩＥＦ後分離されたタンパク質を
溶出するために利用され得る（例えば、Ｋｉｌａｒ，Ｆ．，「Ｉｓｏｅｌｅｃｔ
ｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｉｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ，「ＣＲＣ Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｒ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，
第４章，９５−１０９頁（１９９４）を参照のこと）。制御された溶出技術は、
再現性を高めるために有用であり、比較法および診断方法における重要なファク
ターである。このような技術はまた、空間的分離に依存する方法と比較して、大
量成分（例えば、タンパク質）の改善された許容範囲を提供する。
【０４３０】 （Ｂ．代謝物プロファイリングのためのキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ
）） （１．一般論） キャピラリーゾーン電気泳動は、ゲルマトリックスのない自由溶液中で行われ
る電気泳動法であり、そしてそれらの固有の質量／電荷比に基づいて荷電成分（
例えば、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸、脂肪、砂糖ホスフェート、核酸、ヌク
レオチドおよびヌクレオシド）の分離を生じる。ＣＺＥ方法に対する１つの利点
は、典型的な水溶性ゲルマトリックスと通常適合しない溶媒系で行う能力である
。非水または水混和性溶媒系を使用して、水性電気泳動方法によって通常分離さ
れない疎水性でかつ膜結合成分の溶解度を改善し得る。この方法を実施するため
の一般的な方法が、例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．「Ｃａｐｉｌｌａｒ
ｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，」
ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．，第１２章，２８７−３２３頁（１９９４）；Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，
Ｊ．Ｗ．およびＬｕｋａｃｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｊ．Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔ．Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４：２３０（１９８１）；ならびにＪｏｒ
ｇｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．およびＬｕｋａｃｓ，Ｋ．Ｄ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．
５３：１２９８（１９８１）（それらの各々は、その全体が参考として援用され
る）によって記載される。
【０４３１】 （２．システムおよび溶液） 一般に、ＣＩＥＦのための上記のキャピラリーはまた、ＣＺＥ方法を行うため
に適切である。しばしば、キャピラリーは、約５０〜１００ミクロンの内径を有
する。緩衝液組成物およびｐＨは、分離に有意に影響し得る。なぜなら、ＣＺＥ
における分離は、質量／電荷比に基づき、そして成分の電荷は、周囲溶液のｐＨ
に依存するからである。極端なｐＨ（すなわち、２より低く、そして１０より高
い）において、多くの成分の分解能を達成することは、典型的に困難である。な
ぜなら、成分上のほとんどの荷電基は、完全にプロトン化されているか、または
脱プロトン化されているかのいずれかであり、そして多くの成分が、単位質量当
たり同じような数の酸性残基および塩基性残基を有するからである。選択性は、
代表的に、中間のｐＨにおいて高められる。比較的高いパーセントの酸性基を有
する成分について、選択性は、しばしば、ｐＨ４．５付近で高められ得る。高濃
度のアミン残基を有する成分について、選択性は、ｐＨ１０付近で高められ得る
。
【０４３２】 ＣＺＥにおいて、アノードおよびカソードにおける溶液は、典型的に同じであ
る。利用される緩衝液は、本質的に任意の緩衝液であり得、緩衝液の選択は、部
分的に、電気泳動方法が実行されるｐＨ範囲および検出機ノイズに対するその影
響によって制御される。低ｐＨにおける有用な緩衝液の例には、ホスフェートお
よびシトレートが挙げられるが、これらに限定されない；高ｐＨにおいて有用な
緩衝液には、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ、ボラート、およびＣＡＰＳ（３−（シ
クロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）が挙げられる。適切な緩衝液
および緩衝液添加物に関するさらなる手引きは、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．
「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ」、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，第１２章，２８７−３２３頁（１９９４）に
よって記載される。
【０４３３】 いくつかの例において、多重ＣＺＥ分離が、異なるｐＨ緩衝液を用いて実施さ
れて、成分の分別に影響し得る。例えば、ｐＨ３の緩衝液を使用して、中性成分
（例えば、オリゴ糖、多糖類、単純砂糖、および脂肪酸）から、および正味負に
荷電した成分（例えば、リン糖酸およびヌクレオチド）から、正味正に荷電した
アミン官能性成分（例えば、アミノ酸、およびヌクレオシド）を分離し得る。こ
の最初のＣＺＥディメンションから回収された画分は、続いて、別のｐＨにおけ
る第二のＣＺＥディメンションにおいて、さらに分離され得る。例えば、アミノ
酸は、ｐＨ７で実施された第二のＣＺＥディメンションによってヌクレオシドか
ら分離され得、そして脂肪酸は、５．５のｐＨにおいてアミノ酸から分離され得
る。リン糖酸は、ｐＨ１１での続くＣＺＥ分離によって、カルボン酸からさらに
分離され得る。
【０４３４】 （３．溶出） 溶出は、ＣＩＥＦについての上記の同じ方法のいくつか（すなわち、圧力およ
おびＥＯＦ）を利用して、達成され得る。ＣＩＥＦと同様に、ＥＯＦを制御する
ことは、充填されたサンプル内の成分が分離される機会を有する前に、成分を含
む電気泳動媒体がキャピラリーから溶出することを防ぐために、特定の方法にお
いて重要である。ＥＯＦは、ＣＩＥＦ方法においてＥＯＦを制御するために利用
される同じ方法（例えば、キャピラリーの内壁をコーティングすること、多孔性
プラグを使用すること、およびＥＯＦを相殺する誘導場を発生させること）を用
いて、制御され得る。電気泳動媒体のｐＨおよびイオン強度を調節し、そして注
意深く選択することは、使用され得る別の技術である。ＥＯＦは、比較的低いｐ
Ｈ（例えば、ｐＨ２〜５、より代表的には、約ｐＨ３〜４）でＣＺＥを実施する
ことによって、内部キャピラリー表面のシラノール基のイオン化から生じるので
、イオン化されるシラノール基の数は減少される。このような減少は、ＥＯＦを
減少させる。完全な分離の前にサンプル溶出を防止するために、特定の分析にお
いて、ＥＯＦは、＜１×１０-4ｃｍ2／Ｖ−ｓ（ｐＨ８．６および２５ｍＭ Ｔ
ＲＩＳ−ホスフェート緩衝液における）に減少されるべきである。このレベルの
ＥＯＦは、こおで記載された方法を使用して得られ得る。
【０４３５】 １以上の検体の共有結合性改変はまた、成分溶出を制御するための手段として
戦略的に使用され得る。この技術は、サンプルを次のチャピラリーに注入する前
に、化学的部分をサンプル中の特定の成分またはＣＥ工程から回収された画分に
添加する工程を含む。特定の官能基（例えば、アミノまたはカルボキシル基）と
優先的に反応する改変剤を選択することによって、特定の成分の質量／電荷比を
変更し得る。このようの変更は、電気泳動の間の成分の分解能を改善し、そして
それらの検出性を改善する。
【０４３６】 （Ｄ．代謝物プロファイリングのためのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）
） （１．一般論） キャピラリーゲル電気泳動は、ゲルマトリックスを介する篩分けによって達成
されるタンパク質、核酸、または他の高分子の分離をさし、サイズに従う分離を
生じる。１つの形式において、タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）で変性され、その結果、質量／電荷比が、タンパク質の固有の質量／電荷比よ
りもむしろこのカチオン性界面活性剤によって決定される（Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．
Ｒ．およびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，ＮＹ，（１９８０））。この
ことは、タンパク質は、電荷が分離の程度に要因として入ることなく、サイズを
基準にして単に分離され得ることを意味する。一般的なＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳
動方法のキャピラリー電気泳動（ＣＧＥ）への適用は、例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ
，Ｓ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｖ．，９：１２２（１９６７）によって記
述される。
【０４３７】 （２．システムおよび溶液） キャピラリーおよびそれらのサイズのタイプは、一般的に、ＣＺＥについて上
記されたようなものである。種々の異なる緩衝液が使用され得、Ｂａｃｍａｎに
よって製造された「ｅＣＡＰ ＳＤＳ」のような市販の緩衝液を含む（Ｈｊｅｒ
ｔｅｎ，Ｓ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｖ．，９：１２２（１９６７）；Ｂ
ｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，「ｅＣＡＰ ＳＤＳ ２００：Ｆａｓ
ｔ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ，」ＢＲ２５１１Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，（１９９３）；Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｍ．および
Ｃｈａｖｋｏ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６５：３３（１９８７）
；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｄ．Ｆ．，ら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１
７３：４２４（１９８８））。種々の緩衝液添加物は、分解能を増加させるため
に利用され得る。このような添加物には、以下のような少量の有機溶媒が挙げら
れるが、これらに限定されない：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、シクロヘキシ
ルジエチルアミン、ジメトキシテトラエチレングリコールおよび他のポリオール
（例えば、エチレングリコールよおびポリエチレングリコール）（例えば、Ｐａ
ｌｍｉｅｒｉ，Ｒ．およびＮｏｌａｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｐｉ
ｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎ
ｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」：ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１３章，３２５−３６８頁，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂ
ｏｃａ Ｒａｔｏｎ，（１９９４）；Ｗａｎｄｅｒｓ，Ｂ．Ｊ．およびＥｖｅｒ
ａｅｒｔｓ，Ｆ．Ｍ．，「Ｉｓｏｔｇａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｐ
ｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，」：ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第５章，１１１−１２７頁，ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，（１９９４）を参照のこと）。このような
溶媒の使用は、特定の化合物（例えば、水溶液中の脂質親和性成分）の溶解度を
改善し得、そして熱変性に対するそれらの安定性を高め得（Ｍａｒｔｉｎｅｋ，
Ｋ．，ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５１：１５２−１５５（１９７５））、ＣＺ
ＥおよびＣＧＥにおける電気浸透流を抑制し（Ａｌｔｒｉａ，Ｋ．Ｄ．およびＳ
ｉｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｆ．，Ａｎａｌ．Ｐｒｏｃ．，２３：４５３（１９８６））
、キャピラリー壁における電気二重層の厚さを変更して、タンパク質結合相互作
用を阻害し得（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．，「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎ
ｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，」：ＣＲＣ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓ：Ａ Ｐｒｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１２章，２８７−３２３
頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，（１９９４））、そし
て電気浸透流を抑制するランニング緩衝液の粘度を増加させ得る。利用される溶
媒は、キャピラリー内のポリマーマトリックスと適合するべきである。
【０４３８】 等速回転電気泳動（ＩＰＥ）を特定の方法で使用して、荷電成分の分解能を高
め得る。ＩＰＥの一般的な議論について、例えば、Ｂ．Ｊ．Ｗａｎｄｅｒｓおよ
びＥｖｅｒａｅｒｔｓ，Ｆ．Ｍ．，「Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，」ＣＲＣ Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第５章，１１１−１２７頁（１９９４
）（これは、その全体が参考として援用される）を参照のこと。一定の電場強度
下で、キャピラリーを通過する荷電分子の速度は、その相対移動度に依存し、こ
の移動度は、分子の質量／電荷比、温度、そして分子が通過する媒体の粘度の関
である。しかし、サンプルイオンの上流の高度に移動可能なイオンの適切な濃度
が存在しない場合、一旦電場がキャピラリーの内部で定常状態に達すると、全て
のイオンは、最終的に最も遅いイオンの速度で移動しなければならない。この条
件は、リーディング（ｌｅａｄｉｎｇ）緩衝液およびターミネ−ティング（ｔｅ
ｒｍｉｎａｔｉｎｇ）緩衝液の界面におけるそれらの相対的な移動度の順番でで
、カチオンを積み重ねさせる。
【０４３９】 ＳＤＳ変性条件下で、サンプルに存在する全ての成分は、ほぼ同一の質量／電
荷を有する。ターミナル緩衝液により高い質量／電荷のアニオンを使用すること
によって、成分を一定の遅い速度でキャピラリーを通過させ得る。このことは、
２つの効果を有する。第１に、成分は、キャピラリー内部のそれらの有効濃度を
増加させるリーディング緩衝液の末端縁で、「積み重なる」。第２に、成分間の
任意の分離は、それらのサイズに基づく。従って、ＩＰＥがサンプルの「積み重
なり」のために使用されるハイブリッドＩＰＥ−ＣＧＥ方法の使用は、いくつか
の方法における続くＣＧＥ分離において可能な分解能を改善し得る。
【０４４０】 種々のターミナル緩衝液系は、ＩＰＥ方法と関連して利用され得る。１つの系
において、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は、ターミナル電解質として使用
される。なぜなら、それは、高ｐＨ（＞６）において高い質量／電荷を有するか
らである。トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）シトレート（
０．０５Ｍ）は、ｐＨ＝４．８でリーディング緩衝液として、およびｐＨ＝６．
５で中程度のスタッキング緩衝液として使用される。サンプル成分（例えば、タ
ンパク質）は、最初に「積み重なる」。なぜなら、ＥＡＣＡは、ｐＨ６．５のス
タッキング緩衝液において非常に低い移動度を有するためである。しかし、一旦
タンパク質が「積み重なり」、そしてＥＡＣＡがより低いｐＨのリーディング緩
衝液に達すると、ＥＡＣＡの移動度は、サンプル中の成分の移動度を超え、そし
て分離が開始する（例えば、Ｓｃｈｗｅｒ，Ｃ．およびＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，
Ｆ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６２３：３４５（１９９２）を参照のこと
）。この系は、ハイブリッド単一カラムＩＰＥ−ＣＰＡＧＥ系を作製するために
使用され得る。
【０４４１】 タンパク質の分離のためのＩＰＥについての２緩衝液系は、サンプルを０．０
１Ｍ 酢酸に溶解する工程を含み、この酢酸はまた、ターミナル電解質として使
用される。リーディング緩衝液およびバックグラウンド緩衝液は、ｐＨ４．４の
０．０２Ｍトリエチルアミン−酢酸溶液であった。ターミナル緩衝液中のサンプ
ルは、リーディング緩衝液とバックグラウンド緩衝液との間に挟まれる。ＩＰＥ
は、バックグラウンド緩衝液が、ターミナル緩衝液の先行縁に追いつくまで続く
。その場所で、ＩＰＥは停止し、そして分離が始まる（例えば、Ｆｏｒｅｔ，Ｆ
．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６０８：３（１９９２）を参照のこと）。
【０４４２】 任意のランニング緩衝液を用いて達成され得る別のＩＰＥアプローチは、サン
プルをランニング緩衝液に溶解し、より低いイオン強度に希釈することである。
これは、サンプルプラグが充填されるキャピラリーにおける電気抵抗の増加を引
き起こし、そして対応して、サンプルマトリックスに存在するイオンをランニン
グ緩衝液の境界へより迅速に移動させる。サンプルマトリックスとランニング緩
衝液との間の最適なイオン強度の差は、典型的に約１０倍である（例えば、Ｓｈ
ｉｈａｂｉ，Ｚ．Ｋ．およびＧａｒｃｉａ，Ｌ．Ｌ．，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｓａｍｐｌｅ ｍａｔｒｉｘ ｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｐｉ
ｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，」：ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｃａｐｉｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第２０章，５３７−５４８頁，ＣＲＣ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，（１９９４）を参照のこと）。
【０４４３】 （３．溶出） 一般に、ＣＺＥについての溶出の議論を、ＣＧＥに適用する。溶出は、圧力お
よびＥＯＦを利用して達成され得る。ＣＩＥＦおよびＣＺＥと同様に、ＥＯＦを
制御することは、適用されたサンプル内の成分が分離の機会を有する前に、成分
を含む電気泳動媒体が溶出することを防ぐために、特定の方法において重要であ
り得る。ＣＩＥＦおよびＣＺＥについての上記の方法を使用して、所望のレベル
でＥＯＦを制御し得る。特定の分析において、完全な溶出の前にサンプルが溶出
することを防ぐために、ＥＯＦは、＜１×１０-4ｃｍ2／Ｖ−ｓ（ｐＨ８．６お
よび２５ｍＭ ＴＲＩＳ−ホスフェート緩衝液における）に減少されるべきであ
る。ＥＯＦは、例えば、緩衝液のｐＨを制御することによって、相殺する誘導電
場、キャピラリーコーティングおよび多孔性プラグの生成によって、この範囲に
減少され得る。
【０４４４】 （Ｅ．分離に続く検出） 図１に示されるように、最後の電気泳動分離の間に抜き出された電気泳動溶液
は、標識された分析物および標識されていない分析物の相対的存在量の決定のた
めに、分析機８２に向けられ得る。この構成は、検出の性質に関するかなりの柔
軟性を提供し、そしてこの方法を標準的な吸収および蛍光の技術に限定しない。
しかし、この分析機は、図１に示されるように溶出される成分を検出するように
位置付けされる必要はない。他の構成では、分析機は、キャピラリー管自体の分
離キャビティー内の分割された成分をスキャンし得るように適合される。このよ
うな構成の例は、分割された成分中の13Ｃ存在量を検出するための近赤外分析機
の使用を含む。代謝フラックスは、目的の分析物の同位体比の相対的存在量から
決定されるのみであるので、標識された分析物および標識されていない分析物の
相対的存在量を分析し得る任意の検出器が、この方法で使用され得る。検出器の
定量的感度および精度は、比較的重要でない。なぜならば、各分析物は、標識さ
れた形態および標識されていない形態の両方で同時に存在するからである。この
検出器は、同位体の相対的存在量を、ただ正確に定量し得るべきである。
【０４４５】 いくつかの例において、検出器は、流れをモニターするため、および／または
画分が収集されるべき時を決定するために、最後のキャピラリーカラムの末端（
および／または他のカラムの間）に配置され得る。
【０４４６】 （Ｆ．例示的なシステム；代謝プロファイリング） 本発明の方法は、種々の異なる電気泳動方法に従う。制御された溶出技術（こ
の技術により、規定された画分は、空間的、物理的、または時間により分離され
る）、ならびに標識化方法および検出方法は、多数の異なる電気泳動技術におい
て利用され得る。上記のように、一連の連結された電気泳動方法の数は、代表的
には少なくとも２であるが、複数のさらなる電気泳動方法も含み得る。いくつか
の例では、この一連の方法における各電気泳動方法は、異なるが；特定の電気泳
動方法が異なるｐＨまたは分離マトリックス条件で繰り返される例もある。
【０４４７】 この方法の一般的な適用性にもかかわらず、上記のようなＣＩＥＦ、ＣＺＥお
よびＣＧＥ方法は、本発明の方法に従って利用され得る電気泳動方法の型の特定
の例である。特定の方法において、２つの方法のみが実行される。このような方
法の例としては、ＣＩＥＦが最初に、次いでＣＧＥが実行される方法が挙げられ
る。実行される場合、標識化は、代表的にはＣＧＥキャピラリーからの成分の溶
出後の検出を伴って、ＣＩＥＦの後に実行される。別のシステムでは、第１の方
法は、ＣＧＥであり、そして最後の方法が、ＣＺＥである。同位体検出は、一般
的には最後の電気泳動分離が完了するまで実行されない。しかし、上記で示した
ように、ＵＶ／ＶｉｓまたはＬＩＦ検出は、任意または全ての分離規模（ｄｉｍ
ｅｎｓｉｏｎｓ）を通して使用されて、分離の進行をモニターし得、特に画分が
収集されるべきときを決定し得る。第３の有用なアプローチは、複数のＣＺＥ規
模の実行を含む。これらは利用され得るシステムの特定の例であり；本発明は、
これらの特定のシステムに限定されないことが理解されるべきである。他の構成
およびシステムは、本明細書中に記載される技術およびアプローチを使用して開
発され得る。
【０４４８】 （ＶＩＩ．代謝プロファイルのための質量分析法） 荷電された分析物またはイオン化された分析物は、種々の質量分析方法により
検出され得る。特定の方法としては、飛行時間（ＴＯＦ）イオン検出と組合せた
、電子スプレー（ＥＳＩ）イオン化法およびマトリックス支援レーザー脱離イオ
ン化（ＭＡＬＤＩ）法が挙げられる。ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩは、低エネルギー
イオン化法であり、一般的に大部分の分析物の低いフラグメンテーションを生じ
、標的分析物の最も広範な可能なアレイのイオン化に適切であるため、好ましい
。ＴＯＦ検出は、質量を決定する際のこの技術の精度が、多価荷電種についてさ
え、単一原子質量単位レベルまで同位体の分析を一般的に可能にするので、有用
である。しかし、他の質量分析イオン化および検出技術は、分析物がフラグメン
テーションに対して特に丈夫（ｒｏｂｕｓｔ）である場合、標識された分析物と
標識されていない分析物との間の同位体差が、十分に大きい場合、および／また
は電荷状態の数が十分に低い場合には、標識された分析物および標識されていな
い分析物の分析を達成するために、有用に使用され得る。
【０４４９】 （ＶＩＩＩ．代謝プロファイルのための微小流体システム） （Ａ．構成の例） 以下に記載される電気泳動システムのバリエーションにおいて、キャピラリー
は、微小流体デバイスの一部であるか、または基板内に形成されて微小流体デバ
イスの一部を形成し、この微小流体システムを使用して、非常に小さいスケール
で、かつ最小量のサンプルのみが必要な場合に、本発明の分析を行い得る。これ
らの方法において、サンプルの物理的画分は典型的には収集されない。代わりに
、分割された成分が、空間的または時間により分離される。微小流体チャネルま
たはキャピラリーおよび種々の異なる設計内でサンプルを製造または移動させる
ための方法が考察されており、これらとしては，例えば、米国特許第５，８５８
，１８８号；同第５，９３５，４０１号；同第６，００７，６９０号；５，８７
６，６７５号；６，００１，２３１号；および同第５，９７６，３３６号（これ
らの全てはそれらの全体が参考として援用される）が挙げられる。
【０４５０】 本発明の方法と共に使用され得る一般的なシステム１５０の例は、図３Ａに示
される。キャピラリーまたはチャネルは、代表的には平坦な支持体または基板に
形成されるかエッチングされる。分離キャピラリー１５２は、アノード液を含む
アノードリザーバー１５４からカソードリザーバー１５６へ延びる。アノードリ
ザーバー１５４およびカソードリザーバー１５６は、それぞれアノードおよびカ
ソード１５８、１６０と電気接触している。サンプル注入チャネル１６２は、分
離キャピラリー１５２へほぼ垂直に延び、そして一方の端がアノードリザーバー
１５４のわずかに下流の注入部位１６４で交差する。サンプル注入キャピラリー
１６２の他方の端は、サンプルリザーバー１６６で終結し、このサンプルリザー
バー１６６は、サンプルリザーバー電極１６８と電気接触している。検出器１７
０は、分離キャピラリー１５２を通過する電気泳動媒体と流体連絡するように位
置付けられ、そしてサンプル注入部位１６４の下流で、かつ代表的にはカソード
リザーバー１５６のいくらか上流に位置付けられる。この特定の構成において、
画分はカソードリザーバー１５６へ抜き出される。種々のチャネルを通る電気泳
動媒体の移動は、１つ以上の電極１５８、１６０、１６８を介する電界の選択的
な印加により制御される。電極への電界の印加は、種々のキャピラリー内のＥＯ
Ｆの大きさを制御し、それにより種々のキャピラリーを通る流れを制御する。
【０４５１】 別の構成の例は図３Ｂに例示される。このシステム１８０は、図３Ａに示され
るシステムにおいて記載される要素を含む。しかし、この構成において、空間的
または時間的に分割された画分は、分離キャピラリー１５２に沿った複数の異な
る場所で、出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃを介して抜き出
され得る。これらのキャピラリーの各々は、それぞれ緩衝液リザーバー１７６ａ
、１７６ｂ、１７６ｃを含み、そしてそれぞれ電極１７４ａ、１７４ｂ、１７４
ｃと電気連絡している。電気泳動媒体の分離キャピラリー１５２に沿った移動お
よび画分の分離キャピラリーから出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１
７２ｃへの抜き出しは、分離キャピラリー１５２に沿ったどの電極を起動させる
か、およびどの出口キャピラリー電極を起動させるかを制御することにより、制
御され得る。あるいは、またはさらに、種々の微小流体弁が、流れを制御するた
めに出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃに位置付けられ得る。
代表的には、さらなる検出器が、種々の出口キャピラリー１７２ａ、１７２ｂお
よび１７２ｃににおいて、これらのキャピラリー内に引き込まれた画分中の成分
を検出するために位置付けられる。
【０４５２】 図３Ｂに示された構成は、多くの異なる適用において使用され得る。この型の
システムが適切である適用の一例は、試験されるサンプルの型が、十分に特徴付
けられている状況である。例えば、目的の成分の特定の画分が、以前に分離キャ
ピラリー１５２の特定の場所で分別されることが確立されている場合、出口キャ
ピラリー１７２ａ、１７２ｂおよび１７２ｃは、目的の成分の選択的除去を可能
にする場所に位置付けられ得る。
【０４５３】 なお別の構成において、複数の出口キャピラリーは、カソードリザーバー１５
６に近い分離キャピラリー１５２の末端から分岐し、抜き出しおよび輸送用の各
出口キャピラリーは、画分を分離する。この構成においてまた、分別された成分
の分離キャピラリーからの抜き出しは、種々のキャピラリー内のＥＯＦを調整す
ることにより、および／または微小流体弁により、制御され得る。
【０４５４】 電気泳動分析を行うために必要な他の構成要素は、支持体にエッチングされ得
、これらの構成要素としては、例えば、上記で考察されたリザーバー、検出器お
よび弁が挙げられる。
【０４５５】 （２．基板） 本発明の分析デバイスのキャピラリーまたは微小チャネルネットワークが上に
形成される基板は、広範な種々の材料（ケイ素、ガラス、溶融シリカ、結晶石英
、溶融石英および種々のプラスチックなどを含む）から製造され得る。このデバ
イスの他の構成要素（例えば、検出器および微小流体弁）は、このデバイスの特
定の用途、経済的な事柄、溶媒の適合性、光学的清澄性、機械的強度および他の
構造的な事柄に依存して、同じ材料または異なる材料から製造され得る。一般的
に、基板は、種々のチャネルを通るサンプルの動電学的輸送するために印加され
る比較的高い電界を可能にするために、非電導性材料から製造される。
【０４５６】 プラスチックのようなポリマー物質の場合、基板材料は、材料が意図される用
途に依存して、剛体、半剛体、または非剛体で有り得、不透明、半透明または透
明であり得る。本発明の電界に供された場合に低い表面電荷を有し、従って特に
有用であるプラスチックとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリカ
ーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンまたはスチレンコポリ
マー、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリスルホン
などが挙げられる。
【０４５７】 光学的または視覚的検出器を含むデバイスは、検出器による分離チャネル内の
成分の検出を容易にするために、一般的に、少なくとも部分的に透明な材料から
製造される。
【０４５８】 （２．チャネル構造／形成） 本発明のデバイスの基板に形成されるチャネルまたはキャピラリーのサイズお
よび形状は、本質的に任意の形状を有し得、これらとしては、半円形、円筒形、
長方形および台形が挙げられるが、これらに限定されない。チャネルの深さは変
化し得るが、約１０〜１００ミクロンになる傾向があり、そして最も代表的には
、約５０ミクロンである。チャネルは２０〜２００ミクロンの幅になる傾向があ
る。
【０４５９】 基板表面に形成されるチャネルおよび他の要素の製造は、当該分野で公知の任
意の数の製造技術により実行され得る。例えば、リソグラフィー技術は、例えば
、半導体製造産業において確立された方法を使用して、ガラスまたは石英の基板
の製造において使用され得る。フォトリソグラフィーマスキング、プラズマエッ
チングまたは湿性（ｗｅｔ）エッチング、および他の半導体処理技術は、基板表
面に、かつ基板表面上にミクロスケールの要素を生成するために利用され得る。
あるいは、微細加工方法（例えば、レーザードリル法、ミクロミリング法など）
が、利用され得る。プラスチックにチャネルおよび他の要素を調製するための製
造技術はまた、確立されている。これらの技術としては、射出成形技術、スタン
プ成形方法（例えば、ミクロスケール基板の大きなシートを生成するためにロー
リングスタンプを使用する）、ポリマーミクロ鋳造技術（ここで基板は微細加工
された鋳型内で重合される）が挙げられる。
【０４６０】 上記に記載されるこのような微小流体デバイスを使用するための他の設計およ
び方法に関するさらなる手引きは、例えば米国特許第５，８５８，１８８号；同
第５，９３５，４０１号；同第６，００７，６９０号；同第５，８７６，６７５
号；同第６，００１，２３１号；および同第５，９７６，３３６号（これらの全
てはそれらの全体が参考として援用される）に見出され得る。
【０４６１】 （ＩＸ．例示的な有用性） 本発明の方法および装置は、種々の異なる型の代謝化合物を分離および検出す
るために使用され得る。このような代謝化合物としては、タンパク質、核酸、多
糖類、脂質、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、単糖類および二
糖類が挙げられるが、これらに限定されない。結果として、これらの方法および
装置は、種々の代謝適用において使用され得る。例えば、これらの方法は、種々
の代謝産物のフラックスを決定するために使用され得る。この能力は、生化学に
おいて、特に代謝産物のフラックスが、異なる細胞状態の関数として、または種
々の外部刺激に応答してどのように変化するかを決定する際に、代謝の研究にお
いて使用され得る。これらの方法は、種々の代謝産物のフラックス速度が、健康
状態と疾患状態との間でどのように変化し得るかを決定することにより、臨床的
研究において価値がある。
【０４６２】 より詳細には、本発明は、メトミクス（ｍｅｔｏｍｉｃ）データベースを開発
するために使用され得る。このようなデータベースとしては、例えば、被験体の
特定の状態または生理学的状態について検出された種々の代謝産物のレジスター
が挙げられ得る。このデータベースは、被験体および／または代謝産物に関する
さらなる情報と相互参照され得る。例えば、被験体に関して、データベースは、
属、種、年齢、種族、性別、環境の曝露条件、健康状態、サンプル収集方法論お
よびサンプルの型に関する情報を含み得る。フラックス値は、データベース中に
格納される各々の代謝産物について含まれ得、そして代謝産物濃度値、代謝フラ
ックスの原因である酵素または輸送タンパク質濃度値、または代謝フラックスの
原因であるタンパク質に対応する遺伝子発現値とともに、他所参照され得る。
【０４６３】 複数の分析物のフラックスが、全体の細胞代謝の分離可能な成分を表すと決定
される場合、被験体の代謝フィンガープリントが得られ得る。全体の代謝の分離
可能な成分に由来する分析物は、一連の酵素的変換段階により十分に分離される
化合物として、機能的に規定される。任意の単一の基質により導入される同位体
富化は、分析物中の同位体の天然存在比より上には検出され得ず、その結果、第
２の基質が、フラックスを測定するために導入されなければならない。一般的に
、この機能的基準は、標的分析物が５つ以上の変換段階で加えられた基質から除
去される場合に満たされる。例えば、標識されたグルコースの基質としての投与
は、糖分解経路におけるいくつかのリン糖質のフラックスの決定に適切である。
しかし、このような投与は、一般的には、これらの標的分析物から基質を分離す
る多数の変換段階のために、アミノ酸、脂肪酸、およびタンパク質中の13Ｃの相
対的存在量を上昇させるには十分ではない。このような例において、同位体で標
識されたアミノ酸の投与は、アミノ酸およびタンパク質のフラックスを決定する
ために使用され得；同位体で標識された脂肪酸またはアセテートの投与は、脂肪
酸の代謝フラックスを決定するために使用され得る。
【０４６４】 特定の方法において、複数の代謝で分離可能な基質は、被験体に同時に投与さ
れ得、そして複数の代謝で分離可能な標的分析物は、所定の時間後に被験体から
得られた単一のサンプルから検出され得る。このような方法のバリエーションに
おいて、代謝で分離可能な基質の各々は、異なる安定同位体で標識され得る。例
えば、［18Ｏ］−グルコース、［15Ｎ］−フェニルアラニン、および［13Ｃ］−
アセテートは、糖分解代謝経路、アミノ酸代謝経路、および脂肪酸代謝経路にお
ける標的分析物フラックスを決定するために、被験体に同時に投与され得る。
【０４６５】 本発明は、種々のスクリーニング適用において利用され得る。例えば、本発明
の装置および方法は、特定の細胞状態（例えば、特定の疾患）と相関する代謝産
物を同定するために使用され得る。例えば、これらの方法は、濃度またはフラッ
クスが、健康な個体または細胞と疾患個体または細胞との間で変化する代謝産物
を同定するために利用され得る。従って、このような代謝産物の濃度およびフラ
ックスの制御の原因である酵素は、例えば薬物治療のための潜在的な標的として
同定される。同様の様式で、特定の方法は、毒物学の研究を行うために使用され
て、どの代謝産物が毒物攻撃により影響されるか、従ってどの酵素が代謝産物の
形成を制御するかを同定し得る。
【０４６６】 代謝産物と特定の細胞状態を相関させるスクリーニング方法は、以下に述べる
一般的な分析方法と類似である。例えば、安定同位体で標識された基質は、疾患
を有する試験被験体に投与され、そして少なくとも部分的にその試験被験体によ
って代謝される。次いで、一般的に、目的の標的分析物を部分的または全体的に
、サンプル中の他の成分から、上記に記載したような種々の分離技術を利用する
評価の下で分離する。標的分析物中の同位体の相対的存在量は、試験被験体中の
標的分析物の各々についてのフラックス値を決定するために、異なる同位体を検
出し得る方法を使用して決定される。次いで、これらの決定された値は、非疾患
状態におけるフラックス値についての参照として役立つコントロールについての
対応するフラックス値と比較される。
【０４６７】 コントロールは、同様の条件下で決定されたコントロール被験体（すなわち疾
患を有さない被験体）についての値（例えば、平均値（ａｖｅｒａｇｅ ｏｒ
ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ））であり得る。あるいは、コントロールは、以前に非疾
患状態を代表することが確立された値の範囲であり得る。試験フラックス値とコ
ントロールフラックス値との間の差（例えば、統計学的に有意な差）は、特定の
代謝産物が、疾患と相関するということを示す。このように、代謝産物は、疾患
についての「マーカー」または潜在的なマーカーである。コントロール被験体に
ついてのフラックス値は、以前に同様の条件下で試験被験体に対して得られたデ
ータであり得るか、またはフラックス値は、同一の条件下で試験被検体と同時に
処置を受けるコントロール被験体について決定され得る。
【０４６８】 当然のことながら、類似のスクリーニング方法は、特定の代謝産物と疾患状態
以外の細胞状態との間の相関を生じさせるために実行され得る。例えば、方法は
、特定の発症段階、特定の環境刺激に曝露されて生じた状態、および特定の治療
的処置に関連する状態と相関する代謝産物を同定するために実行され得る。
【０４６９】 疾患被験体とコントロール被験体との間のフラックス値において統計学的に有
意な差を有するとみなされた複数の代謝産物（すなわち、マーカー）は、「代謝
フラックスフィンガープリント」または単に疾患についての「フィンガープリン
ト」を開発するために使用され得る。このようなフィンガープリントは、続いて
疾患を診断するために使用され得る（以下を参照のこと）。代表的には、このよ
うなフィンガープリントは、疾患に相関することが見出された少なくとも２、３
、４、または５種の代謝産物を含む。他の例において、フィンガープリントは、
少なくとも６、７、８、９、または１０種のこのような代謝産物を含み、そして
なお他の例においては、１０、１５、または２０種以上のこのような代謝産物を
含む。
【０４７０】 比較研究からの結果は、種々の診断的適用に移行可能である。例えば、「マー
カー」または「フィンガープリント」は、被験体が特定の疾患を有するか、また
は疾患にかかりやすいか否かを決定するために、被験体をスクリーニングするか
、診断するために使用され得る。同位体で標識された基質が、疾患を有するか、
または疾患にかかり易いと疑われる被験体（あるいは、疾患を有するか、または
疾患にかかり易いか否かを決定することの探求に単に興味のある個体）に投与さ
れることを除いて、この方法は、上記に記載される方法と一致する。次いで、試
験分析物についてのフラックス値（すなわち、試験被験体についての「代謝プロ
ファイル」は、個々の試験分析物についての参照フラックス値（マーカー）また
はマーカーの集合（フィンガープリント）と比較される。
【０４７１】 決定された値と比較される参照値は、健康状態または疾患状態のいずれかを表
し得る。さらに、参照値は、健康状態または疾患状態のいずれかと相関する特定
の値か、または値の範囲であり得る。例えば、この参照は、コントロール被験体
または疾患を有するかもしくは有さない被験体についての値（例えば、平均値（
ａｖｅｒａｇｅ ｏｒ ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ））であり得、参照値は、試験被
験体が試験された条件と同様の条件下で決定される。あるいは、参照は、疾患を
有するかまたは有さないかのいずれかであるコントロール被験体の集合から得た
値の範囲であり得る。
【０４７２】 参照が正常または健康な状態である場合、試験被験体と参照との間のフラック
ス値の差（例えば統計的に有意な差）は、試験被験体が、疾患を有するか、また
は疾患を獲得する危険性があるということを示す。あるいは、差が無いことは、
試験被験体が疾患を有さないか、および／または疾患を獲得する危険が無いこと
を示す。しかし、参照が疾患状態を表す場合、試験値と参照値との間の差（例え
ば、統計学的に有意な差）は、試験被験体が疾患を有さないか、および／または
疾患を獲得する危険のないことを示す。逆に、示唆の無いことにより、試験被験
体が疾患を有するか、疾患を獲得し易いということのいずれかが示される。
【０４７３】 診断的スクリーニングは、単に疾患状態を検出することに限定されない。スク
リーニングはまた、例えば特定の発症状態または毒性状態のような細胞状態の他
の型を検出するために使用され得る。
【０４７４】 このようなスクリーニング試験を実行する場合、代表的には分析は単純化され
得る。例えば、一旦疾患についてのマーカーが同定されると、目的のマーカーを
含む画分が既知であるような分離条件を確立し得る。従って、スクリーニング試
験の間、特定の画分中の成分のみが評価される必要がある。本発明の分離および
検出の局面の再現性は、このような分析を容易にする。
【０４７５】 このようなスクリーニング方法は、種々の異なる疾患について行われ得る。本
発明の方法で評価され得る疾患としては、種種の型の癌、自閉症、微生物感染お
よびウイルス感染、および種々の消化疾患が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０４７６】 本発明の方法は、構造活性研究を行う際にさらなる有用性を有する。例えば、
これらの方法は、特定の化学的薬剤または薬剤の組み合わせが一般的に代謝に対
して有する効果、より詳細には、目的の特定の代謝産物のフラックスに対する効
果を決定するために使用され得る。このような試験は、代謝を妨害する薬剤を同
定し得、もたらされた特定の代謝を正確に指し示す。他の適用において、一旦薬
剤が最初に試験されると、薬剤または薬剤の組合せが、改変され得、そして存在
するならば改変が代謝にもたらす効果を決定するために分析が繰り返される。こ
のような研究は、例えば、最初の薬物スクリーニング試験の間に同定されたリー
ド化合物の誘導体を作製する際に有用であり得る。
【０４７７】 代謝工学研究はまた、本発明の方法を使用して行なわれ得る。このような研究
において、代謝に関与する遺伝子は、特定の所望の変異を含むように遺伝的に処
理され得るか、または遺伝子のプロモーターは、この遺伝子の相対的な発現レベ
ルを増加させるかまたは減少させるように遺伝子的に処理され得る。本明細書中
に記載される方法を使用して、存在するならば、何が試験被験体の代謝に対して
遺伝的に処理された変化をもたらすのかを決定し得る。
【０４７８】 （タンパク質発現フィンガープリントおよび／または代謝プロファイルフィン
ガープリントデータを含むバイオインフォマティクスデータベース） （概観） 本発明は、サンプル中に存在する分子種に対する情報を与える有効な分析方法
、それらの独特な識別子特性（例えば、アミノ酸配列タグ（ＰＳＴ）；分離座標
など）を提供し、そしてさらに複数の前述の分子種の定量的測定を提供し得る。
この有効な分析ツールは、サンプル中の複数の分子種の相対的または絶対的な存
在量を、さらなるデータと相関させる可能性を提供し、例えば、サンプルが由来
する患者の医療情報が得られ、または新規な薬物および毒物を同定しようとする
研究において、本発明が使用される場合に、生物学的情報および生化学的情報が
得られる。
【０４７９】 ある局面において、本発明は、細胞集団またはタンパク質を含むサンプル（そ
の抽出物を含む）からのタンパク質発現プロファイリング方法を提供する。この
方法は、以下の工程を包含する：細胞集団から得られた複数のタンパク質種を含
む溶液を第１のキャピラリー電気泳動装置において電気泳動し、それによってタ
ンパク質種を区別する少なくとも１つの第１の生物物理学的パラメーターに基づ
いてこのタンパク質種を分離する工程、この第１の電気泳動装置からの画分を溶
出し、そしてこの画分を第２のキャピラリー電気泳動装置において別々に電気泳
動し、それによってタンパク質種を区別する少なくとも１つの第２の生物物理学
的パラメーターに基づいてこのタンパク質種を分離する工程、およびこのタンパ
ク質種を溶出し、そして質量分析フラグメンテーションによりサンプルからの複
数のタンパク質種のＰＳＴを同定する工程。ある実施形態において、サンプルか
ら分離された少なくとも１，０００のタンパク質がＰＳＴ決定により同定される
；ある実施形態において、サンプルから分離された少なくとも５，０００〜７，
５００以上のタンパク質がＰＳＴ決定により同定される。バリエーションでは、
２つのサンプル、すなわち、標準的（コントロールまたは正常）細胞集団由来の
第１のサンプルおよび試験細胞集団由来の第２のサンプルが使用され；試験細胞
集団は、例えば、標準的な細胞集団とは異なる組織学的型の細胞、標準的な細胞
と同じ組織学的型の病的細胞、毒物学的または薬理学的薬剤に曝されているが、
標準的な細胞と同じ組織学的型である処理された細胞、標準的な細胞とは異なる
継代レベルまたは年齢または複製能力の細胞、あるいは第１の細胞サンプルと第
２の細胞サンプルとの間のタンパク質発現プロフィール差を確かめるために調査
している当業者に明らかな任意の他の改変体であり得るが、これらに限定されな
い。あるいは、複数の非タンパク質代謝産物は、タンパク質発現フィンガープリ
ントを確認するとともに、または別々にのいずれかで本発明の方法に従ってプロ
フィールが得られ得る。
【０４８０】 ある局面において、本発明は、細胞集団、または代謝産物を含むその抽出物を
含むサンプルから代謝産物のプロファイリング方法を提供する。この方法は、以
下を包含する：細胞集団または非細胞サンプルからから得た複数の代謝産物種を
含む溶液を第１の装置において分離し、それによって少なくとも１つの第１の生
物物理学的パラメーターに基づいて、この代謝産物種を分離する工程、ならびに
質量分析フラグメンテーションによりこのサンプル由来の複数の代謝産物種の第
１の装置における分離に基づいて、独特の質量サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）お
よび／または分離座標を同定する工程。ある実施形態において、サンプルから分
離された少なくとも５つの代謝産物が、質量サインおよび／または分離座標決定
により同定される；ある実施形態において、サンプルから分離された少なくとも
７〜５００以上の代謝産物が質量分析決定により同定される。バリエーションに
おいて、２つのサンプル、すなわち、標準的な（コントロールまたは正常）細胞
集団由来の第１のサンプルおよび試験細胞集団由来の第２のサンプルが使用され
；試験細胞集団は、例えば、標準的な細胞集団とは異なる組織学的型の細胞、標
準的な細胞と同じ組織学的型の病的細胞、毒物学的または薬理学的薬剤に曝され
ているが、標準的な細胞と同じ組織学的型である処理された細胞、標準的な細胞
とは異なる継代レベルまたは年齢または複製能力の細胞、あるいは第１の細胞サ
ンプルと第２の細胞サンプルとの間の代謝産物発現プロフィール差を確かめるた
めに調査している当業者に明らかな任意の他の改変体であり得るが、これらに限
定されない。複数の非タンパク質代謝産物は、タンパク質発現フィンガープリン
トを確認するとともに、または別々にのいずれかで本発明の方法に従ってプロフ
ィールが得られ得る。
【０４８１】 （データベースシステムおよび計算されたデータ分析および検索（ｒｅｔｒｅ
ｉｖａｌ）システム） 本発明は、一般に、生物学的情報を格納し、そして検索するための関連するデ
ータベースに関する。より詳細には、本発明は、クライアント−サーバー環境で
の検索を可能にする関連フォーマット（ｒｅｌａｔｉｏｎ ｆｏｒｍａｔ）にお
ける生物学的分子（例えば、タンパク質）の独特の識別子データ（例えば、配列
）、独特に識別可能な生物学的巨大分子（例えば、コードされたｍＲＮＡ種を含
む）の相対量または絶対量に関する量的情報、ならびに必要に応じて多くの他の
型のデータ（例えば、医学的記録情報、差次的診断（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）および／または予測情報）を提供するためのシステムお
よび情報に関する。情報科学（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）は、情報管理に対する
コンピューターの研究および適用ならびに統計技術である。ゲノムプロジェクト
において、生物情報科学は、データベースを迅速に検索するため、核酸配列情報
を分析するため、およびＤＮＡ配列データからタンパク質配列、構造および機能
を推定するための方法の開発を含む。プロテオミクスプロジェクトにおいて、こ
れは、タンパク質発現プロフィールを提供するために、独特の識別子情報と構造
情報との相関を含み得、そして他のデータ（例えば、医学的データなど）と相互
に表にした場合、細胞または生物における特定のタンパク質およびそれらのコー
ドされている遺伝子の機能に見識を提供し得る。
【０４８２】 本発明は、配列データの供給源および解釈を詳述する生物学的注釈とともに、
生体分子独特の識別子情報を格納および分析するための関連データベースシステ
ムを提供する。本発明は、薬物開発および他の研究および開発目的のための強力
なデータベースツール、ならびにヒト疾患を診断および処置するための深くかつ
強力なツールを提供する。
【０４８３】 本発明はまた、１つ以上の生物型、細胞型、医学的サンプルについてのタンパ
ク質発現フィンガープリントライブラリーを含むデータベースを含むコンピュー
ターシステムを提供し、これらのライブラリーは、独特に識別された種について
の量的情報および／または量的情報（例えば、ある条件下での分離座標の変更）
に対して相互リンクされた複数の独特のタンパク質識別子フィールドを有する記
録を有する。このシステムはまた、１つ以上のタンパク質タグ（ＰＳＴ）配列と
ゲノムライブラリーにおけるコードポリヌクレオチド配列からの推定アミノ酸配
列との間の相同性適合を決定し、そしてこの決定の結果を表示する際に使用する
ための１つ以上のプローブ配列の選択を受け入れ得るユーザーインターフェース
を含む。
【０４８４】 生物、細胞または病的状態の１つ以上の型についてのタンパク質発現フィンガ
ープリントライブラリーを含むデータベースに関連して、具現化されたコンピュ
ーター読みとり可能なプログラムコードを有するコンピューター使用可能な媒体
を含むコンピュータープログラム製品もまた提供される。このライブラリーは、
複数のタンパク質発現フィンガープリント記録を有し、この記録は、ナビゲーシ
ョン用フィールドとして働き、そしてデータ相関および他の関連を識別するため
に使用され得る情報フィールドにリンクしている。コンピュータープログラム製
品が、コンピューターシステム内で、比較のために２つ以上のタンパク質発現フ
ィンガープリント記録の選択を受け入れ、翻訳後修飾および／または各フィンガ
ープリント記録において独特に同定され、そして比較される記録のセットに共通
するか、または独特なタンパク質種の相対量もしくは絶対量の変化を決定し、な
らびに決定の結果を表示するためのインターフェースを提供するためのコンピュ
ーター読みとり可能なプログラムコードを含む。
【０４８５】 １つ以上の型の生物、組織、細胞型または病的状態についてのタンパク質発現
フィンガープリント記録ライブラリーを含むデータベースに関連して、具現化さ
れたコンピューター読みとり可能なプログラムコードを有するコンピューター使
用可能な媒体を含むコンピュータープログラム製品がさらに提供される。このコ
ンピュータープログラム製品は、コンピューターシステム内でデータベースに対
する問い合わせを入力し、そして問い合わせ結果の出力を得るためのインターフ
ェースを提供するためのコンピューター読みとり可能なプログラムコードを含む
。
【０４８６】 （データベース構造） 本発明の方法により得られたタンパク質発現フィンガープリントに関して、初
めに記載するが、関連データベースシステム構造は、代謝産物プロフィールフィ
ンガープリント記録を含むデータベースを含むように、またはこのようなデータ
ベースと別々に存在するように容易に改変され得る。
【０４８７】 タンパク質発現フィンガープリント記録は、ナビゲーション用フィールドおよ
び情報フィールドを含み、好ましくは、複数の情報フィールドを含み、そして好
ましくは複数のナビゲーション用フィールドを含み、各々は、記録が１つ以上の
情報フィールドにリンクしている。例えば（限定ではない）、ナビゲーション用
フィールドは、独特のアミノ酸配列タグ（ＰＳＴ）、分離座標、または両方の組
合わせを含み得、この組合わせは、種々の様式で表示され得る。このうちの１つ
は、当業者の裁量で選択され得る任意の多くの他の代替物の中で、分離座標のバ
イナリビットストリング表示に対して独特なＰＳＴサイン配列を追加している、
連結されたバイナリビットストリングである。サンプル中で検出される各タンパ
ク質種については、少なくとも１つの独特な識別子属性は、ナビゲーション用フ
ィールドを含む。例えば（限定ではない）、情報フィールドは、それぞれのナビ
ゲーション用フィールド要素（すなわち、独特に識別されたタンパク質種）に関
連する任意の種々の他の情報を含み得る。このような情報としては、サンプルが
得られた患者についての情報、サンプルについての情報、サンプル中に存在する
独特に識別されたタンパク質種の相対量または絶対量（種々のアイソフォーム、
翻訳後修飾の比を含む）についての情報などが挙げられる。代表的なタンパク質
発現フィンガープリント記録は、サンプルからのデータを表示し、そして２５〜
１００以上の独特に識別されたナビゲーション用フィールドを含み得、各々は、
１つ以上の情報フィールド（しばしば、サンプル中の特定のタンパク質種の相対
量を含む）に対して相互に表にされる。タンパク質発現フィンガープリント記録
のライブラリーにおいて、このライブラリーのメンバーは、複数の共通ナビゲー
ション用フィールド（例えば、独特のタンパク質＃１００および独特のタンパク
質＃１０１）を共有する。その結果、共通のフィールドにまたがってライブラリ
ーのメンバーを比較し、そして／またはメンバーの間で、共通のナビゲーション
用フィールドの存在を識別しかつ重みづけ（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）するためのソ
フトウェアが実行され、そしてライブラリーのメンバー間の統計学的に有意な関
係の計算および相関尺度が実行され得る（ユーザーがデータベースに入力した問
い合わせを介するか、またはデータフィールド間、もしくはデータフィールドの
組合わせおよび部分組合わせ（ｓｕｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）間の内因的な関
係を識別し、かつ重みづけするために訓練されたニューラルネットワークプログ
ラムを介して自動的にかのいずれか）。ナビゲーション用フィールドとしてタン
パク質種各々の独特の識別子を使用することはしばしば好ましい。その結果、タ
ンパク質発現フィンガープリント記録における全ての独特の識別子の組合わせは
、各独特のタンパク質識別子ナビゲーションフィールドにリンクした情報フィー
ルド間の相関を検索するために、そして類似のスコアに基づいたセットにおける
記録をランク順にするために、記録間で比較されるナビゲーション用フィールド
のセットを含み得る。このスコアは、ユーザーがプログラムしたいと望む、すな
わち、ユーザーが望めば、標準的なセットのデータを用いてニューラルネットワ
ークを訓練したいと望む任意の適切な比較アルゴリズムを用いて（例えば、同じ
または類似の表現型を有する所定のコントロールおよび所定の改変体からのタン
パク質発現フィンガープリント記録を用いてバックプロパゲーションまたは他の
訓練ストラテジーにより）計算して、ユーザーが望む予測精度を提供する出力を
提供するそれらのフィールド比較重みづけを反映する。
【０４８８】 例示的な実施形態において、コンピューターシステムにおけるタンパク質発現
フィンガープリント記録データベースは、サンプルにおける整数または浮動小数
点値（絶対量または相対量を表示する）を含む情報フィールドに関連してリンク
しているバイナリストリングとして表示された（関連してリンクしたＰＳＴ識別
子により表示された）独特のＰＳＴを含むナビゲーション用フィールドを含む。
各タンパク質発現フィンガープリント記録は、各独特のＰＳＴについての量また
は分離座標情報に関連している複数の情報フィールドを含み得、そしてさらにタ
ンパク質発現フィンガープリント記録自体、サンプル、患者、状態もしくは処置
に関するデータに関連しているさらなる情報フィールドにリンクされ得る。
【０４８９】 他のデータベース構造および問い合わせ方法論が本明細書を読んだ当業者に明
らかである。
【０４９０】 上記の説明は、例示であって限定ではないと意図されることが理解されるべき
である。上記の説明を読むと、当業者には多くの実施形態が明らかである。従っ
て、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではなく、添付の特
許請求の範囲により含まれる等価物の全範囲に沿って、このような特許請求の範
囲を参照して決定されることが意図されるべきである。全論文および参考文献（
特許出願および刊行物を含む）の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０４９１】 以下の実施例は、例示のために提供され、本願発明を制限するためには提供さ
れない。
【０４９２】 （実験的実施例） （実施例１：非標識タンパク質のｃＺＥ分離） ５つのタンパク質の各々（表２を参照のこと）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
から得、そして水性変性サンプル緩衝液（２５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタンホスフェート（ｐＨ４．０）、０．５％重量％のＩＧＥＰＡＬ
ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ＃Ｉ３０２１から得た）お
よび１重量％のトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）ヒドロクロリド（Ｐ
ｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃２０４９０ＺＺから得た）を含有する）中に５ｍｇ／ｍｌ
で懸濁した。タンパク質サンプルを９５℃で１５分間加熱することによりこのサ
ンプル緩衝液中で変性させた。５つの変性タンパク質サンプルの各々を、ｃＺＥ
サンプル緩衝液に希釈して、２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
ホスフェート緩衝液（ｐＨ４．０）、８Ｍ尿素、および５つのタンパク質の各々
について最終濃度が０．２ｍｇ／ｍｌからなる最終溶液を作製した。各変性タン
パク質のコントロールサンプルもまた調製した（同じサンプル緩衝液で０．５ｍ
ｇ／ｍｌの最終濃度で別々に）。
【０４９３】
【表２】 混合したタンパク質サンプルおよび各々のコントロールサンプルを、６０ｃｍ
×７０μｍの石英硝子キャピラリー（ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｃａｐｉｌｌ
ａｒｙ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）においてｃＺＥで泳動させた。８
００μｍの検出ウィンドウをキャピラリーのカソード端から５０ｃｍに配置した
。１６０ｎｌのサンプル容量をカソード端に圧入（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎｊｅ
ｃｔ）し、そして２５ｍＭ ＴＲＩＳ−リン酸および８Ｍ 尿素泳動溶液（ｐＨ
４．０）中５００Ｖ／ｃｍで分離を行った。タンパク質検出を２１４ｎｍのＵＶ
吸収により行った。
【０４９４】 個々の非標識タンパク質は、これらの条件下では分離しなかった（図４を参照
のこと）。各タンパク質の電気泳動易動度を、個々のタンパク質コントロールの
反復泳動から決定し（図５）、そしてｐＨ４．０でのタンパク質の電荷比に対し
て推定質量を相関させた（図６）。非標識タンパク質の各々についての質量対電
荷の比は、その全体が参考として援用されるＣａｎｔｅｒ，Ｃ．Ｒ．およびＳｃ
ｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．
Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）により記
載される様式で、Ｇｅｎｂａｎｋを通じて得た公開されたタンパク質配列から決
定した。
【０４９５】 （実施例２：標識タンパク質のｃＺＥ分離） 実施例１に記載の５つのタンパク質の各々を、等しい質量のドデシル硫酸ナト
リウムをＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０の代わりに使用したことを用いて、実施例
１に記載の同じ変性緩衝液中に、１０ｍｇ／ｍｌで懸濁した。変性タンパク質サ
ンプルを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｔ＃８５，７８２−３）から得た
４−スルホフェニルイソチオシアネート（ＳＰＩＴＣ）で標識し、供給時に使用
した。１０μｌのトリエチルアミン、１０μｌの２Ｍ酢酸および２０μｌの１０
重量％ＳＰＩＴＣ水溶液を１００μｌの各変性タンパク質サンプルに添加するこ
とにより標識を行った。反応混合物を、５０℃で２４時間加熱した。
【０４９６】 ５０μｌ量のＳＰＩＴＣ標識タンパク質標準物質の各々をともに混合し、そし
て分離緩衝液のｐＨを３．０に調節したことを除いて、実施例１に記載のように
ｃＺＥで分離した。個々のＳＰＩＴＣ標識タンパク質を分離した（図７）。従っ
て、本実施例（非標識タンパク質があまり分離しなかった実施例１の結果を考慮
して行った）は、ｃＺＥ分離の前に行った場合に標識が有し得るポジティブな効
果を実証する。電気的溶出により、示された時間の分離緩衝液を有する別のバイ
アルに画分を集めた。ＳＰＩＴＣ標識タンパク質の正体を、画分のその後のｃＧ
Ｅ分析により決定した。
【０４９７】 （実施例３：画分収集によるＣＩＥＦ １次元分離） ウシ血清アルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、およびコナルブミンをＳ
ｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（表２）から与えたように使用した。各タンパク質を
実施例１に記載のように変性させた。各変性タンパク質サンプルの１０μｌのア
リコートを２００μｌのｃＩＥＦ集束緩衝液に添加した。ｃＩＥＦ集束緩衝液は
、１容量％のｐＨ３〜１０ 両性電解質（Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ＃１００４３）お
よび１重量％の３−［（３−コルアミドプロピル（ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐ
ｙｌ））ジメチルアンモニオ（ｄｉｍｅｔｈｌａｍｍｏｎｉｏ）］−１−プロパ
ンスルホネートを含有する０．４重量％のヒドロキシメチルセルロース溶液（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ｅＣＡＰ ｃＩＥＦゲル緩衝液、Ｃａｔ＃４７
７４９７）からなっていた。
【０４９８】 ポリ（エチレングリコール）でコーティングした６０ｃｍ長、１００μｍ内径
の石英硝子キャピラリー（Ｓｕｐｅｌｃｏｗａｘ １０，Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｃａ
ｔ＃２５０２５−Ｕ）に、集束緩衝液中のタンパク質サンプルを充填した。キャ
ピラリー内容物は、５００Ｖ／ｃｍおよび２５℃で７．５分の間、１０ｍＭ リ
ン酸と２０ｍＭ ＮａＯＨリザーバとの間に集束した。次いで、０．５ｐｓｉの
圧力勾配をアノード液リザーバとカソード液リザーバとの間に付与して、電気浸
透流の方向に、集束したタンパク質の溶出を促進した。
【０４９９】 タンパク質ピークは、低ｐＨ端から５０ｃｍに配置したキャピラリーの光学ウ
ィンドウを通して、２１４ｎｍの紫外線吸収をモニターすることにより検出した
。キャピラリーを通る電流もまたモニターした（図８）。画分（Ｂ〜Ｇ）を、示
された時間につき、別々のリザーババイアルに含まれる５０μｌの２０ｍＭ Ｎ
ａＯＨへ収集した（図８）。ＦおよびＧ画分のみがタンパク質を含んでいること
が分かった（実施例４を参照のこと）。画分Ｇは、カルボニックアンヒドラーゼ
を含み、そしてコナルブミンもウシ血清アルブミンも含まないことが分かった。
コナルブミンおよびウシ血清アルブミンは画分Ｆで観察されたピークに同時に溶
出することが分かった。この実験により、１つの次元でのタンパク質混合物の部
分的分離が示される。さらなる分離を第２の次元で達成した（実施例４を参照の
こと）。
【０５００】 （実施例４：ＣＩＥＦ画分のＣＧＥ第２次元分離） 実施例３に記載のＣＩＥＦ分離の間に収集したＣＩＥＦ画分（Ｂ〜Ｇ）の各々
を、最終容量５μｌまでＳａｖａｎｔ Ｍｏｄｅｌ ＳＣ２１０Ａ Ｓｐｉｎ−
Ｖａｐでエバポレートして、画分中に存在する任意のタンパク質を濃縮した。１
０μｌ量のＳＤＳサンプル緩衝液を各タンパク質濃縮物に添加した。ＳＤＳサン
プル緩衝液は、１００μｌのｅＣＡＰ ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｔ＃２４１５２５）、１０μｌのｅＣＡＰ オレンジＧ
参照マーカー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｔ＃２４１５２４）お
よび９０μｌの無水グリセロールからなっていた。
【０５０１】 次いで、各サンプルを直鎖状ポリ（アクリルアミド）でコーティングした石英
硝子キャピラリー（６０ｃｍ長および１００μｍ内径）を用いてｃＧＥモードで
泳動した。ｅＣＡＰ ＳＤＳ１４−２００ゲル緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕ
ｌｔｅｒ Ｃａｔ＃４７７４１６）を分離のためにおよび両方のリザーバにおい
て用いた。分離を２０℃および５００Ｖ／ｃｍで５０分間行った。タンパク質の
紫外線検出をキャピラリーのサンプル注入端から５０ｃｍに配置した光学ウィン
ドウを通して２１４ｎｍで行った。ｅＣＡＰ ＭＷ標準物質（Ｂｅｃｋｍａｎ−
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃａｔ＃４７７４１８）を製造業者による記載のように用いて
、別の泳動で分子量較正を行った。０．５ｐｓｉで１００秒のサンプル注入を用
いて各サンプルをキャピラリーにロードした。
【０５０２】 得られた電気泳動図は、画分Ｆ（図９）およびＧ（図１０）を除いて任意のｃ
ＩＥＦ画分においてタンパク質が検出できないことを示した。画分Ｆ（図９）に
おいて見られた２つのタンパク質の分子量は、ウシ血清アルブミンおよびコナル
ブミンの分子量（表２）に対応していた。画分Ｇ（図１０）において見られたタ
ンパク質の分子量は、カルボニックアンヒドラーゼの分子量（表１）に対応して
いた。コナルブミンからウシ血清アルブミンを完全に分離するために第２のｃＧ
Ｅ次元が必要であることが観察された。コナルブミンは１回のｃＩＥＦモードで
は、分離されなかった（実施例３）。
【０５０３】 （実施例５：健常組織と癌組織とを区別するためのプロテオミクス分析におけ
る方法の使用） 本実施例は、健常組織と癌組織を区別するために本発明を使用することを示す
。本発明は、健常組織および癌組織および転移組織のタンパク質発現パターンを
直接分析して、遺伝子発現のパターン、ならびに癌（例えば、前立腺、胸部、結
腸および皮膚）の発生、段階分けおよび転移の種々の局面に対するこのような関
連を解釈するために使用され得る。
【０５０４】 本発明の方法は、疾患の機構の機能的ゲノム分析を行うために必要な時間を顕
著に減少させ得、そして新たな治療標的、診断マーカー、および薬物産物（すな
わち、特定の細胞タンパク質が、それ自体治療薬剤として働き得る場合）の同定
を導き得る。プロテオミクス分析を用いることにより、調査されなければならな
い遺伝子の数を１０分の１に（標的組織におけるタンパク質を形成するために実
際に発現されている５０，０００〜１５０，０００のヒト遺伝子を２，０００〜
１０，０００の遺伝子に）減少する。健常組織および疾患組織のタンパク質発現
パターンの定量的比較を通じて、疾患の進行において役割を果たし得る候補遺伝
子の数を、約１００分の１にさらに減少する。最終的にタンパク質配列タグ（Ｐ
ＴＳ；すなわち、部分的アミノ酸配列）の引き続く生成を通じて、差次的発現を
示すタンパク質の各々を、それらが完全な配列決定のためにゲノムに戻ることが
可能な様式で、独特に同定し得る（例えば、変異検出）。
【０５０５】 最初に、組織サンプルを疾患に罹った被験体およびコントロール被験体（例え
ば、研究される特定の癌組織を有することが分かっていない個体）から得る。各
個体由来の組織サンプルを公知の方法に従ってホモジナイズする。サンプルに依
存して、得られるホモジネートを濾過するか、または遠心分離して、細胞細片を
除去する。尿素（６〜８Ｍ）、界面活性剤（例えば、１重量％のドデシル硫酸ナ
トリウム）および１重量％のジチオスレイトールを含むようにサンプルを調節す
ることにより、サンプルを変性したホモジネートおよびホモジネート中のタンパ
ク質から得る。サンプルを９５℃で１５分間加熱して、変性を早める。
【０５０６】 次いで、サンプル（５μｌ）をカラム（７５ミクロン内径、６０ｃｍ長）上で
ＣＩＥＦにより電気泳動する。アノード液は最初１０ｍＭリン酸であり、カソー
ド液は最初２０ｍＭ 水酸化ナトリウムである。５００Ｖ／ｃｍで分離を行う。
分離したタンパク質の画分をカソード溶液の塩化ナトリウム濃度を９６増分単位
で１０ｍＭから１００ｍＭに増加させることにより溶出する。９６ウェルプレー
トのウェルに含まれる２００μｌのカソード溶液中の各塩濃度に、キャピラリー
の高ｐＨ端を連続的に挿入することにより、画分を収集する。キャピラリー端を
次の画分に移動させる前に、分離電流を再平衡化させる。
【０５０７】 標識の前に、画分をロータリーエバポレーターを使用して濃縮する。収集した
画分中のタンパク質を、スルホフェニルイソチオシアネートについて実施例２に
記載するように、タンパク質とフルオレセインイソチオシアネートとを反応させ
ることにより標識する。
【０５０８】 標識タンパク質を含む画分を、ＣＺＥにより別々に電気泳動した。標識タンパ
ク質を、ＣＺＥサンプル緩衝液中に希釈し、２５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、８Ｍ 尿素および約１ｍｇ／ｍ
ｌの最終濃度のタンパク質を含む最終溶液を形成する。混合タンパク質サンプル
および各々のコントロールサンプルを６０ｃｍ×７５μｍの融合シリカキャピラ
リー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）中でＣＺＥモードで泳動する。１つの
８００μｍウィンドをそのキャピラリーのカソード末端から５０ｃｍに配置する
。１６０ｎｌのサンプル容量を、カソード末端に加圧注入する。そして、分離を
、２５ｍＭ ＴＲＩＳリン酸および８Ｍ 尿素の泳動緩衝液（ｐＨ４．０）中で
５００Ｖ／ｃｍにて行った。タンパク質を、キャピラリー中の残留ＥＯＦにより
溶出する。キャピラリーが１つのウェルから次のウェルへ進行的に進められる場
合、再度、画分を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルにおける溶出時
間に基づいて収集する。各々のウェルは、２００μｌのｃＺＥ分離緩衝液を含む
。このプロセスを、ＣＩＥＦの間に収集した他の画分からのサンプルを用いて繰
り返す。
【０５０９】 ＣＺＥ画分からのサンプルをＣＧＥによりさらに分離する。ＣＺＥからの画分
を、ロータリーエバポレーターにより別々に濃縮し、約５μｌの最終液体容積に
する。タンパク質サンプルを冷却（４℃）遠心分離により結晶尿素から単離する
。１０マイクロリットルのＳＤＳサンプル緩衝液を、タンパク質濃縮物の各バイ
アルに添加する。ＳＤＳサンプル緩衝液は、１００μｌのｅＣＡＰ ＳＤＳサン
プル緩衝液（Ｂｅｃｋｍｏｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，カタログ番号２４１５２５）、
１０μｌのｅＣＡＰ Ｏｒａｎｇｅ Ｇ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｒｋｅｒ（
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，カタログ番号２４１５２４）および９０μｌ
の無水グリセロールからなる。
【０５１０】 各サンプルを、１００μｍの内部直径を有する６０ｃｍ長の直線ポリ（アクリ
ルアミド）コートした融合シリカキャピラリーを使用してｃＧＥモードで泳動す
る。市販のｅＣＡＰ ＳＤＳ １４−２００Ｇｅｌ緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ カタログ番号４７７４１６）を分離に使用し、そして両方のリザ
ーバーでインキュベートする。分離を５０分間２０℃かつ５００Ｖ／ｃｍで行っ
た。分子量の較正を、製造業者により記載されるように、ｅＣＡＰ ＭＷ Ｓｔ
ａｎｄａｒｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ カタログ番号４７７４１８
）を使用して分離泳動において行う。一回の０．５ｐｓｉでの１００秒のサンプ
ル注入を使用して、キャピラリーへ各サンプルをロードする。溶解タンパク質を
、４６６ｎｍのレーザー誘導蛍光検出機を用いてフルオレセイン蛍光により検出
する。
【０５１１】 （実施例６） 本実施例は、グリコーゲンホスホリラーゼの配列を決定するための逆転質量梯
子型配列決定（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍａｓｓ ｌａｄｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｉｎｇ）の使用を例示する。
【０５１２】 グリコーゲンホスホリラーゼＡ（ＥＣ ２．４．１．１）は、アミノ末端にお
いてアセチル化されるタンパク質の群のメンバーである（Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：５２３−５２７（１９８５）を参照のこと
）。このアセチル基は、グリコーゲンホスホリラーゼの場合、天然の生化学的手
段を解してＮ末端へ付加され得る。Ｎ末端アセチル化はまた、Ｎ−ヒドロキシス
クシミジルアセテートまたはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシミジルアセテート（
これらは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ
から市販される）を使用して、公開されたプロトコールを介して達成され得る（
Ｌｏｎａｍｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０４：２４３−２６１（１９７６
）を参照のこと）。このアセチル基は、逆転質量梯子型配列決定について、単一
の質量サインを提供する。
【０５１３】 アセチル化グリコーゲンホスホリラーゼＡを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した（カタログ番号Ｐ１２６１）。このタン
パク質を０．７２ｍｇ／ｍＬで、４ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）
中に溶解した。このサンプル（５００μｌ）を、５０，０００ＭＷのカットオフ
膜を用いたＭｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
スピン透析チューブを使用する透析により、残留不揮発性イオンならびに低分子
量タンパク質およびペプチド不純物から精製した。このサンプルを、Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｎ製品の指示に従って、４ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液に対して１０倍に
希釈した。この保留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を４６０μＬの酢酸緩衝液中に回
収し、約０．８ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得た。
【０５１４】 回収した保留物を、市販のＭｉｃｒｏｓｐｒａｙイオン源を備えるエレクトロ
スプレー−飛行時間質量分析器−ＭａｒｉｎｅｒTM（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグメント化に供した。公開された機器のプロ
トコールに従って、質量分析器の設定を最適化し、そして機器をグリコーゲンホ
スホリラーゼサンプルを注入する直前に較正した。サンプルを、０．４μＬ／分
の速度で、マイクロスプレー源へ連続して供給した。ノズル電位を、各ノズル電
位においてスペクトルを収集する前に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）、５分の機
器平衡化時間で２５Ｖの増加にて、１２Ｖの最小設定値から３５０Ｖの最大値へ
増加した。合計３０の３秒間スペクトルを各ノズル電位における分析のために蓄
積した。
【０５１５】 親のグリコーゲンホスホリラーゼＡタンパク質の同一性および純度を、販売業
者により供給されたＢｉｏＳｐｅｃ Ｄａｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒTMソフトウェ
ア（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．０）を使用して、７００と４０００ａｍｕとの間で観測
された多重電荷質量ピークのゼロ電荷質量デコンボレーションを行うことにより
、最小フラグメント化された１２Ｖスペクトル（図１）において決定した。グリ
コーゲンホスホリラーゼのＮ末端配列を、得られた質量スペクトルを調査するこ
とにより決定し、各ノズル電位において可能なアセチル化ペプチドの相対存在比
を決定した。アセチル化ペプチド質量に対応するピークを、ノズル電位の増加に
伴い、相対存在比が増加することを明らかに観察した（図１２）。図１２は、配
列における各ペプチド質量について、ａ−イオンおよびｂ−イオンの両方の累積
相対存在比を示す。２５０Ｖの２５０Ｖノズル電位に対応する実質的にフラグメ
ント化した質量スペクトルの例を、図１３に示す。２００Ｖを超えるノズル電位
における増加した存在比を示すこれらの質量フラグメントは、グリコーゲンホス
ホリラーゼについての公開されたアミノ末端配列（アセチル−ＳＲＰＬＳＤ）に
対応すした（Ｐｅｒｓｓｏｎら、同書を参照のこと）。
【０５１６】 アミノ末端のセリンまたはアセテート標識のいずれかにおけるイオン化可能な
残基の欠失は、配列中の第１のアミノ酸の直接決定を妨げた。しかし、このアミ
ノ酸の同定は、第２のペプチドフラグメント（アセチル−ＳＲに対応する）の累
積質量から容易に推論され、これは、第１の検出可能なＲ−残基からの正に荷電
したイオンを生成する。ペプチド質量梯子型の配列は、全ての試験したノズル電
位における６番目のアミノ酸残基を超えて曖昧になった。
【０５１７】 （実施例７） 本実施例は、フェニルイソチオシアネートを用いて標識したブラジキニンの配
列を決定するための逆転質量梯子型配列決定の使用を例示する。
【０５１８】 Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（９個のアミノ酸ペプチド）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ
ｃｈから購入し（カタログ番号Ｂ３２５９）、そして供給されたまま使用した。
Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（５ミリモル）を、１０μＬのトリエチルアミン（純粋）
、１０μＬの２Ｍ 酢酸、５μＬの配列決定グレードのフェニルイソチオシアネ
ート（ＰＩＴＣ）（Ｐｉｅｒｃｅから購入（カタログ番号２６４２２））および
２ｍＬの５０％水性メタノールからなる１００μＬのカップリング緩衝液に可溶
化した。カップリング混合物を５５℃にて１０分間インキュベートした。この反
応混合物を室温に冷却し、そして１５０μＬの２：１（ｖ／ｖ）ヘプタン／酢酸
エチル溶液で２回抽出した。抽出サンプルを凍結乾燥し、そして１容量％の酢酸
を含む５０％水性アセトニトリル溶液中の２μＭ ＰＩＴＣ−ブラジキニンに再
懸濁した。
【０５１９】 ＰＩＴＣ標識したＢｒａｄｙｋｉｎｉｎを、標準の市販の含気性エレクトロス
プレーイオン源を備えるエレクトロスプレー−飛行時間質量分析器−Ｍａｒｉｎ
ｅｒTM（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグメント
化に供した。公開された機器のプロトコールに従って、質量分析器の設定を最適
化し、そして機器をＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎサンプルを注入する直前に
較正した。サンプルを、５μＬ／分の速度で、エレクトロスプレー源へ連続して
供給した。ノズル電位を、各ノズル電位においてスペクトルを収集する前に割り
当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）１分の機器平衡化時間で２５Ｖの増加で、１２Ｖの最
小設定値から３５０Ｖの最大値へ増加した。合計３０の３秒間スペクトルを各ノ
ズル電位における分析のために蓄積した。
【０５２０】 親のＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎペプチドの同一性および純度を、推定反
応生成物についての算出された質量に基づいて最小にフラグメント化している１
２Ｖスペクトル（図１４）において決定した。残留非標識Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ
の濃度を、５％未満であるように標準添加により決定した。Ｂｒａｄｙｋｉｎｉ
ｎのＮ末端配列を、得られた質量スペクトルを調査することにより決定し、各ノ
ズル電位において可能なＰＩＴＣ標識ペプチドフラグメントの相対存在比を決定
した。ＰＩＣＴ標識ペプチド質量に対応するピークを、ノズル電位が増加するに
つれて相対存在比が増加することを明らかに観察した（図５）。図５は、配列に
おける各ペプチド質量について、ａ−イオンおよびｂ−イオンの和の累積相対存
在比を示す。２５０Ｖのノズル電位に対応する実質的にフラグメント化した質量
スペクトルの例を、図１６に示す。２００Ｖを超えるノズル電位における増加し
た存在比を示すこれらの質量フラグメントは、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎについて公
開されたアミノ末端配列に対応する（Ｓｉｇｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌ
ｏｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９を参照のこと）。
【０５２１】 いくつかのＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎフラグメントが、サンプルマトリ
ックスにより生成される他のイオンのピークと重複することが見られる。ｂ1−
イオン（ＰＩＴＣ−Ｒ）は、（標識Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの非存在下で）サンプ
ルマトリックスから生成されているように同定されたイオンの第１の単一の同位
体（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）ピークと重複した。このマトリックスイオンの
非存在は、ノズル電位と共に不変のままであることが見出された。同様に、ａ2
−イオンピーク（ＰＩＴＣ−ＲＰ）は、マトリックスにより生成される別のイオ
ンの第２の同位体ピークと重複することが見出された。この場合、マトリックス
イオンは、ノズル電位が増加するにつれて消失することが見出された。第１〜第
３の同位体種の推定相対存在比およびａ−およびｂ−イオンの両方の位置の調査
を使用して、以前に記載されるように（Ｈｉｅｓら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．
Ｓｐｅｃ．３：３２６−３３６（１９９２）を参照のこと）質量スペクトルにお
けるそれらの重複を決定し、そしてデコンボレーションをした。
【０５２２】 （実施例８） 本実施例は、イミノビオチンで標識したブラジキニンの配列を決定するための
逆質量梯子型配列決定の使用を例示する。
【０５２３】 Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し（カタログ
番号Ｂ３２５９）そして供給されたまま使用した。イミノビオチンのＮ−ヒドロ
キシスクシミジル（ＮＨＳ）エステルを、Ｐｉｅｒｃｅから購入し（カタログ番
号２１１１７ＺＺ）、そして供給されたまま使用した。Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（
５ナノモル）を１００μＭの１Ｍ酢酸ピリジニウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶
解した。ＮＨＳ−イミノビオチンをＤＭＳＯに溶解し、反応混合物に添加した７
μｌのこのＤＭＳＯ溶液で、６．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。この反応混
合物を、４℃にて２時間インキュベートした。このサンプルを、凍結乾燥し、そ
して１容量％の酢酸を含む５０％の水性アセトニトリル溶液中で２μＭの最終の
イミノビオチン（ＩＭＢ）標識Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの濃度にした。
【０５２４】 イミノビオチン（ＩＭＢ）標識したＢｒａｄｙｋｉｎｉｎを、標準の市販の含
気性エレクトロスプレーイオン源を備えるエレクトロスプレー−飛行時間質量分
析器−ＭａｒｉｎｅｒTM（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソ
ースフラグメント化に供した。公開された機器のプロトコールに従って、質量分
析器の設定を最適化し、そして機器をＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎを注入す
る直前に較正した。サンプルを、５μＬ／分の速度で、マイクロスプレー源へ連
続して供給した。ノズル電位を、各ノズル電位においてスペクトルを収集する前
に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）１分の機器平衡化時間で２５Ｖの増加にて、７
５Ｖの最小設定値から４００Ｖの最大値へ増加した。合計３０の３秒間スペクト
ルを各ノズル電位における分析のために蓄積した。
【０５２５】 親のＩＭＢ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎペプチドの同一性および純度を、推定反応
生成物についての算出された質量に基づいて最小にフラグメント化している７５
Ｖスペクトルにおいて決定した。残留非標識Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの濃度を、５
％未満であるように標準添加により決定した。ＢｒａｄｙｋｉｎｉｎのＮ末端配
列を、得られた質量スペクトルを調査することにより決定し、各ノズル電位にお
いて可能なＩＭＢ標識ペプチドフラグメントの相対存在比を決定した。ＩＭＢ標
識したフラグメントの質量から生じたａ−イオン（図１７）およびｂ−イオン（
図１８）に対応するピークカウントを、約２００Ｖにおいて記載される最大フラ
グメント化存在比を有するノズル電位が増加するにつれて相対存在比が増加する
ことを明らかに観察した。２００Ｖを超えるフラグメントイオンの存在比におけ
る減少は、全てのイミノビオチン種の検出またはイオン化効率における全体的な
減退に起因し、そして観察される全カウントにおける減退と並行する（図１７お
よび図１８）。２００Ｖのノズル電位における増加した存在比を示すこれらのフ
ラグメントは、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎについて公開されたアミノ末端配列に対応
する。
【０５２６】 （実施例９） 本実施例は、４−スルホフェニルイソチオシアネート標識したアポミオグロビ
ンを使用する逆質量梯子型配列決定の適用を例示する。
【０５２７】 配列決定グレードのアポミオグロビンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購
入し（カタログ番号Ａ８６７３）、そして提供された用に使用した。アポミグロ
ビン（１０ナノモル）を、以下からなる１００μＬの反応緩衝液中に溶解した：
１０μｌのトリエチルアミン、１０μＬの２Ｍ酢酸、２ｍＬの８Ｍ尿素および１
０μＬの１０ｍｇ／ｍＬの水性４−スルホフェニルイソチオシアネート（ＳＰＩ
ＴＣ）溶液。ＳＰＩＴＣを、Ｆｌｕｋａから購入し（カタログ番号８６１８０）
そして供給されたまま使用した。反応混合物を、５５℃にて１時間インキュベー
トした。尿素および過剰試薬を、脱イオン水を用いる６回の洗浄に対するスピン
透析により、反応混合物から除去した。スピン透析を、梱包の指示に従って、モ
デルＹＭ１０ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号４２４０７
）チューブ中で行った。透析したサンプルを凍結乾燥し、そして０．１容量％の
トリエチルアミンを含む、５００μＬの５０％の水性アセトニトリル中に再溶解
した。
【０５２８】 ＳＰＩＣＴ標識したアポミオグロビンサンプルを、標準の市販の含気性エレク
トロスプレーイオン源を備えるエレクトロスプレー−飛行時間質量分析器−Ｍａ
ｒｉｎｅｒTM（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグ
メント化に供した。質量分析機を陰イオンモードで操作した。公開された機器の
プロトコールに従って、質量分析器の設定を最適化し、そして機器をサンプルを
注入する直前に較正した。サンプルを、３μＬ／分の速度で、マイクロスプレー
源へ連続して供給した。ノズル電位を、各ノズル電位においてスペクトルを収集
する前に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）１分の機器平衡化時間で２５〜３０Ｖの
増加にて、１２５Ｖの最小設定値から３００Ｖの最大値へ増加した。合計３０の
３秒間スペクトルを各ノズル電位における分析のために蓄積した。
【０５２９】 顕著な数のＳＰＩＣＴ標識が、より高いノズル電位においてタンパク質および
フラグメントイオンから脱離されることが見出された（図１９）。これは、配列
決定についてのこの標識の感受性を阻害する。しかし、アポミオグロビンタンパ
ク質の初めの３つのアミノ酸残基（Ｇｅｎｅｂａｎｋからの配列）のフラグメン
ト質量に対応するピークは、より高いノズル電位において存在比における増加を
見出した。標識ａ1−イオンフラグメントは、２００Ｖ以上のノズル電位におい
て現れる。ｂ1，ａ2，ｂ2，ａ3およびｂ3イオンは、全て、２５０Ｖを超えるノ
ズル電位のみにおける相対存在比におおいて増加するようである（図２０）。
【０５３０】 （実施例１０） 本実施例は、１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミド塩酸（ＥＤＣ）を介して、（２−アミノエチル）トリメチル塩化アンモニウ
ム塩酸（２−ＡＥＴＡ）でのカルボキシ末端（Ｃ末端）において標識されたブラ
ジキニンの配列を決定するための逆質量梯子型配列決定の使用を例示する。
【０５３１】 Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（カタログ番号Ｂ３２５９）、２−ＡＥＴＡ（カタログ
番号２８４５５６）および２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］エタンスルホン酸
（ＭＥＳ）（カタログ番号Ｍ５２８７）を、Ｓｉｇｎａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購
入し、そして供給されたまま使用した。ＥＤＣをＰｉｅｒｃｅ（カタログ番号２
２９８０）から購入し、そして供給されたままに使用した。Ｂｒａｄｙｋｉｎｉ
ｎ（０．６７μｌ）を０．２５ｍＬの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中
に溶解した。この溶液を８．０μｍｏｌの２−ＡＥＴＡに添加し、そしてこの溶
液を、固体が溶解するまで混合した。次いで、この溶液を３７．５μｍｏｌのＥ
ＤＣに添加し、そしてＥＤＣが溶解するまで完全に混合した。このサンプルを周
囲温度で一晩インキュベートした。
【０５３２】 １容量％の酢酸を含む５０％の水性アセトニトリル溶液中に反応混合物を希釈
することにより、質量分析のためのサンプルを調製し、その結果、２−ＡＥＴＡ
−標識ブラジキニンの最終濃度は、１０μＭであった。この２−ＡＥＴＥ−標識
ブラジキニンを、標準の市販の含気性エレクトロスプレーイオン源を備えるエレ
クトロスプレー−飛行時間質量分析器−ＭａｒｉｎｅｒTM（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）中でインソースフラグメント化に供した。製造業者の指示
プロトコールに従って、質量分析器の設定を最適化し、そして機器を２−ＡＥＴ
Ａ標識ブラジキニンサンプルを注入する直前に較正した。サンプルを、５μＬ／
分の速度で、マイクロスプレー源へ連続して供給した。ノズル電位を、各ノズル
電位においてスペクトルを収集する前に割り当てた（ａｌｏｔｔｅｄ）１分の機
器平衡化時間で５０Ｖの増加にて、５０Ｖの最小設定値から３００Ｖの最大値へ
増加した。５０〜２０００の電荷単位に対する範囲のデータを、各スペクトルに
おいて得、そして全部で６０の３秒スペクトルを各ノズル電位において分析のた
めに蓄積した。
【０５３３】 親の２−ＡＥＴＡ標識ブラジキニンの同一性を、推定反応生成物についての算
出された質量に基づいて最小にフラグメント化している５０Ｖスペクトルにおい
て決定した。ブラジキニンのＣ末端配列を、得られた質量スペクトルを調査する
ことにより決定し、各ノズル電位における可能な２−ＡＥＴＡ−標識ペプチドフ
ラグメントの相対存在比を決定した。２−ＡＥＴＡ標識ペプチドフラグメント質
量から生じた全体の可能な一連のｙ2+イオン（図２１）に対応するピークカウン
トは、１５０〜２００Ｖの範囲における最大フラグメント化存在比を有するノズ
ル電子の増加に伴なって、相対存在比における増加を明らかに観察した。固定正
電荷を保有するこの標識を用いて、１電荷のｙイオンを観察しなかった。なぜな
ら、ブラジキニンのＣ末端の残基は、アルギニンだからである。１５０〜２００
Ｖのノズル電位の範囲における増加した存在比を示すこれらのフラグメントは、
ブラジキニンについて公開されたＣ末端配列に対応する。
【０５３４】 （実施例１１） 本実施例は、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を一致させるために遺伝子データ
ベースを検索することによるタンパク質グリコーゲンホスホリラーゼの同定のた
めの逆質量梯子型配列決定の有用性および検索がタンパク質配列中のＰＳＴの位
置に基づくことを制限することを例示する。
【０５３５】 実施例１から、グリコーゲンホスホリラーゼＡの還元Ｎ末端アミノ酸配列（す
なわち、ＳＲＰＬＳＤ）を使用して、公開されたＥｘＰＡＳｙ ＴａｇＩｄｅｎ
ｔツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｔａｇｉ
ｄｅｎｔ／ｈｔｍｌを参照のこと）を使用してＳＷＩＳ−ＰＲＯＴおよびＴｒＥ
ＭＢＥＬタンパク質配列データベースを検索した。このツールは、１〜６の連続
するアミノ酸ＰＳＴに対して一致する配列を含む任意の配列について、このデー
タベース内に含まれる既知のタンパク質配列を検索し得る。検索は、タンパク質
中のＰＳＴの位置（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端）、ならびに電気泳動の座標
による等電点および／または見かけの分子量の使用により制限される。
【０５３６】 この検索は、当時のデータベース内に含まれた４９０種類のウサギタンパク質
配列に限定された。一致したタンパク質の数（「ヒット」）は、ＰＳＴの長さが
増加するにつれて減少することが見出された（表２）。所定のＰＳＴの長さにお
けるヒットの数は、Ｎ末端の一致のさらなる検索を制限することによりさらに減
少され得た（表２）。任意の所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数はまた、キ
ャピラリーゲル電気泳動分離から決定される、タンパク質の見かけのＭＷ（１０
０＋／−２０ｋＤａ）を含むことにより減少される（表２）。
【０５３７】
【表３】 （実施例１２） 本実施例は、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を一致させるために遺伝子データ
ベースを検索することによるヒトペプチドＢｒａｄｙｋｉｎｉｎの同定のための
逆質量梯子型配列決定の有用性および検索がタンパク質配列中のＰＳＴの位置に
基づくことを制限することを例示する。
【０５３８】 実施例２および３から決定されたブラジキニンの還元Ｎ末端アミノ酸配列（す
なわち、ＲＰＰＧＦＳ）を使用して、実施例６に記載されるようなＳＷＩＳ−Ｐ
ＲＯＴおよびＴｒＥＭＢＥＬタンパク質配列データベースを検索した。
【０５３９】 この検索は、当時のデータベース内に含まれた７１７１種類のヒトタンパク質
配列に限定された。一致したタンパク質の数（「ヒット」）は、ＰＳＴの長さが
増加するにつれて減少することが見出された（表３）。所定のＰＳＴの長さにお
けるヒットの数は、Ｎ末端の一致のさらなる検索を制限することによりさらに減
少され得た（表３）。任意の所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数はまた、Ｅ
ＳＩ−ＴＯＦ ＭＳにおける親ペプチドのゼロ電荷質量から決定される、タンパ
ク質の見かけのＭＷ（１０００＋／−２０ｋＤａ）を含むことにより減少される
（表３）。
【０５４０】
【表４】 （実施例１３） 本実施例は、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）を一致させるために遺伝子データ
ベースを検索することによるウマアポミオグロビンタンパク質の同定のための逆
質量梯子型配列決定の有用性および検索がタンパク質配列中のＰＳＴの位置に基
づくことを制限することを例示する。
【０５４１】 実施例４から決定されたアポミオグロビンの還元Ｎ末端アミノ酸配列（すなわ
ち、ＧＬＳ）を使用して、実施例６に記載されるようなＳＷＩＳ−ＰＲＯＴおよ
びＴｒＥＭＢＥＬタンパク質配列データベースを検索した。
【０５４２】 この検索は、当時のデータベース内に含まれた２４１種類のウマタンパク質配
列に限定された。一致したタンパク質の数（「ヒット」）は、ＰＳＴの長さが増
加するにつれて減少することが見出された（表４）。所定のＰＳＴの長さにおけ
るヒットの数は、Ｎ末端の一致のさらなる検索を制限することによりさらに減少
され得た（表４）。任意の所定のＰＳＴの長さにおけるヒットの数はまた、ＥＳ
Ｉ−ＴＯＦ ＭＳにおける親ペプチドのゼロ荷電質量から決定される、タンパク
質の見かけのＭＷ（７＋／−３．４ｋＤａ）およびキャピラリー等電点決定によ
り決定されるタンパク質の等電点（ｐＩ＝７＋／−０．５）を含むことにより減
少される（表４）。
【０５４３】
【表５】 （実施例１４） 質量分析配列分析についての最大蛍光検出可能性および適切性の両方に適切な
標識化学物質は、代替的標識化学物質で既知の濃度および配列の精製タンパク質
を標識すること、およびＣＥ分析および質量分析の両方においてそれらを試験す
ることによって、決定する。少なくとも３つの異なる、タンパク質または合成調
製ペプチドを、この作業における評価のために選択する。２つのタンパク質が、
使用するＮ末端標識化学物質またはＣ末端標識化学物質への交差反応性を示し、
そして１つは示さない。理論的に適切な構成を有する３０個までの代替的標識が
、市販されている。各タンパク質のサンプルを調製し、そしてそれらのＣＥ検出
可能性およびエレクトロスプレー質量分析サインについて分析する。最適化した
５個までの第２回の代替的標識化学物質を合成し、そして市販の標識から得られ
る結果に基づいて分析する。次いで、最適の標識を、残りの作業における使用の
ために選択する。
【０５４４】 （実施例１５） （２次元ＣＥ法） ＣＩＥＦ技術、ＣＺＥ技術、およびＣＰＡＧＥ技術が以前に開発されそして記
載されているが、２次元ＣＥ法を作製するためにこれらの技術を結合することに
対する言及は以前になされていない。本実施例は、個別のタンパク質の複合混合
物を再現可能にかつ定量的に分離するために、ＣＰＡＧＥまたはＣＺＥとＣＩＥ
Ｆを組み合わせ得ることを示す。既知の濃度および配列の精製タンパク質の混合
物を、実施例１２のように調製する。これらのタンパク質混合物を、実施例１２
からの標識で標識し、そしてまず、ＣＩＥＦ法を流し画分収集する。その後、収
集したＣＩＥＦ画分をＧＰＡＧＥ法またはＣＺＥ法を流し、さらにそのタンパク
質を分離する。混合物中の個別のタンパク質の濃度が互いに対して１０００倍ま
で変動する、少なくとも２５連の実験を実行して、２次元ＣＥ法のバリエーショ
ンの係数を確立する。最後に、少なくとも５連の実験を、異なるタンパク質ロー
ディングで実行して、溶出時間および見かけの等電点に対するカラムローディン
グの効果を決定する。
【０５４５】 （実施例１６） タンパク質の質量分析分画パターンおよび効率は、そのタンパク質がイオン化
工程の間に存在する緩衝溶液により有意に影響され得る。代表的なＣＥ緩衝液は
、ＭＳによるタンパク質配列決定に通常使用されるのと同じ緩衝液ではない。Ｃ
Ｅの第２次元から溶出する個別のタンパク質の画分を収集し、そして使用する溶
出緩衝液について質量分析法を最適にするために使用する。エレクトロスプレー
およびＭＡＬＤＩ ＭＳ技術の両方を比較する。そのサンプルを、検出感度、分
画効率、および識別し得るタンパク質配列の最大長について、評価する。最良の
ＭＳ法および条件を、さらなるすべての作業について選択しそして使用する。
【０５４６】 （実施例１７） （ＣＥ＋ＭＳ法の使用） 本実施例において、上記実施例１３および１４からのＣＥ法およびＭＳ法を、
代表的プロテオミクス系に組み合わせる。この系は、市販の構成成分から構築し
得る。例えば、ストレス遺伝子分析（下記を参照のこと）についてのこの系の適
切性は、公知のストレス遺伝子応答のプロテオミクス分析（例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉのｐｈｏ応答）を実施することにより示す。この系の性能を確認するために、
Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、適切なＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのストックから調製し、そしてホスフェート飢餓に供する
。細胞性タンパク質を対数増殖期培養サンプルから抽出し、そしてこの系を使用
してホスフェート飢餓させたサンプルと比較する。この系から得た結果を、文献
に記載される結果（例えば、Ｌ．Ｖ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｕｒｉ
ｎｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ」Ｔｈｅｓｉｓ博士
、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９７）を参照のこと）と比
較する。２次元ＣＥ法から得たタンパク質発現パターンを画像に変換し、この画
像を古典的２次元ゲル電気泳動の結果と直接比較する。ｐｈｏ遺伝子すべてに関
する遺伝子配列が公開されているので、この分析から決定したタンパク質配列タ
グの正確性をその公知の配列と比較することができる。
【０５４７】 （実施例１８） （健常組織と癌性組織との間を識別するためのプロテオミクスの使用） 本実施例は、健常組織と癌性組織との間を識別するための本発明の使用を示す
。詳細には、本発明を使用して、健常前立腺組織および癌性前立腺組織、ならび
に転移組織のタンパク質発現パターンを直接分析して、前立腺癌における種々の
局面の発症、段階および転移に関連する、遺伝子発現および翻訳のパターンを解
明し得る。このようなプロテオミクス調査は、疾患の機構のゲノム分析および機
能的ゲノム分析を非常に促進し、そして新規な治療標的、診断マーカー、および
薬物産物（すなわち、特定の細胞性タンパク質がそれ自体が治療剤として作用し
得る）の同定を迅速にもたらす。プロテオーム分析を使用することによって、調
査されなければならない遺伝子の数は、（５０，０００〜３５１００，０００個
のヒト遺伝子から標的組織中で実際に発現される２，０００〜５，０００個へと
）１０分の１に減少する。健常組織と疾患組織とのタンパク質発現パターンの定
量的比較を通じて、疾患の進行において役割を果たし得る候補遺伝子の数を、さ
らに約１００分の１に減少させる。最後に、タンパク質配列タグ（ＰＳＴ）の生
成を通じて、これらのタンパク質を、完全配列決定（例えば、変異検出）のため
にそれらをゲノムに戻して追跡することを可能にする様式で、独自に同定し得る
。
【０５４８】 この方法はまた、疾患における機構的役割のより徹底的な分子生物学的調査（
例えば、モデル生物におけるノックイン研究およびノックアウト研究）のための
ｃＤＮＡ捕捉を可能にする。事実上すべての細胞代謝および細胞シグナル伝達が
生じるのは、タンパク質レベルにおいてである。遺伝子転写物の未成熟の終結ま
たは生じた遺伝子産物におけるアミノ酸置換のいずれかを生じる遺伝子変異を検
出するために、プロテオミクスを使用する。これらは、生じるタンパク質におけ
る分子量変化または等電点変化として現れる。遺伝子産物における直接の変化が
観察されるので、矛盾する遺伝的バリエーション（例えば、多型）は無視する。
このようにして、プロテオーム分析は、癌性細胞を生じる遺伝子変異を迅速に同
定し得る。個別のタンパク質の発現レベルの変化は、遺伝子発現における変化に
より引き起こされ得る。これらの変化は、機能的ゲノム法により追跡し得るが、
翻訳効率および分解における変化によってもまた引き起こされ得、これらの翻訳
効率および分解における変化は、プロテオーム分析を使用してのみ同定し得る。
特定のタンパク質のレベルはまた、癌の原因であり得る。例えば、Ｇタンパク質
（膜レセプター）のおける変動（細胞外シグナル（例えば、ホルモンレベル）を
細胞性応答に翻訳することを担う）は、その細胞がその対応するシグナルの変化
を増殖するための喚起として解釈する場合に、癌をもたらし得る。代謝タンパク
質における変化は、増殖および癌をもたらす細胞性代謝での増加を引き起こし得
る。プロテオミクスを通じて、レベルの変化の理由に関わらず、健常細胞と腫瘍
細胞との間のタンパク質レベルと直接比較する。癌の可能な別の原因は、翻訳後
タンパク質修飾の失敗であり、これは、制御されない細胞増殖をもたらす、重要
なシグナル伝達系の損失を引き起こし得る。また、これは、翻訳後にのみ生じ、
そしてゲノム分析または機能的ゲノム分析によっては検出し得ない。天然のディ
フェンシンタンパク質（これは、腫瘍増殖と闘う）もまた、翻訳後修飾の失敗ま
たは分解速度の増加により非機能的になり得る。プロテオーム分析は、疾患に対
する薬物または遺伝子治療剤として使用し得る天然のディフェンシンの不在を明
らかにするのを補助する。これらの様式で、プロテオーム分析は、疾患のゲノム
分析および機能的ゲノム分析に対する補助であり、そしてその疾患の経路の原因
および薬物開発の標的の両方の同定を促進する。
【０５４９】 プロテオーム分析はまた、免疫診断アッセイのための診断マーカー（例えば、
細胞表面抗原または血清タンパク質）の同定を可能にする。推定診断タンパク質
の精製サンプルを、プロテオーム分析の間に回収し、それにより抗体を惹起する
ことが可能になる。これらの抗体を使用して、その診断タンパク質とその疾患と
の間の関連を、細胞におけるそのタンパク質の位置決めのための免疫組織化学的
染色を介してさらに研究するか、またはそのタンパク質の存在について患者集団
を迅速にスクリーニングして、その疾患に対するその統計学的関連を示す。プロ
テオーム分析はまた、改良されたスクリーニング試験を提供する。
【０５５０】 米国において、前立腺癌の発症率は、６５歳よりも若い男性すべての間で１０
０，０００人あたり２３人であり、そして６５歳を超える男性の間で１００，０
００人あたり８８４人である。高齢に加えて、この癌についての他の危険因子と
しては、家族性関連性の疑い、高飽和脂肪の摂取（ω−３脂肪酸が危険を減少さ
せると考えられる）、性病の病歴、複数の性交相手、精管切除、および窒素肥料
への曝露（農家／農場作業者）およびフェロクロムが挙げられる。すべての癌と
同様に、これらの危険因子は、複数の原因因子が関与し得ることを示唆する。例
えば、家族性関連性は、遺伝的偏向（ｐｒｅｄｉｌｅｃｔｉｏｎ）（おそらくは
遺伝子変異に関連する）を示唆する。食事因子に対する関連性は、代謝経路また
は化学的に誘導された遺伝子損傷を示唆する。性病および複数の性交相手に対す
る関連性は、病原菌（ｉｎｆｅｃｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）（例えば、ウイルス性
の原因）または感染により損なわれた天然の腫瘍防御の損失を示唆する。これら
の推定疾患機構すべてに、プロテオーム分析を介して取り組み得る。初期の前立
腺癌は、通常は無症候性であり、そして慣用的スクリーニングによってのみ検出
し得る。最もしばしば使用するスクリーニング様式は、直腸指診である。しかし
、最近の前立腺スクリーニング研究の結果は、直腸指診が、触知可能な硬変を有
する悪性腫瘍の患者のほぼ３分の２に適当な感度を欠くことを示している。前立
腺癌特異抗原（ＰＳＡ）レベルスクリーニングは、初期前立腺癌の感度の良い指
標であるが、不十分な特異性しか有さないと見なされる。なぜなら、レベルの上
昇が、良性前立腺肥大（ＢＨＰ）、前立腺炎、または前立腺に対する物理的損傷
を有する患者において存在するからである。最近開発された腫瘍関連抗原（ＴＡ
Ａ）マーカーアッセイは、ＰＳＡスクリーニングに対する有望な補助であるよう
である。それにも関わらず、スクリーニングの道具としてのＰＳＡの広範な使用
は、なお議論の余地がある。なぜなら、部分的には、前立腺癌の早期の検出が、
見込みのある十分に制御された研究において、死亡率および罹患率に関して患者
の結果の改善をもたらすと証明されていないからである。より決定的なスクリー
ニング試験がひどく必要とされる。
【０５５１】 前立腺癌は、一般的に、４つの臨床段階により特徴付けられ、わずかな臨床的
管理選択肢しかない。初期段階（段階Ａ）は、処置せずに増殖についてモニター
し得るか、放射線治療で処置し得るか、または除去し得る（前立腺全摘出術）。
段階Ｂの前立腺癌（確定的だが限局的な癌）は、放射線治療か、または診断の最
初の８ヶ月内の除去により自動的に処置する。段階Ｃの前立腺癌（拡大中だがな
お器官に限局的）は、除去および放射線の組み合わせ治療によってか、またはホ
ルモン療法と組み合わせた待期的放射線治療によって、直ちに処理する。段階Ｄ
の前立腺癌（転移した）は、最も根治的な治療（前立腺の経尿道的切除、組み合
わせ放射線治療、待期的放射線治療およびホルモン療法を含む）を必要とする。
骨のスキャンもまた、段階Ｄで実行する。首尾良い臨床結果は、その疾患の各段
階で実質的に減少する。初期の検出における改良は別として、治療の選択を案内
することによってかまたはその癌の進行を適切に段階分けする腫瘍遺伝子学者の
能力を改善することによって、臨床管理の改善を可能にする診断法もまた、臨床
結果を改善し得る。多数の抗癌薬物が前立腺癌についての臨床試験において存在
するが、今日の唯一の頼りとなるものは、その腫瘍組織を除去または殺傷するこ
とである。前立腺癌およびその転移の機構を同定することは、より良好な薬物療
法の開発を促進するはずである。
【０５５２】 従って、健常前立腺組織および癌性前立腺組織ならびに前立腺癌転移のプロテ
オーム分析を実行する。プロテオームデータベースを、この分析に基づいて構築
し、そして前立腺タンパク質すべての発現レベルを、その等電点、分子量によっ
て定量する。相対的発現レベルを、ネイティブの組織サンプルから直接決定する
。タンパク質発現レベルの定量分析のために同位体標識したサンプルは、必要と
しない。従って、正常な生検サンプルまたは剖検サンプルを、実施する分析すべ
てのために使用し得る。タンパク質配列タグを、健常前立腺組織と癌性前立腺組
織との間で発現パターンの変化を示すタンパク質すべてについて決定する。モデ
ルタンパク質を使用して、代替的タンパク質配列決定技術の相対的効率を評価す
る。健常組織サンプルの２次元キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して、前立
腺組織サンプルの２次元ＣＥのための条件を開発する。この開発において健常組
織サンプルを使用することによって、本発明者らは、基準プロテオミクスデータ
ベースを同時に作製する。複製実験を、別個の人々から採取した前立腺組織サン
プルを用いて実施して、タンパク質発現における天然の変動を評価する。少なく
とも２連の実験を、各組織サンプルを用いて実施し、タンパク質発現レベルにお
ける実験上の変動を評価する。段階Ｄの前立腺癌は、健常組織からのタンパク質
発現において最も大きい変動を示す。従って、上記で開発した２次元ＣＥ条件を
、５つまでの切除した段階Ｄの前立腺腫瘍サンプルに適用する。最良の結果が、
健常組織サンプルと同様の年齢および人種の背景の個体から採取したサンプルを
用いて予測される。上記で開発した２次元ＣＥパターンにて出現するかまたは消
失するかのいずれかである、各タンパク質についてのＰＳＴを、健常組織の２次
元電気泳動パターンの比較の際に開発する。本発明者らは、１０個のタンパク質
のみが、完全にその２つの発現パターンのうちの１つに存在しないとみなし、こ
のことは、遺伝子５の配列、発現、または翻訳後修飾における変化を示す。これ
らのタンパク質は、前立腺癌の発症または転移に最も関連がありそうであると考
えられる。ＰＳＴの決定は、正常組織について決定された天然の変動の有意に（
すなわち、３標準偏差）外側にある発現レベルを示すタンパク質へと拡張される
。本発明者らは、いくつかのタンパク質が、有意な発現レベル変化を示すと見な
す。これらのタンパク質は、前立腺癌にその次に最も関連がありそうである。前
立腺癌のプロテオームデータベースを、上記から生じた情報を用いて開発する。
このデータベースは、同定した各タンパク質について（決定した場合）、等電点
、分子量、相対発現レベルおよびタンパク質配列タグを含む。
【０５５３】 上記の実験はまた、前立腺癌の基礎をなす共通の機構に基づく、基礎のデータ
セットを提供する。このデータを使用して、家族性癌を追跡し得、癌標的および
他の組織における転移と関連するプロテオームの変動を調査し得、そして思春期
と関連する発達タンパク質に関連し得る腫瘍容疑標的の機能を調査し得る。さら
に、他の身体組織における転移の付着と関連するタンパク質を発見し得、そして
前立腺癌またはその種々の段階の血漿タンパク質マーカーを同定し得る。さらに
、臨床前試験または臨床試験からの種々の薬物療法のプロテオーム効果を、その
薬物の作用機構および効力を決定するのを補助するためにスクリーニングし得る
。
【０５５４】 （実施例１９） （ストレス遺伝子発現の分析のためのプロテオミクスの使用） プロテオミクスを用いて、ストレス遺伝子発現を使用して、組織に基づくバイ
オセンサーにおいて応答を引き起こすことが既知である化学物質または生物学的
物質を識別し得る。組織に基づく検出系の優れた感度は、生物学的検出にて固有
の生化学的増幅カスケードに起因する。このレセプターに基づく生化学的増幅ア
プローチ（（細菌からヒトまでの）すべての生物学的検出にて固有である）は、
従来の化学的検出系の２つの主要な限界：閾値感度および兆し（ｔｈｒｅａｔ）
の識別をよけて通る能力を保持する。既知の兆しは、その兆し因子への曝露に際
して組織により生成された生化学的サインを既知の生化学的サインのライブラリ
ーに一致させることによって、同定し得る。生化学的増幅系の１つの種類は、ス
トレス遺伝子系である。フィンガープリント生成においてストレス遺伝子のサイ
ンを使用する利点は、新規かつ未知の兆しをその組織に対して有する毒性効果の
型に基づいて同定し得ることである。
【０５５５】 本実施例は、ストレス遺伝子発現を（その遺伝子配列レベルまで）迅速に同定
しそして定量するための、新規なプロテオミクス法を示す。ストレス遺伝子のフ
ィンガープリントを、組織に基づくバイオセンサーを誘発することが公知である
化学物質および生物学的物質について同定する。ストレス遺伝子のフィンガープ
リントのライブラリーをどの化学物質および生物学的物質についても作製し得、
そしてそのライブラリーを、一旦組織に基づくセンサーが誘発された領域にて、
迅速に兆しを識別するために使用する。そのプロテオミクス技術は、任意の組織
または細胞型に普遍的に適用可能である。
【０５５６】 （実施例２０） （プロテオミクスデータベースプロフィールを作製する目的のための疾患組織
サンプルおよび健常組織サンプルのＭＤＥ分析よびＩＭＬＳ分析のための蛍光タ
グでのタンパク質の標識） タンパク質濃度がより感度のよい検出様式を必要とするに十分低い場合におい
て、所望の感度を達成するための蛍光団の使用は、十分に記載されている。さら
に、標識反応を実施する場合において、保護ストラテジーを実施して、所望の基
のみ標識するのを確実にすることは、一般的である。水性溶媒環境または水性／
有機性混合溶媒環境中における種々の因子でのタンパク質の標識もまた、当該分
野で公知であり、そして本発明の実施にて有用な広範な標識試薬および技術が、
当業者に容易に利用可能である。例えば、Ｍｅａｎｓら、ＣＨＥＭＩＣＡＬ Ｍ
ＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、Ｓ
ａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９７１；Ｆｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩ
ＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ ＡＮＤ
ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴＳ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２；Ｆｅ
ｅｎｙら、ＦＯＯＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＩＭＰＲＯＶＥＭＥＮＴ ＴＨＲＯＵ
ＧＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩ
ＯＮ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１６０
巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９７；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡ
ＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ、１９９６を参照のこと。
【０５５７】 以下の実施例は、蛍光原性ＰＳＴを本発明の代表的実施形態において選択しそ
して利用する方法を示す。さらに、この実施例は、保護基化学を戦略的に使用し
て（ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｗｉｌｅｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９９９））を参照のこと）タンパク質またはペプチドの選択的末端標識を確
実にすることを示す。最後に、この実施例は、放射性同位体タグおよびモディフ
ァイヤーを用心深く使用して、その物質がＩＭＬＳ条件下で断片化および分析さ
れた場合に、特有の質量フラグメントを生成することを示す（同時係属中の米国
特許出願第０９／５１３，３９５「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（２０００年２月２５日出願）を参照のこと）。
【０５５８】 この実施例において、健常標本および疾患標本由来の組織サンプルを、タンパ
ク質粗抽出のための代表的手段に供する。そのタンパク質を単離した後、予備分
離を、電気泳動（好ましくはｃＩＥＦ）を使用して実施する。さらなる分離が必
要ならば実施する。次いで、タンパク質画分を、本発明の所望の特徴すべて（す
なわち、特有の質量サイン、定量検出成分、および反応性官能基）すべてを含む
蛍光タグ材料での標識に供する。Ｑｕａｎｔｕｍ ＤｙｅTM（市販の化合物（Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ））は、特有の
蛍光特性を示し、そして本発明の主な特徴を組み込む、ユーロピウム（ＩＩＩ）
の大環状キレートである（Ｌｅｉｆら、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉ
ｅｓ ４６４、Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｓ．ＫａｍｐａｌａおよびＰ．Ｗ．Ｔｏｄｄ編、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ
Ｃ、４１〜５８頁（１９９１）；Ｖａｌｌａｒｉｎｏら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｅｎｓｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｒ．ＬａｋｏｗｉｃｚおよびＲ．Ｂ．Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎ編、ならびにＡ．Ｋａｔｚｉｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｓｅｒｉｅｓ編、ＳＰＩＥ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
Ｓｅｒｉｅｓ １８８５、３７６〜３８５頁（１９９３）；ならびにＬｅｉｆ
ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ、編Ｒ．Ｆ．Ｂｏｎｎｅｒ、Ｇ．Ｅ．Ｃｏｈｎ、Ｔ
．Ｍ．ＬａｕｅおよびＡ．Ｖ．Ｐｒｉｅｚｚｈｅｖ．、ＳＰＩＥ Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ Ｓｅｒｉｅ ２１３６、２５５〜２６２頁（１９９４）を参照のこ
と）（図１を参照のこと）。適切なエネルギーの光（３６０ｎｍ）により切除し
、そして増強剤の存在下における場合、Ｅｕ（ＩＩＩ）キレートは、強力な狭い
バンドの発光スペクトルを（代表的には、ピークの高さの２分の１にて約１０ｎ
ｍ）大きなストークスシフトとともに示す。この錯体は、強力に発光し、約６２
０ｎｍの発光である。特徴的に長い蛍光時間（３００マイクロ秒を超える、Ｐｅ
ｒｉａｓａｍｙら、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｒ
ｃｈ、３３〜３５頁（１９９５）およびＳｅｖｅｕｓら、Ｍｉｃｒｏ．Ｒｅｓ．
Ａｎｄ Ｔｅｃｈ．２８、１４９〜１５４頁（１９９４）を参照のこと）により
、サンプルの短いパルス励起、続いてタイムディレイシグナル検出を実施するこ
とが可能になり、結果として、比較的短い蛍光寿命を有する成分からのパックグ
ラウンド干渉を０にする。偶然にも、その標識は、他の多くの標識がそうである
のと同様に、蛍光クエンチングに悩まされず、従って、スタンダードについての
応答曲線は、高濃度で直線状のままである。Ｓｅｖｅｕｓら（同書）は、これら
の化合物が、水溶性の増加およびそのキレート金属の遊離に対する相対的不活性
に起因して、生物学的適用に最適であることを示している。これは、より安全な
反応条件の使用を可能にし、そしてこの標識における硬い（ｈａｒｄ）正電荷と
いうさらなる特徴を提供する。Ｑｕａｎｔｕｍ ＤｙｅTM上のフェニルイソチオ
シアナート結合は、アミンへの結合に最適であり、そしてこのキレートの中心の
正の３つ（＋３）の硬い電荷は、そのタグの大きな質量９２７．７ａｍｕを快適
なｍ／ｅ値３０９．２３３３にする。
【０５５９】 この実施例において、Ｑｕａｎｔｕｍ ＤｙｅTMタグを、代表的には単離され
たタンパク質混合物上に結合し得る（Ｊ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｄｅｐｔ
．ｏｆ Ｃｈｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅ Ｗｅｉｔｚｍａｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．とＪ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇ
ｅｒとの間の私信）；Ｄ．Ｂｌａｋｅｓｌｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ、１３：３０５（１９７６）；およびＨ．Ｐ．Ｒｏｔｈｂａｒｔら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９：１０１（１９７８）を参照のこと）。試験タ
ンパク質サンプルとコントロールタンパク質サンプルとを、ｐＨ９〜９．５の０
．０５Ｍホウ酸塩（または炭酸塩または他の適切な緩衝液）にて、濃度０．５〜
３ｍｇ／ｍＬまで分離する。０．４Ｍ塩化ナトリウムを添加して、イオン強度を
調整する。適切な体積（５ｍＬ）を透析バッグ中に配置する。約３ｍｇのＱｕａ
ｎｔｕｍ ＤｙｅTMを１００ｍＬホウ酸塩（炭酸塩）緩衝液（ｐＨ９．３）に溶
解する。そのタンパク質溶液を色素溶液に対して適切な時間（１時間＋）室温で
透析して、タグをそのタンパク質に結合させる。次いで、結合したタンパク質を
、分離に適切な緩衝液に対して透析し、そしてｃＧＥまたはｃＺＥ様式（例えば
、ＭＥＳまたは酢酸ピリジニウム）にて多次元キャピラリー電気泳動により分析
する。
【０５６０】 タグ化タンパク質をキャピラリーにロードし、そして電気泳動し、検出し、そ
して分画する。このタンパク質を蛍光および紫外検出によりモニターする。なぜ
なら、Ｑｕａｎｔｕｍ ＤｙｅTMは、蛍光団であることに加えて、発色団でもあ
るからである。これら画分の各々を、蛍光およびＵＶにより定量する。次いでそ
の画分を細分し、そしてＮａｎｏＯｒａｎｇｅTM色素およびＳｙｐｒｏTM色素（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈａｒｖｅｙ Ｍ．Ｄ．ら、Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｅｐ；１９（１２）：２１６９〜７４（１９
９８）を参照のこと）により総タンパク質について分析する。各サンプルについ
て分析したタンパク質の総質量を知ると、完全標識に必要な蛍光タグの理論量を
評価し得る。これは、分画したタンパク質の全体消化と組み合わせて決定して、
全体のアミノ酸含量を決定し得る。各タンパク質画分において実際に見出される
タグの量を、ＡＡ分析、ならびにＳｙｐｒｏTMアッセイおよびＮａｎｏＯｒａｎ
ｇｅTMアッセイにより見出される総質量に基づいて予測した理論量と比較する。
この様式で、全体標識効率を、サンプル対サンプルの原理に基づいて決定する。
【０５６１】 代表的なＮａｎｏＯｒａｎｇｅTMアッセイまたはＳｙｐｒｏTMアッセイにおい
て、ｎｇ／ｍＬレベルまでの検出が可能である。この試薬は、水溶液中で非蛍光
性であるが、界面活性剤の存在下でタンパク質と相互作用する際に、タンパク質
に強く結合する。
【０５６２】 他の標識が必要とされる場合において、選択肢は多い。蛍光団（ｆｌｕｏｒｏ
ｐｈｏｒｅ）に対する他の連結化学物質としては、塩化スルホニル、ＮＨＳエス
テル、アルキルハライド、および活性化アルケンが挙げられる。他の連結化学物
質を選択することによって、他の蛍光発生種（例えば、タグ）の使用が可能であ
り、そして多くのアミノ酸残基を含むフラグメントでの優れたＩＭＬＳデータを
生成するために必要とされる選択肢を有する機会が増大される。各々の選択肢（
本実施例で使用されるＯｕａｎｔｕｍ ＤｙｅTMタグおよびより多くの標識を含
む）は、本発明の主要な特徴（すなわち、連結官能性、荷電化学種（＋または−
）、強い（ｈａｒｄ）または弱い（ｓｏｆｔ）電荷、および固有の質量サイン）
を取り込むことが可能である。
【０５６３】 Ｃ末端上でタンパク質を標識するために、いくつかの保護手段が通常必要であ
り、そして望ましい（Ａｔａｓｓｉら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９
９５；Ｂｏｙｄ，Ｖ．Ｌ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ、１０９−１１８頁；ならびにＤｕ
ｐｏｎｔら、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏｔｅを参照のこと）。慣用的なＡＡアッセイから収集されるデータに基づい
て、適切な保護化学物質が選択される。いくつかの型のＣ末端標識または配列決
定の実施を試みる場合に、ｃｙｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｐおよびｇｌ
ｕ側鎖残基がチャレンジを課され得、そしてこれらの基の改変がしばしば必要で
あるが、達成することは比較的容易であることが実証されている（例えば、Ａｔ
ａｓｓｉら、同書、およびＧｕｇａら、「Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ
Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎｓ：Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｃｙｓ，Ｇｌｕ
，Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ．」、ｔｈｅ Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
Ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９９３）のポスター発表
を参照のこと）。
【０５６４】 これらの保護化学物質は、ＰＥ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｏｃｉｓｅ ４
９４Ｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにおいて、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって使
用される保護化学物質に類似するが（Ｗｅｒｎｅｒら、「Ａ Ｎｅｗ Ｓｉｍｐ
ｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎｉｎｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ
ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙでのポスター発表；およびＢｒｕｎ
ｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０７：２８５（１９９２）を参照のこと）、
本実施例においては、同位体標識した試薬を、それらに対応する非同位体対応物
とのほぼ５０／５０の混合物で提供し、ここでは、慎重に標識を行う。本実施例
の継続において、ｃｙｓ残基は、アクリルアミドでのアルキル化によって改変さ
れて、安定な誘導体を生じる。Ｌｙｓ、ＳｅｒおよびＴｈｒもまた、同位体およ
び非同位体のフェニルイソチオシアネートの混合物で改変して、非常に安定な誘
導体を生じる。フェニル尿素誘導体がリジンで形成され、そしてカルバメートが
、ＳｅｒおよびＴｈｒで形成され、そしてアシルカルバメートがＴｙｒ残基で形
成される。同位体標識されたＰＩＴＣを使用して、ＩＭＬＳスペクトルにおける
固有の質量フラグメント対を生じる。どの程度使用するかを選択することが、Ｐ
ＶＤＦ膜へ接着する場合の最終的な疎水性に役立つ。これらの変換は、ＰＶＤＦ
膜上で容易に行われる。ＳｅｒおよびＴｈｒのヒドロキシル基は、無水酢酸を使
用してキャップされる。Ｃ末端と共にＡｓｐ残基およびＧｌｕ残基はまた、無水
酢酸中で反応される。このＣ末端は、オキサゾロン環を形成し、これは、アスパ
ラギン酸およびグルタミン酸側鎖残基のいずれか一方については形成されず、代
わりに混合酸無水物を形成する。これは、このキャップ化プロセスの間に同位体
標識された無水酢酸をＴｈｒおよびＳｅｒ残基に選択的に組み込むことを可能に
し、ＩＭＬＳ分析の間にそれらの残基の同定をより容易にする。次いで、この環
化Ｃ末端を、ＮＨＳエステルで促進される機構を介して、所望のアミン改変剤と
反応させる。完了すると、全ての潜在的に相互作用する残基の側鎖が、選択的に
改変され、そしてＣ末端は、アミンに化学改変された。この接合部において、本
実施例のＯｕａｎｔｕｍ ＤｙｅTMが、上記で議論された手順によって容易に結
合されるか、または所望の場合に、他の所望の蛍光タグが利用され得る。
【０５６５】 側鎖改変およびこのタンパク質サンプルのアミン改変Ｃ末端への蛍光タグの結
合の後、このサンプルを、ＭＥＳ緩衝液（または、多くの他の可能な界面活性剤
／界面化性物質のうちの１つ）中に溶解させて、そしてｃＧＥ様式またはｃＺＥ
様式で電気泳動し、蛍光およびＵＶによって検出し、そしてタンパク質のレベル
を定量して、最後に分画する。ＳｙｐｒｏTMアッセイおよびＮａｎｏＯｒａｎｇ
ｅTMアッセイは、タグ化の前後のいずれかで、行うサンプル量に依存して、タン
パク質サンプルに対して行う。蛍光発光せず、単に発色団である標識を選択する
場合、このタンパク質配列タグの一部として蛍光特性を有することによって付与
される利点を必要とすることなく、ＮａｎｏＯｒａｎｇｅTMアッセイおよびＳｙ
ｐｒｏTMアッセイが、これらのタンパク質のＣＥでの容易な分析を可能にするた
めになお使用され得ることに留意する。消費されるＱｕａｎｔｕｍＤｙｅTM標識
の実際量を、推定される理論的な量と比較して、明確な標識効率を得る。
【０５６６】 次いで、分画したタグ化タンパク質を、同じ緩衝液（本実施例のＭＥＳ）中で
のＩＭＬＳ分析に適切な容量にして、そしてＩＭＬＳフラグメント化条件下でＥ
ＳＩ−ＴＯＦ質量分析計において分析する。本発明者らが開発したＩＭＬＳデー
タ分析アルゴリズムを使用するデータ整理およびデータ分析下で、スペクトルデ
ータを収集する。次いで、タンパク質配列およびＩＤの同定および割当てを、Ｃ
Ｅ分析を受けたタンパク質画分の各々について収集された定量データおよび移動
データに対して相関させる。この情報は、全タンパク質アッセイ（ＳｙｐｒｏTM など）の情報と結び付け、各アッセイから得られた情報集団と共に、完全なタン
パク質発現データベースが構築するのを可能にする。このデータベース集団は、
本実施例の最終目標である、疾患組織におけるタンパク質発現プロフィールとコ
ントロール（すなわち、健常）組織との間での競合分析を可能にする。
【０５６７】 前述のプロセスは、疾患被験体およびコントロール被験体由来の複数のサンプ
ルで繰り返され、そして同じ被験体由来のサンプルで繰り返し実行される。次い
で、これらの結果を試験して、疾患被験体とコントロール被験体との間で相対的
な存在比が変化するタンパク質を同定する。このようなタンパク質は、特定の疾
患および／または薬物標的についての潜在的なマーカー、あるいは潜在的な薬物
である。
【０５６８】 （実施例２１） （自閉症における代謝の役割） 本発明の方法を利用して、種々の疾患が代謝性の根源を有するか否かを確認し
得、およびその代謝性の根源を特定さえし得る。特定の例として、本発明の方法
および装置を使用して、自閉症（または、重篤な自閉的症状）が食餌性の因子か
ら生じるか否かを確認し、食餌が自閉症に影響を及ぼし得る機構を決定し、そし
てこのような食餌性の影響の診断を容易にするための単純な13Ｃ代謝アッセイを
確立し得る。
【０５６９】 外因性ペプチドの上昇が、多数の自閉症の幼児の血液、尿および脳骨髄液に見
い出された（Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，
４２：１−１１（１９９０）；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，７：７１−８５（１９９４）
；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，４：３０
８−３１９（１９９１）；Ｇｉｌｌｂｅｒｇ，Ｃ．「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ
ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｏｐｉｏｉｄｓ ｉｎ ａｕｔｉｓｍ ａｎｄ ｐｏｓ
ｓｉｂｌｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔ
ｕｒｅ」、Ｗｉｎｇ，Ｌ．編、Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ａｕｔｉｓｍ：Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１−３７頁、Ｇａｓｋｅｌｌ，Ｌｏｎｄｏ
ｎ，（１９８８）；Ｓｈａｔｔｏｃｋ，Ｐ．Ａ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｄｙｓｆｕｎ
ｃｔｉｏｎ，３：３２８−３４５（１９９０））。セリアック病からの前例、な
らびに穀物および日常の食事制限において有意な患者の改善を実証する多くの臨
床事象研究は、自閉症に対する食餌性の効果に関する３つの仮説を導いた（例え
ば、Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｓ．およびＹｏｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．２９６：１０７−１１１（１９９２）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｓ．およびＹｏ
ｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１６：１７−１９（１９９３）；
Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４２：１−１１
（１９９０）；Ｒｅｉｃｈｅｌｔ，Ｋ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒ
ａｉｎ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，７：７１−８５（１９９４）；Ｒｅｉｃｈｅ
ｌｔ，Ｋ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，４：３０８−３１９（１
９９１）；Ｓｈａｔｔｏｃｋ，Ｐ．，Ａ．，ら、Ｂｒａｉｎ Ｄｙｓｆｕｎｃｔ
ｉｏｎ，３：３２８−３４５（１９９０）；Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｓ．，「Ｄｉｅｔ
ａｒｙ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏ
ｆ ａｕｔｉｓｍ：Ｗｈｙ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔ ａ ｇｌｕｔｅｎ ａｎｄ
ｃａｓｅｉｎ ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ？」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍ
ｅｎｔｓ ｆｏｒ Ａｕｔｉｓｍ ａｎｄ ＰＤＤ，１９６−２２６頁（Ｓｈａ
ｗ、１９９８）；Ｓｅｒｏｕｓｉ，Ｋ．，「Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａ ｄｉｆｆ
ｅｒｅｎｔ ｒｏａｄ．Ａ ｃｈｉｌｄ’ｓ ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ ｒｅｃｏ
ｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ａｕｔｉｓｍ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅ
ｎｔｓ ｆｏｒ Ａｕｔｉｓｍ ａｎｄ ＰＤＤ，２６５−２８９頁（Ｓｈａｗ
、１９９８）を参照のこと）。
【０５７０】 Ｌｅｗｉｓによって提案された第１の理論は、軽度の段階のセリアック病が、
全てではないが、自閉症幼児に多く存在し得、これが、腸のペプチド吸収不全（
ｍａｌａｓｏｒｐｔｉｏｎ）および関連する神経学的症状を導くということであ
る（Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｓ．，「Ｄｉｅｔａｒｙ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ：Ｗｈｙ ｉｍｐｌｅ
ｍｅｎｔ ａ ｇｌｕｔｅｎ ａｎｄ ｃａｓｅｉｎ ｆｒｅｅ ｄｉｅｔ？」
：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ａｕｔｉｓｍ ａｎ
ｄ ＰＤＤ，１９６−２２６頁（Ｓｈａｗ、１９９８））。Ｓｈａｗは、第２の
理論、すなわち、観察された外因性ペプチドが、腸の酵母感染の結果であり、こ
の感染は、穀物および乳汁の炭水化物成分によって刺激されるということを提唱
した（Ｓｈａｗ，Ｗ．ら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ Ｋｒｅｂｓ ｃｙｃｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａ
ｎｄ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｎ ｔｗｏ ｂｒｏｔｈｅｒｓ ｗｉｔｈ ａｕ
ｔｉｓｔｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１：１０９４−
１１０４（１９９５）；およびＳｈａｗ，Ｗ．，「Ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ
ｔｅｓｔｉｎｇ，ｂｙｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅｉ
ｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ａｕｔｉｓｍ」：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ａｕｔｉｓｍ ａｎｄ ＰＤＤ，３１−６５
頁（Ｓｈａｗ、１９９８））。腸内酵母は、二次代謝物として外因性ペプチドを
直接的に産生し得るか、またはこれらのペプチドは、酵母が産生する高レベルの
還元糖によって生じる架橋によって、間接的に血液中に形成され得る。自閉症幼
児の食餌中のセクレチンおよびペプチダーゼの補給の効力に関する臨床データに
基づいて、Ｓｈａｗは、第３の可能性のある機構を提唱し、これは、消化酵素が
、自閉症患者において適切に機能していないかもしれないということを示唆する
（Ｓｈａｗ、Ｗ．，「Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓ
ｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ」：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏ
ｒ Ａｕｔｉｓｍ ａｎｄ ＰＤＤ，１２４−１３８（Ｓｈａｗ，１９９８））
。
【０５７１】 本発明の方法をどのように使用して、これらの理論間を区別し得るかは、腸を
介するペプチド吸収の２画分の薬物動態学モデルから観察され得る（Ｎｏｔａｒ
ｉ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｋｉｎｅｔｉｃｓ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，第２版、Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ（１９７５））。腸壁を介する外因性ペプチドのフラックス
（ｇp）は、以下：
【０５７２】
【数４】 によって表され、ここで、ｋtは、この腸壁についての質量輸送係数であり、Ｋ
ｉおよびＫbは、腸壁におけるペプチドの溶解についての平衡定数であり、
【０５７３】
【数５】 は、それぞれ、腸および血液におけるペプチド濃度である。
【０５７４】 腸壁を介するペプチドのフラックスは、腸におけるペプチドのペプチダーゼ消
化の速度（ｒp）と競合し、このｒpを、本発明者らは、以下：
【０５７５】
【数６】 によって表し、ここで、ｋは、速度定数であり、Ｅpは、腸におけるペプチダー
ゼ濃度であり、そしてＫmは、ミカエリス定数である。
【０５７６】 代表的には、以下：
【０５７７】
【数７】 であるので、血液中のペプチド濃度は、時間（ｔ）の関数として、以下：
【０５７８】
【数８】 によって示され、ここで、Ｖiは、腸に含まれる容量であり、Ｖbは、体内の分配
容量であり、そして
【０５７９】
【数９】 は、腸におけるペプチドボーラスの初濃度である。ここで、
【０５８０】
【数１０】 の場合、式３は、以下：
【０５８１】
【数１１】 によって近似され得る。式４から、腸壁を横切るペプチドの量は、腸におけるペ
プチド消化の速度（ｋＥＶｉ）に対する透過速度（ｋtＳ）の比によって決定さ
れることが、容易に明らかである。
【０５８２】 血液中のペプチドの蓄積速度も等しく重要であり、これは、腸におけるペプチ
ダーゼ活性（ｋＥ）に主に依存することが予測される（式４）。従って、血液中
のペプチド蓄積のタイムコースの測定を使用して、吸収不全をもたらす基礎とな
る機構を同定し得、そして最も適切な治療過程に対する有意な洞察を提供し得る
。より詳細には、これは、自閉症幼児の血液中および尿中の外因性ペプチドの出
現についての以下の２つの可能な理由、すなわち：（１）腸壁は、セリアック病
ににある場合に損なわれ、ペプチド透過性（ｋt）の増加を生じるか、または（
２）自閉症幼児は、ペプチダーゼ欠損症（例えば、低いペプチダーゼ酵素レベル
（すなわち、正常なペプチダーゼ活性よりも低い））を罹患し得る、の間を区別
するための基礎を提供する。
【０５８３】 コムギから生じる外因性ペプチドの供給源（すなわち、不適切な消化および吸
収不全または微生物刺激）を同定するために、自閉症幼児（およびコントロール
群）に、13Ｃ富化コムギ粉および正常なコムギ粉の混合物を食餌させる。外因性
ペプチドを、自閉症群およびコントロール群の血漿および尿から同定する。質量
分析技術を使用して、同定された任意の外因性ペプチドの安定同位体の比を確認
する。摂取されたコムギ粉混合物の相対的な存在比に対して等しい相対的な存在
比を有する、２つの優位な同位体ピークを示すペプチドは、コムギタンパク質自
体からのみ直接的に誘導され得る。摂取されたコムギ粉混合物の相対的な存在比
とは異なる相対的な存在比にある、複数の同位体ピークを示すペプチドは、コム
ギタンパク質の完全な消化後（すなわち、構成する13Ｃアミノ酸および12Ｃアミ
ノ酸は、混合する機会を有した後）にしか形成され得ない。追跡実験において、
患者に、プロテアーゼで消化したコムギ混合物を食餌させる。これらの患者は、
コムギタンパク質に由来するいかなる外因性ペプチドを示すはずがないが、体内
の微生物合成または疾患関連性の合成に由来するペプチドをなお示すはずである
。
【０５８４】 関連する方法を使用して、任意の外因性ペプチドが、血液脳関門を通過する（
神経学的障害を生じる可能性を有する）か否かを同定し、そしてそれらの最終的
な供給源を同定する。不完全な消化および食品タンパク質の吸収不全に直接的に
由来するペプチドは、本明細書中に記載される方法に従って、コムギ粉混合物の
摂取後の自閉症幼児から採取した脳脊髄液において、直接的に検出され得る。13 Ｃ富化アミノ酸を供給し、同時に１以上のアミノ酸の静脈内補給を提供すること
によって、コムギタンパク質に直接的に由来しない外因性ペプチドの可能性のあ
る供給源を、同定し得る。腸中の微生物起源のこれらのペプチドは、高い比の13 Ｃ−アミノ酸を含有する。低い安定同位体含量（特に、静脈内投与されたアミノ
酸の）は、血液中またはヒト組織中で合成されたペプチドを示す。ペプチダーゼ
またはセクレチン補充の効力は、この技術を用いて同様に調べられ得る。
【０５８５】 腸から発生する外因性ペプチドが脳脊髄液中に現れることを立証すること、お
よびこれらのペプチドの最終的な供給源を同定することが、自閉症の適切な臨床
処置において使用され得る。例えば、この安定同位体技術は、臨床医のための迅
速な早期診断ツールの開発において使用され得、食餌または酵母感染の影響が不
可逆的になる前のより早期の臨床介入を可能にする。
【０５８６】 （実施例２２） （Ｅ．ｃｏｌｉにおける［13Ｃ］6−グルコースおよび［12Ｃ］6−グルコース
の代謝の検出） 本実施例において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αの培養物を
、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，Ｐ．Ｌ．Ｂｌｏｃｈ
およびＤ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１９：７３６（１９７
４）］に記載されるように、［12Ｃ］−グルコースモルホリノプロパンスルホン
酸緩衝化最小培地中、３７℃で、ＡＵ600＝０．７の細胞密度まで対数的に増殖
させた。この細胞密度の時点で、０．８４ｍｌの［13Ｃ］6−グルコースの５０
０ｍＭ溶液を、８４ｍｌのこの培養物に添加し、ほぼ等モル比の［13Ｃ］6−グ
ルコースおよび［12Ｃ］6−グルコースを生じた。約８ｍｌのアリコートを、培
養物から定期的に収集し、そして２ｍｌの氷冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中でク
エンチし、最終濃度１０重量％ＴＣＡにした。このクエンチしたサンプルを、４
，０００ｒｐｍ、１０℃で、４０分間遠心分離した。このＴＣＡ上清のアリコー
ト（１ｍｌ）を、２ｍｌの微量遠心管に配置し、Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ Ｖ
ａｐ中で濃縮し、乾燥させた。このサンプルを、ＨＰＬＣグレードの水に再懸濁
し、各時点のサンプルについての再懸濁した濃縮物を合わせて０．７ｍｌの総量
にした。
【０５８７】 この再懸濁したＴＣＡ可溶性画分を、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｒｉ
ｎｅｒTMマイクロエレクトロスプレー飛行時間型質量分析計で、陰イオン様式に
おける質量分析に供した。この質量分析計は、製造者の説明書に従って、分析直
前に較正した。サンプルを、１６０Ｖのノズル電位および１７０℃のノズル温度
で、このエレクトロスプレーイオン化システムに０．３μｌ／分で連続的に供給
した。質量スペクトルを、約１５分間蓄積した。
【０５８８】 質量スペクトルデータを、各位置より正確に６．０２０１３ａｍｕより高い位
置で測定されたカウントを、各質量位置におけるピークカウントで除算すること
により分析し、全ての６炭素種についての13Ｃ／12Ｃ同位体比スペクトルを得た
。各時点で採取したサンプルについて得られた13Ｃ／12Ｃ比スペクトルを、一緒
にプロットし、そして定時サンプルにわたって一貫して変化したピークについて
、手動で調査した。この分析において、０時間のスペクトルが、１より有意に小
さいピークを示し、そして基質添加後（すなわち、13［Ｃ］−グルコースの代謝
後）から十分に長い時点のスペクトルは、１に近い平衡値に漸近的に到達するこ
とが予測される。比スペクトルの手動調査は、７つのこのような可能性のある６
炭素代謝物を示した（図３３−４１）。
【０５８９】 平衡基質比は、ほぼ等モルであることが予測されるので、実際のＭＳスペクト
ル（全カウントに対して測定された）を、この比分析から得られた対応する12Ｃ
および13Ｃの位置の各々で分析した。７つの推定される６炭素代謝物のうちの３
つは、この第２レベルの分析によって排除された。なぜなら、推定される12Ｃお
よび13Ｃのピークは、同じ大きさで見い出されなかったからである（図３３、３
７および３９）。
【０５９０】 最後に、代謝フラックスを、以下の式：
【０５９１】
【数１２】 に当てはめることによって決定した。ここで、ＲＡssは、無視される。１５０．
８７ａｍｕ（図３４）および１５２．８８ａｍｕ（図３５）の代謝物のみが、０
とは有意に異なる代謝フラックス値を有することが見い出され、そして長時間の
時点で13Ｃおよび12Ｃの両方の位置でほぼ等モルのピークを示した。これらの質
量位置は、６つのグルコース炭素から直接的に得られる実際の代謝物にもっとも
対応するようであり、従って、これが、これらの増殖条件でのＥ．ｃｏｌｉによ
るグルコース代謝の代謝性Ｃ6フィンガープリントに対応する。１５０．８７ａ
ｍｕおよび１５２．８８ａｍｕの代謝物の代謝フラックスは、それぞれ、１×１
０-2ｓ-1ＡＵ600 -1および９×１０-3ｓ-1ＡＵ600 -1に近似することが見い出され
た。
【０５９２】 類似の分析を、５炭素代謝物に対して行い、これは、２つの５炭素代謝物がま
た、［13Ｃ］−グルコース代謝に由来し得ることを示唆した（図４０および４１
）。しかし、長時間の時点でのみ、２７８．８１ａｍｕ代謝物が、13Ｃ含量にお
ける任意の有意な増加を示し（図４０）、これは、このピークが、実験による人
為的産物であり得ることを示唆する。２８０．８０ａｍｕ代謝物は、焼く４×１
０-3ｓ-1ＡＵ600 -1の実際のフラックスを示すようであり、これは、６炭素代謝
物について観察されたフラックスの約半分である。これらの代謝物の化学的実体
は、未知である。
【０５９３】 類似の分析を、４、３および２炭素代謝物レベルで行い、質量スペクトルデー
タに見い出される［13Ｃ］−グルコースから生じる明らかな13Ｃ−代謝物は存在
しなかった。
【０５９４】 本明細書中で記載される実施例および実施形態は、例示的目的のみのものであ
り、それらを考慮する種々の改変または変更は、当業者に示唆され、そして本出
願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解され
る。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、各々個々の
刊行物、特許または特許出願が、参考として特定かつ個々に援用されるように特
定かつ個々に示されるような程度で、全ての目的のためにそれらの全体が参考と
して本明細書によって援用される。
【０５９５】
【表６】
【０５９６】
【表７】
【０５９７】
【表８】
【０５９８】
【表９】
【０５９９】
【表１０】
【０６００】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の特定の方法を用いて利用され得る、代表的な電気泳動システ
ムの１例の概略図である。
【図２】 図２Ａは、本発明の特定の電気泳動方法を行うのに利用される、代表的な電気
泳動システムの主なエレメントのいくつかの概略図である。図２Ｂは、本発明の
特定の方法における電気浸透フローを制御するためにキャピラリーに挿入された
多孔性プラグの配向を示す、キャピラリーの断面図である。
【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、本発明の特定の電気泳動法を行うのに利用され得る、マ
イクロ流体デバイスの特定のエレメントの平面図である。
【図４】 図４は、キャピラリーゾーン電気泳動による電気泳動の後に得られる、５つの
未標識のタンパク質（ニワトリ卵白コンアルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ
炭酸脱水酵素ＩＩ、炭酸脱水酵素ＩＩ、ウサギ筋肉ＧＡＰＤＨ、およびウシリボ
ヌクレアーゼＡ）を含むサンプルのための電気泳動図である。吸光度は、２１４
ｎｍでモニタされた。このタンパク質が未標識である、この特定の実験の条件下
（実施例１を参照のこと）で、これらのタンパク質は分離されなかった。
【図５】 図５は、図４に記載したのと同一の電気泳動条件下で、図４において列挙され
た５つのタンパク質についての電気泳動移動度のプロットである。
【図６】 図６は、電気泳動移動度とｐＨ４．０でのタンパク質の予測される質量／電荷
比との間の相関を示すプロットである。
【図７】 図７は、キャピラリーゾーン電気泳動による電気泳動後に得られる、５つのス
ルホフェニルイソチオシアネート標識化タンパク質（ニワトリ卵白コンアルブミ
ン、ウシ血清アルブミン、ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ、炭酸脱水酵素ＩＩ、ウサギ筋
肉ＧＡＰＤＨ、およびウシリボヌクレアーゼＡ）を含むサンプルの分離中に得ら
れる電気泳動図である。吸光度は、２１４ｎｍでモニタされた。このタンパク質
が標識される、この特定の実験の条件下（実施例２を参照のこと）で、これらの
標識化タンパク質は部分的に分離された。
【図８】 図８は、タンパク質（ニワトリ卵白コンアルブミン、ウシ血清アルブミン、お
よびウシ炭酸脱水酵素ＩＩ）を含むサンプルのＣＩＥＦによる分離中に得られる
、電気泳動図である。
【図９】 図９は、図７に示されるＣＩＥＦによる分離から得られる、画分（画分Ｆ）の
電気泳動図である。
【図１０】 図１０は、図７において示されるＣＩＥＦによる分離から得られる、画分（画
分Ｇ）の電気泳動図である。
【図１１】 図１１は、グリコーゲンホスホリラーゼＡタンパク質の低フラグメント化１２
Ｖスペクトルを提供する。７００ａｍｕと４０００ａｍｕとの間で観察される多
電荷質量ピークのゼロ電荷質量デコンボリューションは、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｄａ
ｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒTMソフトフェアを用いて調製された。
【図１２】 図１２は、ノズル電位の上昇とともにアセチル化ポリペプチド質量に対応する
ピークの相対的存在度の上昇を例示する。
【図１３】 図１３は、グリコーゲンホスホリラーゼＡの２５０Ｖノズル電位に対応する実
質的にフラグメント化した質量スペクトルの例を提供する。
【図１４】 図１４は、ＰＩＴＣ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎペプチドの低フラグメント化１２
Ｖスペクトルを提供する。７００ａｍｕと４０００ａｍｕとの間で観察される多
電荷質量ピークのゼロ電荷質量デコンボリューションは、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｄａ
ｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒTMソフトフェアを用いて調製された。
【図１５】 図１５は、ノズル電位の上昇とともにＰＩＴＣ標識化ペプチドの質量に対応す
るピークの相対的存在度の上昇を例示する。
【図１６】 図１６は、ＰＩＴＣ標識化Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの２５０Ｖノズル電位に対応
する、実質的にフラグメント化したスペクトルの例を提供する。
【図１７】 図１７は、ＩＭＢ標識化ペプチドフラグメントの質量から生成されるα−イオ
ン（図１７）およびβ−イオン（図１８）に対応するピーク数が、約２００Ｖで
の最大フラグメント化存在度を用いてノズル電位の上昇とともに相対的存在度に
おいて上昇することが明らかに観察されたことを例示する。
【図１８】 図１８は、ＩＭＢ標識化ペプチドフラグメントの質量から生成されるα−イオ
ン（図１７）およびβ−イオン（図１８）に対応するピーク数が、約２００Ｖで
の最大フラグメント化存在度を用いてノズル電位の上昇とともに相対的存在度に
おいて上昇することが明らかに観察されたことを例示する。
【図１９】 図１９は、陰イオン様式において得られる、ＳＰＩＴＣ標識化アポミオグロビ
ン由来の質量スペクトルを示す。このノズル電位は、２５〜５０Ｖの増分で１２
５Ｖの最小設定から３００Ｖの最大値まで上昇され（１分間の割り当てられた機
器平衡時間を有する）、その後各々のノズル電位でスペクトルを集めた。総数３
０の３秒のスペクトルは、各々のノズル電位での分析のために蓄積された。
【図２０】 図２０は、２５０Ｖのノズル電位以上で生じる、β1イオン、α2イオン、β2
イオン、α3イオン、およびβ3イオンの相対的存在度の上昇を示す。
【図２１】 図２１は、陽イオン様式において得られる、Ｃ末端（２−アミノエチル）トリ
メチルアンモニウム標識化Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎペプチドから生成される二重荷
電したｙ1〜7イオンの相対的存在度の上昇を示す。このノズル電位は、５０Ｖの
増分で最小５０Ｖから最大３００Ｖまで上昇され（１分間の割り当てられた機器
平衡時間を有する）、その後各々のノズル電位でスペクトルを集めた。総数６０
の３秒のスペクトルは、各々のノズル電位での分析のために蓄積された。
【図２２】 図２２は、本発明によって記載される共有結合化学標識の概略図である。
【図２３】 図２３は、本発明によって包含される共有結合化学標識の例を描写する。
【図２４】 図２４は、本発明の実施形態の進行工程を示す、説明図である。
【図２５】 図２５は、予期されるタンパク質の質量分析法のフラグメント化パターンの概
略図および本発明を用いて質量分析法のフラグメント化パターンからタンパク質
配列を再構築する方法である。
【図２６】 図２６は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのｐｈｏレギュロンの遺伝子座
マップである。ｐｈｏ調節コントロールのオペロンは、ゲノムの外に示される。
このフォト遺伝子（４つの遺伝子を含むｃｒｅオペロンの一部）は、ゲノムの内
側に示される。
【図２７】 図２７は、リン酸不足の前およびその間に、Ｅ．ｃｏｌｉによって示される、
アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）と全タンパク質合成速度を示す。リン酸不
足の徴候は、３時間の直後に発生する。
【図２８】 図２８は、指数関数的増殖（ＥＸＰ）の間、およびＥ．ｃｏｌｉのリン酸不足
の間に、差動的に発現される５３タンパク質の時間的な発現を示す。
【図２９】 図２９は、ノズル電圧（それぞれ、２７０Ｖ（上方のスペクトル）および１５
０Ｖ（下方のスペクトル））の関数として、ＥＳＩ−ＴＯＦ装置のイオン化領域
のウシリボヌクレアーゼＡのＭＳ誘導フラグメンテーションの能力の変化を示す
。
【図３０】 図３０は、Ｎ末端配列に適切な「ハード」または「ソフト」な正電荷の標識、
ならびに本明細書、米国出願第０９／５１３，３９５号、同０９／５１３，４８
６号および同０９／５１３，９０７号に記載される方法によるタンパク質のおよ
び増強した蛍光検出の例を提供する。
【図３１】 図３１は、Ｎ末端配列に適切な「ハード」または「ソフト」な正電荷の標識、
ならびに本明細書、米国出願第０９／５１３，３９５号、同０９／５１３，４８
６号および同０９／５１３，９０７号に記載される方法によるタンパク質のおよ
び増強した蛍光検出の例を提供する。
【図３２】 図３２は、カルボジイミドによるＣ末端標識化に適切な化合物、ならびに本明
細書、米国出願第０９／５１３，３９５号、同０９／５１３，４８６号および同
０９／５１３，９０７号に記載される方法によって、タンパク質のＣ末端配列お
よび増強した蛍光検出のための無水付着化学物質の例を提供する。
【図３３】 図３３は、（Ａ）１３６．８８ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの１３６．８８ａｍｕ位置での数値に対す
る、１４２．９０ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）１３６．８８ａｍｕ
での13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、
代謝物のフラックスである。
【図３４】 図３４は、（Ａ）１５０．８７ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの１５０．８８ａｍｕ位置での数値に対す
る、１５６．８９ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）１５０．８７ａｍｕ
での13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、
代謝物のフラックスである。
【図３５】 図３５は、（Ａ）１５２．８８ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの１５２．８８ａｍｕ位置での数値に対す
る、１５２．９０ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）１５２．８８ａｍｕ
での13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、
代謝物のフラックスである。
【図３６】 図３６は、（Ａ）２８１．７７ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの２８１．７７ａｍｕ位置での数値に対す
る、２８７．７９ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）２８１．７７ａｍｕ
での13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、
代謝物のフラックスである。
【図３７】 図３７は、（Ａ）３２８．７６ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの３２８．７６ａｍｕ位置での数値に対す
る、３３４．７８ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）３２８．７６ａｍｕ
での13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、
代謝物のフラックスである。
【図３８】 図３８は、（Ａ）３３０．７６ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの３３０．７６ａｍｕ位置での数値に対す
る、３３６．７８ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）３３０．７６ａｍｕ
での13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、
代謝物のフラックスである。
【図３９】 図３９は、（Ａ）４９４．８４ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に６．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの４９４．８４ａｍｕ位置での数値に対す
る、５００．８６ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）４９４．８２ａｍｕ
での13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、
代謝物のフラックスである。
【図４０】 図４０は、（Ａ）２７８．８０ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に５．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの２７８．８０ａｍｕ位置での数値に対す
る、２８３．８２ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）２７８．８０ａｍｕ
での13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、
代謝物のフラックスである。
【図４１】 図４１は、（Ａ）２８０．８０ａｍｕ付近の質量スペクトルのセクション；（
Ｂ）［13Ｃ］6−代謝物のピークが存在する位置に対応する、正確に５．０２ａ
ｍｕ高い質量スペクトルの類似のセクション；（Ｃ）６個の炭素の13Ｃ／12Ｃの
代謝物比に対応する、質量スペクトルの２８０．８ａｍｕ位置での数値に対する
、２８５．８２ａｍｕ位置での数値の比；ならびに（Ｄ）２８８．８０ａｍｕで
の13Ｃ／12Ｃ比の経時的な変化に対する、曲線あてはめによって決定される、代
謝物のフラックスである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/60 Ｚ 33/60 Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｆ Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｋ ３３１Ｅ ３１５Ｇ ３２５Ａ ３１５Ｈ (31)優先権主張番号 ０９／５１３，４８６ (32)優先日 平成12年２月25日(2000．2．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／５１３，９０７ (32)優先日 平成12年２月25日(2000．2．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ホール， マイケル ピー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94070， サン カルロス， ナンバー11， ロー ラル ストリート 1364 (72)発明者 ペテシュ， ロバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 94560， ニューアーク， ロバートソン アベニ ュー 6004 (72)発明者 ピーターソン， ジェフリー エヌ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォースター シティ， ナンバー410， バウンティ ドライブ 704 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BB20 CA25 CA26 CB03 CB04 CB07 CB09 CB12 CB13 CB14 DA01 DA02 DA10 DA12 DA13 DA14 DA30 DA36 DA60 FA11 FA36 FB05 FB07 FB08 JA01 4H045 AA50 BA50 CA40 GA31 GA32 5B075 ND20 QM08

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液からポリペプチド
    種を分離し、そして該ポリペプチド種を同定するための方法であって、該方法は
    、該複数のポリペプチド種を含む該サンプル溶液をキャピラリー電気泳動デバイ
    スで電気泳動してポリペプチド種を分離および溶出し、それによりタンパク質種
    を、タンパク質種を区別する少なくとも１つの第１の生物物理学的パラメーター
    に基づいて分離する工程；ならびに溶出されたポリペプチド種の質量分析フラグ
    メンテーションにより、少なくとも１つの分離されたタンパク質種を同定するポ
    リペプチド配列タグ（「ＰＳＴ」）を得る工程、を包含する方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで該方法は、第２のキ
    ャピラリー電気泳動デバイスにおいて前記キャピラリー電気泳動デバイスから溶
    出されたポリペプチド種を電気泳動して、ポリペプチド種を分離および溶出し、
    それにより該タンパク質種を、タンパク質種を区別する少なくとも１つの第２の
    生物物理学的パラメーターに基づいて分離する工程、ならびに該工程の後、該工
    程により得られた該ポリペプチド種に対して質量分析フラグメンテーションを行
    う工程、をさらに包含する方法。
  3. 【請求項３】 前記キャピラリー電気泳動デバイスが、キャピラリー等電点
    電気泳動（ＣＩＥＦ）デバイス、キャピラリーゾーン電気泳動デバイス（ＣＺＥ
    ）、またはキャピラリーゲル電気泳動デバイス（ＣＧＥ）である、請求項１に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 前記キャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＩＥＦデバイスで
    あり、そして前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスがＣＺＥデバイスまたは
    ＣＧＥデバイスのいずれかである、請求項２に記載のデバイス。
  5. 【請求項５】 前記キャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＺＥデバイスであ
    り、そして前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＩＥＦデバイスまた
    はＣＧＥデバイスのいずれかである、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記キャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＧＥデバイスであ
    り、そして前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスがＣＩＥＦデバイスまたは
    ＣＺＥデバイスのいずれかである、請求項２に記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項２に記載の方法であって、ここで該方法は、第３のキ
    ャピラリー電気泳動デバイスで前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスから溶
    出されたポリペプチド種を電気泳動して、ポリペプチド種を分離および溶出し、
    それにより該タンパク質種を、タンパク質種を区別する少なくとも１つの第３の
    生物物理学的パラメーターに基づいて分離する工程、ならびに該工程の後、該工
    程により得られた該ポリペプチド種に対して質量分析フラグメンテーションを行
    う工程、をさらに包含する方法。
  8. 【請求項８】 前記キャピラリー電気泳動デバイスが、ＣＩＥＦデバイスで
    あり、そして前記第２のキャピラリー電気泳動デバイスがＣＺＥデバイスであり
    、そして前記第３のキャピラリー電気泳動デバイスがＣＧＥデバイスである、請
    求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記複数のポリペプチド種を含むサンプル溶液が、標識され
    たポリペプチド種を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ポリペプチド種が、キャピラリー電気泳動の後で、か
    つ質量分析の前に標識される、請求項１、２または７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記標識が、検出可能な部分を含む、請求項９または１０
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記標識が、イオン質量サイン成分を含む、請求項９また
    は１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記標識が、イオン質量サイン成分および検出可能な部分
    を含む、請求項９または１０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 細胞型、組織または病理学的サンプルについての高分解能
    タンパク質発現フィンガープリントを同定するための方法であって、細胞サンプ
    ルのタンパク質含有抽出物を得る工程、および該抽出物を第１のキャピラリー電
    気泳動装置を用いて電気泳動する工程、該第１のキャピラリー電気泳動装置から
    タンパク質含有画分を溶出する工程、第２のキャピラリー電気泳動装置で該タン
    パク質含有画分を電気泳動する工程、または並行して複数の第２のキャピラリー
    電気泳動装置で該タンパク質含有画分を電気泳動する工程、およびフラグメンテ
    ーション質量分析配列決定によりタンパク質の種を同定して、複数のタンパク質
    種についてのＰＳＴを得る工程、およびそれにより得られたＰＳＴの集合を含む
    、データセットまたはフィンガープリント記録を集める工程を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法であって、タンパク質種の定量的
    検出工程およびデータセットを集める工程を包含し、ここで前記第２のキャピラ
    リー電気泳動から溶出された複数のタンパク質種の相対的存在量および／または
    絶対量が、ＰＳＴ同定と相互作表される、方法。
  16. 【請求項１６】 コンピュータシステムであって、以下： 複数のフィンガープリント記録を含むデータベースであって、該フィンガープ
    リント記録は、サンプル中の各種の相対的存在量および／または絶対的存在量を
    示す定量的データとともに相互作表される独特の識別子をそれぞれ有する少なく
    とも５０の分子種のアレイを各々含む、データベース、 ならびに、該データベースにおける該フィンガープリント記録のランク順の類
    似性を決定する際に使用するための、該データベースに対する１つ以上のクエリ
    の選択を受容し得るユーザインターフェース、を備える、コンピュータシステム
    。
  17. 【請求項１７】 請求項１に記載の方法により生成された分離座標と相互作
    表されたＰＳＴを各々有する、少なくとも５０のタンパク質種のアレイを含むフ
    ィンガープリント記録を有する、請求項１６に記載のコンピュータシステム。
  18. 【請求項１８】 請求項１に記載の方法により得られたＰＳＴを各々有する
    、少なくとも５０のタンパク質種のアレイを含むフィンガープリント記録を有す
    る、請求項１６に記載のコンピュータシステム。
  19. 【請求項１９】 コンピュータデータベースを生成するかまたはコンピュー
    タデータベースにアクセスするための方法であって、該コンピュータデータベー
    スは、コンピュータで取出し可能な形態でタンパク質発現フィンガープリント記
    録の集合を格納するためのコンピュータおよびソフトウエアを備え、該タンパク
    質発現フィンガープリント記録が、タンパク質含有サンプルの供給源を提示した
    データと相互作表され、該タンパク質含有サンプルから各々のタンパク質発現フ
    ィンガープリント記録が得られた、方法。
  20. 【請求項２０】 前記供給源の少なくとも１つは、病理学的障害の無いこと
    が既知である組織サンプル由来である、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記供給源の少なくとも１つは、既知の病理学的組織標本
    である、請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 タンパク質サンプル中の複数の異なるタンパク質を標識す
    る方法であって、該方法は、該タンパク質サンプルを標識化剤と接触させる工程
    を包含し、該標識化剤は、独特のイオン質量サイン成分、定量的検出成分、およ
    び標識を該複数の異なるタンパク質の少なくとも一部に共有結合で連結するため
    の反応性官能基を含む、方法。
  23. 【請求項２３】 前記タンパク質サンプルが、少なくとも５つの異なるタン
    パク質を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記検出増強成分が、ナフチルアミン類、クマリン類、ア
    クリジン類、スチルベン類およびピレン類からなる群から選択される蛍光団であ
    る、請求項２２に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記検出増強成分が、１−ジメチルアミノナフチル−５−
    スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、２−ｐ−トルイジ
    ニル−６−ナフタレンスルホネート、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン
    、９−イソチオシアナトアクリジン、アクリジンオレンジ、Ｎ−（ｐ−（２−ベ
    ンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド、およびベンゾオキサジアゾールから
    なる群から選択される蛍光団である、請求項２２に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 最初のサンプル中の複数のタンパク質を分離するための方
    法であって、該方法は以下： 一連の複数の電気泳動方法を実行する工程であって、各電気泳動方法が、 複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動する工程であって、それにより、
    複数の分離されたタンパク質が得られる工程を包含し、そして ここで該電気泳動されたサンプルは、該一連の方法のうちの第１の方法を除い
    て、該一連の方法における直前の方法からの該複数の分離されたタンパク質のサ
    ブセットのみを含み、該第１の方法において該サンプルが該最初のサンプルであ
    る、工程；ならびに 最後の電気泳動方法から分離されたタンパク質を検出する工程、 を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 前記複数の電気泳動方法が、キャピラリー電気泳動方法で
    ある、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記複数のキャピラリー電気泳動方法は、キャピラリー等
    電点電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動か
    らなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記複数のキャピラリー電気泳動方法が、２つの方法であ
    って、第１の電気泳動方法が、キャピラリー等電点電気泳動であり、そして第２
    の電気泳動方法が、キャピラリーゲル電気泳動である、請求項２７に記載の方法
    。
  30. 【請求項３０】 複数のキャピラリー電気泳動方法が２つの方法であり、第
    １の電気泳動方法が、キャピラリーゾーン電気泳動であり、そして第２の電気泳
    動方法が、キャピラリーゲル電気泳動である、請求項２７に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記複数のキャピラリー電気泳動方法が、３つの方法であ
    り、第１、第２および第３の電気泳動方法が、それぞれキャピラリー等電点電気
    泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動である、請
    求項２７に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２６に記載の方法であって、ここで 前記実行する工程が、前記電気泳動工程を複数回繰り返す工程をさらに包含し
    、各回において、前記一連の方法における直前の方法からの前記複数の分離され
    たタンパク質のサブセットのみを含む異なるサンプルを用い、それにより該異な
    るサンプルの各々について複数の分離されたタンパク質が得られ；そして 前記検出する工程が、前記最後の電気泳動方法からの前記異なるサンプルの各
    々からの分離されたタンパク質を検出する工程を包含する、方法。
  33. 【請求項３３】 複数のタンパク質を分離するための方法であって、該方法
    は、以下： 一連の複数の電気泳動方法を実行する工程であって、ここで最後の方法の前の
    該方法が、 該電気泳動方法の間に分離されたタンパク質を含む複数の画分を抜き出して集
    める工程を包含し、そして ここで各電気泳動方法が、第１の電気泳動方法を除いて、前の電気泳動方法で
    集められた画分からのサンプルを用いて行われ、該第１の電気泳動方法が、該複
    数のタンパク質を含むサンプルを用いて行われる、工程； 該最後の電気泳動方法を行う前に、該複数のタンパク質を標識する工程、また
    は集められた画分中に含まれるタンパク質を標識する工程；ならびに タンパク質に保有される標識を検出することにより、最後の電気泳動方法の間
    に利用される電気泳動媒体中に含まれるタンパク質を検出する工程であって、該
    最後の電気泳動方法が、最後から２番目の電気泳動方法において得られる１つ以
    上の画分からのサンプルを用いて行われる、工程、 を包含する方法。
  34. 【請求項３４】 前記検出工程が、検出器でタンパク質を検出する工程を包
    含し、該検出器は、前記最後の電気泳動方法の間に利用される前記電気泳動媒体
    を含有する分離キャビティ−と流体連絡している、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記複数の電気泳動方法のうちの１つが、キャピラリーゾ
    ーン電気泳動であり、そして前記標識する工程が、該キャピラリーゾーン電気泳
    動方法を行う前に行われる、請求項３３に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記複数の電気泳動方法のうちの１つが、キャピラリー等
    電点電気泳動であり、そして前記標識する工程が、キャピラリー等電点電気泳動
    方法に続いて実行される、請求項３３に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 複数のタンパク質を分離する方法であって、該方法は、以
    下： １つ以上のキャピラリー電気泳動方法を実行する工程であって、該１つ以上の
    方法の各々が、 キャピラリー内に含まれる電気泳動媒体内に複数のタンパク質を含むサンプル
    を電気泳動する工程を包含する、工程； 複数の画分を抜き出して集める工程であって、各画分は該電気泳動工程の間に
    分離されたタンパク質を含有し、そして ここで各方法が第１の電気泳動方法を除いて、前の電気泳動方法において集め
    られた画分からのサンプルを用いて行われ、該第１の電気泳動方法が、該複数の
    タンパク質を含有するサンプルを用いて行なわれる、工程； 最後の電気泳動方法を行う前に、該複数のタンパク質を標識する工程、または
    集められた画分中に含有されるタンパク質を標識する工程；ならびに 最後のキャピラリーを用いて最後のキャピラリー電気泳動方法を行う工程であ
    って、該最後の方法が、該最後のキャピラリー中にあるか、または該最後のキャ
    ピラリーから抜き出した、分離されたタンパク質を検出する工程を包含する、工
    程、 を包含する、方法。
  38. 【請求項３８】 前記１つ以上のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリ
    ー等電点電気泳動であり、前記最後のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリ
    ーゲル電気泳動である、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記１つ以上のキャピラリー電気泳動方法が、キャピラリ
    ーゾーン電気泳動であり、そして前記最後のキャピラリー電気泳動方法が、キャ
    ピラリーゲル電気泳動である、請求項３７に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記１つ以上のキャピラリー電気泳動方法が２つの方法で
    あって、第１の方法が、キャピラリー等電点電気泳動であり、第２の方法がキャ
    ピラリーゾーン電気泳動であり、そして最後のキャピラリー電気泳動方法が、キ
    ャピラリーゲル電気泳動である、請求項３７に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 最初のサンプル中の複数のタンパク質を分離するための方
    法であって、該方法は、以下： 一連の複数の電気泳動方法を実行する工程であって、各方法が、 電気泳動媒体中で、複数のタンパク質を含有するサンプルを電気泳動し、それ
    により該複数のタンパク質のサブセットを含有する画分が、物理的に、時間的に
    、または空間的に単離される工程を包含し、そして ここで該電気泳動されたサンプルが、該一連の方法のうちの第１の方法を除い
    て、該一連の方法のうちの直前の方法の間に単離された画分から得られ、該第１
    の方法において、サンプルは、該最初のサンプルである、工程；ならびに 最後の電気泳動方法から単離されたタンパク質を検出する工程、 を包含する、方法。
  42. 【請求項４２】 複数のタンパク質を分離するための方法であって、該方法
    は、一連の少なくとも２つのキャピラリー電気泳動分離を実行する工程を包含し
    、ここで第２のキャピラリー電気泳動分離のためのサンプルが、第１のキャピラ
    リー電気泳動分離の間に得られた画分であり、該画分が、該第１のキャピラリー
    電気泳動方法の間に電気泳動されたサンプル中に含まれる複数のタンパク質のサ
    ブセットのみを含む、方法。
  43. 【請求項４３】 代謝経路を分析するための方法であって、該方法は、以下
    ： 被験体に安定同位体で標識された基質を投与する工程であって、ここで該基質
    中の該同位体の相対的同位体存在量が既知である、工程； 該標識された基質が、該被験体により少なくとも部分的に代謝されて、１つ以
    上の標的代謝産物を形成させる工程；ならびに 該被験体由来のサンプル中の複数の標的分析物における該同位体の存在量を決
    定して、各標的分析物のフラックスについての値を決定する工程であって、ここ
    で該複数の標的分析物が、該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含
    む、工程、 を包含する方法。
  44. 【請求項４４】 前記検出する工程が、前記フラックス値を決定する工程の
    前に、前記サンプル中の他の生物学的成分から、前記標的分析物を少なくとも部
    分的に分離する工程を包含する、請求項４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記分離する工程が、一連の複数のキャピラリー電気泳動
    方法を実行する工程を包含する、請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４５に記載の方法であって、ここで前記キャピラリ
    ー電気泳動方法を実行する工程が、少なくとも１つの代謝産物のクラスについて
    の別々の画分を生じ、ここで該代謝産物のクラスが、タンパク質、多糖類、炭水
    化物、核酸、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂肪、脂肪酸および有機
    酸からなる群から選択される、方法。
  47. 【請求項４７】 請求項４３に記載の方法であって、ここで前記決定する工
    程が、前記被験体から異なる所定の時点で複数のサンプルを得る工程、前記標的
    分析物を、前記サンプルの各々における他の生物学的成分から分離する工程、お
    よび各サンプル中に含有される前記標的分析物中の前記同位体の存在量を決定す
    る工程であって、それにより各標的分析物中の該同位体の存在量についての複数
    の値が得られ、各標的分析物についてのフラックス値が、各標的分析物について
    決定された複数の存在量の値から決定される、工程を包含する、方法。
  48. 【請求項４８】 代謝経路を分析するための方法であって、以下： 複数の標的分析物を、被験体から得られるサンプル中に含まれる生物学的成分
    から少なくとも部分的に分離する工程であって、該標的分析物が安定同位体で標
    識された基質および／または該被験体による該基質の代謝から生じる１つ以上の
    標的代謝産物を含み、そしてここで該基質中の該同位体の相対的同位体存在量が
    既知である、工程；ならびに 該サンプル中の複数の該標的分析物中の該同位体の存在量を決定して、各標的
    分析物のフラックスについての値を決定する工程、 を包含する、方法。
  49. 【請求項４９】 疾患と相関する代謝産物についてのスクリーニングのため
    の方法であって、該方法は、以下： 該疾患を有する試験被験体由来のサンプルを分析する工程であって、該サンプ
    ルが、該試験被験体に投与された、安定同位体で標識された基質、および／また
    は該試験被験体による該基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝産物を含み、
    該基質中の該同位体の相対的同位体存在量が、投与の時点で既知であり、そして
    ここで該分析工程が該サンプル中の複数の分析物における該同位体の同位体存在
    量を決定して、各分析物のフラックスについての値を決定する工程を包含し、こ
    こで該複数の分析物が、該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含む
    、工程；ならびに 該分析物についてのフラックス値を、コントロール被験体について得られた同
    じ分析物についてのフラックス値と比較する工程であって、ここで分析物につい
    てのフラックス値における差は、このような分析物が該疾患と相関しているとい
    うことを示す、工程、 を包含する、方法。
  50. 【請求項５０】 疾患の存在についてスクリーニングするための方法であっ
    て、該方法は、以下： 試験被験体由来のサンプルを分析する工程であって、該サンプルは、該試験被
    験体に投与される、安定同位体で標識された基質、および／または該試験被験体
    による該基質の代謝から生じる１つ以上の標的代謝産物を含み、該基質中の該同
    位体の相対的同位体存在量が、投与の時点で既知であり、そしてここで該分析工
    程が、該サンプル中の複数の分析物中の該同位体の存在量を決定して、各分析物
    のフラックスについての値を決定する工程を包含し、ここで該複数の分析物が、
    該基質および／または１つ以上の該標的代謝産物を含む、工程；ならびに 各標的分析物について、該決定されたフラックス値を、該分析物についてのフ
    ラックス値の範囲と比較する工程であって、ここで該範囲は、該疾患と相関する
    ことが既知であり、そして標的分析物について決定されたフラックス値が、該標
    的分析物についての範囲内にある場合、該試験被験体が疾患を有するか、または
    該疾患にかかり易いということを示す、工程、 を包含する、方法。
  51. 【請求項５１】 請求項１、１４、２２、２６，３３、３７、４１、４３、
    ４８、４９、または５０に記載の方法を実行するための装置であって、以下： 少なくとも２つのキャピラリー電気泳動デバイスであって、共通プラットホー
    ムまたはフレームに固定され、かつ互いに液体連絡し、かつ質量分析計を有し、
    ここでサンプルは、第１のキャピラリー電気泳動デバイスに流入し、そして分析
    物の分離は、少なくとも第１の生化学的分離パラメーターに基づいて起こり、そ
    して該分析物は、続いて第２のキャピラリー電気泳動デバイスに流入し、そして
    分析物の分離は、少なくとも第２の生化学的分離パラメーターに基づいて起こり
    、該第２の生化学的分離パラメーターが、該第１の生化学的分離パラメーターと
    異なり、そしてここで該分析物が続いて質量分析計に流入する、少なくとも２つ
    のキャピラリー電気泳動デバイス、を備える装置。
  52. 【請求項５２】 請求項１、１４、１９、２２、２６、３３、３７、４１、
    ４３、４８、４９、また５０に記載の方法、または請求項５１の装置、または請
    求項１６に記載のコンピュータシステムもしくはデータベースの使用。
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