JP2000502443A

JP2000502443A - 毛管電気泳動を使用して新規の治療コンパウンド類のための天然物サンプルのスクリーニング

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Publication number: JP2000502443A
Application number: JP09522198A
Authority: JP
Inventors: ヒューズ，ダラス，イー．; カーガー，バーリー，エル
Original assignee: ノースイースタンユニバーシティ
Priority date: 1995-12-11
Filing date: 1996-12-10
Publication date: 2000-02-29
Anticipated expiration: 2016-12-10
Also published as: DE69624942D1; CA2239418A1; ES2187685T3; EP0876609B1; US5783397A; WO1997022000A1; CA2239418C; DE69624942T2; DK0876609T3; JP3603267B2; EP0876609A1

Abstract

(57)【要約】注目する特定分子に強く結合した化合物が、天然試料成分から同時に分別および選別される方法が開示される。このように新規に分離された配位子は、潜在的に治療用または診断用の化合物の良き候補となる。天然試料は、先ず潜在的な目標分子と結合され、それから毛管電気泳動（ＣＥ）に導入される。添加された目標分子に結合した天然試料中に存在する荷電された（または中性の）化合物は、その電荷対質量比を変化させることによって、その通常の移動時間をＣＥによって変更し得るか、あるいはピーク形状または領域に変化を生じさせる。複合形態は、電気泳動の期間に、目標分子の移動を単に監視することによって検出することができる。目標分子に結合した如何なる新規な配位子も、治療用または診断用の化合物の良き候補となる。一般的に粗製の抽出物内に存在する弱い結合の妨害する配位子は、検出されない。微小な天然配位子は、荷電された配位子と同様に、既知の荷電された競争分子との結合比較実験において識別され得る。

Description

【発明の詳細な説明】名称毛管電気泳動を使用して新規の治療コンパウンド類のための天然物サンプルのスクリーニング発明の分野この発明は、新規な薬物コンパウンド類のために複合した天然サンプル類をスクリーニングすること、特に、そのようなスクリーニングに毛管電気泳動を使用することに関するものである。発明の背景天然物サンプル類において新規の薬物コンパウンド類を確認するためのスクリーニングの開発は、ユニークで、困難なチャレンジである。主要な問題には、活性コンパウンド類、スクリーニングに干渉する未知の成分及びポジティブなサンプルが得られたときのコンパウンド確認（同定）が含まれる。こられの障害に拘らず、医薬品産業は、天然プロダクトのスクリーニングに強い関心を未だに抱いている。広く認識されていることは、自然がコスト効率の点から、合成することが多くの場合困難であるか、不可能である新規の化学構造物を事実上終えることなしに供給していることである。殆どの天然プロダクツは、なんらかのバイオアクティビティ（対生物活性）を有し、歴史的には、天然物類とそれらの類似物は、医薬品コンパウンド類の最も好結果が得られる供給源になっている。治療のための天然プロダクト類のためのスクリーニング技術は、大別して二つのカテゴリー、即ちバイオアッセイとメカニズムをベースとしたアッセイに分類される（Gordon et al.，J.Med.Chem．37:1386-1401，1994）。バイオアッセイは、最古で、これまでは、最も生産的なスクリーニングツールである。バイオアッセイにより、バクテリア、真菌、ウイルス及び腫瘍細胞のような病気に関連する細胞タイプの生存力又は代謝に関する天然物サンプルのイフェクトが測定される。例えば、β−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン及びセファロスプリン）は、組織テストにおけるバクテリア成長抑制のための微生物ブロスをテストすることによって発見された。同様に、抗菌コンパウンズのナイスタチン及びアンフォテリシンＢは、特異性及びセンシビティティのものであって、バイオアッセイの殆どのものが一次スクリーンとして、より精妙なメカニズムベースのアッセイに置き換えられている。メカニズムベースのアッセイは、三つのカテゴリーに大別できるもので：組み換え細胞ベースのアッセイ、酵素（バイオケミカル）アッセイ及びバインディングアッセイである。現在のアッセイは、高いスループットキャパシティの必要性にそってデザインされており、そのため大雑把で、単純で、パラレルの処理モードにおいてのオートメーションに合うものでなければならない。組み換えの細胞ベースのアッセイは、いくつかの既知のファンクショナルリスポンスをスクリーンする。通常、ターゲットレセプター、酵素又は他のプロテインを遺伝子工学により培養細胞内に導入する。ターゲット活性度の抑制又は誘導は、容易に測定されるリスポンスと関連する。例えば、転写ファクター（ＴＦ）のモディファイヤーがＴＦのターゲットＤＮＡシーケンス（インハンサー又はプロモーター）をルシフェラーゼ（光を発する）遺伝子に融合することで測定できる。ＴＦアゴニストは、ルシフェラーゼ遺伝子の転写に帰着するもので、発光するものである。アンタゴニストが存在すれば、発光しない。酵素アッセイとバインディングアッセイとに勝るセルベースのアッセイの一つの利点は、そこなわれていない細胞を使用する点で、より生理学的に適切なリード（手掛かり）を与えることができる点である。他方、これらのスクリーンは、発展させることが極めて困難であり、スローなものであり、そして全く変わりやすいものである（Janzen et al．Society for BiomolecularScreening Meeting，Nov．7-10,1 995）。酵素アッセイは、セルフリーのスクリーンであって、精製されたターゲット分子の活性についての可溶性コンパウンド類のイフェクトを直接的に又は間接的にテストする。例えば、ウイルス性リバース転写酵素インヒビター類は、ポリウリジンＲＮＡテンプレートからの成長ＤＮＡ鎖への放射性同位元素を使って識別されたチミジンの組み込みを測定することによってスクリーニングできる。これらのアッセイは、極めてセンシティブなものであって、マイクロタイタープレート類を用いてのオートメーションに従うものである。しかしながら、天然プロダクトのスクリーニングにとって、サンプル類における未知のコンパウンド類がドラマティックに結果に干渉し、容認できない高レベルのフォールス（疑似）ネガテイブ及びフォールス（疑似）ポジテイブになってしまう。例えば、陸生植物、シアノバクテリア、海にすむ無脊椎もの及び藻類からの水性抽出物の１５％以上のものは、プラントタンニン類のような干渉化合物によりＨＩＶ抗ウイルス性スクリーンにおいてポジティブな活性を示す。(Cardellina et al.，J.Nat. Prod．56:1123-1123，1393)。バインディングアッセイは、ターゲット治療分子をバインドし、したがって、ポテンシャルに抑制する化合物に対し可溶性混合体をスクリーニングするのに特に有益である。ターゲット分子（通常プロテイン）は、マイクロタイターウエルの側面、ビーズ又はクロマトグラフサポートのようなソリッドの基体に付着又は束縛される。ターゲット分子がレセプターであれば、ソリッドのサポートに付着されているものが細胞の膜に表出される。前記サンプルは、不動態化されたターゲットと共に潜伏し、通常、関連の比色定量分析反応(colorometric re action)又は蛍光反応を介して、バインドされたリガンドが検知される。または別に、サンプルをアンチターゲット抗体を用いて、捉えられている可溶相ターゲットと混合する。このような複数のバインディングアッセイは、ターゲット−リガンド・コンプレックスの洗浄と隔離とが容易である点で、有利なものである。しかしながら、これらアッセイは、いくつかの不利益さ、特にナチュラルプロダクトのスクリーニングについて不利な点がある。一つの問題点は、マルチプルでバインディングが弱いバックグラウンドコンパウンド類は、それらが大量に存在していれば、ポジティブなシグナルを与えるものである。したがって、激しいウオッシングが可能でない限り、改良された清浄化能力が望ましい。不動態化されたターゲットのバインディングアッセイに伴う他の一般的な問題は、ターゲットプロテイン類をソリッドの基体に付着することで、該プロテインがファンクショナルに変化したり、不活性になったりすることがしばしば生じることである。この問題は、ペプチドエピトープのような不活性”ハンドル(handle)”を組み換えＤＮＡ技術を用いて前記ターゲットへ挿入することにより、ある程度解決できる。ついで、プロテイン- リガンドコンプレックスが抗体を使用して、このエピトープへ隔離できる。しかしながら、これらの人工的ターゲットを開発することは、時間がかかり、経済的でない。一般に使用されているマイクロタイター(ELISA )フォーマットの不利な点は、前記ウエル壁に通常付着しているターゲット分子が前記ウエルにくまなく分散している可溶性サンプルと接触しない点であり、これによって反応時間を延長させる必要がある。反応ボリュウムを減らして、いくつかの改良がなされている。前記困難性に拘らず、バインディングアッセイは、医薬品会社とバイオテクノロジーの会社による薬物発見努力における主要なスクリーニングツールになっている。これは、多くの好結果を得た薬物類(drugs)がキイとなる代謝経路のエッセンシャルの分子と緊密に結合することにより効能を発揮するからである。例としては、抗癌剤タクソール(taxol)及びダウノマイシン、通風薬コルヒチン及び抗血栓症剤ヒルジン及び類似物が含まれる。ゲノミックスにおける急速な進歩により，多数の病源関連遺伝子類及びそれらの対応するプロテイン類が近い将来に発見されるであろう（Bevan et a l.，Trends in Biotechnology 13:115-121，1995）。これらのエレメンツは、アフィニティ・バインディングアッセイに対する治療用ターゲットの現在のインベントリー（天然資源調査一覧）に加わるものである。これらのターゲットを利用できる開発速度が早く、コスト効率のあるスクリーニングツールは、薬物(drug) 発見ビジネスにおける重大で発展するゴールである。発明の概要発明の方法は、毛管電気泳動（ＣＥ）を使用して、パーシャルの精製ステップと溶液ベースのアフィニティアッセイとを結び付け、新規の活性コンパウンド類、例えば、ポテンシャルの新規薬物類(drugs)又は診断用コンパウンド類を複雑な生物マテリアル、特に、ナチュラルサンプル類（ＮＳ）から発見することである。この方法は、コンプレックスなナチュラルサンプル類に存在する干渉コンパウンド類により生じている検知レベルの低さ及び低いセンシティビティのような現在の医薬品上のスクリーンに関連した主要な問題を克服できる。さらに、この発明の方法は、他のプライマリーのスクリーニング方法を用いて以前に観察できなかったサンプルにおける医薬物活性を見いだすことができる。この発明の方法においては、例えば、ナチュラルサンプルからのコンプレックスな生物マテリアルの成分が、関心ある特定分子に緊密にバインドしている新規のコンパウンド類について同時に分別し、スクリーンされる。そのような新たに隔離されたリガンド類は、ポテンシャルの治療用又は診断用コンパウンド類の優秀な候補である。このシングルステップのアッセイは、極めて微量なサンプルが必要で、高度の特定の溶液ベースのアフィニティアッセイを利用するもので、真実のポジティブサンプルの確認（アイデンティフィケーン）が容易になると共に干渉するバックグラウンド成分の発生を防ぐものである。発明の一つのアプリケーションにおいて、コンプレックスな生物マテリアル、例えば、ナチュラルサンプルは、まず最初に既知のターゲット分子と組み合わされ、ついで、ＣＥにより分別される一方、ターゲット（標的）分子の移動が突きとめられる。ターゲット分子に緊密にバインドするナチュラルサンプル内に存在する電荷されたコンパウンド類は、そのノーマルの移動時間を変えるか、又は、チャージ対マスのレシオ又は全体の形状を変えることによりピーク形状又は領域に変化を生じさせる。コンプレックスなフォーメーションが電気泳動の間にターゲット分子を単純に追跡し、ナチュラルサンプルの存在における、その移動パターン又は電気泳動プロファイルを前記サンプルが存在しない、それらと比較することにより、検知できる。ターゲット分子へバインドするリガンド類は、治療リード化合物又は診断用化合物の候補である。前記方法の別のアスペクトにおいては、小さな、ニュートラルのリガンド類ならびにチャージされたリガンド類は、既知のチャージされた拮抗分子を用いる拮抗的バインディング実験において確認（アイデンティファイ）されることができる。コンペティター−ターゲット分子錯体（コンプレックス）又はバインドされていないコンペティターをリファレンススタンダードとして、特定の移動時間をもつことが観察できる。ターゲット分子に緊密にバインドされているナチュラルサンプルにおけるリガンド類は、前記コンペティターが前記ターゲットに相互作用することを許さず、かくて、ターゲット分子の観察された移動度を変える。かくして、概論的には、新規の活性化合物類のためのコンプレックスな生物マテリアルをスクリーニングする発明の方法は、コンプレックスな生物マテリアルのサンプルを提供し、該サンプルをターゲット分子と組み合わせ、先のステップからのサンプルを毛管電気泳動装置に注入し、該サンプルを毛管電気泳動させ、そして、電気泳動に基づきラベルされた、又は、ラベルされていないターゲット分子をモニターする（直接的又は間接的のいずれか）ものである。好ましくは、前記方法は、また、前記ターゲットの移動をリファレンススタンダードの移動と比較することを含む。リファレンススタンダードは、通常、インターナルコントロールとして、コンプレックスな生物サンプルの存在のもとに変化されたターゲット又はコンペティターリガンドの移動であるか否かを決定するのに使用される既知の移動時間をもつ検体である。例えば、リファレンススタンダードは、余剰のバインドされていないターゲット又はコンペティター・リガンドシフトされたターゲット、余剰のコンペティターリガンド、独立の相互作用しない分子、又は、コンプレックスな生物サンプルが存在しない状態でのターゲット又はコンペティターが通常走る時間レンジでさえでもよい。発明の別のアプリケーションにおいては、減法分析のために、スクリーニングされるべきコンプレックスな生物マテリアルのサンプルにおける全てありうる検知可能なコンパウンド類は、特定の方法により、リファレンススタンダードとして作用するために検知され、ついで、前記サンプルを電気泳動させる。ついで、スクリーニングすべき生物マテリアルの追加サンプルをポテンシャルのターゲット分子と組み合わせ、組み合わせたマテリアルをＣＥにより分別し、同じ検出方法で、すべてのコンパウンド類を再び検出する。リファレンススタンダードサンプルにおいて検出されたコンパウンド類で、（組み合わせたマテリアルの電気泳動が後続する同じ方法により）検出されたコンパウンド類に入らないコンパウンド類は、ターゲット分子の新規で有用なリガンドとして、さらに行われる分析のための候補プロダクツである。検出されれば、バインディングリガンドは、隔離され、例えば、それらの治療効能及び薬物動力特性のためにテストされる。色素共役分子及びレーザー励起蛍光を使用して、発明の方法は、前記サンプルに直接に、現行のナチュラルプロダクトのスクリーンにおける限界であるミクロモル濃度よりも非常に低い低ナノモルレンジにおけるリガンド濃度を付与する。さらに、毛管の洗浄及び毛管電気泳動システムにおけるバッファー又はマトリックスの交換が迅速に行え、アフィニティ・クロマトグラフィをベースとする標準の手順で可能なものである以上に天然のものであるナチュラルサンプルのスループットを高めるものである。この発明の方法は、低い濃度及び／又は干渉コンパウンド類の存在によりスタンダードなスクリーンでは捕捉できないナチュラルサンプルにおけるポテンシャルで有用な新規の分子を素早く検出することを可能にする。ＣＥの小形な規模の主要な利点は、稀な、又は、ポテンシャルに危険なアッセイコンポーネンツ、例えば、ナチュラルサンプルそれ自体、ターゲット分子又は使用のバッファーの量を大幅に減らすことができる点にある。この発明の方法は、微細組立のデバイスに多数の毛管又は多数のチャンネル、そして、チャンネルごと又は毛管ごとにいくつかのターゲット分子を使用することにより、オートメーションに適したナチュラルサンプルのハイスループット・スクリーニングに適合するものである。多くのケースにおいては、リードする候補のオンラインの構造情報が質量分析計、又は、ＮＭＲのような他の分析デバイスを毛管又はチャンネルに直接カップリングすることによりダイレクトに確認できる。発明の他の特徴及び利点は、発明の好ましい実施例の以下の記述から明らかになる。図面の簡単な記述図１は、発明の方法により、ナチュラルサンプルから新規のリガンドを隔離する一つの概略モデルを示し；図２ａは、発明の方法におけるダイレクトバインディングを検出する一つのモデルを示し；図２ｂは、発明の方法におけるダイレクトバインディングを検出する別のモデルを示し；図２ｃは、発明の方法におけるダイレクトバインディングを検出する別のモデルを示し；図３は、図２ａに示された発明の方法に対するモデルの一例としてトロンビンの天然インヒビター、ヒルジンの存在及び不存在の状態におけるトロンビンの毛管電気泳動を示し；図４は、図２ａに示されたモデルの追加例として、トロンビン−バインディング・アプタマー(aptamer)の存在及び不存在の状態におけるトロンビンの毛管電気泳動を示し；図５は、図２ｃに示されたモデルの例として、ヒルジンをもつ、又は、もたないトロンビン−バインディング・アプタマー(aptamer)の存在の状態におけるトロンビンの毛管電気泳動を示し；図６は、弱いバインディングのネガティブにチャージされたインヒビターの存在および存在しない状態における炭酸脱水酵素の毛管電気泳動を示し；図７は、弱いバインディングのネガティブにチャージされたインヒビターが存在し、緊密にバインディングすうニュートラルにチャージされたインヒビターの濃度が異なる状態における炭酸脱水酵素の毛管電気泳動を示し；図８は、炭酸脱水酵素の移動性になんらの相違も生じさせないマリンサンプルの存在及び存在しない状態における炭酸脱水酵素の毛管電気泳動を示し；図９は、炭酸脱水酵素の移動性に変化を生じさせたマリンサンプルの存在及び存在しない状態における炭酸脱水酵素の毛管電気泳動を示し；図１０は、トロンビンの移動性に変化を生じさせたマリンサンプルの存在及び存在しない状態におけるトロンビンの毛管電気泳動を示し；及び図１１は、減法分析の例として、異なる電気泳動コンディションのもとにおける図９のもののようなサノンルの毛管電気泳動を示す。発明の詳細な記述毛管電気泳動（ＣＥ）は、高解造度、低い検出レベル、速度及び便宜性を組み合わせたも効率的な分析／分離ツールとして広範囲な有用性を得ている。この発明の方法は、アフィニティベースの毛管電気泳動方法を使用してのナチュラルサンプル類から新規のコンパウンド類を発見するＣＥの新規の利用である。この発明の方法は、検出レベルが貧弱で、選択度に劣り、そして、コンプレックスなサンプル類に存在するインターフェアーするコンパウンド類による低度のセンシティビティといったような、天然物をソースとする現行の医薬物スクリーンに関連の大きな問題を克服するものである。この発明の方法においては、これらの問題は、解決されたものであり、これは、ナチュラルサンプルが干渉するコンパウンド類から分離されると同時に、関心ある特定の分子に緊密にバインドするコノパウンド類に対しスクリーニングされるからである。前記方法の一つのアスペクトにおいては、天然物サンプルは、まず最初に既知のターゲット分子（下記の例を参照）と組み合わされ、ついでＣＥにより分別される。図１に示すように、天然物サンプルに存在のチャージされたコンパウンド類は、前記方法の第１フェーズにおいて、付加されたターゲット分子にバインドする。この発明の方法は、最も緊密にバインドしている、それらのコンパウンド類を検出（デテクト）するように考えられている。このバインドされ、チャージされたコンパウンド類は、ターゲット分子のノーマルの移動時間を、そのチャージ対マスレシオを変えることにより変更する。前記方法の第２フェーズにおいては、コンプレックスなフォーメーションが電気泳動の間のターゲット分子の移動をモニターするだけで検出できる。検出されたリガンドのオフレートは、毛管電気泳動フェーズのランタイムに較べて長いものである。ターゲット分子にバインドするリガンドのすべては、治療用のリードコンパウンド類又は診断用コンパウンド類のための強い候補である。電気泳動分離フェーズは、治療効能及び薬物動力特性といったようなものについての後続のテストのためのバインディングリガンドの隔離と特徴づけを容易にする。かくて、一つのステップにおいて、そのままの天然物サンプルは、分別され、ポテンシャルの薬物コンパウンド類に選別される。色素共役分子とレーザー励起蛍光を用いて、この方法は、天然そのもののサンプルにおける低いナノモルの範囲におけるリガンド濃度を検出することができ、該濃度は、直近のナチュラルプロダクト・スクリーンにおけるミクロモル濃度限界よりはるかに下のものである。分別されたコンプレックスは、毛管から集められるか、又は、例えばオフラインで、又は、前記毛管を質量分光計のようなスタンダードの分析デバイスへ接続するかにより直接分析される。疾患プロセスに巻き込まれる分子は、ポテンシャルの治療用分子ターゲットである。さらに、該ポテンシャルのターゲット分子は、特定条件の診断に検出が望ましいコンパウンドである。さらに、ターゲット分子の他のカテゴリーが考えられる。例えば、農業の領域においては、前記ターゲットは、害虫のエッセンシャルのファンクションを表す分子であり得る。治療用ターゲット分子のいくつかの例が以下の表に含まれる：分子ターゲット関連した疾患 HIV 反転転写酵素ＡＩＤＳ HIV プロテアーゼＡＩＤＳ炭酸脱水酵素緑内障チュービュリン癌トロンビン凝血 HMG-CoA 還元酵索高コレステロールエラスターゼ肺気腫、Ｒｈ．関節炎シクロオキシジナーゼ炎症 p56,p59 チロシンキナーゼ癌トポイソメラーゼ癌適当な分子ターゲットの他の例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソーム、細胞膜プロテイン、発育因子、細胞メッセンジャー、テロメラーゼ、エラスチン、毒性因子、抗体、レプリカーゼ、他のプロテインキナーゼ、転写因子、特徴づけられていない(uncharacterized)疾患関連遺伝子及びそれらのＲＮＡ及びプロテインプロダクツ、特徴づけられていない(uncharacterized)疾患関連調節ＤＮＡ又はＲＮＡシーケンス、レクチン、ホルモン、代謝酵素、プロテアーゼ及びトキシンが含まれる。上記定義には、さらに、プロテインサブユニット、治療プロテインの活性ペプチドドメイン及び小さい分子の活性領域のようなリストされた分子のサブコンポーネントが含まれる。前記分子は、例えばデグライコサイレートされるように、化学的に、酵素により、又は、組み換えて変更され、電気泳動特性が改善されたり、フルオロフォール又はポリイオンが添加されて、分離及び／又は検出を容易にすように処理される。どのような純粋な、または純粋でない試料、例えば、組み換えられた、または組み換えられていない複合生物物質を含んだ天然試料は、本発明の方法によって分析されるべき適切な試料であると考えられる。天然試料は、これには限定されないが、地上及び海中の植物の抽出物、ヒトを含む高等動物の細胞、真性細菌、放線菌および他のバクテリア、微生物発酵ブイヨン、糸状菌および非糸状菌、原虫類、藻類、古菌類、虫、海中の有機物、スポンジ類、サンゴ類、甲殻類、ウイルス、ファージ、組織、器官、血液、土、海水、真水、腐植土、砕岩、肥料、泥、および汚水を含んでいる。更に、「複合生物物質」は、生物システム、例えばヒト、その他の哺乳類、または農産物において有用な可能性のある化合物の混合体を含むように意図されている。例えば、大きな化学物質ライブラリは、可能性のある治療または診断目的のために、膨大な数の化学化合物を選別（スクリーン）する調査を可能にする合成化学によってしばしば生成される。これらのライブラリは、本質的に、生物学的な構造に修正され、そして本発明の方法によって有利に選別され得る。典型的なＣＥシステムは、濾化用または相互作用用の母材を含んだり又は含まない分離用の毛管（被覆されたもの、または被覆されていないもの）と、前記毛管の入り口及び出口を提供する電気泳動用および回収用の緩衝液と、分離された試料成分を他の分析のために転送するための回収装置とを含む。特定の天然試料と特定の目標分子に対して適切な特別な条件は、当業者には良く知られた方法による定型の実験によって決定され得る。使用される条件は、主として目標分子の、全電荷、構造の安定性、機能的な活性、および種々の緩衝液および電気泳動条件下での検出電位を含む特性によって決定される。例えば、チューブリンのようないくつかのタンパク質は、ｐＨ値の狭い範囲（６．８−７．２）内で活性である。この範囲内での緩衝液の使用は、タンパク質上の全電荷、従って注入の極性を指示する。中性に近いｐＨでは、チューブリンは少しの電荷を運んで、電気泳動による移動がアノードからカソードに向かって生じるようにする。また、チューブリンのようないくつかのタンパク質の活性を維持するために高イオン強度が必要とされるので、重力注入法は、高い塩の含有量が妨害を与える動電学的注入法より好ましいものとなる。次に、電界は、緩衝液によって生成される電流に依存するものとなる。通常、高い電界は、ジュール熱によって負の効果を引き起こすほど高くなければ、好ましいものとなる。より長い毛管の全長は、分析度を改善するために使用される。しかしながら、長い毛管は、一方で実験時間を増加させ、試料の生産性に損失を与える。ＣＥはまた、溶融シリカまたはポリマーの微小チップのような平坦な表面内で開放された溝またはチャネルの形態をとる毛管中において遂行され得る。追跡される分子の移動は、典型的には毛管内にエッチングされた小さな窓に固定されたオン・カラム型の検出器を使用して観察される。その代わりに、毛管全体をスキャンすること、またはダイオード・アレイ型分光光度器を使用して個々のピーク上を完全にスキャンすることも可能である。好ましい検出方法は、ＵＶ吸収およびレーザ誘導蛍光を使用して行われる。化学ルミネセンス、屈折率、放射線核種、蛍光偏向、ＮＭＲ、質量分析、および電気化学検出もまた使用できる。直接検出用の検出変数は、大半のタンパク質に対しては２１０または２８０ｎｍでの、また核酸に対しては２６０ｎｍでの吸収率である。間接検出法は、染料ラベル付けされた目標分子または競争配位子からの大半が可視波長であるレーザ誘導放射を使用する。蛍光染料は、フルオロセイン、ローダミン、テキサス・レッド、および臭化エチジウムを含む。しかしながら、これらのラベルが目標分子上の全電荷に影響を与えることが喚起される。ＵＶ源およびレーザの例としては、重水素、キセノンおよび水銀の各ランプと、アルゴン、Ａｒ／Ｋｒ、ＨｅＣｄ、ＨｅＮｅ、ＸｅＣｌ、ＫｒＦ、窒素、および固体の各レーザとが含まれる。ＤＮＡのようないくつかの目標分子は、高分析度および複合形態の識別のために、線形ポリアクリルアミドのような、ふるい母材（シービング・マトリクス）を必要とする。炭酸水素化合物や微小分子のような他のものは、末梢誘導を必要とする。電気泳動の移動時間は、分子の電荷対質量比に比例する。荷電された、または大きな配位子の、目標分子に対する結合は、目標分子の電気泳動の移動時間の変化によって、あるいはピーク形状または領域の変化によって観察され得る。以下に詳細に説明するように、ストレプトアビジンに由来する荷電されたビオチンの結合は、ストレプトアビジンに結合していない場合と比較して、複合ストレプトアビジンの移動時間を２３秒シフトさせる結果を生じさせた。他の例では、天然産物であるヒルジンの、治療用目標タンパク質であるトロンビンに対する結合は、トロンビンのピークを消失させ、そして可能性のある複合体のピークを約１分早く出現させる結果を生じさせた。他のケースでは、ヒルジン結合は、使用されている電気泳動条件下では複合体が検出できないほどに、トロンビンの質量、電荷、および／または構造を変化させた。微小な荷電されていない配位子の結合は、荷電された配位子の結合と同様に、競争的結合試験を通して検出され得る。この方法の変形では、目標分子は天然試料と共に培養され、更に続けてまたは分離して、目標は、予測されるシフトを目標移動に生じさせる既知の荷電された配位子と相互作用させられる。このシフトの抑制または時間の変化は、既知の配位子の結合部位が、今は天然試料からの他の配位子によって占められていることを示している。例えば、相対的に弱い結合をした既知の荷電された競争配位子が電気泳動の運用緩衝液中に過剰に存在していると仮定すると、目標分子は既知の配位子と平衡して相互作用しており、また目標が追跡される時に目標／既知の配位子の複合体の移動度を変化させている。目標分子／天然試料の混合物の毛管電気泳動では、運用緩衝液中に既知の競争体が存在する場合に、目標分子に強く結合された中性または異なって荷電された配位子は、既知の配位子の結合を防止し、そして追跡される目標分子の一部は、既知の配位子が存在しない場合の目標の移動位置に戻り、かくして「ヒット」の存在が識別される。この代わりに、目標分子の追跡が困難であると仮定すると、既知の競争配位子の移動度は追跡され得る。この場合には、選択された既知の競争配位子（ラベル付けされ、またはラベル付けされていない）は、強く結合され、そして目標と等しい分子密度の目標／天然試料の混合物に添加される。天然試料混合物の電気泳動によって、競争配位子は追跡される。結合していない既知の競争配位子の再出現は、ある目標分子が今、天然試料からの新たな配位子と結合したことを意味する。目標分子に結合し、そして結合によって目標またはそれ自身の電気泳動のプロフィールに変化を生じさせる如何なる既知の荷電された分子は、競争的結合試験にとって好ましい配位子である。競争配位子の他の例は、以下の分子およびその派生物および類似物を含む：ペプチド、オリゴヌクレオチド、微小タンパク質、イオン、金属、ペプトイド、カルバメイト、ジバソーマ、ポリアミン、および微小な薬学的な分子。不活性な体内の緩衝液（例えば、メシチルオキシド、ミヨグロビン）と比較した移動時間の約５％−１０％のシフトは、充分であると考えられる。この代わりに、ピーク領域における１０％またはそれ以上の減少もまた充分である。加えて、ピークの拡大、ピークの曲がり、または新たなピークの肩を含む、ピーク形状の如何なる変化も、天然試料の配位子に対する本発明のＣＥ選別方法の実施における充分な変化である。物質のソースに依存して、天然試料は、どのような選別方法をも妨害する種々の異なる化合物を含む。これらの化合物は、ポリフェノール、ポリリン酸塩、脂質、タンパク質、多糖類、ステロール、ビタミン、および微小イオンのような一般的な分類に入る。標準液試験を一般に妨害する多くの化合物は、負に荷電されている分子（ポリリン酸塩）か、または中性に荷電されている分子（ポリフェノール、脂質）の何れかである(Bull et al.，Annual Rev．Microbiol．4 6 :219-252，1992)。それ故、追跡されている分子に純粋な正電荷を与えることによって、上述した方法は、親和力反応と同じ工程においてこれら妨害する種のほとんどを除去するように調整され得る。このことを生じさせる方法は数多くある。第１に、追跡される分子は、ほとんどの緩衝液条件下で既に正に荷電されている。第２に、緩衝液条件は、純粋な電荷が正となるように修正され得る。勿論、低いｐＨが使用されても、依然として目標が機能することが重要である。第３に、多カチオンの種は、例えばタンパク質のスルフヒドリル基での共有付着によって、目標分子に付着され得る。もし自由なスルフヒドリル基が利用できない場合は、それらはＤＮＡ組み替え法によってタンパク質中に処理され得る。この可能性は、それが背景妨害の潜在的な大きな源を追加の工程を導入することなく除去できる効果的な手法と、プロセスを自動化するための重要な考察を示しているため、本発明の方法の１つの大きな利点である。天然試料は、環境から収穫できたり、および／または適当な環境条件（成長媒体、温度、湿度）下で培養されたものである。好ましくは、収穫された試料は、本発明の方法を実施するに必要な広がりとなるように単純に希釈される。しかしながら、必要であれば、試料物質は、分析用の試料を準備するために当業者によって使用される標準的なプロセスの如何なる組み合わせによっても処理される。例えば、粗製の試料は、冷凍融解法、均質化、音波処理、または細胞壁を破壊するためのマイクロ波抽出のような予備的な処理に導入される。典型的な次工程は、加熱処理である（例えば、破壊酵素を不活性にするため５０℃で１０分間）。耐熱性プロテアーゼによる目標の破壊を防止する非特定タンパク質の添加が行われる。細胞の抽出、またはエチルアセテート、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、エーテル、または水のような種々の溶媒を伴う培養媒体の抽出が遂行され、これに続いて粒状物質および／または高分子量の化合物を除去するための濾化が行われる。天然試料はまた、遠心分離法、シーケンシャルな抽出法、高圧液体クロマトグラフィ、薄膜クロマトグラフィ、および／または対向流クロマトグラフィによって分別され、続いて本発明の方法による処理に先行して、分別された小片が分離される。最後に、試料は、水の溶液、または塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、またはＧｏｏｄの緩衝液のような緩衝液を含む水ではない溶液で希釈される。多くの試料にとって、希釈工程は必要であり、そして好ましい唯一の処理である。しかしながら、希釈はまた、１以上の先行する工程の後の最後の処理としても行われる。元の天然試料の１：２０（体積／体積）の希釈は、再現性のある結果を達成するために通常は必要である。本発明の方法は、新規な治療用化合物のための、迅速で単純化された一次的な天然試料の選別ツールとして適用され得る。もし肯定的な試料が得られる場合は、配位子の分離および特徴化を行うための種々の方法がある。１つの方法は、親和力クロマトグラフィである。ここでは、先ず配位子は目標と結合され、次に配位子／目標の複合体が分離され、その後で配位子は目標から分離され、そして濃縮される。もう１つの方法は、標準的な抽出処理法およびクロマトグラフィによって後続される可変極性の溶媒を使用して分別することである。配位子は、一度分離されると、ＩＲおよびＮＭＲ分光法のような標準構造決定処理に導入される。分離された配位子はまた、細胞を基にした生化学試験で機能活性が試験される。第３の方法は、毛管と、複合物の直接構造分析用の質量分析器とを仲介するものである。この方法は、それまでに分離されている化合物の迅速な識別および放棄をするために特に重要である（非再現）。本発明の好ましい方法は、強い結合を伴う高親和力の化合物だけが正の信号を与えるという点に特定される。しばしば誤った正の反応によって標準親和力試験を悩ませる、高いオフレートを伴う複数の弱い結合は、観察されることがない。高い分析度がまた可能である。レーザ誘導蛍光を使用することによって、ほとんどの標準試験よりも低い検出限界である、低いナノモルの濃度が検出可能になる。本発明のシステムのように、完全に溶媒を基にした親和力システムでは、全ての試料成分と目標との接触が可能になる。特にタンパク質目標の生理学的活性を破壊する固体結合相（標準ＥＬＩＳＡ試験で使用される）が全くない。完全自動化およびこの方法の複合化（複合毛管と化合物の複合体を使用することによって）がまた可能になる。非常に小量の試料だけが必要とされ（１０回の再現運用に対して＜５μＬ）、また非常に小量の背景緩衝液だけが必要とされ（５０回の運用に対して＜５ｍＬ）、そして試料当たりの合計分析時間は、１０分間が典型的である。以下の実施例は、本発明の有利さを示すため、およびこれを使用する当業者を支援するために呈示されている。これらの実施例は、この開示の範囲を制限することを意図したものではない。実施例Ｉ本発明の方法は、毛管内の治療目標分子の電気泳動による移動度が、荷電されたおよび／または大きな配位子との結合によって変化させられる、という原理に基づいている。この原理は、目標分子の電気泳動による移動度が結合配位子の質量と電荷によって特に影響される毛管電気泳動に基づいて、複合天然試料中の結合化合物を識別するために使用できる。この原理を示す反応は、以下の通りである(Chu et al.，Med．Chem．35:2915-2917，1992)。目標治療分子＋天然試料中＝複合体の配位子質量ＭｍＭ＋ｍ純粋電荷Ｚ ±ｚＺ±ｚ電気泳動移動度Ｚ／Ｍ^α （Ｚ±ｚ）／（Ｍ±ｍ）^α α＝複合体の形状に基づく係数微小な中性配位子を識別するために、既知の荷電された配位子を競争的結合反応に使用することによって、同じ原理が適用され得る。本発明の方法にこの原理を適用すると、天然試料から新規な配位子を分離するための少なくとも３つの分離されたモデルが導かれる。図２ａを参照すると、荷電された配位子を検出するために、直接結合法が使用され得る。治療目標分子は監視され、そして目標分子の移動度は天然試料からの荷電された配位子の結合によってシフトしている。この代わりに、監視される目標分子のピーク形状は変化し、あるいは複合体の吸収特性が変化する場合には消失している。図２ｂに示すモデルは、微小な中性配位子の検出方法を示している。このモデルでは、目標分子の移動度が再び監視され、そして上記のように、目標の移動度は、このときは既知の荷電競争配位子（例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、微小分子）との配位子結合によってシフトしている。しかしながら、目標分子が先ず天然試料と共に、そして次に競争配位子と共に培養された場合は、天然試料からの結合した中性配位子が存在するために、競争配位子は結合することができない。このモデルはまた、電気泳動による移動度のシフトが、既知の配位子の結合によるシフトのそれと異なる場合には、荷電された分子を検出する。図２ｃに示された第３のモデルは、中性または荷電された配位子のいずれかの検出を示している。このモデルでは、既知の荷電された配位子との競争的結合が再び使用されているが、競争配位子の移動度は監視される。このことは、目標分子を直接発見することが困難な場合に、有利になる。目標は存在するが天然試料が存在しないＣＥでは、目標治療分子との相互作用によって配位子移動度はシフトする。しかしながら、天然試料中に結合した配位子が存在する場合は、競争配位子は目標分子と相互作用することができず、そしてその移動度は変化しない。実施例II 図２ａに示したモデルの実施例のように、血液の固まったタンパク質であるトロンビンと、その天然阻害剤であるヒルジンとの相互作用が監視された。図３のパネルＡを参照すると、ポリビニル製のアルコール被覆された毛管内のトロンビンのヒルジン不在下のＣＥは、形の良いピークを生成した。しかしながら、図３のパネルＢ−Ｄに示すように、天然阻害剤ヒルジンの濃度が増加すると、トロンビンのピークは消失する。ヒルジン結合が、これらの条件下では複合体が検出できないように、トロンビンの質量、電荷および／または構造を変化させたものと推測される。これらの条件は次の通りであった。背景緩衝液：ＰＨ４．５のε−アミノ−ｎ−カプロン酸、電界：４００Ｖ／ｃｍ、注入時間：アノードでの重力による３０”、検出：２１４ｎｍ。同じ緩衝液条件下でも逆極性では新規なピークは何も観察されなかった。図２ａに示されるこのモデルのもう１つの実施例が、図４に示されている。トロンビン／ヒルジンの相互作用と同一の電気泳動条件下で、一本鎖のトロンビン結合したアプタマー５’ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’の濃度の増加はまた、トロンビンのピークを消失させる結果を生じさせた（図４のパネルＡ−Ｄを参照）。再び、この条件下では複合形態は検出することができない。トロンビンのピークは、ランダムなオリゴヌクレオチドの等価な濃度の存在において不変であった。図５に示された実験は、図２ｃのモデルの１つの実施例であり、ここでは競争配位子（トロンビンアプタマー）が天然産物配位子（ヒルジン）と治療目標タンパク質（トロンビン）の存在下で監視された。ヒルジンに対してと同様に、トロンビンアプタマーはトロンビンのアニオン結合部位に強く結合する。この実験では、ヒルジン結合した、または自由なトロンビンの存在下で、アプタマーの移動度が監視された。アプタマーの移動度は、自由トロンビンの存在下（図５のパネルＣ）では遅いが、トロンビンがヒルジンと複合化されているとき（図５のパネルＤ）ではない。このことは、結合したヒルジンの存在下ではトロンビンとアプタマーの相互作用が生起できず、その結果アプタマーのピークをシフトできない、ということを示唆している。電気泳動条件は、ｐＨ６．５の２−［（２−アミノ−２−オキソエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）を背景緩衝液として使用し、また試料注入がカソード端からであった点を除けば、前述したものと同様であった。実施例III 放線菌バクテリアであるストレプトミセスのコエリカラー(coelicolo r)からの培養ブイヨンおよびストレプトアビジン(streptavidin)／ビオチンのシステムが、「天然試料」環境における本発明の方法の原理を示すために使用された。放線菌、特にストレプトミセスは、抗癌剤、免疫調整剤、抗真菌剤、抗ヘルミンチック剤(antihelminthics)、および市場の７０％の抗生物質を含む治療化合物の膨大なソースである。Ｓ．コエリカラーは、この重要な有機体群において、遺伝子工学的および生物学的に理解される最良のものである。Ｓ．コエリカラーのブイヨンは、ストレプトアビジンのピーク形状および移動時間がブイヨンによって十分に影響されておらず、そのことが非常に少ないストレプトアビジン結合物質しか存在していないことを示しているため、選択された。これは、複合天然試料の存在下のストレプトアビジン／ビオチンの複合形態を、ブイヨン内の他の化合物から妨害されることなく学習するための便利な手段を提供する。ストレプトアビジンとビオチンは、解離定数が４Ｘ１０^-14の非常に強い複合体を形成する。細胞のない培養ブイヨン、ストレプトアビジン、およびビオチンの種々の組み合わせの分析のためにＣＥが使用された。毛管の寸法は、内径７５μｍ，全長６３ｃｍ，検出窓４９ｃｍであった。運用条件は、２０ｍＭのＴＡＰＳ／トリス中で２００ｖ／ｃｍであり、２８０ｎｍでの吸収が監視された。培養ブイヨンなしに、ストレプトアビジン／ビオチンの複合体は、ストレプトアビジン単体に比べて２３秒長い移動時間を呈示し、負に荷電したビオチン分子の結合を示した。ピーク時間における２３秒のシフトはまた、Ｓ．コエリカラーの培養ブイヨンの１：１０希釈液の存在下でも呈示された。ビオチンはその後、ブイヨン内の配位子の最低検出濃度を決定するために、濃度を減少するように滴定された。８２０ｎＭのビオチンで、少しのストレプトアビジンのピークのシフトが依然として観測可能であった。これは、ブイヨン試料が初めに１０倍に希釈されているために、８．２μＭのビオチンの効果的な最低検出限界に対応している。この実施例で観測された８．２μＭの最低検出限界は、現在の天然産物選別（スクリーン）の最低限界と等価であるかそれよりも良く、そして染料接合した目標分子とレーザ導入蛍光検出を使用することによって、少なくとも１０，０００倍には改善され得る。かくして、天然試料中で結合した化合物に対する検出レベルは、現在の天然産物スクリーンのそれに比べて遥かに低い、ピコモルの範囲になり得る。実施例IV 本発明の方法によって可能になる低い検出レベルを示すために、治療目標酵素であるヒト炭酸脱水酵素（ＨＣＡＩＩ）が、前記酵素の単一システインの自由スルフヒドリル基に、蛍光の共有付着法により蛍光ラベル付けされた。染料ラベル付けされた低いナノモル濃度のタンパク質は、ＣＥ上で運用され、そしてレーザ誘導蛍光を使用して監視されたときに（図６の上側のプロット）、単一のピークを示した。弱い結合の負に荷電されたＨＣＡＩＩ阻害剤が背景緩衝液に含まれているときは、ＨＣＡＩＩのピーク速度は２０”速かった（図６の下側のプロット）。このことは、負に荷電された阻害剤とＨＣＡＩＩとの相互作用が移動するＨＣＡＩＩ分子上に、より大きな負の電荷を生じさせ、アノード方向に向けたより速い酵素の移動を生起させたために、生じたものである。図７では、ＨＣＡＩＩは、強い結合の中性に荷電された阻害剤の量を増加させながら予備的に培養された。この阻害剤は、前記酵素の同じ部位に対して弱く結合している阻害剤と競争するものである。全ての運用は、図６に示すように、１μＭの弱い結合の阻害剤の存在下で実施された。下側のプロットでは、１ｐＭの強い結合の阻害剤は、負に荷電された阻害剤の結合によって依然としてシフトするＨＣＡＩＩの移動に対しては、何も効果を有しない。しかしながら、１００ＰＭの強い結合の中性に荷電された阻害剤が存在すると、そのピークのシフトは殆ど完全に阻害される（図７の上側のプロット）。この場合には、弱い結合の阻害剤は、強い結合の阻害剤が存在するために、ＨＣＡＩＩと相互作用することが不可能になる。図７の中間のプロットに示されているように、５０ｐＭの強い結合をした阻害剤では、強い結合の中性に荷電されたＨＣＡＩＩと、弱い結合の負に荷電されたＨＣＡＩＩの双方が観測される飽和濃度に達してはいない。この実験は、複数の不活性な天然試料の存在下で繰り返され、同じ結果が得られた。かくして、この実施例は、レーザ誘導蛍光と親和力毛管電気泳動との組み合わせによって、ピコモルのレベルの強く結合した阻害剤が検出され得ることを呈示している。これは、現在の天然試料スクリーンの最低検出限界を遥かに下回っている。条件は、背景緩衝液：１００ｍＭのＣＡＰＳ［（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）］、１００ｍＭのＡＭＰＤ［２−アミノ −２−メチル−１，３−プロパンジオール］、ｐＨ７．９；電界：５５０Ｖ／ｃｍ；注入：圧力によって５”；励起波長：４８８ｎｍ；放射波長：５５２ｎｍであった。実施例Ｖ５０種類の海中試料および１７種類の放線菌（例えば、ストレプトミセス）試料が、複数の治療目標タンパク質の電気泳動プロフィールに対してそれらの効果を与えるために、被覆された毛管内で試験された。海中試料は、ＤＭＳＯによる抽出により準備され、そして１：２０（０．５ｍｇ／ｍＬ）の最終希釈液で試験された。放線菌試料は、培養されたブイヨンの１：２０希釈液を濾過した。放線菌試料は、２つの典型的なタンパク質である炭酸脱水酵素とチューブリンの移動度やピーク形状に何も効果を与えなかった。しかしながら、海中試料のいくつかは、トロンビン（１２／５０）および炭酸脱水酵素（２／５０）のピークのプロフィールまたは電気泳動による移動時間のいずれかに肯定的な効果を与えた。図８−１０に示された電気泳動のプロフィールは、特定された実験の実施例である。図８を参照すると、多くの場合に、希釈された（１：２０）海中試料の添加は、目標治療タンパク質である炭酸脱水酵素の電気泳動プロフィールを評価し得るように変化させていない。また、海中試料それ自身のプロフィールも変化してはいない。電気泳動の条件は次の通りであった。背景緩衝液：ｐＨ４．５のε−アミノ−ｎ−カプロン酸、電界：４００Ｖ／ｃｍ、注入時間：アノードでの重力による３０”、検出：２１４ｎｍ。図９を参照すると、１つの海中試料が炭酸脱水酵素のピークに減少（パネルＡ−Ｃ）と、新規なピークの出現（パネルＤ−Ｆ）とを生じさせている。これらは、混合物を逆極性で運用した時に観察されたものである（底部のパネルＦに矢印で示されている）。新規なピークの移動がアノードに向かうため、それはあたかも、存在し得る複合体に対して全体的に負の電荷があるかのように現れる。もう１つの実験では、図１０に示すように、１つの海中試料が、トロンビンのピークの減少と、未知の正に荷電された配位子とトロンビンとの複合体を示す新規なピーク（パネルＢに矢印で示す）とを生じさせている。実施例VI ＣＥにおいて１２種類の海中試料がトロンビンのプロフィールを変化させたにも係わらず、これら試料の２つだけが標準凝析試験で抗トロンビン活性を示した。この現象に対しては、いくつかの可能な説明がある。１つは、トロンビン活性は実際に阻害され得たが、凝固を推進するその他のセリン・プロテアーゼが天然試料中に存在していた可能性がある。もう１つの可能性としては、凝固試験の成分がトロンビン結合配位子を阻害したということである。あるいは、いくつかのトロンビンは結合され、そして阻害されたが、凝固を生じさせるに十分な自由なトロンビンが存在していた可能性がある。他の説明としては、トロンビンのプロフィールがＣＥにおいて天然試料中に存在する塩やプロテアーゼのような結合以外の理由によって変化させられたか、あるいはトロンビンの完成領域が配位子によって結合されたものと考えられる。ＣＥにおいてトロンビンのプロフィールを変化させたが、凝固時間を阻害してはいない５つの海中抽出物が更に試験された。この試料は液相と有機相に分離され、乾燥され、そしてＤＭＳＯにおいて１０倍高い濃度で再懸濁された。これらの分別および濃縮工程は、２つの試料の液相における、今までに観測されていなかった抗凝固剤の活性を明らかにした。このことは、本発明の方法が、天然試料の一次的な選別にとって優れた方法であることを示している。実施例VII 結合した配位子はまた、減法試験によって識別される。被覆された毛管中の炭酸脱水酵素のプロフィールを変化させた１つの海中試料は、被覆されてない毛管中で更に試験された。電気浸透流によって、被覆されていない毛管は、荷電および中性の全てのＵＶ活性化合物を、単一の運用で明らかにする。この実験に対する運用条件は、背景緩衝液：ＰＨ７．０のＡＣＥＳ；電界：４００Ｖ／ｃｍ；注入時間：アノードにおける重力によって３０”；検出：２１４ｎｍであった。図１１を参照すると、天然試料の複合体のプロフィール（パネルＡ）が、１μＭの炭酸脱水酵素を伴う予備培養によって変化していることが判る（パネルＢ）。特に、いくつかのピークが消失し（パネルＡに矢印で示す）、ＣＥが粗製試料中の相互作用する配位子を直接識別するために使用できることを示唆している。関心のあるピークは、毛管から直接分離されたり、あるいは更なる分析のために質量分析器で運用され得る。その他の実施例上述した方法は、４つの基本的な手法によって、迅速に多くの数の試料を選別するためのシステム（高生産性スクリーン法）に発展され得る。第１は、最大９６の平行な毛管を備えた同時多重毛管システムを現在構築可能なことである。将来は、同時に監視される毛管の数は更に増加されるであろう。典型的には、単一のレーザビーム源が、個々の毛管を監視するために無数のビームに分割される。第２の方法は、異なる目標と結合した化合物に対して、単一の天然試料が同時に選別され得るように、毛管当たり１以上の治療目標と組み合わされる。これは、異なる吸収／放射特性や異なる電気泳動移動時間を有する目標の選択を必要とする。例えば、各目標は異なる蛍光染料に凝固され得る。目標は、混合されたときに同じ運用緩衝液中において安定していて、また検出可能であり、さらに活性であるように、選択される。第３は、選別に先行して、天然試料は混合され得る。この手法によって毛管当たり５つの試料が分析され得る。肯定的な反応が得られた後に、活性試料を識別するためにデコンボリューションが使用され得る。試料の混合が生産性を向上させるにも係わらず、それはまた潜在的な活性化合物を希釈し、これをあまり好ましくない多重化方法にしてしまう。生産性を向上させる最後の方法は、毛管を例えば溶融シリカの微小チップ上に形成することである。この場合には、１つの微小チップ上に多数の毛管が存在し、そしてもし短い（２ｃｍ）毛管長が使用されるときは、運用時間はより速くなる。微小チップ形態はまた、ＣＥが例えばバイオ測定のような識別された配位子の測定と組み合わされ得る２次元分析の可能性を許容する。上述した方法はまた、天然試料中の弱い結合の配位子を識別するために適用できる。これは、希釈された天然試料または目標を運用緩衝液中に導入することによって達成される。ここでは、運用の過程で、目標または競争配位子の変化した移動度を通して、目標および配位子の迅速な結合および解離が観測される。この適用は、後により高い活性のために修飾され得る弱い結合の初期化合物を分離するために有用である。本発明は好ましい実施例を伴って説明されたが、当業者であれば以上の明細書を読んだ後に、種々の変形、均等物の置換、およびその他の変形を、個々に述べた構成と方法に対してなす事が可能である。それ故、特許によって許可される保護は、添付した請求の範囲に含まれる定義およびその均等物によってのみ限定されるべきものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月２日（１９９８．１．２）【補正内容】請求の範囲１．複合生物物質から選択された目標の未確認の候補配位子を選別する方法であって、（１）複合生物物質の試料を供給する工程と、（２）前記複合生物物質の試料を前記選択された目標に結合して、試料／目標混合物を形成する工程と、（３）工程（２）からの前記試料／目標混合物のアリコートを、母材を濾さない毛管電気泳動装置内に注入する工程と、（４）前記試料／目標混合物のアリコートを、母材を濾さない毛管電気泳動に導入する工程と、（５）前記毛管電気泳動による前記目標の移動を追跡する工程と、（６）工程（５）からの目標の移動パターンが、複合生物物質の前記試料中に未確認の候補配位子の存在を示しているか否かを決定する工程と、（７）前記複合生物物質から前記候補化合物を分離する工程と、（８）前記分離された化合物が、それまで前記目標と相互作用するものとして識別されていなかったか否かを決定する工程とを与えられた順序で備えることを特徴とする方法。２．請求項１の方法において、前記工程（６）は、前記目標の移動を、前記目標単独のアリコートが前記毛管電気泳動装置内の検出点に到達するための移動時間を有する参照標準液と比較する工程を備えることを特徴とする方法。３．請求項１の方法において、前記工程（６）は、前記目標の移動パターンを、前記目標単独のアリコートの移動パターンを有する参照標準液と比較する工程を備えることを特徴とする方法。４．複合生物物質から選択された目標の未確認の候補配位子を選別する方法であって、（１）複合生物物質の第１の試料を供給する工程と、（２）複合生物物質の前記第１の試料を、母材を濾さない毛管電気泳動装置内に注入する工程と、（３）複合生物物質の前記第１の試料を、母材を濾さない毛管電気泳動に導入する工程と、（４）前記第１の試料の毛管電気泳動に後続し、複合生物物質の前記第１の試料に由来する化合物の存在を検出し、そして検出された化合物の第１の検出パターンを生成する一般的な検出方法を使用する工程と、（５）複合生物物質の第２の試料を供給する工程と、（６）試料／目標混合物を形成するために、複合生物物質の前記第２の試料を前記目標に結合させる工程と、（７）前記試料／目標混合物のアリコートを、母材を濾さない前記毛管電気泳動装置内に注入する工程と、（８）前記試料／目標混合物のアリコートを、母材を濾さない前記毛管電気泳動に導入する工程と、（９）前記試料／目標混合物のアリコートの前記毛管電気泳動に後続し、前記試料／目標混合物に由来する化合物の存在を検出し、そして検出された化合物の第２の検出パターンを生成する前記一般的な検出方法を使用する工程と、（１０）前記第１の検出パターンには描写されているが前記第２の検出パターンには描写されていない如何なる化合物をも探すために、前記第１の検出パターンと前記第２の検出パターンを比較する工程と、（１１）前記第１の検出パターンに現れるが、第２の検出パターンには現れない前記複合生物物質に由来する如何なる化合物をも分離する工程と、（１２）前記分離された化合物がそれまで前記目標と相互作用するものとは識別されていなかったか否かを決定する工程とを与えられた順序で備えることを特徴とする方法。５．請求項１または４の方法において、前記目標に対抗する、前記分離された化合物の治療性能または薬物動態学的特性を試験する工程を更に備えることを特徴とする方法。６．複合生物物質から選択された目標の未確認の候補配位子を選別する方法であって、（１）複合生物物質の試料を供給する工程と、（２）前記複合生物物質の試料を前記選択された目標に結合して、試料／目標の第１の混合物を形成する工程と、（３）続けて、前記第１の混合物を前記目標の既知の荷電された配位子に結合して、試利／目標／既知の配位子の第２の混合物を形成する工程と、（４）前記第２の混合物のアリコートを、母材を濾さない毛管電気泳動装置内に注入する工程と、（５）前記第２の混合物のアリコートを、母材を濾さない毛管電気泳動に導入する工程と、（６）前記毛管電気泳動による前記既知の配位子の移動を追跡する工程と、（７）工程（６）からの既知の配位子の移動パターンが、前記目標が存在し且つ前記複合生物物質が不在である状態における前記既知の配位子の移動パターンを有する参照標準液と比較したときに、複合生物物質の前記試料中に、前記目標の未確認の候補配位子の存在を示しているか否かを決定する工程とを与えられた順序で備えることを特徴とする方法。７．請求項６の方法において、工程（７）においてその存在が確認されている前記目標の前記未確認候補配位子を前記複合生物物質から分離する工程と、前記分離された化合物がそれまで前記目標と相互作用するものとは識別されていなかったか否かを決定する工程と、前記目標に対抗する、前記分離された化合物の治療性能または薬物動態学的特性を試験する工程とを更に備えることを特徴とする方法。８．請求項６の方法において、前記既知の配位子は強く結合していることを特徴とする方法。９．複合生物物質から選択された目標の未確認の候補配位子を選別する方法であって、（１）複合生物物質の試料を供給する工程と、（２）前記複合生物物質の試料を前記選択された目標に結合して、試料／目標の混合物を形成する工程と、（３）前記混合物のアリコートを、母材を濾さない毛管電気泳動装置内に注入する工程と、（４）前記混合物のアリコートを、母材を濾さない毛管電気泳動に導入する工程であって、前記毛管電気泳動の遂行に使用される運用緩衝液が、前記目標の既知の荷電された配位子を有するものである工程と、（５）前記毛管電気泳動による前記目標の移動を追跡する工程と、（６）工程（５）からの前記目標の移動パターンが、前記既知の荷電された配位子が存在し且つ前記複合生物物質が不在である状態における前記目標の移動パターンを有する参照標準液と比較したときに、複合生物物質の前記試料中に、前記目標の未確認の候補配位子の存在を示しているか否かを決定する工程とを与えられた順序で備えることを特徴とする方法。１０．請求項９の方法において、工程（６）においてその存在が確認されている前記目標の前記未確認候補配位子を前記複合生物物質から分離する工程と、前記分離された化合物がそれまで前記目標と相互作用するものとは識別されていなかったか否かを決定する工程と、前記目標に対抗する、前記分離された化合物の治療性能または薬物動態学的特性を試験する工程とを更に備えることを特徴とする方法。１１．請求項９の方法において、前記既知の配位子は、弱い結合をしていることを特徴とする方法。１２．請求項１，４，６または９の方法において、前記母材を濾さない毛管電気泳動装置は、複数の毛管を備えていることを特徴とする方法。１３．請求項１，４，６または９の方法において、前記母材を濾さない毛管電気泳動装置は、微小組立技術によって形成されたデバイス上に複数のチャネルを備えていることを特徴とする方法。１４．請求項１３の方法において、前記微小組立技術によって形成されたデバイスは、２次元分析用に構成されていることを特徴とする方法。１５．請求項１，４，６または９の方法において、目標を試料に結合させる前記工程では、前記試料は１以上の目標分子と結合されることを特徴とする方法。１６．請求項１，４，６または９の方法において、前記追跡される分子の移動はＵＶ吸収の検出によって監視されることを特徴とする方法。１７．請求項１，４，６または９の方法において、前記追跡される分子の移動は、レーザ誘導蛍光の検出によって監視されることを特徴とする方法。１８．請求項１，４，６または９の方法において、前記試料は、前記供給する工程において、１以上のソースからの複合生物物質を備えることを特徴とする方法。１９．請求項１，４，６または９の方法において、前記複合生物物質は、前記供給する工程に先行して、少なくとも１つの前処理工程に導入され、前記少なくとも１つの前処理工程は、冷凍融解法、均質化、音波処理、マイクロ波抽出、加熱、溶媒抽出、濾化、分別、または希釈であることを特徴とする方法。２０．請求項１，４，６または９の方法において、前記毛管電気泳動装置は、母材を濾さない分析デバイスに直接接続されていることを特徴とする方法。２１．請求項２０の方法において、前記分析デバイスは、質量分析器であることを特徴とする方法。２２．請求項１，４，６または９の方法において、前記複合生物物質は、地上の植物の抽出物、海中の植物の抽出物、海中の有機物の抽出物、微生物のブイヨン、および微生物の抽出物からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。２３．請求項１，４，６または９の方法において、前記複合生物物質は、合成化学ライブラリであることを特徴とする方法。２４．請求項１，４，６または９の方法において、前記目標は、ＨＩＶ反転転写酵素、ＨＩＶプロテアーゼ、ヒト・トロンビン、タンパク質キナーゼ、および治療用タンパク質の活性ペプチドドメインからなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。２５．請求項６または９の方法において、前記既知の配位子は、ペプチドおよびその類似物、オリゴヌクレオチドおよびその類似物、微小タンパク質、イオン、金属、ペプトイド、カルバメイト、ポリアミン、および荷電された微小分子からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。２６．請求項１，４，６または９のいずれかの方法において、前記追跡される分子は、前記追跡する工程において、純粋に正の電荷を有していることを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．複合生物物質から未知の活性化合物を選別する方法であって、複合生物物質の試料を供給する工程と、前記複合生物物質の試料を目標分子に結合する工程と、前記結合する工程からの試料を毛管電気泳動装置内に注入する工程と、前記結合する工程からの前記試料を毛管電気泳動に導入する工程と、前記毛管電気泳動による前記目標分子の移動を監視する工程とを備えることを特徴とする方法。２．請求項１の方法において、前記目標分子の移動が、前記複合生物物質の試料中に活性化合物の存在を示しているか否かを決定する工程と、前記決定する工程で示された活性化合物を前記複合生物物質の試料から分離し、そして前記化合物の活性を試験する工程とを更に備えることを特徴とする方法。３．請求項１の方法において、前記毛管電気泳動による前記目標分子の移動を、参照標準液の移動と比較する工程を更に備えることを特徴とする方法。４．請求項３の方法において、前記監視する工程は、前記目標分子を追跡する工程を備え、前記参照標準液は、前記比較する工程において、前記目標分子を備えることを特徴とする方法。５．請求項３の方法において、前記結合する工程は、前記目標分子の既知の配位子を前記複合生物物質の試料および前記目標分子に結合する工程を更に備え、前記監視する工程は、前記既知の配位子を追跡する工程を備え、前記参照標準液は、前記比較する工程において、前記既知の配位子と前記目標分子の組み合わせを備えることを特徴とする方法。６．請求項３の方法において、前記目標分子の既知の配位子は、前記導入する工程において、前記毛管電気泳動を遂行するための運用緩衝液内に存在し、前記監視する工程は、前記目標分子を追跡する工程を備え、前記参照標準液は、前記比較する工程において、前記既知の配位子と前記目標分子の組み合わせを備えることを特徴とする方法。７．請求項１の方法において、前記毛管電気泳動装置は、複数の毛管を備えることを特徴とする方法。８．請求項１の方法において、前記毛管電気泳動装置は、微小組立技術によって形成されたデバイス上に複数のチャネルを備えることを特徴とする方法。９．請求項１の方法において、１以上の目標分子は、前記結合する工程において、前記試料に結合されていることを特徴とする方法。１０．請求項１の方法において、前記目標分子の移動は、ＵＶ吸収の検出によって監視されることを特徴とする方法。１１．請求項１の方法において、前記目標分子の移動は、レーザ誘導蛍光の検出によって監視されることを特徴とする方法。１２．請求項１の方法において、前記試料は、前記供給する工程において、１以上のソースからの複合生物物質を備えることを特徴とする方法。１３．請求項１の方法において、前記複合生物物質は、前記供給する工程に先行して、前処理されていることを特徴とする方法。１４．請求項１の方法において、前記毛管電気泳動装置は、分析デバイスに直接接続されていることを特徴とする方法。１５．請求項１４の方法において、前記分析デバイスは、質量分析器であることを特徴とする方法。１６．請求項８の方法において、前記微小組立技術によって形成されたデバイスは、２次元分析用に構成されていることを特徴とする方法。１７．請求項１の方法において、前記複合生物物質は、地上の植物の抽出物、海中の植物の抽出物、海中の有機体の抽出物、微生物のブイヨン、および微生物の抽出物からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。１８．請求項１の方法において、前記複合生物物質は、組み合わせ可能なライブラリであることを特徴とする方法。１９．請求項１の方法において、前記目標分子は、炭酸脱水酵素、ＨＩＶ反転転写酵素、ＨＩＶプロテアーゼ、ヒト・トロンビン、タンパク質キナーゼ、および治療用タンパク質の活性ペプチドドメインからなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。２０．請求項５または６の方法において、前記既知の配位子は、ペプチドおよびその類似物、オリゴヌクレオチドおよびその類似物、金属、および荷電された微小分子からなる群から選択されたものであることを特徴とする方法。２１請求項４、５または８のいずれかの方法において、前記追跡される分子は、前記監視する工程において、純粋に正の電荷を有していることを特徴とする方法。２２．複合生物物質から未知の活性化合物を選別する方法であって、複合生物物質の試料を供給する工程と、前記複合生物物質の試料を目標分子に結合し、続けて前記目標物質の既知の配位子に結合する工程と、前記結合する工程からの試料を毛管電気泳動装置内に注入する工程と、前記結合する工程からの前記試料を毛管電気泳動に導入する工程と、前記毛管電気泳動による前記目標分子の移動を監視する工程と前記毛管電気泳動による前記目標分子の移動を、参照標準液の移動と比較する工程とを備え、前記参照標準液は、前記既知の配位子と前記目標分子の組み合わせを備えることを特徴とする方法。２３．請求項２２の方法において、前記参照標準液の移動と比較された前記目標分子の移動が、前記複合生物物質の試料中に活性化合物の存在を示しているか否かを決定する工程と、前記決定する工程で示された活性化合物を前記複合生物物質の試料から分離し、そして前記化合物の活性を試験する工程とを更に備えることを特徴とする方法。２４．複合生物物質から未知の活性化合物を選別する方法であって、複合生物物質の試料を供給する工程と、前記複合生物物質の試料を目標分子に結合する工程と、前記結合する工程からの試料を毛管電気泳動装置内に注入する工程と、前記結合する工程からの前記試料を毛管電気泳動に導入する工程と、前記毛管電気泳動による前記目標分子の移動を監視する工程と前記毛管電気泳動による前記目標分子の移動を、参照標準液の移動と比較する工程とを備え、前記毛管電気泳動を遂行するための運用緩衝液は、前記目標分子の既知の配位子を備え、前記参照標準液は、前記既知の配位子と前記目標分子の組み合わせを備えることを特徴とする方法。２５．請求項２４の方法において、前記参照標準液の移動と比較された前記目標分子の移動が、前記複合生物物質の試料中に活性化合物の存在を示しているか否かを決定する工程と、前記決定する工程で示された活性化合物を前記複合生物物質の試料から分離し、そして前記化合物の活性を試験する工程とを更に備えることを特徴とする方法。２６．複合生物物質から未知の活性化合物を選別する方法であって、複合生物物質の第１の試料を供給する工程と、複合生物物質の前記第１の試料を毛管電気泳動装置内に注入する工程と、複合生物物質の前記第１の試料を毛管電気泳動に導入する工程と、前記第１の試料の毛管電気泳動に後続し、複合生物物質の前記第１の試料に由来する化合物の存在を検出し、そして検出された化合物の第１の検出パターンを生成する一般的な検出方法を使用する工程と、複合生物物質の第２の試料を供給する工程と、目標分子の第２の組み合わせ試料を形成するために、複合生物物質の前記第２の試料を目標分子に結合させる工程と、前記結合させる工程からの前記組み合わせ試料を毛管電気泳動装置内に注入する工程と、前記結合させる工程からの前記組み合わせ試料を毛管電気泳動に導入する工程と、前記結合させる工程からの前記組み合わせ試料の毛管電気泳動に後続し、前記結合させる工程からの前記組み合わせ試料に由来する化合物の存在を検出し、そして検出された化合物の第２の検出パターンを生成する前記一般的な検出方法を使用する工程と、前記第１の検出パターンには描写されているが前記第２の検出パターンには描写されていない化合物を探すために、前記第１の検出パターンと前記第２の検出パターンを比較する工程と、複合生物物質の前記第１の試料に由来する化合物であって、前記結合する工程からの前記組み合わせ試料に由来する化合物の中には存在しないものを分離する工程とを備えることを特徴とする方法。