JP3175941B2 - クロマトグラフ溶出液の減法に依るオンライン生成物確認方法及び装置 - Google Patents
クロマトグラフ溶出液の減法に依るオンライン生成物確認方法及び装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は全体としてクロマトグラフ操作に有用な方法
及び装置に関する。特に本発明はクロマトグラフ溶出液
中の生成物の迅速な確認方法に関する。
及び装置に関する。特に本発明はクロマトグラフ溶出液
中の生成物の迅速な確認方法に関する。
背景技術 クロマトグラフ及び電気泳動技術は、混合物中に存す
る成分(溶質)の分離方法として当該技術分野に周知で
ある。これらの技術は特に化学及び生物工学の技術分野
で有用である。クロマトグラフィーが真に意味するもの
は2(または3)相間の異なった分配に依る溶質の分離
である。これらの相は通常固相及び液相であり、溶質分
配は流動相の存在下に固体微粒子(マトリックス)層を
通過する際に異なった移動性をもたらす。層を通過する
溶質の移動は圧力勾配に従い、一般的に“液体クロマト
グラフィー”と呼ばれている。一方、電気泳動システム
は溶質をその電気泳動的移動性、等電点、及び/または
大きさを識別するマトリックスを通過する異なった移動
速度に従って分離する。これらのシステム内の溶質の移
動は、与えられた電界からの電圧勾配に依って移動し、
“電気泳動”と呼ばれる。
る成分(溶質)の分離方法として当該技術分野に周知で
ある。これらの技術は特に化学及び生物工学の技術分野
で有用である。クロマトグラフィーが真に意味するもの
は2(または3)相間の異なった分配に依る溶質の分離
である。これらの相は通常固相及び液相であり、溶質分
配は流動相の存在下に固体微粒子(マトリックス)層を
通過する際に異なった移動性をもたらす。層を通過する
溶質の移動は圧力勾配に従い、一般的に“液体クロマト
グラフィー”と呼ばれている。一方、電気泳動システム
は溶質をその電気泳動的移動性、等電点、及び/または
大きさを識別するマトリックスを通過する異なった移動
速度に従って分離する。これらのシステム内の溶質の移
動は、与えられた電界からの電圧勾配に依って移動し、
“電気泳動”と呼ばれる。
クロマトグラフに用いられるマトリックスは、大き
さ、電荷、疎水性相互作用及び/またはマトリックスも
しくはその結合部位に対する特異的親和性を含む多数の
基準のいずれかに従って成分を分離出来る。混合物中の
成分はマトリックスに対する親和性が多様に亘るので、
成分がマトリックスを通過する間の分配で、順次マトリ
ックスから溶出されて時間的及び量的に分離される。各
種の分離された成分の位置、または溶出物中の目的とす
る成分の測定は、通常マトリックスから溶出される液相
(溶出液流)を一連の分画として集めて、これらの分画
中の成分を該当技術に既知のいずれかの方法に依って確
認する為に分析試料を採取することで行なわれる。
さ、電荷、疎水性相互作用及び/またはマトリックスも
しくはその結合部位に対する特異的親和性を含む多数の
基準のいずれかに従って成分を分離出来る。混合物中の
成分はマトリックスに対する親和性が多様に亘るので、
成分がマトリックスを通過する間の分配で、順次マトリ
ックスから溶出されて時間的及び量的に分離される。各
種の分離された成分の位置、または溶出物中の目的とす
る成分の測定は、通常マトリックスから溶出される液相
(溶出液流)を一連の分画として集めて、これらの分画
中の成分を該当技術に既知のいずれかの方法に依って確
認する為に分析試料を採取することで行なわれる。
混合物中の種々の成分の分離は幾つかの条件に依り、
その主なものはマトリックスの分配能及びシステム内の
理論的なプレート(plate)の高さ及びプレート数(下
記参照)である。一般的に、表面積対容量比の大である
ことが望ましい。液体クロマトグラフィー システムの
マトリックスは、典型的にはカラムとして知られる円筒
形のクロマトグラフィー システムに詰められている。
電気泳動システムでは、高度の分離はかけられる電界に
依って生じる熱を効率的に除くことも必要とする。大き
な表面積対容量比を与える細管電気泳動、またはその他
の電気泳動的モジュールは、ジュール熱を分散させて、
分離に大きな損失を生じることなく迅速な分析を可能と
する。
その主なものはマトリックスの分配能及びシステム内の
理論的なプレート(plate)の高さ及びプレート数(下
記参照)である。一般的に、表面積対容量比の大である
ことが望ましい。液体クロマトグラフィー システムの
マトリックスは、典型的にはカラムとして知られる円筒
形のクロマトグラフィー システムに詰められている。
電気泳動システムでは、高度の分離はかけられる電界に
依って生じる熱を効率的に除くことも必要とする。大き
な表面積対容量比を与える細管電気泳動、またはその他
の電気泳動的モジュールは、ジュール熱を分散させて、
分離に大きな損失を生じることなく迅速な分析を可能と
する。
合成または精製の過程に於て、生成物の状態を監視す
る必要性は、当該技術分野で周知である。状態の監視は
多段階の製造工程に於て特に重要である。頻回の混合物
中の生成物の存在及び性状に迄およぶ確認は、各段階毎
に測定せねばならない。生成物の監視は工程中の変動条
件を調整するフィードバック システムの一部としても
使用される。通常、確認は予め設定された確認基準を用
いて、例えば特定波長の特徴的吸収の測定で決定され
る。目的とする生成物が蛋白質の場合には、確認には分
子量、活性、及び/または免疫親和性でもある。
る必要性は、当該技術分野で周知である。状態の監視は
多段階の製造工程に於て特に重要である。頻回の混合物
中の生成物の存在及び性状に迄およぶ確認は、各段階毎
に測定せねばならない。生成物の監視は工程中の変動条
件を調整するフィードバック システムの一部としても
使用される。通常、確認は予め設定された確認基準を用
いて、例えば特定波長の特徴的吸収の測定で決定され
る。目的とする生成物が蛋白質の場合には、確認には分
子量、活性、及び/または免疫親和性でもある。
残念なことに、生成物及び/または工程の監視、特に
多段階の製造実施中に多数回の試料採取を要する場合に
は時間がかかる。監視に要する時間的制約は、工業的及
びその他の大規模製造には特に重要である。有用である
為には、監視操作は迅速、適応性大、及び反復可能でな
ければならない。従って、いずれの製造条件に於ても対
象分子の存在及び位置の迅速な確認方法が必要である。
多段階の製造実施中に多数回の試料採取を要する場合に
は時間がかかる。監視に要する時間的制約は、工業的及
びその他の大規模製造には特に重要である。有用である
為には、監視操作は迅速、適応性大、及び反復可能でな
ければならない。従って、いずれの製造条件に於ても対
象分子の存在及び位置の迅速な確認方法が必要である。
従って、本発明の1つの目的は、分子生成物の合成ま
たは精製の過程の様な製造計画中に於て、これら迅速な
オンライン確認の為の方法及び装置を提供するにある。
他の目的はクロマトグラフィー溶出液中の溶質の存在と
位置を迅速に確認する方法及び装置を提供するにある。
別の目的は溶出液流れの中の生成物の濃度の迅速な検出
方法を提供するにある。更にその他の目的は精製または
分離工程の成果を迅速に評価する方法を提供するにあ
る。本発明のこれら及びその他の目的並びに態様は以下
に記載する図面、記述、及び特許請求の範囲から明かと
なるであろう。
たは精製の過程の様な製造計画中に於て、これら迅速な
オンライン確認の為の方法及び装置を提供するにある。
他の目的はクロマトグラフィー溶出液中の溶質の存在と
位置を迅速に確認する方法及び装置を提供するにある。
別の目的は溶出液流れの中の生成物の濃度の迅速な検出
方法を提供するにある。更にその他の目的は精製または
分離工程の成果を迅速に評価する方法を提供するにあ
る。本発明のこれら及びその他の目的並びに態様は以下
に記載する図面、記述、及び特許請求の範囲から明かと
なるであろう。
本発明の概要 溶出液流中に存する予め設定された溶質または溶質の
組合せの存在及び位置を迅速に確認する方法及び装置の
発明がなされた。本方法及び装置は製造工程中の監視シ
ステムの一部として特に有用である。ここに使用する
“差動移動分離システム(differential migration sep
atation system,(DMSS))”は、“液体クロマトグラ
フィー”及び“電気泳動”として知られる、混合物中に
存する溶質を分離する技術に既知のすべての方法を含む
と解釈せねばならない。
組合せの存在及び位置を迅速に確認する方法及び装置の
発明がなされた。本方法及び装置は製造工程中の監視シ
ステムの一部として特に有用である。ここに使用する
“差動移動分離システム(differential migration sep
atation system,(DMSS))”は、“液体クロマトグラ
フィー”及び“電気泳動”として知られる、混合物中に
存する溶質を分離する技術に既知のすべての方法を含む
と解釈せねばならない。
本発明の方法は、先ず混合物(溶質)中の成分を分離
することが出来るシステムに、混合物を通過させて、成
分が液相(溶出液流)のシステムから溶出されるに伴っ
て時間的及び量的に分離させる段階から成る。本発明の
好ましい実施態様では、この第1のシステムは液体クロ
マトグラフィー マトリックス、例えばカラム、または
その他の電気泳動モジュールの様な溶質を分離する為の
方法である。この第1の溶質分離システムからの溶出液
流(“第1溶出液流”と称する)は、次いでカラム中に
存する溶質の順序を示す最初の溶出分画を求めて検出器
に流入させる。この溶出分画中の目的とする特定の溶質
の確認は、最初の溶出流を、液相中から目的とする溶質
を選択的に抽出が可能な第2のシステムに流入させて測
定する。目的とする溶質を抽出する能力以外には、この
第2のシステムは実質的に不活性で、その溶質の順序は
第2のシステムを第1の相が通過しても、目的とする成
分が除かれる以外は実際に変動してはならない。選択的
抽出はマトリックスと目的成分とのなんらかの特定の結
合相互作用形態で起こることが好ましい。特に有用な選
択的抽出システムには免疫吸着剤及び免疫親和性マトリ
ックスの使用が含まれる。
することが出来るシステムに、混合物を通過させて、成
分が液相(溶出液流)のシステムから溶出されるに伴っ
て時間的及び量的に分離させる段階から成る。本発明の
好ましい実施態様では、この第1のシステムは液体クロ
マトグラフィー マトリックス、例えばカラム、または
その他の電気泳動モジュールの様な溶質を分離する為の
方法である。この第1の溶質分離システムからの溶出液
流(“第1溶出液流”と称する)は、次いでカラム中に
存する溶質の順序を示す最初の溶出分画を求めて検出器
に流入させる。この溶出分画中の目的とする特定の溶質
の確認は、最初の溶出流を、液相中から目的とする溶質
を選択的に抽出が可能な第2のシステムに流入させて測
定する。目的とする溶質を抽出する能力以外には、この
第2のシステムは実質的に不活性で、その溶質の順序は
第2のシステムを第1の相が通過しても、目的とする成
分が除かれる以外は実際に変動してはならない。選択的
抽出はマトリックスと目的成分とのなんらかの特定の結
合相互作用形態で起こることが好ましい。特に有用な選
択的抽出システムには免疫吸着剤及び免疫親和性マトリ
ックスの使用が含まれる。
第2のシステムから流出する溶出流は、次いで流出液
中の成分の順序を求めて検出器に流入させる。第2のシ
ステムは溶出流中のその他の溶質の時間的及び/または
量的配置を大きく変動させることなく、目的とする成分
を選択的に抽出するので、第1及び第2の溶出分画との
間の差は、目的とする精製物の溶出流中の位置を決定す
る為に用い得る。かくして、目的とする成分は第2の流
出分画から除かれる。従って、2つの溶出流の比較は第
1の溶出流中の目的とする溶質の位置を特定出来る。
中の成分の順序を求めて検出器に流入させる。第2のシ
ステムは溶出流中のその他の溶質の時間的及び/または
量的配置を大きく変動させることなく、目的とする成分
を選択的に抽出するので、第1及び第2の溶出分画との
間の差は、目的とする精製物の溶出流中の位置を決定す
る為に用い得る。かくして、目的とする成分は第2の流
出分画から除かれる。従って、2つの溶出流の比較は第
1の溶出流中の目的とする溶質の位置を特定出来る。
使用される検出器は当該技術分野で通常使用される分
子検出装置のいずれであっても良い。現在好ましい検出
器には、液体中の紫外吸収を監視可能な装置、例えば分
孔光度計があげられる。更に、第1及び第2の溶出分画
は単一の検出器、または代わりに別々の検出器で測定出
来る。同様に、第1及び第2の溶出分画は視覚的または
電気的に対比出来る。電気的対比には第1の溶出分画か
ら第2の溶出分画を差し引いて、第1の溶出流中に存す
る目的とする成分のみの存在及び位置を現わす第3の分
画を求めることが含まれる。検出器はまた第1の溶出流
中の目的とする溶質の濃度を算出して表示する装置も構
成に含め得る。更に、第2のシステムに結合した目的の
成分は、その後溶出され、検出され、減法(subtractio
n)で得られたデータを確認する手段として定量され
る。最後に、本発明の装置は、コンピューター制御下の
本発明方法の実施に含まれる生成物及び/または工程の
監視、並びに種々の工程の自動化精製またはその他の製
造システムに組む込むことも出来る。
子検出装置のいずれであっても良い。現在好ましい検出
器には、液体中の紫外吸収を監視可能な装置、例えば分
孔光度計があげられる。更に、第1及び第2の溶出分画
は単一の検出器、または代わりに別々の検出器で測定出
来る。同様に、第1及び第2の溶出分画は視覚的または
電気的に対比出来る。電気的対比には第1の溶出分画か
ら第2の溶出分画を差し引いて、第1の溶出流中に存す
る目的とする成分のみの存在及び位置を現わす第3の分
画を求めることが含まれる。検出器はまた第1の溶出流
中の目的とする溶質の濃度を算出して表示する装置も構
成に含め得る。更に、第2のシステムに結合した目的の
成分は、その後溶出され、検出され、減法(subtractio
n)で得られたデータを確認する手段として定量され
る。最後に、本発明の装置は、コンピューター制御下の
本発明方法の実施に含まれる生成物及び/または工程の
監視、並びに種々の工程の自動化精製またはその他の製
造システムに組む込むことも出来る。
本発明の方法及び装置は迅速で、信頼し得て、且つ適
用可能性がある。本発明の方法は生物学的巨大分子の製
造、特に蛋白質の分離および精製に有用である。本発明
の特に有用な一面、即ち第1及び第2のシステムは溶媒
を再還流させることで容易に再生され、所定の工程全体
を反復使用可能とする。
用可能性がある。本発明の方法は生物学的巨大分子の製
造、特に蛋白質の分離および精製に有用である。本発明
の特に有用な一面、即ち第1及び第2のシステムは溶媒
を再還流させることで容易に再生され、所定の工程全体
を反復使用可能とする。
本発明の方法及び装置は、第1の溶出流の異なった試
料を、目的とする異なった溶質を選択的に抽出可能な、
別の第2のシステムに通過させて、第1のシステムとの
溶出分画を比較して、溶出流中の複数成分を特定する為
に使用出来る。
料を、目的とする異なった溶質を選択的に抽出可能な、
別の第2のシステムに通過させて、第1のシステムとの
溶出分画を比較して、溶出流中の複数成分を特定する為
に使用出来る。
本発明の方法は、目的とする溶質の純度を測定する為
にも使用出来る。第2のシステムは、第1の溶出流中の
目的とする溶質を選択的に抽出する様に設計されている
ので、第1の溶出流中の目的とする溶質と一緒に溶出す
る夾雑物が、第2の溶出流中に示される。
にも使用出来る。第2のシステムは、第1の溶出流中の
目的とする溶質を選択的に抽出する様に設計されている
ので、第1の溶出流中の目的とする溶質と一緒に溶出す
る夾雑物が、第2の溶出流中に示される。
本発明の別の実施態様に於ては、ここに記述した方法
及び装置が、工程の状況を即時にオンライン工程で監視
するシステムの一部として使用され、発生する情報が生
産を最適化する必要に合わせて条件を変化させる為に使
用される。例えば、監視出力オンラインでピークが重複
して同時に溶出される溶質が確認されると、特定の工程
条件、例えば緩衝液のpHまたは溶出勾配の変数を変更す
ることで分離が可能となる。
及び装置が、工程の状況を即時にオンライン工程で監視
するシステムの一部として使用され、発生する情報が生
産を最適化する必要に合わせて条件を変化させる為に使
用される。例えば、監視出力オンラインでピークが重複
して同時に溶出される溶質が確認されると、特定の工程
条件、例えば緩衝液のpHまたは溶出勾配の変数を変更す
ることで分離が可能となる。
図面の簡単な説明 第1図は本発明の装置の一実施態様の模式図である。
第2A−2C図は第1の溶出流(2A)、及び第2の溶出流
(2B)の波長280nmの吸収に依る溶出曲線を示し、目的
とする溶質HSAは第2の溶出流からは失われ、また2Cは
その後に溶出されたHSAの吸収スペクトルを現わす。
(2B)の波長280nmの吸収に依る溶出曲線を示し、目的
とする溶質HSAは第2の溶出流からは失われ、また2Cは
その後に溶出されたHSAの吸収スペクトルを現わす。
第3A−3C図は第1及び第2の溶出流(それぞれ3A及び
3B)、及びHSA単独の溶出(3C)の波長280nmの吸収に依
る溶出曲線を示す。また、 第4A−4C図は第1の溶出流(4A)及び第2の溶出流
(4B)の波長280nmの吸収に依る溶出曲線を示す。また4
Cはこれら第1及び第2の溶出曲線の重ね合わせであ
り、第2の溶出流には目的とする溶質、IgG、の不存在
を示す。
3B)、及びHSA単独の溶出(3C)の波長280nmの吸収に依
る溶出曲線を示す。また、 第4A−4C図は第1の溶出流(4A)及び第2の溶出流
(4B)の波長280nmの吸収に依る溶出曲線を示す。また4
Cはこれら第1及び第2の溶出曲線の重ね合わせであ
り、第2の溶出流には目的とする溶質、IgG、の不存在
を示す。
発明の詳細な説明 本発明の方法及び装置は、第1図に示された本発明の
一実施態様を現わす図式の参照に依って理解されるであ
ろう。分離すべき混合物を含有する試料10は、混合物中
の成分(溶質)を分配可能な第1のシステム12に供給さ
れる。この第1システムからの分離された溶質を含む溶
出流14は、次いで検出器16を通過させて第1の出力18を
描き、これは第1のシステム中に存する混合成分の時間
的及び/または容量的な一連の構成を現わす。溶出流14
は次いで第1の溶出流14から目的とする溶質を選択的に
抽出出来る第2のシステム20を通過させる。第2の溶出
流中の溶質の時間的及び容量的な一連の構成は、第2の
システムが適切に配置され、目的とする成分以外は大き
な相互作用または遅れを生じないで通過する様い充分に
不活性であることを前提として、第1の溶出流と実質的
に同一である。
一実施態様を現わす図式の参照に依って理解されるであ
ろう。分離すべき混合物を含有する試料10は、混合物中
の成分(溶質)を分配可能な第1のシステム12に供給さ
れる。この第1システムからの分離された溶質を含む溶
出流14は、次いで検出器16を通過させて第1の出力18を
描き、これは第1のシステム中に存する混合成分の時間
的及び/または容量的な一連の構成を現わす。溶出流14
は次いで第1の溶出流14から目的とする溶質を選択的に
抽出出来る第2のシステム20を通過させる。第2の溶出
流中の溶質の時間的及び容量的な一連の構成は、第2の
システムが適切に配置され、目的とする成分以外は大き
な相互作用または遅れを生じないで通過する様い充分に
不活性であることを前提として、第1の溶出流と実質的
に同一である。
第2システムを流出した溶出流22は、次いで検出器16
を通過して、溶出液中に残存する溶質の時間的及び/ま
たは容量的な一連の構成を示す第2の出力24を生じる。
検出器はまた第1の出力18から第2の出力24を減じて、
第1の溶出流14中の目的とする溶質の存在と位置のみを
現わす第3の出力26を示す。検出器は更に第1の溶出流
中の目的とする溶質の濃度を測定する装置、及びこのデ
ータを表示する装置となる。最後に、結合した溶質は次
いで第2のシステムから溶出、検出、及び減法データを
確認する為に定量する。目的とする溶質が蛋白質である
場合には、典型的な検出器はフィルム状とした液体を透
過する紫外吸収を測定する通常の検出器である。
を通過して、溶出液中に残存する溶質の時間的及び/ま
たは容量的な一連の構成を示す第2の出力24を生じる。
検出器はまた第1の出力18から第2の出力24を減じて、
第1の溶出流14中の目的とする溶質の存在と位置のみを
現わす第3の出力26を示す。検出器は更に第1の溶出流
中の目的とする溶質の濃度を測定する装置、及びこのデ
ータを表示する装置となる。最後に、結合した溶質は次
いで第2のシステムから溶出、検出、及び減法データを
確認する為に定量する。目的とする溶質が蛋白質である
場合には、典型的な検出器はフィルム状とした液体を透
過する紫外吸収を測定する通常の検出器である。
本装置は、自動化されることもある分子製造システム
内の監視装置の一部として使用可能である。この場合、
装置は更に当該技術の専門家には既知の自動化蛋白質製
造システムに見出られる様な複数ポートの試料採取バル
ブ28を備えるのが好ましい。複数ポートの試料採取バル
ブは試料を第1のシステム12に、洗浄液、溶出溶媒、電
気泳動システムの差動液、及び試料採取の間に必要とす
るシステムを再生する循環溶媒を含めたすべての必要な
溶媒または緩衝液と共に供給する。同様に、複数ポート
試料採取バルブ30は、第1の溶出液流及びすべての必要
な溶媒を含めて第2のシステムに液体を供給する。双方
の複数ポート バルブの位置は、好ましくはコンピュー
ター制御下に起き、液体の供給は計量ポンプで行なわれ
る。複数ポートバルブは更に“流量分配器”または所望
の流速に減速及び/または第1及び第2のシステムのみ
に供給する他の装置を含むこともある。第1及び第2シ
ステム双方の出口のバルブ32は、システムから流出する
液体を検出器18、廃棄物収集容器34、または生成物収集
容器36に送る。所望ならば、装置は検出した試料を再利
用する為にも使用される。当該技術分野の熟達者には、
第1及び/または第2システムが必要な適用電界を設
け、コンピューター制御を設けて、その運用下に置く装
置である電気泳動モジュールであることが理解されるで
あろう。
内の監視装置の一部として使用可能である。この場合、
装置は更に当該技術の専門家には既知の自動化蛋白質製
造システムに見出られる様な複数ポートの試料採取バル
ブ28を備えるのが好ましい。複数ポートの試料採取バル
ブは試料を第1のシステム12に、洗浄液、溶出溶媒、電
気泳動システムの差動液、及び試料採取の間に必要とす
るシステムを再生する循環溶媒を含めたすべての必要な
溶媒または緩衝液と共に供給する。同様に、複数ポート
試料採取バルブ30は、第1の溶出液流及びすべての必要
な溶媒を含めて第2のシステムに液体を供給する。双方
の複数ポート バルブの位置は、好ましくはコンピュー
ター制御下に起き、液体の供給は計量ポンプで行なわれ
る。複数ポートバルブは更に“流量分配器”または所望
の流速に減速及び/または第1及び第2のシステムのみ
に供給する他の装置を含むこともある。第1及び第2シ
ステム双方の出口のバルブ32は、システムから流出する
液体を検出器18、廃棄物収集容器34、または生成物収集
容器36に送る。所望ならば、装置は検出した試料を再利
用する為にも使用される。当該技術分野の熟達者には、
第1及び/または第2システムが必要な適用電界を設
け、コンピューター制御を設けて、その運用下に置く装
置である電気泳動モジュールであることが理解されるで
あろう。
工程監視システムの一部として、本発明の方法は特定
の分離または精製条件の評価及び/または開発に有用で
ある。例えば、イオン交換クロマトグラフィー システ
ムでは、pHの変動は溶質の分離に大きく影響する。本発
明の方法を用いるとオンラインで溶質分離に及ぼす種々
のpHの影響をオンラインで迅速に評価が出来、分離を最
適とする適切な条件に変更出来る。本発明の好ましい実
施態様に於ては、この評価は少量の試料を用いて迅速に
実行可能である。従って、本方法は試料または時間の実
質的な損失なしにオンラインに依る生産の最適化を可能
とする。
の分離または精製条件の評価及び/または開発に有用で
ある。例えば、イオン交換クロマトグラフィー システ
ムでは、pHの変動は溶質の分離に大きく影響する。本発
明の方法を用いるとオンラインで溶質分離に及ぼす種々
のpHの影響をオンラインで迅速に評価が出来、分離を最
適とする適切な条件に変更出来る。本発明の好ましい実
施態様に於ては、この評価は少量の試料を用いて迅速に
実行可能である。従って、本方法は試料または時間の実
質的な損失なしにオンラインに依る生産の最適化を可能
とする。
生産物監視システムの一部として、本発明の方法は、
目的の溶質と同時に溶出される夾雑物の存在を確認する
に有用でもある。第2のシステムが試料混合物中に残存
する溶質の量または所在に大きく影響せずに、液相から
目的の溶質の殆どすべてを選択的に抽出する事を前提
に、目的とする溶質に依って通常占められる筈の位置に
ある第2の溶出液中の溶質の存在は、夾雑物の存在を示
す。更に、確認は目的の溶質を溶出し、定量して、この
値を第1及び第2の溶出液中の該当するピークと比較す
ることで確証出来る。
目的の溶質と同時に溶出される夾雑物の存在を確認する
に有用でもある。第2のシステムが試料混合物中に残存
する溶質の量または所在に大きく影響せずに、液相から
目的の溶質の殆どすべてを選択的に抽出する事を前提
に、目的とする溶質に依って通常占められる筈の位置に
ある第2の溶出液中の溶質の存在は、夾雑物の存在を示
す。更に、確認は目的の溶質を溶出し、定量して、この
値を第1及び第2の溶出液中の該当するピークと比較す
ることで確証出来る。
本発明の主要な態様の中で、本発明を生産物及び/ま
たは工程の監視条件の一部として有用にするのは、溶質
確認の迅速さ、優秀性、及び信頼性である。これは装置
中の両システムを通過する迅速な液体移送、及び第1及
び第2溶出流との間の分解が少ないことを要する。
たは工程の監視条件の一部として有用にするのは、溶質
確認の迅速さ、優秀性、及び信頼性である。これは装置
中の両システムを通過する迅速な液体移送、及び第1及
び第2溶出流との間の分解が少ないことを要する。
混合物中に分配された溶質の分解は、分配成分(通常
マトリックス)中の種々の溶質の親和性及びシステムの
理論的プレートの高さの双方の関数である。カラムクロ
マトグラフィー中の“プレート(plate)”は、溶質を
取り込み得る最大の均一な領域と考えられる。
マトリックス)中の種々の溶質の親和性及びシステムの
理論的プレートの高さの双方の関数である。カラムクロ
マトグラフィー中の“プレート(plate)”は、溶質を
取り込み得る最大の均一な領域と考えられる。
カラムのプレートの高さが低ければ低い程、分離工程
が多く(プレート数が多い)、溶質は類似の成分の間で
より良好な分離をもたらして、マトリックス中を通過す
る様になる。一般に、マトリックスの表面積対カラム容
量比が大きい程、プレートの高さは低くなり、プレート
数を増加することが出来る。カラムは通常目的とする成
分を分離するに充分なプレート数を供給する様に、可能
な限りの小型なマトリックス容量に設計の重点をおく。
小容量はシステム中の液体の通過速度を増加させ、展開
領域を減少させる。好ましいマトリックスは、固形(非
多孔質)微粒子を充填したマトリックスより、実質的に
大きな表面積対容量比が得られる多孔質微粒子からな
る。
が多く(プレート数が多い)、溶質は類似の成分の間で
より良好な分離をもたらして、マトリックス中を通過す
る様になる。一般に、マトリックスの表面積対カラム容
量比が大きい程、プレートの高さは低くなり、プレート
数を増加することが出来る。カラムは通常目的とする成
分を分離するに充分なプレート数を供給する様に、可能
な限りの小型なマトリックス容量に設計の重点をおく。
小容量はシステム中の液体の通過速度を増加させ、展開
領域を減少させる。好ましいマトリックスは、固形(非
多孔質)微粒子を充填したマトリックスより、実質的に
大きな表面積対容量比が得られる多孔質微粒子からな
る。
今日用いられている特に有用な差動移動分離システム
の1つはHPLCシステム(高速液体クロマトグラフィー)
である。HPLCカラムは均一な多孔質の小型ビーズ微粒子
のマトリックスを利用する。これらの小型ビーズを密に
充填すると、液体の流れに強い抵抗性を生じるので、機
器は急速な液体の移動を可能とする高圧で運転する様に
デザインされる。密に充填された微粒子からは分子量の
小さい溶質を充分分離する大きな表面積対容量比が得ら
れる。しかしながら、通常のHPLCシステムは蛋白質の様
な大きな分子量の溶質の分離に使用して実際に成功する
ことは少ない。蛋白質の様な大きな分子量の溶質の通常
のHPLCの流通速度は、対流的である小孔間の大量移動に
比して微粒子小孔内の大量移動が主として拡散的である
ので限られてくる。一方高圧を低下させる代償として流
速の増加が得られるが、これは分離性能を低下させる傾
向がある。
の1つはHPLCシステム(高速液体クロマトグラフィー)
である。HPLCカラムは均一な多孔質の小型ビーズ微粒子
のマトリックスを利用する。これらの小型ビーズを密に
充填すると、液体の流れに強い抵抗性を生じるので、機
器は急速な液体の移動を可能とする高圧で運転する様に
デザインされる。密に充填された微粒子からは分子量の
小さい溶質を充分分離する大きな表面積対容量比が得ら
れる。しかしながら、通常のHPLCシステムは蛋白質の様
な大きな分子量の溶質の分離に使用して実際に成功する
ことは少ない。蛋白質の様な大きな分子量の溶質の通常
のHPLCの流通速度は、対流的である小孔間の大量移動に
比して微粒子小孔内の大量移動が主として拡散的である
ので限られてくる。一方高圧を低下させる代償として流
速の増加が得られるが、これは分離性能を低下させる傾
向がある。
これらの従来のHPLC分析の限界は、潅流クロマトグラ
フィーが可能な高速クロマトグラフィー用マトリックス
の使用に依って克服される。これらのマトリックスは従
来のマトリックスで時として用いられていた、全体が同
一の大きさを取れる微粒子から成っているが、微粒子内
部の多孔性に優れている。更に、微粒子内部を貫通する
小孔の直径が例えば6,000〜8,000Åと大であるに加え
て、潅流クロマトグラフィーが可能な微粒子は大きな貫
通孔を相互に結びつける500〜1,500Åのネットワークを
有している。得られたネットワークは微粒子内部の拡散
経路の長さを限定して、微粒子小孔内部の物質移動を、
広範囲な液体の流速に亘って、主として対流で規定す
る。この作用はこれらのシステムの移動相速度の増大
を、分離を実際的に低下させずに、従来(1,000cm/時
間)のHPLCシステムの10〜100倍以上とする。潅流クロ
マトグラフィーのより詳細な説明は米国出願No.376,885
(1989年6月6日出願)及びAfeyanらのBio/Technolog
y,8:203−206(1990)の報告に述べられ、その記載を
ここに引用した。潅流クロマトグラフィーのマトリック
ス材料は、米国マサチュウセッツ州ケンブリッジのPerS
eptive biosystems,Inc.より購入出来る。潅流クロマト
グラフィーが可能となった多孔性の改善された微粒子
は、カラムの実効表面積を大きく増大させ、典型的には
約30〜50m2/mlの範囲にして、カラムのプレートの高さ
を大きく低下させる。従って、小型カラムが使用可能と
なり、分離に大きな損失なしに従来得られなかった高速
で分析が行える。
フィーが可能な高速クロマトグラフィー用マトリックス
の使用に依って克服される。これらのマトリックスは従
来のマトリックスで時として用いられていた、全体が同
一の大きさを取れる微粒子から成っているが、微粒子内
部の多孔性に優れている。更に、微粒子内部を貫通する
小孔の直径が例えば6,000〜8,000Åと大であるに加え
て、潅流クロマトグラフィーが可能な微粒子は大きな貫
通孔を相互に結びつける500〜1,500Åのネットワークを
有している。得られたネットワークは微粒子内部の拡散
経路の長さを限定して、微粒子小孔内部の物質移動を、
広範囲な液体の流速に亘って、主として対流で規定す
る。この作用はこれらのシステムの移動相速度の増大
を、分離を実際的に低下させずに、従来(1,000cm/時
間)のHPLCシステムの10〜100倍以上とする。潅流クロ
マトグラフィーのより詳細な説明は米国出願No.376,885
(1989年6月6日出願)及びAfeyanらのBio/Technolog
y,8:203−206(1990)の報告に述べられ、その記載を
ここに引用した。潅流クロマトグラフィーのマトリック
ス材料は、米国マサチュウセッツ州ケンブリッジのPerS
eptive biosystems,Inc.より購入出来る。潅流クロマト
グラフィーが可能となった多孔性の改善された微粒子
は、カラムの実効表面積を大きく増大させ、典型的には
約30〜50m2/mlの範囲にして、カラムのプレートの高さ
を大きく低下させる。従って、小型カラムが使用可能と
なり、分離に大きな損失なしに従来得られなかった高速
で分析が行える。
潅流マトリックスは、本発明の装置に於て、第1及び
第2の双方のシステムで、液体クロマトグラフィー用マ
トリックスに現在好適に使用されている。第1システム
に使用される潅流マトリックスは、混合物中の成分を分
配し、分離する様にデザインされ、特定のクロマトグラ
フィー システムを形成する様に、本技術分野の通常の
技術者が通常の方法を用いて所望に沿う様に調製出来
る。例えば、マトリックスは溶質を大きさに依って分配
し、または電荷(例えばイオン交換樹脂として)、金属
イオン親和性、または疎水性もしくは親水性に依って溶
質を分離する様に誘導する。その他の有用なマトリック
スとしては、リン酸カルシウム(ヒドロキシアパタイ
ト)、ベントナイト、アルミナ、及び酸化チタンもしく
は酸化亜鉛ゲルの様な無機物質が含まれる。
第2の双方のシステムで、液体クロマトグラフィー用マ
トリックスに現在好適に使用されている。第1システム
に使用される潅流マトリックスは、混合物中の成分を分
配し、分離する様にデザインされ、特定のクロマトグラ
フィー システムを形成する様に、本技術分野の通常の
技術者が通常の方法を用いて所望に沿う様に調製出来
る。例えば、マトリックスは溶質を大きさに依って分配
し、または電荷(例えばイオン交換樹脂として)、金属
イオン親和性、または疎水性もしくは親水性に依って溶
質を分離する様に誘導する。その他の有用なマトリック
スとしては、リン酸カルシウム(ヒドロキシアパタイ
ト)、ベントナイト、アルミナ、及び酸化チタンもしく
は酸化亜鉛ゲルの様な無機物質が含まれる。
溶液中の溶質を分離するその他の方法、特に本発明で
有用な方法は電気泳動である。特に細管電気泳動は、か
けられた高い電界に依って生じたジュール熱を放散させ
るに必要な適切な構造(高い表面積対容積比)が得られ
る。これらの高い電界に耐えられることで細管電気泳動
システムは、潅流HPLCの様に分離度を損なわずに迅速な
処理を可能とする。更に、細管構造は小容量で必要なプ
レート数が得られ、システムを小型カラムとして使用出
来る。従って、潅流HPLCと同様に細管電気泳動システム
は、試料の大幅な少量化及び迅速分析を可能とする。
有用な方法は電気泳動である。特に細管電気泳動は、か
けられた高い電界に依って生じたジュール熱を放散させ
るに必要な適切な構造(高い表面積対容積比)が得られ
る。これらの高い電界に耐えられることで細管電気泳動
システムは、潅流HPLCの様に分離度を損なわずに迅速な
処理を可能とする。更に、細管構造は小容量で必要なプ
レート数が得られ、システムを小型カラムとして使用出
来る。従って、潅流HPLCと同様に細管電気泳動システム
は、試料の大幅な少量化及び迅速分析を可能とする。
電気泳動は分子を幾つかの異なった方式で分離が可能
で、これらはいずれも細管システムで実施出来る。最も
有用な方法にはゾーン電気泳動または“自由流動(free
−flow"(open)電気泳動法、ゲル電気泳動法、及び等
電点焦点化法である。ゾーン電気泳動法は固形の支持体
を有さず、分離は単一相(即ち、液体)内で行なわれ
る。それにも拘らず、ゾーン電気泳動法、特に細管ゾー
ン電気泳動法の分離記録は、標準的な溶出クロマトグラ
フィーで得られた記録に類似し、カラム クロマトグラ
フィーの為に定義されたプレート数及び分離度の正規な
概念が広く受け入れられている。
で、これらはいずれも細管システムで実施出来る。最も
有用な方法にはゾーン電気泳動または“自由流動(free
−flow"(open)電気泳動法、ゲル電気泳動法、及び等
電点焦点化法である。ゾーン電気泳動法は固形の支持体
を有さず、分離は単一相(即ち、液体)内で行なわれ
る。それにも拘らず、ゾーン電気泳動法、特に細管ゾー
ン電気泳動法の分離記録は、標準的な溶出クロマトグラ
フィーで得られた記録に類似し、カラム クロマトグラ
フィーの為に定義されたプレート数及び分離度の正規な
概念が広く受け入れられている。
一般的に、通常のポリアクリルアミド板状(“sla
b")ゲルを含むすべての電気泳動システムが、システム
上のゾーンの拡大(例えば拡散、ジュール熱及び/また
は伝導度の変化)に依る限界を考慮し、最小限とすれば
使用可能である。例えば、チャンネルの厚さを約200μ
m未満とした等電点焦点化及び電気泳動システムが、本
発明の方法及び装置の使用に有用と考えられる。細管電
気泳動を含む電気泳動の理論、応用、機器及び自動化に
関する詳細な情報は、本技術分野の通常の専門家に多数
知られている。特に役立つ情報源には、Kargerら(198
9)J.Chromatogr.,492:585−614、Foretら(1990)Elec
trophoresis11:661−664、及びNovotny(1990)Electro
phoresis11:735−749等がある。
b")ゲルを含むすべての電気泳動システムが、システム
上のゾーンの拡大(例えば拡散、ジュール熱及び/また
は伝導度の変化)に依る限界を考慮し、最小限とすれば
使用可能である。例えば、チャンネルの厚さを約200μ
m未満とした等電点焦点化及び電気泳動システムが、本
発明の方法及び装置の使用に有用と考えられる。細管電
気泳動を含む電気泳動の理論、応用、機器及び自動化に
関する詳細な情報は、本技術分野の通常の専門家に多数
知られている。特に役立つ情報源には、Kargerら(198
9)J.Chromatogr.,492:585−614、Foretら(1990)Elec
trophoresis11:661−664、及びNovotny(1990)Electro
phoresis11:735−749等がある。
上記した様に、第2のシステムは溶液中に残存する溶
質の位置及び濃度を大きく影響してはならない。これは
システムの配置が重要であることを意味する。目的とす
る溶質の実質的にすべてと適切に結合する最少量を使用
すべきである。更に、非特異的結合は、偽陰性を避ける
為に最少とせねばならない。好ましくは、非特異的吸着
は約1ng/10μl未満とすべきである。従って、結合表面
積またはマトリックスは実質的に不活性で、目的とする
単一または複数の溶質を、溶出液中に残存する溶質の分
離を大きく変動させることなく、選択的に、好ましくは
定量的に抽出できねばならない。所望ならば、非特異的
結合は、第2のシステムに於ては試料を負荷する前に、
非特異的分子に依って潜在的な非特異的結合部位を先ず
被覆することで更に低下させることが可能である。本技
術分野の熟達者には、この“被覆(coat)”分子は溶離
条件下では結合が充分で、第2の溶出流の出力に干渉し
ない様にすべきである。
質の位置及び濃度を大きく影響してはならない。これは
システムの配置が重要であることを意味する。目的とす
る溶質の実質的にすべてと適切に結合する最少量を使用
すべきである。更に、非特異的結合は、偽陰性を避ける
為に最少とせねばならない。好ましくは、非特異的吸着
は約1ng/10μl未満とすべきである。従って、結合表面
積またはマトリックスは実質的に不活性で、目的とする
単一または複数の溶質を、溶出液中に残存する溶質の分
離を大きく変動させることなく、選択的に、好ましくは
定量的に抽出できねばならない。所望ならば、非特異的
結合は、第2のシステムに於ては試料を負荷する前に、
非特異的分子に依って潜在的な非特異的結合部位を先ず
被覆することで更に低下させることが可能である。本技
術分野の熟達者には、この“被覆(coat)”分子は溶離
条件下では結合が充分で、第2の溶出流の出力に干渉し
ない様にすべきである。
現在、目的とする溶質を選択的に抽出する好ましいマ
トリックスは、溶質と特異的な結合作用相互を可能とす
るものである。最も好ましくは、これらの相互作用が可
逆性であり、システムは溶質をカラムから脱離可能で、
他の試料の為にシステムを調整可能な1種以上の再生溶
媒に依って再活性化可能であると良い。有用な溶質特異
的な結合部位には、免疫吸着部位(例えば抗体)及び目
的とする溶質と特異的に相互作用が可能なその他の蛋白
質が含まれる。例えば、溶質とホルモン、毒素、レクチ
ン及びそれらの適当なレセプターを含むリガンドと酵素
の組合せのいずれかから成るその溶質特異的結合が想定
される。目的とする溶質が酵素である場合、結合部位は
偽−基質または阻害剤を成すことがある。一般的に、溶
質に特異的な結合部位(溶質に特異的な親和性吸着)
は、与えられた目的とする溶出液に対して生物学的親和
性を示すすべての不動化リガンドであって良い。マトリ
ックスの表面は、溶質特異的な結合部位がマトリックス
表面に不可逆的に結合する様に誘導されることがある。
結合した溶質は、次いで溶出され、カラムは次の材料に
備えて再生される。或は、溶質特異的結合部位がマトリ
ックス表面に非共有結合的に結びつくことも出来る。こ
のことはシステムが異なった標的溶質への使用に適応可
能とする。特定の溶質に特異的な結合部位は、1種以上
の再生溶媒に依ってシステムから脱離され、第2の異な
った溶質に特異的な第2の結合部位がシステムに適用さ
れる。例えば、蛋白質AまたはGはマトリックス表面に
共有結合をして、代わりにマトリックスに複数の異なっ
た溶質特異的な抗体の結合が可能となる。
トリックスは、溶質と特異的な結合作用相互を可能とす
るものである。最も好ましくは、これらの相互作用が可
逆性であり、システムは溶質をカラムから脱離可能で、
他の試料の為にシステムを調整可能な1種以上の再生溶
媒に依って再活性化可能であると良い。有用な溶質特異
的な結合部位には、免疫吸着部位(例えば抗体)及び目
的とする溶質と特異的に相互作用が可能なその他の蛋白
質が含まれる。例えば、溶質とホルモン、毒素、レクチ
ン及びそれらの適当なレセプターを含むリガンドと酵素
の組合せのいずれかから成るその溶質特異的結合が想定
される。目的とする溶質が酵素である場合、結合部位は
偽−基質または阻害剤を成すことがある。一般的に、溶
質に特異的な結合部位(溶質に特異的な親和性吸着)
は、与えられた目的とする溶出液に対して生物学的親和
性を示すすべての不動化リガンドであって良い。マトリ
ックスの表面は、溶質特異的な結合部位がマトリックス
表面に不可逆的に結合する様に誘導されることがある。
結合した溶質は、次いで溶出され、カラムは次の材料に
備えて再生される。或は、溶質特異的結合部位がマトリ
ックス表面に非共有結合的に結びつくことも出来る。こ
のことはシステムが異なった標的溶質への使用に適応可
能とする。特定の溶質に特異的な結合部位は、1種以上
の再生溶媒に依ってシステムから脱離され、第2の異な
った溶質に特異的な第2の結合部位がシステムに適用さ
れる。例えば、蛋白質AまたはGはマトリックス表面に
共有結合をして、代わりにマトリックスに複数の異なっ
た溶質特異的な抗体の結合が可能となる。
溶質特異的マトリックスは液体クロマトグラフィーの
システムまたは電気泳動システム(例えば細管電気泳動
システム)に導入可能である。
システムまたは電気泳動システム(例えば細管電気泳動
システム)に導入可能である。
或は、溶質特異的な結合部位は細管の内壁表面、また
は充分に高い表面積対容量比が得られるその他の表面に
付着出来る。細管クロマトグラフィーは圧力勾配または
電圧勾配を用いて実施出来る。
は充分に高い表面積対容量比が得られるその他の表面に
付着出来る。細管クロマトグラフィーは圧力勾配または
電圧勾配を用いて実施出来る。
本発明は以下の非限定的な実施例に依ってさらに理解
されるであろう。
されるであろう。
実施例 1. 本実験に於て、ヒト血清アルブミン(HSA)を混合物
中に確認した。第1のシステムはヒト血清アルブミン
(HSA、50μg)、キモトリブシン(CT、25μg)、チ
トクロームC(Cyt、25μg)、及びリゾチーム(Lys、
25μg)を含有するリン酸緩衝生理食塩液(PBS)1mlの
混合物を分離する為に、潅流イオン交換剤を用いて製作
した。本混合物をPBS中1ml/分の速度で負荷させ、0時
間時点で90%%緩衝液A(20mMモルフォリンエタンスル
フォン酸、pH6.0)/10%緩衝液B(1M塩化ナトリウム含
有20mM MES)及び8分時点で50%緩衝液A/50%緩衝液B
の勾配で1ml/分の速度で溶出した。第1の溶出流は波長
280nmの吸収を分光光度計で検出した。第2A図から判明
する様に、第1の溶出液には5つのピークが確認され
た。
中に確認した。第1のシステムはヒト血清アルブミン
(HSA、50μg)、キモトリブシン(CT、25μg)、チ
トクロームC(Cyt、25μg)、及びリゾチーム(Lys、
25μg)を含有するリン酸緩衝生理食塩液(PBS)1mlの
混合物を分離する為に、潅流イオン交換剤を用いて製作
した。本混合物をPBS中1ml/分の速度で負荷させ、0時
間時点で90%%緩衝液A(20mMモルフォリンエタンスル
フォン酸、pH6.0)/10%緩衝液B(1M塩化ナトリウム含
有20mM MES)及び8分時点で50%緩衝液A/50%緩衝液B
の勾配で1ml/分の速度で溶出した。第1の溶出流は波長
280nmの吸収を分光光度計で検出した。第2A図から判明
する様に、第1の溶出液には5つのピークが確認され
た。
第1の溶出液流は。次いでこのシステムはイオン交換
クロマトグラフィー(IEC)カラムの後に配置した第2
のシステムを通過させる。第2のシステムは予め170μ
gの精製抗HSA(Sigma Co.,オハイオ州シンシナティ、N
o.A−2672)及びウシ血清アルブミン(BSA)を含有する
溶液を用いて、1ml/分の速度で負荷した潅流逆相媒体
(POROS RM、2.1x30mm)で構成した。BSAは無結合マト
リックス表面を充分被覆する様に添加して、試料がマト
リックスに非特異的に結合するのを防げた。第2B図に示
す様に、第1の溶出流が第2のシステムを通過した際
に、少なくともピーク1及び2の90%が消失し、一方ピ
ーク3、4及び5はその濃度に影響なく溶出された。
クロマトグラフィー(IEC)カラムの後に配置した第2
のシステムを通過させる。第2のシステムは予め170μ
gの精製抗HSA(Sigma Co.,オハイオ州シンシナティ、N
o.A−2672)及びウシ血清アルブミン(BSA)を含有する
溶液を用いて、1ml/分の速度で負荷した潅流逆相媒体
(POROS RM、2.1x30mm)で構成した。BSAは無結合マト
リックス表面を充分被覆する様に添加して、試料がマト
リックスに非特異的に結合するのを防げた。第2B図に示
す様に、第1の溶出流が第2のシステムを通過した際
に、少なくともピーク1及び2の90%が消失し、一方ピ
ーク3、4及び5はその濃度に影響なく溶出された。
更にピーク3、4、及び5は第2システムから、第1
システムから溶出したと同様な相対的距離間隔で溶出さ
れた。試験として、結合したHSAは次いで第2のシステ
ムから2%酢酸及びMgCl2300mMを含有する溶液を用い
て、流速1ml/分で溶出した。第2C図に見られる様に、こ
の操作で約13分の位置に広いピークで結合HSAの少なく
とも90%が脱離した。本実施例及び以後の実験の為に、
混合物中の各成分単独の溶出特性は、実施条件で測定し
た。本実施例では、PBSの存在下流速1ml/分で、HSAが約
1分、Ctが約2.3分、Cytが約2.9分、及びLysが約4.7分
で溶出した。しかしながら、明細書及び実施例から、こ
の確認は本発明の方法には必要ではないことが明かであ
る。
システムから溶出したと同様な相対的距離間隔で溶出さ
れた。試験として、結合したHSAは次いで第2のシステ
ムから2%酢酸及びMgCl2300mMを含有する溶液を用い
て、流速1ml/分で溶出した。第2C図に見られる様に、こ
の操作で約13分の位置に広いピークで結合HSAの少なく
とも90%が脱離した。本実施例及び以後の実験の為に、
混合物中の各成分単独の溶出特性は、実施条件で測定し
た。本実施例では、PBSの存在下流速1ml/分で、HSAが約
1分、Ctが約2.3分、Cytが約2.9分、及びLysが約4.7分
で溶出した。しかしながら、明細書及び実施例から、こ
の確認は本発明の方法には必要ではないことが明かであ
る。
実施例 2. HSAを確認する第2の方法を本実験で検討した。HSA45
μg、CT22.5μg、Cyt22.5μg及びLys22.5μgを含有
する試料を、実施例1と同様の条件下で潅流イオン交換
媒体(POROS SM、4.6x50mmカラム)を含有する第1シス
テムを通過させた。最初の溶出液は第2A図に示した。本
実施例では、若干優れた分離が得られ、HSAは単一ピー
クとして(1.1分時点に)溶出した。更に、少量の蛋白
質が0.58分の溶媒分画に現われた。
μg、CT22.5μg、Cyt22.5μg及びLys22.5μgを含有
する試料を、実施例1と同様の条件下で潅流イオン交換
媒体(POROS SM、4.6x50mmカラム)を含有する第1シス
テムを通過させた。最初の溶出液は第2A図に示した。本
実施例では、若干優れた分離が得られ、HSAは単一ピー
クとして(1.1分時点に)溶出した。更に、少量の蛋白
質が0.58分の溶媒分画に現われた。
最初の溶出液は、次いでPOROS SMカラムに続く第2シ
ステムを通過させた。第2のシステムは、予めポリクロ
ーナルヤギ抗HSA(1ml、Sigma Co.,No.A−7544、総抗体
量3.9mg/ml)を含有するPBS2mlを、流速0.5ml/分で負荷
させた潅流蛋白質G親和性カラム(POROS GM、2.1x30m
m)で調製した。溶出は実施例1と同様に行なって、第
2の流出液は次いで280nmで検出測定し、第2B図に現わ
す溶出を示した。第2A及び2B図の比較は第1の溶出液中
に存するHSAの少なくとも約90%が、残存する溶質に影
響することなく、第2のシステムに捕らえられ、明瞭に
本溶出液中のHSAの存在を確認した。
ステムを通過させた。第2のシステムは、予めポリクロ
ーナルヤギ抗HSA(1ml、Sigma Co.,No.A−7544、総抗体
量3.9mg/ml)を含有するPBS2mlを、流速0.5ml/分で負荷
させた潅流蛋白質G親和性カラム(POROS GM、2.1x30m
m)で調製した。溶出は実施例1と同様に行なって、第
2の流出液は次いで280nmで検出測定し、第2B図に現わ
す溶出を示した。第2A及び2B図の比較は第1の溶出液中
に存するHSAの少なくとも約90%が、残存する溶質に影
響することなく、第2のシステムに捕らえられ、明瞭に
本溶出液中のHSAの存在を確認した。
実施例2の溶媒分画中に存する蛋白質がHSAであるか
否かを決定する為に、実施例1及び2(PBS中HSA100μ
g、20μlを負荷)に記載したと同一条件下で、HSAを
単独でイオン交換クロマトグラフィー(IEC)カラムを
通過させた。上記した標準緩衝液A対緩衝液B勾配を用
いた溶出は、溶媒分画のピークを0.58分及びHSA(1.1分
時点、第2C図参照)を得た。本クロマトグラムは明瞭に
溶媒流中の蛋白質がHSAと共に導入された夾雑物である
ことを示す。
否かを決定する為に、実施例1及び2(PBS中HSA100μ
g、20μlを負荷)に記載したと同一条件下で、HSAを
単独でイオン交換クロマトグラフィー(IEC)カラムを
通過させた。上記した標準緩衝液A対緩衝液B勾配を用
いた溶出は、溶媒分画のピークを0.58分及びHSA(1.1分
時点、第2C図参照)を得た。本クロマトグラムは明瞭に
溶媒流中の蛋白質がHSAと共に導入された夾雑物である
ことを示す。
実施例 3. 本実施例では、IgGが目的とする溶質であり、少量粗
細胞抽出の上清混合物から成る。
細胞抽出の上清混合物から成る。
潅流アニオン交換マトリックス(POROS QM、4.6x100m
mカラム)を含有する第1システムに、IgG50μg及び10
0倍量のハイブリドーマ粗細培養上清(蛋白質5mg)を含
有する試料50μlを負荷させた。試料は5ml/分の速度で
負荷させ、100%緩衝液C(20mMトリス緩衝液、NaCl無
添加、pH8)対0%緩衝液D(緩衝液C+1M NaCl)を0
時間時点、また0%緩衝液C対100%緩衝液Dを10分時
点とする勾配で、同一流速で溶出した。溶出液は280nm
で検出し、溶出液は第4A図に示す溶出を示した。
mカラム)を含有する第1システムに、IgG50μg及び10
0倍量のハイブリドーマ粗細培養上清(蛋白質5mg)を含
有する試料50μlを負荷させた。試料は5ml/分の速度で
負荷させ、100%緩衝液C(20mMトリス緩衝液、NaCl無
添加、pH8)対0%緩衝液D(緩衝液C+1M NaCl)を0
時間時点、また0%緩衝液C対100%緩衝液Dを10分時
点とする勾配で、同一流速で溶出した。溶出液は280nm
で検出し、溶出液は第4A図に示す溶出を示した。
溶出液は次いで第1システムに続く第2システムを通
過させた。第2システムは潅流蛋白質A親和性マトリッ
クス(POROS AM、4.6x50mmカラム)から成る。試料は5m
l/分で流下させ、この第2溶出液は、波長280nmで検出
し、第4B図に示す溶出液を得た。2.1分時点の第3のピ
ーク、IgG、は第2溶出流にはなかった。第4A及び4B図
を重ね合わせて第4C図とすると、残存する溶出の位置
は、第1及び第2の溶出液中で無変化であった。IgGは
カラムより2%酢酸、0.3M MgCl2及び0.15M NaClさら成
る再生溶媒でカラムから溶出した。
過させた。第2システムは潅流蛋白質A親和性マトリッ
クス(POROS AM、4.6x50mmカラム)から成る。試料は5m
l/分で流下させ、この第2溶出液は、波長280nmで検出
し、第4B図に示す溶出液を得た。2.1分時点の第3のピ
ーク、IgG、は第2溶出流にはなかった。第4A及び4B図
を重ね合わせて第4C図とすると、残存する溶出の位置
は、第1及び第2の溶出液中で無変化であった。IgGは
カラムより2%酢酸、0.3M MgCl2及び0.15M NaClさら成
る再生溶媒でカラムから溶出した。
本発明は本発明の精神及び中核を為す特徴から逸脱す
ることなくその他の特定の形態を取り得る。本実施態様
は従って、あらゆる点で例証であり、限定的ではなく、
本発明の範囲は前記の記述より未確定の特許請求の範囲
に依って示され、従って特許請求の範囲と同等の意味及
び範囲内にあるすべての変更が含まれる。
ることなくその他の特定の形態を取り得る。本実施態様
は従って、あらゆる点で例証であり、限定的ではなく、
本発明の範囲は前記の記述より未確定の特許請求の範囲
に依って示され、従って特許請求の範囲と同等の意味及
び範囲内にあるすべての変更が含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レグナー,フレッド イー. アメリカ合衆国 47986 インディアナ, ウエスト ラファイエット,タカホウ レイン 1219 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 30/86 B01D 15/08 G01N 30/46
Claims (15)
- 【請求項1】溶質を分離する装置に於て、 供給液体中の複数の溶質と異なって相互反応して、個々
の溶質を順次多量に含有する第1溶出流を形成する装
置、 前記溶出流中の前記の個々の溶質の時間的な存在を示す
第1出力を示す第1検出装置、 前記個々の溶質を予め設定した組合せの前記溶出流から
抽出し、残存する個々の溶質を時間を追って豊富に含有
する第2の溶出流を形成する装置、 第2の検出装置は前記の残存する個々の溶質の前記第2
溶出流の時間的存在を示す第2の出力を供給する装置、
及び 前記第1出力と前記第2出力とを比較して、前記第1の
溶出流中の個々の溶質の予め設定した組合せの位置の確
定が可能な比較装置から成る装置。 - 【請求項2】前記第1検出器及び前記第2検出器が単一
の検出器を構成する請求項1の装置。 - 【請求項3】前記検出器の1つが液体中の溶質の紫外吸
収を測定する装置を構成する請求項1の装置。 - 【請求項4】複数の溶質と異なって相互反応する前記の
液体供給装置が液体クロマトグラフィーシステムを構成
する請求項1の装置。 - 【請求項5】前記液体クロマトグラフィー システム
が、アニオン交換樹脂、カチオン交換樹脂、疎水性相互
作用、親水性相互作用、分子篩、粒度選別、金属イオン
親和性及び生物親和性材質から成る群から選ばれるクロ
マトグラフィー材質である請求項4の装置。 - 【請求項6】液体供給装置内の複数の溶質と異なった相
互作用する前記装置が電気泳動システムから成る請求項
1の装置。 - 【請求項7】前記電気泳動システムが細管電気泳動シス
テムである請求項6の装置。 - 【請求項8】前記電気泳動システムがゲル電気泳動、ゾ
ーン電気泳動及び等電点焦点法から成る群から選出され
る請求項6または7の装置。 - 【請求項9】前記抽出装置が溶質特異的な親和性吸着材
である請求項1の装置。 - 【請求項10】前記複数の溶質に於て最初の液体供給が
生物学的巨大分子から成る請求項1の装置。 - 【請求項11】前記検出装置が前記溶出液流中の蛋白質
の存在を検出する装置から成る請求項1の装置。 - 【請求項12】前記検出装置の1つが、前記個々の溶質
の瞬間濃度を検出する装置から成る請求項1の装置。 - 【請求項13】溶質分離装置からの溶出液流中の溶質の
予め設定した組合せの位置を特定する方法に於て、前記
方法が 前記溶出流が前記溶出流中の個々の溶質の時間的存在を
表示する最初の出力を形成する様に検出器を通過し、 次いで、前記溶出流が前記溶出流から予め設定した溶質
の組合せを抽出する為の装置を通過し、 その後に前記溶出流が前記溶出流中の個々の残存する溶
質の時間的存在を示す第2の出力を形成する様に検出器
を通過し、 前記最初の出力を前記第2の出力と比較して前記溶出流
中の予め設定した溶質の組合せを決定することから成る
方法。 - 【請求項14】前記抽出装置が溶質特異的な親和性吸収
材を含有する装置から成る請求項13の方法。 - 【請求項15】比較段階が電気的に実施される請求項13
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US67687291A | 1991-03-28 | 1991-03-28 | |
US676.872 | 1991-03-28 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06500402A JPH06500402A (ja) | 1994-01-13 |
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Family
ID=24716390
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---|---|---|---|
JP50997292A Expired - Fee Related JP3175941B2 (ja) | 1991-03-28 | 1992-03-20 | クロマトグラフ溶出液の減法に依るオンライン生成物確認方法及び装置 |
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EP (1) | EP0533909B1 (ja) |
JP (1) | JP3175941B2 (ja) |
AT (1) | ATE147281T1 (ja) |
AU (1) | AU647929B2 (ja) |
CA (1) | CA2083820A1 (ja) |
DE (1) | DE69216520T2 (ja) |
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