JP2002181781A - キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 - Google Patents
キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置Info
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- JP2002181781A JP2002181781A JP2000380547A JP2000380547A JP2002181781A JP 2002181781 A JP2002181781 A JP 2002181781A JP 2000380547 A JP2000380547 A JP 2000380547A JP 2000380547 A JP2000380547 A JP 2000380547A JP 2002181781 A JP2002181781 A JP 2002181781A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】
【課題】各種微生物、とりわけサルモネラを迅速且つ高
感度に分離検出する分析方法並びに該方法に使用される
分析装置を提供することを目的とする 【解決手段】微生物を含む試料をアルギン酸塩を含有す
る泳動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動する微生物
の分析方法。微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍
光抗体で処理し、これをキャピラリー電気泳動に供して
蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出する微生物の分
析方法。キャピラリー電気泳動を用いて微生物を分析す
る方法であって、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を
含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離す
るキャピラリー、および(iii)分離された微生物を検出
するための検出手段、を備える微生物の分析装置。
感度に分離検出する分析方法並びに該方法に使用される
分析装置を提供することを目的とする 【解決手段】微生物を含む試料をアルギン酸塩を含有す
る泳動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動する微生物
の分析方法。微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍
光抗体で処理し、これをキャピラリー電気泳動に供して
蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出する微生物の分
析方法。キャピラリー電気泳動を用いて微生物を分析す
る方法であって、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を
含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離す
るキャピラリー、および(iii)分離された微生物を検出
するための検出手段、を備える微生物の分析装置。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キャピラリー電気
泳動を用いて、検体試料中に存在する微生物を分析する
方法並びに分析装置に関する。本発明の分析方法並びに
分析装置は、環境、食品及び医療分野等において、検体
試料中に混在する微生物を精度よく又は一斉分析する上
で有用である。
泳動を用いて、検体試料中に存在する微生物を分析する
方法並びに分析装置に関する。本発明の分析方法並びに
分析装置は、環境、食品及び医療分野等において、検体
試料中に混在する微生物を精度よく又は一斉分析する上
で有用である。
【０００２】なお、本発明で分析とは、試料中に含まれ
る所望微生物の分離、検出（定性的分析）、同定、定
量、スクリーニング、生死判別を包含するものである。
る所望微生物の分離、検出（定性的分析）、同定、定
量、スクリーニング、生死判別を包含するものである。
【０００３】
【従来の技術】一般に、試料中に微生物が存在するか否
かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量
を調べるためには、一旦これらの試料を適当な培地に接
種して培養することによって目的の微生物を増殖させる
必要がある。このため、従来、微生物の分析にはその培
養のために少なくとも数時間という長い時間が必要であ
り、結果が迅速に得られないという問題があった。ま
た、細菌培養は基本的に無菌的に行われるため、特殊な
培養技術や設備が要求される。
かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量
を調べるためには、一旦これらの試料を適当な培地に接
種して培養することによって目的の微生物を増殖させる
必要がある。このため、従来、微生物の分析にはその培
養のために少なくとも数時間という長い時間が必要であ
り、結果が迅速に得られないという問題があった。ま
た、細菌培養は基本的に無菌的に行われるため、特殊な
培養技術や設備が要求される。
【０００４】これらのことから、微生物の培養並びに高
度な技術や装置を要することなく、試料中に含まれ得る
微生物を迅速に且つ簡便に検出し得る方法が望まれてい
る。
度な技術や装置を要することなく、試料中に含まれ得る
微生物を迅速に且つ簡便に検出し得る方法が望まれてい
る。
【０００５】微生物の中でも腸内細菌であるサルモネラ
は、大腸菌および赤痢菌と共に、食中毒を発症する最多
原因菌として知られている。サルモネラによる食中毒
は、サルモネラに汚染された食肉、牛乳、卵およびこれ
らの加工食品を摂取し、サルモネラが腸管内で増殖する
ことによって起こる感染型食中毒であり、1999年度の食
中毒患者総数（ウイルス、自然毒、化学物質などを含
む）の３分の１がサルモネラ中毒であると報告されるよ
うに、年々増加の傾向にある。
は、大腸菌および赤痢菌と共に、食中毒を発症する最多
原因菌として知られている。サルモネラによる食中毒
は、サルモネラに汚染された食肉、牛乳、卵およびこれ
らの加工食品を摂取し、サルモネラが腸管内で増殖する
ことによって起こる感染型食中毒であり、1999年度の食
中毒患者総数（ウイルス、自然毒、化学物質などを含
む）の３分の１がサルモネラ中毒であると報告されるよ
うに、年々増加の傾向にある。
【０００６】サルモネラによるヒトの疾病には、基本的
には上記食中毒という形で発症する急性胃腸炎、並びに
チフス性疾患（腸チフス、パラチフス）の２種類が知ら
れているが、これらの疾病は、同じサルモネラに属する
細菌でも異なる亜種（７種）や血清型（約2,200種）に
よってもたらされる。例えば急性胃腸炎（食中毒）は宿
主域の広い亜種Ｉ血清型のいずれでも起こりうるが、一
般にはネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び
腸炎菌（Salmonella enteritidis）によって生じ、また
チフス性疾患はごく少数の亜種Ｉ血清型（Typhi, Parat
yphi A, Paratyphi B, Paratyphi C, Sendai）で生じる
ことが知られている。
には上記食中毒という形で発症する急性胃腸炎、並びに
チフス性疾患（腸チフス、パラチフス）の２種類が知ら
れているが、これらの疾病は、同じサルモネラに属する
細菌でも異なる亜種（７種）や血清型（約2,200種）に
よってもたらされる。例えば急性胃腸炎（食中毒）は宿
主域の広い亜種Ｉ血清型のいずれでも起こりうるが、一
般にはネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び
腸炎菌（Salmonella enteritidis）によって生じ、また
チフス性疾患はごく少数の亜種Ｉ血清型（Typhi, Parat
yphi A, Paratyphi B, Paratyphi C, Sendai）で生じる
ことが知られている。
【０００７】このように多くの種類に分類されるサルモ
ネラの検出は、従来、選択分離培養で培養後、疑わしい
集落を釣菌し、確認培地や同定キットあるいは抗血清に
より判定する必要があり、菌種・菌株を正確に同定する
には多くの経験と熟練が必要であった。また、培養など
の時間を合わせると判定結果には３〜５日間の長期間を
要していた。
ネラの検出は、従来、選択分離培養で培養後、疑わしい
集落を釣菌し、確認培地や同定キットあるいは抗血清に
より判定する必要があり、菌種・菌株を正確に同定する
には多くの経験と熟練が必要であった。また、培養など
の時間を合わせると判定結果には３〜５日間の長期間を
要していた。
【０００８】このため食品及び医療分野では、微生物、
とりわけ多くの種類に分類されるサルモネラを菌種・菌
株毎に特異的に検出するための迅速で且つ安全な方法の
確立が求められているのが実情である。
とりわけ多くの種類に分類されるサルモネラを菌種・菌
株毎に特異的に検出するための迅速で且つ安全な方法の
確立が求められているのが実情である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】感染症疾患に対して迅
速に適切な処置を施したり、その感染源を迅速に阻止す
るためには、感染源となりうる微生物の迅速で且つ特異
的な検出方法が求められる。そこで、本発明は各種微生
物、とりわけサルモネラを迅速且つ高感度に分離検出等
する分析方法並びに該方法に使用される分析装置を提供
することを目的とする。
速に適切な処置を施したり、その感染源を迅速に阻止す
るためには、感染源となりうる微生物の迅速で且つ特異
的な検出方法が求められる。そこで、本発明は各種微生
物、とりわけサルモネラを迅速且つ高感度に分離検出等
する分析方法並びに該方法に使用される分析装置を提供
することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルギン酸塩を配
合した泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動法を利
用することにより、試料中に種々含まれる微生物、特に
サルモネラを高い分離能をもって且つ再現性よく分離す
ることができることを見出した。また本発明者らは、キ
ャピラリー電気泳動法において検出手段として蛍光検出
器を利用することによって、とりわけ蛍光抗体で目的の
微生物を予め蛍光標識することによって、微量の微生物
であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出
できること、またこれにより更に一層高い分離能でもっ
て精度よく所望の微生物が検出できることを見出した。
更に本発明者らは、本発明の方法によると試料中に混在
する微生物が単に検出できるだけでなく、定量的に測定
できることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて
完成されたものである。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルギン酸塩を配
合した泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動法を利
用することにより、試料中に種々含まれる微生物、特に
サルモネラを高い分離能をもって且つ再現性よく分離す
ることができることを見出した。また本発明者らは、キ
ャピラリー電気泳動法において検出手段として蛍光検出
器を利用することによって、とりわけ蛍光抗体で目的の
微生物を予め蛍光標識することによって、微量の微生物
であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出
できること、またこれにより更に一層高い分離能でもっ
て精度よく所望の微生物が検出できることを見出した。
更に本発明者らは、本発明の方法によると試料中に混在
する微生物が単に検出できるだけでなく、定量的に測定
できることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて
完成されたものである。
【００１１】すなわち本発明は下記（１）〜（４）に掲
げる微生物の分析方法である： （１）微生物を含む試料を、アルギン酸塩を含有する泳
動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動することを特徴
とする、微生物の分析方法。 （２）微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍光抗体
で処理し、これをキャピラリー電気泳動に供して、蛍光
抗体で標識された微生物を蛍光検出することを特徴とす
る、微生物の分析方法。 （３）アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いてキャ
ピラリー電気泳動することを特徴とする、（２）記載の
微生物の分析方法。 （４）微生物が、サルモネラに属する細菌であることを
特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の微生物
の分析方法。
げる微生物の分析方法である： （１）微生物を含む試料を、アルギン酸塩を含有する泳
動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動することを特徴
とする、微生物の分析方法。 （２）微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍光抗体
で処理し、これをキャピラリー電気泳動に供して、蛍光
抗体で標識された微生物を蛍光検出することを特徴とす
る、微生物の分析方法。 （３）アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いてキャ
ピラリー電気泳動することを特徴とする、（２）記載の
微生物の分析方法。 （４）微生物が、サルモネラに属する細菌であることを
特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の微生物
の分析方法。
【００１２】さらに本発明は下記（５）〜（７）に掲げ
る微生物の分析装置である： （５）キャピラリー電気泳動を用いて微生物を分析する
方法であって、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含
む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離する
キャピラリー、および(iii)分離された微生物を検出す
るための検出手段、を備えることを特徴とする微生物の
分析装置。 （６）検出手段として蛍光検出器を備えることを特徴と
する（５）記載の微生物の分析装置。 （７）検出する微生物がサルモネラに属する細菌である
ことを特徴とする（５）または（６）に記載の微生物の
分析装置。
る微生物の分析装置である： （５）キャピラリー電気泳動を用いて微生物を分析する
方法であって、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含
む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離する
キャピラリー、および(iii)分離された微生物を検出す
るための検出手段、を備えることを特徴とする微生物の
分析装置。 （６）検出手段として蛍光検出器を備えることを特徴と
する（５）記載の微生物の分析装置。 （７）検出する微生物がサルモネラに属する細菌である
ことを特徴とする（５）または（６）に記載の微生物の
分析装置。
【００１３】
【発明の実施の形態】（１）微生物の分析方法 本発明の微生物の分析方法は、第１に、微生物の分離に
アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いたキャピラリ
ー電気泳動法を利用することを特徴とする。また本発明
の微生物の分析方法は、第２に、微生物をキャピラリー
電気泳動法によって分離し蛍光的に検出すること、具体
的には目的微生物を蛍光抗体で標識することによって蛍
光的に検出することを特徴とするものである。
アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いたキャピラリ
ー電気泳動法を利用することを特徴とする。また本発明
の微生物の分析方法は、第２に、微生物をキャピラリー
電気泳動法によって分離し蛍光的に検出すること、具体
的には目的微生物を蛍光抗体で標識することによって蛍
光的に検出することを特徴とするものである。
【００１４】ここで用いられるキャピラリー電気泳動法
は、泳動緩衝液としてアルギン酸塩を配合した緩衝液を
使用する以外は、特に制限されることなく、従来公知の
方法を任意に使用することができる。また、泳動緩衝液
としてアルギン酸塩を配合した緩衝液を使用する限り、
マイクロチップ電気泳動技術も含めて将来開発されるキ
ャピラリー電気泳動法も制限されることなく使用でき
る。
は、泳動緩衝液としてアルギン酸塩を配合した緩衝液を
使用する以外は、特に制限されることなく、従来公知の
方法を任意に使用することができる。また、泳動緩衝液
としてアルギン酸塩を配合した緩衝液を使用する限り、
マイクロチップ電気泳動技術も含めて将来開発されるキ
ャピラリー電気泳動法も制限されることなく使用でき
る。
【００１５】泳動緩衝液中に含まれるアルギン酸塩の割
合は特に制限されないが、通常０．００１〜１重量％、
好ましくは０．００１〜０．１重量％、より好ましくは
０．００１〜０．０１重量％を挙げることができる。ア
ルギン酸の塩としては、具体的にナトリウムやカリウム
などのアルカリ金属塩、マグネシウムやカルシウムなど
のアルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩を挙げる
ことができるが、好ましくはアルギン酸ナトリウムであ
る。また、泳動緩衝液としては、ｐＨ３〜１０、好まし
くはｐＨ７〜９の範囲に緩衝能を有するものであればよ
く、具体的にはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、またはシ
ュウ酸緩衝液を例示することができる。好ましくはトリ
ス−ホウ酸−EDTA緩衝液である。また、これらの泳動緩
衝液の濃度としては、通常１〜１０００ｍＭ、好ましく
は２〜２００ｍＭの範囲を挙げることができる。
合は特に制限されないが、通常０．００１〜１重量％、
好ましくは０．００１〜０．１重量％、より好ましくは
０．００１〜０．０１重量％を挙げることができる。ア
ルギン酸の塩としては、具体的にナトリウムやカリウム
などのアルカリ金属塩、マグネシウムやカルシウムなど
のアルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩を挙げる
ことができるが、好ましくはアルギン酸ナトリウムであ
る。また、泳動緩衝液としては、ｐＨ３〜１０、好まし
くはｐＨ７〜９の範囲に緩衝能を有するものであればよ
く、具体的にはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、またはシ
ュウ酸緩衝液を例示することができる。好ましくはトリ
ス−ホウ酸−EDTA緩衝液である。また、これらの泳動緩
衝液の濃度としては、通常１〜１０００ｍＭ、好ましく
は２〜２００ｍＭの範囲を挙げることができる。
【００１６】図１に本発明で利用できるキャピラリー電
気泳動システムの基本的構成を一例として示す。ここで
中空キャピラリー１０の両端は、上記泳動緩衝液を入れ
た水槽１１及び１２にそれぞれ浸され、キャピラリー内
は当該泳動緩衝液で満たされている。水槽１１及び１２
には、それぞれ電極（１３，１４）が付けられており、
これらは高電圧サプライなどのように電源１５を介して
連結されている。
気泳動システムの基本的構成を一例として示す。ここで
中空キャピラリー１０の両端は、上記泳動緩衝液を入れ
た水槽１１及び１２にそれぞれ浸され、キャピラリー内
は当該泳動緩衝液で満たされている。水槽１１及び１２
には、それぞれ電極（１３，１４）が付けられており、
これらは高電圧サプライなどのように電源１５を介して
連結されている。
【００１７】分析対象である微生物を含む試料は、キャ
ピラリーの一端（入口側、１０ａ）から注入され、次い
で電源１５が作動されることにより、泳動領域でキャピ
ラリー内に電位勾配が発生する。キャピラリー内壁に表
面電荷が存在する場合、この電位勾配によりキャピラリ
ー内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それ
は陰極方向への流れとなる。また、キャピラリー内に注
入された微生物は、上記発生した電位勾配に応答して、
該微生物が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極
方向へ移動する。結果としてキャピラリー内での該微生
物の泳動方向及び速度は、上記電気浸透流速度と該微生
物の移動度によって決まり、キャピラリーの反対端（出
口側、１０ｂ）の近くに備えられた検出器１８によって
検出される。尚、検出手段として光学的検出方法を利用
する場合は、キャピラリーそのものがフローセル１６と
なり、キャピラリー壁を通して直接光学的に検出され
る。
ピラリーの一端（入口側、１０ａ）から注入され、次い
で電源１５が作動されることにより、泳動領域でキャピ
ラリー内に電位勾配が発生する。キャピラリー内壁に表
面電荷が存在する場合、この電位勾配によりキャピラリ
ー内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それ
は陰極方向への流れとなる。また、キャピラリー内に注
入された微生物は、上記発生した電位勾配に応答して、
該微生物が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極
方向へ移動する。結果としてキャピラリー内での該微生
物の泳動方向及び速度は、上記電気浸透流速度と該微生
物の移動度によって決まり、キャピラリーの反対端（出
口側、１０ｂ）の近くに備えられた検出器１８によって
検出される。尚、検出手段として光学的検出方法を利用
する場合は、キャピラリーそのものがフローセル１６と
なり、キャピラリー壁を通して直接光学的に検出され
る。
【００１８】キャピラリー内への試料の注入方法は、特
に制限されず、従来使用される重力法、加圧法、減圧法
及び電気泳動注入法のいずれをも使用することができ
る。注入量も特に制限されないが、通常０．１〜１００
ｎｌ、好ましくは１〜１００ｎｌ、より好ましくは１〜
１０ｎｌを例示することができる。
に制限されず、従来使用される重力法、加圧法、減圧法
及び電気泳動注入法のいずれをも使用することができ
る。注入量も特に制限されないが、通常０．１〜１００
ｎｌ、好ましくは１〜１００ｎｌ、より好ましくは１〜
１０ｎｌを例示することができる。
【００１９】尚、上記で例示した一対の電極（１３、１
４）及び電源１５は、キャピラリー内に注入された微生
物がキャピラリー内の泳動緩衝液中を泳動するのに必要
な強さの電位勾配を、キャピラリー中の泳動緩衝液に対
して印加するための手段であり、かかる目的が達成でき
るものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）
に何ら限定されることなく任意の手段（電位勾配を印加
する手段）を使用することができる。
４）及び電源１５は、キャピラリー内に注入された微生
物がキャピラリー内の泳動緩衝液中を泳動するのに必要
な強さの電位勾配を、キャピラリー中の泳動緩衝液に対
して印加するための手段であり、かかる目的が達成でき
るものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）
に何ら限定されることなく任意の手段（電位勾配を印加
する手段）を使用することができる。
【００２０】上記のように印加手段として電源および電
極を使用する場合、電極はそれぞれの泳動緩衝液を満た
した対極の水槽中に挿入されており、電源が入れられる
と、陽極（アノード）と陰極（カソード）との間に電位
勾配が形成され、それによってキャピラリーに注入され
た微生物は、それが有する電荷と電気浸透流速度のバラ
ンスによりしかるべき電極方向へ移動する。一般的に
は、微生物の表面電荷は負であることが多いので微生物
は陽極方向に移動する性質をもつが、上記電気浸透流速
度がこの微生物泳動速度より大きい場合が多いので、微
生物は結果として陰極へと移動する。
極を使用する場合、電極はそれぞれの泳動緩衝液を満た
した対極の水槽中に挿入されており、電源が入れられる
と、陽極（アノード）と陰極（カソード）との間に電位
勾配が形成され、それによってキャピラリーに注入され
た微生物は、それが有する電荷と電気浸透流速度のバラ
ンスによりしかるべき電極方向へ移動する。一般的に
は、微生物の表面電荷は負であることが多いので微生物
は陽極方向に移動する性質をもつが、上記電気浸透流速
度がこの微生物泳動速度より大きい場合が多いので、微
生物は結果として陰極へと移動する。
【００２１】印加手段が電極を含む場合、電極間にかけ
られる電圧としては、キャピラリー長さに対して、一般
に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋ
Ｖ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／
ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを挙げることができる。
られる電圧としては、キャピラリー長さに対して、一般
に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋ
Ｖ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／
ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを挙げることができる。
【００２２】キャピラリーとしては、内径１〜１５０μ
ｍ、長さ０.１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１
００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空キャピラリーを挙げ
ることができる。その材質としては特に制限されず、ガ
ラス製やテフロン（登録商標）製などを任意に例示する
ことができるが、好ましくはフューズドシリカ製であ
る。
ｍ、長さ０.１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１
００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空キャピラリーを挙げ
ることができる。その材質としては特に制限されず、ガ
ラス製やテフロン（登録商標）製などを任意に例示する
ことができるが、好ましくはフューズドシリカ製であ
る。
【００２３】キャピラリー内で分離された微生物を検出
する手段としては、分光学的、電気化学的、重量分析的
方法のいずれもが使用できるが、好ましくはＵＶ−可視
検出、蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法
が挙げられる。中でも検出の特異性と感度に優れた蛍光
検出法が好ましく、特により高感度検出が可能なレーザ
ー誘導蛍光検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検
出は、免疫反応（抗原抗体反応）、酵素反応、及び核酸
相補鎖形成反応、等を最終信号検出手段として利用する
ことができ、これらの反応を目的微生物に応じて適宜組
み合わせることで、目的微生物をより特異的且つ高感度
に検出することができる。これらの方法の中でも免疫反
応は、微生物試料に特別な前処理をする必要がなく、ま
た特異性に優れている点で、好ましい方法の１つであ
る。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識
抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵
素抗体ともいう）等を用いて目的の微生物を蛍光や酵素
等で標識する方法を挙げることができる。
する手段としては、分光学的、電気化学的、重量分析的
方法のいずれもが使用できるが、好ましくはＵＶ−可視
検出、蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法
が挙げられる。中でも検出の特異性と感度に優れた蛍光
検出法が好ましく、特により高感度検出が可能なレーザ
ー誘導蛍光検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検
出は、免疫反応（抗原抗体反応）、酵素反応、及び核酸
相補鎖形成反応、等を最終信号検出手段として利用する
ことができ、これらの反応を目的微生物に応じて適宜組
み合わせることで、目的微生物をより特異的且つ高感度
に検出することができる。これらの方法の中でも免疫反
応は、微生物試料に特別な前処理をする必要がなく、ま
た特異性に優れている点で、好ましい方法の１つであ
る。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識
抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵
素抗体ともいう）等を用いて目的の微生物を蛍光や酵素
等で標識する方法を挙げることができる。
【００２４】例えば、微生物を標識するために使用され
る蛍光試薬としては、特に制限されることなく従来公知
若しくは将来知られうるものを広く挙げることができる
が、具体的にはBODIPY FL（4,4-difluoro-5,7-dimethyl
-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic Acid, S
uccinimidyl Ester）（励起波長503nm、蛍光波長512n
m、Molecular Probe社製）、SYTO9（励起波長480nm、蛍
光波長500nm、MolecularProbe社製）、FITC（Fluoresce
in Isothiocyanate)（励起波長490nm、蛍光波長520nm、
Dojin社製）、TexasRed（励起波長596nm、蛍光波長620n
m、Molecular Probe社製）、TRITC（Tetramethylrhodam
ine Isothiocyanate）（励起波長541nm、蛍光波長572n
m、Research Organics社製）、Cy3（N,N'-diethyl-indo
dicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid）（励起波長552
nm、蛍光波長565nm、Amersham Pharmacia Biotech社
製）、Cy5（N,N'-di-carboxypentyl-indodicarbocyanin
e-5,5'-disulfonic acid）(励起波長650nm、蛍光波長66
7nm、Amersham Pharmacia Biotech社製）、Acridine Or
ange（励起波長490nm、蛍光波長530nm、640nm、Wako社
製）、Ethidum Bromide（励起波長545nm、蛍光波長605n
m、Dojin社製）、Propidumiodide（励起波長530nm、蛍
光波長615nm、Dojin社製）、Calcein（励起波長495nm、
蛍光波長520nm、Dojin社製）、BCECF-AM（2',7'-Bis-(2
-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein Acetox
ymethyl Ester）（励起波長500nm、蛍光波長530nm、Mol
ecular Probe社製）、Evans blue（励起波長550nm、蛍
光波長610nm、Wako社製）、Lucifer Yellow CH（励起波
長430nm、蛍光波長535nm、ICN Pharmaceutical社製）、
Dil（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocar
bocyanine perchlorate）（励起波長550nm、蛍光波長56
5nm、Molecular Probe社製）、Dio（励起波長484nm、蛍
光波長501nm、Molecular Probe社製）、DioC6(3)（3,3'
-Dihexyloxacarbocyanine Iodide）（励起波長480nm、
蛍光波長501nm、Lambda Probe & Diagnostics社製）、R
hodamine123（励起波長500nm、蛍光波長540nm、Molecul
ar Probe社製）、Fluo-3（励起波長506nm、蛍光波長526
nm、Dojin社製）、Calcium Green（励起波長506nm、蛍
光波長526nm、Molecular Probe社製）等を例示すること
ができる。
る蛍光試薬としては、特に制限されることなく従来公知
若しくは将来知られうるものを広く挙げることができる
が、具体的にはBODIPY FL（4,4-difluoro-5,7-dimethyl
-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic Acid, S
uccinimidyl Ester）（励起波長503nm、蛍光波長512n
m、Molecular Probe社製）、SYTO9（励起波長480nm、蛍
光波長500nm、MolecularProbe社製）、FITC（Fluoresce
in Isothiocyanate)（励起波長490nm、蛍光波長520nm、
Dojin社製）、TexasRed（励起波長596nm、蛍光波長620n
m、Molecular Probe社製）、TRITC（Tetramethylrhodam
ine Isothiocyanate）（励起波長541nm、蛍光波長572n
m、Research Organics社製）、Cy3（N,N'-diethyl-indo
dicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid）（励起波長552
nm、蛍光波長565nm、Amersham Pharmacia Biotech社
製）、Cy5（N,N'-di-carboxypentyl-indodicarbocyanin
e-5,5'-disulfonic acid）(励起波長650nm、蛍光波長66
7nm、Amersham Pharmacia Biotech社製）、Acridine Or
ange（励起波長490nm、蛍光波長530nm、640nm、Wako社
製）、Ethidum Bromide（励起波長545nm、蛍光波長605n
m、Dojin社製）、Propidumiodide（励起波長530nm、蛍
光波長615nm、Dojin社製）、Calcein（励起波長495nm、
蛍光波長520nm、Dojin社製）、BCECF-AM（2',7'-Bis-(2
-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein Acetox
ymethyl Ester）（励起波長500nm、蛍光波長530nm、Mol
ecular Probe社製）、Evans blue（励起波長550nm、蛍
光波長610nm、Wako社製）、Lucifer Yellow CH（励起波
長430nm、蛍光波長535nm、ICN Pharmaceutical社製）、
Dil（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocar
bocyanine perchlorate）（励起波長550nm、蛍光波長56
5nm、Molecular Probe社製）、Dio（励起波長484nm、蛍
光波長501nm、Molecular Probe社製）、DioC6(3)（3,3'
-Dihexyloxacarbocyanine Iodide）（励起波長480nm、
蛍光波長501nm、Lambda Probe & Diagnostics社製）、R
hodamine123（励起波長500nm、蛍光波長540nm、Molecul
ar Probe社製）、Fluo-3（励起波長506nm、蛍光波長526
nm、Dojin社製）、Calcium Green（励起波長506nm、蛍
光波長526nm、Molecular Probe社製）等を例示すること
ができる。
【００２５】本発明の方法が対象とする微生物には、細
菌類、真菌類、クラミジア、ウイルス、リケッチアが包
含される。好ましくは細菌類である。例えば細菌類とし
てはブドウ球菌、８連球菌、スピリルム、連鎖球菌、球
桿菌、桿菌、スピロヘータ、４連球菌、コンマ型球菌及
び放線菌などが挙げられる。具体的には、ロドスピリル
ム（Rhodospirillaceae）、クロマチア（Chromatiacea
e）、クロロビウム（Chlorobiaceae）、ミクソコッカス
（Myxococcaceae）、アルカンギウム（Archangi acea
e）、シストバクター（Cystobacteraceae）、ポリアン
ギウム（Polyangiaceae）、サイトファーガ（Cytophaga
ceae）、ベギアトア（Beggiatoaceae）、シモンシエラ
（Simonsiellaceae）、リューコトリックス（Leucotric
haceae）、アクロマチウム（Achromatiaceae）、ペロネ
ーマ（Pelonemataceae）、スピロヘータ（Spirochaetac
eae）、スピリルム（Spirillaceae）、シュードモナス
（Pseudomonadaceae）、アゾトバクター（Azotobactera
ceae）、リゾビウム（Rhizobiaceae）、メチロモナス
（Methylomonadaceae）、ハロバクテリウム（Halobacte
riaceae）、腸内細菌（Enterobacteriaceae）、ヴィブ
リオ（Vibrionaceae）、バクテロイデス（Bacteroidace
ae）、ナイセリア（Neisseriaceae）、ヴェイヨネラ（V
eillonellaceae）、アンモニアまたは亜硝酸酸化細菌
（Organisms oxidizing ammonia or nitrite）、硫黄代
謝細菌（Organisms metabolizing sulfer and sulfer c
ompounds）、酸化鉄および／または酸化マンガン沈着細
菌（Organisms depositing iron and/or manganese oxi
des）、シデロカプサ（Siderocapsaceae）、メタノバク
テリウム（Methanobacteriaceae）、好気性および／ま
たは通性嫌気性ミクロコッカス（Aerobic and/or facul
tatively anaerobic Micrococcaceae）、ストレプトコ
ッカス（Streptococcaceae）、嫌気性ペプトコッカス
（Anaerobic Peptococcaceae）、バチルス（Bacillacea
e）、乳酸桿菌（Lactobacillaceae）、コリネフォルム
細菌（Coryneform group of bacteria）、プロピオン酸
菌（Propionibacteriaceae）、アクチノミセス（Actino
mycetaceae）、マイコバクテリウム（Mycobacteriacea
e）、フランキア（Frankiaceae）、アクチノプラーネス
（Actinoplanaceae）、デルマトフィルス（Dermatophil
aceae）、ノカルディア（Nocardiaceae）、ストレプト
ミセス（Streptomycetaceae）、ミクロモノスポラ（Mic
romonosporaceae）、リケッチア (Rickettsiaceae）、
バルトネラ（Bartonellaceae）、アナプラズマ（Anapla
smataceae）、クラミジア（Chlamydiaceae）、マイコプ
ラズマ（Mycoplasmataceae）、およびアコレプラズマ
（Acholeplasmataceae）などを挙げることができる。好
ましくはグラム陰性菌に属する細菌類であり、中でも腸
内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する大腸菌、赤痢
菌、サルモネラ及びYersinia属に属する細菌（ペスト
菌、仮性結核菌等）等が好適に挙げられる。より好まし
くはサルモネラである。
菌類、真菌類、クラミジア、ウイルス、リケッチアが包
含される。好ましくは細菌類である。例えば細菌類とし
てはブドウ球菌、８連球菌、スピリルム、連鎖球菌、球
桿菌、桿菌、スピロヘータ、４連球菌、コンマ型球菌及
び放線菌などが挙げられる。具体的には、ロドスピリル
ム（Rhodospirillaceae）、クロマチア（Chromatiacea
e）、クロロビウム（Chlorobiaceae）、ミクソコッカス
（Myxococcaceae）、アルカンギウム（Archangi acea
e）、シストバクター（Cystobacteraceae）、ポリアン
ギウム（Polyangiaceae）、サイトファーガ（Cytophaga
ceae）、ベギアトア（Beggiatoaceae）、シモンシエラ
（Simonsiellaceae）、リューコトリックス（Leucotric
haceae）、アクロマチウム（Achromatiaceae）、ペロネ
ーマ（Pelonemataceae）、スピロヘータ（Spirochaetac
eae）、スピリルム（Spirillaceae）、シュードモナス
（Pseudomonadaceae）、アゾトバクター（Azotobactera
ceae）、リゾビウム（Rhizobiaceae）、メチロモナス
（Methylomonadaceae）、ハロバクテリウム（Halobacte
riaceae）、腸内細菌（Enterobacteriaceae）、ヴィブ
リオ（Vibrionaceae）、バクテロイデス（Bacteroidace
ae）、ナイセリア（Neisseriaceae）、ヴェイヨネラ（V
eillonellaceae）、アンモニアまたは亜硝酸酸化細菌
（Organisms oxidizing ammonia or nitrite）、硫黄代
謝細菌（Organisms metabolizing sulfer and sulfer c
ompounds）、酸化鉄および／または酸化マンガン沈着細
菌（Organisms depositing iron and/or manganese oxi
des）、シデロカプサ（Siderocapsaceae）、メタノバク
テリウム（Methanobacteriaceae）、好気性および／ま
たは通性嫌気性ミクロコッカス（Aerobic and/or facul
tatively anaerobic Micrococcaceae）、ストレプトコ
ッカス（Streptococcaceae）、嫌気性ペプトコッカス
（Anaerobic Peptococcaceae）、バチルス（Bacillacea
e）、乳酸桿菌（Lactobacillaceae）、コリネフォルム
細菌（Coryneform group of bacteria）、プロピオン酸
菌（Propionibacteriaceae）、アクチノミセス（Actino
mycetaceae）、マイコバクテリウム（Mycobacteriacea
e）、フランキア（Frankiaceae）、アクチノプラーネス
（Actinoplanaceae）、デルマトフィルス（Dermatophil
aceae）、ノカルディア（Nocardiaceae）、ストレプト
ミセス（Streptomycetaceae）、ミクロモノスポラ（Mic
romonosporaceae）、リケッチア (Rickettsiaceae）、
バルトネラ（Bartonellaceae）、アナプラズマ（Anapla
smataceae）、クラミジア（Chlamydiaceae）、マイコプ
ラズマ（Mycoplasmataceae）、およびアコレプラズマ
（Acholeplasmataceae）などを挙げることができる。好
ましくはグラム陰性菌に属する細菌類であり、中でも腸
内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する大腸菌、赤痢
菌、サルモネラ及びYersinia属に属する細菌（ペスト
菌、仮性結核菌等）等が好適に挙げられる。より好まし
くはサルモネラである。
【００２６】上記の各種の検出対象となる微生物を、蛍
光若しくは酵素等で標識化するため使用される抗体とし
ては、上記微生物（細菌、真菌、クラミジア、ウイル
ス、リケッチャ）に特異的に結合する抗体（以下、抗体
にはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が包含
される）を任意に例示することができる。例えば、従来
公知の細菌に対する抗体としては、ヒト型結核菌（Myco
bacterium tuberculosis）抗体、抗トリ型結核菌（Myco
bacterium avium）抗体、抗肺炎連鎖球菌（Strptococcu
s pneumoniae）抗体、抗Streptococcus A group抗体、
抗Streptococcus Bgroup抗体，抗Streptococcus D grou
p抗体，抗虫歯レンサ球菌（Streptococcusmutans）抗
体，抗黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureuse）抗
体，抗表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）
抗体，抗大腸菌（Esherichia coli）抗体，抗腸管出血
性病原性大腸菌（Echerichia coli O-157:H7）抗体，抗
サルモネラ（Salmonella sp.）抗体，抗赤痢（Shigella
sp.）抗体，抗カンピロバクター（Campylobacter s
p.）抗体，抗ビブリオ（Vibrio cholerae, paraheamoli
ticase）抗体，抗クレブシエラ（Klebsiella sp.）抗
体，抗ブロテウス（Proteus sp.）抗体、抗レイジョネ
ラ（Legionella pneumophila）抗体，抗ヘリコバクター
（Hellcobacter pylori）抗体，抗緑膿菌（Pseudomonas
aeruginosa）抗体，抗ヘモフィリス（Heamophilisinfl
enzae, Heamophilis sp.）抗体，抗パスツレラ菌（Past
eurella sp.）抗体，抗髄膜炎菌（Neisseria meningiti
dis group A,B,C,X,Y,Z,W,E）抗体，抗リン菌（Neisser
ia gonorrhea）抗体，抗リステリア菌（Listeria sp.）
抗体，抗ボツリヌス菌（Clostridium botulium）抗体，
抗ディフィシル菌（Clostridium difficile）抗体等が
例示される。真菌類に対する従来公知の抗体としては、
抗カンジダ（Candida albicanse, Candida tropicals,
Candida stllatoidea）抗体が例示できる。また、細菌
全種に共通する抗原に対する抗体も使用でき、これらの
ものとしては抗細菌細胞壁ペプチドグリカン（Bacteria
l peptidoglycan）抗体、抗グラム陽性細菌細胞壁リポ
ティコ酸（BacterialLipoteichoicacid）抗体などが知
られている。また腸管内に生息する細菌群の分別に有用
な抗体としては抗腸内細菌（Enterobacteriaceae α、
β）抗体が、また真菌に対する共通抗体しては抗マンナ
ン、抗ガラクトマンナン、１−３β−Ｄグルカンなどが
知られている。
光若しくは酵素等で標識化するため使用される抗体とし
ては、上記微生物（細菌、真菌、クラミジア、ウイル
ス、リケッチャ）に特異的に結合する抗体（以下、抗体
にはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が包含
される）を任意に例示することができる。例えば、従来
公知の細菌に対する抗体としては、ヒト型結核菌（Myco
bacterium tuberculosis）抗体、抗トリ型結核菌（Myco
bacterium avium）抗体、抗肺炎連鎖球菌（Strptococcu
s pneumoniae）抗体、抗Streptococcus A group抗体、
抗Streptococcus Bgroup抗体，抗Streptococcus D grou
p抗体，抗虫歯レンサ球菌（Streptococcusmutans）抗
体，抗黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureuse）抗
体，抗表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）
抗体，抗大腸菌（Esherichia coli）抗体，抗腸管出血
性病原性大腸菌（Echerichia coli O-157:H7）抗体，抗
サルモネラ（Salmonella sp.）抗体，抗赤痢（Shigella
sp.）抗体，抗カンピロバクター（Campylobacter s
p.）抗体，抗ビブリオ（Vibrio cholerae, paraheamoli
ticase）抗体，抗クレブシエラ（Klebsiella sp.）抗
体，抗ブロテウス（Proteus sp.）抗体、抗レイジョネ
ラ（Legionella pneumophila）抗体，抗ヘリコバクター
（Hellcobacter pylori）抗体，抗緑膿菌（Pseudomonas
aeruginosa）抗体，抗ヘモフィリス（Heamophilisinfl
enzae, Heamophilis sp.）抗体，抗パスツレラ菌（Past
eurella sp.）抗体，抗髄膜炎菌（Neisseria meningiti
dis group A,B,C,X,Y,Z,W,E）抗体，抗リン菌（Neisser
ia gonorrhea）抗体，抗リステリア菌（Listeria sp.）
抗体，抗ボツリヌス菌（Clostridium botulium）抗体，
抗ディフィシル菌（Clostridium difficile）抗体等が
例示される。真菌類に対する従来公知の抗体としては、
抗カンジダ（Candida albicanse, Candida tropicals,
Candida stllatoidea）抗体が例示できる。また、細菌
全種に共通する抗原に対する抗体も使用でき、これらの
ものとしては抗細菌細胞壁ペプチドグリカン（Bacteria
l peptidoglycan）抗体、抗グラム陽性細菌細胞壁リポ
ティコ酸（BacterialLipoteichoicacid）抗体などが知
られている。また腸管内に生息する細菌群の分別に有用
な抗体としては抗腸内細菌（Enterobacteriaceae α、
β）抗体が、また真菌に対する共通抗体しては抗マンナ
ン、抗ガラクトマンナン、１−３β−Ｄグルカンなどが
知られている。
【００２７】本発明の方法が分析対象とする試料は、微
生物を含有することが疑われる試料であり、医療分野で
は各種（疑）感染患者から採取される血液、尿、糞便、
喀痰、髄液、膿、唾液などの生体試料を、また食品分野
では食肉、卵、野菜、魚、ミルクなどの原材料や種々の
加工品を例示することができる。
生物を含有することが疑われる試料であり、医療分野で
は各種（疑）感染患者から採取される血液、尿、糞便、
喀痰、髄液、膿、唾液などの生体試料を、また食品分野
では食肉、卵、野菜、魚、ミルクなどの原材料や種々の
加工品を例示することができる。
【００２８】（２）微生物の分析装置 本発明の微生物の分析装置はキャピラリー電気泳動を原
理とするものであり、具体的には、(i)アルギン酸塩を
含む泳動緩衝液を含む一対の水槽、(ii)該泳動緩衝液に
注入された微生物を分離するキャピラリー、(iii)キャ
ピラリー中の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、(i
v)キャピラリー内で分離された微生物を検出するための
検出手段、を備えることを特徴とする。
理とするものであり、具体的には、(i)アルギン酸塩を
含む泳動緩衝液を含む一対の水槽、(ii)該泳動緩衝液に
注入された微生物を分離するキャピラリー、(iii)キャ
ピラリー中の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、(i
v)キャピラリー内で分離された微生物を検出するための
検出手段、を備えることを特徴とする。
【００２９】図１は、本発明にかかるキャピラリー電気
泳動による微生物の分析装置の概略構成を示す一例であ
る。かかる図面を利用して本発明の分析装置をより詳細
に説明すると、本発明の分析装置１は、アルギン酸塩を
含む泳動緩衝液を含む一対の水槽（陽極側水槽（１
１）、陰極側水槽（１２））、注入された微生物を分離
するためのキャピラリー１０、キャピラリー中の泳動緩
衝液に電位勾配を印加する手段としての一対の電極（陽
極側（１３）、陰極側（１４））及び電源１５、並び
に、キャピラリー内で分離された微生物を検出するため
の検出手段として例えばレーザー光源等の光源１７及び
該レーザー照射によって生じる蛍光を検出する検出器１
８を含むように構成されている。キャピラリー１０の両
端は泳動緩衝液を入れた水槽１１及び１２にそれぞれ浸
され、キャピラリー内は当該泳動緩衝液で満たされてい
る。水槽１１及び１２には、それぞれ電極１３及び１４
が付けられており、これらには導線を介して電源１５が
接続されている。なお、検出手段はキャピラリーの出口
側部分（１０ｂ）に設けられる。当該キャピラリー部分
は外壁が剥がされることによってキャピラリーそのもの
が検出用セル（フローセル）１６として形成され、キャ
ピラリー壁を通して直接光学的に検出されるようになっ
ている。なお、水槽には、電圧をかける際に発生する熱
によるキャピラリー内の水溶液の水温の上昇を防ぐため
にその外周に冷却手段が設けられていてもよい（図示せ
ず）。
泳動による微生物の分析装置の概略構成を示す一例であ
る。かかる図面を利用して本発明の分析装置をより詳細
に説明すると、本発明の分析装置１は、アルギン酸塩を
含む泳動緩衝液を含む一対の水槽（陽極側水槽（１
１）、陰極側水槽（１２））、注入された微生物を分離
するためのキャピラリー１０、キャピラリー中の泳動緩
衝液に電位勾配を印加する手段としての一対の電極（陽
極側（１３）、陰極側（１４））及び電源１５、並び
に、キャピラリー内で分離された微生物を検出するため
の検出手段として例えばレーザー光源等の光源１７及び
該レーザー照射によって生じる蛍光を検出する検出器１
８を含むように構成されている。キャピラリー１０の両
端は泳動緩衝液を入れた水槽１１及び１２にそれぞれ浸
され、キャピラリー内は当該泳動緩衝液で満たされてい
る。水槽１１及び１２には、それぞれ電極１３及び１４
が付けられており、これらには導線を介して電源１５が
接続されている。なお、検出手段はキャピラリーの出口
側部分（１０ｂ）に設けられる。当該キャピラリー部分
は外壁が剥がされることによってキャピラリーそのもの
が検出用セル（フローセル）１６として形成され、キャ
ピラリー壁を通して直接光学的に検出されるようになっ
ている。なお、水槽には、電圧をかける際に発生する熱
によるキャピラリー内の水溶液の水温の上昇を防ぐため
にその外周に冷却手段が設けられていてもよい（図示せ
ず）。
【００３０】かかる分析装置によれば、キャピラリー１
０の一端（入口側、１０ａ）に分析対象である微生物を
含む試料を注入した後、電源１５を作動させて電極１１
と電極１２との間に電圧をかけることにより、泳動領域
内（キャピラリー内）の液全体は電気浸透現象により陰
極方向への流れを発生する。一方、微生物は、それが有
する電荷とは逆の極性を有する電極側（水槽）へと移動
しようとする。例えば表面電荷が負である微生物は陽極
側へ移動しようとする。かかる移動は上記電気浸透流に
比べて十分小さい場合が多く、この泳動過程よりキャピ
ラリー内で分離された微生物は、電気浸透流に流される
形でキャピラリーの出口側（１０ｂ）の検出部でＵＶ−
可視検出器又は蛍光検出器などによって光学的に検出す
ることができる。分析対象の微生物が蛍光抗体などで蛍
光標識されている場合は、検出器１８としてレーザー誘
導蛍光検出器を使用することによって、光源１７からレ
ーザー照射されることによって微生物が発生する蛍光を
検出することができる。
０の一端（入口側、１０ａ）に分析対象である微生物を
含む試料を注入した後、電源１５を作動させて電極１１
と電極１２との間に電圧をかけることにより、泳動領域
内（キャピラリー内）の液全体は電気浸透現象により陰
極方向への流れを発生する。一方、微生物は、それが有
する電荷とは逆の極性を有する電極側（水槽）へと移動
しようとする。例えば表面電荷が負である微生物は陽極
側へ移動しようとする。かかる移動は上記電気浸透流に
比べて十分小さい場合が多く、この泳動過程よりキャピ
ラリー内で分離された微生物は、電気浸透流に流される
形でキャピラリーの出口側（１０ｂ）の検出部でＵＶ−
可視検出器又は蛍光検出器などによって光学的に検出す
ることができる。分析対象の微生物が蛍光抗体などで蛍
光標識されている場合は、検出器１８としてレーザー誘
導蛍光検出器を使用することによって、光源１７からレ
ーザー照射されることによって微生物が発生する蛍光を
検出することができる。
【００３１】なお、当該分析装置に用いられるアルギン
酸塩を含む泳動緩衝液、キャピラリー、キャピラリーの
泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、分析対象となる
微生物、及び検出手段については、本発明の微生物分析
方法に関して前述するものを広く挙げることができる。
酸塩を含む泳動緩衝液、キャピラリー、キャピラリーの
泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、分析対象となる
微生物、及び検出手段については、本発明の微生物分析
方法に関して前述するものを広く挙げることができる。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例によって更に詳細に説
明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されるもので
はない。実施例１ S .enteritidis と S.typhimuriumの各々の斜面個体培養
物からそれぞれ１白金耳を取り、これらを常法に従って
調整したＥＥＭブイヨン培地（Enterbacteriaceae Enri
chment Mannitol (EEM)ブイヨン培地：4.35g/100ml）５
０ｍｌを含む200ｍｌ容の三角フラスコに別個に接種し
た後、３７℃で１６時間振盪培養した。振盪培養後、そ
れぞれの培養液から500μｌを1.5ｍｌ容量のサンプルチ
ューブにとり、これにLIVE/DEAD BacLight Bacterial V
iability Kits（Molecular Probes社製）のＳＹＴＯ９
溶液Ａを0.75μｌ添加し、暗所で室温１５分放置した
後、キャピラリー電気泳動に供した。尚、キャピラリー
は、泳動前に予め１Ｎ及び0.1Ｎの水酸化ナトリウムで
それぞれ２０psi、１分間、超純水で２０psi、３分間、
及び泳動緩衝液で２０psi、２分間洗浄しておいたもの
を使用した。かかるキャピラリーに上記サンプルを0.5p
siで５秒間注入し、下記条件下で電気泳動及び検出を行
った。
明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されるもので
はない。実施例１ S .enteritidis と S.typhimuriumの各々の斜面個体培養
物からそれぞれ１白金耳を取り、これらを常法に従って
調整したＥＥＭブイヨン培地（Enterbacteriaceae Enri
chment Mannitol (EEM)ブイヨン培地：4.35g/100ml）５
０ｍｌを含む200ｍｌ容の三角フラスコに別個に接種し
た後、３７℃で１６時間振盪培養した。振盪培養後、そ
れぞれの培養液から500μｌを1.5ｍｌ容量のサンプルチ
ューブにとり、これにLIVE/DEAD BacLight Bacterial V
iability Kits（Molecular Probes社製）のＳＹＴＯ９
溶液Ａを0.75μｌ添加し、暗所で室温１５分放置した
後、キャピラリー電気泳動に供した。尚、キャピラリー
は、泳動前に予め１Ｎ及び0.1Ｎの水酸化ナトリウムで
それぞれ２０psi、１分間、超純水で２０psi、３分間、
及び泳動緩衝液で２０psi、２分間洗浄しておいたもの
を使用した。かかるキャピラリーに上記サンプルを0.5p
siで５秒間注入し、下記条件下で電気泳動及び検出を行
った。
【００３３】 ＜キャピラリー電気泳動及び検出条件＞ 装置 ： P/ACE system MDQ (Beckman Coulter) キャピラリー： ヒューズドシリカ管（Beckman社製）、 内径75μｍ、総長31.2ｃｍ、有効長21ｃｍ 泳動条件 ： １０ｋＶ、２０分 泳動緩衝液 ： トリス10.8ｇ、ホウ酸5.5ｇ、0.5M EDTA（pH8）４ml、アル ギ ン酸ナトリウム0.1ｇ及び塩化ナトリウム２ｇを水に溶解 して 1000ｍｌに調整 検出条件 ： 励起波長488nm、アルゴンイオンレーザーモジュールのレー ザ ー光使用 蛍光波長530nm 検出器 ： MDQレーザ誘導蛍光（LIF）ディテクター。
【００３４】得られたキャピラリー電気泳動のフェログ
ラムを図２に示す。図２からわかるように、S.enteriti
dis及びS.typhimuriumの２株は、それぞれシャープなピ
ークとして良好に分離、検出できることが確認できた。
ラムを図２に示す。図２からわかるように、S.enteriti
dis及びS.typhimuriumの２株は、それぞれシャープなピ
ークとして良好に分離、検出できることが確認できた。
【００３５】次いで、S.enteritidisについて、その培
養液を100ｍＭのトリス−ホウ酸緩衝液により50倍、100
倍及び500倍と希釈して、それぞれについて上記条件下
でキャピラリー電気泳動を行った結果を図３に示す。検
出ピークを分画したものを蛍光顕微鏡で観察することに
よって測定したサルモネラ菌数に対して各蛍光ピーク面
積をプロットしたところ、図４に示すように、蛍光強度
はサルモネラ菌数と比例関係にあることが示された。こ
のことから、本発明に蛍光キャピラリー電気泳動法によ
って検体中のサルモネラ菌を定量的に測定することがで
きることが判明した。
養液を100ｍＭのトリス−ホウ酸緩衝液により50倍、100
倍及び500倍と希釈して、それぞれについて上記条件下
でキャピラリー電気泳動を行った結果を図３に示す。検
出ピークを分画したものを蛍光顕微鏡で観察することに
よって測定したサルモネラ菌数に対して各蛍光ピーク面
積をプロットしたところ、図４に示すように、蛍光強度
はサルモネラ菌数と比例関係にあることが示された。こ
のことから、本発明に蛍光キャピラリー電気泳動法によ
って検体中のサルモネラ菌を定量的に測定することがで
きることが判明した。
【００３６】実施例２ S .enteritidis の培養液から500μｌを1.5ｍｌ容量のサ
ンプルチューブにとり、これにFITC標識Anti-Salmonell
a抗体溶液（１mg/ml、Kirkegaard & Perry Lab.Inc.社
製）５μｌ加え、暗所で室温で１５分間放置した後、実
施例１と同じ条件下で蛍光キャピラリー電気泳動を行っ
た。また、100ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液500μｌにFITC
標識Anti-Salmonella抗体溶液５μｌを添加したもの
（コントロール）、並びにBrucella sp. strain KYM-1,
Stenotrophomonas sp. strain KYM2, Acinetobacter s
p. strain KYM3, Commanonas sp. strain KYM4, Aureob
acterium sp. strain KYM6, Cellulomonas sp. strain
KYM7, Acinetobacterium sp.strain KYM8, Escherichia
coli３種の合計１０種類の菌株をそれぞれ105個/mlと
なるように100ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液500μｌに溶解
し、FITC標識Anti-Salmonella抗体溶液５μｌを加え、
暗所で室温で１５分間放置したもの（比較標品）につい
ても同様にして蛍光キャピラリー電気泳動を行った。各
試料のフェログラムを図５に示す。緩衝液にFITC標識An
ti-Salmonella抗体だけを入れたコントロール標品は、
電気浸透流とほぼ同じ保持時間にフリーのFITC標識Anti
-Salmonella抗体のピークが検出され、他のピークは観
察されなかった。１０種類の細菌についても（比較標
品）、コントロールと同様にフリーのFITC標識Anti-Sal
monella抗体のピークのみが検出された。一方、S.enter
itidisは、フリーのFITC標識Anti-Salmonella抗体のピ
ーク以外に、BacLight SYTO9を入れた時と同じ移動度に
ピークが検出され、このピーク画分を収集し蛍光顕微鏡
により観察したところ、蛍光を発する菌体が確認でき
た。これにより、FITC標識Anti-Salmonella抗体が特異
的にS.enteritidisと結合し、検出されたことが判明し
た。
ンプルチューブにとり、これにFITC標識Anti-Salmonell
a抗体溶液（１mg/ml、Kirkegaard & Perry Lab.Inc.社
製）５μｌ加え、暗所で室温で１５分間放置した後、実
施例１と同じ条件下で蛍光キャピラリー電気泳動を行っ
た。また、100ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液500μｌにFITC
標識Anti-Salmonella抗体溶液５μｌを添加したもの
（コントロール）、並びにBrucella sp. strain KYM-1,
Stenotrophomonas sp. strain KYM2, Acinetobacter s
p. strain KYM3, Commanonas sp. strain KYM4, Aureob
acterium sp. strain KYM6, Cellulomonas sp. strain
KYM7, Acinetobacterium sp.strain KYM8, Escherichia
coli３種の合計１０種類の菌株をそれぞれ105個/mlと
なるように100ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液500μｌに溶解
し、FITC標識Anti-Salmonella抗体溶液５μｌを加え、
暗所で室温で１５分間放置したもの（比較標品）につい
ても同様にして蛍光キャピラリー電気泳動を行った。各
試料のフェログラムを図５に示す。緩衝液にFITC標識An
ti-Salmonella抗体だけを入れたコントロール標品は、
電気浸透流とほぼ同じ保持時間にフリーのFITC標識Anti
-Salmonella抗体のピークが検出され、他のピークは観
察されなかった。１０種類の細菌についても（比較標
品）、コントロールと同様にフリーのFITC標識Anti-Sal
monella抗体のピークのみが検出された。一方、S.enter
itidisは、フリーのFITC標識Anti-Salmonella抗体のピ
ーク以外に、BacLight SYTO9を入れた時と同じ移動度に
ピークが検出され、このピーク画分を収集し蛍光顕微鏡
により観察したところ、蛍光を発する菌体が確認でき
た。これにより、FITC標識Anti-Salmonella抗体が特異
的にS.enteritidisと結合し、検出されたことが判明し
た。
【００３７】
【発明の効果】本発明によれば、検体試料中の微生物を
短時間でかつ精度よく分析（分離、検出）できる方法並
びに装置を提供することができる。請求項１にかかるア
ルギン酸塩を配合した泳動緩衝液を用いたキャピラリー
電気泳動によれば、微生物を高性能に且つ再現性よく分
離することができる。かかる方法は特にサルモネラ等の
グラム陰性菌の分離に有用であり、この方法によればサ
ルモネラに属する菌種・菌株を個々に分離することが可
能となる。請求項２にかかる蛍光抗体を利用したキャピ
ラリー電気泳動法によれば、検体試料中に含まれる微生
物を特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作な
しに短時間に且つ容易にまた正確に検出できるため、高
い精度の微生物検査とモニタリングシステムの確立が可
能となる。請求項３にかかる分析方法によれば、試料中
に含まれる微生物を再現性よく高い分離能をもって分離
することができ、さらに蛍光検出手段としてレーザー誘
導蛍光検出器を利用することにより所望の微生物を高感
度且つ特異的に検出することができるので、試料を培養
などの増殖処理を施すことなく、微量の微生物を精度よ
く分離検出することができる。これらの本発明の方法は
定量性を有するため、試料中に存在する菌体数を判別測
定（定量分析）することも可能である。
短時間でかつ精度よく分析（分離、検出）できる方法並
びに装置を提供することができる。請求項１にかかるア
ルギン酸塩を配合した泳動緩衝液を用いたキャピラリー
電気泳動によれば、微生物を高性能に且つ再現性よく分
離することができる。かかる方法は特にサルモネラ等の
グラム陰性菌の分離に有用であり、この方法によればサ
ルモネラに属する菌種・菌株を個々に分離することが可
能となる。請求項２にかかる蛍光抗体を利用したキャピ
ラリー電気泳動法によれば、検体試料中に含まれる微生
物を特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作な
しに短時間に且つ容易にまた正確に検出できるため、高
い精度の微生物検査とモニタリングシステムの確立が可
能となる。請求項３にかかる分析方法によれば、試料中
に含まれる微生物を再現性よく高い分離能をもって分離
することができ、さらに蛍光検出手段としてレーザー誘
導蛍光検出器を利用することにより所望の微生物を高感
度且つ特異的に検出することができるので、試料を培養
などの増殖処理を施すことなく、微量の微生物を精度よ
く分離検出することができる。これらの本発明の方法は
定量性を有するため、試料中に存在する菌体数を判別測
定（定量分析）することも可能である。
【００３８】また本発明の方法及び装置によれば、試料
中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生
物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体など）を使用
することにより菌種の同定も可能である。特に本発明の
方法は、微生物、特に食中毒菌であるサルモネラの分離
能に優れているため、試料中に存在する数種類（亜種、
血清型）のサルモネラを一斉に分析し同定することが可
能である。
中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生
物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体など）を使用
することにより菌種の同定も可能である。特に本発明の
方法は、微生物、特に食中毒菌であるサルモネラの分離
能に優れているため、試料中に存在する数種類（亜種、
血清型）のサルモネラを一斉に分析し同定することが可
能である。
【００３９】このように本発明の方法及び装置は、特に
サルモネラの分析（定性分析、定量分析）に適している
ため、サルモネラによって汚染された食材や食品が早期
に排除でき食中毒の発生の防止に有用である。またサル
モネラによる食中毒患者の早期診断が可能になることか
ら、食中毒蔓延の防止並びに早期治療の一助となる。さ
らには食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の
厳格性から正味期間も延長可能であり、食品流通の経済
性に大きく貢献することができる。
サルモネラの分析（定性分析、定量分析）に適している
ため、サルモネラによって汚染された食材や食品が早期
に排除でき食中毒の発生の防止に有用である。またサル
モネラによる食中毒患者の早期診断が可能になることか
ら、食中毒蔓延の防止並びに早期治療の一助となる。さ
らには食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の
厳格性から正味期間も延長可能であり、食品流通の経済
性に大きく貢献することができる。
【図１】本発明のキャピラリー電気泳動による微生物の
分析装置の概略構成を示す図である。
分析装置の概略構成を示す図である。
【図２】実施例１において、BacLight(SYTO9)を用いて
S.enteritidis 及び S.typhimuriumをキャピラリー電気
泳動で検出したフェログラムを示す図である。縦軸は蛍
光強度を、横軸は時間（分）を示す。
S.enteritidis 及び S.typhimuriumをキャピラリー電気
泳動で検出したフェログラムを示す図である。縦軸は蛍
光強度を、横軸は時間（分）を示す。
【図３】実施例１において、S.enteritidisについてそ
の培養液を50倍、100倍及び500倍に希釈してキャピラリ
ー電気泳動を行った結果を示す図である。縦軸は蛍光強
度を、横軸は時間（分）を示す
の培養液を50倍、100倍及び500倍に希釈してキャピラリ
ー電気泳動を行った結果を示す図である。縦軸は蛍光強
度を、横軸は時間（分）を示す
【図４】実施例１において、キャピラリー電気泳動によ
って分離したS.enteritidisについて、該電気泳動に供
した菌数に対する蛍光ピーク面積を示す図である。
って分離したS.enteritidisについて、該電気泳動に供
した菌数に対する蛍光ピーク面積を示す図である。
【図５】実施例２において、FITC標識Anti-Salmonella
抗体を用いてS.enteritidisを蛍光キャピラリー電気泳
動によって検出した結果を示す図である。縦軸は蛍光強
度を、横軸は時間（分）を示す。なお、最初に出現する
ピークはフリーの蛍光標識抗体に由来するものである。
抗体を用いてS.enteritidisを蛍光キャピラリー電気泳
動によって検出した結果を示す図である。縦軸は蛍光強
度を、横軸は時間（分）を示す。なお、最初に出現する
ピークはフリーの蛍光標識抗体に由来するものである。
１．キャピラリー電気泳動による微生物の分析装置 10．キャピラリー 10a．入口側 10b．出口側 11．水槽（陽極側） 12．水槽（陰極側） 13．電極（陽極側） 14．電極（陰極側） 15．電源 16．検出用セル（フローセル） 17．光源（レーザー光源） 18．検出器（レーザー誘導蛍光検出器） 19．分離された微生物
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山田 一隆 東京都千代田区東神田一丁目９番８号 環 境エンジニアリング株式会社内 (72)発明者 鳥村 政基 茨城県つくば市千現２−11−３ Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB02 CC01 FA03 4B063 QA01 QA18 QQ06 QR41 QR48 QR51 QR56 QS16 QS33 QS36 QS39 QX02
Claims (7)
- 【請求項１】微生物を含む試料を、アルギン酸塩を含有
する泳動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動すること
を特徴とする、微生物の分析方法。 - 【請求項２】微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍
光抗体で処理し、これをキャピラリー電気泳動に供し
て、蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出することを
特徴とする、微生物の分析方法。 - 【請求項３】アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用い
てキャピラリー電気泳動することを特徴とする、請求項
２記載の微生物の分析方法。 - 【請求項４】微生物が、サルモネラに属する細菌である
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の微
生物の分析方法。 - 【請求項５】キャピラリー電気泳動を用いて微生物を分
析する方法であって、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝
液を含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分
離するキャピラリー、および(iii)分離された微生物を
検出するための検出手段、を備えることを特徴とする微
生物の分析装置。 - 【請求項６】検出手段として蛍光検出器を備えることを
特徴とする請求項５記載の微生物の分析装置。 - 【請求項７】検出する微生物がサルモネラに属する細菌
であることを特徴とする請求項５または６に記載の微生
物の分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000380547A JP4639298B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000380547A JP4639298B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002181781A true JP2002181781A (ja) | 2002-06-26 |
| JP4639298B2 JP4639298B2 (ja) | 2011-02-23 |
Family
ID=18848707
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000380547A Expired - Fee Related JP4639298B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4639298B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006126039A (ja) * | 2004-10-29 | 2006-05-18 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞の分離、同定装置及び方法 |
| JP2006170646A (ja) * | 2004-12-13 | 2006-06-29 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 微細管電気泳動による微生物分離用分離促進剤及び分析装置 |
| JP2007024610A (ja) * | 2005-07-14 | 2007-02-01 | Shimadzu Corp | キャピラリー電気泳動方法 |
-
2000
- 2000-12-14 JP JP2000380547A patent/JP4639298B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| JP2006126039A (ja) * | 2004-10-29 | 2006-05-18 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 細胞の分離、同定装置及び方法 |
| JP4512745B2 (ja) * | 2004-10-29 | 2010-07-28 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 細胞の分離、同定装置及び方法 |
| JP2006170646A (ja) * | 2004-12-13 | 2006-06-29 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 微細管電気泳動による微生物分離用分離促進剤及び分析装置 |
| JP4677524B2 (ja) * | 2004-12-13 | 2011-04-27 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 微細管電気泳動による微生物分離用分離促進剤及び分析装置 |
| JP2007024610A (ja) * | 2005-07-14 | 2007-02-01 | Shimadzu Corp | キャピラリー電気泳動方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4639298B2 (ja) | 2011-02-23 |
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