JP4677524B2 - 微細管電気泳動による微生物分離用分離促進剤及び分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、微細管電気泳動を用いて、検体試料中に存在する微生物を分析する方法並びに分析装置に関する。本発明の分析方法並びに分析装置は、環境、食品及び医療分野等において、検体試料中に混在する微生物を精度よく又は一斉分析する上で有用である。

なお、本発明で分析とは、試料中に含まれる所望微生物の分離、検出（定性的分析）、同定、定量、スクリーニング、生死判別を包含するものである。

一般に、試料中に微生物が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量を調べるためには、一旦これらの試料を適当な培地に接種して培養することによって目的の微生物を増殖させる必要がある。このため、従来、微生物の分析にはその培養のために少なくとも数時間という長い時間が必要であり、結果が迅速に得られないという問題があった。また、細菌培養は基本的に無菌的に行われるため、特殊な培養技術や設備が要求される。

これらのことから、微生物の培養並びに高度な技術や装置を要することなく、試料中に含まれ得る微生物を迅速に且つ簡便に検出し得る方法が望まれている。

多くの種類に分類される微生物の検出は、従来、選択分離培養で培養後、疑わしい集落を釣菌し、確認培地や同定キットあるいは抗血清により判定する必要があり、菌種・菌株を正確に同定するには多くの経験と熟練が必要であった。また、培養などの時間を合わせると判定結果には３〜５日間の長期間を要していた。

このため環境・食品及び医療分野では、微生物、とりわけ多くの種類に分類される微生物を菌種・菌株毎に特異的に検出するための迅速で且つ安全な方法の確立が求められているのが実情である。

近年、迅速な微生物の分離・検出手法として、微細管内で微生物を泳動させ抗体と反応させて検出する電気泳動技術がある（例えば特許文献１）。この方法における電気泳動の技術は、微生物を抗体と反応させるための移動手段であり、微生物細胞そのものを電気泳動的に分離するものではない。一方、微細管内で微生物を泳動分離する際には、微生物細胞と細管内壁、あるいは細胞と細胞との相互作用が大きく、迅速且つ高感度に微細管内で微生物を分離するためには、泳動液にアルギン酸塩を含有させることが有効である（例えば特許文献２）。

特開２００２−３４５４５１号公報 特開２００２−１８１７８１号公報

環境水汚染・食品汚染および感染症疾患に対して迅速に適切な処置を施したり、その汚染源・感染源を迅速に阻止するためには、汚染源・感染源となりうる微生物の迅速で且つ特異的な検出方法が求められる。そこで、本発明は各種微生物を広く迅速且つ高感度に分離検出等する分析方法並びに該方法に使用される分析装置を提供することを目的とする。

前述のアルギン酸を用いる方法において、微生物の分離効率を向上させる添加剤としてのアルギン酸塩は、サルモネラ属微生物等の分離に対しては効果があったが、すべての微生物に対して同様に機能するものではなかった。従って、多種多様な微生物種に対応できるより多くのタイプの分離効率向上剤の導入が期待されていた。また、アルギン酸がどのようなメカニズムで微生物の分離効率の向上に効果があるのが不明であり、他にどのような化合物が微生物の分離効率の向上に役立ち得るのか全く予測がつかなかった。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーを配合した泳動緩衝液を用いた微細管電気泳動法を利用することにより、試料中に種々含まれる微生物を高い分離能をもって且つ再現性よく分離することができることを見出した。また本発明者らは、微細管電気泳動法において検出手段として蛍光検出器を利用することによって、とりわけ蛍光抗体で目的の微生物を予め蛍光標識することによって、微量の微生物であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出できること、またこれにより更に一層高い分離能でもって精度よく所望の微生物が検出できることを見出した。更に本発明者らは、本発明の方法によると試料中に混在する微生物が単に検出できるだけでなく、定量的に測定できることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。

すなわち本発明の態様は、以下のとおりである。
[１] 微生物を含む試料を、アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含有する泳動緩衝液を用いて微細管電気泳動することを特徴とする、微生物の分離分析方法。
[２] 微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍光抗体で処理し、これを微細管電気泳動に供して、蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出することを特徴とする、微生物の分析方法。

[３] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含有する泳動緩衝液を用いて微細管電気泳動することを特徴とする、[２]の微生物の分析方法。
[４] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーである[１]の微生物の分離分析方法。
[５] アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーがスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーである[４]の微生物の分離分析方法。

[６] スルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーがデキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択される、[５]の微生物の分離分析方法。
[７] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーである[１]の微生物の分離分析方法。
[８] スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、[７]の微生物の分離分析方法。

[９] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーである[２]または[３]の微生物の分析方法。
[１０] アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーがスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーである[９]の微生物の分析方法。
[１１] スルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーがデキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択される、[１０]の微生物の分析方法。

[１２] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーである[２]または[３]の微生物の分析方法。
[１３] スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、[１２]の微生物の分析方法。
[１４] 微細管電気泳動を用いて微生物を分離するための装置であって、(i) アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含む泳動緩衝液を含む水槽、および(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離する微細管、を備えることを特徴とする微生物の分離装置。

[１５] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーである[１４]の微生物の分離装置。
[１６] アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーがスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーである[１５]の微生物の分離装置。
[１７] スルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーがデキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択される、[１６]の微生物の分離装置。

[１８] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーである[１４]の微生物の分離装置。
[１９] スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、[１８]の微生物の分離装置。

[２０] 微細管電気泳動を用いて微生物を分析するための装置であって、(i) アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含む泳動緩衝液を含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離する微細管、および(iii)分離された微生物を検出するための検出手段、を備えることを特徴とする微生物の分析装置。
[２１] 検出手段として蛍光検出器を備えることを特徴とする[２０]の微生物の分析装置。

[２２] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーである[２０]または[２１]の微生物の分析装置。
[２３] アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーがスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーである[２２]の微生物の分析装置。
[２４] スルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーがデキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択される、[２３]の微生物の分析装置。

[２５] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーである[２０]または[２１]の微生物の分析装置。
[２６] スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、[２５]の微生物の分析装置。
[２７] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーおよび緩衝液を含有する、微生物を分離する微細管電気泳動における微生物分離用分離促進剤。

[２８] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーである[２７]の微生物分離促進剤。
[２９] アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーがスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーである[２８]の微生物分離促進剤。
[３０] スルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーがデキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択される、[２９]の微生物分離促進剤。

[３１] アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーである[２７]の微生物分離促進剤。
[３２] スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、[３１]の微生物分離促進剤。

本発明によれば、検体試料中の微生物を短時間でかつ精度よく分析（分離、検出）できる方法並びに装置を提供することができる。請求項１にかかるアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーを配合した泳動緩衝液を用いた微細管電気泳動によれば、微生物を高性能に且つ再現性よく分離することができる。かかる方法によれば微生物の菌種・菌株を個々に分離することが可能となる。請求項２にかかる蛍光抗体を利用した微細管電気泳動法によれば、検体試料中に含まれる微生物を特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作なしに短時間に且つ容易にまた正確に検出できるため、高い精度の微生物検査とモニタリングシステムの確立が可能となる。請求項３にかかる分析方法によれば、試料中に含まれる微生物を再現性よく高い分離能をもって分離することができ、さらに蛍光検出手段としてレーザー誘導蛍光検出器を利用することにより所望の微生物を高感度且つ特異的に検出することができるので、試料を培養などの増殖処理を施すことなく、微量の微生物を精度よく分離検出することができる。これらの本発明の方法は定量性を有するため、試料中に存在する菌体数を判別測定（定量分析）することも可能である。

また本発明の方法及び装置によれば、試料中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体など）を使用することにより菌種の同定も可能である。特に本発明の方法は、微生物の分離能に優れているため、試料中に存在する数種類（亜種、血清型）の微生物を一斉に分析し同定することが可能である。

このように本発明の方法及び装置は、微生物の分析（定性分析、定量分析）に適しているため、病原性微生物によって汚染された食材や食品が早期に排除でき食中毒の発生の防止に有用である。また病原性微生物による食中毒患者の早期診断が可能になることから、食中毒蔓延の防止並びに早期治療の一助となる。さらには食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から正味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる。

（１）微生物の分析方法
本発明の微生物の分析方法は、第１に、微生物の分離にアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含有する泳動緩衝液を用いた微細管電気泳動法を利用することを特徴とする。また本発明の微生物の分析方法は、第２に、微生物を微細管電気泳動法によって分離し蛍光的に検出すること、具体的には目的微生物を蛍光抗体で標識することによって蛍光的に検出することを特徴とするものである。

ここで用いられる微細管電気泳動法は、泳動緩衝液としてアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを配合した緩衝液を使用する以外は、特に制限されることなく、従来公知の方法を任意に使用することができる。また、泳動緩衝液としてアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを配合した緩衝液を使用する限り、マイクロチップ電気泳動技術も含めて将来開発される微細管電気泳動法も制限されることなく使用できる。

泳動緩衝液中に含まれるアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーの割合は特に制限されないが、通常0.001〜1重量%、好ましくは0.001〜0.1重量%、より好ましくは0.001〜0.01重量%を挙げることができる。アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーとして、アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーおよび糖を含まない陰イオン性ポリマーが挙げられる。アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーとしては、スルフホン酸基を含む陰イオン性糖ポリマーが挙げられ、例えば、デキストラン硫酸塩、コンドロイチン硫酸塩およびヘパリン等が挙げられる。また、糖を含まない陰イオン性ポリマーとしては、スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが挙げられ、例えば、ポリ-γ-グルタミン酸塩等のポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩が挙げられる。さらに、本発明のアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーとして、具体的に、コロミン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、ペクチン酸塩、コンドロイチン硫酸塩（コンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅまたはコンドロイチン硫酸Ｋの塩）、ヒアルロン酸塩、ヘパリン、フカン硫酸塩、デキストラン硫酸塩、へパラン硫酸、ケラタン硫酸塩、カラゲナン、フコイダン等を挙げることができる。アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーの塩としては、具体的にナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウムやカルシウムなどのアルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩を挙げることができるが、好ましくはナトリウム塩である。

本発明の方法で用いるアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーの平均分子量は限定されないが、好ましくは5000以上、さらに好ましくは20000以上、さらに好ましくは100000以上、特に好ましくは150000あるいは200000以上である。

また、泳動緩衝液としては、pH３〜10、好ましくはpH７〜９の範囲に緩衝能を有するものであればよく、具体的にはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはこれら緩衝液の混合液を例示することができる。また、これらの泳動緩衝液の濃度としては、通常１〜1000mM、好ましくは２〜200mMの範囲を挙げることができる。

図１に本発明で利用できる微細管電気泳動システムの基本的構成を一例として示す。ここで中空の微細管１０の両端は、上記泳動緩衝液を入れた水槽１１及び１２にそれぞれ浸され、微細管内は当該泳動緩衝液で満たされている。水槽１１及び１２には、それぞれ電極（１３、１４）が付けられており、これらは高電圧サプライなどのように電源１５を介して連結されている。

分析対象である微生物を含む試料は、微細管の一端（入口側、１０ａ）から注入され、次いで電源１５が作動されることにより、泳動領域で微細管内に電位勾配が発生する。微細管内壁に表面電荷が存在する場合、この電位勾配により微細管内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それは陰極方向への流れとなる。また、微細管内に注入された微生物は、上記発生した電位勾配に応答して、該微生物が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極方向へ移動する。結果として微細管内での該微生物の泳動方向及び速度は、上記電気浸透流速度と該微生物の移動度によって決まり、微細管の反対端（出口側、１０ｂ）の近くに備えられた検出器１８によって検出される。尚、検出手段として光学的検出方法を利用する場合は、微細管そのものがフローセル１６となり、微細管壁を通して直接光学的に検出される。

微細管内への試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法、減圧法及び電気泳動注入法のいずれをも使用することができる。注入量も特に制限されないが、通常0.1〜100nL、好ましくは１〜100nL、より好ましくは１〜10nLを例示することができる。

尚、上記で例示した一対の電極（１３、１４）及び電源１５は、微細管内に注入された微生物が微細管内の泳動緩衝液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、微細管中の泳動緩衝液に対して印加するための手段であり、かかる目的が達成できるものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）に何ら限定されることなく任意の手段（電位勾配を印加する手段）を使用することができる。

上記のように印加手段として電源および電極を使用する場合、電極はそれぞれの泳動緩衝液を満たした対極の水槽中に挿入されており、電源が入れられると、陽極（アノード）と陰極（カソード）との間に電位勾配が形成され、それによって微細管に注入された微生物は、それが有する電荷と電気浸透流速度のバランスによりしかるべき電極方向へ移動する。一般的には、微生物の表面電荷は負であることが多いので微生物は陽極方向に移動する性質をもつが、陰極方向へ流れる上記電気浸透流速度がこの微生物泳動速度より大きい場合が多いので、微生物は結果として陰極へと移動する。

印加手段が電極を含む場合、電極間にかけられる電圧としては、微細管長さに対して、一般に約１kV/m〜約500kV/m、好ましくは約２kV/m〜約100kV/m、より好ましくは約５kV/m〜約20kV/mを挙げることができる。

微細管としては、内径1〜150μm、長さ0.1〜100cm、好ましくは内径20〜100μm、長さ1〜50cmの中空管を挙げることができる。その材質としては特に制限されず、ガラス製やテフロン製などを任意に例示することができるが、好ましくはフューズドシリカ製である。

微細管内で分離された微生物を検出する手段としては、分光学的、電気化学的、重量分析的方法のいずれもが使用できるが、好ましくはＵＶ−可視検出、蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法が挙げられる。中でも検出の特異性と感度に優れた蛍光検出法が好ましく、特により高感度検出が可能なレーザー誘導蛍光検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検出は、免疫反応（抗原抗体反応）、酵素反応、及び核酸相補鎖形成反応、等の反応を目的微生物に応じて適宜組み合わせることで、目的微生物をより特異的且つ高感度に検出することができる。これらの方法の中でも免疫反応は、微生物試料に特別な前処理をする必要がなく、また特異性に優れている点で、好ましい方法の１つである。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵素抗体ともいう）等を用いて目的の微生物を蛍光や酵素等で標識する方法を挙げることができる。

例えば、微生物を標識するために使用される蛍光試薬としては、特に制限されることなく従来公知若しくは将来知られうるものを広く挙げることができるが、具体的にはBODIPY FL（4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic Acid, Succinimidyl Ester）（励起波長503 nm、蛍光波長512 nm、Molecular Probe社製）、SYTO 9（励起波長480 nm、蛍光波長500 nm、Molecular Probe社製）、FITC（Fluorescein Isothiocyanate)（励起波長490 nm、蛍光波長520 nm、Dojin社製）、TexasRed（励起波長596 nm、蛍光波長620 nm、Molecular Probe社製）、TRITC（Tetramethylrhodamine Isothiocyanate）（励起波長541 nm、蛍光波長572 nm、Research Organics社製）、Cy3（N,N'-diethyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid）（励起波長552 nm、蛍光波長565 nm、Amersham Pharmacia Biotech社製）、Cy5（N,N'-di-carboxypentyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid）(励起波長650 nm、蛍光波長667 nm、Amersham Pharmacia Biotech社製）、Acridine Orange（励起波長490 nm、蛍光波長530 nm、640 nm、Wako社製）、Ethidum Bromide（励起波長545 nm、蛍光波長605 nm、Dojin社製）、Propidum iodide（励起波長530 nm、蛍光波長615 nm、Dojin社製）、Calcein（励起波長495 nm、蛍光波長520 nm、Dojin社製）、BCECF-AM（2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein Acetoxymethyl Ester）（励起波長500 nm、蛍光波長530 nm、Molecular Probe社製）、Evans blue（励起波長550 nm、蛍光波長610 nm、Wako社製）、Lucifer Yellow CH（励起波長430 nm、蛍光波長535 nm、ICN Pharmaceutical社製）、Dil（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）（励起波長550 nm、蛍光波長565 nm、Molecular Probe社製）、Dio（励起波長484 nm、蛍光波長501 nm、Molecular Probe社製）、DioC6(3)（3,3'-Dihexyloxacarbocyanine Iodide）（励起波長480 nm、蛍光波長501 nm、Lambda Probe & Diagnostics社製）、Rhodamine123（励起波長500 nm、蛍光波長540 nm、Molecular Probe社製）、Fluo-3（励起波長506 nm、蛍光波長526 nm、Dojin社製）、Calcium Green（励起波長506 nm、蛍光波長526 nm、Molecular Probe社製）等を例示することができる。

本発明の方法が対象とする微生物には、細菌類、真菌類、クラミジア、ウイルス、リケッチアが包含される。好ましくは細菌類である。例えば細菌類としてはブドウ球菌、８連球菌、スピリルム、連鎖球菌、球桿菌、桿菌、スピロヘータ、４連球菌、コンマ型球菌及び放線菌などが挙げられる。具体的には、ロドスピリルム（Rhodospirillaceae）、クロマチア（Chromatiaceae）、クロロビウム（Chlorobiaceae）、ミクソコッカス（Myxococcaceae）、アルカンギウム（Archangiaceae）、シストバクター（Cystobacteraceae）、ポリアンギウム（Polyangiaceae）、サイトファーガ（Cytophagaceae）、ベギアトア（Beggiatoaceae）、シモンシエラ（Simonsiellaceae）、リューコトリックス（Leucotrichaceae）、アクロマチウム（Achromatiaceae）、ペロネーマ（Pelonemataceae）、スピロヘータ（Spirochaetaceae）、スピリルム（Spirillaceae）、シュードモナス（Pseudomonadaceae）、アゾトバクター（Azotobacteraceae）、リゾビウム（Rhizobiaceae）、メチロモナス（Methylomonadaceae）、ハロバクテリウム（Halobacteriaceae）、腸内細菌（Enterobacteriaceae）、ヴィブリオ（Vibrionaceae）、バクテロイデス（Bacteroidaceae）、ナイセリア（Neisseriaceae）、ヴェイヨネラ（Veillonellaceae）、アンモニアまたは亜硝酸酸化細菌（Organisms oxidizing ammonia or nitrite）、硫黄代謝細菌（Organisms metabolizing sulfer and sulfer compounds）、酸化鉄および／または酸化マンガン沈着細菌（Organisms depositing iron and/or manganese oxides）、シデロカプサ（Siderocapsaceae）、メタノバクテリウム（Methanobacteriaceae）、好気性および／または通性嫌気性ミクロコッカス（Aerobic and/or facultatively anaerobic Micrococcaceae）、ストレプトコッカス（Streptococcaceae）、嫌気性ペプトコッカス（Anaerobic Peptococcaceae）、バチルス（Bacillaceae）、乳酸桿菌（Lactobacillaceae）、アセトバクター（Acetobacter）、コリネフォルム細菌（Coryneform group of bacteria）、プロピオン酸菌（Propionibacteriaceae）、アクチノミセス（Actinomycetaceae）、マイコバクテリウム（Mycobacteriaceae）、フランキア（Frankiaceae）、アクチノプラーネス（Actinoplanaceae）、デルマトフィルス（Dermatophilaceae）、ノカルディア（Nocardiaceae）、ストレプトミセス（Streptomycetaceae）、ミクロモノスポラ（Micromonosporaceae）、リケッチア (Rickettsiaceae)、バルトネラ（Bartonellaceae）、アナプラズマ（Anaplasmataceae）、クラミジア（Chlamydiaceae）、マイコプラズマ（Mycoplasmataceae）、およびアコレプラズマ（Acholeplasmataceae）に属する微生物などを挙げることができる。

上記の各種の検出対象となる微生物を、蛍光若しくは酵素等で標識化するため使用される抗体としては、上記微生物（細菌、真菌、クラミジア、ウイルス、リケッチャ）に特異的に結合する抗体（以下、抗体にはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が包含される）を任意に例示することができる。例えば、従来公知の細菌に対する抗体としては、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗体、抗トリ型結核菌（Mycobacterium avium）抗体、抗肺炎連鎖球菌（Strptococcus pneumoniae）抗体、抗Streptococcus A group抗体、抗Streptococcus B group抗体，抗Streptococcus D group抗体，抗虫歯レンサ球菌（Streptococcus mutans）抗体，抗黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureuse）抗体，抗表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）抗体，抗大腸菌（Esherichia coli）抗体，抗腸管出血性病原性大腸菌（Echerichia coli O-157:H7）抗体，抗サルモネラ（Salmonella sp.）抗体，抗赤痢（Shigella sp.）抗体，抗カンピロバクター（Campylobacter sp.）抗体，抗ビブリオ（Vibrio cholerae, paraheamoliticase）抗体，抗クレブシエラ（Klebsiella sp.）抗体，抗ブロテウス（Proteus sp.）抗体、抗レイジョネラ（Legionella pneumophila）抗体，抗ヘリコバクター（Hellcobacter pylori）抗体，抗緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）抗体，抗ヘモフィリス（Heamophilisinflenzae, Heamophilis sp.）抗体，抗パスツレラ菌（Pasteurella sp.）抗体，抗髄膜炎菌（Neisseria meningitidis group A,B,C,X,Y,Z,W,E）抗体，抗リン菌（Neisseria gonorrhea）抗体，抗リステリア菌（Listeria sp.）抗体，抗ボツリヌス菌（Clostridium botulium）抗体，抗ディフィシル菌（Clostridium difficile）抗体等が例示される。真菌類に対する従来公知の抗体としては、抗カンジダ（Candida albicanse, Candida tropicals, Candida stllatoidea）抗体が例示できる。また、細菌全種に共通する抗原に対する抗体も使用でき、これらのものとしては抗細菌細胞壁ペプチドグリカン（Bacterial peptidoglycan）抗体、抗グラム陽性細菌細胞壁リポティコ酸（Bacterial Lipoteichoicacid）抗体などが知られている。また腸管内に生息する細菌群の分別に有用な抗体としては抗腸内細菌（Enterobacteriaceae α、β）抗体が、また真菌に対する共通抗体しては抗マンナン、抗ガラクトマンナン、1−3β−Dグルカンなどが知られている。

本発明の方法が分析対象とする試料は、微生物を含有することが疑われる試料であり、医療分野では各種（疑）感染患者から採取される血液、尿、糞便、喀痰、髄液、膿、唾液などの生体試料を、また食品分野では食肉、卵、野菜、魚、飲料水などの原材料や種々の加工品を、また環境衛生分野では水道水、工場排水、浴場用水、下水道水、活性汚泥水を例示することができる。

（２）微生物の分離分析装置
本発明の微生物の分離分析装置は微細管電気泳動を原理とするものであり、具体的には、(i) アルギン酸塩以外のイオン性ポリマーを含む泳動緩衝液を含む一対の水槽、(ii)該泳動緩衝液に注入された微生物を分離する微細管、および(iii)微細管中の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、を備えることを特徴とする。本発明の微生物の分離分析装置はさらに、(iv)微細管内で分離された微生物を検出するための検出手段を備えることを特徴とする。

図１は、本発明にかかる微細管電気泳動による微生物の分析装置の概略構成を示す一例である。かかる図面を利用して本発明の分析装置をより詳細に説明すると、本発明の分析装置１は、アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含む泳動緩衝液を含む一対の水槽（陽極側水槽（１１）、陰極側水槽（１２））、注入された微生物を分離するための微細管１０、微細管中の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段としての一対の電極（陽極側（１３）、陰極側（１４））及び電源１５、並びに、微細管内で分離された微生物を検出するための検出手段として例えばレーザー光源等の光源１７及び該レーザー照射によって生じる蛍光を検出する検出器１８を含むように構成されている。微細管１０の両端は泳動緩衝液を入れた水槽１１及び１２にそれぞれ浸され、微細管内は当該泳動緩衝液で満たされている。水槽１１及び１２には、それぞれ電極１３及び１４が付けられており、これらには導線を介して電源１５が接続されている。なお、検出手段は微細管の出口側付近（１０ｂ）に設けられる。当該微細管部分は光学的に該当波長領域で吸収が無く微細管そのものが検出用セル（フローセル）１６として形成され、微細管を通して直接光学的に検出されるようになっている。なお、水槽には、電圧をかける際に発生する熱によるキャピラリー内の水溶液の水温の上昇を防ぐためにその外周に冷却手段が設けられていてもよい（図示せず）。

かかる分析装置によれば、微細管１０の一端（入口側、１０ａ）に分析対象である微生物を含む試料を注入した後、電源１５を作動させて電極１１と電極１２との間に電圧をかけることにより、泳動領域内（微細管内）の液全体は電気浸透現象により陰極方向への流れを発生する。一方、微生物は、それが有する電荷とは逆の極性を有する電極側（水槽）へと移動しようとする。例えば表面電荷が負である微生物は陽極側へ移動しようとする。かかる移動は上記電気浸透流に比べて十分小さい場合が多く、この泳動過程より微細管内で分離された微生物は、電気浸透流に流される形で微細管の出口付近（１０ｂ）の検出部でＵＶ−可視検出器又は蛍光検出器などによって光学的に検出することができる。分析対象の微生物が蛍光抗体などで蛍光標識されている場合は、検出器１８としてレーザー誘導蛍光検出器を使用することによって、光源１７からレーザー照射されることによって微生物が発生する蛍光を検出することができる。図１中、微細管１０に沿って描かれた矢印は、細胞が泳動する方向を示す。

なお、当該分析装置に用いられるアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含む泳動緩衝液、微細管、微細管の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、分析対象となる微生物、及び検出手段については、本発明の微生物分析方法に関して前述するものを広く挙げることができる。

以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
Lactobacillus deburueckii subsp. bulgaricus B-5b（L. deburueckii B-5b）、Lactococcus lactis subsp. lactisJCM-1158（Lc. LactisJCM-1158）、Streptococcus thermophilus 510（S. thermophilus 510）およびAcetobacter aceti JCM-7641の斜面固体培養物からそれぞれ１白金耳を取り、これらを常法に従って調製したMRS培地50mLを含む200mL容の三角フラスコに別個に接種した後、30℃で48時間振盪培養した。振盪培養後、培養液から500μLを1.5mL容量のサンプルチューブにとり、そのまま、あるいはこれにLIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits（Molecular Probes社製）のSYTO9溶液Aを0.75μL添加し、暗所で室温15分放置した後、キャピラリー電気泳動に供した。尚、キャピラリーは、泳動前に予め１N及び0.1Nの水酸化ナトリウムでそれぞれ20psi、１分間、超純水で20psi、３分間、及び泳動緩衝液で20psi、２分間洗浄しておいたものを使用した。かかるキャピラリーに上記サンプルを５psiで0.4秒間注入し、下記条件下で電気泳動及び検出を行った。

＜キャピラリー電気泳動及び検出条件＞
装置 ： Biofocus(Bio-rad)
キャピラリー： ヒューズドシリカ管（GLサイエンス社製）、
内径50μm、総長24cm、有効長20cm
泳動条件 ： 10kV（４μＡ）、３分
泳動緩衝液 ： Lactobacillus deburueckii subsp. bulgaricus B-5b（L. deburueckii B-5b）については、10mMホウ酸緩衝液(pH9)をコントロールとして用い、さらに10mMホウ酸緩衝液（pH9）に、0.1％濃度(w/v)になるように各陰イオン性糖ポリマー（デキストラン硫酸ナトリウム（平均分子量500,000）、ヘパリンナトリウムおよびコンドロイチン硫酸Ｃナトリウム）を添加溶解したものを用いた。Lactococcus lactis subsp. lactisJCM-1158（Lc. LactisJCM-1158）およびStreptococcus thermophilus 510（S. thermophilus 510）については、10mMホウ酸緩衝液(pH9)をコントロールとして用い、さらに10mMホウ酸緩衝液（pH9）に、0.1％濃度(w/v)になるようにデキストラン硫酸ナトリウム（平均分子量500,000）を添加溶解したものを用いた。Acetobacter aceti JCM-7641については、10mMホウ酸緩衝液(pH9)をコントロールとして用い、さらに10mMホウ酸緩衝液（pH9）に、0.05％濃度(w/v)になるようにポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムを添加溶解したものを用いた。
検出条件 ： 紫外波長210nmで吸光検出、あるいは励起波長488nm（アルゴンイオンレーザーモジュールのレーザ光）で蛍光波長530nmで検出
検出器 ： 紫外可視分光光度計、あるいはレーザ誘導蛍光（LIF）ディテクター。

得られたLactobacillus deburueckii subsp. bulgaricus B-5b（L. deburueckii B-5b）、Lactococcus lactis subsp. lactisJCM-1158（Lc. LactisJCM-1158）、Streptococcus thermophilus 510（S. thermophilus 510）およびAcetobacter aceti JCM-7641についての微細管電気泳動のフェログラムを、それぞれ図２から図５に示す。

図２中、（Ａ）から（Ｄ）の分析条件は以下の通りである。
泳動液：（A）10mMホウ酸緩衝液（pH9.0）、（B）0.10％（w/v）デキストラン硫酸ナトリウム（平均分子量500,000）を含む10mMホウ酸緩衝液（pH9.0），（C）0.10％（w/v）ヘパリンナトリウムを含む10mMホウ酸緩衝液（pH9.0）、（D）0.10%（w/v）コンドロイチン硫酸Cナトリウムを含む10mMホウ酸緩衝液（pH 9.0）、キャピラリー：24cm×50μm（有効長20cm），印加電圧：10kV［（A）2μA，（B）4μA］、試料：B-5b［（A）約2,700個，（B）約1,600個、（C）約2,600個，（D）約2,500個］

図３および４中、（Ａ）および（Ｂ）の分析条件は、(A)10mMホウ酸緩衝液（pH9.0）、（B）0.10％（w/v）デキストラン硫酸ナトリウム（平均分子量500,000）を含む10mMホウ酸緩衝液（pH9.0）である。図５中、（Ａ）および（Ｂ）の分析条件は、(A)10mMホウ酸緩衝液（pH9.0）、（B）0.05％（w/v）ポリ-γ-グルタミン酸ナトリウム（平均分子量500,000）を含む10mMホウ酸緩衝液（pH9.0）である。

図２からわかるように、L. deburueckii B-5bは、陰イオン性糖ポリマー（デキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、コンドロイチン硫酸Cナトリウム）の添加によりそれぞれシャープなピークとして良好に分離、検出できることが確認できた。また、図３および４からわかるように、Lc. lactis JCM-1158およびS. thermophilus 510においても、陰イオン性糖ポリマー（デキストラン硫酸ナトリウム）の添加によりそれぞれシャープなピークとして良好に分離、検出できることが確認できた。さらに、図５からわかるように、Acetobacter aceti JCM-7641についても陰イオン性ポリマー（ポリ-γ-グルタミン酸）の添加によりそれぞれシャープなピークとして良好に分離、検出できることが確認できた。

次いで、L. deburueckii B-5bについて、その培養液を10mMのホウ酸緩衝液により順次希釈して、それぞれについて上記条件下（添加剤としてデキストラン硫酸ナトリウムを使用）で微細管電気泳動を行い紫外可視吸光度測定して得たフェログラム結果を図６に示す。図６は、注入細菌数と紫外可視吸収検出によるエレクトロフェログラムの関係を示し、各フェログラムの右上の数値が注入細菌数を示す。注入された細胞数と検出ピーク面積をプロットしたところ、図７に示すように、ピーク強度は菌数と比例関係にあることが示された。このことから、本発明に微細管電気泳動法によって検体中の微生物を定量的に測定することができることが判明した。さらに、蛍光標識したL. deburueckii B-5bについて、その培養液を10 ｍＭのホウ酸緩衝液により順次希釈して、それぞれについて上記条件下（添加剤としてデキストラン硫酸ナトリウムを使用）で微細管電気泳動を行い蛍光測定して得たフェログラム結果を図８に示す。図８は、注入細菌数とレーザ励起蛍光検出によるエレクトロフェログラムの関係を示し、各フェログラムの右上の数値が注入細菌数を示す。注入された細胞数と蛍光検出ピーク面積をプロットしたところ、図９に示すように、ピーク強度は菌数と比例関係にあることが示された。このことから、本発明に微細管電気泳動法によって検体中の微生物をより高感度に定量的測定ができることが判明した。

実施例２
L. deburueckii B-5bとLactobacillus acidophilusL-54 (L. acidophilus L-54)の斜面固体培養物からそれぞれ１白金耳を取り、これらを常法に従って調製したMRS培地50mLを含む200mL容の三角フラスコに別個に接種した後、30℃で48時間振盪培養した。振盪培養後、それぞれの培養液から500μLを1.5mL容量のサンプルチューブにとり混和し、これにLIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits（Molecular Probes社製）のSYTO9溶液Aを0.75μL添加し、暗所で室温15分放置した後、キャピラリー電気泳動に供した。電気泳動および検出の条件は、実施例１と同様であった。

そのフェログラムを図１０に示す。L. acidophilus L-54は約1.0分にL. deburueckii B-5bは約1.5分に泳動分離され、両微生物は微細管電気泳動により完全分離検出され、各々の泳動時間は単独で分析した際と同じものであった。これにより、乳酸菌の２種類が短時間に分離・検出されたことが判明した。

本発明の微細管電気泳動による微生物の分析装置の概略構成を示す図である。 実施例１において、L. deburueckii B-5bについてその泳動液にデキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、コンドロイチン硫酸Cナトリウムを添加してキャピラリー電気泳動を行った結果を示す図である。縦軸は210 nmにおける吸光度を、横軸は時間（分）を示す。 実施例１において、Lc. lactis JCM-1158についてその泳動液にデキストラン硫酸ナトリウムを添加してキャピラリー電気泳動を行った場合のフェログラム図である。 実施例１において、S. thermophilus 510についてその泳動液にデキストラン硫酸ナトリウムを添加してキャピラリー電気泳動を行った場合のフェログラム図である。 実施例１において、Acetobacter aceti JCM-7641についてその泳動液にポリ-g-グルタミン酸ナトリウムを添加してキャピラリー電気泳動を行った場合のフェログラム図である。 実施例１において、L. deburueckii B-5bについてその泳動液にデキストラン硫酸ナトリウムを添加してキャピラリー電気泳動を行った場合のフェログラム図である。 実施例１において、L. deburueckii B-5bについてその泳動液にデキストラン硫酸ナトリウムを添加してキャピラリー電気泳動を行った場合の電気泳動に供した菌数に対する紫外可視吸収ピーク面積を示す図である。 実施例１において、蛍光標識L. deburueckii B-5bについてその泳動液にデキストラン硫酸ナトリウムを添加してキャピラリー電気泳動を行った場合のフェログラム図である。 実施例１において、蛍光標識L. deburueckii B-5bについてその泳動液にデキストラン硫酸ナトリウムを添加してキャピラリー電気泳動を行った場合の該電気泳動に供した菌数に対する蛍光ピーク面積を示す図である。 実施例２において、L. deburueckii B-5bとL. acidophilus L-54を蛍光微細管電気泳動によって分離・検出した結果を示す図である。縦軸は蛍光強度を、横軸は時間（分）を示す。なお、最初に出現するピークは浸透流マーカーとして添加したクマリン系蛍光色素に由来するものである。

符号の説明

１．微細管電気泳動による微生物の分析装置
10．微細管
10a．入口側
10b．出口側
11．水槽（陽極側）
12．水槽（陰極側）
13．電極（陽極側）
14．電極（陰極側）
15．電源
16．検出用セル（フローセル）
17．光源（レーザー光源）
18．検出器（レーザー誘導蛍光検出器）
19．分離された微生物

Claims (11)

1. 微生物を含む試料を、アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含有する泳動緩衝液を用いて微細管電気泳動することを特徴とする、微生物の分離分析方法であって、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーであり、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーが、デキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択されるスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーである、前記方法。
2. 微生物を含む試料を、アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含有する泳動緩衝液を用いて微細管電気泳動することを特徴とする、微生物の分離分析方法であって、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーであり、
   該スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、前記の微生物の分離分析方法。
3. 微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍光抗体で処理し、これをアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含有する泳動緩衝液を用いた微細管電気泳動に供して、蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出することを特徴とする、微生物の分析方法であって、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーであり、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーが、デキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択されるスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーである、前記方法。
4. 微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍光抗体で処理し、これをアルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含有する泳動緩衝液を用いた微細管電気泳動に供して、蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出することを特徴とする、微生物の分析方法であって、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーであり、
   該スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、前記の微生物の分析方法。
5. 微細管電気泳動を用いて微生物を分離するための装置であって、(i) アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含む泳動緩衝液を含む水槽、および(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離する微細管、を備えることを特徴とする微生物の分離装置であって、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーであり、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーがスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーであり、
   該スルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーがデキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択される、前記の微生物の分離装置。
6. 微細管電気泳動を用いて微生物を分離するための装置であって、(i) アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含む泳動緩衝液を含む水槽、および(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離する微細管、を備えることを特徴とする微生物の分離装置であって、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーであり、
   該スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、前記の微生物の分離装置。
7. 微細管電気泳動を用いて微生物を分析するための装置であって、(i) アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含む泳動緩衝液を含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離する微細管、および(iii)分離された微生物を検出するための検出手段、を備えることを特徴とする微生物の分析装置であって、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーであり、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーがスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーであり、
   該スルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーがデキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択される、前記の微生物の分析装置。
8. 検出手段として蛍光検出器を備えることを特徴とする請求項７記載の微生物の分析装置。
9. 微細管電気泳動を用いて微生物を分析するための装置であって、(i) アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーを含む泳動緩衝液を含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離する微細管、および(iii)分離された微生物を検出するための検出手段、を備えることを特徴とする微生物の分析装置であって、
   該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーであり、
   該スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、前記の微生物の分析装置。
10. アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーおよび緩衝液を含有する、微生物を分離する微細管電気泳動における微生物分離用分離促進剤であって、
    該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがアルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーであり、
    該アルギン酸塩以外の陰イオン性糖ポリマーがスルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーであり、
    該スルホン酸基を有する陰イオン性糖ポリマーがデキストラン硫酸塩、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択される、前記の微生物分離促進剤。
11. アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーおよび緩衝液を含有する、微生物を分離する微細管電気泳動における微生物分離用分離促進剤であって、
    該アルギン酸塩以外の陰イオン性ポリマーがスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーであり、
    該スルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する陰イオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩およびポリ（スチレンスルホン酸／マレイン酸）の塩からなる群から選択される、前記の微生物分離促進剤。

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