JP2002534679A - 分離チャネルにおいて種を分離するための感熱性媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つのアセンブリーのブロックコポリマーが溶解している電解質中を含む媒体に関し、ここで、該ブロックコポリマーは、温度Ｔ１で得られる粘性状態Ｖ１から、温度Ｔ２で得られる、Ｖ１より少なくとも１００％高い粘性状態Ｖ２へ、可逆的に移行する性質を該媒体に提供する濃度レベルで該電解質中に存在し、その構造中に、少なくとも：該電解質中で低い臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示し、かつその骨格に沿って５０より大きい平均原子数を有する２つの非隣接ポリマーセグメントと、温度Ｔ１とＴ２で電解質に可溶性である１つのポリマーセグメントとを含むことを特徴とする。本発明はまた、分析物を分析するための該媒体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、チャネル、例えば、マイクロ流体系またはさらに詳しくは毛細管電
気泳動において、粒子、分子または巨大分子、さらに詳しくは、核酸を分離、同
定および／または分析する分野に関する。

【０００２】 ゲル電気泳動には、荷電粒子、分子および巨大分子、特に核酸（ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、オリゴヌクレオチド）、タンパク質、ポリペプチド、グリコペプチドおよび
多糖類のような生物学的巨大分子の分離のための多くの応用がある。特に重要な
応用は、配列決定、すなわち、ＤＮＡの遺伝子コードの読み取りである。これは
、ほとんどアガロースまたはポリアクリルアミドからなる平坦な巨視的ゲル（１
〜数mm程度の厚さを有する）で行われる。さらに最近になって、アクリルアミド
から誘導される他のゲルおよび全系列のアクリルまたはメタクリルゲルが、ゲル
の種々の性質を改善するために提案されている。詳細には、米国特許第５，１６
４，０５７号では、電気泳動において使用される不変かつ不可逆的に架橋されて
いるゲルの親水性／疎水性を制御するための低い臨界溶解温度（lower critical solution temperature）（本出願では以後ＬＣＳＴと略する）を有するポリマ
ーの使用が提案されている。

【０００３】 これらの改善にもかかわらず、二次元ゲル電気泳動は、多くの欠点を有する。

【０００４】 これは、ゲルの調製のため（１回しか使用できない）、および以後の泳動距離
の視覚化のために、相対的に相当量の手作業を要する。ゲルの性質は、正確な調
製条件に依存するため、ゲル毎に実験の再現性を得ることは難しい。電流に関連
して熱が発生するため、かなり低い低電圧を印加する必要があり、このため分離
時間が長くなる。最終的に、二次元電気泳動は、自動化および定量化するのが難
しい。これらの種々の理由から、巨視的ゲル電気泳動は、試料の構成成分の分離
またはより一般的に分析が、円筒毛細管のような高い表面積／容量比を有するチ
ャネル、または素材中で調製される二次元サブミリセクションを有するチャネル
（「チップ」、マイクロチャネルまたはマイクロ流体系と呼ばれる）で行われる
方法に取って代わられつつある。このような分離の例は、例えば、「分析的バイ
オテクノロジーにおける毛細管電気泳動（Capillary electrophoresis in analy
tical biotechnology）」, Righetti編, CRC Press, 1996年、またはCheng, J.
ら, (1996), Molecular Diagnosis, 1, 183-200に記載されている。

【０００５】 以下の本文では、１つのチャネルまたはいくつかのチャネルにおいて、その少
なくとも１つの寸法がサブミリの大きさである電気泳動分離を有する全ての方法
が、「毛細管電気泳動（capillary electrophoresis）」（ＣＥ）という名称で
呼ばれる。「マイクロ流体系」とは、より一般的には、種の分析が、少なくとも
１つの寸法がサブミリであるチャネルまたはチャネルのセット内で、該種および
／または流体の輸送により行われる任意の系を表す。

【０００６】 ＣＥおよびマイクロ流体系は、ゲルよりも迅速かつ高い分離能の分離が可能で
あり、抗対流性媒体を必要とせず、そしてその性質は、液体媒体中のイオンの分
離を行うために広く使用されている。

【０００７】 しかし、電気泳動による分離が望まれる分析物のかなりの部分、特に生物学で
遭遇するものは、均質な粘性媒体中で、これらの大きさに依存しない移動度を持
ち、そして障害物のある媒体中でのみ満足に分離することができる。従来の電気
泳動に使用されるゲルは特に、相互に連結しているため、分析物が横断できない
巨大分子鎖または繊維部分からなる。後者は、ゲルの巨大分子セグメントの間に
存在する細孔に沿って通路を創る必要があり、これによって所望の分離が可能に
なる。ＤＮＡおよびタンパク質へのＣＥの最初の応用では、しばしば毛細管の内
側で架橋している永久的ゲルが使用された。これは、多くの欠点を有する：毛細
管の内側に気泡を含まない真に均質なゲルの調製は難しい。ゲルは、加水分解に
より比較的急速に分解され、試料中に存在する不純物が「混入」し、このため、
結局分離の性能特性を損なうか、あるいは限られた回数の分離後に毛細管を塞い
でしまうこともある。製造コストおよび／またはゲルを充填した毛細管の製造の
困難さを考慮すると、この欠点がこのアプローチのコストをひどく高いものにす
る。

【０００８】 現在、ＣＥで行われる生物学的巨大分子の分離の大多数は、必要に応じて取り
替え可能であるという利点を有する絡み合った線形水溶性ポリマーの溶液を利用
している。絡み合い閾値を有意に超えるかなりの高濃度では、溶液中の種々のポ
リマーは、絡み合い、分析物が横断できない位相的な障害物の連続した一過性の
ネットワークを構成して、溶液に電気泳動分離性を与える。

【０００９】 これらの水溶性ポリマー溶液は、いくつかの応用において満足すべきものであ
るが、多くの限界も有する。

【００１０】 これらの限界の第１は、電気浸透、すなわち毛細管またはチャネルの壁上の電
荷の存在による分離媒体の同時移動である。この移動はしばしば経時的に変化し
、不均一であるため、測定および分離の再現性を妨げる。これに対抗するため、
多くの方法が提案されており、例えば、実際の分離の前に分離チャネルの壁に本
質的に中性の種を吸着（Wiktorowiczら, Electrophoresis, 11, 769, 1990, Tsu
jiら, J. Chromatogr. 594, 317 (1992)）させるか、または酸性溶液で毛細管を
処理（Fungら, Anal. Chem. 67, 1913, (1995)）して、毛細管の表面を処理する
。これらの方法は、毛細管を再生するために、安価であり数回繰り返すことがで
きるという利点を有するが、しばしば電気浸透を部分的に減少させるだけである
。例えば、ＵＳ４，６８０，２０１に記載されるように、壁への本質的に中性の
ポリマー層の不可逆的グラフト重合のための方法も提案されている。こうしてす
ぐに使用できる処理済毛細管が市販されている。これらの不可逆的に処理された
毛細管は、数回の分離について電気浸透の良好な減少をもたらすが、その寿命は
限界があり、そのコストが高い。

【００１１】 ポリマー溶液中の動電学的分離の別の大きな欠点は、比較的濃縮された巨大分
子量の溶液で、分離および大きさの分離可能範囲が良好なことである（Mitnikら
, J. Chrom. A, 710, 309 (1995)；Goetzingerら, Electrophoresis, 19, 242,
(1998)）。これは、分離マトリックスの変形のせいであり、これが、大きなサイ
ズの分析物の分離を制限し、そしてマトリックスの分子量が低くかつその濃度が
低いほど、これが大きい。一方、ポリマー溶液の粘性は、分子量および濃度が上
昇すると非常に急速に上昇する。従って絡み合った水溶性ポリマー溶液の応用は
、この非常に大きな問題により限定され、最後の手段として、小さなサイズの毛
細管（典型的には１００マイクロメートル未満）中に非常に高粘性の溶液を導入
することになる。最後に、毛細管電気泳動を利用しやすい分離範囲は、パルスフ
ィールドの使用により最大のサイズまで拡大されることに注目すべきである。こ
の場合にはＤＮＡ凝集の現象に遭遇するが、これは、改善の範囲を限定し、そし
てこれもまた、媒体の粘性が低いほど大きい。

【００１２】 分離媒体をチャネル中に注入するための低い粘性の探索、および分離のための
抵抗性の位相的障害物（これは実際高い粘性をもたらす）の探索により提起され
るジレンマを解決するために、一部の研究者らは、温度の上昇中は粘性が大きく
低下するポリマー媒体の使用を提案している。この型の媒体は、高温では低粘性
状態で、毛細管への該媒体の注入を可能にし、そして、ゲル電気泳動（特にアガ
ロースによる電気泳動）において普通に行われるように、低温では、良好な分離
性能特性を示す高粘性状態での分離を可能にするという利点を有する。

【００１３】 出願ＷＯ９４／１０５６１号およびＷＯ９５／３０７８２号では、特に温度を
上げると注入がより容易になる媒体が提案されている。これらの特許出願におい
て本質的に、高温で容量が低下する（こうして、低粘性の不連続の粒子の希薄溶
液になる）、および分離チャネルを完全に占める程度まで低温で膨潤する（こう
して、媒体にゲル化特性および良好な分離性を与える）ことが可能なマイクロゲ
ルが記載されている。

【００１４】 しかし、これらの分離媒体の粘度は、温度と共にやや急速に低下する：従って
分離が起きる温度よりも高温でこれらを毛細管に導入することが必要であるが、
これは種々の欠点がある。一方、毛細管電気泳動装置では、毛細管全体をサーモ
スタット調温するのは非常に難しく、従って、室温よりも顕著に高い温度でのみ
注入可能なポリマーを自動化様式で使用することは難しい。室温であまり粘性で
なく、低温では高粘性と良好な分離性を持つ溶液を企図することは可能であろう
が、これは、分離を低温で行うことを伴い、全ての分析物について可能ではない
。詳細には、ＤＮＡ配列決定について、「圧縮物（compressions）」の最適な分
離は、比較的高温（５０〜６０℃程度）で得られることが知られているが、これ
は、前記原理とは相容れない。

【００１５】 出願ＷＯ９８／１０２７４号は、第１の温度では溶解状態であり、第２の温度
ではゲル型状態である、少なくとも１つの型のブロックコポリマーを含んでなる
分子分離媒体を提案している。この媒体はさらに、その役割が、第１の温度でブ
ロックコポリマーを溶解し、かつ該第２の温度で、分離プロセスを遮ることなく
かつ該第１の温度に戻る間可溶性状態に戻るのを妨げることなく、ゲル状態に移
行させることである緩衝液を含む。さらに具体的には、記載されるポリマーは、
低分子量（典型的には２０，０００未満）の、ポリオキシエチレン−ポリオキシ
プロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥ）ファミリーのトリ
ブロックポリマー、そしてさらに具体的には（ＰＯＥ₉₉−ＰＯＰ₆₉−ＰＯＥ₉₉、
ここで、下付文字は、各ブロックのモノマーの数を表す）（商品名「プルロニッ
ク（Pluronic）Ｆ１２７」）である。低温では、トリブロック系の末端の２つの
ＰＯＥセグメントは、水溶性であり、そしてコポリマーの低分子量を考慮すれば
、溶液は高濃度までほんのわずかに粘性であるのみである。１５〜２５℃付近ま
で温度を上げることにより、中央のＰＯＰ中央セグメントがより疎水性になり、
これらのポリマーは媒体の内部で結合して、予め決められた構造を有する組織化
された三次元ネットワークを構成し、媒体にゲルの外観と粘稠度を与える。残念
ながら、この機序は、電気泳動にとってはいくつかの欠点を示す。一方これは、
高ポリマー濃度（１５g/１００mlより大きい、または２０g/１００mlさえ超える
）で良好な電気泳動分離性を有するゲル状態が生じるだけであり、これは強い摩
擦と長い泳動時間を引き起こす。さらに、その性質が温度変化の速度の関数とし
て依存することは、結果の再現性を予測不能にする。最後に、ＷＯ９８／１０２
７４号において提案された生成物は、室温未満か室温より大きいかのいずれかで
低い粘性を示し、室温（２５℃）の領域では電気泳動分離に有利なゲル状態を示
すが、このことは、毛細管を便利に充填することにとっても、またはＤＮＡ配列
決定のような応用にとっても有利ではない。

【００１６】 異なる分子量で、同じ構造を有するトリブロックコポリマーは、Ｆ１２７と同
等な物性、およびＦ１２７と同等かそれ以下の分離に関する性能特性が生じる。
またＷＯ９８／１０２７４号には、ＰＯＢ₁₂−ＰＯＥ₂₆₀−ＰＯＢ₁₂型ポリマー
（ここで、ＰＯＢは、ポリオキシブチレンを意味する）が開示されている。前記
ポリマーとは異なり、これらのポリマーは、室温より高い温度であまり粘性でな
い状態になり、室温の領域まで温度を低下させることによりゲル化を起こす。

【００１７】 水の中で熱粘性促進性または熱濃縮性を示し得る他のポリマーが存在すること
に注意されたい。熱粘性促進性ポリマーは、特許出願ＥＰ５８３８１４号に記載
されており、これは、一方で、有用な温度範囲でＬＣＳＴを示さないプレポリマ
ーまたは巨大モノマー鎖型の親水性部分と、他方で、該有用な温度範囲でＬＣＳ
Ｔを示すプレポリマーまたは巨大モノマー鎖型の親水性部分とを含有する。しか
しこの型のポリマーは、いくつかの理由により、電気泳動の分離媒体としてその
良好な性能特性で使用することができない。まず、これらは、溶液中に比較的多
量の塩（０．４Ｍ〜数Ｍのオーダー）が存在する場合だけ、その熱粘性促進性を
示す。塩濃度の高い溶液を使用すると、溶液が加熱し強い電界を使用することが
できないため、この性質は電気泳動にとって極めて不都合である。従って、塩濃
度の高い媒体中での分離は、遅く、分離能が低くなる。さらに、これらは荷電し
た骨格を示す。すなわち、これらを電気泳動分離媒体として使用したいなら、マ
トリックスを構成するポリマーを動かしているという危険を冒すことになり、こ
れは電子浸透を発生させて、分析物と固定障害物との相互作用により得ようとし
ている分離を破壊してしまう。第３に、これらの媒体は、すなわちＬＣＳＴを有
する該親水性部分のＬＣＳＴをカバーするユニークで比較的広い温度範囲で、熱
粘性化の発生、ほぼ一定の粘度を維持することを目的とする。しかし、電気泳動
では、２つの明確な有用な温度範囲（１つは、毛細管に分離媒体を注入するため
の温度、もう１つは、実際の電気泳動分離のための温度）を持ち、媒体がほぼ一
定の温度に維持されている間に分離を行うことが特に好ましい。

【００１８】 実際、熱粘性化作用を発生することができるとして今日まで提唱されている多
くの合成媒体は、荷電した骨格を有する（L'Alloretら、Colloid. Polym. Sci.,
273, 1163-1173 (1995)、Hourdet, Polymer preprints, 34, 972-973 (1993)、
Hourdetら, Polymer, 38 2535-2547 (1997)）。実際、ポリマーに熱粘性化性を
付与するふつうの方法は、任意の温度で親水性であり、分子を溶液中に維持する
のを助ける親水性である鎖部分と、温度の上昇により鎖間で魅力的な相互作用を
引き起こし粘性化に関与する、ＬＣＳＴを有する鎖部分とを、有する分子を作製
することである。良好な粘性化を得るためには、ＬＣＳＴを有する鎖の割合とそ
の相互作用の力を上げることことが好ましいが、かかる上昇はまた、巨視的な相
分離を誘導し、これは粘度を低下させる傾向がある。骨格上に電荷が存在すると
、対イオンのエントロピーと静電的反発の作用により巨視的相分離の防止を助け
、従って巨視的相分離を避けながら、粘性化を与えるのに充分なＬＣＳＴを有す
る部分の量の、ポリマー組成への侵入を引き起こすことを可能にする。従って、
中性の親水性骨格を有するポリマーに基づく熱粘性化媒体を作成することは、特
に困難であることがわかる。かかる媒体のいくつかの例は、Vosら, Polymer, 35
, 2644 (1994) に記載されているが、これらは、高塩レベルと８０℃を超える温
度でのみ熱粘性化を引き起こし、これはまた、分離マトリックスとして応用、特
に電気泳動への応用が企図されるほとんどの場合に使用不可能とする。

【００１９】 従って、感熱性であるものや感熱性でないものなど多くの型の媒体が、チャネ
ル中の種の動電的分離用のマトリックスとして提唱されており、無数の感熱性媒
体が他の用途に提唱されているが、現在のところ、該分離に最適な性質を示す媒
体はまだない。

【００２０】 本発明の目的は、特定のコポリマーの選択により、分離すべき分析物のサイズ
の関数としてその性質を最適化することが可能であることがわかっている、新し
い型の分離媒体を正確に提供することである。

【００２１】 本発明の目的において、分離という表現は、混合物中に含有される種のすべて
または一部（該種は、一般に「分析物」と呼ばれる）を分離、同定または分析す
ることを目的とする任意の方法をカバーする。

【００２２】 従ってこの分離は、マイクロ流体系のチャネル、または電気泳動に関連して実
施される。

【００２３】 本発明は、動電的分離の場合に特に有利である。

【００２４】 動電的分離という表現は、この分離は、例えば電気クロマトグラフィー中のよ
うに媒体自身の運動により、またはミセル電気クロマトグラフィー中のようにミ
セルのような付随的種の運動により、または直接的もしくは間接的作用の任意の
組合せによるような、電界がその移動作用を及ぼすのが直接的または間接的方法
であっても、分析物に対して移動作用を及ぼす電界の作用下で、媒体中でこれら
の移動を引き起こすことにより、混合物中に含有される種のすべてまたは一部（
該種は、一般に「分析物」と呼ばれる）を分離することを目的とする、任意の方
法をカバーする。電界の該作用を非電界起源の別の移動作用と組合せる任意の分
離法も、本発明の動電的分離法と見なされる。

【００２５】 さらに詳しくは、本発明の主題は、分離チャネルにおける種の分離のための感
熱性媒体であって、該媒体は、少なくとも１つのセットのブロックコポリマーが
溶解している電解質を含み、該ブロックコポリマーは、

【００２６】 ・該電解質中で、温度Ｔ１で得られる粘性状態Ｖ１から、Ｔ１よりも少なくと
も２０℃高い温度Ｔ２で得られる、Ｖ１より少なくとも１００％高い粘性状態Ｖ
２へ可逆的に移行する能力を該媒体に付与するのに十分な濃度で、与えられ、そ
して

【００２７】 ・その構造中に、少なくとも

【００２８】 ・該電解質中でＬＣＳＴを示し、かつその骨格に沿って５０より大きい平均
原子数を有する、２つの非隣接ポリマーセグメントと、

【００２９】 ・温度Ｔ１とＴ２で電解質に可溶性である１つのポリマーセグメント とを含むことを特徴とする、上記媒体である。

【００３０】 本発明の目的において、特に明記しない場合は、鎖のセットまたはポリマーセ
グメントのセットについてのすべての平均値、例えば、平均分子量、または骨格
に沿った平均原子数、または櫛型ポリマーの場合は平均グラフト数は、ポリマー
物理学の通常の意味の範囲内で、質量による平均値を意味するものと理解される
。

【００３１】 従って、特許請求される分離媒体は、温度Ｔ１で得られる該チャネルへの導入
を可能にするかなり低い粘性の流動状態と、温度Ｔ１より少なくとも２０℃高い
温度Ｔ２で得られる、顕著に高い粘性（少なくとも２倍は高い）の状態との間を
、可逆的に移行する能力を有する。温度Ｔ２において、該分離媒体は、あらかじ
め決められた範囲の化学組成とサイズの種について、大きな分離性を付与される
。

【００３２】 「温度Ｔ１」という表現は、本発明の文脈において、分離プロセスに関連する
特定の操作、特に本発明の分離マトリックスを分離チャネルに導入する操作を実
施するのに有用な、正確な温度、または比較的狭い範囲の温度（通常、１０℃の
オーダーである）を意味する。本発明の好適な実施態様において、温度Ｔ１は約
１５〜３０℃である。同様に「温度Ｔ２」という表現は、本発明の文脈において
、分離プロセスに関連する特定の操作、特にチャネル中の分析物を分離する工程
に関連する操作を実施するのに有用な、正確な温度、または比較的狭い範囲の温
度（通常、１０℃のオーダーである）を意味する。ＤＮＡの配列決定に有用な本
発明の好適な実施態様において、この温度または温度範囲Ｔ２は、約４０〜８０
℃である。

【００３３】 本発明の好適な実施態様において、ＬＣＳＴを示すかなりの割合の該セグメン
トのＬＣＳＴは、Ｔ１とＴ２の間の温度、好ましくは約２０〜５０℃である。

【００３４】 本発明の目的において電解質という表現は、イオンを伝導することができる凝
縮した媒体を意味する。最も一般的な場合、この媒体は、緩衝化水性媒体、例え
ばリン酸塩、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ホウ酸
塩、Ｎ−トリス（ヒドロキシルメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
（ＴＡＰＳ）、ヒスチジン、リジンなどに基づく緩衝液である。電気泳動で使用
可能な無数の緩衝液の例が当業者に公知であり、その多くが例えばSambrookら、
"Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Lab, New Yo
rk, 1989 に記載されている。しかし本発明では任意の型の電解質が使用でき、
特に水性−有機溶媒（例えば、水−アセトニトリル、水−ホルムアミド、または
水−尿素混合液）、極性有機溶媒（例えば、Ｎ−メチルホルムアミド）がある。
本発明において特に好適な電解質は、実質的な割合の尿素および／またはホルム
アミドを補足したアルカリ性ｐＨの水性緩衝液からなる「配列決定緩衝液」と呼
ぶ電解質である。

【００３５】 本発明の目的において「種」という用語は、一般的に分析物を意味する。これ
らの分析物は、粒子、細胞小器官、分子もしくは巨大分子種を意味し、特に、該
分離媒体内で動電的移動中に完全または部分的に分離されることが好ましい、核
酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）、化学合成もしくは修飾により得ら
れる核酸類似体、タンパク質、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖類のよ
うな生物学的巨大分子でもよい。

【００３６】 本発明の目的において「ポリマーセグメント」または「セグメント」という表
現は、互いに共有結合しており、かつ特定の物性（特に、溶媒和に関して）を有
するモノマーのセットを意味する。本発明の目的においてポリマーセグメントの
１つの例は、すべて同一であるモノマーの鎖（ホモポリマーセグメント）、また
は数モノマー以上の長さで組成に有意な相関を示さないコポリマー（ランダムコ
ポリマー型のセグメント）である。

【００３７】 本発明の目的においてブロックコポリマーという表現は、互いに共有結合した
、大きく異なる組成を有するポリマーセグメントからなるコポリマーを意味する
。ブロックコポリマーは、各セグメントが、電解質中で物理化学的、特に、同じ
組成と同じサイズを有するホモポリマーに匹敵する溶媒和性を示すように、充分
な数のモノマーを含有するという事実により規定される。これは、種々の型のモ
ノマーが互いに、基本的にランダムにつながり、問題の種のそれぞれのホモポリ
マーとは異なる鎖上の全体的性質を局所的に付与する、ランダムポリマーとは区
別することができる。このブロック性を得るのに必要なホモポリマーセグメント
のサイズは、モノマーと電解質の型により変化するが、典型的には該セグメント
の骨格に沿った数十個の原子である。本発明の意味においてブロックコポリマー
を構成することが可能であり、ここで、セグメント毎に物理化学（特に、溶媒和
）的性質に有意な変化を生み出すのに充分な、サイズと化学組成の差を有するゾ
ーンまたはセグメントを区別することができる限り、セグメント自身の一部また
はすべてはランダム型のコポリマーからなる。最後に、ブロックポリマーにおい
て「非隣接ポリマーセグメント」という表現は、異なる性質のポリマーセグメン
トにより互いに結合した２つのセグメントを意味する。

【００３８】 本発明に適したブロックコポリマーは、その構造内に少なくとも２つの型のセ
グメントを組合せているという特徴を有する。

【００３９】 最初の型のセグメントは、特許請求される媒体を使用するための２つの温度Ｔ
１とＴ２で分離に使用される電解質に可溶性であり、好ましくは、該電解質中で
ＬＣＳＴを示さない。本発明において可溶性という用語は、温度Ｔ１とＴ２での
電解質中の溶解性を意味する。

【００４０】 一方、第２の型のセグメントは、分離に使用される電解質中でＬＣＳＴを付与
される。さらに詳しくは、この型のセグメントは、該電解質中に、低温の範囲で
基本的に可溶性であり、高温の範囲で該電解質に基本的に不溶性である。これら
の２つの温度範囲の限界は、「最小脱混合温度（minimum demixing temperature
）」またはより一般的には「ＬＣＳＴ」と呼ぶ。

【００４１】 この構造レベルでＬＣＳＴを有するこれらのセグメントが存在するために、本
発明で使用されるコポリマーは、低温では、その中では種々のポリマー分子間の
相互作用は基本的に反発性である巨視的に均質な絡み合った溶液を構成し、そし
て温度の上昇により、その部分の間で引力が発生して、鎖間のもつれをほどく引
力を強化する性質を有する。

【００４２】 本発明の好適な実施態様において、ＬＣＳＴを有するセグメントのコポリマー
当たりの平均数は、２より大きく、好ましくは５より大きく、さらに好ましくは
８〜４０である。引きつける形で相互作用することができるこの大きな数のセグ
メントのために、あるコポリマーは、無数の他のコポリマーと相互作用し、これ
は、分析物の通過中に媒体に強い耐性を付与する。

【００４３】 従って本発明の媒体で使用されるコポリマー中に存在するＬＣＳＴを有するセ
グメントの長さと数ならびにその化学的性質は、本発明において大きく変動し、
従って、実施例でさらに正確に示されるように、該媒体の粘弾性は、所望の応用
に応じて大きく変動することになる。

【００４４】 従って本発明の媒体は、熱増粘性を生成するのに適している。本発明の目的に
おいて「熱増粘性」とは、熱粘性化または熱ゲル化を有する媒体を意味する。

【００４５】 通常の使用法に従って熱粘性化という用語は、使用される温度範囲で、巨視的
容器中で容易な取り扱いに適合する時間（約３０秒未満）流動することができる
状態にとどまる媒体を意味する。これに対して、「ゲル型状態」という表現は、
同じ条件下で有意に流動することができない媒体を意味する。

【００４６】 同様に熱粘性化という用語は、使用される温度範囲で、温度の変化速度（毛細
管電気泳動で通常かつ便利に使用される温度の変化速度、すなわち１℃／分〜約
１０℃／分のオーダー）の関数として、その性質のヒステリシスまたはその性質
の大きな依存性を示さない媒体を意味する。一方、「熱ゲル化媒体」という表現
、または同様に「ゲル型の状態を生成する媒体」という表現は、これらの条件下
で、２０，０００cpより大きい粘性を有するその性質のヒステリシスを示す媒体
を意味する。

【００４７】 ２つの連続的分離の間の時間を最小にするために好ましい自動化法に特に適し
た好適な実施態様において、本発明の媒体は熱粘性化型である。

【００４８】 これに対して、別の好適な実施態様において、分離間の長い待ち時間が許容さ
れ、かつ分析物の通過に対するマトリックスの最大の耐性が所望の場合は、温度
Ｔ２でゲル型状態を生成する本発明の媒体が好ましい。

【００４９】 本発明の好適な実施態様において、ＬＣＳＴを有するセグメントのすべてまた
は一部またはかなりの部分は、その骨格に沿って、７５より大きい平均原子数、
または２，５００より大きい分子量、好ましくは４，５００より大きい分子量を
有する。

【００５０】 本発明の目的において「かなりの部分」またはその略した型「すべてまたは一
部」という表現は、温度の上昇により、少なくとも１００％高い粘性の上昇、ま
たは同様の方法で２倍粘度の上昇を引き起こす割合を意味する。

【００５１】 本発明を実施するための最適化されたコポリマーは、ＬＣＳＴを有するセグメ
ントのセットが、該コポリマーの全平均モル質量の２〜２５％、好ましくは５〜
１５％、さらに好ましくは８〜１５％、またはモノマーのモル数としてコポリマ
ーの総組成の３〜２０％、好ましくは５〜１０％であるものである。

【００５２】 特許請求される分離媒体は、同一のまたは異なる化学的性質を有し、温度Ｔ１
とＴ２で電解質中に基本的に可溶性であるかまたは溶媒和する共通の性質を示す
１つまたは複数のセグメントからなる骨格を含み、ここに、同一のまたは異なる
化学的性質を有し、温度Ｔ１で電解質中に基本的に可溶性であるかまたは溶媒和
し、温度Ｔ２で電解質中で基本的に不溶性であるかまたはあまり溶媒和しない共
通の性質を示す複数のセグメントが共有結合している、ブロックコポリマーのセ
ットを含むことが有利である。

【００５３】 直接連結されてなく、分離条件下で可逆的な熱増粘性を発生する複数のセグメ
ントを有するなら、この型のコポリマーのすべての種類の構造を、本発明の実施
に使用することができる。

【００５４】 本発明のコポリマーが取る種々の構造の例として、最も好ましくは、該コポリ
マーのすべてまたは一部が：

【００５５】 ・線形ブロックポリマーの形で、

【００５６】 ・そのセグメントが、温度Ｔ１とＴ２などで電解質中で可溶性の１つ以上のセ
グメントからなる櫛型コポリマーの形で、

【００５７】 ・分岐した形で、 存在するものがある。

【００５８】 線形ブロックポリマー構造において、ＬＣＳＴを有するセグメントは２より大
きい数で存在し、基本的に線形の骨格に沿って、ＬＣＳＴを持たないポリマーセ
グメントにより互いに分離されている。後者のセグメントの長さは、本発明にお
いて、比較的均一であるかまたは反対に不定であり、後者が好ましい。

【００５９】 実際、温度Ｔ１とＴ２で電解質中に基本的に可溶性である骨格で、温度Ｔ１で
電解質中に基本的に可溶性であり、温度Ｔ２で電解質中に不溶性である、複数の
側枝メンバーを有する骨格を有する、櫛型ポリマーの型のブロックポリマーを選
択することが特に有利である。好適な実施態様において、ＬＣＳＴを有する該側
枝メンバーは、骨格に沿ってランダムすなわち不規則に並べられる。

【００６０】 この第２の型のポリマーがＬＣＳＴより上では収縮し、従って本発明を実施す
るのに必要な位相的な障害物の連続したネットワークを作り出すことができない
限り、この実施態様は一般に、親水性グラフトを有するＬＣＳＴを有するセグメ
ントからなる主鎖からなるポリマーを含む反対の構造より好ましい。

【００６１】 電解質中で可溶性のセグメントとＬＣＳＴの無い親水性セグメントとからなる
ブロックポリマーは、熱流動化を形成しないため、そのようなポリマーでは本発
明を実施することはできないことに注意されたい。

【００６２】 本発明において特に好適なものは、以下の条件の少なくとも１つを満足する分
離媒体である：

【００６３】 ・コポリマーの全部または一部が、可溶性セグメントとＬＣＳＴを有するセグ
メントとの２個の連続する結合点の間の、可溶性セグメントのセクションに沿っ
て、２１０より大きい平均原子数を有する；

【００６４】 ・コポリマーの全部または一部が、３０，０００より大きい分子量、または主
骨格に沿って２，０００より大きい原子数を有する、および

【００６５】 ・コポリマーの全部または一部が、５０，０００〜３，０００，０００の分子
量、または主骨格に沿って２，５００〜１００，０００の原子数を有する、およ
び／または

【００６６】 ・ＬＣＳＴを有するセグメントの鎖あたりの平均数が、４より大きいかまたは
等しい、そして好ましくは５〜１００である。

【００６７】 温度Ｔ１およびＴ２で可溶性のポリマーセグメントが、ポリエーテル、ポリエ
ステル（例えば、ポリグリコール酸）、ポリオキシアルキレンの可溶性ランダム
コポリマーおよびホモポリマー（例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブ
チレン、ポリオキシエチレン）、多糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド
、ポリスチレンスルホネート、該電解質に可溶性である置換または非置換ポリア
クリルアミドまたはポリメタクリルアミドから選択される、少なくとも１つのポ
リマーからなる、コポリマーを使用することが、本発明の実施に特に好ましい。

【００６８】 ポリアクリルアミドまたはポリメタクリルアミドの例として、ポリアクリルア
ミド、ポリアクリル酸、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）およびポリア
クリロイルアミドプロパノールがある。

【００６９】 もちろん電解質に可溶性の他のポリマーは、可溶性セグメントとして本発明に
従って、特定の応用および所望の構造を有するブロックポリマーへこれらの導入
のしやすさに従って、使用される。

【００７０】 可溶性セグメントが、２つの温度Ｔ１とＴ２で電解質中で高溶媒和を有するこ
とがより好ましい。

【００７１】 企図される電解質、実施のためのＴ１とＴ２の好適な温度、および分離すべき
分析物に従って、本発明で使用できるブロックコポリマー内に、ＬＣＳＴを有す
る非隣接性セグメントを構成する無数の型のポリマーが選択される。ＬＣＳＴを
有する無数のポリマーは当業者に公知であり、特に水性媒体中のものがある。"P
olymer Handbook" Brandrupt & Immergut, Johy Wiley, New York を参照された
い。

【００７２】 本発明の好適な実施態様において、ＬＣＳＴを有するポリマーセグメントのす
べてまたは一部は、下記から選択される１つまたはそれ以上のポリマーから誘導
される：

【００７３】 ・ポリビニルアルキルエーテル、例えばポリビニルメチルエーテル、

【００７４】 ・ヒドロキシアルキルセルロース、例えばヒドロキシエチルセルロースおよび
メチルセルロース、

【００７５】 ・ポリオキシアルキレンのような酸化エーテルのホモポリマー、例えばポリオ
キシプロピレンおよびポリオキシブチレン、

【００７６】 ・酸化エーテルのランダムおよびブロックコポリマー、例えばポリオキシエチ
レン／ポリオキシポリプロピレンおよびポリオキシエチレン／ポリオキシブチレ
ンのような、ＬＣＳＴを有するポリオキシアルキレン型のコポリマー、

【００７７】 ・アルキレンホモ−およびコポリマー、例えばブチレン−プロピレン、エチレ
ン−プロピレンおよびエチレン−ブチレン、および

【００７８】 ・アクリル酸およびメタクリル酸、アルキルアクリレートおよびメタクリレー
ト（例えば、ヒドロキシプロピルおよびヒドロキシエチルアクリル酸）、Ｎ−ア
ルキル−アクリルアミドまたは−メタクリルアミド（例えば、Ｎ−エチルアクリ
ルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ’，Ｎ−ジアルキル−アクリル
アミドまたは−メタクリルアミド）、アリール−アクリルアミドまたは−メタク
リルアミド、およびアルキルアリール−アクリルアミドまたは−メタクリルアミ
ドから選択されるモノマーのホモ重合または共重合から得られるポリアクリル酸
誘導体。

【００７９】 さらに好ましくは、本発明で使用されるコポリマーは、アクリル酸およびメタ
クリル酸、Ｎ−アルキル−アクリルアミドまたは−メタクリルアミド（例えば、
Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、アリール−ア
クリルアミドまたは−メタクリルアミド、およびアルキルアリール−アクリルア
ミドまたは−メタクリルアミドから選択されるモノマーのホモ重合または共重合
から得られる、ＬＣＳＴ性を有する少なくとも２つの非隣接性セグメントを含ん
でなる。

【００８０】 すなわち、例えばＬＣＳＴを有するセグメントとして、特に限定されないが、
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、Ｎ−イソプロピルメタクリル
アミド、Ｎ，Ｎ’−ジエチルアクリルアミド、またはこれらのモノマーと互いの
、または他とのランダムコポリマーを使用することが可能である。

【００８１】 以下のコポリマーが本発明に特に適している：

【００８２】 ・骨格が、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノールまた
はジメタクリルアミドを含む型のものであり、その上に、ポリ（Ｎ−アルキルま
たはＮ，Ｎ−ジアルキル）アクリルアミド型、好ましくはポリ（Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミド）型の側枝セグメント、またはランダムもしくはブロックのポ
リオキシエチレン／オキシプロピレンコポリマーもしくはポリオキシプロピレン
型の側枝セグメント、またはより一般的にはポリエーテル型の側枝セグメント（
これは、ポリオキシエチレンより疎水性であることが顕著である）がグラフトさ
れている、櫛形コポリマー型のコポリマー、

【００８３】 ・骨格に沿って、交互のポリオキシエチレン型のセグメントとポリオキシプロ
ピレン型のセグメント、または交互のポリオキシエチレン型のセグメントとポリ
オキシブチレン型のセグメント、またはより一般的には交互のポリエチレンのセ
グメントとポリオキシエチレンよりも疎水性の大きなポリエーテル型のセグメン
トを示す、ブロックコポリマー型のコポリマー

【００８４】 例えば、特許請求される分離媒体において、コポリマーとして、ポリアクリル
アミド／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ）；ポ
リビニルアルコール／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＶＡ−ＮＩ
ＰＡＭ）、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン、ポリアクリルアミド／
オキシエチレン−オキシプロピレンコポリマー、ポリアクリルアミド／ポリオキ
シプロピレン、ポリアクリル酸／ポリオキシプロピレン、ポリアクリル酸／オキ
シエチレン−オキシプロピレンコポリマー、ポリアクリル酸／ポリ（Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミド）およびポリジメチルアクリルアミド／ポリ（Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＭ−ＮＩＰＡＭ）から選択されるコポリマー
を使用することができる。

【００８５】 ポリアクリルアミド骨格に沿って、基本的にポリ−ＮＩＰＡＭからなるＬＣＳ
Ｔを有するセグメントを有する櫛型コポリマーと、その骨格に沿って、３５〜６
００の炭素原子数と２５％を超えない総質量画分とを、含んでなる媒体を有利に
使用することができる。

【００８６】 大多数の応用において、特に荷電分析物の分離のための応用においては、基本
的に中性である本発明のポリマーを使用することが好ましいことにも注意された
い。しかしある応用では、特に弱く荷電しているかまたは非荷電の分析物もしく
はポリマーと結合しやすい分析物の分離のための応用においては、意図的に荷電
している本発明のポリマーを選択することが有用である。例えば、重合したアク
リルアミドの実質的な部分を、温度Ｔ１とＴ２で電解質に可溶性のセグメント中
に存在させることにより、この型のポリマーを便利に調製することができる。こ
の型のコポリマーは、後述の実施例１０により詳細に記載される。

【００８７】 特に媒体中のコポリマー濃度について、これは一般的に２０ｇ／１００重量ml
未満である。ＤＮＡ配列決定応用については、これは好ましくは約１〜８ｇ／１
００重量mlである。

【００８８】 本発明の具体的な実施態様において、該媒体中で使用されるコポリマーは、５
ｇ／１００重量mlのオーダーの濃度、好ましくは２ｇ／１００重量mlのオーダー
から、該媒体を、温度Ｔ１で得られる粘性状態Ｖ１から、Ｔ１より少なくとも２
０℃高い温度Ｔ２で得られる、Ｖ１より少なくとも１００％大きい粘性状態Ｖ２
に、可逆的に移行することができることが好ましい。

【００８９】 また本発明の好適な実施態様において、粘性Ｖ２は、粘性Ｖ１より少なくとも
５倍大きい。

【００９０】 本発明において使用されるコポリマーの調製において、これは従来法の重合ま
たは重縮合法により行われる。調製法の選択は、一般的にコポリマーについて所
望の構造（すなわち櫛型、線形、または分岐構造）とそれを構成する種々のブロ
ックの化学的性質を考慮しながら行われる。

【００９１】 これらの調製態様の例示のために、特に、該コポリマーが得られる方法は以下
の通りである：

【００９２】 ・同一または異なるモノマーの、同一または異なる巨大モノマーの、または同
一または異なるモノマーと巨大分子モノマーの、イオン性またはフリーラジカル
ポリ縮合、重合または共重合、あるいは

【００９３】 ・基本的に可溶性型の直鎖または分岐鎖ポリマー骨格に、ＬＣＳＴを有するい
くつかのポリマーセグメントのグラフト、または基本的に可溶性型の直鎖もしく
は分岐鎖ポリマー骨格から、ＬＣＳＴを有するポリマー側枝セグメントの重合。

【００９４】 好ましくは本発明で使用されるコポリマーのすべてまたは一部は、以下により
得られる：

【００９５】 ａ）その末端の少なくとも１つに反応性官能基を含んでなる、基本的に可溶性
型であるモノマー、および基本的にＬＣＳＴを有する型である巨大モノマーの共
重合、または

【００９６】 ｂ）その末端の少なくとも１つに反応性官能基を含んでなる、基本的にＬＣＳ
Ｔを有する型である巨大モノマー、およびその構造中に少なくとも１つに反応性
官能基を含んでなる、基本的に可溶性型である巨大モノマーの共重合。

【００９７】 本発明の目的において反応性官能基という表現は、この基を有する分子が、共
重合反応中に、該共重合を妨害することなく、巨大分子中に組み込まれることを
可能にする基を意味する。

【００９８】 上記の好適な方法および規則を使用して、当業者は、本発明に従って、該ポリ
マーの構造、性質および調製法を、種々の応用に所望の分離性に適合させること
により、コポリマーを調製することができる。

【００９９】 特許請求される分離媒体の非限定例として、特に以下の媒体が言及される：

【０１００】 ・１５〜３０℃の温度Ｔ１での５０〜１，０００mPa.m^-1.s^-1の粘性Ｖ１から
、４０℃のオーダーまたはこれより高い温度Ｔ２でのＶ１よりも２〜５０倍大き
い粘性Ｖ２まで移行する媒体で、かつ

【０１０１】 ・３０，０００〜２，０００，０００の平均分子量、または主骨格に沿った１
，０００〜６０，０００の原子数、

【０１０２】 ・２％〜２０％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および

【０１０３】 ・２，０００〜２０，０００の、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量、
または３５〜３５０の、ＬＣＳＴを有するセグメントに沿った平均原子数 を有する５g/１００ml〜２０g/１００mlのコポリマーを含む媒体；

【０１０４】 ・１５〜３０℃の温度Ｔ１での１００〜１，０００mPa.m^-1.s^-1の粘性Ｖ１か
ら、４０℃より高い温度Ｔ２でのＶ１よりも２〜１００倍大きい粘性Ｖ２まで移
行する媒体で、かつ

【０１０５】 ・５００，０００〜５，０００，０００の平均分子量、または主骨格に沿った
７，０００〜９０，０００の原子数、

【０１０６】 ・２．５％〜１５％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および

【０１０７】 ・４，０００〜３０，０００の、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量、
または６０〜６００の、ＬＣＳＴを有するセグメントに沿った平均原子数 を有する１g/１００ml〜８０g/１００mlのコポリマーを含む媒体；および

【０１０８】 ・１５〜３０℃の温度Ｔ１での１００〜１０，０００mPa.m^-1.s^-1の粘性Ｖ１
から、４０℃より高い温度Ｔ２でのＶ１よりも２〜１００倍大きい粘性Ｖ２まで
移行する媒体で、かつ

【０１０９】 ・５００，０００より大きい平均分子量、または主骨格に沿った７，０００よ
り大きい原子数、

【０１１０】 ・２％〜１５％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および

【０１１１】 ・４，０００より大きい、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量、または
９０より大きい、ＬＣＳＴを有するセグメントに沿った平均原子数 を有する０．１g/１００ml〜５g/１００mlのコポリマーを含む媒体；

【０１１２】 本発明の説明において、粘性は１０s^-1の剪断速度で得られるものである。

【０１１３】 また本発明において、熱増粘性を有するコポリマー以外に、これらの性質を示
さない他の種、例えば特に水溶性ポリマー、非熱増粘性結合性ポリマー、または
他の中性もしくはイオン性界面活性剤を、分離媒体中に含めることができるが、
ただし、これらの補助剤は、分離媒体中で脱混合を起こしたり、または可逆的熱
増粘性を喪失させたりしないものである。かかる補助剤は、該媒体の性質および
／または分離能力を調節するのに有利である。ある界面活性剤の添加は、ポリマ
ー間の結合を強化し、従って熱増粘性を強化することがあることが特に知られて
いる。また、本発明とは異なる文脈で公知のように、全体の粘性に悪影響を与え
ることなく、混合物中に含有される最も小さい分析物の分離を増強するために、
低分子量の結合性または非結合性ポリマーを媒体に加えることも有効である。

【０１１４】 本発明の主題はまた、分子種または巨大分子種、および特に核酸（ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、オリゴヌクレオチド）、化学合成もしくは修飾により得られる核酸類似体
、タンパク質、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖類のような生物学的巨
大分子、有機分子、合成巨大分子、または鉱物粒子、ラテックス、細胞もしくは
細胞小器官のような粒子からの種の分離または分析のための、上記で定義した分
離媒体の使用である。

【０１１５】 これは、ＤＮＡの配列決定に特に有用であり、高粘性、高温（ここでは、圧縮
の分離が良好であり、分離は迅速である）に関連する最適分離条件を得ることを
可能にし、一方、室温で、ＤＮＡの容易な注入を可能にする適度な粘性を維持す
る。

【０１１６】 しかし、温度を変化させて媒体の粘性を大きく変化させる本発明による可能性
は、他の応用にも有利である。

【０１１７】 これは、毛細管またはマイクロチャネルに含有される媒体の剛性または粘性の
増加が好ましい場合にいつも有利である。例えば高粘性は、パルスフィールド中
の大きなＤＮＡの不充分な分離の原因である電磁流体力学的作用を低下させるこ
とができ、より一般的には、毛細管またはマイクロチャネル中の電磁流体力学的
流れを低下させる。

【０１１８】 また、本発明の媒体は一般に、温度の変化によりその有効作用を最大限に発揮
するが、これらはまた、一定温度での使用にも適している。すなわちこれらは、
同じ温度で分析物の分離チャネルへの導入および連続的分離に適している。これ
は、特に分離チャネルに高粘性の媒体を導入することができ、および／またはチ
ャネルへの該媒体の導入と分析物の分離との間の温度を容易に変更することが不
可能な装置が入手できるなら、特に有利である。

【０１１９】 本発明の媒体により可能となる高粘性の別の利点は、これらが、当業者に公知
の電気浸透を抑制するための他の方法（例えば、毛細管の壁に対して親和性を有
するポリマーの使用、またはその表面への中性の親水性ポリマーのグラルト）を
使用する必要がなく、電気浸透（例えば、Belloら, Electrophorresis 15, 623,
1994を参照）を低下させることである。もし本発明の媒体により与えられる電
気浸透の抑制または分析物と壁との相互作用の抑制が、特定の応用において充分
ではないなら、本発明を、当業者に公知の方法の１つと組合せて、こうして、単
独で使用されるこれらの方法で得られるものより優れた性質を得ることができる
。

【０１２０】 本発明のコポリマーおよびその熱増粘性作用が、異なるサイズの種の分離によ
り詳細に最適化されているコポリマーの選択により、特許請求される媒体の分離
性を調節することが可能である。

【０１２１】 本発明により利用できるこの型の適合の例として、特に、以下が可能である：

【０１２２】 ・５０，０００未満の分子量を有する分子、または１００個未満のヌクレオチ
ドを含むオリゴヌクレオチド、または未変性もしくは変性タンパク質を、１５〜
３０℃の温度Ｔ１での５０〜１，０００mPa.m^-1.s^-1の粘性Ｖ１から、４０℃の
オーダーまたはこれより高い温度Ｔ２でのＶ１よりも２〜５０倍大きい粘性Ｖ２
まで移行する媒体で、かつ

【０１２３】 ・３０，０００〜２，０００，０００の平均分子量、または主骨格に沿った１
，０００〜６０，０００の原子数、

【０１２４】 ・２％〜２０％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および

【０１２５】 ・２，０００〜２０，０００の、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量、
または３５〜３５０の、ＬＣＳＴを有するセグメントに沿った平均原子数 を有する５g/１００ml〜２０g/１００mlのコポリマーを含む媒体で、分離するこ
と；

【０１２６】 ・ＤＮＡ配列の反応の産物、１，０００塩基対未満のＤＮＡ２本鎖、変性タン
パク質または２０，０００〜１０，０００，０００の分子量を有する合成もしく
は天然ポリマーを、１５〜３０℃の温度Ｔ１での１００〜１，０００mPa.m^-1.s^{- 1} の粘性Ｖ１から、４０℃より高い温度Ｔ２でのＶ１よりも２〜１００倍大きい
粘性Ｖ２まで移行する媒体で、かつ

【０１２７】 ・５００，０００〜５，０００，０００の平均分子量、または主骨格に沿った
７，０００〜６０，０００の原子数、

【０１２８】 ・２．５％〜１５％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および

【０１２９】 ・４，０００〜３０，０００の、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量、
または６０〜６００の、ＬＣＳＴを有するセグメントに沿った平均原子数 を有する１g/１００ml〜８０g/１００mlのコポリマーを含む媒体で、分離するこ
と；および

【０１３０】 ・５００塩基〜数百万の塩基対の大きさを有するＤＮＡ２本鎖、またはラテッ
クス、細胞全体、染色体全体もしくは細胞小器官のような粒子を、１５〜３０℃
の温度Ｔ１での１００〜１０，０００mPa.m^-1.s^-1の粘性Ｖ１から、４０℃より
高い温度Ｔ２でのＶ１よりも２〜１００倍大きい粘性Ｖ２まで移行する媒体で、
かつ

【０１３１】 ・５００，０００より大きい平均分子量、または主骨格に沿った７，０００よ
り大きい原子数、

【０１３２】 ・２％〜１５％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および

【０１３３】 ・４，０００より大きい、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量、または
９０より大きい、ＬＣＳＴを有するセグメントに沿った平均原子数 を有する０．１g/１００ml〜５g/１００mlのコポリマーを含む媒体で、分離する
こと。

【０１３４】 さらに好ましくは、これらの媒体は、以下から選択されるコポリマーのセット
を含んでなる：

【０１３５】 ・骨格が、アクリルアミド、アクリロイルアミノエタノールまたはジメタクリ
ルアミド型のものであり、その上に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）
型の側枝セグメントがグラフトされている、櫛形コポリマー型のコポリマー、お
よび

【０１３６】 ・骨格に沿って、交互のポリオキシエチレン型のブロックとポリオキシプロピ
レン型のブロック、または交互のポリオキシエチレン型のブロックとポリオキシ
ブチレン型のブロック、または交互の可溶性ポリオキシアルキレン型のブロック
とＬＣＳＴを有するポリオキシアルキレンブロックを示す、ブロックコポリマー
型のコポリマー。

【０１３７】 特許請求される分離媒体を使用する方法の例として、特に以下を含んでなるも
のが提唱される：

【０１３８】 ・分離すべき種の性状に従って本発明の分離媒体を選択する工程；

【０１３９】 ・この媒体を電気泳動装置の分離チャネルに、その分離媒体を構成するのに十
分な量で導入する工程；

【０１４０】 ・試料の導入の前または後のいずれかに、かなりの割合のチャネルを温度Ｔ２
にする工程；

【０１４１】 ・ある量の試料を分離チャネルの入口に導入する工程；

【０１４２】 ・チャネルのサーモスタット調温部においてＴ２のオーダーの温度で分離を行
う工程；そして

【０１４３】 ・当初試料中に含まれる分析物の泳動を検出する工程

【０１４４】 この検出は、当業者の能力内の従来法を使用するため、本明細書では詳述しな
い。

【０１４５】 特許請求される媒体の使用はまた、分離工程中に温度が変更される変更態様も
含み（該温度の変更態様は、媒体の熱増粘が前述のように行われる温度Ｔ２また
は温度Ｔ２の範囲を含むため）、また上記サイクルが（好ましくは自動化されて
）任意の回数繰り返される変更態様もカバーすることを注意されたい。

【０１４６】 実際、自動動電的分離は、分離チャネルの自動充填を容易かつ迅速にするため
、本発明は自動動電的分離の場合に特に有利である。さらに試料の導入は、本発
明において、分離チャネルのかなりの部分を温度Ｔ２に加熱する前、その最中、
またはその後に、行っても良い。

【０１４７】 本発明の主題はまた、分離媒体として本発明の媒体を使用する、チップに基づ
く毛細管電気泳動装置である。これは、「チップベース」またはエッチングされ
たマイクロチャネルベースと呼ぶ電気泳動装置の場合に特に有用であり、これは
、一般に、これらの装置が、円筒形毛細管より、分離媒体を導入するための高圧
弁の適用を許容することが困難なためである。

【０１４８】 本発明の媒体およびこれらの媒体を使用する分離法は、診断、遺伝子タイピン
グ、高処理量スクリーニング、および品質管理用途、または生成物中の遺伝子修
飾した生物の存在を検出するのに、特に有効である。

【０１４９】 以下の図と実施例は、本発明の非限定例として提示される。

【０１５０】 実施例１： 本発明による熱ゲル化コポリマーの調製のための、官能基化されていない１０，
０００の領域の分子量を有する、ｐＮＩＰＡＭのＬＣＳＴを有する巨大モノマー
の調製。

【０１５１】 １）ＮＩＰＡＭの重合 ＮＩＰＡＭのラジカル重合は、純水中で室温よりわずかに高いがポリマーのＬ
ＣＳＴより低い温度で行われる。開始剤は、酸化剤が、過硫酸カリウム、Ｋ₂Ｓ₂ Ｏ₈（ＫＰＳ）であり、そして還元剤が、アミノエタンチオール、ＡＥＴ．ＨＣ
ｌである、レドックス対である。プライミング反応は、以下である：

【０１５２】 Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₈ ＋ ２Ｃｌ^-，ＮＨ₃ ⁺−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＳＨ → ２ＫＨＳＯ₄ ＋
２Ｃｌ^-，ＨＮ₃ ⁺−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ^.

【０１５３】 ＡＥＴ．ＨＣｌはまた、鎖の長さを制御可能にする転移剤の役割を演じる。

【０１５４】 方法 ２０ｇのＮＩＰＡＭ（０．１８mol）および２００mlの水を、冷却器を載せ、
かつ窒素を入れるための装置を取り付けた５００ml三つ口フラスコ中に導入する
。次に混合物を撹拌して、水浴で２９℃まで加熱する。窒素のバブリングを開始
する。４５分後、前もって２０mlの水に溶解した０．４２ｇのＡＥＴ．ＨＣｌ（
０．００３７mol）を加え、続いて最少量の水に溶解した０．００１８molの過硫
酸カリウム（ＫＰＳ）を加える。混合物を３時間撹拌し続ける。次に溶液を濃縮
し、次いで凍結乾燥する。

【０１５５】 ポリマーを単離するために、以下の方法により沈殿を行う：

【０１５６】 得られる固体を１００mlのメタノールに再溶解し、０．００３７molのＫＯＨ
（これは、０．２０８ｇを約２５mlのメタノールに溶解した）を滴下して加え、
存在する塩酸塩を中和する。生成した塩のＫＣｌが沈殿し、これをろ過して抽出
する。こうして回収されるろ液を濃縮し、次に４リットルのエーテル中に滴下し
て注ぎ入れる。ポリマーが沈殿し、これを４番焼結ガラスでろ過して回収する。
次に固体を、スライド翼回転真空ポンプで作られる真空下で乾燥する。質量収率
は、５０％のオーダーである。

【０１５７】 上記プロトコールによりアミノ化ポリマーの「ＰＮＩＰＡＭ−Ａ−１０」が得
られ、そしてこのプロトコールは、開始剤−モノマー比Ｒｏ＝０．０２およびＡ
ｏ＝０．０１に相当し、ここで、

【０１５８】 Ｒｏ＝［Ｒ−ＳＨ］／［ＮＩＰＡＭ］、そしてＡｏ＝［ＫＰＳ］／［ＮＩＰＡＭ
］。

【０１５９】 他の種々のアミノ化ポリマーは、０．０１の比Ａｏを維持しながら、重合温度
および比Ｒｏを変化させることにより、同じプロトコールによって調製した。こ
れらのポリマーは、表１に記載され定義される。

【０１６０】 ２）温度Ｔ１およびＴ２で可溶性の１つまたはそれ以上のセグメントとの共重合
のための、アミノ化ＰＮＩＰＡＭの修飾

【０１６１】 合成されるＰＮＩＰＡＭ高分子は、鎖の末端にアミン官能基を持つが、これは
、開始剤のアミノエタンチオールＡＥＴ．ＨＣｌから誘導される。

【０１６２】 アミン官能基をアクリル酸と反応させることにより、ビニル二重結合は、以下
の反応スキームにより鎖の末端に結合する：

【０１６３】

【化１】

【０１６４】 方法 ５０mlの塩化メチレン、１．５ｇのアクリル酸（０．０２１mol）、９ｇのＰ
ＮＩＰＡＭおよび４．３ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＰ）（０
．２１mol）を１００mlのビーカーに入れる。

【０１６５】 反応媒体を１時間撹拌する。アクリル酸は、ＰＮＩＰＡＭに比較して大過剰で
あるため（アクリル酸の量は、ＰＮＩＰＡＭの約２０倍である）、全てのアミノ
官能基が修飾されていると仮定することができ、これは、実施例２に記載される
共重合により確認される。次に、ＤＣＣＩの変換から生じる副産物であるジシク
ロヘキシル尿素沈殿物を除去するために、混合物を４番焼結ガラスでろ過する。

【０１６６】 次に混合物を１５mlまで濃縮し、次いでポリマーを沈殿させるために、２００
mlのエーテル中に滴下して注ぎ入れる。混合物を４番焼結ガラスでろ過して、固
体を１００mlのエーテルで３回洗浄し、次にこれをスライド翼回転真空ポンプに
より作られる真空下で一晩乾燥する。

【０１６７】 こうして鎖末端にアリル官能基を有するポリ−（ＮＩＰＡＭ）巨大モノマーが
、７０％のオーダーの質量収率で得られる。

【０１６８】 こうして調製される巨大モノマーのモル質量は、ＳＥＣ（立体排除クロマトグ
ラフィー（steric exclusion chromatography））により以下の条件下で測定し
た：

【０１６９】 ａ：２０℃の０．５Ｍ ＬｉＮＯ₃水溶液、直列の２５cmの４個のショーデック
スパック（Shodex Pack）Ｂ８０３〜Ｂ８０６カラムを屈折率測定による検出お
よびＰＯＥ標準と比較した分子量の較正と共に使用する

【０１７０】 ｂ：４０℃でＴＨＦ中で、ウルトラスチラゲル（ultrastyragel）カラムにより
、二重屈折率測定による検出およびポリスチレン試料と比較した万能較正。一方
では万能較正が、試験すべきポリマーの鎖と標準との間の可撓性の違いを無いも
のとするため、そして他方ではＴＨＦが、水よりもＰＮＩＰＡＭにとって良好な
溶媒であるため、この第２様式の測定が、より正確である。

【０１７１】

【表１】

【０１７２】 これらの結果は、重合温度、および開始剤／ポリマー比Ｒｏを変化させること
により、巨大モノマーの平均分子量を変化させることが可能であることを示して
いる（比Ｒｏが最も大きいと、分子量が最も小さくなる）。結果はまた、巨大モ
ノマーの多分散性値が高いこと、一般には２より大きいことを示している。

【０１７３】 実施例２： 櫛形構造を持ちＬＣＳＴを有するセグメントとして実施例１で調製されるＰＮＩ
ＰＡＭを含んでなる種々のコポリマーの調製。

【０１７４】 本実施例の目的は、実施例１で得られる巨大モノマーＰＮＩＰＡＭと水溶性型
モノマーとの共重合による、本発明のコポリマーの調製である。

【０１７５】 ａ）合成 この共重合は、水中で室温で行われる。使用される開始剤は、レドックス対の
過硫酸アンモニウム（（ＮＨ₄）₂Ｓ₂Ｏ₈）［２０g/l］−メタ重亜硫酸ナトリウ
ム（Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₅）である。こうして調製される全てのコポリマーは、アセトン
から沈殿させて精製するが、ただし、可溶性セグメントがジメチルアクリルアミ
ドＤＭＡＭからなるコポリマーＴ７は、限外ろ過および凍結乾燥により精製する
。

【０１７６】 合成される種々の重合体は、以下の表２に示されるが、そこで使用される試薬
の量が示す（カッコ内に示される）。

【０１７７】 表中： ・粘性は、水中５g/１００mlの溶液中のポリマーについて、一定のブルック
フィールド（Brookfield）ＬＤＶIII剪断速度のコーン−プレート粘度計を使用
して、１０ｓ^-1の剪断速度で、センチポアズ［ＳＩで表現すべき（TO BE EXPRES
SED IN SI）］で表現される；

【０１７８】 ・これらは、屈折率測定による検出を有する、直列の２５cmの４個のショーデ
ックスＯＨパック（Shodex OH Pack）Ｂ８０３〜Ｂ８０６カラムを使用して、２
０℃の０．５Ｍ ＬｉＮＯ₃水溶液中で測定した。カッコ内の値は、屈折率測定
による検出で、「ＰＯＥ同等」な値（ポリオキシエチレン標準と比較することに
より得られる）である。

【０１７９】 コポリマーＴ１０、およびここに記載していない同じファミリーの他のコポリ
マーも、多角形レーザー光散乱検出（「ミニドーン・ワイアット（MiniDawn Wya
tt）」）（絶対分子量を得ることを可能にする）を使用して、分子量に関して分
析した。「ＰＯＥ同等」として、同じポリマーの質量と比較することにより、表
２に示される全てのポリマーは絶対分子量が、ＰＯＥ同等の２倍のオーダーの質
量であると評価された：この推定値は、表中に太字で示される。

【０１８０】 コポリマーの平均分子量、ＬＣＳＴを有するセグメントまたは巨大モノマーの
分子量、およびコポリマーに組み込まれるＬＣＳＴを有するセグメントの質量比
率、表２中Ｎｓで表されるポリマーあたりのＬＣＳＴを有するセグメントの平均
数（質量平均値）を知るには、下記式により容易に導き出される：

【０１８１】 Ｎｓ＝ｆ Ｍｗ（コポリマー）／Ｍｗ（巨大モノマー）。

【０１８２】 ・太字の値は、最終コポリマー中のＬＣＳＴを有するセグメントの比率ｆ（質
量比率）を表す。

【０１８３】 表２に記載される全てのコポリマーは、熱増粘性を示す。

【０１８４】

【表２】

【０１８５】 以下に示す方法は、コポリマーＴ７の調製のために与えられる。他のコポリマ
ーのための方法は、試薬の性質と濃度、および場合により表２の反応温度を調節
することにより、ここから演繹できる。

【０１８６】 ＰＮＩＰＡＭ−１０およびモノマーさらに３０mlの蒸留水を、１００ml丸底フ
ラスコに導入する。この混合物を溶存二原子酸素を除去するために、窒素をバブ
リングしながら室温で２時間撹拌する。

【０１８７】 次に混合物を、サーモスタット調温浴を使用して、重合のために選択した温度
まで加熱して、次いで開始剤を、２０g/lの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₈の溶液および５g/l
のＮａ₂Ｓ₂Ｏ₅の溶液の形態（すなわちそれぞれ導入されるモノマーの量の０．
１mol％および０．０３mol％である）で加える。撹拌およびバブリングは４時間
維持する。

【０１８８】 開始剤を導入する前、次に重合中１時間毎に、立体排除クロマトグラフィーに
より反応の変化をモニターするために、反応媒体の試料を回収（０．１mlを５ml
のメタノールに希釈）する。

【０１８９】 一般に、反応媒体の粘性の上昇の目視により、事実上全収率で、反応が良好に
進行したことを確認することができる。

【０１９０】 ｂ）精製 ポリマーの精製は、骨格の性質に応じて様々に行われる。 骨格がＤＭＡＭからなるポリマーでは、以下の方法により限外ろ過を使用した
： 反応媒体を１リットルの水に希釈し、次にカットオフが１００，０００ダルト
ンである膜で限外ろ過する。次にポリマーの溶液を濃縮し、次いで凍結乾燥する
。 収率は、かなり変動するが、一般に約６０％である。

【０１９１】 アクリルアミド骨格の高分子は、以下の方法によりアセトンから沈殿させる： 反応媒体を、１リットルのアセトンからゆっくり沈殿させ、次に４番焼結ガラ
スでろ過して、１００mlのアセトンで３回洗浄する。固体を回収し、次にスライ
ド翼回転真空ポンプを使用して一晩乾燥する。 質量収率は、限外ろ過−凍結乾燥よりもはるかに高く、９０％に近い。

【０１９２】 巨大分子の取り込みのレベルは、重水中に２g/１００mlで希釈したポリマーで
プロトンＮＭＲによりチェックした（ブルーカー（Bruker）装置、２５０および
４００MHz）。取り込みレベルが、実験の変動を除くと、ＰＮＩＰＡＭの当初質
量と親水性モノマーの当初質量の間の比にのみ依存することがわかる。これはそ
れぞれ、２．８ｇのアクリルアミドあたり０．４ｇのＰＮＩＰＡＭの当初濃度で
は、６．５±０．３mol％、そして２．８ｇのアクリルアミドあたり０．８ｇの
ＰＮＩＰＡＭの当初濃度では、１２±１mol％である。

【０１９３】 実施例３： 実施例２で調製されるＤＭＡＭ／ＰＮＩＰＡＭおよびＡＭ／ＰＮＩＰＡＭコポリ
マーの温度の関数としての流動学的挙動の評価

【０１９４】 本実施例では、それぞれのコポリマーを５g/１００mlの量で精製水（ミリＱ（
MilliQ））中に導入した。それぞれの対応する溶液の粘性は、レオカルク（Rheo
calc）ソフトウェア（ソデキシム（Sodexim）、マイゾン（Muizon）、Ｆ））に
より制御されるブルックフィールド（Brookfield）ＤＶ３コーン−プレートレオ
メーターで測定した。選択される剪断速度は、１℃／分の温度勾配に対して１０
（1/s）である。得られる結果は、図１に表す。

【０１９５】 合成される種々のコポリマーが、実際に、本発明に使用することができる流動
学的性質を示すこと、そして特に、これらが温度Ｔ２で、Ｔ２よりも少なくとも
２０°低い温度Ｔ１で得られる粘性Ｖ１よりも、２倍を超えて（１００％）、し
ばしば１０倍のオーダー、そして６０倍までのこともある有意に高い粘性Ｖ２を
示すことを観察することができる。

【０１９６】 本実施例に記載されるポリマーでは、温度Ｔ１は、２０と４０℃の間であるか
、またはそれより低いこともあり、そして温度Ｔ２は、４５℃より高く、好まし
くは６０℃のオーダーである。

【０１９７】 また、ＰＮＩＰＡＭ巨大モノマーがない他は同じプロトコールにより対照とし
て調製され、従ってその構造中に本発明のコポリマーを特徴づけるＬＣＳＴを有
する多数のブロックを持ち得ないポリマーＴ１０ＡＡは、温度の関数として弱く
連続的に低下する粘性を示し、従って本発明の有益な効果を発揮できない。

【０１９８】 さらに、全てのコポリマーについて、および１分あたり１℃の温度変化の速度
で、有意なヒステリシスは観察されず、粘性曲線は、温度が上昇または下降する
ときと本質的に同一である。

【０１９９】 図１と表２を比較することにより、低温の粘性はコポリマーの分子量と高度に
相関することが注目される。また、熱増粘性挙動および温度に伴う粘性の上昇が
、鎖あたりのＬＣＳＴを有するセグメントの平均数Ｎｓと高度に相関することも
観察され、このパラメーターの最高値は、最高の熱増粘性効果に対応する。

【０２００】 図２ａは、例えば炭酸カリウムのようなイオン性電解質、あるいは配列測定に
使用されるようなトリス−ＴＡＰＳ ５０mM／尿素７Ｍ型の緩衝液中の、コポリ
マーＴ１０の流動学的挙動を例示する。

【０２０１】 図２ｂでは、コポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ Ｔ１０に基づく溶液の挙動を表
し、一方は３g/１００mlの濃度のコポリマーであり、もう一方は２g/１００mlの
濃度のコポリマーである。熱増粘性は、２g/１００mlから感受性であるが、３g/
１００mlで強化され、そしてさらに５g/１００ml（図１）でいっそう強化される
が、濃度はまた、本発明の媒体を特定の応用に適合させるために、有用な様式で
変化するパラメーターである。

【０２０２】 詳細には、表２に示されるポリマーの多くは、５g/１００ml以下の濃度では、
熱増粘性を示す、すなわちこれらは、温度が上昇および下降するとき有意なヒス
テリシスは示さず、そして容器を倒すと３０ｓ未満で流れ出ることが可能である
。 これに反してポリマーＴ１６は、８g/１００ml以上の濃度で６０℃でゲル型状
態になる。

【０２０３】 実施例４： コポリマーとして実施例２で調製されるコポリマーの１つを含む、毛細管電気泳
動のための分離媒体の分離の性質。

【０２０４】 本実施例および以下の実施例に与えられる電気泳動実験は、Lindbergら, Elec
trophoresis, 18, 1973 (1997)に記載されるのと類似した実験室で組立てた装置
を使用して行った。分離されるＤＮＡは、４８８nmでアルゴンレーザーにより励
起し、５３０±３０nmで発光する蛍光により検出される。注入は、動電学型のも
のである。ポリイミド（ポリマイクロ）により被覆される溶融シリカから作られ
、１００μm未満の直径を有する毛細管は、最初の２センチメートルと最後の２
センチメートルを除いて、注入の点と検出の点の間、密閉エンベロープ中のシリ
コーン油の循環により、サーモスタット調温されている（特に明記しない場合は
、この型の毛細管は、以下に与えられる電気泳動実験において使用される）。

【０２０５】 試験４−１ コポリマーとしてコポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ１５）を２g/１００mlの濃
度で含む媒体の分離性。

【０２０６】 媒体をトリス−ＴＡＰＳ緩衝液（５０mM）およびＤＮＡマーカー（ＳＹＢＲグ
リーンＩ（SYBR GREEN I）１０^-4として）と混合する。

【０２０７】 この特定のケースでは、毛細管の充填は２５℃で行い、注入は１センチメート
ルあたり２５ボルトで１０秒間かけて行い、そして分離すべき試料は、前記試験
のものと同じ性質のものである。

【０２０８】 該媒体の分離性は、２つの温度、２５℃と６０℃で評価し、そして図３ａと３
ｂは、これらの性質を示す。分離が、高い分離能を有しており、かつ６０℃では
さらに迅速であることが観察される。

【０２０９】 試験４−２ コポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ１２）に基づく分離媒体の分離性。

【０２１０】 媒体は、毛細管に２５℃で８g/１００mlの濃度で導入し、トリス−ＴＡＰＳ緩
衝液（５０mM）、および供給業者が売っている原液に対して１０^-4の比率で希釈
されたＤＮＡマーカーのＳＹＢＲグリーンＩ（分子プローブ）と混合する。分離
のために選択される温度が６０℃であるとき、分離能と分離時間の改善という類
似した挙動が示されている。

【０２１１】 また、大きな２本鎖ＤＮＡ断片の分離は、高レベルの転移剤により調製され低
い分子量を示すコポリマーＴ１２よりも、低レベルの転移剤により調製され従っ
て高い分子量を示すコポリマーＴ１５で良好なことが観察される。

【０２１２】 試験４−３ コポリマーとしてコポリマーＰＤＭＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ７）を２g/１００mlの
濃度で含む媒体の分離性。

【０２１３】 この媒体は、トリス−酢酸緩衝液（５０mM）およびＤＮＡマーカーのＳＹＢＲ
グリーンＩ １０^-4と混合する。

【０２１４】 この特定のケースでは、試料はマーカー「ファイ−Ｘ１７４−ＲＦ（Phi-X 17
4-RF）ＤＮＡ、ＨａｅIII消化物」（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biote
ch））であり、その断片は、７２〜１３５８bpの大きさであり、注入は１センチ
メートルあたり２０ボルトで５秒間かけて行い、そして分離すべき試料は、前記
試験と同じ性質のものである。

【０２１５】 該媒体の分離性は、２つの温度、２５℃と６０℃で評価し、そして図４ａと４
ｂは、これらの性質を示す。前記試験と同様に、分離が、高い分離能を有してお
りかつ高温ではさらに迅速であることが観察される。

【０２１６】 試験４−４ コポリマーとして巨大モノマーＰＮＩＰＡＭ−２０から調製されるコポリマーＰ
ＡＭ−ＮＩＰＡＭ Ｔ２１を２g/１００mlの濃度で含む媒体の分離性。

【０２１７】 媒体は、トリス−酢酸緩衝液（５０mM）と混合する。この分離媒体では、高温
での粘性が比較的低く、電気浸透を完全に抑制することはできない。したがって
、毛細管は、その使用の前に、１，０００，０００の分子量を有する１g/１００
mlのポリビニルピロリドン（ポリサイエンシーズ（Polysciences）、エッペルハ
イム（Eppelheim）、Ｄ））を含む１Ｍ塩酸溶液で洗浄した。

【０２１８】 この特定のケースでは、試料はマーカー「１００bpフルオレセインラダー」（
バイオラッド（Bio-Rad））であり、その断片は、１００〜１０００bpの大きさ
であり、注入は１センチメートルあたり２５ボルトで１０秒間かけて行う。

【０２１９】 毛細管に２５℃で導入される該媒体の分離性は、２つの温度、２５℃と５０℃
で評価し、そして図５ａと５ｂは、これらの性質を示す。

【０２２０】 前記試験と同様に、分離が、高温ではさらに迅速であるが、分離の利得は、例
えばＴ１５やＴ７（これらは、より顕著な熱増粘性を示す）よりも低いことが観
察される。このことは、温度の関数として粘性曲線に出現するような熱増粘性が
、本発明の媒体の特徴的な利点であること、および該粘性曲線が、分離性を最適
化するためのガイドとして使用しうることを確認している。

【０２２１】 試験４−５ コポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ１０）を含む分離媒体を使用する配列産物の
分離。

【０２２２】 コポリマーは、７Ｍ尿素を含有するトリス−ＴＡＰＳ緩衝液（５０mM）中の２
つの異なる濃度、それぞれ３g/１００mlおよび５g/１００mlで使用する。媒体の
ｐＨは、８．２のオーダーである。対照として、市販の配列決定媒体（ＰＯＰ６ パーキンエルマー（Perkin-Elmer））を受領したまま使用して試験を行う。

【０２２３】 使用される毛細管は、４０cmの長さで、有効長が３０cmであり、内径１００μ
mである。シリカ上の吸着という特異的性質を示さないＴ１０ポリマーに基づく
分離媒体では、毛細管を、その使用の前に、１，０００，０００の分子量を有す
る１g/１００mlのポリビニルピロリドンを含む１Ｍ塩酸溶液で洗浄する。分離媒
体は、２５℃で毛細管に導入する。

【０２２４】 試験される試料は、アマーシャム（Amersham）が販売しているフルオレセイン
−プライマーキットを、製造業者の説明書に従って環状配列決定を行って調製さ
れるＤＮＡの配列ｓｓＭ１３ｍｐ１８（「Ｔ」で終わる断片）の反応の産物であ
る。

【０２２５】 電場は１センチメートルあたり２００ボルトであり、注入は１センチメートル
あたり２００ボルトで８秒間かけて行う。それぞれの媒体の分離能力は、６０℃
の温度で評価する。図６と７は、市販の配列決定媒体（対照、図ａ）、およびコ
ポリマーＴ１０に基づく本発明の媒体の３g/１００ml（図ｂ）と５g/１００ml（
図ｃ）の濃度での分離能力を示す（ピークの上の数字は、４８塩基を引いたＤＮ
Ａ断片の長さを表す）。

【０２２６】 試験４−６ 本発明の種々の分離媒体を使用する配列の断片に関しての分離性。

【０２２７】 試験される媒体は、それぞれ８g/１００mlの濃度のコポリマーＰＡＭ−ＮＩＰ
ＡＭ（Ｔ１２）、５g/１００mlの濃度のコポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ１３
）または５g/１００mlの濃度のコポリマーＤＭＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ７）に基づ
いている。

【０２２８】 それぞれの媒体は、当然トリス−ＴＡＰＳ緩衝液（５０mM）および７Ｍ尿素を
補足する。これらは、ｐＨが８．２であり、試料の性質および分離条件は、前記
試験で選択されるものと同じである。

【０２２９】 これらの異なる試験によって、１０００mPa.m^-1.s^-1のオーダーの室温での比
較的穏やかな粘性であるかまたは顕著に低い粘性を有する本発明のいくつかの媒
体は、ＤＮＡ配列断片が市販の媒体の性能と同等かまたはそれ以上の性能で分離
することを可能にすることが、確認されている。特に５g/１００mlのＴ１０で得
られる分離は、わずかに短い時間で、ＰＯＰ６で得られるものよりも顕著に大き
いことが観察されよう。

【０２３０】 試験４−７ コポリマーとしてコポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ１０）を含む媒体のＤＮＡ
断片を使用する分離。

【０２３１】 ２g/１００mlの濃度で使用されるコポリマーを、トリス−ＴＡＰＳ緩衝液（５
０mM）、２mM ＥＤＴＡおよびＤＮＡマーカーＳＹＢＲグリーンＩ １０^-4と混
合する。毛細管の長さは、１５cmであり、そのうち１０cmは検出器に至り、そし
て毛細管は、この媒体と共に発生する残留電気浸透を排除するために、１００マ
イクロメートルの内径を有する「ＤＢ１７」型（ＪＷサイエンティフィック（JW scientific））のものである。

【０２３２】 この特定のケースでは、試料は、マーカーの高分子量標準（ライフテクノロジ
ーズ（Life Technologies））であり、８，２７１〜４８，５０２塩基対の断片
を有する。注入は１センチメートルあたり１００ボルトで５秒間かけて行う。分
離は、＋パルスと−パルスの間の非対称が２０％であり３０Hzの周波数の、±２
００Ｖの矩形パルスのパルスフィールドで行う。断片の分離は、普通の絡み合っ
たポリマー溶液中での数時間に対して、２０分未満で行われる（図８）（Heller
ら, Electrophoresis, 16, 1423-1428 (1995)）。

【０２３３】 試験４−８ 本発明の分離媒体の４０℃での分離と分離性。

【０２３４】 試験される媒体は、７Ｍ尿素を含有するトリス−ＴＡＰＳ緩衝液（５０mM）中
に３g/１００mlで溶解された異なる長さ（それぞれＴ２２、Ｔ２６、Ｔ２４およ
びＴ２５）のＮＩＰＡＭ巨大モノマーに基づくポリマーを含有する。媒体のｐＨ
は、８．２のオーダーである。使用される試料は、「５０ＢＬ ラダー（LADDER
）−フルオレセイン」、ファルマシア（Pharmacia）である。

【０２３５】 ピーク幅に関する結果は、図１２に示す。

【０２３６】 ここから、最も良好な分離（ピーク幅が狭い）は、ポリマーＴ２４により得ら
れるシリーズ（１５，０００の平均分子量を有する巨大モノマーから調製される
）であり、Ｔ２５とＴ２６に基づく媒体も、良好な品質の配列決定を行うのに十
分な非常に満足すべき結果を与えることが明らかである。

【０２３７】 試験４−９ 一定温度で本発明の分離媒体を使用する配列の反応産物の分離。

【０２３８】 試験される媒体は、２mM ＥＤＴＡと７Ｍ尿素を含有する５０mM Ｎａ ＴＡ
ＰＳ緩衝液中５g/１００mlのＴ１６型のものであり、該媒体は、５０℃で毛細管
に導入され、分離も５０℃で行われる。ＡＢＩ３１０装置を使用する。

【０２３９】 読み取りが、５００塩基を超えるまで非常に良好に行うことができること、お
よびまさにこのケースでは、低温での導入が、本発明の媒体の利用に本質的では
ないことが注目される。この有利な性質は、媒体が熱増粘化型のものであり、従
って分離が行われる温度で、毛細管へのその導入を妨げるであろうゲル型状態を
示さないという事実に由来する。

【０２４０】 実施例５： ＰＶＡ−ＮＩＰＡＭ（ポリビニルアルコール／ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリル
アミド）コポリマーの調製。

【０２４１】 コポリマーの水溶性骨格を構成するポリビニルアルコールは、事前にポリ酢酸
ビニルを加水分解することにより得られる。試験に使用されるポリマーは、１２
．４mol％のアセテートレベルおよび１４５，０００g/molの重量平均モル質量を
有する。水中のその固有の粘性は３０℃で９２ml/gであり、Ｃ*鎖をカバーする
ための限界濃度は、約１．２５g/１００mlである。

【０２４２】 使用する合成経路は、「グラフティングフロム（grafting from）」型である
。これはNonakaらにより均質媒体として（Y. Nonaka, Y. Ogata, S. Kurihara,
Journal of Applied Polymer Science, vol. 52, 951-957 (1994)）、またはIka
daらによりポリ（メタクリル酸メチル）骨格（Y. Ikada, Y. Nischizaki, I. Sa
kwada, J. Polym. Sci., Vol. 12, 1829-1839 (1974)）のケースとして報告され
ている。

【０２４３】 合成は、ＰＶＡ骨格上にラジカルを生成させるために、ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）中で、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）の存在下で６０℃で２０時間行わ
れる。次にこれらのラジカルは、媒体中に存在するモノマーの重合を誘導し、最
終生成物へ導く。

【０２４４】 ケトエノール互変異性の二次反応によるカルボニル基の形成によって、合成の
間有効に観察される黄色が出現する。

【０２４５】 下記の表３は、本プロトコールで得られるＰＶＡ−ＮＩＰＡＭの性状を示す。

【０２４６】

【表３】

【０２４７】 ｂ ウルトラスチラゲル（ultrastyragel）カラム（ウォーターズ（Waters）１
５０ＣＶ＋ クロマトグラフ）、屈折率測定による検出およびポリスチレン標準
に対する単一較正を用いて、４０℃でＴＨＦ中でＳＥＣにより測定。 ｃ ＮＭＲにより測定。

【０２４８】 実施例６： 線形トリブロックコポリマーＰＯＰ−ＰＯＥ−ＰＯＰの調製

【０２４９】 このコポリマーは、J.P. KaczmarskiとJ.E. Glass, Langmuir, 1994, 10, 303
5-3042が報告したプロトコールから得られるプロトコールにより調製する。

【０２５０】 ３５，０００の分子量を有する約１０ｇのポリエチレングリコール（メルク（
Merck）、ホーヘンブルン（Hohenbrunn）、Ｄ）（ＰＥＧ）および１００mlの無
水トルエンをアルゴン雰囲気下で混合する（低分子量ポリオキシエチレン類は一
般に「ポリエチレングリコール」と呼ばれる）。一旦ＰＥＧがトルエンに溶解し
たら、混合物をアルゴン下で加熱還流して、約１０〜１５mlの無水トルエンを留
去する。溶液を室温まで冷却して、１２０mg（０．２重量％）のジラウリン酸ジ
ブチルスズを溶液に加える。化学量論量のジイソシアン酸イソホロン（１２８mg
）を５mlの無水トルエンに溶解して、混合物に加える。反応は、赤外吸収スペク
トル分析を用いて視覚化（２２６０cm^-1のイソシアネートバンドの減少を強化す
ることにより）してモニターする。９０分経過後、２．４ｇのポリプロピレング
リコールモノブチルエーテル（Ｍｎ４００）（ＰＰＧ）（アルドリッチ（Aldric
h）、ミルウォーキー、米国）を２０mlの無水トルエンに溶解して、混合物に滴
下して加える（低分子量ポリオキシプロピレン類は、一般に「ポリプロピレング
リコール」と呼ばれる）。反応を５℃で一晩（約１５時間）続ける（イソシアネ
ートバンドは、反応の開始時から低下し、次いで安定化する）。溶液の粘性を低
下させるために、８０mlのトルエンを混合物に加え、５５０mlの石油エーテルを
使用して沈殿させ、４番焼結ガラスでろ過し、過剰の石油エーテルで洗浄して、
真空下で乾燥する。

【０２５１】 実施例７： ＰＶＡ−ＮＩＰＡＭコポリマーと線形トリブロックコポリマーＰＯＰ−ＰＯＥ−
ＰＯＰの熱増粘性挙動の測定。

【０２５２】 使用されるレオメーターは、上記実施例３で使用されるものと同一である。使
用されるＰＶＡ−ＮＩＰＡＭは、表３中のものに対応し、線形トリブロックコポ
リマーＰＯＰ−ＰＯＥ−ＰＯＰは、実施例６で調製されるものである。

【０２５３】 図９では、以下を有する媒体の流動学的挙動を示す：

【０２５４】 ・５０mMトリス−ＴＡＰＳ電解質液に溶解されるそれぞれ４．５重量％のＰＶ
Ａ−ＮＩＰＡＭまたは４．７５重量％のＰＶＡ（図９ａ）（ＰＶＡ−ＮＩＰＡＭ
コポリマーは、３５℃を超える温度から熱増粘性を示し、これはＰＶＡ単独では
示さない）、および

【０２５５】 ・２０℃の温度から急速に濃厚化する、線形トリブロックコポリマーＰＯＰ−
ＰＯＥ−ＰＯＰの熱架橋性（図９ｂ）（また、このグラフには同じ濃度のポリエ
チレングリコールポリマーの流動学的挙動が示される。このケースでは、温度の
関数としての粘性の上昇は観察されない）。

【０２５６】 実施例８： 実施例５のＰＶＡ−ＮＩＰＡＭコポリマーを含む電気泳動分離媒体の分離性。

【０２５７】 蛍光検出は、実施例４に記載されるものと同じ条件下で行われる。毛細管チャ
ネルに関しては、４０cmの全長および３０cmの有効長、１００μmの内径を持ち
、電気浸透を排除するために、HJERTEN J. Chromatogr., 1985, 347, 191に記載
されるプロセスによりアクリルアミド誘導体で被覆されている。

【０２５８】 電解質は、４．７５g/１００mlのＰＶＡ−ＰＮＩＰＡＭコポリマーと５０nMの
トリス−ＴＡＰＳ緩衝液を含んでなる。

【０２５９】 電場は、１センチメートルあたり２００ボルトである。注入は１センチメート
ルあたり２００ボルトで１０秒間かけて行われる。試料は、ミリＱ（MILI Q）水
（ミリポート（Miliport））で１／５００希釈されたサイザー５０−５００、フ
ァルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech）である。

【０２６０】 分離性は、２つの温度、２０℃（図１０ａ）および４４℃（図１０ｂ）で評価
する。分離時間は改善されるが、分離は顕著に上昇せず、このことは疑いもなく
この媒体の４４℃で到達する過剰に低い粘性のためである。

【０２６１】 実施例９： 実施例８のトリブロックコポリマーＰＯＰ−ＰＯＥ−ＰＯＰをコポリマーとして
含む分離媒体の分離性。

【０２６２】 媒体は、上記実施例７に記載される媒体の推奨条件下で試験した。 得られる結果は、図１１に示す。

【０２６３】 図１１ａは、対照媒体、すなわち２０℃の未修飾ポリエチレングリコールに単
純に基づく媒体の分離性を示す。図１１ｂは、対照媒体と同様に、２０℃のコポ
リマーＰＯＰ−ＰＯＥ−ＰＯＰを含む媒体の分離性を示し、そして図１１ｃは、
該コポリマーに基づく媒体ではあるが５０℃の分離性を説明する。これは、疑い
もなくその高分子量のため、コポリマーが、室温から、ＰＯＥ単独により得られ
る分離よりも大きな分離を示すことを示しており、しかし５０℃に達するとその
性質は再度大きく改善されることを示しており、そして少なくとも２つのＬＣＳ
Ｔを有するブロックを有するブロック型のポリマーも、動電学的分離を行うため
に本発明の状況において有利に使用できることを示している。

【０２６４】 実施例１０： 荷電コポリマーＰＡＡｇＮＩＰＡＭ（ポリアクリル酸／ポリ−Ｎ−イソプロピル
アクリルアミド）の調製。

【０２６５】 使用されるポリアクリル酸は、水中１２．５g/１００mlで溶解している。ＰＡ
Ａ５００と称されるポリマーは、５００，０００g/molの重量平均モル質量を有
する（フルカ（Fluka））。

【０２６６】 ＰＡＡ５００骨格は、ｐＨに感受性である；イオン性カルボキシル官能基は、
４．２５ｐＨ単位の領域のｐＫ₀を有する。

【０２６７】 １）ＰＡＡｇＮＩＰＡＭコポリマーの合成 ａ）方法 使用する合成経路は、ＮＩＰＡＭの短鎖をポリアクリル酸骨格の小画分のカル
ボン酸官能基上にグラフトすることからなる。これは２つの段階に分類すること
ができる：

【０２６８】 メタノール中の転移剤ＡＥＴ．ＨＣｌ（２−アミノエタンチオール塩酸塩）と
開始剤のＡＩＢＮ（２，２’−アゾビスブチロンニトリル）の存在下で、６０℃
で２０時間のＮＩＰＡＭモノマーのラジカル重合による、アミン官能基で終わる
ＰＮＩＰＡＭの短鎖（Ｍｗ≒２，０００g/mol）であるオリゴＮＩＰＡＭの合成
（この様式の合成は、実施例１のＰＮＩＰＡＭ−Ａポリマーを調製するために、
水溶液中で使用される方法の代替法である）。

【０２６９】 既知の長さのオリゴＮＩＰＡＭは次に、ＰＡＡ５００骨格上にグラフトされる
。ポジイミド開始剤の存在下で酸とアミン官能基を：

【０２７０】 ・水中６０℃で１時間（開始剤 ＥＤＣ １，２−ジクロロエタン）、または ・Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中６０℃で２４時間（開始剤ＤＣＣＩ ジ
シクロカルボジイミド）のいずれかで 反応。

【０２７１】 表４は、このプロトコールによる得られるＰＡＡｇＮＩＰＡＭコポリマーの組
成を示す。

【０２７２】

【表４】

【０２７３】 実施例１１： ＰＡＡｇＮＩＰＡＭ Ｉコポリマーの流動学的挙動。

【０２７４】 温度の関数としての粘性の変化は、上記実施例６と同じ条件下でプロットした
が、剪断勾配１００ｓ^-1と１分あたり２℃の温度上昇速度を使用した。熱増粘効
果は、ＰＡＡｇＮＩＰＡＭ Ｉについて３３℃で出現して、６５℃まで延長し、
１つの増殖相とこの温度範囲にわたるプラトーの開始を示すのみである。このこ
とは、上記実施例と説明を使用することにより、荷電した親水性骨格と、熱架橋
性を与えるＬＣＳＴを有する多数のブロックとを、有するコポリマーを調製でき
ること、およびこれは本発明において使用できることを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１：５ｇ／１００mlの水中の種々のコポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭとＰＤＭ
Ａ−ＮＩＰＡＭ、および従来のポリアクリルアミドについての、温度の関数とし
ての粘性の変化。

【図２】 図２：本発明のコポリマーの温度の関数としての粘性の変化。 ・水中のコポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ Ｔ１０、０．２Ｍ Ｋ₂ＣＯ₃緩衝液
と５０mM Ｔｒｉｓ−Ｔａｐｓ緩衝液、７Ｍ尿素中（ＤＮＡの配列決定に使用す
ることができる。）（図２ａ）、および ・２つの異なる濃度（２および３ｇ／１００ml）でのコポリマーＰＡＭ−ＮＩ
ＰＡＭ（図２ｂ）。

【図３】 図３：２５℃（図３ａ）と６０℃（図３ｂ）での２５℃のＴＲＩＳ−ＴＡＰＳ
緩衝液中２ｇ／１００ml溶液中のポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭに基づく、本発明
の分離媒体中の１００〜１２，０００塩基対のサイズ範囲（「ｋｂラダー」、Li
fe Technologies, Paisley, UK）の２本鎖ＤＮＡ断片の分離例。

【図４】 図４：２０℃（図４ａ）と５０℃（図４ｂ）のポリマーＴ７に基づいて得られ
た本発明の媒体中の、制限遺伝子断片「ＰｈｉＸ−１７４−ＲＦ ＤＮＡ Ｈａ
ｅIIIダイジェスト」の分離を示す電気泳動図。

【図５】 図５：２つの温度（２０℃（図５ａ）と６０℃（図５ｂ））でのＴ２１に基づ
く本発明の分離媒体中の、２本鎖ＤＮＡ断片（１００bpフルオレセインルーラー
、バイオラッド（Bio-Rad））の分離例。

【図６】 図６：６０℃のＴＲＩＳ−ＴＡＰＳ緩衝液、７Ｍ尿素中の５ｇ／１００mlのコ
ポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ１０）（図６ｃ）、３ｇ／１００mlのＰＡＭ−
ＮＩＰＡＭ（Ｔ１０）（図６ｂ）に基づく本発明の媒体、および市販の配列決定
媒体（ＰＯＰ６ Perkin-Elmer）（図６ａ）で得られた配列の反応生成物の分離
を示す電気泳動図の一部。

【図７】 図７：６０℃のＴＲＩＳ−ＴＡＰＳ緩衝液、７Ｍ尿素中の５ｇ／１００mlのコ
ポリマーＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ（Ｔ１０）（図７ｃ）、３ｇ／１００mlのＰＡＭ−
ＮＩＰＡＭ（Ｔ１０）（図７ｂ）に基づく本発明の媒体、および市販の配列決定
媒体（ＰＯＰ６ Perkin-Elmer）（図７ａ）で得られた、配列の反応生成物の分
離を示す電気泳動図の一部。

【図８】 図８：６０℃でポリマーＴ１０に基づいて得られた本発明の媒体中のパルス電
気泳動による、大きい２本鎖ＤＮＡ"high Mw markers" (Life Technologies, Pa
isley, GB）の分離を示す電気泳動図。

【図９】 図９：以下についての温度の関数としての粘性の変化： ・コポリマーＰＶＡ−ＮＩＰＡＭ、ポリマーＰＶＡと比較、および ・５ｇ／１００mlの濃度でポリマーＰＯＥと比較したコポリマーＰＯＰ−ＰＯ
Ｅ−ＰＯＰ。

【図１０】 図１０：２つの温度（２０℃（図１０ａ）と４０℃（図１０ｂ））のＰＶＡ−
ＮＩＰＡＭに基づく本発明の分離媒体中の、５０〜５００bpのサイズ範囲（サイ
ザー５０〜５００bp、Pharmacia biotech）中の２本鎖ＤＮＡ断片の分離例。

【図１１】 図１１：ＰＯＥ（図１１ａ）に基づき、２５℃でのＰＯＰ−ＰＯＥ−ＰＯＰ（
図１１ｂ）に基づき、および４５℃でのＰＯＰ−ＰＯＥ−ＰＯＰ（図１１ｃ）に
基づく、サイザー５０〜５００bp（Pharmacia biotech）の分離を示す電気泳動
図。

【図１２】 図１２：ＬＣＳＴを有するセグメントの平均数と平均長さにより区別すること
ができる、変性媒体（フルオレセイン５０bpラダー、Pharmacia Biotech）、本
発明の媒体中の１本鎖ＤＮＡ断片の一連の分離のバンド幅：小さいバンド幅は、
分離が良好なことに対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｆ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ビオビィ，ジャン−ルイ フランス国，エフ−75013 パリ，リュ ドゥ レスペランス，26 (72)発明者 ウルデ，ドミニク フランス国，エフ−94360 ブリィ シュ ール マルヌ，リュ デ トゥルナンフ ィ，25 (72)発明者 スュドー，ジャン フランス国，エフ−75013 パリ，アブニ ュ デ ゴベラン，39 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 HA19 4D054 FA10 FB09 FB11

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分離チャネルにおける種の分離のための感熱性媒体であって
   、該媒体は、少なくとも１つのセットのブロックコポリマーが溶解している電解
   質を含み、該ブロックコポリマーは、 ・該電解質中で、温度Ｔ１で得られる粘性状態Ｖ１から、Ｔ１よりも少なくと
   も２０℃高い温度Ｔ２で得られる、Ｖ１より少なくとも１００％高い粘性状態Ｖ
   ２へ可逆的に移行する能力を該媒体に付与するのに十分な濃度で与えられ、そし
   て ・その構造中に、少なくとも ・該電解質中でＬＣＳＴを示し、かつその骨格に沿って５０より大きい平均
   原子数を有する、２つの非隣接ポリマーセグメントと、 ・温度Ｔ１とＴ２で電解質に可溶性である１つのポリマーセグメント とを含むことを特徴とする、上記媒体。
2. 【請求項２】 温度Ｔ１が、１５℃〜３０℃であることを特徴とする、請求
   項１に記載の媒体。
3. 【請求項３】 温度Ｔ２が、４０℃〜８０℃であることを特徴とする、請求
   項１または２に記載の媒体。
4. 【請求項４】 粘性Ｖ２が粘性Ｖ１よりも、粘性Ｖ１の少なくとも５倍大き
   いことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の媒体。
5. 【請求項５】 ＬＣＳＴを有する該セグメントのかなりの部分のＬＣＳＴが
   、Ｔ１〜Ｔ２であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の媒
   体。
6. 【請求項６】 ＬＣＳＴを有するすべてのセグメントが、コポリマーの全平
   均モル質量の２％〜２５％、好ましくは５〜１５％を占めることを特徴とする、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の媒体。
7. 【請求項７】 ＬＣＳＴを有するブロックの全部または一部が、その骨格に
   沿って７５より大きい平均原子数、または２，５００より大きい平均分子量を有
   することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の媒体。
8. 【請求項８】 該ポリマーの全部または一部が、線形ブロックポリマーの形
   で存在することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の媒体。
9. 【請求項９】 該ポリマーの全部または一部が、骨格が、温度Ｔ１とＴ２で
   電解質に可溶性である１つまたはそれ以上のセグメントからなる、櫛形コポリマ
   ーの形で存在することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の媒体
   。
10. 【請求項１０】 コポリマーの全部または一部が、２より大きい好ましくは
    ５より大きい、ＬＣＳＴを有するセグメントの鎖あたりの平均数を有することを
    特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の媒体。
11. 【請求項１１】 コポリマーの全部または一部が、３０，０００より大きい
    分子量、または主骨格に沿って２，０００より大きい原子数を有することを特徴
    とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の媒体。
12. 【請求項１２】 コポリマーの全部または一部が、５０，０００〜３，００
    ０，０００の分子量、または主骨格に沿って２，５００〜１００，０００の原子
    数を有することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の媒体。
13. 【請求項１３】 コポリマーの全部または一部が、可溶性セグメントとＬＣ
    ＳＴを有するセグメントとの２個の連続する結合点の間に、可溶性セグメントの
    セクションに沿って、２１０より大きい平均原子数を有することを特徴とする、
    請求項１〜１２のいずれか１項に記載の媒体。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の媒体であって、該
    ＬＣＳＴを有するポリマーセグメントの全部または一部が、 ・ポリビニルアルキルエーテル、 ・ヒドロキシアルキルセルロース、 ・エーテルオキシドのホモポリマー、 ・エーテルオキシドのランダムおよびブロックコポリマー、 ・アルキレンホモ−およびコポリマー、並びに ・アクリル酸およびメタクリル酸、アルキルアクリレートおよびメタクリレー
    ト、Ｎ−アルキル−アクリルアミドまたは−メタクリルアミド、Ｎ’，Ｎ−ジア
    ルキル−アクリルアミドまたは−メタクリルアミド、アリール−アクリルアミド
    または−メタクリルアミド、およびアルキルアリール−アクリルアミドまたは−
    メタクリルアミドから選択されるモノマーのホモ重合または共重合から得られる
    ポリアクリル酸誘導体 から選択される１つまたはそれ以上のコポリマーから誘導されることを特徴とす
    る、上記媒体。
15. 【請求項１５】 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の媒体であって、温
    度Ｔ１およびＴ２で可溶性のポリマーセグメントが、ポリエーテル、ポリエステ
    ル、ポリオキシアルキレンの可溶性ランダムコポリマーおよびホモポリマー、多
    糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリウレタン、ポリアミ
    ド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリスチレンスルホネート、該電
    解質に可溶性である置換または非置換ポリアクリルアミドまたはポリメタクリル
    アミドから選択される、少なくとも１つのポリマーからなることを特徴とする、
    上記媒体。
16. 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の媒体であって、コ
    ポリマーが、 ・骨格が、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノールまた
    はジメタクリルアミドを含む型のものであり、その上に、ポリ（Ｎ−アルキルま
    たはＮ，Ｎ−ジアルキル）アクリルアミド型の側枝セグメント、またはランダム
    もしくはブロックのポリオキシエチレン／オキシプロピレンコポリマーもしくは
    ポリオキシプロピレン型の側枝セグメント、またはポリエーテル型の側枝セグメ
    ントがグラフトされている、櫛形コポリマー型のコポリマー、 ・骨格に沿って、交互のポリオキシエチレン型のセグメントとポリオキシプロ
    ピレン型のセグメント、または交互のポリオキシエチレン型のセグメントとポリ
    オキシブチレン型のセグメント、または交互のポリエチレンのセグメントとポリ
    オキシエチレンよりも疎水性の大きなポリエーテル型のセグメントを示す、ブロ
    ックコポリマー型のコポリマー から選択されることを特徴とする、上記媒体。
17. 【請求項１７】 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の媒体であって、コ
    ポリマーが、 ポリアクリルアミド／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＡＭ−ＮＩ
    ＰＡＭ）；ポリビニルアルコール／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（
    ＰＶＡ−ＮＩＰＡＭ）、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン、ポリアク
    リルアミド／オキシエチレン−オキシプロピレンコポリマー、ポリアクリルアミ
    ド／ポリオキシプロピレン、ポリアクリル酸／ポリオキシプロピレン、ポリアク
    リル酸／オキシエチレン−オキシプロピレンコポリマー、ポリアクリル酸／ポリ
    （Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリジメチルアクリルアミド／ポリ
    （Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＭ−ＮＩＰＡＭ） から選択されることを特徴とする、上記媒体。
18. 【請求項１８】 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の媒体であって、媒
    体は、１５〜３０℃の温度Ｔ１での５０〜１，０００mPa.m^-1.s^-1（ＳＩ単位系
    ）の粘性Ｖ１から、４０℃のオーダーまたはこれより高い温度Ｔ２でのＶ１より
    も２〜５０倍大きい粘性Ｖ２まで移行すること、並びに ・３０，０００〜２，０００，０００の平均分子量、または主骨格に沿った１
    ，０００〜６０，０００の原子数、 ・２％〜２０％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および ・２，０００〜２０，０００の、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量、
    または３５〜３５０の、ＬＣＳＴを有するセグメントに沿った平均原子数 を有する５g/１００ml〜２０g/１００mlのコポリマーを含むことを特徴とする、
    上記媒体。
19. 【請求項１９】 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の媒体であって、媒
    体は、１５〜３０℃の温度Ｔ１での１００〜１０，０００mPa.m^-1.s^-1の粘性Ｖ
    １から、４０℃のオーダーまたはこれより高い温度Ｔ２でのＶ１よりも２〜１０
    ０倍大きい粘性Ｖ２まで移行すること、並びに ・５００，０００〜３，０００，０００の平均分子量、または主骨格に沿った
    ７，０００〜９０，０００の原子数、 ・２．５％〜１５％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および ・４，０００〜３０，０００の、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量、
    または６０〜６００の、ＬＣＳＴを有するセグメントに沿った平均原子数 を有する１g/１００ml〜８g/１００mlのコポリマーを含むことを特徴とする、上
    記媒体。
20. 【請求項２０】 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の媒体であって、１
    ５〜３０℃の温度Ｔ１での１００〜１０，０００mPa.m^-1.s^-1（ＳＩ単位系）の
    粘性Ｖ１から、４０℃のオーダーまたはこれより高い温度Ｔ２でのＶ１よりも２
    〜１００倍大きい粘性Ｖ２まで移行すること、並びに ・５００，０００より大きい平均分子量、または主骨格に沿った７，０００よ
    り大きい原子数、 ・２％〜１５％の、ＬＣＳＴを有するセグメントの重量比、および ・４，０００より大きい、ＬＣＳＴを有するセグメントの平均分子量またはセ
    グメントに沿った９０より大きい、ＬＣＳＴを有する平均原子数 を有する０．１g/１００ml〜５g/１００mlのコポリマーを含むことを特徴とする
    、上記媒体。
21. 【請求項２１】 該コポリマーが該媒体中に存在し、かつコポリマー濃度が
    ２０g/１００ml未満、好ましくは０．１g/１００ml〜８g/１００mlであることを
    特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の媒体。
22. 【請求項２２】 中性またはイオン性である、粒子、水溶性ポリマー、非熱
    増粘結合ポリマー、または界面活性剤を含む型のアジュバントをさらに含むこと
    を特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の媒体。
23. 【請求項２３】 分子種または巨大分子種、および特に核酸（ＤＮＡ、ＲＮ
    Ａ、オリゴヌクレオチド）、化学合成もしくは修飾により得られる核酸類似体、
    タンパク質、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖類のような生物学的巨大
    分子、有機分子、合成巨大分子、または鉱物粒子、ラテックス、細胞もしくは細
    胞小器官のような粒子、から選択される種の分離または分析のための、請求項１
    〜２２のいずれか１項に記載の媒体の使用。
24. 【請求項２４】 ＤＮＡの配列決定のための、請求項１〜２２のいずれか１
    項に記載の媒体の使用。
25. 【請求項２５】 ５０，０００未満の分子量を有する分子、または１００個
    未満のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、または未変性もしくは変性タン
    パク質を分離するために、請求項１８に記載の媒体が使用されることを特徴とす
    る、請求項２４に記載の使用。
26. 【請求項２６】 ＤＮＡ配列の反応の産物、１，０００塩基対未満のＤＮＡ
    ２本鎖、変性タンパク質または２０，０００〜１，０００，０００の分子量を有
    する合成もしくは天然ポリマーを分離するために、請求項１９に記載の媒体が使
    用されることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の使用。
27. 【請求項２７】 ５００塩基〜数百万の塩基対の大きさを有するＤＮＡ２本
    鎖、またはラテックス、細胞全体、染色体全体もしくは細胞小器官のような粒子
    を分離するために、請求項２０に記載の媒体が使用されることを特徴とする、請
    求項２４に記載の使用。
28. 【請求項２８】 請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の使用であって、
    以下の： ・分離すべき種の性状に従って該分離媒体を選択する工程； ・この媒体を電気泳動装置の分離チャネルに、その分離媒体を構成するのに十
    分な量で導入する工程（該分離チャネルは、温度Ｔ１の範囲の温度で維持される
    ）； ・試料の導入の前または後のいずれかに、かなりの割合のチャネルを温度Ｔ２
    にする工程； ・ある量の試料を分離チャネルの入口に導入する工程； ・チャネルのサーモスタット調温部においてＴ２のオーダーの温度で分離を行
    う工程；そして ・当初試料中に含まれる分析物の泳動を検出する工程 を含むことを特徴とする、上記使用。
29. 【請求項２９】 自動化電気泳動装置における、請求項１〜２３のいずれか
    １項に記載の媒体の使用。
30. 【請求項３０】 マイクロ流体系における、請求項１〜２３のいずれか１項
    に記載の媒体の使用。
31. 【請求項３１】 分離媒体として、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の
    媒体を含むことを特徴とする、毛細管電気泳動装置。