JP4639298B2 - キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 - Google Patents
キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4639298B2 JP4639298B2 JP2000380547A JP2000380547A JP4639298B2 JP 4639298 B2 JP4639298 B2 JP 4639298B2 JP 2000380547 A JP2000380547 A JP 2000380547A JP 2000380547 A JP2000380547 A JP 2000380547A JP 4639298 B2 JP4639298 B2 JP 4639298B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- capillary
- microorganism
- microorganisms
- electrophoresis
- salmonella
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キャピラリー電気泳動を用いて、検体試料中に存在する微生物を分析する方法並びに分析装置に関する。本発明の分析方法並びに分析装置は、環境、食品及び医療分野等において、検体試料中に混在する微生物を精度よく又は一斉分析する上で有用である。
【０００２】
なお、本発明で分析とは、試料中に含まれる所望微生物の分離、検出（定性的分析）、同定、定量、スクリーニング、生死判別を包含するものである。
【０００３】
【従来の技術】
一般に、試料中に微生物が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量を調べるためには、一旦これらの試料を適当な培地に接種して培養することによって目的の微生物を増殖させる必要がある。このため、従来、微生物の分析にはその培養のために少なくとも数時間という長い時間が必要であり、結果が迅速に得られないという問題があった。また、細菌培養は基本的に無菌的に行われるため、特殊な培養技術や設備が要求される。
【０００４】
これらのことから、微生物の培養並びに高度な技術や装置を要することなく、試料中に含まれ得る微生物を迅速に且つ簡便に検出し得る方法が望まれている。
【０００５】
微生物の中でも腸内細菌であるサルモネラは、大腸菌および赤痢菌と共に、食中毒を発症する最多原因菌として知られている。サルモネラによる食中毒は、サルモネラに汚染された食肉、牛乳、卵およびこれらの加工食品を摂取し、サルモネラが腸管内で増殖することによって起こる感染型食中毒であり、1999年度の食中毒患者総数（ウイルス、自然毒、化学物質などを含む）の３分の１がサルモネラ中毒であると報告されるように、年々増加の傾向にある。
【０００６】
サルモネラによるヒトの疾病には、基本的には上記食中毒という形で発症する急性胃腸炎、並びにチフス性疾患（腸チフス、パラチフス）の２種類が知られているが、これらの疾病は、同じサルモネラに属する細菌でも異なる亜種（７種）や血清型（約2,200種）によってもたらされる。例えば急性胃腸炎（食中毒）は宿主域の広い亜種Ｉ血清型のいずれでも起こりうるが、一般にはネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び腸炎菌（Salmonella enteritidis）によって生じ、またチフス性疾患はごく少数の亜種Ｉ血清型（Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Paratyphi C, Sendai）で生じることが知られている。
【０００７】
このように多くの種類に分類されるサルモネラの検出は、従来、選択分離培養で培養後、疑わしい集落を釣菌し、確認培地や同定キットあるいは抗血清により判定する必要があり、菌種・菌株を正確に同定するには多くの経験と熟練が必要であった。また、培養などの時間を合わせると判定結果には３〜５日間の長期間を要していた。
【０００８】
このため食品及び医療分野では、微生物、とりわけ多くの種類に分類されるサルモネラを菌種・菌株毎に特異的に検出するための迅速で且つ安全な方法の確立が求められているのが実情である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
感染症疾患に対して迅速に適切な処置を施したり、その感染源を迅速に阻止するためには、感染源となりうる微生物の迅速で且つ特異的な検出方法が求められる。そこで、本発明は各種微生物、とりわけサルモネラを迅速且つ高感度に分離検出等する分析方法並びに該方法に使用される分析装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルギン酸塩を配合した泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動法を利用することにより、試料中に種々含まれる微生物、特にサルモネラを高い分離能をもって且つ再現性よく分離することができることを見出した。また本発明者らは、キャピラリー電気泳動法において検出手段として蛍光検出器を利用することによって、とりわけ蛍光抗体で目的の微生物を予め蛍光標識することによって、微量の微生物であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出できること、またこれにより更に一層高い分離能でもって精度よく所望の微生物が検出できることを見出した。更に本発明者らは、本発明の方法によると試料中に混在する微生物が単に検出できるだけでなく、定量的に測定できることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
すなわち本発明は下記（１）〜（４）に掲げる微生物の分析方法である：
（１）微生物を含む試料を、アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動することを特徴とする、微生物の分析方法。
（２）微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍光抗体で処理し、これをキャピラリー電気泳動に供して、蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出することを特徴とする、微生物の分析方法。
（３）アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動することを特徴とする、（２）記載の微生物の分析方法。
（４）微生物が、サルモネラに属する細菌であることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の微生物の分析方法。
【００１２】
さらに本発明は下記（５）〜（７）に掲げる微生物の分析装置である：
（５）キャピラリー電気泳動を用いて微生物を分析する方法であって、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離するキャピラリー、および(iii)分離された微生物を検出するための検出手段、を備えることを特徴とする微生物の分析装置。
（６）検出手段として蛍光検出器を備えることを特徴とする（５）記載の微生物の分析装置。
（７）検出する微生物がサルモネラに属する細菌であることを特徴とする（５）または（６）に記載の微生物の分析装置。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（１）微生物の分析方法
本発明の微生物の分析方法は、第１に、微生物の分離にアルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動法を利用することを特徴とする。また本発明の微生物の分析方法は、第２に、微生物をキャピラリー電気泳動法によって分離し蛍光的に検出すること、具体的には目的微生物を蛍光抗体で標識することによって蛍光的に検出することを特徴とするものである。
【００１４】
ここで用いられるキャピラリー電気泳動法は、泳動緩衝液としてアルギン酸塩を配合した緩衝液を使用する以外は、特に制限されることなく、従来公知の方法を任意に使用することができる。また、泳動緩衝液としてアルギン酸塩を配合した緩衝液を使用する限り、マイクロチップ電気泳動技術も含めて将来開発されるキャピラリー電気泳動法も制限されることなく使用できる。
【００１５】
泳動緩衝液中に含まれるアルギン酸塩の割合は特に制限されないが、通常０．００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、より好ましくは０．００１〜０．０１重量％を挙げることができる。アルギン酸の塩としては、具体的にナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウムやカルシウムなどのアルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩を挙げることができるが、好ましくはアルギン酸ナトリウムである。また、泳動緩衝液としては、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ７〜９の範囲に緩衝能を有するものであればよく、具体的にはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、またはシュウ酸緩衝液を例示することができる。好ましくはトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液である。また、これらの泳動緩衝液の濃度としては、通常１〜１０００ｍＭ、好ましくは２〜２００ｍＭの範囲を挙げることができる。
【００１６】
図１に本発明で利用できるキャピラリー電気泳動システムの基本的構成を一例として示す。ここで中空キャピラリー１０の両端は、上記泳動緩衝液を入れた水槽１１及び１２にそれぞれ浸され、キャピラリー内は当該泳動緩衝液で満たされている。水槽１１及び１２には、それぞれ電極（１３，１４）が付けられており、これらは高電圧サプライなどのように電源１５を介して連結されている。
【００１７】
分析対象である微生物を含む試料は、キャピラリーの一端（入口側、１０ａ）から注入され、次いで電源１５が作動されることにより、泳動領域でキャピラリー内に電位勾配が発生する。キャピラリー内壁に表面電荷が存在する場合、この電位勾配によりキャピラリー内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それは陰極方向への流れとなる。また、キャピラリー内に注入された微生物は、上記発生した電位勾配に応答して、該微生物が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極方向へ移動する。結果としてキャピラリー内での該微生物の泳動方向及び速度は、上記電気浸透流速度と該微生物の移動度によって決まり、キャピラリーの反対端（出口側、１０ｂ）の近くに備えられた検出器１８によって検出される。尚、検出手段として光学的検出方法を利用する場合は、キャピラリーそのものがフローセル１６となり、キャピラリー壁を通して直接光学的に検出される。
【００１８】
キャピラリー内への試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法、減圧法及び電気泳動注入法のいずれをも使用することができる。注入量も特に制限されないが、通常０．１〜１００ｎｌ、好ましくは１〜１００ｎｌ、より好ましくは１〜１０ｎｌを例示することができる。
【００１９】
尚、上記で例示した一対の電極（１３、１４）及び電源１５は、キャピラリー内に注入された微生物がキャピラリー内の泳動緩衝液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、キャピラリー中の泳動緩衝液に対して印加するための手段であり、かかる目的が達成できるものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）に何ら限定されることなく任意の手段（電位勾配を印加する手段）を使用することができる。
【００２０】
上記のように印加手段として電源および電極を使用する場合、電極はそれぞれの泳動緩衝液を満たした対極の水槽中に挿入されており、電源が入れられると、陽極（アノード）と陰極（カソード）との間に電位勾配が形成され、それによってキャピラリーに注入された微生物は、それが有する電荷と電気浸透流速度のバランスによりしかるべき電極方向へ移動する。一般的には、微生物の表面電荷は負であることが多いので微生物は陽極方向に移動する性質をもつが、上記電気浸透流速度がこの微生物泳動速度より大きい場合が多いので、微生物は結果として陰極へと移動する。
【００２１】
印加手段が電極を含む場合、電極間にかけられる電圧としては、キャピラリー長さに対して、一般に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋＶ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを挙げることができる。
【００２２】
キャピラリーとしては、内径１〜１５０μｍ、長さ０.１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空キャピラリーを挙げることができる。その材質としては特に制限されず、ガラス製やテフロン製などを任意に例示することができるが、好ましくはフューズドシリカ製である。
【００２３】
キャピラリー内で分離された微生物を検出する手段としては、分光学的、電気化学的、重量分析的方法のいずれもが使用できるが、好ましくはＵＶ−可視検出、蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法が挙げられる。中でも検出の特異性と感度に優れた蛍光検出法が好ましく、特により高感度検出が可能なレーザー誘導蛍光検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検出は、免疫反応（抗原抗体反応）、酵素反応、及び核酸相補鎖形成反応、等を最終信号検出手段として利用することができ、これらの反応を目的微生物に応じて適宜組み合わせることで、目的微生物をより特異的且つ高感度に検出することができる。これらの方法の中でも免疫反応は、微生物試料に特別な前処理をする必要がなく、また特異性に優れている点で、好ましい方法の１つである。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵素抗体ともいう）等を用いて目的の微生物を蛍光や酵素等で標識する方法を挙げることができる。
【００２４】
例えば、微生物を標識するために使用される蛍光試薬としては、特に制限されることなく従来公知若しくは将来知られうるものを広く挙げることができるが、具体的にはBODIPY FL（4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic Acid, Succinimidyl Ester）（励起波長503nm、蛍光波長512nm、Molecular Probe社製）、SYTO9（励起波長480nm、蛍光波長500nm、Molecular Probe社製）、FITC（Fluorescein Isothiocyanate)（励起波長490nm、蛍光波長520nm、Dojin社製）、TexasRed（励起波長596nm、蛍光波長620nm、Molecular Probe社製）、TRITC（Tetramethylrhodamine Isothiocyanate）（励起波長541nm、蛍光波長572nm、Research Organics社製）、Cy3（N,N'-diethyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid）（励起波長552nm、蛍光波長565nm、Amersham Pharmacia Biotech社製）、Cy5（N,N'-di-carboxypentyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid）(励起波長650nm、蛍光波長667nm、Amersham Pharmacia Biotech社製）、Acridine Orange（励起波長490nm、蛍光波長530nm、640nm、Wako社製）、Ethidum Bromide（励起波長545nm、蛍光波長605nm、Dojin社製）、Propidum iodide（励起波長530nm、蛍光波長615nm、Dojin社製）、Calcein（励起波長495nm、蛍光波長520nm、Dojin社製）、BCECF-AM（2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein Acetoxymethyl Ester）（励起波長500nm、蛍光波長530nm、Molecular Probe社製）、Evans blue（励起波長550nm、蛍光波長610nm、Wako社製）、Lucifer Yellow CH（励起波長430nm、蛍光波長535nm、ICN Pharmaceutical社製）、Dil（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）（励起波長550nm、蛍光波長565nm、Molecular Probe社製）、Dio（励起波長484nm、蛍光波長501nm、Molecular Probe社製）、DioC6(3)（3,3'-Dihexyloxacarbocyanine Iodide）（励起波長480nm、蛍光波長501nm、Lambda Probe & Diagnostics社製）、Rhodamine123（励起波長500nm、蛍光波長540nm、Molecular Probe社製）、Fluo-3（励起波長506nm、蛍光波長526nm、Dojin社製）、Calcium Green（励起波長506nm、蛍光波長526nm、Molecular Probe社製）等を例示することができる。
【００２５】
本発明の方法が対象とする微生物には、細菌類、真菌類、クラミジア、ウイルス、リケッチアが包含される。好ましくは細菌類である。例えば細菌類としてはブドウ球菌、８連球菌、スピリルム、連鎖球菌、球桿菌、桿菌、スピロヘータ、４連球菌、コンマ型球菌及び放線菌などが挙げられる。具体的には、ロドスピリルム（Rhodospirillaceae）、クロマチア（Chromatiaceae）、クロロビウム（Chlorobiaceae）、ミクソコッカス（Myxococcaceae）、アルカンギウム（Archangi aceae）、シストバクター（Cystobacteraceae）、ポリアンギウム（Polyangiaceae）、サイトファーガ（Cytophagaceae）、ベギアトア（Beggiatoaceae）、シモンシエラ（Simonsiellaceae）、リューコトリックス（Leucotrichaceae）、アクロマチウム（Achromatiaceae）、ペロネーマ（Pelonemataceae）、スピロヘータ（Spirochaetaceae）、スピリルム（Spirillaceae）、シュードモナス（Pseudomonadaceae）、アゾトバクター（Azotobacteraceae）、リゾビウム（Rhizobiaceae）、メチロモナス（Methylomonadaceae）、ハロバクテリウム（Halobacteriaceae）、腸内細菌（Enterobacteriaceae）、ヴィブリオ（Vibrionaceae）、バクテロイデス（Bacteroidaceae）、ナイセリア（Neisseriaceae）、ヴェイヨネラ（Veillonellaceae）、アンモニアまたは亜硝酸酸化細菌（Organisms oxidizing ammonia or nitrite）、硫黄代謝細菌（Organisms metabolizing sulfer and sulfer compounds）、酸化鉄および／または酸化マンガン沈着細菌（Organisms depositing iron and/or manganese oxides）、シデロカプサ（Siderocapsaceae）、メタノバクテリウム（Methanobacteriaceae）、好気性および／または通性嫌気性ミクロコッカス（Aerobic and/or facultatively anaerobic Micrococcaceae）、ストレプトコッカス（Streptococcaceae）、嫌気性ペプトコッカス（Anaerobic Peptococcaceae）、バチルス（Bacillaceae）、乳酸桿菌（Lactobacillaceae）、コリネフォルム細菌（Coryneform group of bacteria）、プロピオン酸菌（Propionibacteriaceae）、アクチノミセス（Actinomycetaceae）、マイコバクテリウム（Mycobacteriaceae）、フランキア（Frankiaceae）、アクチノプラーネス（Actinoplanaceae）、デルマトフィルス（Dermatophilaceae）、ノカルディア（Nocardiaceae）、ストレプトミセス（Streptomycetaceae）、ミクロモノスポラ（Micromonosporaceae）、リケッチア (Rickettsiaceae）、バルトネラ（Bartonellaceae）、アナプラズマ（Anaplasmataceae）、クラミジア（Chlamydiaceae）、マイコプラズマ（Mycoplasmataceae）、およびアコレプラズマ（Acholeplasmataceae）などを挙げることができる。好ましくはグラム陰性菌に属する細菌類であり、中でも腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する大腸菌、赤痢菌、サルモネラ及びYersinia属に属する細菌（ペスト菌、仮性結核菌等）等が好適に挙げられる。より好ましくはサルモネラである。
【００２６】
上記の各種の検出対象となる微生物を、蛍光若しくは酵素等で標識化するため使用される抗体としては、上記微生物（細菌、真菌、クラミジア、ウイルス、リケッチャ）に特異的に結合する抗体（以下、抗体にはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が包含される）を任意に例示することができる。例えば、従来公知の細菌に対する抗体としては、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗体、抗トリ型結核菌（Mycobacterium avium）抗体、抗肺炎連鎖球菌（Strptococcus pneumoniae）抗体、抗Streptococcus A group抗体、抗Streptococcus B group抗体，抗Streptococcus D group抗体，抗虫歯レンサ球菌（Streptococcus mutans）抗体，抗黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureuse）抗体，抗表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）抗体，抗大腸菌（Esherichia coli）抗体，抗腸管出血性病原性大腸菌（Echerichia coli O-157:H7）抗体，抗サルモネラ（Salmonella sp.）抗体，抗赤痢（Shigella sp.）抗体，抗カンピロバクター（Campylobacter sp.）抗体，抗ビブリオ（Vibrio cholerae, paraheamoliticase）抗体，抗クレブシエラ（Klebsiella sp.）抗体，抗ブロテウス（Proteus sp.）抗体、抗レイジョネラ（Legionella pneumophila）抗体，抗ヘリコバクター（Hellcobacter pylori）抗体，抗緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）抗体，抗ヘモフィリス（Heamophilisinflenzae, Heamophilis sp.）抗体，抗パスツレラ菌（Pasteurella sp.）抗体，抗髄膜炎菌（Neisseria meningitidis group A,B,C,X,Y,Z,W,E）抗体，抗リン菌（Neisseria gonorrhea）抗体，抗リステリア菌（Listeria sp.）抗体，抗ボツリヌス菌（Clostridium botulium）抗体，抗ディフィシル菌（Clostridium difficile）抗体等が例示される。真菌類に対する従来公知の抗体としては、抗カンジダ（Candida albicanse, Candida tropicals, Candida stllatoidea）抗体が例示できる。また、細菌全種に共通する抗原に対する抗体も使用でき、これらのものとしては抗細菌細胞壁ペプチドグリカン（Bacterial peptidoglycan）抗体、抗グラム陽性細菌細胞壁リポティコ酸（Bacterial Lipoteichoicacid）抗体などが知られている。また腸管内に生息する細菌群の分別に有用な抗体としては抗腸内細菌（Enterobacteriaceae α、β）抗体が、また真菌に対する共通抗体しては抗マンナン、抗ガラクトマンナン、１−３β−Ｄグルカンなどが知られている。
【００２７】
本発明の方法が分析対象とする試料は、微生物を含有することが疑われる試料であり、医療分野では各種（疑）感染患者から採取される血液、尿、糞便、喀痰、髄液、膿、唾液などの生体試料を、また食品分野では食肉、卵、野菜、魚、ミルクなどの原材料や種々の加工品を例示することができる。
【００２８】
（２）微生物の分析装置
本発明の微生物の分析装置はキャピラリー電気泳動を原理とするものであり、具体的には、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含む一対の水槽、(ii)該泳動緩衝液に注入された微生物を分離するキャピラリー、(iii)キャピラリー中の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、(iv)キャピラリー内で分離された微生物を検出するための検出手段、を備えることを特徴とする。
【００２９】
図１は、本発明にかかるキャピラリー電気泳動による微生物の分析装置の概略構成を示す一例である。かかる図面を利用して本発明の分析装置をより詳細に説明すると、本発明の分析装置１は、アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含む一対の水槽（陽極側水槽（１１）、陰極側水槽（１２））、注入された微生物を分離するためのキャピラリー１０、キャピラリー中の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段としての一対の電極（陽極側（１３）、陰極側（１４））及び電源１５、並びに、キャピラリー内で分離された微生物を検出するための検出手段として例えばレーザー光源等の光源１７及び該レーザー照射によって生じる蛍光を検出する検出器１８を含むように構成されている。キャピラリー１０の両端は泳動緩衝液を入れた水槽１１及び１２にそれぞれ浸され、キャピラリー内は当該泳動緩衝液で満たされている。水槽１１及び１２には、それぞれ電極１３及び１４が付けられており、これらには導線を介して電源１５が接続されている。なお、検出手段はキャピラリーの出口側部分（１０ｂ）に設けられる。当該キャピラリー部分は外壁が剥がされることによってキャピラリーそのものが検出用セル（フローセル）１６として形成され、キャピラリー壁を通して直接光学的に検出されるようになっている。なお、水槽には、電圧をかける際に発生する熱によるキャピラリー内の水溶液の水温の上昇を防ぐためにその外周に冷却手段が設けられていてもよい（図示せず）。
【００３０】
かかる分析装置によれば、キャピラリー１０の一端（入口側、１０ａ）に分析対象である微生物を含む試料を注入した後、電源１５を作動させて電極１１と電極１２との間に電圧をかけることにより、泳動領域内（キャピラリー内）の液全体は電気浸透現象により陰極方向への流れを発生する。一方、微生物は、それが有する電荷とは逆の極性を有する電極側（水槽）へと移動しようとする。例えば表面電荷が負である微生物は陽極側へ移動しようとする。かかる移動は上記電気浸透流に比べて十分小さい場合が多く、この泳動過程よりキャピラリー内で分離された微生物は、電気浸透流に流される形でキャピラリーの出口側（１０ｂ）の検出部でＵＶ−可視検出器又は蛍光検出器などによって光学的に検出することができる。分析対象の微生物が蛍光抗体などで蛍光標識されている場合は、検出器１８としてレーザー誘導蛍光検出器を使用することによって、光源１７からレーザー照射されることによって微生物が発生する蛍光を検出することができる。
【００３１】
なお、当該分析装置に用いられるアルギン酸塩を含む泳動緩衝液、キャピラリー、キャピラリーの泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、分析対象となる微生物、及び検出手段については、本発明の微生物分析方法に関して前述するものを広く挙げることができる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
S.enteritidis と S.typhimuriumの各々の斜面個体培養物からそれぞれ１白金耳を取り、これらを常法に従って調整したＥＥＭブイヨン培地（Enterbacteriaceae Enrichment Mannitol (EEM)ブイヨン培地：4.35g/100ml）５０ｍｌを含む200ｍｌ容の三角フラスコに別個に接種した後、３７℃で１６時間振盪培養した。振盪培養後、それぞれの培養液から500μｌを1.5ｍｌ容量のサンプルチューブにとり、これにLIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits（Molecular Probes社製）のＳＹＴＯ９溶液Ａを0.75μｌ添加し、暗所で室温１５分放置した後、キャピラリー電気泳動に供した。尚、キャピラリーは、泳動前に予め１Ｎ及び0.1Ｎの水酸化ナトリウムでそれぞれ２０psi、１分間、超純水で２０psi、３分間、及び泳動緩衝液で２０psi、２分間洗浄しておいたものを使用した。かかるキャピラリーに上記サンプルを0.5psiで５秒間注入し、下記条件下で電気泳動及び検出を行った。
【００３３】
＜キャピラリー電気泳動及び検出条件＞
装置 ： P/ACE system MDQ (Beckman Coulter)
キャピラリー： ヒューズドシリカ管（Beckman社製）、
内径75μｍ、総長31.2ｃｍ、有効長21ｃｍ
泳動条件 ： １０ｋＶ、２０分
泳動緩衝液 ： トリス10.8ｇ、ホウ酸5.5ｇ、0.5M EDTA（pH8）４ml、アルギン酸ナトリウム0.1ｇ及び塩化ナトリウム２ｇを水に溶解して1000ｍｌに調整
検出条件 ： 励起波長488nm、アルゴンイオンレーザーモジュールのレーザー光使用
蛍光波長530nm
検出器 ： MDQレーザ誘導蛍光（LIF）ディテクター。
【００３４】
得られたキャピラリー電気泳動のフェログラムを図２に示す。図２からわかるように、S.enteritidis及びS.typhimuriumの２株は、それぞれシャープなピークとして良好に分離、検出できることが確認できた。
【００３５】
次いで、S.enteritidisについて、その培養液を100ｍＭのトリス−ホウ酸緩衝液により50倍、100倍及び500倍と希釈して、それぞれについて上記条件下でキャピラリー電気泳動を行った結果を図３に示す。検出ピークを分画したものを蛍光顕微鏡で観察することによって測定したサルモネラ菌数に対して各蛍光ピーク面積をプロットしたところ、図４に示すように、蛍光強度はサルモネラ菌数と比例関係にあることが示された。このことから、本発明に蛍光キャピラリー電気泳動法によって検体中のサルモネラ菌を定量的に測定することができることが判明した。
【００３６】
実施例２
S.enteritidis の培養液から500μｌを1.5ｍｌ容量のサンプルチューブにとり、これにFITC標識Anti-Salmonella抗体溶液（１mg/ml、Kirkegaard & Perry Lab.Inc.社製）５μｌ加え、暗所で室温で１５分間放置した後、実施例１と同じ条件下で蛍光キャピラリー電気泳動を行った。また、100ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液500μｌにFITC標識Anti-Salmonella抗体溶液５μｌを添加したもの（コントロール）、並びにBrucella sp. strain KYM-1, Stenotrophomonas sp. strain KYM2, Acinetobacter sp. strain KYM3, Commanonas sp. strain KYM4, Aureobacterium sp. strain KYM6, Cellulomonas sp. strain KYM7, Acinetobacterium sp. strain KYM8, Escherichia coli３種の合計１０種類の菌株をそれぞれ105個/mlとなるように100ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液500μｌに溶解し、FITC標識Anti-Salmonella抗体溶液５μｌを加え、暗所で室温で１５分間放置したもの（比較標品）についても同様にして蛍光キャピラリー電気泳動を行った。各試料のフェログラムを図５に示す。緩衝液にFITC標識Anti-Salmonella抗体だけを入れたコントロール標品は、電気浸透流とほぼ同じ保持時間にフリーのFITC標識Anti-Salmonella抗体のピークが検出され、他のピークは観察されなかった。１０種類の細菌についても（比較標品）、コントロールと同様にフリーのFITC標識Anti-Salmonella抗体のピークのみが検出された。一方、S.enteritidisは、フリーのFITC標識Anti-Salmonella抗体のピーク以外に、BacLight SYTO9を入れた時と同じ移動度にピークが検出され、このピーク画分を収集し蛍光顕微鏡により観察したところ、蛍光を発する菌体が確認できた。これにより、FITC標識Anti-Salmonella抗体が特異的にS.enteritidisと結合し、検出されたことが判明した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、検体試料中の微生物を短時間でかつ精度よく分析（分離、検出）できる方法並びに装置を提供することができる。請求項１にかかるアルギン酸塩を配合した泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動によれば、微生物を高性能に且つ再現性よく分離することができる。かかる方法は特にサルモネラ等のグラム陰性菌の分離に有用であり、この方法によればサルモネラに属する菌種・菌株を個々に分離することが可能となる。請求項２にかかる蛍光抗体を利用したキャピラリー電気泳動法によれば、検体試料中に含まれる微生物を特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作なしに短時間に且つ容易にまた正確に検出できるため、高い精度の微生物検査とモニタリングシステムの確立が可能となる。請求項３にかかる分析方法によれば、試料中に含まれる微生物を再現性よく高い分離能をもって分離することができ、さらに蛍光検出手段としてレーザー誘導蛍光検出器を利用することにより所望の微生物を高感度且つ特異的に検出することができるので、試料を培養などの増殖処理を施すことなく、微量の微生物を精度よく分離検出することができる。これらの本発明の方法は定量性を有するため、試料中に存在する菌体数を判別測定（定量分析）することも可能である。
【００３８】
また本発明の方法及び装置によれば、試料中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体など）を使用することにより菌種の同定も可能である。特に本発明の方法は、微生物、特に食中毒菌であるサルモネラの分離能に優れているため、試料中に存在する数種類（亜種、血清型）のサルモネラを一斉に分析し同定することが可能である。
【００３９】
このように本発明の方法及び装置は、特にサルモネラの分析（定性分析、定量分析）に適しているため、サルモネラによって汚染された食材や食品が早期に排除でき食中毒の発生の防止に有用である。またサルモネラによる食中毒患者の早期診断が可能になることから、食中毒蔓延の防止並びに早期治療の一助となる。さらには食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から正味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のキャピラリー電気泳動による微生物の分析装置の概略構成を示す図である。
【図２】実施例１において、BacLight(SYTO9)を用いてS.enteritidis 及び S.typhimuriumをキャピラリー電気泳動で検出したフェログラムを示す図である。縦軸は蛍光強度を、横軸は時間（分）を示す。
【図３】実施例１において、S.enteritidisについてその培養液を50倍、100倍及び500倍に希釈してキャピラリー電気泳動を行った結果を示す図である。縦軸は蛍光強度を、横軸は時間（分）を示す
【図４】実施例１において、キャピラリー電気泳動によって分離したS.enteritidisについて、該電気泳動に供した菌数に対する蛍光ピーク面積を示す図である。
【図５】実施例２において、FITC標識Anti-Salmonella抗体を用いてS.enteritidisを蛍光キャピラリー電気泳動によって検出した結果を示す図である。縦軸は蛍光強度を、横軸は時間（分）を示す。なお、最初に出現するピークはフリーの蛍光標識抗体に由来するものである。
【符号の説明】
１．キャピラリー電気泳動による微生物の分析装置
10．キャピラリー
10a．入口側
10b．出口側
11．水槽（陽極側）
12．水槽（陰極側）
13．電極（陽極側）
14．電極（陰極側）
15．電源
16．検出用セル（フローセル）
17．光源（レーザー光源）
18．検出器（レーザー誘導蛍光検出器）
19．分離された微生物
【発明の属する技術分野】
本発明は、キャピラリー電気泳動を用いて、検体試料中に存在する微生物を分析する方法並びに分析装置に関する。本発明の分析方法並びに分析装置は、環境、食品及び医療分野等において、検体試料中に混在する微生物を精度よく又は一斉分析する上で有用である。
【０００２】
なお、本発明で分析とは、試料中に含まれる所望微生物の分離、検出（定性的分析）、同定、定量、スクリーニング、生死判別を包含するものである。
【０００３】
【従来の技術】
一般に、試料中に微生物が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量を調べるためには、一旦これらの試料を適当な培地に接種して培養することによって目的の微生物を増殖させる必要がある。このため、従来、微生物の分析にはその培養のために少なくとも数時間という長い時間が必要であり、結果が迅速に得られないという問題があった。また、細菌培養は基本的に無菌的に行われるため、特殊な培養技術や設備が要求される。
【０００４】
これらのことから、微生物の培養並びに高度な技術や装置を要することなく、試料中に含まれ得る微生物を迅速に且つ簡便に検出し得る方法が望まれている。
【０００５】
微生物の中でも腸内細菌であるサルモネラは、大腸菌および赤痢菌と共に、食中毒を発症する最多原因菌として知られている。サルモネラによる食中毒は、サルモネラに汚染された食肉、牛乳、卵およびこれらの加工食品を摂取し、サルモネラが腸管内で増殖することによって起こる感染型食中毒であり、1999年度の食中毒患者総数（ウイルス、自然毒、化学物質などを含む）の３分の１がサルモネラ中毒であると報告されるように、年々増加の傾向にある。
【０００６】
サルモネラによるヒトの疾病には、基本的には上記食中毒という形で発症する急性胃腸炎、並びにチフス性疾患（腸チフス、パラチフス）の２種類が知られているが、これらの疾病は、同じサルモネラに属する細菌でも異なる亜種（７種）や血清型（約2,200種）によってもたらされる。例えば急性胃腸炎（食中毒）は宿主域の広い亜種Ｉ血清型のいずれでも起こりうるが、一般にはネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び腸炎菌（Salmonella enteritidis）によって生じ、またチフス性疾患はごく少数の亜種Ｉ血清型（Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Paratyphi C, Sendai）で生じることが知られている。
【０００７】
このように多くの種類に分類されるサルモネラの検出は、従来、選択分離培養で培養後、疑わしい集落を釣菌し、確認培地や同定キットあるいは抗血清により判定する必要があり、菌種・菌株を正確に同定するには多くの経験と熟練が必要であった。また、培養などの時間を合わせると判定結果には３〜５日間の長期間を要していた。
【０００８】
このため食品及び医療分野では、微生物、とりわけ多くの種類に分類されるサルモネラを菌種・菌株毎に特異的に検出するための迅速で且つ安全な方法の確立が求められているのが実情である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
感染症疾患に対して迅速に適切な処置を施したり、その感染源を迅速に阻止するためには、感染源となりうる微生物の迅速で且つ特異的な検出方法が求められる。そこで、本発明は各種微生物、とりわけサルモネラを迅速且つ高感度に分離検出等する分析方法並びに該方法に使用される分析装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルギン酸塩を配合した泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動法を利用することにより、試料中に種々含まれる微生物、特にサルモネラを高い分離能をもって且つ再現性よく分離することができることを見出した。また本発明者らは、キャピラリー電気泳動法において検出手段として蛍光検出器を利用することによって、とりわけ蛍光抗体で目的の微生物を予め蛍光標識することによって、微量の微生物であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出できること、またこれにより更に一層高い分離能でもって精度よく所望の微生物が検出できることを見出した。更に本発明者らは、本発明の方法によると試料中に混在する微生物が単に検出できるだけでなく、定量的に測定できることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
すなわち本発明は下記（１）〜（４）に掲げる微生物の分析方法である：
（１）微生物を含む試料を、アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動することを特徴とする、微生物の分析方法。
（２）微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍光抗体で処理し、これをキャピラリー電気泳動に供して、蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出することを特徴とする、微生物の分析方法。
（３）アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動することを特徴とする、（２）記載の微生物の分析方法。
（４）微生物が、サルモネラに属する細菌であることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の微生物の分析方法。
【００１２】
さらに本発明は下記（５）〜（７）に掲げる微生物の分析装置である：
（５）キャピラリー電気泳動を用いて微生物を分析する方法であって、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離するキャピラリー、および(iii)分離された微生物を検出するための検出手段、を備えることを特徴とする微生物の分析装置。
（６）検出手段として蛍光検出器を備えることを特徴とする（５）記載の微生物の分析装置。
（７）検出する微生物がサルモネラに属する細菌であることを特徴とする（５）または（６）に記載の微生物の分析装置。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（１）微生物の分析方法
本発明の微生物の分析方法は、第１に、微生物の分離にアルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動法を利用することを特徴とする。また本発明の微生物の分析方法は、第２に、微生物をキャピラリー電気泳動法によって分離し蛍光的に検出すること、具体的には目的微生物を蛍光抗体で標識することによって蛍光的に検出することを特徴とするものである。
【００１４】
ここで用いられるキャピラリー電気泳動法は、泳動緩衝液としてアルギン酸塩を配合した緩衝液を使用する以外は、特に制限されることなく、従来公知の方法を任意に使用することができる。また、泳動緩衝液としてアルギン酸塩を配合した緩衝液を使用する限り、マイクロチップ電気泳動技術も含めて将来開発されるキャピラリー電気泳動法も制限されることなく使用できる。
【００１５】
泳動緩衝液中に含まれるアルギン酸塩の割合は特に制限されないが、通常０．００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、より好ましくは０．００１〜０．０１重量％を挙げることができる。アルギン酸の塩としては、具体的にナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウムやカルシウムなどのアルカリ土類金属塩、またはアンモニウム塩を挙げることができるが、好ましくはアルギン酸ナトリウムである。また、泳動緩衝液としては、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ７〜９の範囲に緩衝能を有するものであればよく、具体的にはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、またはシュウ酸緩衝液を例示することができる。好ましくはトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液である。また、これらの泳動緩衝液の濃度としては、通常１〜１０００ｍＭ、好ましくは２〜２００ｍＭの範囲を挙げることができる。
【００１６】
図１に本発明で利用できるキャピラリー電気泳動システムの基本的構成を一例として示す。ここで中空キャピラリー１０の両端は、上記泳動緩衝液を入れた水槽１１及び１２にそれぞれ浸され、キャピラリー内は当該泳動緩衝液で満たされている。水槽１１及び１２には、それぞれ電極（１３，１４）が付けられており、これらは高電圧サプライなどのように電源１５を介して連結されている。
【００１７】
分析対象である微生物を含む試料は、キャピラリーの一端（入口側、１０ａ）から注入され、次いで電源１５が作動されることにより、泳動領域でキャピラリー内に電位勾配が発生する。キャピラリー内壁に表面電荷が存在する場合、この電位勾配によりキャピラリー内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それは陰極方向への流れとなる。また、キャピラリー内に注入された微生物は、上記発生した電位勾配に応答して、該微生物が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極方向へ移動する。結果としてキャピラリー内での該微生物の泳動方向及び速度は、上記電気浸透流速度と該微生物の移動度によって決まり、キャピラリーの反対端（出口側、１０ｂ）の近くに備えられた検出器１８によって検出される。尚、検出手段として光学的検出方法を利用する場合は、キャピラリーそのものがフローセル１６となり、キャピラリー壁を通して直接光学的に検出される。
【００１８】
キャピラリー内への試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法、減圧法及び電気泳動注入法のいずれをも使用することができる。注入量も特に制限されないが、通常０．１〜１００ｎｌ、好ましくは１〜１００ｎｌ、より好ましくは１〜１０ｎｌを例示することができる。
【００１９】
尚、上記で例示した一対の電極（１３、１４）及び電源１５は、キャピラリー内に注入された微生物がキャピラリー内の泳動緩衝液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、キャピラリー中の泳動緩衝液に対して印加するための手段であり、かかる目的が達成できるものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）に何ら限定されることなく任意の手段（電位勾配を印加する手段）を使用することができる。
【００２０】
上記のように印加手段として電源および電極を使用する場合、電極はそれぞれの泳動緩衝液を満たした対極の水槽中に挿入されており、電源が入れられると、陽極（アノード）と陰極（カソード）との間に電位勾配が形成され、それによってキャピラリーに注入された微生物は、それが有する電荷と電気浸透流速度のバランスによりしかるべき電極方向へ移動する。一般的には、微生物の表面電荷は負であることが多いので微生物は陽極方向に移動する性質をもつが、上記電気浸透流速度がこの微生物泳動速度より大きい場合が多いので、微生物は結果として陰極へと移動する。
【００２１】
印加手段が電極を含む場合、電極間にかけられる電圧としては、キャピラリー長さに対して、一般に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋＶ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを挙げることができる。
【００２２】
キャピラリーとしては、内径１〜１５０μｍ、長さ０.１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空キャピラリーを挙げることができる。その材質としては特に制限されず、ガラス製やテフロン製などを任意に例示することができるが、好ましくはフューズドシリカ製である。
【００２３】
キャピラリー内で分離された微生物を検出する手段としては、分光学的、電気化学的、重量分析的方法のいずれもが使用できるが、好ましくはＵＶ−可視検出、蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法が挙げられる。中でも検出の特異性と感度に優れた蛍光検出法が好ましく、特により高感度検出が可能なレーザー誘導蛍光検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検出は、免疫反応（抗原抗体反応）、酵素反応、及び核酸相補鎖形成反応、等を最終信号検出手段として利用することができ、これらの反応を目的微生物に応じて適宜組み合わせることで、目的微生物をより特異的且つ高感度に検出することができる。これらの方法の中でも免疫反応は、微生物試料に特別な前処理をする必要がなく、また特異性に優れている点で、好ましい方法の１つである。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵素抗体ともいう）等を用いて目的の微生物を蛍光や酵素等で標識する方法を挙げることができる。
【００２４】
例えば、微生物を標識するために使用される蛍光試薬としては、特に制限されることなく従来公知若しくは将来知られうるものを広く挙げることができるが、具体的にはBODIPY FL（4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic Acid, Succinimidyl Ester）（励起波長503nm、蛍光波長512nm、Molecular Probe社製）、SYTO9（励起波長480nm、蛍光波長500nm、Molecular Probe社製）、FITC（Fluorescein Isothiocyanate)（励起波長490nm、蛍光波長520nm、Dojin社製）、TexasRed（励起波長596nm、蛍光波長620nm、Molecular Probe社製）、TRITC（Tetramethylrhodamine Isothiocyanate）（励起波長541nm、蛍光波長572nm、Research Organics社製）、Cy3（N,N'-diethyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid）（励起波長552nm、蛍光波長565nm、Amersham Pharmacia Biotech社製）、Cy5（N,N'-di-carboxypentyl-indodicarbocyanine-5,5'-disulfonic acid）(励起波長650nm、蛍光波長667nm、Amersham Pharmacia Biotech社製）、Acridine Orange（励起波長490nm、蛍光波長530nm、640nm、Wako社製）、Ethidum Bromide（励起波長545nm、蛍光波長605nm、Dojin社製）、Propidum iodide（励起波長530nm、蛍光波長615nm、Dojin社製）、Calcein（励起波長495nm、蛍光波長520nm、Dojin社製）、BCECF-AM（2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein Acetoxymethyl Ester）（励起波長500nm、蛍光波長530nm、Molecular Probe社製）、Evans blue（励起波長550nm、蛍光波長610nm、Wako社製）、Lucifer Yellow CH（励起波長430nm、蛍光波長535nm、ICN Pharmaceutical社製）、Dil（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）（励起波長550nm、蛍光波長565nm、Molecular Probe社製）、Dio（励起波長484nm、蛍光波長501nm、Molecular Probe社製）、DioC6(3)（3,3'-Dihexyloxacarbocyanine Iodide）（励起波長480nm、蛍光波長501nm、Lambda Probe & Diagnostics社製）、Rhodamine123（励起波長500nm、蛍光波長540nm、Molecular Probe社製）、Fluo-3（励起波長506nm、蛍光波長526nm、Dojin社製）、Calcium Green（励起波長506nm、蛍光波長526nm、Molecular Probe社製）等を例示することができる。
【００２５】
本発明の方法が対象とする微生物には、細菌類、真菌類、クラミジア、ウイルス、リケッチアが包含される。好ましくは細菌類である。例えば細菌類としてはブドウ球菌、８連球菌、スピリルム、連鎖球菌、球桿菌、桿菌、スピロヘータ、４連球菌、コンマ型球菌及び放線菌などが挙げられる。具体的には、ロドスピリルム（Rhodospirillaceae）、クロマチア（Chromatiaceae）、クロロビウム（Chlorobiaceae）、ミクソコッカス（Myxococcaceae）、アルカンギウム（Archangi aceae）、シストバクター（Cystobacteraceae）、ポリアンギウム（Polyangiaceae）、サイトファーガ（Cytophagaceae）、ベギアトア（Beggiatoaceae）、シモンシエラ（Simonsiellaceae）、リューコトリックス（Leucotrichaceae）、アクロマチウム（Achromatiaceae）、ペロネーマ（Pelonemataceae）、スピロヘータ（Spirochaetaceae）、スピリルム（Spirillaceae）、シュードモナス（Pseudomonadaceae）、アゾトバクター（Azotobacteraceae）、リゾビウム（Rhizobiaceae）、メチロモナス（Methylomonadaceae）、ハロバクテリウム（Halobacteriaceae）、腸内細菌（Enterobacteriaceae）、ヴィブリオ（Vibrionaceae）、バクテロイデス（Bacteroidaceae）、ナイセリア（Neisseriaceae）、ヴェイヨネラ（Veillonellaceae）、アンモニアまたは亜硝酸酸化細菌（Organisms oxidizing ammonia or nitrite）、硫黄代謝細菌（Organisms metabolizing sulfer and sulfer compounds）、酸化鉄および／または酸化マンガン沈着細菌（Organisms depositing iron and/or manganese oxides）、シデロカプサ（Siderocapsaceae）、メタノバクテリウム（Methanobacteriaceae）、好気性および／または通性嫌気性ミクロコッカス（Aerobic and/or facultatively anaerobic Micrococcaceae）、ストレプトコッカス（Streptococcaceae）、嫌気性ペプトコッカス（Anaerobic Peptococcaceae）、バチルス（Bacillaceae）、乳酸桿菌（Lactobacillaceae）、コリネフォルム細菌（Coryneform group of bacteria）、プロピオン酸菌（Propionibacteriaceae）、アクチノミセス（Actinomycetaceae）、マイコバクテリウム（Mycobacteriaceae）、フランキア（Frankiaceae）、アクチノプラーネス（Actinoplanaceae）、デルマトフィルス（Dermatophilaceae）、ノカルディア（Nocardiaceae）、ストレプトミセス（Streptomycetaceae）、ミクロモノスポラ（Micromonosporaceae）、リケッチア (Rickettsiaceae）、バルトネラ（Bartonellaceae）、アナプラズマ（Anaplasmataceae）、クラミジア（Chlamydiaceae）、マイコプラズマ（Mycoplasmataceae）、およびアコレプラズマ（Acholeplasmataceae）などを挙げることができる。好ましくはグラム陰性菌に属する細菌類であり、中でも腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する大腸菌、赤痢菌、サルモネラ及びYersinia属に属する細菌（ペスト菌、仮性結核菌等）等が好適に挙げられる。より好ましくはサルモネラである。
【００２６】
上記の各種の検出対象となる微生物を、蛍光若しくは酵素等で標識化するため使用される抗体としては、上記微生物（細菌、真菌、クラミジア、ウイルス、リケッチャ）に特異的に結合する抗体（以下、抗体にはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が包含される）を任意に例示することができる。例えば、従来公知の細菌に対する抗体としては、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗体、抗トリ型結核菌（Mycobacterium avium）抗体、抗肺炎連鎖球菌（Strptococcus pneumoniae）抗体、抗Streptococcus A group抗体、抗Streptococcus B group抗体，抗Streptococcus D group抗体，抗虫歯レンサ球菌（Streptococcus mutans）抗体，抗黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureuse）抗体，抗表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）抗体，抗大腸菌（Esherichia coli）抗体，抗腸管出血性病原性大腸菌（Echerichia coli O-157:H7）抗体，抗サルモネラ（Salmonella sp.）抗体，抗赤痢（Shigella sp.）抗体，抗カンピロバクター（Campylobacter sp.）抗体，抗ビブリオ（Vibrio cholerae, paraheamoliticase）抗体，抗クレブシエラ（Klebsiella sp.）抗体，抗ブロテウス（Proteus sp.）抗体、抗レイジョネラ（Legionella pneumophila）抗体，抗ヘリコバクター（Hellcobacter pylori）抗体，抗緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）抗体，抗ヘモフィリス（Heamophilisinflenzae, Heamophilis sp.）抗体，抗パスツレラ菌（Pasteurella sp.）抗体，抗髄膜炎菌（Neisseria meningitidis group A,B,C,X,Y,Z,W,E）抗体，抗リン菌（Neisseria gonorrhea）抗体，抗リステリア菌（Listeria sp.）抗体，抗ボツリヌス菌（Clostridium botulium）抗体，抗ディフィシル菌（Clostridium difficile）抗体等が例示される。真菌類に対する従来公知の抗体としては、抗カンジダ（Candida albicanse, Candida tropicals, Candida stllatoidea）抗体が例示できる。また、細菌全種に共通する抗原に対する抗体も使用でき、これらのものとしては抗細菌細胞壁ペプチドグリカン（Bacterial peptidoglycan）抗体、抗グラム陽性細菌細胞壁リポティコ酸（Bacterial Lipoteichoicacid）抗体などが知られている。また腸管内に生息する細菌群の分別に有用な抗体としては抗腸内細菌（Enterobacteriaceae α、β）抗体が、また真菌に対する共通抗体しては抗マンナン、抗ガラクトマンナン、１−３β−Ｄグルカンなどが知られている。
【００２７】
本発明の方法が分析対象とする試料は、微生物を含有することが疑われる試料であり、医療分野では各種（疑）感染患者から採取される血液、尿、糞便、喀痰、髄液、膿、唾液などの生体試料を、また食品分野では食肉、卵、野菜、魚、ミルクなどの原材料や種々の加工品を例示することができる。
【００２８】
（２）微生物の分析装置
本発明の微生物の分析装置はキャピラリー電気泳動を原理とするものであり、具体的には、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含む一対の水槽、(ii)該泳動緩衝液に注入された微生物を分離するキャピラリー、(iii)キャピラリー中の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、(iv)キャピラリー内で分離された微生物を検出するための検出手段、を備えることを特徴とする。
【００２９】
図１は、本発明にかかるキャピラリー電気泳動による微生物の分析装置の概略構成を示す一例である。かかる図面を利用して本発明の分析装置をより詳細に説明すると、本発明の分析装置１は、アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含む一対の水槽（陽極側水槽（１１）、陰極側水槽（１２））、注入された微生物を分離するためのキャピラリー１０、キャピラリー中の泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段としての一対の電極（陽極側（１３）、陰極側（１４））及び電源１５、並びに、キャピラリー内で分離された微生物を検出するための検出手段として例えばレーザー光源等の光源１７及び該レーザー照射によって生じる蛍光を検出する検出器１８を含むように構成されている。キャピラリー１０の両端は泳動緩衝液を入れた水槽１１及び１２にそれぞれ浸され、キャピラリー内は当該泳動緩衝液で満たされている。水槽１１及び１２には、それぞれ電極１３及び１４が付けられており、これらには導線を介して電源１５が接続されている。なお、検出手段はキャピラリーの出口側部分（１０ｂ）に設けられる。当該キャピラリー部分は外壁が剥がされることによってキャピラリーそのものが検出用セル（フローセル）１６として形成され、キャピラリー壁を通して直接光学的に検出されるようになっている。なお、水槽には、電圧をかける際に発生する熱によるキャピラリー内の水溶液の水温の上昇を防ぐためにその外周に冷却手段が設けられていてもよい（図示せず）。
【００３０】
かかる分析装置によれば、キャピラリー１０の一端（入口側、１０ａ）に分析対象である微生物を含む試料を注入した後、電源１５を作動させて電極１１と電極１２との間に電圧をかけることにより、泳動領域内（キャピラリー内）の液全体は電気浸透現象により陰極方向への流れを発生する。一方、微生物は、それが有する電荷とは逆の極性を有する電極側（水槽）へと移動しようとする。例えば表面電荷が負である微生物は陽極側へ移動しようとする。かかる移動は上記電気浸透流に比べて十分小さい場合が多く、この泳動過程よりキャピラリー内で分離された微生物は、電気浸透流に流される形でキャピラリーの出口側（１０ｂ）の検出部でＵＶ−可視検出器又は蛍光検出器などによって光学的に検出することができる。分析対象の微生物が蛍光抗体などで蛍光標識されている場合は、検出器１８としてレーザー誘導蛍光検出器を使用することによって、光源１７からレーザー照射されることによって微生物が発生する蛍光を検出することができる。
【００３１】
なお、当該分析装置に用いられるアルギン酸塩を含む泳動緩衝液、キャピラリー、キャピラリーの泳動緩衝液に電位勾配を印加する手段、分析対象となる微生物、及び検出手段については、本発明の微生物分析方法に関して前述するものを広く挙げることができる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
S.enteritidis と S.typhimuriumの各々の斜面個体培養物からそれぞれ１白金耳を取り、これらを常法に従って調整したＥＥＭブイヨン培地（Enterbacteriaceae Enrichment Mannitol (EEM)ブイヨン培地：4.35g/100ml）５０ｍｌを含む200ｍｌ容の三角フラスコに別個に接種した後、３７℃で１６時間振盪培養した。振盪培養後、それぞれの培養液から500μｌを1.5ｍｌ容量のサンプルチューブにとり、これにLIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits（Molecular Probes社製）のＳＹＴＯ９溶液Ａを0.75μｌ添加し、暗所で室温１５分放置した後、キャピラリー電気泳動に供した。尚、キャピラリーは、泳動前に予め１Ｎ及び0.1Ｎの水酸化ナトリウムでそれぞれ２０psi、１分間、超純水で２０psi、３分間、及び泳動緩衝液で２０psi、２分間洗浄しておいたものを使用した。かかるキャピラリーに上記サンプルを0.5psiで５秒間注入し、下記条件下で電気泳動及び検出を行った。
【００３３】
＜キャピラリー電気泳動及び検出条件＞
装置 ： P/ACE system MDQ (Beckman Coulter)
キャピラリー： ヒューズドシリカ管（Beckman社製）、
内径75μｍ、総長31.2ｃｍ、有効長21ｃｍ
泳動条件 ： １０ｋＶ、２０分
泳動緩衝液 ： トリス10.8ｇ、ホウ酸5.5ｇ、0.5M EDTA（pH8）４ml、アルギン酸ナトリウム0.1ｇ及び塩化ナトリウム２ｇを水に溶解して1000ｍｌに調整
検出条件 ： 励起波長488nm、アルゴンイオンレーザーモジュールのレーザー光使用
蛍光波長530nm
検出器 ： MDQレーザ誘導蛍光（LIF）ディテクター。
【００３４】
得られたキャピラリー電気泳動のフェログラムを図２に示す。図２からわかるように、S.enteritidis及びS.typhimuriumの２株は、それぞれシャープなピークとして良好に分離、検出できることが確認できた。
【００３５】
次いで、S.enteritidisについて、その培養液を100ｍＭのトリス−ホウ酸緩衝液により50倍、100倍及び500倍と希釈して、それぞれについて上記条件下でキャピラリー電気泳動を行った結果を図３に示す。検出ピークを分画したものを蛍光顕微鏡で観察することによって測定したサルモネラ菌数に対して各蛍光ピーク面積をプロットしたところ、図４に示すように、蛍光強度はサルモネラ菌数と比例関係にあることが示された。このことから、本発明に蛍光キャピラリー電気泳動法によって検体中のサルモネラ菌を定量的に測定することができることが判明した。
【００３６】
実施例２
S.enteritidis の培養液から500μｌを1.5ｍｌ容量のサンプルチューブにとり、これにFITC標識Anti-Salmonella抗体溶液（１mg/ml、Kirkegaard & Perry Lab.Inc.社製）５μｌ加え、暗所で室温で１５分間放置した後、実施例１と同じ条件下で蛍光キャピラリー電気泳動を行った。また、100ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液500μｌにFITC標識Anti-Salmonella抗体溶液５μｌを添加したもの（コントロール）、並びにBrucella sp. strain KYM-1, Stenotrophomonas sp. strain KYM2, Acinetobacter sp. strain KYM3, Commanonas sp. strain KYM4, Aureobacterium sp. strain KYM6, Cellulomonas sp. strain KYM7, Acinetobacterium sp. strain KYM8, Escherichia coli３種の合計１０種類の菌株をそれぞれ105個/mlとなるように100ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液500μｌに溶解し、FITC標識Anti-Salmonella抗体溶液５μｌを加え、暗所で室温で１５分間放置したもの（比較標品）についても同様にして蛍光キャピラリー電気泳動を行った。各試料のフェログラムを図５に示す。緩衝液にFITC標識Anti-Salmonella抗体だけを入れたコントロール標品は、電気浸透流とほぼ同じ保持時間にフリーのFITC標識Anti-Salmonella抗体のピークが検出され、他のピークは観察されなかった。１０種類の細菌についても（比較標品）、コントロールと同様にフリーのFITC標識Anti-Salmonella抗体のピークのみが検出された。一方、S.enteritidisは、フリーのFITC標識Anti-Salmonella抗体のピーク以外に、BacLight SYTO9を入れた時と同じ移動度にピークが検出され、このピーク画分を収集し蛍光顕微鏡により観察したところ、蛍光を発する菌体が確認できた。これにより、FITC標識Anti-Salmonella抗体が特異的にS.enteritidisと結合し、検出されたことが判明した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、検体試料中の微生物を短時間でかつ精度よく分析（分離、検出）できる方法並びに装置を提供することができる。請求項１にかかるアルギン酸塩を配合した泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動によれば、微生物を高性能に且つ再現性よく分離することができる。かかる方法は特にサルモネラ等のグラム陰性菌の分離に有用であり、この方法によればサルモネラに属する菌種・菌株を個々に分離することが可能となる。請求項２にかかる蛍光抗体を利用したキャピラリー電気泳動法によれば、検体試料中に含まれる微生物を特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作なしに短時間に且つ容易にまた正確に検出できるため、高い精度の微生物検査とモニタリングシステムの確立が可能となる。請求項３にかかる分析方法によれば、試料中に含まれる微生物を再現性よく高い分離能をもって分離することができ、さらに蛍光検出手段としてレーザー誘導蛍光検出器を利用することにより所望の微生物を高感度且つ特異的に検出することができるので、試料を培養などの増殖処理を施すことなく、微量の微生物を精度よく分離検出することができる。これらの本発明の方法は定量性を有するため、試料中に存在する菌体数を判別測定（定量分析）することも可能である。
【００３８】
また本発明の方法及び装置によれば、試料中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体など）を使用することにより菌種の同定も可能である。特に本発明の方法は、微生物、特に食中毒菌であるサルモネラの分離能に優れているため、試料中に存在する数種類（亜種、血清型）のサルモネラを一斉に分析し同定することが可能である。
【００３９】
このように本発明の方法及び装置は、特にサルモネラの分析（定性分析、定量分析）に適しているため、サルモネラによって汚染された食材や食品が早期に排除でき食中毒の発生の防止に有用である。またサルモネラによる食中毒患者の早期診断が可能になることから、食中毒蔓延の防止並びに早期治療の一助となる。さらには食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から正味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のキャピラリー電気泳動による微生物の分析装置の概略構成を示す図である。
【図２】実施例１において、BacLight(SYTO9)を用いてS.enteritidis 及び S.typhimuriumをキャピラリー電気泳動で検出したフェログラムを示す図である。縦軸は蛍光強度を、横軸は時間（分）を示す。
【図３】実施例１において、S.enteritidisについてその培養液を50倍、100倍及び500倍に希釈してキャピラリー電気泳動を行った結果を示す図である。縦軸は蛍光強度を、横軸は時間（分）を示す
【図４】実施例１において、キャピラリー電気泳動によって分離したS.enteritidisについて、該電気泳動に供した菌数に対する蛍光ピーク面積を示す図である。
【図５】実施例２において、FITC標識Anti-Salmonella抗体を用いてS.enteritidisを蛍光キャピラリー電気泳動によって検出した結果を示す図である。縦軸は蛍光強度を、横軸は時間（分）を示す。なお、最初に出現するピークはフリーの蛍光標識抗体に由来するものである。
【符号の説明】
１．キャピラリー電気泳動による微生物の分析装置
10．キャピラリー
10a．入口側
10b．出口側
11．水槽（陽極側）
12．水槽（陰極側）
13．電極（陽極側）
14．電極（陰極側）
15．電源
16．検出用セル（フローセル）
17．光源（レーザー光源）
18．検出器（レーザー誘導蛍光検出器）
19．分離された微生物
Claims (6)
- 微生物を含む試料を、アルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いてキャピラリー電気泳動することを特徴とする、微生物の分析方法。
- 微生物を含む試料を該微生物に結合する蛍光抗体で処理し、これをアルギン酸塩を含有する泳動緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動に供して、蛍光抗体で標識された微生物を蛍光検出することを特徴とする、微生物の分析方法。
- 微生物が、サルモネラに属する細菌であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の微生物の分析方法。
- キャピラリー電気泳動を用いて微生物を分析する方法であって、(i)アルギン酸塩を含む泳動緩衝液を含む水槽、(ii)泳動緩衝液に注入された微生物を分離するキャピラリー、および(iii)分離された微生物を検出するための検出手段、を備えることを特徴とする微生物の分析装置。
- 検出手段として蛍光検出器を備えることを特徴とする請求項４記載の微生物の分析装置。
- 検出する微生物がサルモネラに属する細菌であることを特徴とする請求項４または５に記載の微生物の分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000380547A JP4639298B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000380547A JP4639298B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002181781A JP2002181781A (ja) | 2002-06-26 |
| JP4639298B2 true JP4639298B2 (ja) | 2011-02-23 |
Family
ID=18848707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000380547A Expired - Fee Related JP4639298B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4639298B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4512745B2 (ja) * | 2004-10-29 | 2010-07-28 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 細胞の分離、同定装置及び方法 |
| JP4677524B2 (ja) * | 2004-12-13 | 2011-04-27 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 微細管電気泳動による微生物分離用分離促進剤及び分析装置 |
| JP4742712B2 (ja) * | 2005-07-14 | 2011-08-10 | 株式会社島津製作所 | キャピラリー電気泳動方法 |
-
2000
- 2000-12-14 JP JP2000380547A patent/JP4639298B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002181781A (ja) | 2002-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sohrabi et al. | Lateral flow assays (LFA) for detection of pathogenic bacteria: A small point-of-care platform for diagnosis of human infectious diseases | |
| Guan et al. | Rapid detection of pathogens using antibody-coated microbeads with bioluminescence in microfluidic chips | |
| Schreier et al. | Leptospirosis: current situation and trends of specific laboratory tests | |
| US5821066A (en) | Simple, rapid method for the detection, identification and enumeration of specific viable microorganisms | |
| Deisingh et al. | Detection of infectious and toxigenic bacteria | |
| Favrin et al. | Development and optimization of a novel immunomagnetic separation-bacteriophage assay for detection of Salmonella enterica serovar enteritidis in broth | |
| Chapman et al. | Use of commercial enzyme immunoassays and immunomagnetic separation systems for detecting Escherichia coli O157 in bovine fecal samples | |
| Song et al. | Simple sensitive rapid detection of Escherichia coli O157: H7 in food samples by label-free immunofluorescence strip sensor | |
| JP2018029610A (ja) | 微生物培養試料中の微生物を検出および同定するための方法、システムならびにデバイス | |
| US20070059725A1 (en) | Apparatus and method for detecting microscopic organisms using bacteriophage | |
| CN106636387B (zh) | 沙门氏菌核酸快速检测试剂盒、试纸及检测方法 | |
| JP2014131512A (ja) | 均質なプラスチック付着性アプタマー磁性蛍光ビーズ（Ｐｌａｓｔｉｃ−ａｄｈｅｒｅｎｔａｐｔａｍｅｒ−ｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄ−ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の製造方法及びその他のサンドイッチアッセイ | |
| Mazumdar et al. | Surface plasmon resonance (SPR) as a rapid tool for serotyping of Salmonella | |
| Pang et al. | Rapid and quantitative detection of Vibrio parahemolyticus by the mixed-dye-based loop-mediated isothermal amplification assay on a self-priming compartmentalization microfluidic chip | |
| Balakrishnan et al. | A rapid and highly specific immunofluorescence method to detect Escherichia coli O157: H7 in infected meat samples | |
| CN101432739A (zh) | 超灵敏传感器和分析物的快速检测 | |
| Ekrami et al. | Validity of bioconjugated silica nanoparticles in comparison with direct smear, culture, and polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens | |
| JP2011527562A (ja) | 培養可能な細胞の計数のための方法、キット及びシステム | |
| Taha et al. | Rapid detection of Salmonella in chicken meat using immunomagnetic separation, CHROMagar, ELISA and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) | |
| Sun et al. | Review of recent advances in improved lateral flow immunoassay for the detection of pathogenic Escherichia coli O157: H7 in foods | |
| JP4639298B2 (ja) | キャピラリー電気泳動による微生物分析法及び分析装置 | |
| Li et al. | PMAxx combined with recombinase aided amplification technique for specific and rapid detection of Salmonella in milk | |
| Tarh | A Review on Diagnostic Methods for the Identification of Vibrio cholerae | |
| KR20210045879A (ko) | 표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 포함하는 그람 음성균 검출용 조성물 및 이를 이용한 그람 음성균의 검출 방법 | |
| JP4677524B2 (ja) | 微細管電気泳動による微生物分離用分離促進剤及び分析装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071009 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20071009 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20091224 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100728 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100915 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101005 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101026 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131210 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131210 Year of fee payment: 3 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131210 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |