KR20210045879A

KR20210045879A - 표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 포함하는 그람 음성균 검출용 조성물 및 이를 이용한 그람 음성균의 검출 방법

Info

Publication number: KR20210045879A
Application number: KR1020190129453A
Authority: KR
Inventors: 정현정; 류제성
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-04-27
Also published as: KR20220020307A; KR20230061323A

Abstract

본　발명은　표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 포함하는 그람 음성균 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 표지물질로 표지된 콜리스틴 컨쥬게이트를 포함하는 그람 음성균 검출용 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 그람 음성균의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 콜리스틴 또는 폴리믹신 E로 불리는 항생제를 그람 음성균의 검출에 이용하기 위해 예의 연구한 결과, 선택적 리간드로서 콜리스틴 및 표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 선택하여 상기 리간드가 다양한 그람 음성균에 대해 범용적이면서도 특이적인 선택성을 가지고, 다양한 시료에 대해 그람 음성균을 신속하게 검출할 수 있음을 최초로 확인하였는바, 본 발명에 따른 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 검출방법은 신속한 그람 음성균 진단을 위한 플랫폼으로서, 인체 감염의 진단, 식료품 검사, 수질 오염 검사 등에 유용하게 쓰일 것으로 기대된다.

Description

표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 포함하는 그람 음성균 검출용 조성물 및 이를 이용한 그람 음성균의 검출 방법{Gram-negative bacterial detection composition comprising colistin conjugated with labeling material and method for detecting Gram-negative bacteria using thereof}

본　발명은　표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 포함하는 그람 음성균 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 표지물질로 표지된 콜리스틴 컨쥬게이트를 포함하는 그람 음성균 검출용 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 그람 음성균의 검출 방법에 관한 것이다.

그람 음성균의 외부막은 특징적인 구조와 물질로 이루어져 있으며, 이는 내독소 (endotoxin)의 주요 출처이며 항생제가 작용하는 주요 표적이다. 그람 음성균에 의한 병원 내 감염과 사회에서의 감염은 대부분의 경우 숙주의 면역력 문제가 생길 때 발생하는 기회성 감염으로 심각한 건강상의 위험을 야기한다.

그런데 현대의 감염에 대한 치료의 대부분은 증상에 기반한 진단을 한 후 그람 음성균 및 그람 양성균 전체에 작용하는 광범위 항생제를 사용하는 것으로, 이러한 방식으로 최근의 몇 십년간 지속적으로 항생제가 남용되었고, 그 결과 항생제에 대한 다제내성을 갖는 병원균이 인류 전체를 위협하게 되어 새로운 항생제를 필연적으로 개발해야 하게 되었으며, 새로운 항생제는 기존의 항생제보다 더 광범위하게 작용하는 항생제 또는 그람 음성과 그람 양성균에 대해서 선택적으로 적용 가능한 항생제의 개발에 초점이 맞춰져 있는바, 그람 음성균과 그람 양성균을 빠르고 정확하게 구별하는 것은 항생제의 오남용을 확실하게 줄이는 결과를 가져올 수 있을 것으로 예상된다.

또한 종래에 감염의 진단을 위해 사용되는 표준방식인 미생물 배양법은 2내지 7일의 긴 시간이 소요되었고, 큰 배양장비와 더불어 오염에 의한 오진의 가능성을 가지고 있었며, 핵산을 이용한 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 등은 높은 성공률을 보이지만 임상에서 복잡한 과정에 때문에 전문인력이 필요하고 위양성 (false-positive)의 가능성이 있었으며, 면역분석방법 (ELISA)은 단순한 진단방법을 이용하여 소형화 진단기기 등을 쉽게 개발할 수 있었지만, 다양한 표적에 대응하는 항체가 없어 적용범위가 좁은 문제점이 있었다.

이에, 보편화된 방식의 감염균 진단을 목표로 하기 위해 저 분자량의 항생제는 항체를 대체할 좋은 결합 리간드가 될 수 있고 큰 감염균 그룹에 존재하는 공통 물질을 표적하여 특이적으로 감지하는데 사용할 수 있다. 상기 항생제들은 각각 다양한 결합 메커니즘을 가지며 이러한 항생제의 특징을 특정 균에 대한 분석 및 진단을 위한 기술에 응용할 수 있다. 예를 들면 반코마이신과 답토마이신은 그람 양성균에 대한 결합 리간드로서 펩티도글리칸의 소단위 분자와 세포막을 표적으로 하며, 자기 또는 형광을 이용한 분석 진단에 사용할 수 있다.

그람 음성균을 검출하기 위해 폴리믹신으로 알려진 항생제를 사용한 연구가 있으나 (한국공개특허공보 제10-2018-0066103호), 이전의 폴리믹신을 이용한 연구는 나노파티클에 기반한 분석법 및 면역 분석을 중심으로 진행된 것으로 단일 유형의 항생제를 리간드로 사용하여 그람 음성균을 범용적으로 검출하되, 그람 양성균과 특이적으로 검출하거나, 다른 생체 분자 또는 포유류 세포 등을 포함한 복잡하는 환경에서 그람 양성균을 특이적으로 검출한 연구는 전무한 실정이다.

본 발명자들은 콜리스틴 또는 폴리믹신 E로 불리는 항생제를 그람 음성균의 검출에 이용하기 위해 예의 연구한 결과, 선택적 리간드로서 콜리스틴을 선택하여 상기 리간드가 다양한 그람 음성균에 대해 범용적이면서도 특이적인 선택성을 가지고, 다양한 시료에 대해 그람 음성균을 신속하게 검출할 수 있음을 최초로 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트 (Colistin conjugate)를 포함하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria) 검출용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 그람 음성균 검출용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 그람 음성균의 검출 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

(a) 표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트 (Colistin conjugate)를 포함하는, 조성물을 검체 유래의 시료와 배양하여 검체 내 콜리스틴 컨쥬게이트가 표지된 그람음성균을 형성하는 단계; 및

(b) 상기 콜리스틴 컨쥬게이트가 표지된 그람음성균으로부터 형광변화를 측정하는 단계.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트 (Colistin conjugate)를 포함하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 표지물질은 형광 물질로 형광 유기염료인 Cascade Blue, Pacific Blue, Pacific Orange, fluorescein, FITC, BODIPY-FL, Texas Red, TAMRA, FAM, rhodamine, coumarin, phycoerythrin, TRITC, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Alexa Fluor350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, Alexa Fluor 790과 형광 나노입자로서 CdSe 양자점, CdSe/ZnS 양자점, CdSeS/ZnS 양자점, CdTe 양자점, InP/ZnS 양자점, PbS 양자점, 탄소양자점 및 이들의 접합체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 그람 음성균의 속 (genus)으로 Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter, Acinetobacter, Neisseria, Haemophilus, Chlamydia, Legionella, Helicobacter, Campylobacter, Salmonella, Moraxella, Stenotrophomonas, Proteus, Enterobacter, Serratia, Yersinia 및 그 외에 장내 세균 과에 포함된 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 그람 음성균 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 그람 음성균의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 콜리스틴 컨쥬게이트의 농도는 0.001 μM 내지 100 μM인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 배양은 4 시간 이하의 시간 동안 진행되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 검체 유래의 시료는 다수균의 혼합시료, 동물세포와의 혼합시료 및 혈액 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 그람 음성균의 속 (genus)으로 Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter, Acinetobacter, Neisseria, Haemophilus, Chlamydia, Legionella, Helicobacter, Campylobacter, Salmonella, Moraxella, Stenotrophomonas, Proteus, Enterobacter, Serratia, Yersinia 및 그 외에 장내 세균 과에 포함된 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (a) 단계 후, 상기 콜리스틴 컨쥬게이트가 표지된 그람음성균을 형성하지 않은 콜리스틴 컨쥬게이트를 세척하여 표지된 그람 음성균을 확보하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명자들은 콜리스틴 또는 폴리믹신 E로 불리는 항생제를 그람 음성균의 검출에 이용하기 위해 예의 연구한 결과, 선택적 리간드로서 콜리스틴 및 표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 선택하여 상기 리간드가 다양한 그람 음성균에 대해 범용적이면서도 특이적인 선택성을 가지고, 다양한 시료에 대해 그람 음성균을 신속하게 검출할 수 있음을 최초로 확인하였는바, 본 발명에 따른 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 검출방법은 신속한 그람 음성균 진단을 위한 플랫폼으로서, 인체 감염의 진단, 식료품 검사, 수질 오염 검사 등에 유용하게 쓰일 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 콜리스틴 (폴리믹신 E) 및 콜리스틴-Cy3 의 다양한 이형체의 화학 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 콜리스틴-Cy3를 균 시료에 첨가한 후 배양하여 그람 음성균을 선택적으로 표지하고, 형광 분석을 통해 그람 음성균의 검출 및 정량 분석하는 기술을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 농도의 콜리스틴-Cy3 또는 콜리스틴 컨쥬게이트와 균 시료의 배양 시간을 달리한 경우의 대장균 (E. coli)과 황색포도상구균 (S. aureus)에 대한 표지 정도를 나타낸 결과로서, 도 3a는 콜리스틴-Cy3를 다양한 농도로 대장균 (E. coli)과 황색포도상구균 (S. aureus)에 첨가하고 10분간 배양하여 형광도를 마이크로플레이트 형광분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 3b는 콜리스틴-Cy3를 다양한 농도로 대장균 (E. coli)과 황색포도상구균 (S. aureus)에 첨가하고 10분간 배양하여 형광신호를 공초점현미경으로 관찰한 결과를 이미지로 나타낸 것이며, 도 3c는 콜리스틴-Cy3, 농도 1 μM에서 배양 시간을 달리하여 대장균 (E. coli)과 황색포도상구균 (S. aureus)을 배양한 후 형광도를 마이크로플레이트 형광분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도 3d는 콜리스틴-Cy3, 농도 1 μM에서 배양 시간을 달리하여 대장균 (E. coli)과 황색포도상구균 (S. aureus)을 배양한 후 형광신호를 공초점현미경으로 관찰한 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 4는 범용적 리간드로써 콜리스틴-Cy3의 다양한 병원성의 그람 음성균에 대한 선택성을 검증하기 위해, 그람 음성균과 그람 양성균에 콜리스틴-Cy3를 적용한 후 형광도를 마이크로플레이트 형광분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 범용적 리간드로써 콜리스틴-Cy3의 다양한 병원성의 그람 음성균에 대한 선택성을 검증하기 위해, 그람 음성균과 그람 양성균에 콜리스틴-Cy3를 적용한 후 형광도를 공초점 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 6은 콜리스틴-Cy3의 그람 음성균에 대한 결합 특성을 분석하기 위하여 콜리스틴-Cy3, 1 μM와 함께 개질하지 않은 콜리스틴을 다양한 농도로 첨가하여 대장균 (E. coli)과 황색포도상구균 (S. aureus)을 배양한 후 형광도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 콜리스틴-Cy3가 그람 양성균과 그람 음성균에 미치는 독성 효과를 확인하기 위해 1.5 시간 동안 1 μM의 콜리스틴-Cy3을 상기 균에 첨가한 후 WST-8 키트를 이용하여 생존률을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 그람 음성균이 2 종 이상 또는 그람 음성균 및 그람 양성균이 2 종 이상 동시에 존재하는 혼합 시료에 콜리스틴-Cy3를 첨가하여 표지한 후 형광분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 대장균 (E. coli, 그람 음성균)과 포유류 세포가 혼합된 시료에서 그람 음성균을 콜리스틴-Cy3로 표지한 후 형광분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 대장균 (E. coli, 그람 음성균)과 포유류 세포가와 혼합된 시료에서 그람 음성균을 콜리스틴-Cy3로 표지한 후 공초점현미경으로 관찰한 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 비율의 혈청 용액 내 그람 음성균 (대장균), 그람 양성균 (황색포도상구균, 대조군)을 콜리스틴-Cy3로 표지한 후 표지된 그람 음성균의 형광도를 마이크로플레이트 형광분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 콜리스틴 또는 폴리믹신 E로 불리는 항생제를 그람 음성균의 검출에 이용하기 위해 예의 연구한 결과, 그람 음성균 그룹과 결합하는 선택적 리간드로서 콜리스틴을 선택하여 다양한 그람 음성균에 대해 범용적이면서도 특이적인 선택성을 가지고 다양한 시료에 대해 그람 음성균을 신속하게 검출할 수 있음을 최초로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트 (Colistin conjugate)를 포함하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria) 검출용 조성물을 제공하며, 콜리스틴과 표지물질이 결합된 콜리스 컨쥬게이트는 콜리스틴의 아민기에 검출 가능한 표지물질을 화학결합으로 연결한 것일 수 있으나, 결합의 종류가 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 검출 가능한 표지물질은 형광 물질로 형광 유기염료인 Cascade Blue, Pacific Blue, Pacific Orange, fluorescein, FITC, BODIPY-FL, Texas Red, TAMRA, FAM, rhodamine, coumarin, phycoerythrin, TRITC, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Alexa Fluor350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, Alexa Fluor 790과 형광 나노입자로서 CdSe 양자점, CdSe/ZnS 양자점, CdSeS/ZnS 양자점, CdTe 양자점, InP/ZnS 양자점, PbS 양자점, 탄소양자점 및 이들의 유도체 또는 혼합물인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 검출의 대상으로 하는 “그람 음성균 (Gram-negative bacteria)”은 그람염색을 통해 박테리아를 구분할때, crystal violet　시약의 색을 유지하지 못하는 박테리아 그룹을 지칭하며, 내부　세포질 막과　외막　사이에 얇은 펩티도글리칸　세포벽이 샌드위치 모양처럼 구성된 것이 그람음성균 세포벽의 특징이다. 그람 음성균은 전 세계적으로 퍼져 있으며, 거의 모든 생활 환경에서 생존할 수 있다. 또한 상기 그람 음성균의 속 (genus)으로 Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter, Acinetobacter, Neisseria, Haemophilus, Chlamydia, Legionella, Helicobacter, Campylobacter, Salmonella, Moraxella, Stenotrophomonas, Proteus, Enterobacter, Serratia, Yersinia 및 그 외에 장내 세균 과에 포함된 속과 같은 많은 병원성 박테리아가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, “콜리스틴 (Colistin)”은 일본에서 개발된　항생물질의 하나 일본 후쿠시마현의 토양속에서 고야마 (小山) 등 (1950년)에 의해 분리된 것의　배양여액중에서 발견된 폴리믹신계 항생물질이다. 폴리믹신 B와 마찬가지로 주로 음성간균 (陰性杆菌)에 효과가 있고,　진균 및 그람양성균에는 항균력이 있다고 보고된다. 다른 항생물질과의　교차내성은 없고 항균작용도 살균적이며, 특히　녹농균,　백일해균에 대한 항균력이 강한 것이 특징이며, 강한 신독성을 지니고　내복에서는 거의 흡수되지 않는 특성을 가진다.

본 발명은 실시예에서 검출 과정의 최적화를 통해 형광물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 이용하여 다양한 배양조건에서, 그람 음성균을 가장 효과적으로 표지할 수 있고, 그람 음성균 이외의 균에 대한 비특이적 결합을 최소화하는 조건을 확립하여 그람 음성균의 검출 조건 (콜리스틴 컨쥬게이트의 배양 농도 및 콜리스틴 컨쥬게이트과 시료의 배양 시간)을 도출하였으며, 시료에 그람 음성균이 2 종 이상 또는 그람 음성균 및 그람 양성균이 2 종 이상 동시에 존재하는 경우의 혼합 시료에 대해 콜리스틴-Cy3를 이용한 표지 과정을 수행하여 각각 동일한 균 수로 2 종 또는3 종의 그람 음성균과 그람 양성균을 혼합한 개별 시료의 신호 합에 근접한 형광신호를 나타냄을 확인하였다 (실시예 3-1 참조).

또한 균의 검출에 있어, 특히 인체나 동물 유래 시료는 다양한 생물화학적 물질, 인체 및 동물 세포 이외에 여러 가지 균 등이 함께 섞여 있을 가능성이 높으므로, 두 종류의 세포주 (H1975 와 HeLa)를 그람 음성균인 대장균과 혼합하고 콜리스틴-Cy3를 첨가하여 표지 및 형광분석을 진행한 결과, 포유류 세포와 대장균이 공존하는 경우에 대장균에서만 강한 형광신호가 관찰되어 콜리스틴-Cy3가 대장균에 대해서만 특이적으로 표지되어 검출이 가능함을 확인하였다 (실시예 3-2 참조).

또한 본 발명에 따른 검출법이 혈청에 적용 가능한지 여부를 확인하기 위해, 다양한 농도 조건의 소 유래의 혈청을 준비하고 대장균을 첨가하여 본 발명에 따른 검출방법을 수행한 결과, 대장균 (그람 음성균)의 형광신호는 대조군인 그람 양성균과 비교하였을 때 일관되게 유의미하게 관찰됨을 확인하였다 (실시예 3-3 참조).

상기의 결과들은 혈청과 같이 다양한 생물화학적 물질이 포함된 복잡한 시료에서도 콜리스틴 컨쥬게이트가 그람 음성균을 표지하여 그람 음성균을 검출할 수 있음을 확인한 것이며, 특히 혈액에서 추출한 시료에서 균을 검출할 수 있다는 것은, 최소한의 침투경로를 이용하여 그람 음성균 검출에 관한 임상 진단이 가능함을 확인한 것이다.

이에, 본 발명은 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 그람 음성균의 검출 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 콜리스틴 컨쥬게이트의 농도는 0.001 μM 내지 100 μM인 것일 수 있고, 바람직하게는 0.5 μM 내지 1 μM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1 μM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서 상기 배양 시간은 4시간 이하로 진행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 10분 내지 120분 이하로 진행되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10분 동안 진행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서 상기 검체 유래의 시료는 다수 균의 혼합시료, 동물세포와의 혼합시료 및 혈액 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서 상기 (a) 단계 후, 상기 콜리스틴 컨쥬게이트가 표지된 그람음성균을 형성하지 않은 콜리스틴 컨쥬게이트를 세척하여 표지된 그람 음성균을 확보하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험방법

1-1. 콜리스틴-형광물질 컨쥬게이트 합성

콜리스틴 및 표지물질이 결합한 것을 콜리스틴 컨쥬게이트라고 명칭한다. 상기 콜리스틴 컨쥬게이트를 합성하기 위해, 표지물질의 하나의 예, 형광물질인 Cy3를 콜리스틴에 접합하였다.

그 결과, NHS ester로 활성화된 Cy3가 콜리스틴의 아민기와 반응하여 도 1에 나타낸 바와 같이 콜리스틴의 다수의 아민기 중 일부가 Cy3로 치환된 콜리스틴 컨쥬게이트의 혼합물이 생성됨을 확인하였다.

1-2. 콜리스틴 컨쥬게이트 기반 그람 음성균 검출법 개발 및 최적화

상기 1-1에서 제조된 콜리스틴 컨쥬게이트를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하여 검출법을 규명하고 검출조건을 최적화하였다.

1-2-1. 콜리스틴 컨쥬게이트 기반 그람 음성균 검출 원리

폴리믹신은 환형 펩타이드 항생제의 일종이며, 폴리믹신의 L-diaminobutyric acid 작용기는 양전하를 가지고, acyl chain 작용기는 소수성을 가지므로 상기 L-diaminobutyric acid 작용기는 그람 음성균의 외막에 존재하는 지질다당류 (lipopolysaccharide)와 전기적 결합을 하고, 상기 acyl chain 작용기는 lipid A 와 소수성 작용을 한다.

본 발명에서 콜리스틴은 범용적 결합 리간드로서 다양한 종의 그람 음성균을 진단하기 위하여 사용하였다. 균주 시료를 첨가한 후 단일 과정의 배양을 통해 진단이 진행되고, 형광물질이 컨쥬게이트된 콜리스틴을 첨가한 후 정해진 시간 동안 배양하고, 다공성 필터를 이용하여 시료를 세척하였다. 상기 형광표지된 병원균은 도 2에 나타낸 바와 같이 형광도 측정과 현미경을 이용하여 분석하였다.

콜리스틴은 다른 미생물 또는 포유류 세포의 혼합시료에서 그람 음성균을 범용적이고 선택적으로 구분하며, 병원균 표적에 대한 분류를 확인할 수 있었다. 상기 분석은 하기에 서술하는 바와 같이 10분이라는 짧은 시간 동안 배양하더라도 단일 과정 배양 과정만으로 그람 음성균에 대한 범용적 분류가 가능하여 환자의 머리맡 (bedside) 진단 또는 현장 진단의 도구로서 쉽게 응용할 수 있을 것으로 보인다.

1-2-2. 검출 과정의 최적화

검출 과정의 최적화는 형광물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트를 이용하여 다양한 배양조건에서, 그람 음성균을 가장 효과적으로 표지 가능하고 그람 음성균 이외의 균에 대한 비특이적 결합을 최소화하는 조건을 확립하기 위한 것이다. 검출 과정의 최적화는 하기 실험에 나타낸 바와 같다.

① 최적의 콜리스틴-Cy3 배양 농도 확립

먼저, 대장균 (그람 음성균)과 황색포도상구균 (그람 양성균, 대조군)에 대하여 다양한 농도의 콜리스틴-Cy3에서 배양하여 표지하는 실험을 수행하였다.

그 결과 도 3a에 나타낸 바와 같이, 그람 음성균과 그람 양성균의 형광신호 세기는 0.5 μM 에서는 약 7.0 배 차이인 것으로 확인하였으며, 1.0 μM 에서는 약 6.7 배 차이인 것으로 대장균에서 확인하였다.

상기 결과에 기초하면, 콜리스틴-Cy3의 형광신호는 0.5 μM 와 1 μM 두 경우에서 가장 유의미한 차이로써 그람 음성균과 그람 양성균을 구분함을 알 수 있었다.

다음으로, 콜리스틴-Cy3의 배양 농도가 1 μM에서 2 μM 로 증가한 경우, 배양농도가 1 μM일 때와 비교 시 대장균 (그람 음성균)의 형광신호는 1.3 배 증가하였고, 배양농도가 1 μM일 때와 비교 시 황색포도상구균 (그람 양성균, 대조군)의 형광신호는 1.8 배 증가하였기 때문에, 그람 음성균과 그람 양성균의 전체 형광신호 세기의 차이는 약 5 배 정도이며, 상기 결과는 그람 음성균과 그람 양성균간의 형광신호의 차이가 오히려 감소한 결과이다.

마지막으로, 콜리스틴-Cy3 의 배양농도가 2 μM 보다 높은 조건에서는 추가적인 형광신호의 변화를 확인할 수 없었다.

또한 도 3b에 나타낸 바와 같이, 공초점 현미경을 통해 관찰한 이미지에서 콜리스틴-Cy3의 배양농도가 0.5 μM인 경우 그람 양성 대조군에서 비특이적 결합이 적게 나타남을 확인하였고, 콜리스틴-Cy3의 배양농도가 1 μM인 경우 그람 음성균에서 높고 특정 가능한 형광신호가 나타남을 확인하였다.

전술한 실험결과를 종합하면 콜리스틴-Cy3, 1 μM과 0.5 μM 배양 농도에서 표적 (그람 음성균 또는 그람 양성균)의 형광신호 차이를 현미경을 통해 관찰한 결과 콜리스틴-Cy3, 1 μM 배양 농도에서 형광신호를 통해 그람 음성균과 그람 양성균을 시각적으로 비교하기에 효과적임을 확인하였다.

② 최적의 배양시간 확립

시료 내 균의 표지를 위한 배양 및 결합에 필요한 시간을 최적화하기 위한 실험으로서, 콜리스틴-Cy3 와 균주 시료를 10 내지 120 분 동안 배양하였다.

그 결과 도 3c에 나타낸 바와 같이, 대장균 (그람 음성균)의 형광신호는 배양 시작 후 10 분까지 극적으로 증가하였고, 그 이후 지속적으로 형광신호가 감소하는 것을 확인하였다.

반면에 황색포도상구균 (그람 양성균, 대조군)은 배양시간의 변화에 따른 형광신호 변화가 크게 나타나지 않음을 확인하였다.

전술한 실험결과를 종합하여, 그람 음성균과 콜리스틴-Cy3의 10 분의 배양 시간은 그람 음성균과 콜리스틴-Cy3의 결합 형광신호를 가장 빠르고 유의하게 감지할 수 있는 최적의 배양시간임을 확인하였다.

한편, 10 분 이상 대장균을 배양한 경우 형광신호가 감소한 이유는 콜리스틴의 항생작용으로 인하여 대장균 세포막의 투과도를 높이고 세포질을 불안정하게 만들어 대장균과 콜리스틴-Cy3의 결합을 줄이기 때문으로 예상된다. 단, 도 3d의 공초점 현미경 관찰 결과에서는 10 분 이상 배양한 시료에서 오히려 높은 형광신호를 보이는 모순점이 있지만, 이는 현미경을 이용한 정량분석의 한계 때문이며 세포구조에 문제가 생긴 그람 음성균이 배제되기 때문인 것으로 보인다. 이를 통해 배양시간이 증가함에 따라 대부분의 그람 음성균은 손상을 입지만, 일부 구조를 유지하는 균들은 오히려 더 강한 형광 신호를 나타내는 경우가 있음을 알 수 있었다.

상기 ① 및 ②의 실험 결과에 따라 그람 음성균을 검출하기 위한 최적의 조건으로서 1 μM의 콜리스틴-Cy3 배양 농도 및 10 분의 배양 시간을 결정하였다.

실시예 2. 콜리스틴 컨쥬게이트 기반 그람 음성균 검출의 선택성 검증

상기 1-1에서 제조된 콜리스틴 컨쥬게이트를 이용하여 그람 음성균을 선택적으로 검출할 수 있음을 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

2-1. 다양한 그람 음성균에 대한 선택성 검증

본 발명에 따른 콜리스틴 컨쥬게이트를 이용하여, 그람 음성균에 대한 범용적이며 선택적인 진단이 가능한지 검증하기 위해 다양한 그람 음성균 및 대조군인 그람 양성균을 준비하였다.

상기 그람 음성균으로 대장균, 폐렴막대균, 녹농균 및 아시네토박터 바우마니를 준비하였고, 그람 양성균 대조군으로 황색포도상구균, 표피포도구균 및 엔테로코쿠스 페칼리스를 준비하여 실험을 수행하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 콜리스틴-Cy3를 이용한 그람 음성균의 표지는 대조군인 그람 양성균에 비해 유의미하게 높은 형광신호를 나타냄을 확인하였다.

보다 구체적으로 대조군으로써 그람 양성균은 그람 음성균 (대장균)의 신호 세기의 5~20 % 수준에 해당하는 정도의 낮은 형광신호를 보였으며, 이는 배경 신호의 세기와 비슷한 정도로 낮은 값에 해당한다.

또한 대장균, 폐렴막대균 및 아시네토박터 바우마니는 그람 양성의 황색포도상구균, 표피포도구균 및 엔테로코쿠스 페칼리스 보다 유의미하게 높은 형광신호를 보였다.

단, 또 다른 그람 음성균인 녹농균은 다른 그람 음성균에 비해 낮은 형광신호를 나타냈지만, 대조군인 그람 양성균에 비해서는 3~5 배 높은 형광신호를 나타낸 것으로 확인하였다. 녹농균이 다른 그람 음성균보다 낮은 이유는 녹농균으로부터 형성되는 생물막 (biofilm) 때문인 것으로 추측된다. 형성된 생물막은 각각의 감염균의 표면을 감싸며, 콜리스틴과 녹농균의 상호작용을 방해하는 것으로 보인다.

상기의 결과와 일치하는 결과로, 도 5에 나타낸 바와 같이 공초점 현미경 이미지의 표지에서 그람 음성균은 모두 대조군인 그람 양성균과 비교하였을 때 콜리스틴-Cy3에 의한 강한 형광신호를 나타냄을 확인하였다.

전술한 결과는 콜리스틴이 그람 음성균의 범용적이고 선택적인 리간드이며, 그람 음성균의 검출에 사용 가능함을 확인한 것이다.

2-2. 콜리스틴 컨쥬게이트의 리간드로써 결합 특성 분석 및 콜리스틴-Cy3 배양 조건의 항생효과 분석

① 리간드로써 결합 특성 분석

그람 음성균에 대한 콜리스틴의 결합 특성을 확인하기 위해, 컨쥬게이션되지 않은 단독의 콜리스틴을 콜리스틴-Cy3과 그람 음성균의 배양과정에 추가한 후 형광 분석법을 수행하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 대장균 (그람 음성균)에 콜리스틴을 1 μM까지 추가함에 따라 콜리스틴과 콜리스틴-Cy3의 대장균에 대한 경쟁적 결합으로 인해 형광신호가 70 % 수준으로 감소함을 확인하였다.

또한 1 μM 보다 높은 농도의 콜리스틴을 추가한 경우 (1 내지 3 μM) 형광신호가 지속적으로 흔들리며 감소하는 것을 확인하였으며, 3 μM 보다 높은 고농도의 콜리스틴을 추가한 경우 콜리스틴의 항생 효과인 세포막의 투과도 증가, 세포막 두께 변화 및 파괴가 나타난 것으로 예상되었다.

한편, 황색포도상구균 (그람 양성균, 대조군)의 경우 추가적인 콜리스틴은 콜리스틴-Cy3의 결합에 유의미한 변화를 주지 못했으며, 대장균과 비교할 때 낮은 (< 24 %) 형광신호를 지속적으로 유지하였다.

또한 공초점 현미경과 이미지를 이용한 정량분석에서도 콜리스틴의 농도가 증가함에 따라 콜리스틴-Cy3의 형광 신호가 감소함을 확인하였다.

상기 결과들은 콜리스틴과 콜리스틴-Cy3의 경쟁적 결합과 그람 음성균에 대한 리간드의 결합 특이성을 확인한 것이다.

② 콜리스틴-Cy3 배양 조건의 항생효과 분석

전술한 바와 같이 콜리스틴과 균이 결합함으로써 발생하는 항생효과의 가능성 때문에, 그람 음성균에 컨쥬게이트를 첨가한 상태에서 균의 생존률의 분석이 필요하였다. 보다 구체적으로 그람 음성균과 그람 양성균에 각각 1.5 시간 동안 1 μM의 콜리스틴-Cy3를 첨가하여 배양하였고, 탈수소효소를 이용한 활성도 테스트인 WST-8 키트를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이 모든 그람 음성균과 그람 양성균은 1 μM 콜리스틴 컨쥬게이트를 첨가한 상태에서 1.5 시간의 배양 과정 동안 75 % 이상의 생존률을 나타냄을 확인하였다.

상기 생존률 결과를 토대로 본 실시예에서 사용한 콜리스틴-Cy3 배양 조건은 항생효과를 미미하게 일으키는 조건이며, 대부분의 그람 음성균의 최소억제농도보다 낮은 것으로 확인하였다 (E. coli 는 0.5 ug/ml, 다른 그람 음성균은 2 ug/ml).

실시예 3. 복잡한 시료에서 그람 음성균 검출

상기 1-2에서 개발 및 최적화한 방법을 복잡한 시료에 적용하기 위해, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

3-1. 다수의 균 혼합 시료에서 검출법 검증

시료에 그람 음성균이 2 종 이상 또는 그람 음성균 및 그람 양성균이 2 종 이상 동시에 존재하는 경우의 혼합 시료에 대해 콜리스틴-Cy3를 첨가하여 그람 음성균의 검출 과정을 수행하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 각각 동일한 균 수로 2 종 또는 3 종의 그람 음성균과 그람 양성균을 혼합하면 개별 시료의 신호 합에 근접한 형광신호를 나타냄을 확인하였다.

보다 구체적으로, 대장균과 폐렴막대균 각각 1 종의 형광신호는 1214, 1298의 값을 보였고, 두 가지를 섞은 경우 2122.5 정도의 형광 신호를 보였다.

반면, 대조군인 그람 양성균을 2 종의 그람 음성균과 혼합한 경우에는 그람 양성균과 콜리스틴의 비특이적 결합에 따라 약간의 형광 신호 변화가 나타났지만, 그람 음성균만 2 종을 혼합한 시료와 비교하였을 때 형광신호가 그람 양성균을 2 종의 그람 음성균과 혼합한 혼합시료의 형광신호의 약 93 % 수준에 이르는바, 그람 양성균에서 검출되는 형광신호는 유의미하지 않은 수치임을 확인하였다.

상기 결과에 따라 본 발명에 따른 검출방법은 그람 음성균을 범용적이며, 특이적으로 검출하는데 적용될 수 있을 것으로 보이며, 의료 분야에서 미생물에 의한 감염을 진단하는데 유용하게 사용될 것임을 확인한 것이다.

3-2. 동물세포와의 혼합 시료에서 검출법 검증

균의 검출에 있어서, 특히 인체나 동물 유래 시료는 다양한 생물화학적 물질, 인체 및 동물 세포 이외에 여러 가지 균 등이 함께 섞여 있을 가능성이 높다. 콜리스틴은 강한 양전하를 띠어 포유류 세포의 원형질막에 대해서도 비특이적으로 결합할 가능성이 있기 때문에, 본 실시예에서는 포유류 세포와 그람 음성균이 함께 존재하는 상황에서 본 발명에 따른 검출 방법을 수행하였다.

보다 구체적으로, 본 실시예에서는 두 종류의 세포주, H1975 와 HeLa를 그람 음성균인 대장균과 혼합하여 콜리스틴-Cy3에 의한 표지 및 형광분석을 진행하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 H1975 및 HeLa 세포를 각각 대장균이 포함된 시료에 추가하였을 때 대장균만 단일로 존재하는 시료에 비해, 콜리스틴-Cy3에 의한 형광신호에 있어서 유의미한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.

또한 포유류 세포만 단독으로 존재하는 시료에서는 콜리스틴-Cy3에 의한 형광신호가 미약함을 확인하였다.

또한 도 10에 나타낸 바와 같이, 공초점 현미경 관찰 결과에서도 포유류 세포와 대장균이 공존하는 경우에 대장균에서만 콜리스틴-Cy3에 의한 강한 형광신호가 관찰되어, 콜리스틴-Cy3에 의한 표지가 대장균에 대해서만 특이적으로 이루어짐을 확인하였다.

상기 결과로부터 콜리스틴 컨쥬게이트의 그람 음성균의 세포벽과의 상호작용으로 나타나는 정전기적 작용 및 소수성 작용이 포유류 세포의 세포막과의 사이에서는 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 검출방법은 시료가 채취된 숙주 유래의 세포가 혼합된 상태에서도 진단에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

3-3. 혈액 유래 시료에서 검출법 검증

혈액에서 추출한 시료에서 균을 검출할 수 있다면, 최소한의 침투경로를 이용하여 그람 음성균 검출 여부에 관한 임상 진단이 가능하여 큰 장점을 지닌다고 볼 수 있다.

본 검출법이 혈청에 적용 가능한지 여부를 확인하기 위해, 다양한 농도 조건의 소 유래의 혈청을 준비하고 대장균을 첨가하여 본 발명에 따른 검출방법을 수행하였다. 보다 구체적으로, 최대 80 v/v %까지 혈청의 농도를 증가시키며 콜리스틴 컨쥬게이트 표지를 진행한 결과 형광 신호는 점점 감소하였는데, 이는 혈청 농도가 증가함에 따라 콜리스틴과 균의 결합이 방해되기 때문이고, 콜리스틴-Cy3에 의한 대장균의 형광신호는 대조군인 그람 양성균과 비교하였을 때 일관되게 유의미한 것으로 확인하였다.

보다 구체적으로, 표지 후 형광신호는 10 v/v % 혈청 조건에서 57.5 %로 감소하였고, 80 v/v % 혈청 조건에서는 10 v/v %에 비하여 69.0 % 정도의 값으로 감소하여 큰 변화를 보이지는 않았다.

상기 결과는 혈청과 같이 다양한 생물화학적 물질이 포함된 복잡한 시료에서도 콜리스틴의 그람 음성균에 대한 결합이 일어날 수 있음을 확인한 것이다.

전술한 실험결과를 종합하면, 본 발명에 따른 그람 음성균의 검출 방법은 그람 음성균 검출의 플랫폼으로써, 임상 진단, 식료품 모니터링, 가축 관리 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

표지물질로 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트 (Colistin conjugate)를 포함하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria) 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표지물질은 형광 물질로 형광 유기염료 인Cascade Blue, Pacific Blue, Pacific Orange, fluorescein, FITC, BODIPY-FL, Texas Red, TAMRA, FAM, rhodamine, coumarin, phycoerythrin, TRITC, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Alexa Fluor350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, Alexa Fluor 790과 형광 나노입자로서 CdSe 양자점, CdSe/ZnS 양자점, CdSeS/ZnS 양자점, CdTe 양자점, InP/ZnS 양자점, PbS 양자점, 탄소양자점 및 이들의 유도체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria) 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 그람 음성균의 속 (genus)으로 Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter, Acinetobacter, Neisseria, Haemophilus, Chlamydia, Legionella, Helicobacter, Campylobacter, Salmonella, Moraxella, Stenotrophomonas, Proteus, Enterobacter, Serratia, Yersinia 및 그 외에 장내 세균 과에 포함된 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria) 검출용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria) 검출용 키트.
(a) 표지물질이 접합된 콜리스틴 컨쥬게이트 (Colistin conjugate)를 포함하는, 조성물을 검체 유래의 시료와 배양하여 검체 내 콜리스틴 컨쥬게이트가 표지된 그람음성균을 형성하는 단계; 및
(b) 상기 콜리스틴 컨쥬게이트가 표지된 그람음성균으로부터 형광변화를 측정하는 단계를 포함하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria)의 검출 방법.
제5항에 있어서,
상기 콜리스틴 컨쥬게이트의 농도는 0.001 μM 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria)의 검출 방법.
제5항에 있어서,
상기 배양은 4 시간 이하의 시간 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria)의 검출 방법.
제5항에 있어서,
상기 그람 음성균의 속 (genus)으로 Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter, Acinetobacter, Neisseria, Haemophilus, Chlamydia, Legionella, Helicobacter, Campylobacter, Salmonella, Moraxella, Stenotrophomonas, Proteus, Enterobacter, Serratia, Yersinia 및 그 외에 장내 세균 과에 포함된 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria)의 검출 방법.
제5항에 있어서,
상기 검체 유래의 시료는 다수 균의 혼합시료, 동물세포와의 혼합시료 및 혈액 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria)의 검출 방법.
제5항에 있어서,
상기 (a) 단계 후, 상기 콜리스틴 컨쥬게이트가 표지된 그람음성균을 형성하지 않은 콜리스틴 컨쥬게이트를 세척하여 표지된 그람 음성균을 확보하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 그람 음성균 (Gram-negative bacteria)의 검출 방법.