JP5670207B2 - 凝集反応による液体培地中の微生物のリアルタイム検出のための方法 - Google Patents

Description

技術分野は、臨床又は工業の微生物学的試験の分野である。より詳しくは、微生物の試料の濃縮と同時に実施される凝集反応によって一つ以上の微生物を同定する方法を含む。
微生物学の分析は、できる限り短時間に結果を得るための正確な手段を必要とする。
医療分野では、感染のリスクを予測して診断することが必要である：より迅速且つより正確な診断は、患者の治療により効果的であり、伝染のリスクをより最小限に抑えられる。該アプローチは、動物の健康のためも同様である。
食品加工分野でも、仕様は同一である。しかしながら、これらの仕様は、病原微生物とそれらの毒素との間で区別され、この検査は、市販の製品、非病原性の微生物に適用され、生の製品から最終製品までの、全てのつながりに沿った製造工程、及び発酵のような技術的関心のバクテリアの品質のインジケータとして使用される。推定される混入物の迅速且つ正確な検出は、それらについてテストすること、次に補正処置を始めることを可能にする。

技術的に、微生物学的解析は、前濃縮／濃縮の一つ以上の段階、検出の一つ以上の段階、微生物の中で計数する一つ以上の段階を実装することができる。食物加工微生物テストのような特殊な適用のために、この分野の標準に従わせるために、確認段階が更に必要とされてもよい。
前濃縮/濃縮段階は、当業者には有名な選択的又は非選択的培養培地を必要とする。従来の培地の調合に基づく使用準備済みの培養培地は、しばしば液体形態で市販されている。
検出段階は、調査されている微生物の代謝特性の証明に基づく。従来は特異的な酵素基質が使われる。これらの酵素基質は、通常は、２つの部分、標的部分と呼ばれる、明らかにされる酵素活性に特異的な第１の部分、及び標識部分とも呼ばれる、標識として働く第２の部分であって、通常はクロロフォアまたはフルオロフォアを構成する部分からなる。これらの基質の選択によって、反応があるか否かに応じて、微生物の性質を特徴づけるか、又は微生物のさまざまなグループを区別することが可能である。したがって、呈色又は蛍光の出現または消失は、微生物の属または種類のシグネチャーとなる。この点に関しては、発色性培地の使用は、調査されている微生物の同時検出及び同定を可能にする。それはプロセスを単純化するものであり、結果を得るための時間を短縮する。具体的な例として、出願人のＣｈｒｏｍＩＤ（登録商標）培地を挙げることができる。これらの発色性培地は、調査されている微生物のために特異的な代謝特性、例えば大腸菌のためのβ‐グルクロニダーゼ酵素活性の検出に基づく。しかしながら、いくつかの微生物、又はいくつかの亜型（たとえば大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）は、いかなる特異的な酵素活性をも呈さず、そのため発色性培養培地を使用して検出することができない。

一方で、確認段階は、食物加工分野の微生物学分析に特に連結される。特に、以前開発された方法の結果が陽性である場合、調査されている病原体の存在を確認する必要がある。このことは、第１の分析で使用されたものとは異なる検出原理を使用すること及び追加テストが要求されることを意味する。調査されている微生物のゲノム特性に基づいた分子生物学の技術は、同定を確認するために使用する手段の１つを構成する。例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）及びＮＡＳＢＡ（増幅に基づいた核酸配列）のような従来の増幅技術を挙げることができ、それらは当業者に知られているリアルタイム検出技術に結合することができるものである。

イムノアッセイは、確認テストのために使用する別の技術を構成する。それらは、調査されている微生物の免疫原性特性を使用する。調査されている微生物のエピトープを検出する、競合又はサンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）技術又は免疫凝集技術を非網羅的に挙げることができる。後者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体により被覆されたビーズのような機能化された固体支持体（例えばラテックス粒子）を使用し、前記機能化された支持体は、例えば特許化された欧州特許第0701624号及び1199567号に示されるように、生物学的サンプルと接触させられる。あるいは、米国特許第4659658号に記載のように、固体粒子は、所与の微生物の表面に位置する糖と特異的に結合するレクチンによって被覆されてもよい。いずれにしても、凝集反応の出現は、調査されている微生物を明確に同定することを可能にする。

従って、試料中の微生物の完全且つ正確な同定は、いくつかの工程のつながりを必要とする：濃縮、検出、確認。ルーチンに使用されるテストの標準化は、検査法の自動化を可能にしたが、しかしながら、実施は遅いままである。従来技術の１つの欠点は、これらの工程が連続して実施されるという事実である。別の欠点は、免疫反応又は分子ハイブリダイゼーション反応である確認工程のために使用する特異的な相互作用反応が最も一般的には「エンドポイント」で読みとられるということである。この時間のあいだ、食品加工業では、確認の結果を待つ一方で、終末産物の全バッチは流れを止められ、臨床期間では、相対的な抗生物質療法と予防措置のセッテイングが遅延する。
従って、考慮される従来技術からみて、濃縮、検出及び正確な同定の工程を結合する方法は欠如している。具体的には、上記の方法は、迅速性、特異性及び感受性を一つにする。

本発明は、従って、液体培地中で、微生物の培養と少なくとも一つの凝集反応を同時に使用することにより、上記の欠点を解決することを提案する。
より詳細には、本発明は、第１に、試料中に存在する可能性がある少なくとも一つの微生物を検出して同定する方法であって、
ａ）コンテナ中で、微生物の増殖および／または検出を可能にする培地、前記試料及び感作された固体支持体を接触させること；
ｂ）その全体を微生物の増殖および／または検出を促進する温度に供すること；
ｃ）工程ｂ）が完了したときに、リアルタイムで、前記培養培地において、微生物の存在を示しているか、又は前記微生物が検出された場合に前記存在を確認する、凝集の出現を観察する工程を含む方法に関する。

本発明の別の課題は、試料中に存在する可能性がある少なくとも一つの微生物を検出して同定する方法であって、
ａ）コンテナ中で、微生物の増殖および／または検出を可能にする培地、前記試料及び感作された固体支持体を接触させること；
ｂ）その全体を微生物の増殖および／または検出を促進する温度に供すること；及び
ｃ）工程ｂ）が完了したときに、リアルタイムで、前記培養培地において、微生物の同定を可能にするか、又は前記微生物が同定された場合に前記同定を確認することを可能にする、凝集の出現を観察する工程を含む方法に関する。

本発明は、さらに、試料中に存在する可能性がある少なくとも一つの微生物を検出して同定する方法であって、
ａ）コンテナ中で、微生物の増殖および／または検出を可能にする培地、前記試料及び感作された固体支持体を接触させること；
ｂ）その全体を微生物の成長および／または検出を促進する温度に供すること；及び
ｄ）工程ｂ）が完了したときに、リアルタイムにおいて、微生物の同定を補足すること可能にする凝集の出現を観察する工程を含む方法に関する。

「同定を補足する」なる表現は、微生物の同定を特定することを可能にする付加的情報を提供することを意味する。例えば、工程ａ）において、使用する培養培地は、大腸菌属のバクテリアに特異的であってもよく、このバクテリアの属に特異的な基質をふくんでもよく、試験サンプルの上記のバクテリアの存在が培養培地の変化、例えば使用する基質が発色性基質である場合は色の変化によって特徴づけられる。工程ｃ）において観察される凝集反応は、例えば病原性菌株である大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のような特定の菌株を証明することが可能であってもよい。

微生物の増殖を促進する温度は２０と４４℃との間であり、試料は、微生物の検出が可能になるために十分な一定期間の間、この温度に保たれる（すなわち、６から９６時間の期間）。
単一のコンテナにおける、これらのさまざまな手段の組合わせた使用は、時間及び操作の両方を節約することを可能にし、故に、後者の場合は偽陽性につながる取扱者または試料の混入を制限する。更に、本発明の実施は、自動化されることができる。また、時間の節約が、２つの工程を単一工程へ組合わせること、上記の確認技術のようなエンドポイントではもはやなく、リアルタイムで凝集を検出することにつながることに注目されたい。

有利には、上記の方法の工程ａ）及びｃ）は、発色性化合物（またはクロロフォアと呼ばれる）または蛍光性の化合物（またはフルオロフォアと呼ばれる）を使用する。
より詳細には、検出と同定の２つの方法は、好ましくは、呈色または蛍光の出現または消失を使用することができる。さらに、本発明の課題である全ての方法では、有利には、凝集反応は、呈色または蛍光の出現または消失によって示されることができる。
好ましくは、コンテナは、マイクロプレート、マイクロキュプル、マイクロチューブ、キャピラリー又はマルチウェルカードから構成されるグループから選択される。
有利には、本発明の課題である方法は、更に微生物を計数する工程を含むことができ、好ましくは出願人の欧州特許第１１０５４５７号に説明されている最確数方法による。
ある特定の実施態様によれば、工程ｃ）で実施される凝集反応は、抗原抗体反応を示す免疫凝集反応である。
別の特定の実施態様によれば、工程ｃ）で実施される凝集反応は、バクテリオファージ−細菌反応である。より詳細には、それは、バクテリアの種類に特異的なファージの組換えタンパク質と、対応するバクテリアの分子との間の反応である。上記の相互作用は、欧州特許第１１９８７１３号に記載されている。
別の特定の実施態様によれば、工程ｃ）で実施される凝集反応は、リガンド／抗リガント反応である。
別の特定の実施態様によれば、上で記載されている実施態様のうちの１つによる工程ｃ）で実施されている凝集反応のリアルタイム検出は、凝集の出現の前に沈降を検出することを可能にすることができる。

さらに、本発明の課題は、上で開発されたさまざまな実施態様に従って方法を実施する診断キットである。キットは、
-コンテナ；
-選択的又は非選択的培養培地であって、場合により、検出される微生物の属又は種の代謝に特異的な基質を含む培養培地；及び
-感作された固体支持体
を含む。
有利には、コンテナは、マイクロプレート、マイクロキュプル、マイクロチューブ、キャピラリーまたはマルチウェルカードから構成されるグループから選択される。
第１の好ましい実施態様によれば、感作された支持体は、固体支持体−抗原複合体または固体支持体−抗体複合体である。
第２の好ましい実施態様によれば、前記感作された支持体は、固体支持体-リガンド複合体または固体支持体-抗リガンド複合体である。リガンドは、バクテリオファージの全部または一部を含みことができる。
本発明に係る診断キットは、更に少なくとも一つの発色性又は蛍光性の化合物を含むことができる。
最後に、本発明の最後の課題は、試料中に存在する可能性がある少なくとも一つの微生物を検出および／または同定するための本発明の診断キットの使用に関する。

本発明の課題である方法は、食物、環境又は臨床起源の試料のために使用されることができる。試料は、解析のための実体から分離された小部分または少量として定義される。
食物起源の試料には、非網羅的に、乳製品（ヨーグルト、チーズなど）の、肉の、魚の、卵子の、果物の、野菜の、水のまたは飲物（牛乳、果汁、ソーダ等）の試料を挙げることができる。食物起源のこれらの試料は、更に調製された料理またはソースに由来してもよい。最後に、食物試料は、例えば動物飼料、特に動物の餌に由来してもよい。
さらに、例えば表面、水又は空気から取られた試料のような環境に関連した試料を挙げることが出来る。
臨床起源の試料は、採取された体液（全血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液）試料、採取されたふん便試料、鼻、のど、皮膚、損傷、器官、組織又は単離された細胞などからの取り出された試料に対応することができる。

微生物学的なテストは、バクテリアまたはイーストのような潜在的に存在する微生物を、分離すること及び／又は同定すること及び／又は計測することを目的とする、分析に対応する。技術的に、この分析は、インビトロで、培養培地における、微生物の増殖を含む。「培養培地」なる用語は、微生物の生存および／または増殖のために必要な全ての要素を含む培地を意味することを目的とする。培養培地は、例えば任意の添加物を含むことができる：ペプトンまたは組織の抽出物、一つ以上の成長因子、炭水化物、一つ以上の選択剤、バッファー、一つ以上のゲル化剤等。この培養培地は、チューブまたはフラスコまたはシャーレ上に播種の準備ができている、液体形態または使用準備済みのゲル形態であってもよい。
本発明において、「微生物」なる用語は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌、イースト、さらに一般的にいえば、肉眼に見えない単細胞生物をカバーし、それらは実験室において取り扱うことができ、増やすことができる。
通常は、培養培地は、直接的または間接的に検出可能な信号によって、標的微生物の代謝活性又は酵素活性を検出するため基質を更に含むことができる。直接的検出のために、この基質は標識として働く部分に連結されることができ、それは蛍光性でも発色性でもよい。間接的検出のために、本発明に係る培地は、基質の消費によって誘導されるｐＨの変異に感受性があるｐＨ指示薬を更に含むことができ、標的微生物の増殖を明らかにする。前記ｐＨ指示薬は、クロロフォアまたはフルオロフォアであってもよい。クロロフォアの例として、ニュートラルレッド、アニリンブルー及びブロモクレゾールブルーを挙げることができる。フルオロフォアは、例えば４‐メチルウンベリフェロン、アミノクマリン誘導体及びレゾルフィン誘導体を含む。
本発明の目的において、調査されている微生物の同定は確認されるべきであり、その代謝特性について調査することによって実施される場合がある。この確認は、凝集反応の使用によってできる。

「凝集」なる用語は、微生物と粒子との間の相互作用の結果を意味することを目的とし、前記粒子は天然由来であるか（例えば免疫グロブリンＭ）または固体支持体の種類（例えばポリマー）のどちらかである。この相互作用によって、微生物と粒子は凝集して、互いに付着してネットワークを形成する。前記ネットワークは、堆積又は沈澱が可能である。微生物と粒子との間の相互作用は堆積の前に誘導され、リアルタイム観察がネットワーク形成の完了する前に検出することを可能にする。凝集反応は、免疫反応、例えば抗原抗体反応、またはタンパク質の間のより一般な特異的な相互作用を含む。前記特異的反応によって形成されたネットワークまたは複合体は、光学系によって自動的に又は視覚的に検出される。あるいは、形成された複合体の量が測定される。
凝集反応をを実施するための、当業者にしられている様々な方法の何れか一つが使用される。固体支持体は、天然材料、場合により化学的に修飾される合成材料から、特にラテックス、ポリ（塩化ビニル）、ポリエチレン、ポリスチレン又はポリアクリラート種のポリマー、及びスチレンを主とするそれらの種のコポリマーから選択される、上記の固体支持体が粒子の形態であってもよい。

「感作された支持体」なる用語は、抗原、抗体、完全なファージまたはファージタンパク質を含む機能的な化合物の、前記固体支持体への結合を意味する。
「抗原」なる用語は、免疫応答を介した合成を誘導した抗体によって認識されることができる化合物を示す。
「抗体」なる用語は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含み、抗体は遺伝子組換え及び抗体断片によって得られる。
ファージまたはバクテリオファージは、バクテリアだけを感染させるウイルスである;また、それらは細菌ウイルスと呼ばれている。凝集反応において、それらは大きな特異性と大きな感受性を有する所与の菌株または種を認識するそれらのタンパク質のために使われる。
固体支持体に対する結合性は、直接的または間接的な固定化に対応することができる：「直接的固定化」なる用語は、共有原子価または受動的な吸着による結合性を意味することを目的とする;直接的固定化は、前記固体支持体に化学的に結合したリガンドによって実施されうる。「間接的固定化」なる用語は、抗原、抗体またはファージ（より広義には、機能的化合物）に結合したリガンドと、抗リガンドまたは固体支持体結合した相補的リガンドとの間のリガンド/抗リガンド相互作用を意味することを目的とする。

リガンド／抗リガンドの対は、当業者にとって周知であり、例えば：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／それに相補的ポリヌクレオチドを挙げることができる。また、無水マレイン酸ホモポリマーまたはコポリマーの水溶性誘導体（例えば特許化された欧州特許第０５６１７２２号の出願人によって開発されたもの）は、生体分子を固定するために用いてもよい。これらの固体支持体は、さまざまな形態の反応において配給することができる：冷凍乾燥、液体懸濁液中に、商標バイオボール（登録商標）として市販されているようなビーズの形態など。凝集は、視覚的に、または当業者に知られているさまざまな原理による自動光学式読み取り装置によって検出されることができ、
（１）培地に始めから存在する蛍光を吸収する着色したラテックスの堆積による蛍光の出現の検出；
（２）着色したラテックス粒子と潜在的に着色したマトリックスとを混ぜ合わせることによる色相の変化の検出；
（３）培地の拡散蛍光の消失につながる、蛍光性ラテックス粒子の凝集反応による蛍光の濃度；
（４）培地に存在する着色したラテックスの堆積による色の消失
を非網羅的に挙げることができる。

使用することができるフルオロフォアは上記のものであり、4-メチルウムベリフェロン、アミノクマリン誘導体またはレゾルフィン誘導体を含む。
２工程に記載された、培養／同定の操作、次にエンドポイントでの凝集は、本発明によれば、単一工程に組合せることができ、特異的な凝集反応がリアルタイムで検出される。例証として、食物由来の試料において、リステリア菌（セロタイプ４ｂ）の同定が可能であることを挙げることができる：リステリア‐モノサイトゲネスの検出は、この細菌の代謝に特異的な一つ以上の基質を含んでいる培地を使用して、実施されることができ、セロタイプ４ｂの同定は凝集反応によって同時に実施され、リアルタイムで検出される。
ある特定の実施例では、本発明は、マイクロプレート、マイクロキュプル、マイクロチューブ、キャピラリー等のコンテナ中で実施することができる。
有利には、本発明による方法は、出願人によって開発された、ＴＥＭＰＯ（登録商標）型の自動化微生物試験器と組合わせて実施されてもよく、場合により検出した微生物の計測を可能にしてもよい。

本発明の課題である方法は、栄養ベースを含む反応培地、感作された粒子、場合により、調査されている微生物に特異的な発色性基質を含むキットを用いて実施することができる。前記培地は、分析される試料のアリコートにより再懸濁される。有利には、本発明による方法を実施するためのキットは更にマイクロプレート、マイクロチューブ、マイクロキュプル、キャピラリー、ＶＩＴＥＫ（登録商標）カードまたはＴＥＭＰＯ（登録商標）カード型の固体のコンテナを含むことができる。

本発明は、図と組合わせて、以下の詳細な説明と非限定的実施例をよむことによりより明確に理解される。

インキュベーション前の、乳房炎/乳腺炎のバクテリアの起源を特徴づけるための試験片を表す。 インキュベーション後の、黄色ブドウ球菌についての陽性の反応の試験片を表す。 インキュベーション後の、ストレプトコッカス種についての陽性の反応の試験片を表す。 インキュベーション後の、大腸菌についての陽性の反応の試験片を表す。 インキュベーション後の、クレブシェラ種についての陽性の反応の試験片を表す。

実施例１：表現型及び免疫学的反応を結合することによる、大腸菌種と大腸菌Ｏ１５７のダブル・カウント
この分析の目的は、出願人によって市販されているＴＥＭＰＯ（登録商標）システムを使用して、大腸菌種を酵素的に、大腸菌Ｏ１５７を免疫学的に同時に計測することである。
（手順）
工程１：分析される試料のアリコートによる反応培地の再懸濁：
反応培地は、
-大腸菌種に特異的な酵素基質；4-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-グルクロニド（Biosynth ref.M-5700）：Ｔ０、５０ｍｇ／ｌにおいて非蛍光（０．１ｍｇ／ｌと１０００ｍｇ／ｌとの間で変化できる）；
-ラテックス粒子（Oxoid,ref.DR0620M）、青色、大腸菌Ｏ１５７に特異的な抗体によって感作されたもの、１％の乾燥エキストラクト（０．１％と１０％との間を変化することができる）；
-栄養ベース：濃度１０ｇ／ｌのペプトン；
-インヒビター・システム：濃度１．５ｇ／ｌの胆汁酸塩
を含む。
計数を実施する観点から、試料中（例えば、４ｍｌの主要供給水）の中に再懸濁される反応培地は、次にＴＥＭＰＯ（登録商標）カードに組み込まれる。
カードのインキュベーション前に、後者のウェルは青色で非蛍光である。

工程２：カードのインキュベーション：
ＴＥＭＰＯ（登録商標）カードは、次に２４時間３７℃でインキュベートされる。このインキュベーションの間、抗大腸菌Ｏ１５７抗体により感作された粒子の凝集の反応及び酵素反応（大腸菌に特異的な基質の分解）は、ＴＥＭＰＯ（登録商標）カードのウェルに存在する標的バクテリアの場合には、バクテリアの増殖と同時に起こる。

工程３：２４時間のインキュベーション後のテストの読み取り：
大腸菌Ｏ１５７についての陽性反応：抗大腸菌Ｏ１５７抗体／大腸菌Ｏ１５７細胞複合体の形成があり、ラテックス粒子の凝集を結果として生じ、続いて青色の呈色反応の消失、続いてウェルの底に青色の沈殿を形成する。
大腸菌種について陽性の反応：大腸菌種による基質の分解後の陽性ウェルにおける蛍光の出現（蛍光性の4-メチルウムベリフェロン分子の放出）
大腸菌種について陽性であり、大腸菌Ｏ１５７について陰性のウェル：蛍光性及び青色。
大腸菌種及び大腸菌Ｏ１５７について陽性のウェル：蛍光性及び無色（＋ウェルの底における青色の沈殿）。
大腸菌種及び大腸菌Ｏ１５７について陰性のウェル：非蛍光性及び青色。
次に、大腸菌Ｏ１５７と大腸菌種について陽性であるウェルは、試料の１グラムごとの、大腸菌Ｏ１５７及び大腸菌種のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を、ＭＰＮ表（内部アルゴリズム）により測定するために、計数した。

実施例２：適切且つ有効な抗生物質療法を採用する観点による、乳牛／ヒツジ／ヤギの乳房炎／乳腺炎の症例の細菌の起源の特徴づけ

乳房炎は、多少ともこのバイオトープに適しているバクテリアによる乳房の感染症に結果としてなる。複数のバクテリアがこの種の感染症の原因となっており、２つの群に分類される：乳房リザーバ・バクテリア（例えば黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス種）と環境バクテリア（例えば大腸菌、クレブシェラ種）。

テストの原理：標的のバクテリアの細胞（すなわち黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス種、大腸菌、クレブシェラ種）の液体培地の懸濁液では、感作された粒子の凝集反応によって、乳房炎の場合のバクテリアの起源が特徴づけられる。

（手順）
工程１：分析される（例えば牛乳）試料のアリコートによる反応培地の再懸濁：
テストは、反応培地を含む４つのウェルを含むストリップの形態である。

反応培地の組成物は、以下である：
-標的に特異的なバクテリオファージタンパク質および／または抗体（Ａｂ）によって感作された青色の粒子：黄色ブドウ球菌（ウェルＮｏ．１）、ストレプトコッカス種（ウェルＮｏ．２）、大腸菌（ウェルＮｏ．３）、クレブシェラ種（ウェルＮｏ．４）;
-栄養ベース：緩衝化ペプトン水（Ref. bMx 51094）。

各ウェルは、５００μｌの試料によって再懸濁される。
インキュベーション（反応の欠如）前のストリップの最初の状態：ストリップの全てのウェルは青色であり、凝集及び抗標的で感作された青色の粒子のＴ０における堆積の欠如を与えた（図１を参照）。

工程２：ストリップのインキュベーション：
次に、ストリップは３７℃で４時間から１６時間インキュベートされた。このインキュベーションの間、研究される乳房炎の原因となる標的のバクテリアによって汚染があった場合、バクテリアの増殖と同時に、抗標的感作された粒子の凝集反応が生じる。

工程３：４から１６時間のインキュベーション後の試験の読み取り：
陽性反応：ラテックス粒子（ウェルの底で沈殿を形成する）の凝集反応を結果として生じ、関係するウェルの青色の消失に結果としてなるバクテリオファージタンパク質／細菌または抗体／細菌性抗原の形成。さまざまなケースが想定できる：
-乳房炎が黄色ブドウ球菌による場合には、青色の呈色反応の消失はウェルＮｏ．１（参照図２）で生じる。
-乳房炎がストレプトコッカス種による場合には、青色の呈色反応の消失はウェルＮｏ．２（参照図３）で生じる。
-乳房炎が大腸菌による場合には、青色の呈色反応の消失はウェルＮｏ．３（参照図４）で生じる。
-乳房炎がクレブシェラ種による場合には、青色の呈色反応の消失はウェルＮｏ．４（参照図５）で生じる。

実施例３：ＴＥＭＰＯ（登録商標）プラットフォーム上のサルモネラの計数

この解析の目的は、出願人によって市販されているＴＥＭＰＯ（登録商標）システムを使用して、組換えファージタンパク質によって感作された粒子の凝集反応により、免疫学的にサルモネラを計数することである。

（手順）
工程１：抗サルモネラ菌B D1ファージタンパク質の吸着
この工程は、粒子の表面でファージタンパク質を吸着することからなる：
-対照標準：抗−Ｂ−Ｄ１ファージタンパク質２．６７ｍｇ／ｍｌ、
-使用するラテックス、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより供給される、平坦な蛍光性黄色のＰＬ ＦＹバッチＣＤ２２２：３１１ｎｍ。
ファージタンパク質は、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、濃度１４０μｇ／ｍｌで吸着される。テスト量は、２００μｌである。
ラテックス粒子は、５ｍｇ／ｍｌの一部分として培地に導入される。
吸着は回転車輪上の振動で１５時間、実施される。
吸着率のテスト：
-試料５０μｌの遠心及び上清の回収；
-ＢＣＡタンパク質アッセイ方法による上清のアッセイ；
-収率は標準曲線及びこの試験に使用されたファージタンパク質の初期濃度に比較により計算される。
この収率は７３％である。
粒子のサイズは、粒径分析計で測定される。
ＰＬ ＦＹラテックスについて３１１ｎｍであり、粒子-ファージ・タンパク質複合体について３１５ｎｍである。

工程２：ＴＥＭＰＯ（登録商標）カード中におけるインキュベーション：
反応培地は、以下を含む：
-３．５ｍｌの栄養ベース：濃度１０ｇ／ｌのペプトン;
-５０ＣＦＵのバクテリアのサルモネラ・バレイリー 06.03.927 IM1272:C₁を含む試料：
-０．５％の乾燥エキストラクトでサルモネラ特異的ファージ・タンパク質によって感作された、０．５ｍｌの蛍光性ラテックス粒子。
次に、反応培地は、計測を実施する趣旨で、ＴＥＭＰＯ（登録商標）カードに組み込まれる。
カードのインキュベーション前に、後者のウェルは蛍光性である。
次にＴＥＭＰＯ（登録商標）カードは、２４時間３７℃でインキュベートされる。このインキュベーションの間、ＴＥＭＰＯ（登録商標）カードのウェルに存在する標的バクテリアの場合には、抗−Ｂ−Ｄ１ファージ・タンパク質によって感作された粒子の凝集反応が、バクテリアの増殖と同時に起こる。

工程３：２４時間のインキュベーション後のテストの読み取り：
サルモネラ・ベイリーについて陽性の反応：ファージ・タンパク質/サルモネラ・ベイリー細胞の複合体形成があり、ラテックス粒子の凝集反応と沈降に結果としてなる。従って、関係するウェルの底の蛍光の濃度及び読みとり窓の蛍光の消失が観察される。
陰性反応：蛍光は、ウェル中で均質なままである。
次に、陽性のウェルが計数され、ＭＰＮ表（内部アルゴリズム）により、試料１グラムにつき、サルモネラ・ベイリー06.03.927 IM1272:C₁のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数が測定される。
計数の結果は、理論上５０ＣＦＵによれば、１１ＣＦＵ／ｍｌ、すなわち４４ＣＦＵである。

Claims (18)

1. 食物、環境又は臨床起源の試料中に存在する可能性がある少なくとも一つの微生物を検出する方法であって、
   ａ）コンテナ中で、微生物の増殖および検出を可能にする培養培地、前記試料および感作された固体支持体を接触させる工程と；
   ｂ）その混合物を微生物の増殖および検出を促進する温度に供しながら、
   リアルタイムで、前記培養培地において、微生物の存在を示している凝集の出現を観察するか、又は前記微生物が検出された場合に前記存在を確認する工程を含み、工程ａ）及びｂ）が単一のコンテナ中で実施される方法。
2. 食物、環境又は臨床起源の試料中に存在する可能性がある少なくとも一つの微生物を検出して同定する方法であって、
   ａ）コンテナ中で、微生物の増殖および同定を可能にする培養培地、前記試料および感作された固体支持体を接触させる工程と；
   ｂ）その混合物を微生物の増殖および同定を促進する温度に供しながら、
   リアルタイムで、前記培養培地において、微生物の同定を可能にするか、又は前記微生物が同定された場合に前記同定を確認することを可能にする、凝集の出現を観察する工程を含み、工程ａ）及びｂ）が単一のコンテナ中で実施される方法。
3. 食物、環境又は臨床起源の試料中に存在する可能性がある少なくとも一つの微生物を検出して同定する方法であって、
   ａ）コンテナ中で、微生物の増殖および同定を可能にする培養培地、前記試料および感作された固体支持体を接触させる工程と；
   ｂ）その混合物を微生物の増殖および同定を促進する温度に供しながら、
   リアルタイムで、微生物の同定を補足することを可能にする凝集の出現を観察する工程を含み、工程ａ）及びｂ）が単一のコンテナ中で実施される方法。
4. 培養培地における検出または同定が、呈色または蛍光の出現または消失を使用する、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
5. 凝集反応が呈色または蛍光の出現または消失によって示される、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
6. 単一のコンテナが、マイクロプレート、マイクロキュプル、マイクロチューブ、キャピラリーまたはマルチウェルカードから構成されるグループから選択される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
7. 微生物を計数する工程を更に含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
8. 凝集反応が抗原-抗体反応を実施する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
9. 凝集反応がファージ-バクテリア・タンパク質反応を実施する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
10. 凝集反応がリガンド/抗リガンド反応を実施する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
11. 請求項１から１０の何れか一項に記載の方法を実施するための微生物診断キットであって、
    -コンテナ;
    -選択的又は非選択的培養培地であって、場合により、検出される微生物の属又は種の代謝に特異的な基質を含む培養培地；および
    -感作された固体支持体を含むキット。
12. 単一のコンテナは、マイクロプレート、マイクロキュプル、マイクロチューブ、キャピラリーまたはマルチウェルカードから構成されるグループから選択される、請求項１１に記載の診断キット。
13. 前記感作された支持体が固体支持体-抗原複合体又は固体支持体-抗体複合体である、請求項１１又は１２に記載の診断キット。
14. 前記感作された支持体が固体支持体-リガンド複合体又は固体支持体-抗リガンド複合体である、請求項１１又は１２に記載の診断キット。
15. リガンドがバクテリオファージの全部または一部を含む、請求項１４に記載の診断キット。
16. 少なくとも一つの発色性又は蛍光性の化合物をさらに含む、請求項１１から１５の何れか一項に記載の診断キット。
17. 試料中に存在する可能性がある少なくとも一つの微生物を検出及び／又は同定するための、請求項１１から１６の何れか一項に記載の診断キットの使用。
18. 工程ｂ）の混合物が４から９６時間の期間、微生物の増殖および検出を促進する温度に供される、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。

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