WO2007013157A1 - 抗体感作ラテックス - Google Patents

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WO2007013157A1
WO2007013157A1 PCT/JP2005/013807 JP2005013807W WO2007013157A1 WO 2007013157 A1 WO2007013157 A1 WO 2007013157A1 JP 2005013807 W JP2005013807 W JP 2005013807W WO 2007013157 A1 WO2007013157 A1 WO 2007013157A1
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antibody
bacteria
latex
genus
trospira
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PCT/JP2005/013807
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Toshikazu Hashimoto
Fumio Mishina
Takekazu Okumura
Fumiko Nagai
Shuta Yamamoto
Haruji Sawada
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Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
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Publication date
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Priority to PCT/JP2005/013807 priority patent/WO2007013157A1/ja
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

Definitions

  • the present invention relates to the antibody-sensitized latex that rapidly and easily measures bacteria belonging to the genus Nitrospira present in biological nitrogen treatment processes such as activated sludge, water, and soil. Specifically, it is possible to accurately and easily detect bacteria of the genus Nitrospira, which required a long period of time and technical skill. Furthermore, the present inventors will establish a method for measuring -Trospira bacteria using this antibody-sensitized latex and a method for accurately operating and managing biological nitrogen treatment processes such as activated sludge. Background art
  • Wastewater, garbage, etc. discharged from our living environment contain a lot of nitrogen compounds, which are discharged into the surrounding environment such as groundwater, rivers and lakes, and may cause serious environmental problems.
  • a biological nitrification / denitrification method using activated sludge has been developed and used in various sewage treatment plants.
  • nitrifying bacteria present in activated sludge play an important role in the nitrification process!
  • the nitrification reaction is at the rate-determining stage. Therefore, in order to improve the stability of the treatment process and the higher efficiency, the microorganism group involved in the nitrification reaction (nitrification) Analysis of bacteria, ammonia-oxidizing bacteria, and nitrite-oxidizing bacteria) is considered essential.
  • bacteria that contribute to the nitrification reaction are autotrophic bacteria, which have a lower specific growth rate than heterotrophic bacteria that remove organic matter, and are susceptible to environmental conditions such as pH and water temperature. It is very important to keep nitrifying bacteria at a high density in the nitrification reaction tank (reaction tank).
  • a biological nitrogen treatment process such as an activated sludge treatment tank of a sewage treatment facility has been conventionally performed.
  • a biological nitrogen treatment process such as an activated sludge treatment tank of a sewage treatment facility has been conventionally performed.
  • a sample is collected, and after a culture period of about 1 month to 2 months, the consumption of nitrite in the sample is determined.
  • a method for measuring them indirectly has been known (see Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Ryusuke Kimura et al., Soil Microbial Experiment, 207-214 (1992)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 05-322896
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-029426
  • the present inventors further easily and quickly measure bacteria of the genus Trospira, which are present in biological nitrogen treatment processes such as activated sludge, water, and soil.
  • biological nitrogen treatment processes such as activated sludge, water, and soil.
  • the present inventors produced an antibody specific to a bacterium belonging to the genus Nitrospira, and used the antibody-sensitized latex in which the antibody was adsorbed to latex particles.
  • the inventors have found that bacteria of the genus can be rapidly measured, and have completed the present invention.
  • the object of the present invention is to provide a novel -trospira that makes it possible to quickly and easily detect bacteria of the genus Trospira in biological nitrogen treatment processes such as activated sludge, water, and soil. It is to provide an antibody-sensitized latex for measuring bacteria of a genus. Another objective is to use the above-described antibody-sensitized latex for measurement to quickly and easily measure biological nitrogen treatment processes such as activated sludge and nitrospira bacteria in water and soil. It is to provide a physical measurement method. Still another object is to provide an operation management method for an aerobic biological treatment tank using the number of nitrifying bacteria including Nitrospira as an index for daily management of an aerobic biological treatment facility.
  • the antibody-sensitized latex for measuring Trospira bacteria is an antibody-sensitized latex containing a liquid medium and latex particles suspended in the medium. It has a specific gravity of approximately 1.5 gZml and an average particle size of 1.0 to 1.5 m, and has nitrite activity-adsorbs a specific antibody to the genus Trospira. To do. As a result, it is possible to easily and simply perform detection and measurement of bacteria of the genus Nitrospira, which conventionally required a long period of time and technical skill.
  • the antibody-sensitized latex for measuring nitrospira bacteria of the present invention can detect -trospira bacteria by an immunoassay. That is, against bacteria of the genus Nitrospira
  • specimens that can be used are immunological measurement methods that allow antibodies to react with antibodies, for example, biological nitrogen treatment processes such as activated sludge, samples collected from water and soil, as they are, or diluted.
  • biological nitrogen treatment processes such as activated sludge, samples collected from water and soil, as they are, or diluted.
  • an immunoassay method for detecting and quantifying a bacterium belonging to the genus Trospira present in a specimen with an antibody specific to these bacteria can be mentioned.
  • immunoassay examples include immunoagglutination such as latex agglutination and reverse passive latex (erythrocyte) agglutination, immunochromatography, fluorescent antibody method, enzyme antibody method, and radioimmunoassay. From the viewpoint of simplicity and rapidity, immunoaggregation and immunochromatography are preferred. Of these immunoaggregation methods, the reverse passive latex (erythrocyte) aggregation method, which is an indirect agglutination reaction using erythrocytes or latex particles bound with an antigen or antibody, is particularly preferred.
  • immunoagglutination such as latex agglutination and reverse passive latex (erythrocyte) agglutination
  • immunochromatography fluorescent antibody method
  • enzyme antibody method enzyme antibody method
  • radioimmunoassay radioimmunoassay.
  • immunoaggregation and immunochromatography are preferred.
  • the reverse passive latex (erythrocyte) aggregation method which is an indirect agglutination reaction using
  • any of inorganic compound particles such as erythrocytes and gold colloid particles and organic polymer particles such as latex particles may be used. It is preferable to use from the viewpoint of the stability of the reagent after sensitization with an antigen or antibody.
  • the bacterium belonging to the genus Trospira referred to in the present invention is a microorganism having an activity of producing nitric acid by nitrite oxidation activity, that is, an acid of nitrite, so-called genus of nitrite-oxidizing bacteria.
  • nitrite oxidation activity that is, an acid of nitrite
  • genus of nitrite-oxidizing bacteria Currently, DDBJ (DNA Data Bank of Japan) has 43 registered 16S-rRNA base sequences of trospira-like bacteria, and 4 strains (species) are proposed based on the results of phylogenetic analysis using these sequences. Has been.
  • nitrospira moscoviensis was used as a bacterium belonging to the genus -Trospira for preparing the antibody. Needless to say, antibodies can be prepared.
  • An antibody specific for these bacteria can be obtained by using the above-mentioned microbial cells as an antigen, rabbit, mouse, rat,- ⁇ An animal such as a bird, sheep, or horse may be immunized, and the obtained antibody may be used as an antibody for detecting bacteria. Furthermore, antiserum produced by a known method (such as the method described in Patent Document 1) is further purified by an appropriate purification means such as affinity chromatography to which protein G is bound. .
  • the method of the present invention is a method for detecting a bacterium belonging to the genus Trospira using the antibody-sensitized latex, the operation of mixing the antibody-sensitized latex and a test sample, and the obtained mixture. It is characterized by comprising an operation of allowing the combined sample to stand for a predetermined time and an operation of confirming the presence or absence of aggregation of latex particles in the mixed sample that has been left still.
  • the test sample is a nitros in the treatment liquid in the aerobic biological treatment tank by using a sample from which the treatment liquid force in the aerobic biological treatment tank is also collected. The presence or absence of the genus Pyra can be detected.
  • the immunoagglutination method will be described in more detail as an example.
  • a specific gravity of 1. Og or more / ml, preferably around 1.5 mg / ml, particularly 1.2 to 1.8 mgZml of high specific gravity latex particles is preferably used.
  • the average particle diameter is about 0.1 to 4.0 111, preferably [average 1.0 to about 1.5 / zm, more preferably about 1.25 ⁇ m on average latex particles are preferably used.
  • colored latex particles are preferably used. Examples of such latex particles include Noct Latex 0.81 (manufactured by DIFCO, average particle size 0.81 ⁇ m, specific gravity 1.
  • the bacterium is cultured in an inorganic salt liquid medium containing nitrite as a growth substrate, sterilized if necessary, and collected. And antigen.
  • this antigen is administered by injection from the ear vein of a rabbit, and after confirming an increase in antibody titer, whole blood is collected and subjected to appropriate treatment such as centrifugation, and then inactivated at 56 ° C. Do sputum to make antiserum. Furthermore, it is used after being purified by an appropriate purification means such as affinity chromatography to which protein G is bound.
  • the latex particles of the carrier for adsorbing the specific antibody and the method for producing the sensitized latex are not particularly limited. For example, the method reported by the present inventors. (The method described in Patent Document 2) can be prepared.
  • Methods for supporting these antibodies on carrier particles to form immunological agglutination reaction particles include a physical adsorption method and a chemical binding method, both of which are preferably used for the immunological agglutination reaction of the present invention. be able to.
  • the antigen or antibody can be sufficiently sensitized by a physical adsorption method.
  • a buffer solution a suspension of latex particles diluted to an appropriate concentration and an antibody or antigen solution are mixed and allowed to stand for a while and then washed to produce sensitized latex particles.
  • a buffer used for dilution a buffer having an ionic strength and a pH that does not inhibit a reaction with an antibody or antigen that is a measurement target substance of the antigen or antibody that is generally carried is selected.
  • TBS, PBS, GBS, phosphate buffer and borate buffer can be used.
  • phosphate buffer solution borate buffer solution and GBS are preferably used because of the cohesiveness of the sensitized latex particles and the resistance to self-aggregation.
  • the pH is selected in the range of 5 to 10, and the pH range of 6 to 9 is particularly preferable.
  • the concentration of latex particles at the time of sensitization is suitably from 0.01 to 0.5 (wZv)%, and good results are obtained particularly at about 0.05 to 0.25 (wZv)%.
  • the antibody protein concentration of the antibody solution in the case of sensitizing an antibody is suitably 1.0 to: LOOO / zg. Otherwise, the sensitivity decreases if the sensitized latex particles self-aggregate. It becomes difficult to make negative judgments.
  • the temperature during the sensitization reaction is in the range of 0 to 60 ° C, but if the reaction is performed at room temperature or slightly higher than room temperature (up to 40 ° C), sensitive latex particles will be produced. can get.
  • the reverse passive latex agglutination method is preferred for detecting nitrospyra bacteria and measuring the number of bacteria using these sensitized latexes.
  • the reverse passive latex agglutination method is a liquid containing immunological agglutination reaction particles in which a substance (such as an antibody) that specifically binds to a test substance is bound to a high specific gravity labeling substance (such as a latex particle).
  • a reagent and a sample containing a test substance are mixed to detect or quantify the target substance. More specifically, suitable Samples diluted in stages and reagent containing antibody-sensitized latex are mixed to confirm the degree of dilution at which aggregated images are observed.
  • a mixing test using a standard sample containing a bacterial solution with a known number of bacteria is performed. And the number of bacteria may be calculated from the comparison with the result.
  • a method for measuring the number of bacteria of the genus Trospira using the antibody-sensitized latex and an operation for preparing a plurality of test samples diluted to different concentrations from each other
  • An operation of mixing the antibody-sensitized latex with each of the test samples, an operation of allowing each of the obtained mixed samples to stand for a predetermined time, and latex particles in each of the left mixed samples It was confirmed by the same operation using a standard sample containing an operation for confirming the presence or absence of agglutination, a measurement image of agglutination confirmed for each mixed sample, and a bacterial solution of a known number of bacteria previously confirmed. And an operation for identifying the number of bacteria belonging to the genus Nitrospira by comparing with a measurement image of aggregation.
  • an antigen or standard sample diluted stepwise with a buffer solution is added, and an equal amount of reagent is dispensed into each well.
  • a naked eye or a magnifier of about 10 times use a naked eye or a magnifier of about 10 times to observe.
  • the agglutination image in the case of only the buffer solution was determined to be negative, the agglutination image of each hole was judged, and the result of the agglutination test using the dilution factor of the test hole that showed a positive agglutination image and the standard antigen From the above, calculate the number of bacteria.
  • the latex particles according to the present invention and a test sample are mixed on a slide glass, and the success or failure of an aggregated image is determined by an optical microscope (microscope latex). Needless to say, it can be used for various qualitative / quantitative methods using immunological agglutination particles such as immunochromatography and immunochromatography.
  • the number of nitrospira bacteria necessary for maintaining the target nitrification rate after measuring the number of -trospira bacteria in the treatment liquid in the aerobic biological treatment tank, the number of nitrospira bacteria necessary for maintaining the target nitrification rate and As described above, it further includes an operation of managing at least one operating condition selected from the solid material residence time in the tank, the amount of dissolved oxygen in the tank, and the inflow load into the tank.
  • the number of bacteria belonging to the genus Trospira necessary for maintaining the target nitrification rate is preferably 10 7 cells / mL or more.
  • the aerobic biological treatment referred to here is a variety of aerobic microorganisms involved in the presence of dissolved oxygen, and oxidatively decomposes organic substances, ammoniacal nitrogen, odor, iron, etc. It is a processing method to remove.
  • the aerobic treatment is roughly divided into a method of oxidizing and decomposing organic substances in a state where biological flocs are floated by aeration, and a method of making microorganisms adhere to the carrier to form a biological film, which is then contacted with wastewater to oxidize. Divided into disassembling methods.
  • the former is the activated sludge method, which is widely used in sewage treatment.
  • the latter is generally called the biofilm method.
  • the activated sludge method includes a standard activated sludge method, an oxygen activated sludge method, a long-time aeration method, an oxidation ditch method, a batch activated sludge method, and the like.
  • the biofilm method here is often called a biofixation method recently because microorganisms are immobilized on a carrier (also called a support or contact material). According to the state of the carrier, it can be divided into a case where the carrier is immersed in the treatment tank (fixed bed) and a case where the carrier is moved in the treatment tank (fluidized bed).
  • Anaerobic high-concentration wastewater using biofilms mainly for the purpose of removing nitrogen compounds and phosphorus A combination of aerobic treatment and anaerobic treatment, such as a method of aerobic treatment after anaerobic treatment, is utilized, but it goes without saying that it can be widely applied to biological treatment methods including such aerobic biological treatment.
  • the present invention relates to an antibody-sensitized latex for measurement in which an antibody specific for a bacterium of the genus -Trospira is adsorbed to latex particles, and by using the antibody-sensitized latex, This makes it possible to easily and conveniently detect and measure nitrospira bacteria, which have conventionally required a long period of time and technical skill.
  • another invention of the present invention can produce a specific antibody against bacteria belonging to the genus Nitrospira, and identify bacteria belonging to the genus Nitrospira such as biological nitrogen treatment processes such as activated sludge, water, and soil.
  • the operation management of the aerobic biological treatment facility is facilitated by controlling the operating conditions of the aerobic biological treatment tank using the number of nitrifying bacteria including the genus Nitrospira as an index.
  • Nitrospira moscoviensis was cultured in the medium shown in Table 1. This strain was distributed from Universitat Hamburg, Dr. Eva Spieck (University of Hamburg, Germany) (Eh rich S., D. Behrens, E. Lebedeva, W. Ludwig, and E. Bock. (1995) ) A new obligately che molitoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. Nov. And its phylogenetic relationship. Arch, microbiol. 164: pp 16-23. Cultivation is carried out in three stages (100 mL scale seed culture, 1 L scale intermediate culture, 4 L scale final culture), and in each stage, the culture temperature is 37 ° C and the culture period is 7 to 10 days. .
  • Centrifugation was carried out at 24,000 xg for 10 minutes at 0 ° C to recover the bacteria.
  • Pivetti with PBS 30mL After the bacteria were dispersed by aging, an equal amount of 0.6% formalin was added and sufficiently stirred. This solution was allowed to stand at 37 ° C for 1 hour, and then fixed at 4.0 ° C until the bacteria were killed. The fixed cells were collected by centrifugation at 24,000 ⁇ g for 10 minutes, washed with PBS, and then centrifuged again at 24,000 ⁇ g for 10 minutes for use as an antigen. Further, the test antigen was prepared by adjusting with PBS so that the absorbance at 660 nm was 0.5.
  • Two KBL: Jw (Japanese white species) Usagi were used.
  • the dose of the antigen was 0.5 mL per injection, and it was injected via the ear vein every 7 days.
  • Serum was also collected from immunized rabbits and tested for the increase in antibody titer against nitrospira moscowiensis strain DSM10035 by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
  • step dilute PBS (—) containing 0.05% Triton-X100 1.0% BSA.
  • the released serum was added at 90 / zL per well and reacted at 37 ° C for 1.5 hours.
  • a peroxidase-labeled secondary antibody (anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) —hidge IgG) was added with 100 LZ wells, and further reacted at 37 ° C. for 1.5 hours with light shielding.
  • IgG anti-rabbit immunoglobulin G
  • the antibody titer was determined as m 492 nm, which is the dilution factor of serum that shows 0.5 color development intensity.
  • Reciprocal is shown. When no increase in antibody titer was observed, whole blood was collected from the heart. Anti-serum was inactivated at 56 ° C, corresponding to bacteria of the genus Nitrospira.
  • Antiserum IgG was fractionated with a affine-tea mouth mat bound with protein G (Mab TrapG kit, Amersham-Far Macia). This purified IgG was used as a stake-trospira antibody and used in the following experiments.
  • the cross-reactivity between the stake-trospira antibody and each bacterium shown in Table 2 was examined by ELISA.
  • the anti-nitrospira antibody prepared this time has high specificity without any cross-reactivity with these bacteria.
  • These antisera having high specificity can be obtained by directly using the reaction characteristics of the antibody, such as agglutination, as a direct index, or by using a color reaction that correlates with the reaction characteristics as an index. It was proved that it is useful to detect nitrospyra bacteria in biological nitrogen treatment processes such as activated sludge, water, and soil.
  • the amount of protein sensitized to latex particles and the particle size of latex particles were optimized.
  • the antibody-sensitized latex reagent was prepared according to the method described in Patent Document 2 known in the art.
  • the pile-trospira antibody was diluted with GBS so as to be 50 to 500 ⁇ g ZmL.
  • One volume of the antibody dilution was mixed with one volume of polystyrene high specific gravity latex solution CFSR, specific gravity 1.5 gZml diluted with GBS to 0.25% wZv, and reacted at 37 ° C for 1.0 hour.
  • After completion of the reaction add blocking solution (0.1MGBS containing 1.0% BSA)
  • the antibody non-adsorbed portion on the child was probed with BS A.
  • a formalin-fixed Torospira moscowiensis (DSM10035 strain) with a known number of bacteria was diluted to the second factor using a stock solution. After 50 L of each diluted solution was dispensed onto a 96-well UV plate (SJ10 3-20 Sanko Junyaku Co., Ltd.), equal amounts of high specific gravity latex reagent sensitized with various concentrations of antibody were added. The mixture was sufficiently stirred to such an extent that the mixture did not scatter, and then reacted at room temperature for 4.0 hours to determine the minimum amount of bacteria that could be detected. This test was carried out for each particle size shown in Table 4, and the particle size with the highest detection sensitivity and the antibody protein sensitization concentration were examined.
  • the measurement sensitivity of the reagent increases in proportion to the particle size when the diameter is from 0.9 to 1.4 m. Conversely, when the diameter exceeded 1.4 m, a decrease in sensitivity was observed.
  • the detection sensitivity can be adjusted by appropriately adjusting the particle size of the latex particle to sensitize the antibody and the amount of sensitized antibody protein.
  • -Latex reagent for Torospira It was possible to produce.
  • the detection sensitivity of the latex reagent can be increased to 7.0 X 10 5 cells / mL at the maximum.
  • FISH method fluorescent in-situ hybridization method
  • bacteria of the genus -trospira in the activated sludge were detected and quantified by the reverse passive latex agglutination method (RPLA method).
  • the test samples included four standard activated sludge methods (Fig. A), six oxidation ditch methods (Fig. B), A
  • a DNA probe NtspaO 662 specific for bacteria of the genus nitrospyra was used according to the method of Amann et al. ( Amann R. (1995) In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization with rRNA- targeted nucleic acid probes; see Molecular Microbial Ecology Manual 3.3.6: pp 1-15.)
  • FISH method-bacteria of the genus Trospira I asked for a number.
  • the number of nitrite bacteria was determined by the most probable number method (MPN method) which is a culture method.
  • the MPN method showed values lower by 1 to 5 orders or more than the reverse passive latex agglomeration method.
  • the measurement efficiency is 2-5 orders smaller than the antigen-antibody method when the number of nitrifying bacteria in the mixed culture sample is measured by the MPN method (Nobuo Araki).
  • similar results were obtained, indicating that the reverse passive latex agglutination method is more suitable than the MPN method for measuring nitrifying bacteria.
  • the FISH method is generally a detection method that utilizes the fact that the base sequence information of 16S-ribosomal DNA and RNA differs between bacteria, and is very useful as a molecular biological environmental microorganism analysis method. It is considered to be a safe method. However, in this method, since it is essential that a large number of targets (ribosomal RNA) exist in the cell! /, The cell (starved state) is not sufficiently contained in the liposomal RNA molecule. It has been pointed out that it cannot be detected by cells in On the other hand, microorganisms that inhabit biological nitrogen treatment processes such as activated sludge always inhabit some environmental stresses due to the diversity of influent water quality, and so on. In many cases, RNA is not synthesized. Therefore, it was speculated that there was a bacterium belonging to the genus Trospira, which was not sufficiently detected by the FISH method even though it had nitrite activity.
  • the objective is to identify a bacterium belonging to the genus Trospira, such as in water and soil, during water purification processes such as activated sludge, and to establish a method for quickly and appropriately managing the number of bacteria.
  • the antibody-sensitized lathe of the present invention for measuring bacteria of the genus Trospira It was confirmed that the reverse passive latex agglomeration method using X-ray particles is an excellent method in terms of rapidity and simplicity.
  • the relationship between the number of Nitrospira bacteria and the amount of Kjeldahl nitrogen in the sewage treatment facility (10 facilities) was determined. For the number of samples, one sample was collected at each facility for spring, summer, autumn and winter, and a total of 40 samples were analyzed. As a result, as shown in Fig. 3, it became clear that 90% or more of Kjeldahl nitrogen was removed from the reaction tank in which the number of nitrospira bacteria was maintained at 10 7 cellsZmL or more. In addition, about 90% of the tanks in which 10 6 to 10 7 cells / m 1 of bacteria were retained, more than 80% of Kjeldahl nitrogen was removed.
  • the nitrification rate is expressed by the following equation.
  • Nitrification rate (%) (Kjeldahl nitrogen concentration in influent water Kjeldahl nitrogen concentration in treated water) / (Kjeldahl nitrogen concentration in influent water) X 100
  • the operating conditions of the nitrification reaction tank are adjusted so that the number of bacteria of the genus Nitrospira is 10 6 cells ZmL or more, more preferably 10 7 cells Zml or more, the nitrification rate is 80% or more. It was thought that it could be maintained.
  • SRTN Solid residence time required to maintain nitrifying bacteria in the reaction tank system (SRT) (d)
  • the SRT of the nitrifying bacteria and the SRT of the activated sludge process are the same. In order to maintain nitrifying bacteria and promote nitrification in the process, an SRT setting that satisfies Equation 1 is required. It was necessary. [0073] Since the growth rate of nitrifying bacteria is affected by the water temperature, the solids residence time (SRT) required to hold the nitrifying bacteria in the reaction tank becomes longer in the low water temperature period.
  • the nitrifying bacteria in the reaction tank are measured quickly and easily, and the SRT is adjusted so that a sufficient amount of nitrifying bacteria can be maintained based on the measurement data. It is possible to adjust the operation control suitable for each reaction tank.
  • the most probable number method and fluorescence in-situ which are existing nitrifying bacteria measurement methods, can be used.
  • a noise hybridization method, a quantitative PCR method, and the like can also be used.
  • these methods have a long measurement period and require skill, expensive equipment, and reagents, and thus cannot be easily measured in the facility.
  • the operation management method of the activated sludge process using the number of bacteria as an index is realized for the first time by the present invention, and can be said to be a more efficient method compared to the existing method.
  • the present invention relates to an antibody-sensitized latex for measurement in which an antibody specific to a bacterium of the genus Nitrospira is adsorbed to latex particles.
  • the present invention produces a specific antibody against a nitrospira bacterium, identifies a biological nitrogen treatment process such as activated sludge, identifies nitrospira bacterium in water and soil, and counts the number of bacteria. Can be measured quickly and appropriately.
  • the present invention also measures the number of nitrifying bacteria in the reaction tank of a sewage treatment facility quickly and easily, and controls the operating conditions such as solid residence time of the activated sludge process using this as an index. By doing so, the operation management of the activated sludge process becomes easy.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the particle size of latex particles and the lower limit of measurement.
  • the bar graph represents the lower limit of measurement (cells / ml) and the code represents the latex particle size ( ⁇ m).
  • the horizontal axis is the product number of latex particles.
  • FIG. 2 is a diagram showing measured values of a bacterium belonging to the genus Trospira by RPLA method, FISH method and MPN method.
  • the horizontal axis shows the facilities A to D where the standard activated sludge method is performed
  • the figure B is the facilities E to K where the oxidation ditch method is used
  • the figure C is the facility where the AO method is performed K D
  • the number of activated sludge samples collected from the reaction tanks of a total of 12 facilities is shown.
  • the vertical axis of each figure indicates the number of bacteria of the genus -trospira (cells / ml for the RPLA method and FISH method, MPN / 100 ml for the MPN method).
  • graph a shows the RPLA method
  • graph b shows the FISH method
  • graph c shows the MPN method.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the number of nitrospira bacteria and the nitrification rate.
  • the vertical axis indicates the number of bacteria (cells / ml), the horizontal axis indicates the treated water Kjeldahl nitrogen removal rate (nitrification rate) (%), and the dots in the figure indicate nitrite-oxidizing bacteria.

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Abstract

　亜硝酸酸化活性を有するニトロスピラ属細菌に特異的な抗体を比重が略１．５ｇ／ｍｌで平均粒径が１．０～１．５μｍのラテックス粒子に吸着させたニトロスピラ属の細菌測定用抗体感作ラテックス。この抗体感作ラテックスは、被検試料と混合され、予め定められた時間静置させた後、個々のラテックス粒子同士が凝集したことを示す凝集像の発生の有無を確認することにより、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中等のニトロスピラ属細菌の検出・測定を容易にかつ簡便に行うことができる。

Description

明 細 書
抗体感作ラテックス
技術分野
[0001] 本発明は、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中等に存在する ニトロスピラ属に属する細菌を、迅速'簡便に測定する当該抗体感作ラテックスに関 する。詳しくは、徒来、長期間を要し、また技術的にも熟練が必要とされていたニトロ スピラ属の細菌の検出を、簡便な操作で、正確に実施することを可能にする。更に、 この抗体感作ラテックスを用いた-トロスピラ属細菌の測定方法、および活性汚泥等 の生物学的窒素処理プロセスを的確に運転管理する方法を確立するものである。 背景技術
[0002] 我々の生活環境から排出される廃水、ゴミ等は多くの窒素化合物を含み、それらは 地下水、河川、湖沼などの周辺環境へ排出され、重大な環境問題を引き起こすこと がある。その対策として活性汚泥を使った生物学的硝化 ·脱窒法が開発され、様々な 下水処理場で利用されている。その処理法の内、硝化行程においては、活性汚泥中 に存在する硝化細菌が重要な役割を担って!/、る。
[0003] 生物学的脱窒処理プロセスでは硝化反応が律速段階となっているため、処理プロ セスの安定ィ匕ゃ更なる高度効率ィ匕を図るためには、硝化反応にかかわる微生物群（ 硝化細菌、アンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌で構成される）の解析が必要不可 欠であると考えられている。
[0004] 一般に硝化反応に力かわる細菌は独立栄養細菌であり、有機物を除去する従属栄 養細菌に比較して比増殖速度が小さぐ pH、水温などの環境条件の影響を受けや すいため、硝化反応槽 (反応タンク）に硝化細菌を高密度に保持することは非常に重 要である。
[0005] し力しながら、これら処理槽の評価及び維持管理はシステムのインプット及びアウト プットの解析により判定されて 、るが、肝心の菌叢の判定等は全く行われて 、な 、の が現状である。
[0006] 具体的には、従来、下水処理施設の活性汚泥処理槽等の生物学的窒素処理プロ セス中や土壌中の亜硝酸酸ィ匕細菌の定量方法としては、一般に、試料を採取し、 1ケ 月から 2ヶ月位の培養期間を経た後、当該試料における亜硝酸の消費の有無から、 それらを間接的に測定する方法が知られて 、た (非特許文献 1参照)。
[0007] また、従来、力かる方法を利用することによって、活性汚泥等の生物学的窒素処理 プロセスや土壌中の硝化細菌の動向を管理するを行おうとの試みがあつたが、当該 方法では、硝化細菌数の測定に熟練性が要求され、また、力なりの日数が必要とな ることから、測定結果力 硝化細菌の動向を日常的に管理するための迅速な対応が 、のが現状であった。
[0008] そこで、発明者らは、代表的な硝化細菌である-トロソモナス属の細菌（アンモニア 酸化細菌）と-トロパクター属の細菌（亜硝酸酸化細菌）につ ヽてこれらの菌を特異 的に認識する抗体を用いる検出方法を開発し、該方法によりアンモニア酸化細菌ま たは亜硝酸酸化細菌を、迅速 '簡便に検出する方法を提供している (特許文献 1参 照)。更に、当該抗体をラテックス粒子に吸着させた抗体感作ラテックスを使用するこ とで、さらに容易にアンモニア酸ィ匕細菌、亜硝酸酸化細菌の検出を行う方法につい ても提供してきた (特許文献 2参照)。
[0009] 一方、 1990年以降、水環境分野に分子生物学的手法を使った解析技術が導入さ れたことにより、硝化細菌の分布やポピュレーションに関する知見は徐々に更新され つつある。特に亜硝酸酸ィ匕細菌については、新たに-トロスピラ属の細菌が見出され 、優占種として検出される窒素処理プロセスが頻繁に報告されるようになった。このこ とから、当該生物学的窒素処理プロセスでの窒素の除去効率を正しく把握するため には、ニトロソモナス属及び-トロパクター属の細菌に加えて、ニトロスピラ属の細菌 数を 、かに正確に測定するかと 、う点が重要な課題となって!/、る。
[0010] し力しながら、上述した測定方法では、生物学的窒素処理プロセスより入手した活 性汚泥等の検体を用い培養する過程で、ニトロソモナス属細菌やニトロパクター属細 菌等、ニトロスピラ属細菌以外の菌体が優勢となってしまい、正確な結果が得られな いといった問題があった。また、ニトロスピラ属細菌自体が従来の方法では単離でき ないため、ニトロスピラ属細菌を特異的に認識する抗体を得ることができず、当該菌 を検出'定量することはできな 、と 、う問題があった。 非特許文献 1 :木村龍介ら、土壌微生物実験法、 207-214頁 (1992)
特許文献 1：特開平 05— 322896号公報
特許文献 2：特開平 08— 029426号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] この様な状況を踏まえ、本発明者等は、更に、活性汚泥等の生物学的窒素処理プ 口セス、水中、土壌中等などに存在する-トロスピラ属の細菌を簡便かつ迅速に測定 する方法を開発することを目的として鋭意検討を行った。その結果、本発明者らは、 ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体を作製し、当該抗体をラテックス粒子に吸着さ せた抗体感作ラテックスを用いることにより、簡単な操作で目的とする-トロスピラ属 の細菌を迅速に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0012] すなわち、本発明の目的は、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土 壌中等の-トロスピラ属の細菌を迅速 .簡便に検出することを可能にする新規な-トロ スピラ属の細菌測定用抗体感作ラテックスを提供することにある。また、別の目的は、 上記測定用抗体感作ラテックスを利用することによって、活性汚泥等の生物学的窒 素処理プロセス、水中、土壌中等のニトロスピラ属の細菌を、迅速'簡便に測定する 免疫学的測定法を提供することにある。更に別の目的は、好気性生物処理施設の日 々の管理について、ニトロスピラ属をはじめとする硝化細菌数を指標とした好気性生 物処理槽の運転管理法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明に係る-トロスピラ属細菌測定用抗体感作ラテックスは、液状媒質とこの媒 質中に懸濁されたラテックス粒子とを含んだ抗体感作ラテックスにお 、て、前記ラテツ タス粒子力 比重が略 1. 5gZmlで平均粒径が 1. 0〜1. 5 mであり、亜硝酸酸ィ匕 活性を有する-トロスピラ属細菌に特異的な抗体を吸着させものであることを特徴と するものである。これにより、従来、長期間を要し、技術的にも熟練が必要とされてい た、ニトロスピラ属の細菌の検出 ·測定を容易にかつ簡便に行うことができる。
[0014] また、本発明のニトロスピラ属細菌測定用抗体感作ラテックスは、免疫学的測定法 により-トロスピラ属細菌を検出することができる。即ち、ニトロスピラ属の細菌に対す る抗体と、抗体とを反応させる免疫学的測定法であればよぐ検体としては、例えば、 活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中から採取した試料等をその ままあるいは希釈して用いることができる。より具体的には、検体中に存在する-トロ スピラ属の細菌を、これらに特異的な抗体により検出'定量する免疫測定法等が挙げ られる。
[0015] 免疫測定法としては、例えばラテックス凝集法や逆受身ラテックス (赤血球)凝集法 等の免疫凝集法、免疫クロマト法、蛍光抗体法、酵素抗体法及び放射免疫測定法な どが挙げられるが、簡便性、及び迅速性の点から免疫凝集法及び免疫クロマト法が 好ましい。また、当該免疫凝集法のうち、抗原または抗体を結合した赤血球またはラ テックス粒子を用いる間接凝集反応である逆受身ラテックス (赤血球)凝集法が特に 好ましい。
[0016] 本発明の免疫凝集法に使用する不溶性担体としては、赤血球、金コロイド粒子等 の無機化合物粒子およびラテックス粒子等の有機高分子粒子等の何れを用いてもよ いが、ラテックス粒子を用いることが抗原または抗体感作後の試薬の安定性の点から 好ましい。
[0017] 本発明で云う-トロスピラ属の細菌とは、亜硝酸酸化活性、すなわち亜硝酸の酸ィ匕 により硝酸を生成する作用を有する微生物、所謂、亜硝酸酸化菌のー属である。現 在、 DDBJ (DNA Data Bank of Japan)には-トロスピラ様細菌の 16S— rRNA塩基配 列が 43本登録されており、その配列を用いた系統解析結果から、 4つの系統 (種）が 提案されている。
[0018] し力し、純粋培養に成功した菌株は淡水性の-トロスピラ モスコビエンシス (Nitros pira moscoviensis)、および深海から単離された-トロスピラ マリナ (Nitrospira marina ATCC43039株)の 2株しかなぐ活性汚泥、土壌、その他下水処理リアクターなどの通 常の生物学的窒素処理プロセスからは単離されていない。本発明では、抗体を調製 するための-トロスピラ属の細菌として、ニトロスピラ モスコビエンシスを用いたが、他 に-トロスピラ属の純粋培養株が確立された場合には、当該菌株を用いても同様に 抗体を調製し得ることは言うまでもな 、。
[0019] これらの菌に特異的な抗体は、上記の菌体を抗原としてゥサギ、マウス、ラット、 -ヮ トリ、羊、馬などの動物を免疫し、得られた抗体を細菌の検出用抗体とし用いればよ い。さらには、公知の方法 (特許文献 1に記載の方法等）により製造した抗血清を、更 に、プロテイン Gを結合したァフィユティークロマト等の適宣の精製手段で精製して使 用される。
[0020] よって、本発明の方法は前記抗体感作ラテックスを用いた-トロスピラ属細菌の検 出法であって、前記抗体感作ラテックスと被検試料とを混合する操作と、得られた混 合試料を予め定められた時間静置する操作と、静置された混合試料中のラテックス 粒子同士の凝集の有無を確認する操作とを備えたことを特徴とするものである。
[0021] また、より好まし 、態様としては、前記被検試料が、好気性生物処理槽内の処理液 力も採取された試料を用いることにより、好気性生物処理槽内の処理液中のニトロス ピラ属細菌の有無を検出することができる。
[0022] 以下、免疫凝集法の場合を例にとり、より詳細に説明する。用いるラテックス粒子と しては、比重が 1. Og以上/ mlであり、好ましくは 1. 5mg/ml前後、特に 1. 2〜1. 8mgZmlの高比重ラテックス粒子が好適なものとして用いられ、さらに平均粒子径は 約 0. 1〜4. 0 111、好ましく【ま平均1. 0〜1. 5 /z m前後、更に好ましく ίま平均 1. 3 μ m前後のラテックス粒子が好適なものとして用いられ、更にはラテックス粒子に着色 したものが好適なものとして用いられる。このようなラテックス粒子としては、例えば、 ノクトラテックス 0. 81 (ディフコ（DIFCO)社製、平均粒径 0. 81 μ m、比重 1. Og/m 1)や、 IMMUTEX Hシリーズ (JSR社製、比重は 1. 5g/ml,平均粒径は 0. 94 /ζ πι〜 4. 9 m、着色したラテックスを含む）およびポリビーズ #15706、 #15709 (ポリサイェン ス社製)等の市販製品が例示できるが、これに限らず、これらと同じ効果を有するもの であればその種類を問わず使用することが可能である。
[0023] ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体を調製するには、まず、菌を亜硝酸を増殖基 質とする無機塩液体培地を用いて培養し、必要に応じて殺菌し、集菌し、抗原とする 。次いで、この抗原を、ゥサギの耳静脈から注射により投与し、抗体価の上昇を確認 した上で、全採血し、遠心分離などの適宣な処理を施した後、 56°Cで不活ィ匕を行い 、抗血清とする。更に、プロテイン Gを結合したァフィユティークロマト等の適宣の精製 手段で精製して使用される。 [0024] 次 、で、上記特異的な抗体を吸着させる担体のラテックス粒子や、また、感作ラテツ タスの製造方法等は、特に限定されるものではなぐ例えば本発明者らが報告した方 法 (特許文献 2に記載の方法）に従 ヽ調製することができる。
[0025] これら抗体を担体粒子に担持させて免疫学的凝集反応粒子とする方法は、物理吸 着法と化学結合法があるが、どちらも本発明の免疫学的凝集反応に好適に使用する ことができる。凝集反応粒子としてラテックス粒子を用いる場合は、物理的吸着法で 充分に抗原または抗体を感作させることが可能である。
[0026] 上記のラテックス粒子に抗体を感作させる場合は、緩衝液中にお!、て行うことが好 ましい。すなわち、適当な濃度に希釈したラテックス粒子の懸濁液と抗体または抗原 の溶液とを混合し、しばらく放置した後に洗浄して感作ラテックス粒子を製造する。希 釈に用いる緩衝液としては、一般に担持された抗原または抗体の測定対象物質であ る抗体または抗原との反応を阻害しな 、イオン強度、 pHを有するものが選択される。 例えば、 TBS、 PBS、 GBS、リン酸緩衝液およびホウ酸緩衝液が利用できる。中でも 、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液および GBSは感作ラテックス粒子の凝集性、自己凝 集の起こりにくさ力も好適なものとして用いられる。 pH5〜10の範囲で選択されること が一般的であり、特に pH6〜9の範囲が好適なものとして選択される。
[0027] 感作時のラテックス粒子の濃度は 0. 01〜0. 5 (wZv) %が適当であり、特に 0. 05 〜0. 25 (wZv) %程度で良好な結果が得られる。また、抗体を感作させる場合にお ける抗体溶液の抗体タンパク質濃度は、 1. 0〜： LOOO /z gが適当であり、それ以外で は感度の低下ゃ感作ラテックス粒子の自己凝集により陽性 '陰性の判断がつきにくく なる。更に、感作反応時の温度については、 0〜60°Cの範囲内で行うが、室温また は室温よりやや高めの温度（〜40°C)で反応を行うと、感度のよいラテックス粒子が得 られる。
[0028] これらの感作ラテックスを用いて、ニトロスピラ属の細菌の検出、菌数の測定を行う には、逆受身ラテックス凝集法が好ましい。逆受身ラテックス凝集法とは、被検物質と 特異的に結合する性質をもつ物質 (抗体など)を高比重の標識物質 (ラテックス粒子 など）に結合させた免疫学的凝集反応粒子を含む液状の試薬と、被検物質を含む試 料を混合し、対象物質の検出あるいは定量を行う方法である。より詳細には、適当な 段階に希釈した試料と、抗体感作ラテックスを含む試薬とを混合し、凝集像が観察さ れる希釈度を確認し、一方で、既知菌数の菌液を含む標準試料を用いた混合試験 を行い、その結果との比較から、菌数を算出すればよい。
[0029] 従って、本発明の別の態様としては、前記抗体感作ラテックスを用いた-トロスピラ 属細菌数の測定法であって、互いに異なる濃度に希釈された複数の被験試料を用 意する操作と、前記被検試料の各々に前記抗体感作ラテックスを混合する操作と、 得られた各混合試料を予め定められた時間静置する操作と、静置された各混合試料 中のラテックス粒子同士の凝集の有無を確認する操作と、各混合試料にっ ヽて確認 された凝集の測定像と、予め確認された既知菌数の菌液を含む標準試料を用いて 同様の操作で確認された凝集の測定像とを比較することにより、ニトロスピラ属細菌 数を同定する操作とを備えたことを特徴とする。
[0030] さらに詳細には、 U型のマイクロタイタープレートに、緩衝液で段階的に希釈した抗 原または標準試料を添加し、各穴に等量の試薬を分注した後、室温で 4〜15時間静 置した後、肉眼または 10倍程度のルーペを用い、観察 '判定するものである。具体 的には、緩衝液のみの場合の凝集像を陰性とし、各穴の凝集像を判定し、陽性の凝 集像を示した被検穴の希釈倍率と標準抗原を用いた凝集試験の結果から、菌数を 計算する。
[0031] 本発明にお ヽては、このほかにも本発明に係るラテックス粒子と被検試料とをスライ ドガラス上で混合し、光学顕微鏡的に凝集像の成否を判断する方法 (顕微鏡ラテック ス法)や、免疫クロマト法等、免疫学的凝集反応粒子を用いる様々な定性 ·定量方法 に利用できることは言うまでもない。
[0032] なお、従来から、一般的に、抗体を吸着させる担体としてラテックス粒子が存在する ことは知られていた力 これを実際に-トロスピラ属の細菌の検出 '同定に使用した例 はこれまで報告されておらず、その有効性は本発明者らによって初めて検討されたも のである。また、ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体を用いて、特に活性汚泥等の 好気性生物処理槽の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中の活性 (亜硝酸の 酸化)のある目的微生物を同定し、その菌数を迅速かつ適正に管理することを可能 にし得るとの知見は、本発明者らによって初めて得られたものである。 [0033] 更に、本発明の別の態様では、好気性生物処理槽内の処理液中の-トロスピラ属 細菌数を測定した後、目標の硝化率を維持するために必要なニトロスピラ属細菌数と なるように、前記槽内の固形物滞留時間、槽内の溶存酸素量、槽内への流入負荷か ら選ばれる少なくとも 1つの運転条件を管理する操作を更に備える。尚、目標の硝化 率を維持するために必要な-トロスピラ属細菌数としては、好ましくは、 107cells/m L以上である。
[0034] 更に好ましくは、前記-トロスピラ属細菌にカ卩えて、更に好気性生物処理槽内の- トロソモナス属細菌数およびニトロパクター属細菌数を測定し、目標の硝化率を維持 するために必要な-トロソモナス属細菌数、ニトロパクター属細菌数および-トロスピ ラ属細菌数となるように、槽内の固形物滞留時間、槽内の溶存酸素量、槽内への流 入負荷カゝら選ばれる少なくとも 1つの運転条件を管理する操作を更に備えてもよい。
[0035] これにより、好気性生物処理施設日々の運転管理について、ニトロスピラ属をはじ めとする硝化細菌数を指標とした管理が容易となる。
[0036] 尚、ここでいう好気性生物処理とは溶存酸素の存在のもとに、さまざまな好気性微 生物が関与して、有機性物質、アンモニア性窒素、臭気、鉄などを酸化分解し、除去 する処理方法である。好気性処理を大別すると、曝気によって生物フロックを浮遊さ せた状態で有機物質を酸化分解する方法と、担体に微生物を付着増殖させて生物 膜を形成させ、これを廃水に接触させて酸化分解する方式に分かれる。前者の代表 が活性汚泥法であり、下水処理で広く用いられている。後者は一般に生物膜法と呼 ばれている。
[0037] ここで 、う活性汚泥法とは、標準活性汚泥法、酸素活性汚泥法、長時間エアレーシ ヨン法、ォキシデーシヨンディツチ法、回分式活性汚泥法等が含まれ、さらには循環 式硝化脱窒法、硝化内生脱窒法、嫌気 無酸素一好気法、嫌気一好気活性汚泥 法が含まれる。またここでいう生物膜法とは、微生物を担体 (支持体あるいは接触材と もいう）に固定ィ匕させることから、最近は生物固定法と呼ぶことが多い。担体の状態か ら分類すると、担体を処理槽に浸漬させておく場合（固定床)と処理槽内で動かす場 合 (流動床）に分けられる。
[0038] また主に窒素化合物やリンの除去を目的として生物膜を用いて高濃度廃水を嫌気 性処理した後に好気性処理する方法などの好気性処理と嫌気性処理の併用技術が 活用されているが、このような好気性生物処理を含む生物処理方法に広く応用でき ることは言うまでもない。
発明の効果
[0039] 以上説明した通り、本発明は-トロスピラ属の細菌に特異的な抗体をラテックス粒子 に吸着させた測定用抗体感作ラテックスに係るものであり、当該抗体感作ラテックス を用いることにより、従来、長期間を要し、技術的にも熟練が必要とされていた、ニトロ スピラ属の細菌の検出 ·測定を容易にかつ簡便に行うことを可能とするものである。ま た、別の本発明は、ニトロスピラ属の細菌に対する特異的な抗体を作製し、活性汚泥 等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中等のニトロスピラ属の細菌を同定す ることができる。更に別の発明では、それら-トロスピラ属の菌数を迅速かつ適正に測 定することを可能にする。更に別の発明では、ニトロスピラ属をはじめとする硝化細菌 数を指標とし、好気性生物処理槽の運転条件を制御することにより、好気性生物処 理施設の運転管理が容易となる。
発明を実施するための最良の形態
[0040] 以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例により なんら限定されるものではな 、。
実施例 1
[0041] '抗原に用いる菌体の調製
ニトロスピラ モスコビエンシスを表 1の培地で培養した。この株はドイツ'ノヽンブルダ 大学 エバ スピーク博士 (Universitat Hamburg, Dr. Eva Spieck)から分与された (Eh rich S., D .Behrens , E. Lebedeva, W.Ludwig, and E.Bock. (1995) A new obligately che molitoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship. Arch, microbiol. 164: pp 16- 23.参照)。培養は 3段階 (1 00mLスケールの種培養、 1Lスケールの中間培養、 4Lスケールの最終培養)〖こ分けて 行い、いずれの段階も培養温度は 37°C、培養期間は 7〜10日間とした。
[0042] 菌の増殖が最大になったと考えられる時点で最終培養を停止し、当該培養液を 4.
0°Cで 24,000 X g 10分間遠心分離し、菌を回収した。 PBS 30mLを力卩ぇピベッティ ングにより菌を分散させた後、等量の 0. 6%ホルマリンを添加し十分に攪拌した。こ の溶液を 37°Cで 1時間静置した後、さらに菌が死滅するまで 4. 0°Cで固定した。固 定菌体を 24,000 X g 10分間遠心分離して回収し PBSで洗浄した後、再度 24,000 X g 10分間遠心分離した菌体を抗原に用いた。さらに、 660nmの吸光度が 0. 5とな るように PBSで調整し、供試抗原とした。
[0043] [表 1] ニ トロスピラモス コヴイエンシス（DSM10035株）の培地組成（培地 1000m 1 )
N a N O 2 0. 2g
C a C O 0. 007g
N a C 1 0. 5g
M g C 1 2 · 7 H 2 O 0. 05g
K H 2 P 0. l og
Figure imgf000012_0001
p H = 8. 6
[0044] 抗原の純度は、ニトロスビラに特異的な DNAプローブ NSR1156および Ntspa0662 を用いて確認した。すなわち、当該プローブを用いてハイブリダィゼーシヨン試験を 行い、菌懸濁液中に-トロスピラモスコヴイエンシス (DSM10035)以外の菌が混入して Vヽな 、かどうかを確認した。
実施例 2
[0045] ·ポリクローナル抗体の作製方法
KBL:Jw (日本白色種)ゥサギを 2羽使用した。抗原の投与量は 1回あたり 0. 5mL とし、 7 10日毎に耳静脈から注射した。免疫中のゥサギカも試験的に血清を採取し 、ニトロスピラ モスコヴイエンシス DSM10035株に対する抗体価の上昇度を酵素結合 免疫測定法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA法） ELISA法により調べ た。
[0046] 具体的には、炭酸'重炭酸緩衝液で吸光度 (A ) =0. 05に調整した抗原を 96
660nm
穴プレートに 1ゥエルあたり 100 L分注し、 4. 0°Cで 16時間吸着させた。洗浄液 (0 . 05%Triton- X100を含む PBS (—））で各ゥエルを洗浄後、ブロッキング液（1. 0%B SAを含む炭酸 '重炭酸緩衝液)を 120 LZゥエル添加し、 37°Cで 1時間反応させ た。
[0047] ゥエルを洗浄した後、 0. 05%Triton- X100 1. 0%BSAを含む PBS (—）で段階希 釈した血清を 1ゥエルあたり 90 /z Lカ卩え、 37°Cで 1. 5時間反応させた。ゥエルの洗浄 後、ペルォキシターゼ標識 2次抗体 (抗ゥサギ免疫グロブリン G (IgG)—ヒッジ IgG)を 100 LZゥエル添カ卩し、遮光してさらに 37°C、 1. 5時間反応させた。
[0048] 反応終了後、洗浄したゥエルに過酸ィ匕水素をふくむ O—フエ-レンジァミンの加ク ェン酸緩衝液を 100 LZゥエル添カ卩し、遮光して 37°Cで 10分放置し、発色させた 。 2. 5M硫酸を 50 /z LZゥヱル添カ卩し反応を停止させた後、 492nmの吸光度 (A
660η
)を測定した。なお、抗体価は、 Α の発色強度が 0. 5を示す血清の希釈倍率の m 492nm
逆数で示した。抗体価の上昇が認められない場合に、心臓から全採血を行った。 56 °Cで不活化し、ニトロスピラ属の細菌に対応する抗血清とした。
実施例 3
[0049] ·免疫グロブリン G (Immunoglobulin G： IgG)の精製
プロテイン Gを結合したァフィ-ティーク口マト（Mab TrapGキット アマシャム ·フアル マシア製）により抗血清力 IgGを分画した。この精製 IgGを杭-トロスピラ抗体とし、 以下の実験に用いた。
実施例 4
[0050] ，交差反応性試験
杭-トロスピラ抗体と表 2に示す各細菌との交差反応性を ELISA法により調べた。 交差反応性は、杭-トロスピラ抗体の-トロスピラ モスコヴイエンシス （DSM10035株 )に対する抗体価 (ELISA法を応用した呈色反応による吸光度 (OD =0.5)を示す
492
希釈倍率の逆数)を 100%とした場合の、当該抗体と各菌体との交差反応性を％で 示した。一般に活性汚泥等の水質浄ィ匕プロセスからは、シユードモナス、アルカリゲ ネス、フラボパクテリゥムなどのグラム陰性桿菌が優占種として報告される例が多 、。
[0051] [表 2] 抗ニト口ソモナス抗体の交差反応性の解析に使用した菌株
No. 菌株名 菌株保存機関番号
1 ァグ クテリウム レデゥイノくクター- I F O 1 3 5 3 2 T
2 ッメファシエンス I F O 1 2 3 0 7
3 アル力 リゲネス デニト リ フィキヤンス I F O 1 5 1 2 5 T
4 ファェ力 リ ス I F O 1 3 1 1 1 X
Ό チルス リケニフォルミス I F O 1 2 2 0 0 T
6 ズブティリス I F O 1 3 7 1 9 T
7 ンテ クター s p . 分離株
8 フラボバクテリゥム フエ/レギネゥム I F O 1 4 9 9 2 T
9 s p . I F O 1 5 1 2 8
10 s p . I F O 1 5 1 4 7
11 s p . 分離株
12 ノ力ルディァ アマラエ 分離株
13 モラキセラ s p . 分離株
14 二ト クタ—— ゥイノダラ ドスキー I F O 1 4 2 9 7
15 二卜口 ソモラ—ス 口パェァ I F O 1 4 9 9 8
16 ハラコッカス デニト リフィキヤンス I F O 1 4 9 0 7
17 ン ドモナス クロ口ラフイ ス I F O 3 9 0 4 T
18 フノレ ^レッセンス I F O 1 4 1 6 0 T
19 ピケッティ J C M 5 9 6 9 T
20 スタ トゼリ 1 4 1 6 5 T
21 ドロコ ッカス ェリ ス口ボリ ス 分離株
22 チォノ チノレス デニト リ フィキヤンス J C M 3 8 7 0
23 ノ ヴ ノレス I F O 1 2 4 4 3
[0052] しかし、表 3に示す通り、今回作製した抗ニトロスピラ抗体には、これらの菌に対する 交差反応性が認められず高い特異性を有することが明らかとなった。そして、これら の高い特異性を有する抗血清は、当該抗体の各細菌に対する凝集反応等の反応特 性を直接指標として、あるいは当該反応特性に相関する発色反応を指標として、また 、検出用抗体感作ラテックスを用いて、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、 水中、土壌中のニトロスピラ属の細菌を簡便に検出するのに有用であることが判明し た。
[0053] [表 3] 抗ニ トロスビラ抗体の交差反応性
No. 菌株名 相対抗体価
1 ァグロバクテリ ウム レデゥイノ クター 4 . 8
2 ッメファシエンス 5 . 〇
3 ァノレ力 リゲネス デニト リ フィキヤンス 3 . 2
4 ファェ力リス 5 . 0
5 ノ チノレス リケニフォルミス 3 . 6
6 ズブティ リス 2 . 4
7 工ンテロノくクタ■ ~ s p . 0 . 2
8 フラボバクテリ ゥム フヱ /レギネゥム 0 . 1
9 s p . 1 . 3
10 s p . 0 . 7
1 1 s p . 2 . 8
12 ノ力ルディァ アマラエ 0 . 1
13 モラキセラ s P - 4 . 4
14 二 ト πノくクター ゥイ ノグラ ドスキー 0 . 1
15 ニ トロ ソモナス ュ一ロバエア 1 . 3
16 ノ ラコッカス デニト リ フィキヤンス 0 . 1
17 シュ一 ドモナス クロ口ラフイス 4 . 3
18 フノレ才レッセンス 5 . 1
19 ピケッティ 8 . 2
20 スタ トゼリ 4 . 4
2 1 ドロコ ッカス ηリ ス口ポリ ス 〇 . 6
22 チォバチルス デニト リ フィキヤンス 2 . 0
23 ノヴヱルス 5 . 2
二 ト口スピラ モスヴイエンシス 1 0 0 . 0 (抗原） 実施例 5
[0054] ·ニトロスピラ用ラテックス試薬の調製
ニトロスピラ用ラテックス試薬の検出感度を高めるため、ラテックス粒子に感作させる タンパク質量およびラテックス粒子の粒径を最適化した。抗体感作ラテックス試薬の 調製は、公知の特許文献 2に記載した方法に準じて行った。
[0055] 具体的には、杭-トロスピラ抗体を、 50〜500 μ gZmLとなるように GBSで希釈し た。当該抗体希釈液 1容に GBSで 0. 25%wZvに希釈したポリスチレン製高比重ラ テックス溶液 CFSR製、比重 1. 5gZml) 1容を混和し、 37°Cで 1. 0時間反応させた。 反応終了後、ブロッキング溶液（1. 0%BSAを含む 0. 1MGBS)を加えラテックス粒 子上の抗体未吸着部分を BS Aでプロッキングした。
[0056] 30分間ブロッキング反応した後、 2,700 X g 10分間 室温で遠心分離し未結合の 抗体を取SS OO22H11り除いた。この抗体結合ラテックス粒子は保存溶液（1. 0%BSA、 0. 08% NaN3を含む 0. 1M GBS pH8. 2)で 2度遠心洗浄を繰り返した後、最終的に粒 子濃度が 0. 05% (wZv)になるように保存溶液に懸濁し、ニトロスピラ用ラテックス試 薬とした。この操作を、表 4に記載した各粒径のラテックス粒子について行った。
[0057] [表 4]
ラテックスの粒子の粒径
製品 No. 直径（ m)
Figure imgf000016_0001
実施例 6
[0058] '逆受身ラテックス凝集法による-トロスビラの検出
既知菌数のホルマリン固定済み-トロスピラ モスコヴイエンシス（DSM10035株）を 保存溶液を用いて 2の階乗希釈した。各希釈液 50 Lを 96ゥエル UVプレート（SJ10 3-20 三光純薬株式会社）に分注した後、種々の濃度の抗体を感作させた高比重ラ テックス試薬を等量添加した。混合液が飛び散らな ヽ程度の強さで十分攪拌した後 、室温で 4. 0時間反応させ、検出可能な最少菌量を求めた。この試験を、表 4に示 す各粒径について実施し、検出感度の最も高い粒径と抗体タンパク質感作濃度を調 ベた。
[0059] その結果、図 1に示す通り直径が 0. 9〜1. 4 mまでの間では粒径に比例して試 薬の測定感度が高まることが明ら力となった。反対に、直径が 1. 4 mを超えると、感 度の低下が認められた。また、同一粒子でも感作させる抗体量により検出感度は変 化することから、抗体を感作させるラテックス粒子の粒径、および感作抗体タンパク質 量を適宜調節することにより、任意の検出感度を持つ-トロスピラ用ラテックス試薬を 作製することが可能であった。
[0060] また、製品 No. H1009の高比重ラテックス粒子を用いることにより、ラテックス試薬 の検出感度を最高で 7. 0 X 105cells/mLまで高められることを明らかにした。過去 に我々は、 日本各地の廃水処理施設から活性汚泥を採取し、当該汚泥中に棲息す る硝化細菌群を蛍光 in— situハイブリダィゼーシヨン法 (以下 FISH法と略す）により 解析してきた。その結果、ニトロスピラ属細菌の菌数は 106〜： L08cells/mLの間で推 移していることを明らかにしている。よって今回得られた-トロスピラ用ラテックス試薬 の検出感度は、活性汚泥等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中に棲息す る-トロスピラを検出 ·定量する手法として十分実用可能なレベルであると考えられた
実施例 7
[0061] ·実試料中の-トロスピラ属細菌数の測定
本発明に係る免疫学的測定法の有効性を確認するために、逆受身ラテックス凝集 法 (RPLA法）により、活性汚泥中の-トロスピラ属の細菌を検出 '定量した。被検試 料には、標準活性汚泥法 4施設 (a図）、ォキシデーシヨンディツチ法 6施設 (b図）、 A
2
O法 1施設 (c図）および膜分離法 1施設 (d図）の計 12施設 (各図、横軸の A〜L)の 反応タンクから採取した活性汚泥を用いた。
[0062] 各々の施設由来の活性汚泥について、逆受身ラテックス凝集法による細菌の定量 の他、比較対照試験として、ニトロスピラ属の細菌に特異的な DNAプローブ NtspaO 662を用いて Amannらの方法に従い（Amann R. (1995) In situ identification of micr o— organisms by whole cell hybridization with rRNA— targeted nucleic acid probes； M olecular Microbial Ecology Manual 3.3.6： pp 1-15.参照） FISH法により-トロスピラ 属の細菌数を求めた。さらに、培養法である最確数法 (MPN法）により亜硝酸酸ィ匕 細菌数を求めた。
[0063] RPLA法により実処理施設の活性汚泥中の亜硝酸酸化細菌を測定した結果（図 2 )、ニトロスピラ属の細菌は全ての試料力 検出され、菌数は 106〜： L08オーダーであ つた。また FISH法でも 14試料力ゝら菌が検出され、その測定値は 6試料で RPLA法 の値とほぼ一致した。なお、他の試料については FISH法の測定値が RPLA法よりも 1オーダー程度低くなる傾向が認められた。また、処理方法の違いによる影響も認め られなかった。
[0064] 一方、 MPN法では逆受身ラテックス凝集法よりも 1〜5オーダー以上低い値を示し た。 MPN法による測定値については、混合培養系試料の硝化細菌数を MPN法で 測定した場合、抗原抗体法に比較して 2〜5オーダー小さ 、計測効率であることが知 られている（荒木信夫， 大橋晶良， 原田秀榭， Izarul Machdar (1999) FISH法を 適用した生物膜内硝化細菌の菌数計測と空間分布の観察；水環境学会誌 22： (2) PP152-159.参照)。今回行った実験においても、同様の結果が得られており、硝化細 菌の測定法として MPN法よりも逆受身ラテックス凝集法の方が適していることが示さ れた。
[0065] 一方、一般的に FISH法は 16S—リボソ一マル DNAおよび RNAの塩基配列情報 が細菌間で異なること利用した検出方法であり、分子生物学的な環境微生物の解析 手法として非常に有用な方法であると考えられている。し力しこの方法では、細胞内 に多数のターゲット（リボゾーマル RNA)が存在して!/、ることが必須であるために、当 該リポソ一マル RNA分子を十分に含まな 、細胞 (飢餓状態にある細胞など)では検 出することができないことが問題として挙げられている。一方、活性汚泥等の生物学 的窒素処理プロセスに棲息する微生物は、流入水質の多様性等の原因で、常に何 らかの環境ストレスを受けながら棲息しているため、菌体内に十分なリボソーム RNA が合成されていない場合が多い。よって、今回も亜硝酸酸ィ匕活性があっても FISH法 では十分に検出されない-トロスピラ属の細菌が存在すると推測された。
[0066] また、逆受身ラテックス凝集法では、抗体を利用して!/、るため、既に活性をなくして V、るが抗原性は残存して 、るような死菌体も測定して 、る可能性が考えられた。これ らのことが原因で、逆受身ラテックス凝集法による-トロスピラ属細菌の測定値と FIS H法による測定値は一致せず、逆受身ラテックス凝集法の方が FISH法の測定値より も高 、値になったと考えられた。
[0067] し力しながら、活性汚泥等の水質浄化工程中、水中、土壌中等の-トロスピラ属の 細菌を同定し、その菌数を迅速かつ適正に管理する方法を確立することを目的とす る今回の開発目標に関しては、本発明の-トロスピラ属の細菌測定用抗体感作ラテ ックス粒子による逆受身ラテックス凝集法は、迅速性、簡便性の面で優れた方法であ ることが確認できた。
実施例 8
[0068] ·下水処理施設の運転管理への応用
下水処理施設（10施設）の硝化反応タンクについてニトロスピラ属細菌数と処理水 中のケルダール態窒素量の関係を求めた。試料数は、春、夏、秋および冬について 各施設 1試料ずつ採取し、計 40試料を解析した。その結果、図 3に示す通り、ニトロ スピラ属細菌数が 107cellsZmL以上保持されている反応タンクでは、 90%以上の ケルダール態窒素が除去されていることが明ら力となった。また、 106〜107cells/m 1の菌数が保持されて 、るタンクでは、約 9割のタンクで 80%以上のケルダール態窒 素が除去されていた。
[0069] 硝化率は次の式で表される。
硝化率 (%) = (流入水のケルダール態窒素濃度 処理水のケルダール態窒素 濃度) / (流入水のケルダール態窒素濃度） X 100
[0070] よって、以上の結果から、ニトロスピラ属の細菌数が 106cellsZmL以上、更に好ま しくは 107cellsZml以上となるよう、硝化反応タンクの運転条件を調整すれば、 80% 以上の硝化率を維持できると考えられた。
[0071] 硝化細菌の増殖速度は、有機物を分解する細菌の増殖速度と比較して力なり小さ Vヽため、生物学的な硝化 ·脱窒プロセスのようにじ BODの酸化分解と硝化を同一 の反応タンク内で行う場合には、硝化細菌を系内に保持できる条件 (式 1)が必要と なる。
SRTN≥lZ w N （式 1)
SRTN：硝化細菌を反応タンク系内に維持するために必要な固形物滞留時間 (SRT )(d)
μ Ν ：硝化細菌の比増殖速度
[0072] 活性汚泥プロセスでは、硝化細菌の SRTと活性汚泥プロセスの SRTが同じである こと力 、当該プロセスに硝化細菌を維持し硝化を促進させるためには、式 1を満た す SRTの設定が必要であった。 [0073] 硝化細菌の増殖速度は水温の影響を受けるので、低水温期では、硝化細菌を反 応タンク内に保持するために必要な固形物滞留時間（SRT)は長くなる。現在では、 標準活性汚泥法として設計されている下水処理施設における硝化反応に対する水 温と固形物滞留時間の関係から、完全に硝化を生じさせることができる水温ごとの S RTの値を経験的に定量ィ匕し、その値による運転条件の管理が行われてきた。しかし 、この方法はあくまでも経験式に基づくため、この式力 導かれる SRTの値によって 全ての反応タンクで最良の硝化率が得られるわけではな力つた。
[0074] し力しながら、本発明では迅速かつ簡便に反応タンク内の硝化細菌を測定し、測定 データをもとに、良好な硝化率が維持できる量の硝化細菌が保持できるように SRTを 調整することができ、個々の反応タンクごとに適した運転管理を行うことが可能となる また、硝化細菌数の測定には、既存の硝化細菌測定法である最確数法や蛍光 in — situノヽイブリダィゼーシヨン法、定量的 PCR法なども使用することができる。しかし 、これらの方法は、測定期間が長かったり、熟練性や高価な機器、試薬が必要であつ たりすることから、施設内で容易に測定することはできな力つた。
[0075] したがって、菌数を指標とする活性汚泥プロセスの運転管理方法は、本発明により はじめて実現するものであり、既存の方法と比較してより効率的な方法であるといえる 以上詳述したように、本発明は、ニトロスピラ属の細菌に特異的な抗体をラテックス 粒子に吸着させた測定用抗体感作ラテックスに係るものであり、当該抗体感作ラテツ タスを用いることにより、従来、長期間を要し、技術的にも熟練が必要とされていた、 ニトロスピラ属の細菌の検出 ·測定を容易にかつ簡便に行うことを可能とするものであ る。
[0076] また、本発明は、ニトロスピラ属の細菌に対する特異的な抗体を作製し、活性汚泥 等の生物学的窒素処理プロセス、水中、土壌中のニトロスピラ属の細菌を同定し、そ の菌数を迅速かつ適正に測定することを可能にするものである。
[0077] また本発明は、下水処理施設の反応タンク中の硝化細菌数を迅速かつ簡便に測 定し、これを指標として、活性汚泥プロセスの固形物滞留時間等の運転条件を制御 することにより、活性汚泥プロセスの運転管理が容易となる。
図面の簡単な説明
[図 1]ラテックス粒子の粒径と測定下限値との関係を示す線図である。縦軸は棒ダラ フが測定下限値 (cells/ml)を、符号令がラテックス粒径 ( μ m)を各々表す。横軸はラ テックス粒子の製品番号である。
[図 2]RPLA法、 FISH法及び MPN法による-トロスピラ属の細菌の測定値を示す線 図である。図中、各図の横軸は、 a図は標準活性汚泥法を行う施設 A〜D、 b図はォ キシデーシヨンディツチ法を行う施設 E〜K、 c図は A O法を行う施設 K、 d図は膜分
2
離法を行う施設 Lの計 12施設 (各図、横軸の A〜L)の反応タンクから採取した活性 汚泥試料番号を示す。各図の縦軸は-トロスピラ属の細菌数 (RPLA法及び FISH 法では cells/ml、 MPN法では MPN/ 100ml)を示す。各図において、グラフ aは RPLA 法、グラフ bは FISH法及びグラフ cは MPN法を示す。
[図 3]ニトロスピラ属細菌数と硝化率との関係を示す線図である。縦軸は細菌数 (cells /ml)、横軸は処理水ケルダール態窒素除去率 (硝化率）（％)を示し、図中のドットは 亜硝酸酸化細菌を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 液状媒質と、この媒質中に懸濁されたラテックス粒子とを含んだ抗体感作ラテックス において、
前記ラテックス粒子力 比重が略 1. 5gZmlで平均粒径が 1. 0〜1. 5 mであり、 亜硝酸酸ィ匕活性を有するニトロスピラ属細菌に特異的な抗体を吸着させものであるこ とを特徴とする-トロスピラ属に属する細菌の測定用抗体感作ラテックス。
[2] 請求項 1に記載の抗体感作ラテックスを用いた-トロスピラ属細菌の検出法であつ て、
前記抗体感作ラテックスと被検試料とを混合する操作と、
得られた混合試料を予め定められた時間静置する操作と、
静置された混合試料中のラテックス粒子同士の凝集の有無を確認する操作とを備 えたことを特徴とする-トロスピラ属細菌の検出法。
[3] 前記被検試料が、好気性生物処理槽内の処理液カゝら採取された試料であることを 特徴とする請求項 2に記載の検出法。
[4] 請求項 1に記載の抗体感作ラテックスを用いたニトロスピラ属細菌数の測定法であ つて、
互いに異なる濃度に希釈された複数の被験試料を用意する操作と、
前記被検試料の各々に前記抗体感作ラテックスを混合する操作と、
得られた各混合試料を予め定められた時間静置する操作と、
静置された各混合試料中のラテックス粒子同士の凝集の有無を確認する操作と、 各混合試料につ！、て確認された凝集の測定像と、予め確認された既知菌数の菌 液を含む標準試料を用いて同様の操作で確認された凝集の測定像とを比較すること により、ニトロスピラ属細菌数を同定する操作とを備えたことを特徴とする-トロスピラ 属細菌の測定法。
[5] 前記被検試料が、好気性生物処理槽内の処理液中から採取された試料であること を特徴とする請求項 4に記載の測定法。
[6] 前記好気性生物処理槽内の処理液中のニトロスピラ属細菌数を測定した後、目標 の硝化率を維持するために必要な-トロスピラ属細菌数となるように、前記槽内の固 形物滞留時間、槽内の溶存酸素量、槽内への流入負荷力 選ばれる少なくとも 1つ の運転条件を管理する操作を更に備えたことを特徴とする請求項 5に記載の測定法 前記目標の硝化率を維持するために必要な-トロスピラ属細菌数が、 107cells/m L以上であること特徴とする請求項 6に記載の測定法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101971032A (zh) * 2008-03-14 2011-02-09 生物梅里埃公司 在液体培养基中通过凝集实时检测微生物的方法
CN104133063A (zh) * 2014-06-09 2014-11-05 浙江省海洋水产研究所 一种河豚毒素检测试剂盒
US20160341721A1 (en) * 2008-09-05 2016-11-24 Sekisui Medical Co., Ltd. Anti-human igm monoclonal antibody and immunoassay using the same

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133452A1 (ja) * 2011-03-28 2012-10-04 三菱化学メディエンス株式会社 全血検体の免疫測定方法および測定キット
CN103460046B (zh) 2011-03-31 2016-08-03 积水医疗株式会社 测定试剂用胶乳粒子、致敏胶乳粒子及免疫比浊法用测定试剂

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05322896A (ja) 1992-04-14 1993-12-07 Yakult Honsha Co Ltd 活性汚泥の管理方法及び管理用抗体
JPH0829426A (ja) 1994-03-24 1996-02-02 Yakult Honsha Co Ltd 硝酸菌、亜硝酸菌の検出用抗体感作ラテックス
JP2002027976A (ja) * 2000-07-12 2002-01-29 Sumitomo Chem Co Ltd 硝化細菌及び硝化細菌資材の保存方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773233A (en) * 1995-11-02 1998-06-30 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Monoclonal antibody specific to nitrifying bacteria and method for detection thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05322896A (ja) 1992-04-14 1993-12-07 Yakult Honsha Co Ltd 活性汚泥の管理方法及び管理用抗体
JPH0829426A (ja) 1994-03-24 1996-02-02 Yakult Honsha Co Ltd 硝酸菌、亜硝酸菌の検出用抗体感作ラテックス
JP2002027976A (ja) * 2000-07-12 2002-01-29 Sumitomo Chem Co Ltd 硝化細菌及び硝化細菌資材の保存方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMANN R.: "In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization with rRNA-targeted nucleic acid probes", MOLECULAR MICROBIAL ECOLOGY MANUAL, 1995, pages 1 - 15
ARAKI N. ET AL.: "Cell count of nitrifying bacteria in the biofilm by the FISH method and observation of their special distribution", JOURNAL OF WATER AND ENVIRONMENTAL TECHNOLOGY, vol. 22, no. 2, 1999, pages 152 - 159
EHRICH S. ET AL.: "A new obligately chemolitoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship", ARCH. MICROBIOL., vol. 164, 1995, pages 16 - 23, XP002267475, DOI: doi:10.1007/s002030050230
RYUSUKE KIMURA ET AL.: "Methods for Experiments on Soil Microorganisms", SOCIETY FOR THE RESEARCH OF SOIL MICROORGANISMS, 1992, pages 207 - 214
See also references of EP1925939A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101971032A (zh) * 2008-03-14 2011-02-09 生物梅里埃公司 在液体培养基中通过凝集实时检测微生物的方法
CN101971032B (zh) * 2008-03-14 2015-02-25 生物梅里埃公司 在液体培养基中通过凝集实时检测微生物的方法
US20160341721A1 (en) * 2008-09-05 2016-11-24 Sekisui Medical Co., Ltd. Anti-human igm monoclonal antibody and immunoassay using the same
CN104133063A (zh) * 2014-06-09 2014-11-05 浙江省海洋水产研究所 一种河豚毒素检测试剂盒
CN104133063B (zh) * 2014-06-09 2016-01-06 浙江省海洋水产研究所 一种河豚毒素检测试剂盒

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