JP5675022B2 - 磁性粒子を用いた、微生物を迅速に検出するためのプロセス - Google Patents
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Description
本発明は、免疫磁性粒子を用いた、溶液または懸濁液中の生きた微生物の、迅速な検出、半定量および定量を行うためのプロセスに関し、このプロセスは、微生物の培養を通じて予め富化することを必要としない。本発明はまた、上記プロセスを実施するためのキット、および自動化したバイオセンサ装置によって検出された微生物の定量に関する。
微生物の夾雑は、ヒトおよび周囲環境の健康についての深刻な要因であり、ヘルスケアおよび予防に対するその効果に起因するだけでなく、長期にわたるその経済的な影響にも起因する(Hutton G, Bartram J, “Global costs of attaining the Millennium Development Goal for water supply and sanitation”, Bulletin of the World Health Organization, 86(1): 13-9, 2008)。細菌、ウイルス、酵母および原虫は、非常に多くの疾患の原因因子である。
および危険環境の操作の統合を可能にする。
(1)ネガティブな結果は、分析したサンプル中に微生物が存在していることを否定しない。なぜなら、微生物はこの方法の検出限界よりも濃度が低い可能性があるからである。よって、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)型を含むイムノアッセイにおいて、制限されたアッセイ容量(一般的に0.1mL〜1.0mLの間)において、最小濃度の細胞(105〜106個)が微生物の検出に必要とされる。この制限はかなり条件付けられている。なぜなら、これらの方法は、多くの市販のイムノアッセイが、検出のために最小濃度の微生物細胞を必要としているので、多量のサンプルを用いることを許容していないからであり、このことはサンプルを予め富化しておくことを必要とし、その結果アッセイ時間を顕著に延長させ、測定されるべき微生物が十分な細胞濃度に達することを必要とする。
(2)さらに、この方法は生菌と死菌とを区別しない。なぜなら、遊離した抗原もまた検出され、そして殺生剤処理を適用した後には、死菌または遊離の抗原の存在に起因して疑陽性が得られ得るからである。
(3)このアッセイの検出限界は、サンプルの微生物学的組成および化学的組成に、非常に大きく依存している。なぜなら、特定の化学物質の存在または他の微生物の酵素活性の存在、あるいは分析されるべき微生物自身の存在が、分析されるべき微生物の検出および定量に干渉し得るからである。
(1)磁性粒子の表面上への抗体の固定化は、その表面上に官能基(例えば、水酸基、アミノ基またはカルボキシル基)の存在を必要とする。一旦、これらの官能基によって表面上に抗体が結合されると、サンプル中に存在する他の化合物に対して活性な部位を提示する遊離基が存在し得、これが抗原−抗体相互作用を干渉し得る。また、発色試薬の組成物中に存在する他の化合物、または、外部媒体に対する指向性が変更された、固定化された抗体そのものもまた結合し得、抗原との相互作用を形成し、引き続いて微生物の捕捉および回収を低下させるようだ。
1つの実施形態において、本発明は、サンプル中の生きた微生物をインサイチュで検出および半定量するための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、サンプルからの生きた微生物を研究室内にて定量するための方法を提供する。そして、別の実施形態において、本発明は、自動化されたバイオセンサ装置によって生きた微生物を検出および定量する方法を提供する。
(a)微生物を含有することが疑われるサンプルを、
(i)少なくとも1つの型の常磁性粒子を含むpH緩衝化懸濁物であって、該常磁性粒子は、測定されるべき微生物に特異的な抗体がその表面に結合されている、pH緩衝化懸濁物;および
(ii)上記抗体によって占有されていない上記磁性粒子の表面に対する、過剰量の、少なくとも1つの型のブロッキング剤分子
とともに混合する工程;
(b)得られた混合物を所定の時間にわたって、微生物−磁性粒子の複合体を形成するに適切な条件下にてインキュベートする工程;
(c)形成した微生物−磁性粒子の複合体の分離および濃縮のために磁場をかけ、引き続いて上清を回収する工程;
(d)pH緩衝化溶液中にて上記微生物−磁性粒子の複合体を再懸濁する工程であって、該溶液は、過剰量の、少なくとも1つの型のブロッキング分子、およびマーカー(酵素または蛍光団)で標識された第2の抗体を含んでいる、工程;
(e)得られた混合物を所定の時間にわたってインキュベートして、標識された抗体−微生物−磁性粒子の複合体を形成する工程;
(f)形成した上記標識された抗体−微生物−磁性粒子の複合体の分離および濃縮のために磁場をかけ、引き続いて上清を回収する工程;
(g)上記粒子を洗浄して剰余量の第2の抗体を除去し、引き続いて上清を回収する工程;
(h)液体媒体中で、形成した上記標識された抗体−微生物−磁性粒子の複合体を、再懸濁する工程であって、該液体媒体は、
マーカーとして作用する酵素によって発色(develop)させるために必要な基質;
結合したブロッキング分子に向けてシフトした吸収平衡を維持し得る濃度でのブロッキング剤;および
1つまたは数個の上記基質と競合する内因性の酵素に対して特異的な阻害剤
を同時に含んでいる、工程;
(i)得られた混合物を所定の時間にわたってインキュベートしてシグナルを発生させる工程;
(j)上記標識された抗体−微生物−磁性粒子の複合体が形成した結果として生じたシグナルを検出および定量し、該シグナルを目的の微生物の存在および定量と関連付ける工程。
・上記サンプルは、周囲環境に由来するもの、食品に由来するもの、または生物学的流体から得られたものであり、
・上記微生物は、微小な原核生物、好ましくは細菌であり、微小な真核生物、好ましくは原虫、藻類、酵母および真菌であり、病原菌、例えば、腸内細菌科の種、ビブリオ科の種、バチルス属の種、大腸菌属の種、連鎖球菌の種、シュードモナス属の種、サルモネラ属の種、レジオネラ菌の種、エンテロバクター属の種などであり、あるいは真核生物、好ましくは原虫、藻類、酵母および真菌であり、
・目的の微生物を読取り(reading)および/または捕捉する抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり、
・上記磁性粒子は球体であり、その直径が0.5μm〜2μm、好ましくは0.7μm〜1.5μm、より好ましくは0.8μm〜1.0μmの範囲内であり、該粒子は化学的に、特に−NH2基、−COOH基または−OH基で機能化されており、
・少なくとも1つの型のブロッキング分子が全ての工程の間にわたって過剰濃度で維持されており、その結果、吸着−脱離の平衡が、吸着された分子へ向けてシフトされて、上記磁性粒子上での非特異的な吸着を防止して擬陽性または擬陰性を防止し、
・前記ブロッキング分子が、タンパク質、好ましくはウシ、血清アルブミン、乳カゼイン、コールドウォーターフィッシュの皮膚のゼラチン、ブタの皮膚のゼラチン、脱脂粉乳であり、または炭水化物、好ましくはポリデキストランであり、
・上記微生物の存在が、溶液または懸濁液にて可視的に検出され、色の生成が該微生物の存在を示し、
・所望されない吸着を持続的に防止した同一の支持体の上に、多量の同一サンプルおよび/または同一サンプルを連続的なロードを用いて感度が増加させることを可能にし、
・検出感度が1mLあたり1個の細胞であり、
・1時間以内で結果が得られる。
(a)液体培地中に免疫磁性粒子の懸濁液を含んでいる、目的の微生物を捕捉するための組成物であって、
該免疫磁性粒子が、その表面上に共有結合によって捕捉抗体を固定化しており、該抗体によって占められていない表面に非共有結合によって結合したブロッキング剤を有しており、
該液体培地が、(i)該ブロッキング剤と同一のもの、(ii)キレート剤、(iii)界面活性剤、(iv)殺生剤、および(v)静菌剤、を溶液中に含んでおり、かつ、90mM〜500mMの間、好ましくは100mM〜200mMの間、より好ましくは150mMの濃度を有するリン酸緩衝化溶液に対応する高いイオン強度を有している、組成物;
(b)読取り分子または蛍光基質と複合体化した読取り抗体を含んでいる、目的の微生物に対する標識組成物であって、
(i)ブロッキング剤、(ii)該読取り分子において競合し得る、微生物中に存在する酵素の活性の阻害剤、を溶液中に含んでおり、かつ、30mM〜90mMの間の濃度を有するリン酸緩衝化溶液に対応する中程度のイオン強度、好ましくは50mMのpH6.0リン酸−クエン酸緩衝液を有している、組成物;
(c)読取り反応の発色に必要な、酸化可能な基質を含んでいる、目的の微生物に対する読取り組成物であって、該基質の自己酸化を低減させるための、リン酸二ナトリウムの弱塩を溶液中に含んでいる、組成物;
(d)読取り反応の発色に必要な酸化基質をリン酸−クエン酸緩衝化溶液(好ましくはpH6.0で濃度50mM)中に含んでいる、目的の微生物に対する読取り組成物;
(e)強酸または強塩基を含んでいる、該読取り反応を停止させる停止組成物;
(f)ブロッキング剤、界面活性剤および静菌剤を含んでいる、免疫磁性粒子を洗浄するための組成物であって、5mM〜30mMの間の濃度を有するリン酸緩衝化溶液(好ましくはpH7.0で濃度20〜30mMの間、好ましくは25mM)に対応する低度のイオン強度を有している、組成物
である。
・上記ブロッキング剤は、炭水化物またはタンパク質であり、好ましくはタンパク質であり、より好ましくは、血清アルブミン、粉末乳カゼイン、溶液乳カゼイン、コールドウォーターフィッシュの皮膚のゼラチン、ブタの皮膚のゼラチン、脱脂粉乳からなる群より選択されるタンパク質、ポリデキストランであり、
・微生物の酵素活性の、読取り分子との競合が、この活性に特異的な阻害剤(アジ化ナトリウムまたはトリアゾールなど、好ましくはトリアゾール)によって、または読取り酵素(好ましくは、ペルオキシダーゼ)に対する酸化基質として、微生物の酵素活性によって認識されない、置換された過酸化物、より好ましくは過酸化尿素を用いることによって、除去され、
・上記酸化基質が、過酸化水素、および過酸化尿素、好ましくは0.05%過酸化尿素より選択され、
・上記酸化可能な基質が、5−アミノサリチル酸、オルソ−フェニレンジアミン、2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)、好ましくは0.1% 5−アミノサリチル酸より選択され、
・上記強酸が、塩酸、硝酸および硫酸、好ましくは5M塩酸および1M硫酸より選択され、
・上記強塩基が、水酸化カリウムおよび水酸化ナトリウム、好ましくは3M水酸化ナトリウムより選択され、
・上記弱塩が、リン酸二カリウムまたはリン酸二ナトリウム、好ましくは0.1Mリン酸二ナトリウムであり、
・上記キレート剤が、2,2’−ビピリジル,ジメルカプトプロパノール,エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレンジオキシ−ジエチレン−ジニトリロ−四酢酸、エチレン−グリコール−ビス−(2−アミノエチル)−N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、オルソ−フェナントロリン,サリチル酸およびトリエタノールアミン(TEA)、好ましくはEDTAより選択され、
・上記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、好ましくはポリエトキシル化されたアルキルフェノール、ポリエトキシル化された脂肪アルコール、ポリエトキシル化された脂肪酸、アルカノールアミン、または縮合物、より好ましくはソルビタンモノラウレート(Tween 20)より選択され、
・上記静菌剤が、p−ニトロフェニル−ジ−クロロアセトアミドプロパンジオール(クロラムフェニコール)、スルファニルアミド、2,4−ジアミノ-5-(3,4,5-トリメトキシベンジル)ピリミジン(トリメトプリム)、好ましくは2-(エチルメルクリオメルカプト)安息香酸のナトリウム塩(チメロサール)より選択され、
・上記殺生剤が、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、およびアジ化ナトリウム、好ましくはアジ化ナトリウムより選択される。
(a)目的の微生物を捕捉するための組成物において、懸濁液中にて、免疫磁性粒子が、球体であり、0.8μm〜1.1μmの平均直径を有しており、捕捉抗体が、この粒子の表面に共有結合しているモノクローナルまたはポリクローナルの抗レジオネラ抗体であり、ブロッキング剤が、10%濃度のウシ血清アルブミン(BSA)であり、キレート剤が0.1%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)であり、界面活性剤が1%ソルビタンモノラウレートであり、殺生剤が0.1%濃度のアジ化ナトリウムであり、静菌剤が0.01%濃度のチメロサールであり、これらの全てが、150mMの濃度のリン酸緩衝化溶液(pH7.0)中に存在し、上記組成物が1/10の割合でサンプル中に混合される点;
(b)読取り抗体が、ペルオキシダーゼ複合体化抗レジオネラ抗体である、目的の微生物に対する標識組成物において、(i)ブロッキング剤が0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)であり、(ii)読取り分子において競合し得る、微生物中に存在する酵素の活性の阻害剤が、50mMの濃度のリン酸−クエン酸溶液(pH6.0)中の0.01%トリアゾールであり、該標識組成物がこれらを含んでいる溶液である点;
(c)目的の微生物に対する読取り組成物において、読取り反応の発色に必要な酸化可能な基質が、0.1% 5−アミノサリチル酸であり、弱塩がこの基質の自己酸化を低減させるための0.1Mの濃度のリン酸二ナトリウム(pHが7.5〜8.0の間)であり、
(d)目的の微生物に対する読取り組成物において、読取り反応の発色に必要な酸化基質が、50mMの濃度のリン酸−クエン酸緩衝化溶液(pH6.0)中の、過酸化水素または過酸化尿素、好ましくは0.05%過酸化尿素である点;
(e)読取り反応を停止する停止組成物において、強酸が5M塩酸または1M硫酸であり、強塩基が3M水酸化ナトリウムである点;
(f)免疫磁性粒子を洗浄するための組成物において、ブロッキング剤が0.1%ウシ血清アルブミンであり、界面活性剤が25mMの濃度のリン酸緩衝化溶液(pH7.0)中での0.01%チメロサールである点。
自動化された様式において、図2に示されたような以下の(i)〜(ix):
(i)目的の微生物を捕捉および標識する反応のためのセル;
(ii)選択された波長での吸光度、または選択された励起波長での蛍光を読み取るためのセル;
(iii)レジオネラの場合に、分光光度計または分光蛍光光度計からなる、光変換器;
(iv)種々の液体を操作するための流体回路;
(v)分析を連続的に制御し、シグナルを取得するための、マイクロプロセッサ;
(vi)データを処理するためのコンピュータ、および該マイクロプロセッサとの該コンピュータの通信
(vii)撹拌装置;
(viii)磁性保持装置;および
(ix)温度自動調節装置
を備えている統合されたシステムからなることによって特徴付けられる、バイオセンサに関する。このバイオセンサにおいて、各測定サイクルが、ブランクの分析およびサンプルの分析を包含し、得られた吸光度の値が、サンプルのシグナルからブランクのシグナルを差し引いた結果である。
図1は、本発明において手動分析を行うために用いられる装置の構成を示す。図面に示されるように、この装置は、基体(2)と2つの側方の斜面(3)とを含む支持体(1)、磁石(5)を支持し上記支持体に対し磁石を変位させる可動軸(4)、締め具(7)の形態の少なくとも1つの留め具、及び上記基体上で静止し締め具(7)の形態の上記留め具により位置が固定された少なくとも1つのキュベット(6)を備えている。
本発明は、サンプル中の微生物の、検出及び/またはインサイチュ(in situ)半定量の処理を提供する。この処理は、以下のステップを含む。
a)超常磁性粒子の懸濁液に、アッセイするサンプルを混合する。この超磁性粒子は、表面に結合して、測定される微生物に対し特異的な抗体を有する。抗体により占有されていない上記粒子の活性表面は、少なくとも1つのブロッキング試薬により占有されている。ブロッキング試薬は、上記懸濁液をサンプルとともに希釈する際に、ブロッキング分子の、抗体により占有されていない上記粒子表面に対する圧力を一定に保つことができるような、pH、イオン強度、及び濃度の条件で、上記表面に吸着される。よって、結合したブロッキング試薬と遊離しているブロッキング試薬との平衡は、常に、結合したブロッキング試薬の方へシフトしている。
b)微生物−磁性粒子複合体の形成に適した条件下で、上記混合物を所定の時間インキュベートする。
c)形成された微生物−磁性粒子複合体の分離及び凝縮、並びに上清除去のために磁界を加える。
d)洗浄された微生物−磁性粒子複合体を、少なくとも1つのタイプの過剰なブロッキング分子と、マーカーラベルされた二次抗体(酵素または蛍光体)とを含むpH緩衝液溶液に再懸濁する。
e)ラベルされた抗体−微生物−磁性粒子複合体を形成するために、所定の時間上記混合物をインキュベートする。
f)形成されたラベルされた抗体−微生物−磁性粒子複合体の分離及び凝縮のために磁界を加える。
g)上記粒子を洗浄し、二次抗体の残余分を取り除き、上清を除去する。
h)形成されたラベルされた抗体−微生物−磁性粒子複合体を、液体媒体に再懸濁する。この液体媒体は、マーカーとして作用する酵素による発色に必要な基質、吸着平衡が結合されたブロッキング試薬分子の方へシフトすることが可能になる濃度のブロッキング試薬、及び上記基質の1つまたはいくつかと競合する内在酵素に特異的な阻害剤を含む。
i)信号を発色するために、上記混合物を所定時間インキュベートする。
j)ラベルされた抗体−微生物−磁性粒子複合体の形成の結果生じる信号を検出し定量する。この信号は、求められる微生物の存在または定量に関連する。
a)1%の濃度で表面にカルボキシル基を有する磁性粒子の懸濁液を準備する。
b)抗体と共有結合できるように、カルボキシル化された磁性粒子の懸濁液を化学処理し、粒子を活性化する。
c)表面に抗体が結合した免疫磁性粒子を得るために、活性化した磁性粒子に抗体を混合する。
d)抗体により占有されていない表面をブロックするために、ステップc)にて得られた免疫磁性粒子を処理する。
e)安定な懸濁液を得るために、ステップd)にて得られた、ブロックされた免疫磁性粒子を処理する。
a)免疫試薬(固定化された抗体を有する粒子)の製造プロセスの最終ステップとして、分析実行用サンプルに対し予見量の懸濁液を添加するに際し、得られる希釈率がブロッキング試薬の最適濃度を維持し得る濃度で、ブロッキング試薬を添加すること。
b)分析の全ステップでブロッキング試薬の最適濃度が維持されるように、分析に伴う全溶液にブロッキング試薬を導入すること。
c)表面へのブロッキング試薬の相互作用は、共有結合である必要がなく、むしろ弱い多点相互作用に基づいており、吸着平衡が支持体との結合へシフトした支持体に対する吸着を確立すること。これは、抗体を有する活性化粒子の「動的な」保護システムであり、これにより、ポリマー合成及び共有結合の導入の必要がなくなる。
1)粒子表面が脱保護されず、これにより非特異的な吸着が最小になる。
2)抗体は、支持体が固定点の周囲を回転運動するに際し、支持体の近傍を運動し得ず、実際の支持体に吸着されており、これにより生物学的活性の欠損がなくなる。
3)粒子の取り扱い、抗体を有する粒子、免疫複合体を有する粒子、及び(測定用の)ラベルされた免疫複合体を有する粒子は、常に定量的であり、ELISA、または従来の磁性粒子で起こったことと違って、組成に関わらず、測定の可変性の影響を排除する。
a)(上記捕捉抗体が共有結合により表面に固定され、ブロッキング試薬が上記抗体により占有されていない表面に非共有結合により結合している)免疫磁性粒子を、同じブロッキング試薬、キレート試薬、界面活性剤、殺菌試薬、及び静菌試薬を含む液体媒体中で懸濁した液を含む、所望の微生物を捕捉するための組成物。上記組成物は、濃度150mMのリン酸ナトリウム緩衝液に相当する高いイオン強度を有している。
b)例えば過酸化水素または蛍光基質といった読取り分子に会合する読取り抗体を、ブロッキング試薬、及び微生物に存在し上記読取り分子に競合する酵素の活性阻害試薬を含有する溶液中に含む、所望の微生物用の標識組成物。上記組成物は、50mMリン酸−クエン酸緩衝液及びpH6.0に相当する中程度のイオン強度を有している。
c)読取り反応の発色に必要な酸化可能な基質を、上記基質の自己酸化を低減するための弱いリン酸二ナトリウムを含有する溶液中に含む所望の微生物の読取り組成物。
d)読取り反応の発色に必要な酸化基質を、pH6.0、濃度50mMのリン酸−クエン酸緩衝液溶液中に含む、所望の微生物の読取り組成物。
e)1Mと5Mとの間の濃度、好ましくは3Mで強酸または強塩基を含む、読取り反応の停止組成物。
f)濃度25mM、pH7.0のリン酸ナトリウム溶液に相当する低いイオン強度で、ブロッキング試薬、界面活性剤、及び静菌試薬を含む、免疫磁性粒子を洗浄するための組成物。
i)所望の微生物(この例ではレジオネラ)の捕捉反応及び標識反応のためのセル、
ii)選択された波長での吸光度、または選択された放出長での蛍光を読み取るためのセル、
iii)光学変換器(レジオネラの場合では分光光度計、または分光蛍光光度計)、
iv)種々の液体を取り扱うための流体回路、
v)分析の逐次制御及び信号の収集のためのマイクロプロセッサ、
vi)データ処理及び上記マイクロプロセッサとの通信処理のためのコンピュータ、
vii)攪拌装置、
viii)磁気保持装置、
ix)温度自動調節装置
を含む集積システムである。
〔実施例1:清浄水サンプル中のレジオネラの検出〕
ポリスチレンからなり、その表面にカルボキシル基を有する超常磁性粒子(平均粒径0.9μm、45.7%磁性顔料−Estapor Merck France)を用いた。抗レジオネラポリクローナル抗体は、これら粒子に固定された。免疫磁性粒子は、1%BSAとともに、25mMリン酸緩衝液(pH7.0)で、緩やかに攪拌して、12時間インキュベートされた。結果物である免疫磁性粒子は、10%BSA、1.0%Tween20、0.01%チメロサール、及び0.1%アジ化ナトリウムを含む150mMリン酸緩衝液溶液中で、1/40の比率で懸濁された。最終的な免疫磁性粒子の懸濁液は、図1に示されかつ上述されたものと類似する、インサイチュ分析用の携帯機器に配置される。
本発明の実施例1により提供されるプロセスに基づき、冷却塔からのサンプル及び排水からのサンプルという、2つのタイプの水サンプルが分析された。各タイプのサンプルに対して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、プレート培養を用いてレジオネラ濃度が測定され、分析は本発明の方法により実行され、550nmでの吸光度の読取りを得た。本発明の方法でアッセイされた各サンプルの容量は、10.0mLであり、サンプルは前処理されていない。
この実施例は、サンプル当たり7レプリカで種々のレジオネラ濃度の清浄水サンプルに対し、上述した自動バイオセンサ設備(図3)を用いることにより得られた結果を提示する。この自動バイオセンサ設備は、抗レジオネラ免疫磁性粒子の使い捨てアリコートの利用に基づいて水中のレジオネラ濃度をオンラインでモニタリングするためのものである。
2つの異なるタイプの免疫粒子表面の挿入について、保護効果の比較が実行された。一方は、デキストラン−アスパラギン酸−アルデヒド(DAA)の共有結合によるものであり、他方は、本発明にて後に記載されている、タンパク、ウシ血清アルブミン(BSA)の非共有結合によるものであり、免疫磁性粒子の微環境において、その濃度は過度に維持され、上記粒子は予め上記ブロッキング試薬でブロックされている。
免疫粒子の2つのアリコート25μLに対し、分離して、上記プロトコールが適用された。両方とも最初にBSAでブロックされたが、一方の場合ではプロトコールの種々のステップで上記緩衝液(1%BSA)を用い、他方の場合ではBSAを用いていない。
図6は、1.1×106cfu/mLを含む懸濁液から磁性粒子で捕捉した大腸菌(Escherichia coli)のカタラーゼ活性の阻害を伴う、反応(比色)の読取り率の依存性を示す。
所望の微生物(この実施例ではレジオネラ)の免疫捕捉プロセス中、捕捉率は、必須に次の2つの要因によって、長時間にわたり減少した。
1)細菌が占有されている(細菌サイズを考えると、立体障害が引き起こされ得る)ので、細菌の結合点が次第に少なくなる。
2)媒体中の遊離レジオネラ濃度が長時間にわたり減少し、それに比例して衝突が少なくなるので、捕捉率が減少する。
レジオネラ ニューモフィラ(Legionella pneumophila)の濃度が異なるサンプルが、本発明により提供された定量プロセスによって分析された。細菌を熱失活したサンプル、及びこのような失活が起こらず細菌細胞が生存したままであるサンプルという、2つのタイプのサンプルが区別された。上記生存は、培養によりチェックされ、対応するカウントを得る。
a)本発明は、ナノ粒子の利用の必要性がなく、むしろマイクロ粒子を伴う技術的創造により感度を増加させ、ナノ粒子の利用により達成される最大感度よりも大きい階級である、感度1cell/mLを実現する。
b)このプロセスは、液体媒体に懸濁され、好ましくは測定対象の微生物に対するポリクローナル抗体が直接的かつ共有結合で固定された超常磁性粒子を得て用いることに基づく。液体媒体の組成物は、細粒の凝集を最小限にすること、非特異的な吸着を最小限にすること、及び分析されたサンプルの干渉を最小限にすることが同時にできる。そして、組成物の濃度は、分析されるサンプルの希釈に対するこれらの影響を維持することができる。
c)これにより、微生物と衝突する粒子の露出表面が常にあり粒子の取り扱いが定量的であることにより抗原−抗体の相互作用の可能性が高く、かつサンプルに存在する他の化学的または生物的要素との相互作用が減少する限り、免疫捕捉に基づく微生物の効率的な回収が可能になる。
d)機械装置を用いることで、半定量値によるインサイチュ測定、及び定量値による実験室での測定の両方を、1時間もかからない時間で実行することができる。自動バイオセンサを得るため、プロセスは自動化され得る。
Claims (16)
- 予め培養した微生物を含まない溶液または懸濁液にて微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うためのプロセスであって、以下の工程:
(a)微生物を含有することが疑われるサンプルを、
(i)少なくとも1つの型の常磁性粒子を含むpH緩衝化懸濁物であって、該常磁性粒子は、測定されるべき微生物に特異的な捕捉抗体がその表面に結合されている、pH緩衝化懸濁物;および
(ii)上記抗体によって占有されていない上記磁性粒子の表面に対する、過剰量の、少なくとも1つの型のブロッキング剤分子
とともに混合する工程;
(b)得られた混合物を所定の時間にわたって、微生物−磁性粒子の複合体を形成するに適切な条件下にてインキュベートする工程;
(c)形成した微生物−磁性粒子の複合体の分離および濃縮のために磁場をかけ、引き続いて上清を回収する工程;
(d)pH緩衝化溶液中にて上記微生物−磁性粒子の複合体を再懸濁する工程であって、該溶液は、過剰量の、少なくとも1つの型のブロッキング分子、およびマーカー(酵素)で標識された読取り抗体を含んでいる、工程;
(e)得られた混合物を所定の時間にわたってインキュベートして、標識された抗体−微生物−磁性粒子の複合体を形成する工程;
(f)形成した上記標識された抗体−微生物−磁性粒子の複合体の分離および濃縮のために磁場をかけ、引き続いて上清を回収する工程;
(g)上記粒子を洗浄して剰余量の読取り抗体を除去し、引き続いて上清を回収する工程;
(h)液体媒体中で、形成した上記標識された抗体−微生物−磁性粒子の複合体を、再懸濁する工程であって、該液体媒体は、
マーカーとして作用する酵素によって発色させるために必要な基質;
結合したブロッキング分子に向けてシフトした吸収平衡を維持し得る濃度でのブロッキング剤;および
1つまたは数個の上記基質と競合する内因性の微生物の酵素に対して特異的であって、50mMの濃度を有するリン酸−クエン酸緩衝液中の0.01%の濃度のアジ化ナトリウムおよびトリアゾールからなる群より選択される阻害剤、ならびに、過酸化水素および過酸化尿素からなる群より選択される前記読取り抗体に結合した酵素に対する基質
を同時に含んでいる、工程;
(i)得られた混合物を所定の時間にわたってインキュベートしてシグナルを発生させる工程;
(j)上記標識された抗体−微生物−磁性粒子の複合体が形成した結果として生じたシグナルを検出および定量し、該シグナルを目的の微生物の存在および定量と関連付ける工程、を含んでおり、
用いられる前記ブロッキング分子は、0.1〜10%濃度のウシ血清アルブミン(BSA)であることを特徴とする、プロセス。 - 前記サンプルが、周囲環境に由来するもの、食品に由来するもの、または生物学的流体から得られたものである、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項1に記載のプロセス。
- 前記微生物が、微小な原核生物、または微小な真核生物である、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記微生物が細菌である、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項3に記載のプロセス。
- 前記微生物が、病原菌の群に属する、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項4に記載のプロセス。
- 目的の微生物を読取りおよび/または捕捉する抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項1〜5のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記磁性粒子が球体であり、その直径が0.5μm〜2μmの範囲内である、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記磁性粒子が化学的に、−NH2基、−COOH基または−OH基で機能化されており、微生物の検出を行うための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロセス。
- 非特異的な吸着を持続的に防止した同一の支持体の上に、多量の同一サンプルを用いるおよび/または同一サンプルを連続的にロードすることによって感度が増加される、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
- 検出感度が1mLあたり1個の細胞である、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のプロセス。
- 1時間以内で結果が得られる、微生物の検出および/または半定量および/または定量を行うための、請求項1〜10のいずれか1項に記載のプロセス。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のプロセスを実行するためのキットであって、
インサイチュでの分析に手動で用いるための再利用可能なポータブル器具、および
該分析を行うための、反応性の媒体または組成物
を備え、
これらの全てが冷却プレートを組み込んだ容器内に配置されており、
前記反応性の媒体または組成物は、
アジ化ナトリウムおよびトリアゾールからなる群より選択される、内因性の微生物の酵素に対して特異的な酵素阻害剤、ならびに、過酸化水素および過酸化尿素からなる群より選択される前記読取り抗体に結合した酵素に対する基質を含んでおり、
前記反応性の媒体または組成物が、
(a)液体培地中に免疫磁性粒子の懸濁液を含んでいる、目的の微生物を捕捉するための組成物であって、
該免疫磁性粒子が、その表面上に共有結合によって捕捉抗体を固定化しており、該抗体によって占められていない表面に非共有結合によって結合したブロッキング剤を有しており、
該液体培地が、(i)該ブロッキング剤と同一のもの、(ii)キレート剤、(iii)界面活性剤、(iv)殺生剤、および(v)静菌剤、を溶液中に含んでおり、かつ、90mM〜500mMの間の濃度を有するリン酸緩衝化溶液に相当する高いイオン強度を有している、組成物;
(b)マーカーとして作用する酵素と複合体化した読取り抗体を含んでいる、目的の微生物に対する標識組成物であって、
(i)ブロッキング剤、(ii)前記読取り抗体に結合した酵素において競合し得る、微生物中に存在する酵素の活性の阻害剤、を溶液中に含んでおり、かつ、30mM〜90mMの間の濃度を有するリン酸緩衝化溶液に相当する中程度のイオン強度を有している、組成物;
(c)読取り反応の発色に必要な酸化可能な基質を、リン酸二ナトリウムの弱塩を含む溶液中に含んでいる、目的の微生物に対する読取り組成物であって、該基質の自己酸化を低減させるための、組成物;
(d)読取り反応の発色に必要な酸化基質をリン酸−クエン酸緩衝化溶液中に含んでいる、目的の微生物に対する読取り組成物;
(e)強酸または強塩基を含んでいる、該読取り反応を停止させる停止組成物;
(f)ブロッキング剤、界面活性剤および静菌剤を含んでいる、免疫磁性粒子を洗浄するための組成物であって、5mM〜30mMの間の濃度を有するリン酸緩衝化溶液に相当する低度のイオン強度を有している、組成物
であり、
前記ブロッキング分子は、ウシ血清アルブミン(BSA)であることを特徴とする、キット。 - 前記器具が、
少なくとも2つのキュベット、および磁石を有する支持体、ならびに
結果の解釈を補正するためのカラーチャート
を備えている、請求項12に記載のキット。 - 前記(a)のイオン強度が、100mM〜200mMの間の濃度を有するリン酸ナトリウム緩衝液に相当し、
前記(b)のイオン強度が、50mMかつpH6.0のリン酸−クエン酸緩衝液に相当し、
前記(d)のリン酸−クエン酸緩衝液が、pH6.0および50mMの濃度を有し、
前記(e)の強酸または強塩基の濃度が、1M〜5Mの間であり、
前記(f)のイオン強度が、pH7.0かつ20mM〜30mMの濃度のリン酸ナトリウム緩衝液に相当する、請求項13に記載のキット。 - 請求項12〜14のいずれか1項に記載のキットであって、
競合的な微生物の酵素に対する前記阻害剤が、アジ化ナトリウムおよびトリアゾールより選択され、かつ、前記読取り抗体に結合した酵素に対する基質が、過酸化水素および過酸化尿素より選択され、
前記酸化可能な基質が、オルソ−フェニレンジアミン、2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾアソリン−6−スルホン酸)、および5−アミノサリチル酸より選択され、
前記強酸が、塩酸、硝酸および硫酸より選択され、
前記強塩基が、水酸化カリウムおよび水酸化ナトリウムより選択され、
前記弱塩が、リン酸二カリウムまたはリン酸二ナトリウムであり、
前記キレート剤が、2,2’−ビピリジル,ジメルカプトプロパノール,エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレンジオキシ−ジエチレン−ジニトリロ−四酢酸、エチレン−グリコール−ビス−(2−アミノエチル)−N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、オルソ−フェナントロリン、サリチル酸およびトリエタノールアミン(TEA)より選択され、
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤が、ポリエトキシル化されたアルキルフェノール、ポリエトキシル化された脂肪アルコール、ポリエトキシル化された脂肪酸、アルカノールアミン、または縮合物、およびソルビタンモノラウレート(Tween 20)からなる群より選択され、
前記静菌剤が、p−ニトロフェニル−ジ−クロロアセトアミドプロパンジオール(クロラムフェニコール)、スルファニルアミド、2,4−ジアミノ−5−(3,4,5−トリメトキシベンジル)ピリミジン(トリメトプリム)、および2-(エチルメルクリオメルカプト)安息香酸のナトリウム塩(チメロサール)より選択され、
前記殺生剤が、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、およびアジ化ナトリウムより選択される、キット。 - 請求項12〜15のいずれか1項に記載のキットであって、
(a)目的の微生物を捕捉するための組成物において、懸濁液中にて、前記免疫磁性粒子が、球体であり、0.8μm〜1.1μmの平均直径を有しており、前記捕捉抗体が、該粒子の表面に共有結合しているモノクローナルまたはポリクローナルの抗レジオネラ抗体であり、前記ブロッキング剤が、10%濃度のウシ血清アルブミン(BSA)であり、前記キレート剤が0.1%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)であり、前記界面活性剤が1%ソルビタンモノラウレートであり、前記殺生剤が0.1%濃度のアジ化ナトリウムであり、前記静菌剤が0.01%濃度のチメロサールであり、これらの全てが、150mMの濃度のリン酸緩衝化溶液(pH7.0)中に存在し、該組成物が1/10の割合でサンプル中に混合され、
(b)前記読取り抗体が、ペルオキシダーゼ複合体化抗レジオネラ抗体である、目的の微生物に対する標識組成物において、(i)前記ブロッキング剤が0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)であり、(ii)前記読取り抗体に結合した酵素において競合し得る、微生物中に存在する酵素の活性の阻害剤が、50mMの濃度のリン酸−クエン酸溶液(pH6.0)中の0.01%トリアゾールであり、該標識組成物がこれらを含んでいる溶液であり、
(c)目的の微生物に対する読取り組成物において、読取り反応の発色に必要な酸化可能な基質が、0.1% 5−アミノサリチル酸、および前記弱塩が該基質の自己酸化を低減させるための0.1Mの濃度のリン酸二ナトリウム(pHが7.5〜8.0の間)であり、
(d)目的の微生物に対する読取り組成物において、読取り反応の発色に必要な酸化基質が、50mMの濃度のリン酸−クレン酸緩衝化溶液(pH6.0)中の、過酸化水素または過酸化尿素であり、
(e)該読取り反応を停止する停止組成物において、前記強酸が5M塩酸または1M硫酸であり、前記強塩基が3M水酸化ナトリウムであり、
(f)前記免疫磁性粒子を洗浄するための組成物において、前記ブロッキング剤が0.1%ウシ血清アルブミンであり、前記界面活性剤が25mMの濃度のリン酸緩衝化溶液(pH7.0)中での0.01%チメロサールである、キット。
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