CN112326958A - 一种微球封闭的方法及其微球标记的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微球封闭的方法及其微球标记的方法。具体为将封闭液加入到微球中恒温振荡，得到封闭后的微球；清洗封闭后的微球，再加入悬浮液即可；所述封闭液包括第一封闭液和第二封闭液，其中第一封闭液为大分子物质，第二封闭液为小分子物质，悬浮液为表面活性剂。封闭后的微球的线性范围更宽，特异性更好，相关性更优、稳定性更好，进一步达到检测样本时降低非特异性结合及减少假阳信号的效果。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，尤其涉及一种微球封闭的方法及其微球标记的方法。
背景技术
免疫学检测技术的特点是应用抗原-抗体免疫学反应，通过抗原与抗体间的特异性结合，来实现对待测物质定性或定量的检测。有些方法需要使用固相载体来连接某种特定分子，与待测抗原特异性结合。而抗原抗体均会存在不同程度的非特异性结合，有些通过抗干扰试剂处理来解决，但是有很多需要对标记抗体的标记后处理来解决。其中导致非特异性结合的一个原因为微球的标记中的封闭过程中，有部分位点未封闭，导致存在非特异性结合，大部分文献及专利文献描述的微球标记方法中，大多是使用牛血清白蛋白、脱脂奶粉或酪蛋白等进行封闭，来减少反应时的非特异性反应。而这些物质作为封闭剂均有可能导致封闭不完全，无法达到更好的封闭效果。且封闭后由于蛋白之间和蛋白存放在液相中与液体的相互作用，将会对稳定性起到一定的改善作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微球封闭方法，封闭后的微球的线性范围更宽，特异性更好，相关性更优、稳定性更好，进一步达到检测样本时降低非特异性结合及减少假阳信号的效果。
为实现上述目的，本发明提供一种微球封闭的方法，其特征在于，将封闭液加入到微球中恒温振荡，得到封闭后的微球；封闭后的微球清洗，再加入悬浮液即可；所述封闭液包括第一封闭液和第二封闭液，
其中第一封闭液为大分子物质；优选的，第一封闭液为1-20％牛血清白蛋白和1-10％酪蛋白钠中的至少一种；
第二封闭液为小分子物质；优选的，第二封闭液为10-100mM/L Tris和0.1％-10％乙醇胺中的至少一种；
悬浮液包含表面活性剂；优选的，悬浮液包含0.1-5％的triton X-100，triton X-405,TW-20，TW-80，Tetronic 1307 M，SILWET L7600 N 13-17 4000、OHODASURF ON-870中的至少一种。
进一步，所述微球为偶联后的微球。
进一步，所述第一封闭液和第二封闭液同时加入。
进一步，所述第一封闭液和第二封闭液，以(1-3)：(1-3)的体积比混合后作为封闭液同时加入，再按微球体积的1-20％作为封闭液的加入量加入。
进一步，所述恒温振荡的恒温为32-40℃；振荡的时间为30min-60min；优选的，所述恒温振荡的恒温为37℃；振荡的时间为30min。
进一步，所述将封闭液加入到微球中恒温振荡为，将第一封闭液加入到微球中恒温摇床中振荡，再加入第二封闭液恒温摇床中继续振荡，得到封闭后的微球；
具体的，所述第一封闭液按微球体积的1-20％的加入量加入到微球中，恒温摇床中振荡，振荡15-30min后，第二封闭液按微球体积的1-10％的加入量加入到微球中，恒温摇床中继续振荡震荡15-30min，得到封闭后的微球。
进一步，所述清洗为用超纯水或PBS清洗微球；优选的，为往微球中加入超纯水或PBS，超声后14000rpm下离心15min后弃上清。
进一步，所述超纯水或PBS与微球的体积比例为1：1；离心为14000rpm下离心15min。
本发明还提供一种微球标记的方法，其特征在于，采用所述的微球封闭方法。
进一步，清洗微球后采用活化剂活化微球，然后再清洗微球，加入要偶联到微球上的蛋白进行微球偶联得到偶联后的微球，再采用所述的微球封闭方法即可；
优选的，步骤为，
微球清洗：用超纯水或PBS清洗微球；优选的，加入超纯水或PBS，超纯水或PBS与微球的体积比例为1：1，超声后在14000rpm下离心15min，弃上清，重复该步骤1-3次；
微球活化：取清洗后的微球加入50mmol MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS后混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
微球清洗：活化后的微球用微球清洗步骤相同的方法清洗，去除微球多余的活化剂；
微球偶联：再加入Hepes缓冲液和要偶联到微球上的蛋白，使微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
微球封闭：按照所述的方法。
本发明的技术方案是用大分子与小分子以一定比例共同封闭处理，来减少样本中带来的非特异性结合；通过对微球的封闭处理，大分子物质结合到微球剩余位点上，小分子物质的补充对一些遗漏的位点进行结合，进一步加强了封闭的完整性。与传统的封闭方法相比，降低了非特异性结合的情况，减少了假阳信号。
本发明微球封闭的方法，有效的降低了由于非特异性结合带来的线性差，假阳率高，本底高，全血测试影响大等问题，对试剂的信号值、特异性、灵敏度、线性、稳定性有较大提升作用。对某一项目抗体标记微球，通过实验可得知，仅使用单一物质封闭相比多种物质混合封闭所标记得到的微球配制到工作液中，测试得到数据特异性较差，线性较差，假阳率较高，本底较高，稳定性较差；而混合封闭后微球所表现出的性能均比单一物质封闭更优，如线性范围更宽，特异性更好，相关性更优、对稳定性有明显改善。
本发明微球封闭的方法，无复杂操作，且效果明显，对目前抗原抗体特异性结合应用上有较大的帮助。当封闭过程中，封闭剂与微球上未与抗体结合的位点进行了共价键或物理吸附形式的结合，但由于大分子容易因为空间位阻效应而影响了分子活性和结合效率，小分子物质如乙醇胺、Tris等可继续封闭，减少了微球上第一封闭液中大分子未封闭的空白位点，进一步降低后续非特异性结合的可能性。
本发明微球封闭的方法，封闭后悬浮液中含有表面活性剂，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。且对封闭后的微球起到疏水的作用，与封闭物质存在与偶联蛋白竞争结合的关系，保护了封闭的封闭物质不易掉落，进一步加强了封闭的完整性和微球的稳定性。
本发明微球封闭的方法，封闭时长控制在30min-60min之间，封闭的效果最优，封闭时间少会导致封闭不完全，本底值仍较高，特异性较差；封闭时间长会导致封闭物质对偶联微球的蛋白有一定影响，整体信号值较低。
本发明微球封闭的方法，提高了微球的使用率，对试剂性能提升有很大帮助。
附图说明
图1实施例1制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图2对比例1制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图3对比例1制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图4实施例2制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图5实施例3制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图6对比例2制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图7对比例3制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图8实施例4制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图9实施例5制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图10实施例6制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图11对比例7制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图12对比例6制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图13实施例7制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图14实施例8制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图15实施例9制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图16对比例7制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图17对比例8制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
图18对比例9制备得到的微球检测Lp-PLA2校准品后的信号值的线性情况结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例1中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为10％BSA，第二封闭液为50mM/L Tris，悬浮液为含0.5％Triton X-100的0.05M/LTris缓冲液，PH＝8.0；
1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，其包含0.5％Triton X-100，完成对微球的标记。
为评估本发明的效果，本实施例1用于基于均相化学发光平台的光激化学发光方法学，提供了一种均相免疫分析POCT检测方法，包括一下步骤：
1.将待测样品与试剂混合均匀，温育；
2.对步骤1中混合物进行激光照射，同时测量混合物发出的光强度；
3.根据光强度，换算出待测样品的浓度；
对比例1：
采用BSA封闭，其中封闭过程中加入10％BSA，按微球体积的10％作为加入量，在37℃温育摇床振荡30min，完成封闭，悬浮微球，悬浮液含有0.5％Triton X-100，得到标记后的复合物。
为评估对比例1的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
对比例2：
采用第一封闭液和第二封闭液封闭，第一封闭液为10％BSA，第二封闭液为50mM/LTris，在偶联后的微球中加入封闭液。先加入第一封闭液，第一封闭液按微球体积的10％加入到微球中，37℃恒温摇床中振荡10min后，加入第二封闭液，第二封闭液配按微球体积的10％加入到微球中，37℃恒温摇床中继续振荡震荡10min，得到封闭后的微球，完成封闭，悬浮微球，悬浮液含有0.5％Triton X-100，得到标记后的复合物。
为评估对比例2的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
以Lp-PLA2校准品进行检测，结果见表1，根据表1的数值结果绘制图1-3的线性情况。从图1-3可以看出，Lp-PLA2浓度为0-1000ng/ml范围内时，该实施例1的线性接近直线，同时各值均在直线上；而对比例1-2相比较而言，更偏向于曲线，同时大多点值均偏离线性，位于线性外。
表1实施例1和对比例1-2的的Lp-PLA2校准曲线数据结果表
表2为参考品为0ng/ml(即没有参考品)的情况下，用实施例1和对比例1-2所得的微球来测定信号值的结果表。
表2无参考品时实施例1和对比例1-2的检测结果表
为了检测实施例1及对比例1-2所得微球的稳定性，进行不同处理，制备好微球后，37℃放置不同时间后测定，其结果见表3-5。
表3实施例1稳定性数据结果表
表4对比例1稳定性数据结果表
表5对比例2稳定性数据结果表
从表2可以看出，实施例1与对比例1相比，在第一封闭液和第二封闭液对微球封闭处理加上表面活性剂作为悬浮液后，0值参考品测得的检测信号均比对比例1降低了50％左右，换算的空白限为0.69ng/ml，低于线性下限，比对比例1更接近0值；实施例1的相关性更优，线性范围更宽，消除了许多抗原抗体非特异性结合带来的干扰；实施例1与对比例2相比：对比文件2的封闭时间短，封闭时间短对相关性、背景值、稳定性均有一定影响，由于封闭方法与实施例1的方法相同，对比例2的结果比对比例1效果更好。
从表3-5可以看出，实施例1中0-14天的数据，3天后几个时间点信号值的偏差小于10％，稳定的时间点在第三天左右，对比例1的0-14天的数据，每个时间点之间的偏差在10％以上，稳定的时间点在第七天之后，对比例2的0-14天的数据，每个时间点之间的偏差在10％以上，稳定的时间点在第7天之后，实施例1中封闭液与表面活性剂的加入对稳定性有较大的改善。
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1作为代表说明本发明申请优异之处。
实施例2
本实施例2中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为1％BSA，第二封闭液为10mM/L Tris，悬浮液为含0.5％Triton X-100的0.05M/LTris缓冲液，PH＝8.0；1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，其包含0.5％Triton X-100，完成对微球的标记。
为评估实施例2的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
实施例3
本实施例3中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为20％BSA，第二封闭液为10mM/L Tris，悬浮液为含0.5％Triton X-100的0.05M/LTris缓冲液，PH＝8.0；
1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，悬浮液含有0.5％Triton X-100，完成对微球的标记。
为评估对比例1的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
对比例3：
采用BSA封闭，封闭过程中加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为0.5％BSA，第二封闭液为5mM/L Tris，悬浮液含有0.5％Triton X-100。
为评估对比例3的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
对比例4：
采用BSA封闭，封闭过程中加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为30％BSA，第二封闭液为200mM/L Tris，悬浮液含有0.5％Triton X-100。
为评估对比例4的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
以Lp-PLA2校准品进行检测，结果见表6，根据表6的数值结果绘制图4-7的线性情况。从图4-7可以看出，Lp-PLA2浓度为0-1000ng/ml范围内时，该实施例2-3的线性接近直线，同时各值均在线性上；而对比例3-4相比较而言，更偏向于曲线，同时大多点值均偏离线性，位于线性外。说明所述第一封闭液1％-20％牛血清白蛋白的范围值内对于本发明而言是有效的，超过此范围会影响试剂的线性和背景值等其他性能。
表6实施例2-3和对比例3-4的Lp-PLA2校准曲线数据结果表
| 浓度 | 实施例2信号值 | 实施例3信号值 | 对比例3信号值 | 对比例4信号值 |
| 1000 | 1343180 | 1541140 | 1357291 | 1391921 |
| 800 | 1106376 | 1053093 | 1328711 | 1286099 |
| 600 | 819871 | 904526 | 713556 | 770149 |
| 300 | 446980 | 407329 | 470981 | 462100 |
| 175 | 261797 | 250194 | 317887 | 341273 |
| 130 | 168959 | 193208 | 147947 | 173408 |
| 80 | 118014 | 101471 | 149459 | 132383 |
| 56 | 65069 | 58110 | 59096 | 55066 |
| 30 | 30423 | 28710 | 25027 | 23070 |
| 10 | 9268 | 9069 | 8362 | 9560 |
| 0 | 2058 | 2142 | 4097 | 4230 |
实施例4
本实施例4中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为1％酪蛋白钠，第二封闭液为0.1％乙醇胺，悬浮液含有0.5％Triton X-100；
1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，其包含0.5％Triton X-405，完成对微球的标记。
为评估实施例4的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
实施例5
本实施例5中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为5％酪蛋白钠，第二封闭液为5％乙醇胺，悬浮液含有0.5％Triton X-100；
1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，其包含0.5％Triton X-405，完成对微球的标记。
为评估实施例5的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
实施例6
本实施例6中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为10％酪蛋白钠，第二封闭液为10％乙醇胺，悬浮液含有0.5％Triton X-100；
1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，其包含0.5％Triton X-405，完成对微球的标记。
为评估实施例6的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
对比例5：
采用BSA封闭，封闭过程中加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为15％酪蛋白钠，第二封闭液为15％乙醇胺，悬浮液含有0.5％Triton X-100。
为评估实施例6的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
对比例6：
采用BSA封闭，封闭过程中加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为0.5％酪蛋白钠，第二封闭液为0.05％乙醇胺，悬浮液含有0.5％Triton X-100。
为评估实施例6的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
以Lp-PLA2校准品进行检测，结果见表7，根据表7的数值结果绘制图8-11的线性情况。从图8-11可以看出，Lp-PLA2浓度为0-1000ng/ml范围内时，该实施例4-6的线性接近直线，同时各值均在线性上；而对比例5-6相比较而言，更偏向于曲线，同时大多点值均偏离线性，位于线性外。该实施例4-6与对比例5-6通过对比验证了所述第一封闭液1％-10％酪蛋白钠，0.1％-10％乙醇胺的范围值内对于本发明而言是有效的，超过此范围则会影响试剂的线性和背景值等其他性能。
表7实施例4-6和对比例5-6的Lp-PLA2校准曲线数据数据表
| 浓度 | 实施例4信号值 | 实施例5信号值 | 实施例6信号值 | 对比例5信号值 | 对比例6信号值 |
| 1000 | 1397413 | 1276709 | 1355144 | 1390330 | 1335166 |
| 800 | 1220303 | 1062628 | 1085850 | 1331470 | 1325676 |
| 600 | 886993 | 805875 | 857082 | 743438 | 688039 |
| 300 | 456168 | 414045 | 420484 | 512363 | 522635 |
| 175 | 245550 | 256528 | 238713 | 291540 | 353387 |
| 130 | 176340 | 194447 | 170799 | 161105 | 161779 |
| 80 | 100636 | 120529 | 112810 | 152948 | 137023 |
| 56 | 63854 | 55774 | 62535 | 64793 | 59900 |
| 30 | 29956 | 27572 | 31171 | 24884 | 23881 |
| 10 | 9280 | 9031 | 9111 | 9679 | 8478 |
| 0 | 2108 | 2253 | 2360 | 4004 | 4478 |
实施例7
本实施例7中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为1％酪蛋白钠，第二封闭液为1％乙醇胺，悬浮液含有1％Triton X-100；
1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，其包含0.5％Triton X-405，完成对微球的标记。
为评估实施例7的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
实施例8
本实施例8中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为1％酪蛋白钠，第二封闭液为1％乙醇胺，悬浮液含有0.1％Triton X-100；
1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，其包含0.5％Triton X-405，完成对微球的标记。
为评估实施例8的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
实施例9
本实施例9中的封闭步骤为在偶联后的微球加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为1％酪蛋白钠，第二封闭液为1％乙醇胺，悬浮液含有5％Triton X-100；
1.微球清洗：用超纯水/PBS清洗微球，超纯水/PBS与微球比例为1：1，超声，在14000rpm下离心15min，吸去上清。同前述操作依次清洗3次；
2.微球活化：取清洗后的微球加入50mmol/L MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS，混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
3.微球清洗：活化后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的活化剂；
4.微球偶联：活化清洗后的微球加入0.05mol/L Hepes缓冲液，加入要偶联到微球上的蛋白，微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
5.微球封闭：在偶联后的微球加入封闭液，封闭液成分第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中振荡，振荡30min后，第二封闭液配按微球体积的10％作为封闭剂的加入量加入到微球中，在37℃恒温摇床中继续振荡震荡30min，得到封闭后的微球；
6.微球清洗：封闭后的微球用第一步骤相同的方法清洗，目的是为了去除微球多余的封闭剂，清洗后得到标记好的微球。
7.微球悬浮：封闭后的微球加入一种悬浮液，其包含0.5％Triton X-405，完成对微球的标记。
为评估实施例9的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
Lp-PLA2校准品浓度梯度：0，10，30,56,80,130,175,300,600,800,1000ng/ml。校准品溶液配方：50mM Tris-BSA—NaCl-Proclin 300；校准品加入量：20ul。
对比例7：
封闭过程中加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为1％酪蛋白钠，第二封闭液为1％乙醇胺，悬浮液含有10％Triton X-100。
为评估实对比例7的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
对比例8：
采用BSA封闭，封闭过程中加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为1％酪蛋白钠，第二封闭液为1％乙醇胺，悬浮液含有0.05％Triton X-100。
为评估实对比例8的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
对比例9：
封闭过程中加入第一封闭液和第二封闭液，第一封闭液为1％酪蛋白钠，第二封闭液为1％乙醇胺，悬浮液不含有Triton X-100。
为评估实对比例7的效果，采用同上所述的均相免疫分析POCT检测方法。
以Lp-PLA2校准品进行检测，结果见表8，根据表8的数值结果绘制图13-16的线性情况。从图13-16可以看出，Lp-PLA2浓度为0-1000ng/ml范围内时，该实施例7-9的线性接近直线，同时各值均在线性上；而对比例7-9相比较而言，更偏向于曲线，同时大多点值均偏离线性，位于线性外。该实施例7-9与对比例7-9通过对比验证了所述悬浮液0.1％-10％Triton X-100的范围值内对于本发明而言是有效的，超过此范围则会影响试剂的线性和背景值等其他性能。
表8 Lp-PLA2校准曲线数据表
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种微球封闭的方法，其特征在于，将封闭液加入到微球中恒温振荡，得到封闭后的微球；封闭后的微球清洗，再加入悬浮液即可；所述封闭液包括第一封闭液和第二封闭液，
其中第一封闭液为大分子物质；优选的，第一封闭液为1-20％牛血清白蛋白和1-10％酪蛋白钠中的至少一种；
第二封闭液为小分子物质；优选的，第二封闭液为10-100mM/L Tris和0.1％-10％乙醇胺中的至少一种；
悬浮液包含表面活性剂；优选的，悬浮液包含0.1-5％的triton X-100，triton X-405,TW-20，TW-80，Tetronic 1307M，SILWET L7600 N 13-17 4000、OHODASURF ON-870中的至少一种。
2.如权利要求1所述微球封闭的方法，其特征在于，所述微球为偶联后的微球。
3.如权利要求1所述微球封闭的方法，其特征在于，所述第一封闭液和第二封闭液同时加入。
4.如权利要求3所述微球封闭的方法，其特征在于，所述第一封闭液和第二封闭液，以(1-3)：(1-3)的体积比混合后作为封闭液同时加入，再按微球体积的1-20％作为封闭液的加入量加入。
5.如权利要求1或3所述微球封闭的方法，其特征在于，所述恒温振荡的恒温为32-40℃；振荡的时间为30min-60min；优选的，所述恒温振荡的恒温为37℃；振荡的时间为30min。
6.如权利要求1所述微球封闭的方法，其特征在于，所述将封闭液加入到微球中恒温振荡为，将第一封闭液加入到微球中恒温摇床中振荡，再加入第二封闭液恒温摇床中继续振荡，得到封闭后的微球；
具体的，所述第一封闭液按微球体积的1-20％的加入量加入到微球中，恒温摇床中振荡，振荡15-30min后，第二封闭液按微球体积的1-10％的加入量加入到微球中，恒温摇床中继续振荡震荡15-30min，得到封闭后的微球。
7.如权利要求1所述微球封闭的方法，其特征在于，所述清洗为用超纯水或PBS清洗微球；优选的，为往微球中加入超纯水或PBS，超声后14000rpm下离心15min后弃上清。
8.如权利要求7所述微球封闭的方法，其特征在于，所述超纯水或PBS与微球的体积比例为1：1；离心为14000rpm下离心15min。
9.一种微球标记的方法，其特征在于，采用权利要求1-10任一所述的微球封闭方法。
10.如权利要求9所述微球标记的方法，其特征在于，清洗微球后采用活化剂活化微球，然后再清洗微球，加入要偶联到微球上的蛋白进行微球偶联得到偶联后的微球，再采用权利要求1-10任一所述的微球封闭方法即可；
优选的，步骤为，
微球清洗：用超纯水或PBS清洗微球；优选的，加入超纯水或PBS，超纯水或PBS与微球的体积比例为1：1，超声后在14000rpm下离心15min，弃上清，重复该步骤1-3次；
微球活化：取清洗后的微球加入50mmol MES缓冲液，加入10mg/ml的EDC和NHS后混匀，超声，在37℃恒温摇床中振荡30min，得到活化后的微球；
微球清洗：活化后的微球用微球清洗步骤相同的方法清洗，去除微球多余的活化剂；
微球偶联：再加入Hepes缓冲液和要偶联到微球上的蛋白，使微球与蛋白的质量比为20：1，在恒温摇床中振荡4h；
微球封闭：按照权利要求1-8任一所述的方法。
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