CN105044330A - 一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液及其应用，属于医学检测技术领域。该封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为氨基酸溶液，试剂B为3-琉基丙酸溶液。该封闭液用于免疫荧光层析检测系统中的抗体微球的封闭。具体应用过程为：将荧光微球进行预处理，然后与抗体交联得到抗体微球，抗体微球再使用封闭液封闭，最后用缓冲液保存。本发明封闭液中两种试剂反应后得到的离子型氨基酸单层分布在免疫荧光层析检测系统中的抗体微球表面，能减少血清蛋白的非特异性吸附作用，减少血清的基底效应，从而减少体外检测中生物样本假阳性的发生，提高检测的准确度，而且，检测灵敏度高，检测线性宽，稳定性强。

Description

一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液及其应用
技术领域
本发明涉及一种封闭液及其应用，尤其涉及一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液及其应用，属于医学检测技术领域。
背景技术
免疫荧光层析检测系统是：聚苯乙烯荧光微球与抗体交联得到的抗体微球，与生物样本(血清、血浆、全血)混合，混合液跑包被了抗体的试纸条，通过抗原抗体免疫反应来定量样本中的标记物的含量。但是，生物样本中的某些蛋白会非特异性吸附在微球或抗体表面，使检测结果产生假阳性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种能减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液，包括试剂A和试剂B，试剂A为氨基酸溶液，试剂B为3-琉基丙酸溶液。
在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液中，试剂A和试剂B使用时的浓度比为1：(0.5-1.5)。
带有极性或具有短侧链的离子型氨基酸单层分布在免疫荧光层析检测系统中的抗体微球表面，能减少血清蛋白的非特异性吸附作用，减少血清的基底效应。从而减少体外检测中生物样本假阳性的发生，提高检测的准确度。
因此，本发明免疫荧光层析检测系统中荧光微球在交联上抗体得到抗体微球后，用本发明包含试剂A和试剂B的封闭液进行封闭处理，一方面可以封闭微球上未交联上抗体的结合位点，另一方面可以形成N-3-巯基丙基-氨基酸极性氨基酸单层，排布在微球表面，形成一个表面浓度大约1015个分子/cm2的球体，可以有效的减少样本中蛋白分子的非特异性吸附，减少血清的基底效应。从而减少体外检测中生物样本假阳性的发生，提高检测的准确度。
但是，本发明封闭液使用前试剂A和试剂B需要分开储存，使用时再与抗体微球混匀，否则，会由于反应产生副产物而导致封闭不能有效进行。
本发明中，氨基酸与3-琉基丙酸的反应式如下：
在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液中，氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸中的一种。根据反应机理，氨基酸与3-巯基丙酸反应生成的短侧链单层结构，需要参与反应的氨基酸有以下几个特点：1、氨基酸R基不能过于繁琐，尽量简单，这样的氨基酸在反应时空间位阻会比较小；2、氨基酸所带的氨基(-NH2)数量多，便于与3-巯基丙酸的羧基(-COOH)反应，形成的膜结构会更稳定；3、氨基酸的等电点处于中性偏碱，这样的氨基酸在缓冲液中所带的电性更有利于极性短侧链氨基酸膜的形成。因此，本发明进一步优选为赖氨酸。
本发明的另一个目的在于提供上述一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用，封闭液用于免疫荧光层析检测系统中的抗体微球的封闭。
在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，具体应用过程为：将荧光微球进行预处理，然后与抗体交联得到抗体微球，抗体微球再使用封闭液封闭，最后用缓冲液保存。
在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，荧光微球由粒径为450-600nm的荧光微球Ⅰ和粒径为100-300nm的荧光微球Ⅱ组成，粒径为450-600nm的荧光微球Ⅰ和粒径为100-300nm的荧光微球Ⅱ的质量比为1：(0.5-1.5)。本发明荧光微球的选择对免疫荧光层析检测系统的检测性能的影响重大。因为，粒径小的荧光微球内包含的荧光物质少，同摩尔浓度下荧光信号少，但是它的线性范围宽，比例好；而粒径大的荧光微球每个微球中包含的荧光物质多，能显著提升试剂盒的灵敏度，在抗原含量少的项目中，这一特性必不可少。因此，本发明中选取的荧光微球是大小不同的粒径的荧光微球组成的混合微球，混匀后，再进行交联。从而可以提高检测的灵敏度，同时也可以拉宽检测线性。
作为优选，预处理包括清洗和活化。由于荧光微球为一种悬浊液，需要先进行清洗去除杂质。
作为优选，封闭后还需要进行清洗。抗体微球使用封闭液封闭后，进行清洗，可以获得更好的检测效果。清洗液的成分为以5-20mM的PBS为母液，添加0.03-0.1wt％的TW20配制得到，清洗液的pH为7-8。
在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，缓冲液的成分为：Tris：20-100mM，酪蛋白：0.5-2wt％，BSA：0.3-1wt％，表面活性剂：0.3-1wt％，金属螯合剂：3-20mM，PEG：0.5-5wt％，NaN3：0.05-0.3wt％。本发明缓冲液是以20-100mM的Tris为母液，向其中添加酪蛋白，BSA，表面活性剂，金属螯合剂，PEG和NaN3配制而成。
在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，缓冲液的pH为8-10。
在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，表面活性剂为TritonX-100、TW20、BRIJ35、Tetronic1307、BIO-TERGEAS-40中的一种。
在上述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用中，金属螯合剂为EDTA-Na、DEG、HEDTA中的一种。
封闭清洗后用本发明缓冲液保存抗体微球，本发明缓冲液pH高，抗体微球处于此环境中会带负电荷，有利于封闭的稳定性。其次，若长期保存后抗体微球上未与抗体结合的位点又暴露出来，本发明缓冲溶液中的酪蛋白和BSA能及时覆盖住这些位点，保证了交联微球的特性。
与现有技术相比，本发明具有以下几个优点：
1.本发明封闭液中两种试剂反应后得到的离子型氨基酸单层分布在免疫荧光层析检测系统中的抗体微球表面，能减少血清蛋白的非特异性吸附作用，减少血清的基底效应，从而减少体外检测中生物样本假阳性的发生，提高检测的准确度。
2.本发明免疫荧光层析检测系统的检测灵敏度高，检测线性宽。
3.本发明免疫荧光层析检测系统的稳定性强。
附图说明
图1为应用实施例1和应用对比例1两种封闭方法交联荧光微球的校准曲线；
图2为应用实施例1和梅里埃VIDAS测血清PCT浓度的相关性曲线。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
本实施例封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为赖基酸，试剂B为3-琉基丙酸，分开储存，使用时，将试剂A和试剂B与抗体微球混合。其中，试剂A和试剂B的浓度比为1:1。
实施例2：
本实施例封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为甘氨酸，试剂B为3-琉基丙酸，分开储存，使用时，将试剂A和试剂B与抗体微球混合。其中，试剂A和试剂B的浓度比为1:1。
实施例3：
本实施例封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为谷氨酸，试剂B为3-琉基丙酸，分开储存，使用时，将试剂A和试剂B与抗体微球混合。其中，试剂A和试剂B的浓度比为1:1。
实施例4：
本实施例封闭液包括试剂A和试剂B，试剂A为精氨酸，试剂B为3-琉基丙酸，分开储存，使用时，将试剂A和试剂B与抗体微球混合。其中，试剂A和试剂B的浓度比为1:1。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的实施方案及其替换方案中，试剂A和试剂B的浓度比还可以为1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5。
将本发明的能减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液用于免疫荧光层析检测系统中的抗体微球的封闭。
应用实施例1：
以免疫荧光层析检测系统中的PCT免疫荧光层析快速诊断试剂项目和本发明实施例1中的封闭液为例：
取3mg荧光微球，荧光微球由500nm的荧光微球Ⅰ和200nm的荧光微球Ⅱ按质量比为1:1混合而成，先将荧光微球在11℃、15000r离心10min，然后加1mL浓度为10mM的MES在15000r离心20min。再用1mL浓度为10mM的MES溶荧光微球，超声处理2min后15000r离心25min，重复用1mL浓度为10mM的MES溶荧光微球，超声处理2min后15000r离心25min，取出清洗后的荧光微球。
将上述取出的荧光微球进行活化处理，先加入276μL的MES，超声处理6min，然后加入30uL浓度为50mg/mLEDC和30uL浓度为50mg/mL的NHS，混合均匀，在室温下振荡30min。
将上述活化处理后的荧光微球先在15000r离心60min，再用1mL的pH为7.4的PBS清洗，清洗条件为15000r离心40min。再用500μL的pH为7.4的PBS超声处理6min。然后再加入500ug的PCTIgG(IgG用pH为7.4的PBS溶解)混合均匀，使溶液铺满管壁，之后在室温避光条件下振荡12h。
将上述振荡液先15000r离心30min，再添加封闭液重悬，500uL封闭液试剂A(以pH为7.4的PBS溶解的100mM赖氨酸)与500uL封闭液试剂B(以pH为7.4的PBS溶解的100mM3-琉基丙酸)充分混合，50℃振荡3h，然后15000r离心30min。之后用pH为7.4的由10mM的PBS和0.05wt％的TW20组成的PBST清洗三次，其中，清洗的后两次先用超声处理2min。
最后，用pH为9的50mM的Tris缓冲液保存。其中，50mM的Tris缓冲液中含有：酪蛋白：1wt％，BSA：0.5wt％，TW20：0.5wt％，EDTA-Na：10mM，PEG：1wt％，NaN3：0.1wt％。
应用对比例1：
对比例1与实施例1的区别仅在于，对比例1的封闭液为1％的BSA溶液(以pH为7.4的PBS溶解)。
把相应的PCT抗体包被在NC膜上，NC膜的一端贴上吸水纸，另一端固定上样品垫，这三部分组装成层析试纸条。将应用实施例1和应用对比例1交联后的荧光粒子稀释到25ug/ml的浓度，与样品体积比1:1混合，混合液跑试纸条，试纸条孵育15min后，于荧光免疫试条定量检测仪上读取荧光信号。
取100ng/ml的PCT标准品，梯度稀释成不同浓度值，不同浓度的PCT标准品与交联后的荧光粒子混合，混合浓度为25ug/ml，与样品体积比为1:1，混匀后滴加到样品垫上，跑层析试纸条，15min后，读取荧光信号值。应用实施例1和应用对比例1交联的粒子拉PCT的标准曲线，结果如表1和表2所示。
表1：应用实施例1赖氨酸和3-琉基丙酸封闭后PCT校准曲线
表2：应用对比例1BSA封闭后PCT校准曲线
从表1与表2可知，在PCT标准品的低值(包括0.39、0.1、0.05)的线性比例方面，表1的结果更加理想，并且在0值时，用本发明的赖氨酸和3-琉基丙酸封闭处理后的粒子本底更低。
图1为应用实施例1和应用对比例1两种封闭方法交联荧光微球的校准曲线，图中显示了应用实施例1和应用对比例1封闭方法交联出来的粒子拉PCT标准品的情况。结果显示，在PCT浓度比较高的情况下，用赖氨酸和3-琉基丙酸封闭处理后的粒子信号更高，线性也好。因此，PCT的标准曲线用赖氨酸和3-琉基丙酸封闭处理后的粒子更好。
比较应用实施例1和应用对比例1两种封闭后荧光微球，用PCT标准品拉标准曲线和测低值血清的信号值，结果如表3所示。
表3
从表3可知，应用对比例1方法处理时，所有0值血清的信号值在400到4000之间，这表明体系中有明显的非特异性信号或干扰。而用本发明的方法处理后再测定的0值信号值控制在200范围内，随着血清浓度升高，试纸条的荧光信号也逐渐增大，符合血清中PCT的浓度规律。因此，本发明用赖氨酸和3-琉基丙酸封闭得到的交联微球效果更好，测0值血清时，非特异性信号更小，假阳性结果少。由此可知，以赖氨酸和3-琉基丙酸封闭得到的交联微球来测低值血清时，非特异性更小，假阳性更少，信号跟真实值更相近。
本发明若要想更好的抑制生物样本中的非特异性和干扰，还可以在抗体微球的缓冲液中加入阻断剂(如HBR等)，阻断剂的用量为40ug/mL。
在抗体微球的稀释液中加入40ug/mL的HBR，重新拉一批不同浓度的血清，看其相关性。
以本发明方法和现有技术中梅里埃VIDAS测血清PCT浓度，其中，本发明在抗体微球的稀释液中加入40ug/mL的HBR，同时做相关性曲线，结果如表4和图2所示。
表4
以表4的结果作图，得到图2，从图2可知，本发明的检测结果与现有技术中梅里埃VIDAS的检测结果有较好的一致性。不论检测的是标准品还是血清样本，用两种粒子混合，以赖氨酸和3-琉基丙酸封闭交联的粒子得出的结果都比常规的方法有优势。PCT标准曲线线性更宽，本底更好，血清检测与市面上常用的检测结果相关度更好。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，荧光微球中荧光微球Ⅰ的粒径还可以为450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、600nm。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，荧光微球中的荧光微球Ⅱ的粒径还可以为100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，荧光微球Ⅰ和荧光微球Ⅱ的质量比还可以为1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的Tris的浓度还可以为20mM、30mM、40mM、45mM、55mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的酪蛋白的含量还可以为0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.8wt％、2wt％。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的BSA的含量还可以为0.3wt％、0.4wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的表面活性剂的含量还可以为0.3wt％、0.4wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的表面活性剂还可以为TritonX-100、BRIJ35、Tetronic1307、BIO-TERGEAS-40。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的金属螯合剂的浓度还可以为3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的金属螯合剂还可以为DEG、HEDTA。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的PEG的含量还可以为0.5wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.8wt％、2wt％、2.2wt％、2.5wt％、2.6wt％、2.8wt％、3wt％、3.1wt％、3.3wt％、3.5wt％、3.8wt％、4wt％、4.2wt％、4.5wt％、4.6wt％、5wt％。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液中的NaN3的含量还可以为0.05wt％、0.06wt％、0.08wt％、0.09wt％、0.11wt％、0.12wt％、0.13wt％、0.15wt％、0.16wt％、0.17wt％、0.18wt％、0.2wt％、0.22wt％、0.23wt％、0.25wt％、0.26wt％、0.27wt％、0.28wt％、0.3wt％。
在上述减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用实施方案及其替换方案中，缓冲液的pH还可以为8、8.2、8.3、8.5、8.6、8..7、8.8、8.9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10。
鉴于本发明实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1和应用实施例1作为代表说明本发明申请优异之处。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处，同样都在本发明要求保护的范围内。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (10)

1.一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液，其特征在于，所述封闭液包括试剂A和试剂B，所述试剂A为氨基酸溶液，所述试剂B为3-琉基丙酸溶液。
2.根据权利要求1所述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液，其特征在于，所述试剂A和试剂B使用时的浓度比为1：(0.5-1.5)。
3.根据权利要求1所述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液，其特征在于，所述氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸中的一种。
4.一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用，其特征在于，所述封闭液用于免疫荧光层析检测系统中的抗体微球的封闭。
5.根据权利要求4所述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用，其特征在于，所述具体应用过程为：将荧光微球进行预处理，然后与抗体交联得到抗体微球，抗体微球再使用封闭液封闭，最后用缓冲液保存。
6.根据权利要求5所述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用，其特征在于，所述荧光微球由粒径为450-600nm的荧光微球Ⅰ和粒径为100-300nm的荧光微球Ⅱ组成，所述粒径为450-600nm的荧光微球Ⅰ和粒径为100-300nm的荧光微球Ⅱ的质量比为1：(0.5-1.5)。
7.根据权利要求5所述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用，其特征在于，所述缓冲液的成分为：Tris：20-100mM，酪蛋白：0.5-2wt％，BSA：0.3-1wt％，表面活性剂：0.3-1wt％，金属螯合剂：3-20mM，PEG：0.5-5wt％，NaN3：0.05-0.3wt％。
8.根据权利要求7所述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用，其特征在于，所述缓冲液的pH为8-10。
9.根据权利要求7所述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用，其特征在于，所述表面活性剂为TritonX-100、TW20、BRIJ35、Tetronic1307、BIO-TERGEAS-40中的一种。
10.根据权利要求7所述的一种减少体外检测中生物样本假阳性的封闭液的应用，其特征在于，所述金属螯合剂为EDTA-Na、DEG、HEDTA中的一种。
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