CN107677811B - 用于封闭生物磁珠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于封闭生物磁珠的方法、包含生物素化多聚赖氨酸的用于封闭磁珠的封闭液及其制备方法、包含所述封闭液的试剂盒以及它们用于检测生物样品的用途,所述方法可以提高检测准确率,特别是降低健康献血者自身抗体检测的假阳性率。
Description
本申请是针对申请号为201610770444.2,申请日为2016年8月30日,发明名称为“用于封闭生物磁珠的方法”的发明专利申请提出的分案申请。
发明领域
本发明一般性地涉及医疗诊断、生物样品检测、食品安全检测等领域,更具体地涉及用于封闭磁珠的方法、封闭液、以及相关的应用。
发明背景
磁珠是医疗诊断和生物检测等领域常用的原料。磁珠,又称生物磁珠,是指具有细小粒径的超顺磁微球。它们在磁场中能够迅速聚集,离开磁场后又能够均匀分散。它们一般具有合适的且差别较小的粒径,保证了足够强的磁响应性又不会沉降。生物磁珠通常具有丰富的表面活性基团,以便可以和生化物质偶联,并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。与传统的分离方法相比,把磁珠用于生化样品复杂组分的的分离,能够实现分离和富集的同时进行,有效地提高了分离速度和富集效率,同时也使分析检测的灵敏度大大提升。通过在磁珠表面包被上特异性抗体、受体等,可以用于分离纯化样品中的靶体。磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定、生物活性物质的分离、食品安全检测等多个领域。
目前市场上有许多表面包被有亲和素或链霉亲和素的磁珠可以获得。亲和素和链霉亲和素是由四个相同亚基组成的生物素结合蛋白质,每个亚基均有一个与生物素有高亲和力的结合位点。借助于亲和素或链霉亲和素与生物素之间的高亲和力结合特性,包被了亲和素或链霉亲和素的磁珠可以结合生物素化的蛋白、多肽、及非蛋白质(如各种DNA、RNA分子)等分子,进而从混合体系中快速分离生物素化成分,进行如免疫分析/检测、亲和纯化、细胞分离、DNA探针分析和mRNA分离等多方面应用。
将抗原(或抗体)标记生物素后,通过生物素与磁珠上的链霉亲和素反应,从而将抗原(或抗体)包被于磁珠,对于磁珠上未连接抗原(或抗体)的多余链霉亲和素,通常通过引入生物素予以封闭。但是由于人体中可能出现抗生物素抗体,以及与磁珠表面其它结构产生反应的抗体,生物素作为小分子,并不能降低这些抗体与磁珠的连接,由此导致检测结果的准确性降低。例如,在某些间接法检测自身抗体的项目中,使用生物素封闭液来封闭磁珠在检测健康献血者的抗体浓度水平时可能出现信号异常升高,导致假阳性。
另外,CN201210180020.2、CN201510050450.6公开了以含有牛血清白蛋白(BSA)的封闭液对磁珠进行封闭的方法。但是这种BSA封闭液在通用性、检测准确性等方面还存在很多问题。
因此,本领域急需一种新的封闭磁珠的方法,以便提高使用磁珠的生物检测的准确率,尤其是降低健康献血者自身抗体检测的假阳性率。
发明内容
本发明的一个目标是提供一种封闭磁珠的方法和封闭液,其能有效地降低生物检测过程中的假阳性、提高检测准确率。
本发明的另一个目标是提供能有效地降低生物检测过程中的假阳性、提高检测准确率的检测产品(例如试剂盒)和相关应用。
本发明的发明人出乎意料地发现,使用生物素化多聚赖氨酸代替生物素来封闭磁珠,能够有效地降低使用磁珠进行的生物检测的假阳性结果,尤其是对于源自于人的生物样品。在一个优选实施方案中,本发明能够有效地降低健康人类献血者自身抗体检测的假阳性率。
本发明一个方面涉及用于封闭生物磁珠的封闭液,所述封闭液包含生物素化多聚赖氨酸。
本发明另一个方面涉及一种试剂盒,所述试剂盒包含生物磁珠、生物素化诱饵和封闭液,其中所述封闭液包含生物素化多聚赖氨酸。
本发明另一个方面涉及一种封闭磁珠的方法,所述方法包括:
(1)制备含有生物素化多聚赖氨酸的封闭液;
(2)将生物磁珠与生物素化诱饵混匀;
(3)将步骤(2)中产物与步骤(1)中封闭液混匀。
以上步骤(1)、(2)可以任意顺序进行,但是显然步骤(3)只能在步骤(1)、(2)完成之后进行。
所述方法可以进一步包括步骤:
(4)洗涤步骤(3)中产物。
本发明的一个优选实施方式涉及一种封闭磁珠的方法,所述方法包括以下步骤:
(1a)用生物素标记多聚赖氨酸;
(1b)分离生物素化多聚赖氨酸并制备含生物素化多聚赖氨酸的封闭液;
(2)将磁珠与生物素化诱饵混匀;
(3)将步骤(2)中产物与步骤(1b)中产物混匀;
(4)洗涤步骤(3)中产物;
(5)加入适量缓冲液混匀。
在说明书全文以及所附权利要求书中提到的“磁珠”或“生物磁珠”,如本领域所公知,是指用亲和素或链霉亲和素包被(偶联)的磁性微球。这种磁珠为本领域技术人员所熟知,且是市售可得的,例如Thermo公司的MyOneTM Streptavidin T1、Roche公司的Streptavidin Magnetic Particles、Agilent公司的LodeStars 2.7 Streptavidin等。另外,例如CN201510050450.6等文献也公开了亲和素偶联纳米磁珠的制备方法。
在说明书全文以及所附权利要求书中,“生物素化多聚赖氨酸”和“生物素标记的多聚赖氨酸”意思相同;它们旨在表示以共价键直接或间接连接在一起的多聚赖氨酸和生物素。可以通过本领域已知的多种方式将多聚赖氨酸和生物素共价结合在一起。多聚赖氨酸的分子量通常可以为例如7kDa-1500kDa,优选地10kDa-1000kDa,更优选地20kDa-800kDa,例如30kDa-700kDa,例如40kDa-600kDa,例如50kDa-500kDa,例如60kDa-400kDa,例如70kDa-300kDa,例如70kDa-200kDa,最优选地70kDa-150kDa。
本发明的用于封闭生物磁珠的封闭液可以通过将生物素与多聚赖氨酸简单混合接触的方法来进行制备。该制备方法可以进一步包括分离、提纯、缓冲、稀释等常规步骤。例如,在本发明的一个实施方式中,通过将包含NHS(N羟基丁二酰亚胺酯)活化基团的生物素与多聚赖氨酸直接混合来制备生物素化多聚赖氨酸。含NHS活化基团的生物素可以直接商购获得,例如Thermo公司提供的NHS-LC-生物素(货号21336,其中LC代表戊酸空间臂);其他类似产品包括Apexbio公司的NHS-LC-生物素、Sigma公司的(+)-生物素-NHS等。多聚赖氨酸也可以通过商业途径获得,例如Sigma公司的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、MPBiomedicals公司的聚-L-赖氨酸等。市售多聚赖氨酸包括聚-L-赖氨酸和聚-D-赖氨酸以及它们的衍生物(如聚-L-赖氨酸氢溴酸盐,其中溴化氢可通过透析除去),这些都可以用于本发明。用于反应的多聚赖氨酸与含NHS活化基团的生物素之间的比例并不关键,根据实际需要可以调整,例如两者的摩尔比可以为1:20至1:0.1,或1:10至1:5.1,或约1:1。
在说明书全文以及所附权利要求书中,“诱饵”指的是与待分析、检测或分离的靶标相互作用的物质,包括但不限于蛋白质(包括抗体、抗原)、多肽、DNA、RNA等。例如,当要检测的靶标是抗体时,诱饵便为相应的抗原;当要检测的靶标是抗原时,诱饵便为相应的抗体;当要检测的靶标是特定DNA分子时,诱饵便为与该DNA分子特异性结合的探针。
本发明提出了一种新的封闭磁珠的方法和新型的磁珠封闭液,该方法和封闭液适用范围广,可以代替常用的生物素封闭液和封闭方法,适用于各种生物检测。由于本发明的通用性好,具体实施过程中,封闭液中生物素化多聚赖氨酸的具体浓度范围可以由本领域技术人员根据实际需要简单确定。例如,封闭液中生物素化多聚赖氨酸的浓度可以在0.02μg/mL-1000μg/mL范围内,优选地0.2μg/mL-100μg/mL,更优选地0.2μg/mL-20μg/mL,特别优选地2μg/mL-20μg/mL,最优选地2μg/mL-10μg/mL范围内。至于封闭液的其他组成成分,可以是由本领域技术人员确定的任何常用封闭液组成成分,例如封闭液通常含有PBS磷酸缓冲液。一种典型的封闭液组成为PBS磷酸缓冲液中的6μg/mL浓度的生物素化多聚赖氨酸。
生物素化多聚赖氨酸与链霉亲和素磁珠的比例可以由本领域技术人员根据实际需要简单确定。例如,生物素化多聚赖氨酸与链霉亲和素磁珠的比例可以在0.01μg/mg-500μg/mg范围内,优选地0.1μg/mg-50μg/mg,更优选地0.1μg/mg-10μg/mg,特别优选地1μg/mg-10μg/mg,最优选地1μg/mg-5μg/mg范围内。
在一种具体实施方式中,本发明提供一种封闭链霉亲和素磁珠的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)按1:10(摩尔/摩尔)将多聚赖氨酸与NHS-LC-生物素(或其它包含NHS活化基团的生物素)混匀室温放置30分钟;
(b)将(a)中产物于磷酸盐缓冲液中在4℃透析过夜;
(c)按1:2(mg/μg)将链霉亲和素磁珠与经分离的生物素化抗原室温混匀30分钟;
(d)按1:3(mg/μg)将步骤(b)中产物与步骤(c)中产物室温混匀30分钟;
(e)使用相应缓冲液将(d)中产物洗涤3次;
(f)加入适量缓冲液混匀。
发明人发现:使用该方法封闭亲和素磁珠或链霉亲和素磁珠,相较于生物素封闭亲和素磁珠或链霉亲和素磁珠,能够降低健康人类献血者自身抗体检测的假阳性率。
本发明还涉及上述封闭液、试剂盒、封闭方法用于检测生物样品的用途,包括非诊断用途和诊断性用途。
在说明书全文以及所附权利要求书中,“生物样品”指待分析、检测或分离的生物合成样品或待分析、检测或分离的来自于人类或其他动物、植物、微生物的样品等,尤其是来自于人类或其他动物的待测样品,例如血液、尿液、汗液、组织培养液等。本发明的封闭液、试剂盒、封闭方法可以改善生物样品检测的准确率,尤其适合用于降低健康献血者自身抗体检测的假阳性率。
本发明还具体涉及如下各项:
1.一种封闭生物磁珠的方法,所述方法包括:
(1)制备含有生物素化多聚赖氨酸的封闭液;
(2)将生物磁珠与生物素化诱饵混匀;
(3)将步骤(2)中产物与步骤(1)中封闭液混匀。
2.根据项1所述的方法,其中所述诱饵是抗体、抗原、RNA或DNA探针。
3.根据项1或2所述的方法,其中所述方法进一步包括:
(4)洗涤步骤(3)中产物。
4.根据项3所述的方法,其中所述方法包括以下步骤:
(1a)用生物素标记多聚赖氨酸;
(1b)分离生物素化多聚赖氨酸并制备含生物素化多聚赖氨酸的封闭液;
(2)将生物磁珠与生物素化诱饵混匀;
(3)将步骤(2)中产物与步骤(1b)中产物混匀;
(4)洗涤步骤(3)中产物;
(5)加入适量缓冲液混匀。
5.根据项4所述的方法,其中用生物素标记多聚赖氨酸是通过将包含NHS活化基团的生物素与多聚赖氨酸直接混合来实现的。
6.用于封闭生物磁珠的封闭液,其特征在于所述封闭液包含生物素化多聚赖氨酸。
7.一种试剂盒,所述试剂盒包含生物磁珠、生物素化诱饵和封闭液,其中所述封闭液包含生物素化多聚赖氨酸。
8.项1-5中任一项所述方法或者项6所述封闭液或项7所述试剂盒用于对生物样品进行检测的用途。
9.制备用于封闭生物磁珠的封闭液的方法,其包括将生物素与多聚赖氨酸混合接触的步骤。
10.根据项9所述的方法,其包括将包含N羟基丁二酰亚胺酯活化基团的生物素与多聚赖氨酸混合接触的步骤。
实施例
下面用实施例对本发明进行进一步说明。这些说明是示例性的,不是用于限制本发明的范围。
在以下实施例和对比例中,以健康献血者和临床患者血清中抗SS-A抗体、抗SS-B抗体为检测对象,考察RLU(相对发光单位,化学发光检测方法的信号值)变化率。
血液样本由合作医院从志愿献血者的血样中随机提供。使用血清采集管采集血液后于37℃放置15分钟,3000rpm离心10分钟取上清液即为测试用样本。对于抗SS-A抗体检测实验,首先使用抗SS-A抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)(EUROIMMUN,货号EA1595-9601G)检测样本来对样本进行分类,检测结果为阳性者将其鉴定为临床患者,结果为阴性者将其划分为健康献血者。对于抗SS-B抗体检测实验,首先使用抗SS-B抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)(EUROIMMUN,货号EA1597-9601G)检测样本来对样本进行分类,检测结果为阳性者将其鉴定为临床患者,结果为阴性者将其划分为健康献血者。
在本发明中,变化率如下定义和计算:
变化率=(多聚赖氨酸封闭RLU-生物素封闭RLU)/生物素封闭RLU×100%。
实施例1
将生物素化多聚赖氨酸封闭的磁珠用于IS1200全自动化学发光测定仪,检测健康献血者和临床患者血清样本中抗SS-A抗体、抗SS-B抗体的RLU。抗SS-A抗体RLU检测结果列于表1,抗SS-B抗体RLU检测结果列于表2。具体实施步骤如下:
(a)使用混匀仪(dragonlab,型号为MX-T6-S)将2mL多聚赖氨酸水溶液(sigma,货号P2636,1mg/mL)与6.72μL NHS-LC-生物素溶液(Thermo,货号21336,10mM)室温混匀30分钟,然后加入200μL Tris溶液(1M)终止反应;
(b)将(a)中产物于0.02M磷酸盐缓冲液中在4℃透析过夜,透析袋购自biodee(货号D6mm);
(c)按1:2(mg/μg)将2mg/mL链霉亲和素磁珠(Thermo,货号656-03)与生物素化SS-A抗原(自制,0.05μg/μL)/生物素化SS-B抗原(自制,0.05μg/μL)室温混匀30分钟;
(d)按1:5(mg/μg)将步骤(c)中产物与步骤(b)中产物室温混匀30分钟;
(e)使用1mL磷酸盐缓冲液(0.02M)洗涤(d)中产物,共3次;
(f)加入5mL磷酸盐缓冲液(0.02M)混匀,使得磁珠浓度为0.2mg/mL;
(g)使用全自动化学发光测定仪(maccura,IS1200)检测样本。仪器自动取样10μL于反应管,加入(f)中磁珠50μL混匀,37℃反应15分钟,用TBST洗液(50mM)洗涤三次,每次500μL,然后加入100μL鼠抗人IgG-HRP(自制,1μg/mL),37℃反应15分钟,用TBST洗液(50mM)洗涤三次,每次500μL,然后加入鲁米诺催化发光检测器检测,从仪器直接读出RLU读数。
对比例1
类似于实施例1的步骤进行对比例1的检测,不同之处在于使用生物素封闭的磁珠代替生物素化多聚赖氨酸封闭的磁珠。
抗SS-A抗体RLU检测结果列于表1,抗SS-B抗体RLU检测结果列于表2。
表1.抗SS-A抗体RLU检测结果
注:样本A1-A10在EUROIMMUN试剂盒检测中显示阴性,被鉴定为健康献血者样本;样本A11-A19在EUROIMMUN试剂盒检测中显示阳性,被鉴定为临床样本。
表2.抗SS-B抗体RLU检测结果
注:样本B1-B13在EUROIMMUN试剂盒检测中显示阴性,被鉴定为健康献血者样本;样本B14-B30在EUROIMMUN试剂盒检测中显示阳性,被鉴定为临床样本。
从表1和表2中的数据可以看出,无论是对于抗SS-A抗体或抗SS-B抗体,相对于以生物素封闭的磁珠的对比例,根据本发明的以生物素化多聚赖氨酸封闭的磁珠对健康献血者样本RLU检测结果均显示出显著的降低,虽然临床样本RLU也有一定程度的降低,但变化率远小于健康献血者样本。综合来看,即假阳性结果消除或显著降低,而真阳性结果没有实质变化。
例如,对于表1中的健康献血者样本A7,当使用以生物素封闭的磁珠时,其RLU远远高于大部分临床样本的RLU,从而容易导致假阳性;然而,当使用根据本发明的以生物素化多聚赖氨酸封闭的磁珠时,其RLU显著降低(变化率:94%)至远低于所有临床样本的RLU,从而避免了假阳性结果。
类似地,对于表2中的健康献血者样本B8和B9,当使用以生物素封闭的磁珠时,其RLU高于多数临床样本的RLU,从而容易导致假阳性;然而,当使用根据本发明的以生物素化多聚赖氨酸封闭的磁珠时,其RLU显著降低(变化率分别为79%和81%)至低于所有临床样本的RLU,从而避免了假阳性结果。
综上所述,使用根据本发明的封闭生物磁珠的方法能够显著降低健康献血者自身抗SS-A抗体和抗SS-B抗体检测的假阳性率,提高使用磁珠的生物检测的准确率。
以上实施例部分以抗SS-A抗体和抗SS-B抗体为例示出了本发明的效果。本领域技术人员可以理解,本发明的封闭生物磁珠的方法是一种用于生物检测或医学检查的通用前处理技术,其技术效果不取决于待测定的具体目标分子,而是可以广泛适用于各种目标分子的检测。
另外,“实施例”部分和“发明内容”部分所公开的各种参数、数值范围、各个不同的具体特征可以组合在一起,它们的任意组合都在本发明范围内。这些各种参数、数值范围、各个不同的具体特征的组合也是本发明公开的一部分,只是为了节省篇幅未一一列出。
本领域技术人员理解,本申请所涉及的各个权利要求的等同技术方案也在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种封闭生物磁珠的方法,所述方法包括以下步骤:
(1a)用生物素标记分子量为7kDa-1500kDa的多聚赖氨酸;
(1b)分离生物素化多聚赖氨酸并制备含生物素化多聚赖氨酸的封闭液,该封闭液中生物素化多聚赖氨酸的浓度为0.02μg/mL-1000μg/mL;
(2)将链霉亲和素磁珠与生物素化诱饵混匀;
(3)将步骤(2)中产物与步骤(1b)中产物按照生物素化多聚赖氨酸与链霉亲和素磁珠的比例为0.01μg/mg-500μg/mg混匀;
(4)洗涤步骤(3)中产物;
(5)加入适量缓冲液混匀;
其中,所述诱饵是待测自身抗体的抗原。
2.根据权利要求1所述的方法,其中用生物素标记多聚赖氨酸是通过将包含NHS活化基团的生物素与多聚赖氨酸直接混合来实现的。
3.一种试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1所述的链霉亲和素磁珠、权利要求1所述的生物素化诱饵和权利要求1所述的封闭液。
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