WO2018063034A1 - Способ мультиплексного анализа с помощью магнитных меток и устройство для его осуществления - Google Patents

Способ мультиплексного анализа с помощью магнитных меток и устройство для его осуществления Download PDF

Info

Publication number
WO2018063034A1
WO2018063034A1 PCT/RU2017/000724 RU2017000724W WO2018063034A1 WO 2018063034 A1 WO2018063034 A1 WO 2018063034A1 RU 2017000724 W RU2017000724 W RU 2017000724W WO 2018063034 A1 WO2018063034 A1 WO 2018063034A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
test strips
zone
sample
reading
zones
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000724
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Петр Иванович НИКИТИН
Original Assignee
Петр Иванович НИКИТИН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Петр Иванович НИКИТИН filed Critical Петр Иванович НИКИТИН
Publication of WO2018063034A1 publication Critical patent/WO2018063034A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/72—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating magnetic variables
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody

Definitions

  • the invention relates to the field of biology and medicine, namely to the field of biochemical analyzes, and allows to determine quantitatively or qualitatively the presence in the sample of several analytes simultaneously.
  • Biochemical analyzes are widely used in various fields of human activity, such as medicine, veterinary medicine, food and feed control, environmental monitoring, drug control, etc.
  • the multiplexness of biochemical analyzes that is, the ability to simultaneously detect several analytes in one sample, increases detection speed, provides consistent results and increases reliability, for example, medical diagnosis, by detecting a combination of disease biomarkers instead of a single indicator.
  • a common approach to multiplexing is the use of immunochromatographic test strips based on optical labels, such as gold nanoparticles, colored latex particles, quantum dots, etc.
  • the reagents necessary for the detection of the analyte to be determined are applied to the membrane test strip; the contact of the test strip with the analyzed liquid sample initiates the occurrence of specific interactions during the migration of the liquid and the label with the corresponding receptor through the membrane of the test strip, specific binding of labels in predetermined recognition zones (test lines), which are applied
  • a common drawback of methods based on optical labels is to read the result only from the surface of the test strip, while most of the labels located in the thickness of the porous material of the test strip are not taken into account even when instrumental reading of the analysis result.
  • the analysis by such methods of opaque or highly colored liquid media is difficult.
  • immunochromatographic test strips are read by a detection coil.
  • a one-parameter method of magnetic immunochromatographic test [US Pat. No. 9,329,181], selected as a prototype, in which a sample reception zone, a read zone (test line) are formed on a test strip and a moving object connected with magnetic particles is used; the test strip is made of a porous material that allows a liquid sample, analytes and a moving object to move from the sample receiving zone in the direction of the reading zone and through the reading zone; the reading zone on the test strip is configured to interact with the analyte in a liquid sample and selective
  • the prototype method has the following disadvantages.
  • the prototype is intended for one-parameter analysis.
  • the potential expansion of the prototype for the implementation of multiplex analyzes using well-known approaches, for example, using several test lines (recognition zones) on one test strip, will lead to disadvantages,
  • test lines (recognition zones) will not be in equal conditions with respect to the order of interaction with the sample and the moving object with magnetic labels, which will lead to a decrease in the analytical characteristics of the test on the second and subsequent lines;
  • test lines on one test strip will lead to the necessity of taking into account the cross-reactivity factor of biochemical reagents, which will increase the requirements for the specificity (selectivity) of the reagents used;
  • multiplex TM without deterioration of such analytical characteristics as detection threshold, dynamic range, etc .; in eliminating the increased requirements for cross-reactivity of the reagents used for a defined set of analytes; in simplicity
  • test system for multiplex biochemical analysis for each specific set of analytes, as well as providing the possibility of multiplex analysis of opaque and / or highly colored media.
  • a method for multiplex determination of several analytes in a liquid sample at the same time consisting in the fact that the analysis is carried out using modules in the form of immunochromatographic test strips and magnetic particles as detectable labels; on each of the said test strips, a sample reception zone, at least one reading zone are formed and a moving object connected with magnetic particles is used; each of these test strips is made of a porous material that allows a liquid sample, analytes and a moving object to move from the sample receiving zone in the direction of the reading zone and through the reading zone; reading zones on each of the said test strips are capable of interacting with different analytes in a liquid sample and selective (specific) fixation of the said moving object; in said method, an analytical multiplex device is formed in which said modules (test strips) are oriented in such a way that the directions from the sample receiving zone to the reading zone of the test strips are approximately parallel to each other; spatially distributing the positions of each of the reading zones of said test strips along an approximately general
  • test strips are placed in the form of a three-dimensional structure inside the cartridge, at least part of which is cylindrically shaped.
  • Cylindrical-like is understood to be any spatial shape having a constant cross section in planes perpendicular to the axis coinciding with approximately the general direction from the sample receiving zone to the reading zone, in particular, representing a circle, oval, ellipse and the like in cross section.
  • the measuring cell of the said detector of the number of magnetic particles is made in the form of several measuring sections, each of which registers response signals depending on the number of magnetic particles that are connected on one of the reading zones of the said multiplex device.
  • time delays between response signals from said measurement sections are recorded; the values of the mentioned time delays are used to determine the content of analytes with increased accuracy.
  • time delays between response signals from said measurement sections are recorded; the values of the values of the mentioned time delays are used to determine the analyte content with increased accuracy by taking into account the speed of movement of the mentioned moving objects on each of the test strips and stability
  • time delays between response signals from said measurement sections are recorded; the values of the values of the mentioned time delays are used to determine the analyte content with increased accuracy by taking into account the migration parameters of the liquid sample, such as, for example, viscosity, temperature, the presence of microdispersed impurities and inclusions through said porous material.
  • the measuring cell of the detector of the number of magnetic particles is sequentially changed and registering response signals in an area close to each reading zone of said multiplex device.
  • an information signal is determined equal to the difference of the response signal near the interrogated read zone and the response signal in a region that is approximately half the distance between the interrogated and the other nearest zone towards the other nearest read zone reading said multiplex device; said information signal is used to determine the analyte content in the sample using calibration data.
  • multiplex device at a distance of approximately equal to 3 mm to 15 mm
  • an information signal is used to determine the analyte content in the sample using calibration data.
  • said cartridge is made of an optically partially transparent material or having a partially transparent window through which the spatial placement of said test strips is inspected.
  • the aforementioned several measuring sections of the detector of the number of magnetic particles are performed in the form of induction coil systems that excite a probe (interrogating) alternating magnetic field in the area near each of the said read zones of the multiplex device and record the induction response signals of the said magnetic particles; said induction coil systems are connected to a single processor unit of said magnetic particle number detector; said processor unit sets at least two frequencies of a probing alternating magnetic field and extracts spectral components from the induction response signal at combinatorial frequencies of the probing magnetic field; said spectral components are used to determine the number of magnetic particles in each of said read zones
  • multiplex device and determination of analyte content in the sample according to calibration data.
  • a modular test strip can be laminated with a material that is at least partially permeable to an externally generated magnetic field, so that the sample receiving area can be brought into contact with a liquid sample. This allows for a tighter fit. modules inside the cartridge.
  • each test strip is carried out having a control line coated with ligands for binding to receptors (eg, antibodies, antigens, synthetic and natural proteins, nucleic acid molecules and the like) located on said movable object; the spatial positions of the control lines of the test strips approximately coincide in a plane perpendicular to the approximately general direction from the sample receiving zone to the reading zone. This allows you to control with the greatest completeness of the preservation of the functional properties of the reagents used.
  • receptors eg, antibodies, antigens, synthetic and natural proteins, nucleic acid molecules and the like
  • test strips are performed using antibodies on the said reading zones for multiplex determination of botulinum neurotoxins of several serotypes (A, B, E and F).
  • test strips are carried out using recognition receptors (e.g. antibodies, antigens, natural or synthetic proteins, peptides, nucleic acid molecules, molecular fingerprints in polymers and the like) on said read zones and simultaneously determine the concentrations of several biomarkers
  • recognition receptors e.g. antibodies, antigens, natural or synthetic proteins, peptides, nucleic acid molecules, molecular fingerprints in polymers and the like
  • test strips mentioned are performed using hapten protein conjugates (such as small molecules of mycotoxins, drugs, antibiotics, harmonics, vitamins, drugs, trace elements, synthetic and natural poisons, and the like small molecules) to determine several haptens (small molecules ) in competitive immunoassay formats.
  • hapten protein conjugates such as small molecules of mycotoxins, drugs, antibiotics, harmonics, vitamins, drugs, trace elements, synthetic and natural poisons, and the like small molecules
  • test strips are performed using single-stranded nucleic acid molecules with different nucleotide sequences on said test strip reading zones, and several molecules are determined simultaneously, at least partially complementary to said nucleic acid molecules.
  • a similar analysis can be used in combination with the preliminary conduct of the polymerase chain reaction (PCR), in particular for the hypersensitive diagnosis of infections.
  • FIG. 1 -5 shows one of its possible options.
  • the specific amounts, methods, compositions, characteristics and devices presented are not limiting of the invention.
  • the drawings are not to scale.
  • FIG. 1 Module diagram for an analytical multiplex device
  • FIG. 2. Diagram of the analytical multiplex device
  • FIG. 3 The dependence of the induction signal on the concentration of botulinum neurotoxin serotype A with multiplex determination of three neurotoxins of different serotypes (A, B and E) in the sample simultaneously.
  • FIG. 4 Dependence of the induction signal on the concentration of botulinum neurotoxin serotype B with multiplex determination of three neurotoxins of different serotypes (A, B and E) simultaneously in the sample.
  • FIG. 5 Dependence of the induction signal on the concentration of botulinum neurotoxin serotype E with multiplex determination of three neurotoxins of different serotypes (A, B and E) simultaneously in the sample.
  • FIG. 1-5 shows an example implementation of the multiplex method
  • the dashed lines in the upper part of the figure schematically show the spatial positions of the read zones and the control line inside the cartridge, and the arrows at the bottom of the figure schematically show the results of determination of analytes 21, 22, 23 by measuring sections 14, 15, 16 of the detector for the number of magnetic particles, as well as the result of recording magnetic particles on the control line 24 of the measuring section 17 of the detector.
  • FIG. Figures 3–5 show the value of the sum of the negative control signal (in the absence of a detectable analyte in the sample) and the doubled standard deviation of the response signals.
  • the proposed method is implemented as follows.
  • Modules are made in the form of immunochromatographic test strips; each module is designed to determine in the sample at least one of the detected analytes.
  • the porous material 3 is fixed and a reception zone for sample 1 is formed, as well as a zone for the placement of moving objects associated with magnetic particles 2.
  • conjugates of magnetic particles with receptors such as as antibodies, antigens or conjugates based on them, or single-stranded nucleic acid molecules, to those analytes for the detection of which this module is intended.
  • a read zone 6 is formed (FIG. 1) by applying recognition agents to determine the analyte.
  • a control line 9 is also formed on the porous material 3 by applying ligands to bind to receptors located on said movable object with magnetic particles.
  • a multiplex device as described above, is formed from the modules (test strips) made in this way, and the reading zones of the modules (test strips) designed to determine different analytes are spatially spaced along approximately the general direction from the sample receiving zone to the reading zone ( positions 6, 7 and 8 in Fig. 2).
  • the test sample is applied to the area for receiving the liquid sample of the cartridge 10, due to which specific interactions are initiated during the migration of magnetic particles with receptors and liquid along the porous material (membrane) of the test strip.
  • the sandwich format if analytes are detected in the sample, magnetic particles are bound in the corresponding reading zones of the multiplex device.
  • the binding of magnetic particles occurs in the corresponding reading zones, and as the concentration of haptens in the sample increases, the specific binding of magnetic particles decreases.
  • a multiplex device is placed in the measuring cell of the detector of the number of magnetic particles so that the measuring sections 14, 15, 16, 17 are located near the read zones 6, 7, 8 and the control strips 9 of the modules included in the multiplex device.
  • devices for determining the number of magnetic particles act on the closest neighborhood of each of the readout zones by the interrogating magnetic field, after which the induction response signals 21, 22, 23, 24 are recorded, depending on the number of magnetic particles that are connected in each readout zone.
  • Such induction signals can be, for example, the spectral components at the combinatorial frequencies of a probing alternating magnetic field having two frequencies, the mentioned spectral components arise due to nonlinear magnetization reversal of magnetic nanoparticles and are used to determine the number of magnetic particles [AV Orlov, VA Bragina, M.R. Nikitin, PI Nikitin. Rapid dry-reagent immunomagnetic biosensing platform based on volumetric detection of nanoparticles on 3D structures. Biosensors and Bioelectronics. 79 (2016) 423-429].)]. Hall sensors [US Pat. No.
  • fluxgate magnetometers or other known magnetic field sensors for example based on gigantic magnetic resistance or impedance, can be used to record the mentioned induction signals.
  • the analyte content in the sample is determined, and the results are displayed on the display unit of the results of determination of analytes 18.
  • the background signals of nonspecifically coupled magnetic particles on the remaining modules do not make a significant contribution to the response signal from any recognition zone. Even more interesting was the fact that the background signal can be neglected if, as an information signal for determining the analyte concentration, we take the difference of the response signal near the interrogated read zone and the response signal in the region that is farther away from the other nearest read zone, where / - either half the distance between the interviewee and the other nearest reading zone, or lies in the range from 1, 5 to 6 mm. This reduces the cost and simplifies the device that implements this method, while maintaining high accuracy of quantitative determination of the concentration of each analyte in a liquid sample.
  • the test strip has a sample reception zone, a reading zone and a moving object associated with magnetic particles;
  • the test strip is made of a porous material that allows the liquid sample, analyte and moving object to move from the sample receiving zone in the direction of the reading zone and through the reading zone; reading area test strips are made with the possibility of interaction with the analyte in a liquid sample and selective (specific) fixation of the said moving object;
  • the test strip is located inside the cartridge, which is made of a material at least partially permeable to an externally generated magnetic field;
  • the said cartridge has at least one area for receiving a liquid sample, which allows you to bring into contact the liquid sample with the reception area of the sample of the said test strip,
  • the prototype device has the following disadvantages.
  • the prototype is intended for one-parameter analysis.
  • the potential expansion of the prototype for multiplex analyzes using well-known approaches, for example, using several test lines on the same test strip, will lead to disadvantages similar to those discussed above:
  • test lines on one test strip will lead to the necessity of taking into account the cross-reactivity factor of biochemical reagents, which will increase the requirements for the specificity (selectivity) of the reagents used;
  • a device for multiplex determination of several analytes in a liquid sample consisting of modules in the form of
  • each of the said test strips has a sample reception zone, at least one read zone and a moving object associated with magnetic particles; each of these test strips is made of a porous material that allows a liquid sample, analytes and a moving object to move from the sample receiving zone in the direction of the reading zone and through the reading zone; the reading zones of said test strips are configured to interact with different analytes in a liquid sample and to selectively (specifically) fix said movable object, in which said test strips are oriented so that the directions from the sample reception zone to the reading zone of the test strips are approximately parallel between themselves; the spatial positions of each of the read zones of said test strips are spaced along an approximately general direction from the sample reception zone to the read zone; said test strips are located inside the cartridge, which is made of a material at least partially permeable to an externally generated magnetic field; said cartridge has at least one area for receiving a liquid sample, which allows you to bring into contact the liquid sample with the reception areas of the sample mentioned test strips.
  • said cartridge has a spatial configuration that allows it to be exposed to an external sounding (interrogating) magnetic field in an area near each of said test strip readout zones and to record induction response signals depending on the number of magnetic particles in each test strip readout zone.
  • said cartridge is made of an optically partially transparent material or has a partially transparent window allowing inspecting the spatial placement of said test strips.
  • said cartridge near said reading zones has a largest cross-sectional dimension d perpendicular to said approximately general direction from the sample receiving zone to the reading zone of the test strips, in the range of about 3 mm to about 15 mm.
  • the positions of the reading zones of said test strips are spatially spaced apart from each other along the direction from the sample receiving zone to the reading zone of the test strips at distances approximately equal to half the size of said cartridge size d / 2 to 2d.
  • the positions of the read zones of said test strips are spatially spaced from each other along the aforementioned approximately general direction from the sample reception zone to the read zone of the test strips over distances ranging from about 3 mm to about 12 mm.
  • test strips are spatially placed in the form of a three-dimensional structure inside the cartridge, which has a section of cylindrical shape.
  • cylinder-like is understood to be any spatial shape having a constant section in planes, perpendicular to an axis coinciding with approximately the general direction from the sample receiving zone to the reading zone, in particular, representing a circle, oval, ellipse and the like in cross section.
  • each test strip has a control line coated with ligands for binding to receptors located on said movable object; the spatial positions of the control lines of the test strips approximately coincide in a plane perpendicular to the approximately general direction from the sample receiving zone to the reading zone.
  • test strips were made using antibodies on the said reading zones for the multiplex determination of botulinum neurotoxins of several serotypes (A, B, E and F).
  • test strips are made using recognizing receptors (e.g. antibodies, antigen molecules, natural or synthetic proteins, peptides, nucleic acids, molecular fingerprints in polymers) in said reading zones to simultaneously determine the concentration of several disease biomarkers (e.g. oncological, cardiological, infectious, gastrointestinal, autoimmune, allergic) and with the possibility of correlation comparison of biomarker concentrations in one sample under approximately the same external conditions.
  • recognizing receptors e.g. antibodies, antigen molecules, natural or synthetic proteins, peptides, nucleic acids, molecular fingerprints in polymers
  • test strips mentioned were made using hapten protein conjugates (such as small molecules of mycotoxins, drugs, antibiotics, harmonics, vitamins, drugs, trace elements, synthetic and natural poisons, and the like small molecules) to determine several haptens (small molecules ) in competitive immunoassay formats.
  • hapten protein conjugates such as small molecules of mycotoxins, drugs, antibiotics, harmonics, vitamins, drugs, trace elements, synthetic and natural poisons, and the like small molecules
  • test strips are made using single-stranded nucleic acid molecules (oligonucleotides) with different nucleotide sequences in said read zones of test strips to simultaneously detect several molecules that are at least partially complementary to said nucleic acid molecules.
  • nucleic acid molecules oligonucleotides
  • the module can be laminated with a material permeable to an externally generated magnetic field, so that the sample receiving area can be brought into contact with the liquid sample. This allows you to more densely place the modules inside the cartridge.
  • the proposed device is made as follows.
  • Modules are made in the form of immunochromatographic test strips; each module is designed to determine in the sample at least one of the detected analytes.
  • a porous material 3 is fixed on the adhesive substrate 4 and a reception zone for sample 1 is formed, as well as a zone for the placement of moving objects associated with magnetic particles 2.
  • conjugates of magnetic particles with receptors such as antibodies, antigens, or conjugates based on them, or single-stranded nucleic acid molecules to those analytes, or antibodies to them, for detection of which this module is intended.
  • a read zone 6 is formed (FIG. 1) by applying recognition agents to determine the analyte.
  • a control line 9 is also formed on the porous material 3 by applying ligands to bind to receptors located on said movable object with magnetic particles.
  • FIG. 2 A schematic representation of the assembly process of modules into an analytical multiplex device is shown in FIG. 2 ( position 25).
  • the reading zones of the modules (test strips) for determining different analytes are spatially spaced along approximately the general direction from the sample receiving zone to the reading zone (positions 6, 7 and 8 in Fig. 2).
  • the device is used as follows: using the pipette or in another way, apply the test sample to the area for receiving the liquid sample of the cartridge 10, due to which specific interactions are initiated during the migration of magnetic particles with receptors and liquid along the porous material (membrane) of the test strip.
  • sandwich format if analytes are detected in the sample, magnetic particles are bound in the corresponding reading zones of the multiplex device.
  • binding of magnetic particles occurs in the corresponding reading zones, and as the concentration of haptens in the sample increases, the specific binding of magnetic particles decreases.
  • Reading the analysis results from the proposed multiplex device is carried out as described above in the description of the corresponding method.
  • the device allows for multiplex analysis without compromising the basic analytical characteristics, such as detection threshold, dynamic range, etc., as compared to the one-parameter determination of analyte on test strips with one test line;
  • the device provides simplicity and flexibility in the design of multiplex test systems by assembling pre-prepared modules with zones spaced in space
  • test lines to determine in the sample the required set of analytes
  • the device reduces the cost and simplifies the analysis of several analytes simultaneously, including in opaque and / or highly colored environments;
  • the device allows for multiplex analysis, including in the field or near the patient (the so-called point-of-care diagnosis).
  • Example 1 Multiplex analysis of the content in a liquid sample of botulinum
  • Each of the modules is designed to determine one of the botulinum neurotoxins types A, B and E.
  • Each test strip has a width of 3 mm, a nitrocellulose membrane is used as the porous material 3.
  • a conjugate of 200-nm Estapor magnetic particles (Merck Millipore, Germany) with antibodies to the botulinum neurotoxin serotype for detection of which it is intended is applied to zone 2 of the placement of moving objects associated with magnetic particles in each of the test strips.
  • a multiplex device is formed so that a liquid sample is supplied along the modules. Then the multiplex device is placed inside a hollow cylindrical cartridge 1 0 with a length of 95 mm and an inner diameter of 4.5 mm made of polyethylene.
  • the multiplex device is placed in the measuring cell of the magnetic particle number detection device near the read zones of 6, 7, 8 modules.
  • the measuring sections 14, 1, 5, 16 constituting the measuring cell of the detector of the number of magnetic particles induction response signals are recorded, depending on the number of magnetic particles that are connected on each reading zone of the modules (test strips) of the said multiplex device.
  • To register magnetic marks the method of determining the number of magnetic particles by their nonlinear magnetization reversal is used [A.V.
  • FIG. 3 presents the dependence of the registered induction response signals on the concentration of botulinum neurotoxins of serotypes A, B and E, accordingly, when conducting multiplex testing of samples with different contents of botulinum neurotoxins.
  • a bold dashed horizontal line shows the signal level equal to the sum of the negative control signal (in the absence of a detectable analyte in the sample) and the corresponding double standard deviation of the response signals, which is usually used to determine the detection limit of the analyte [AV Orlov, VA Bragina, M. ⁇ . . Nikitin, PI Nikitin. Rapid dry-reagent immunomagnetic biosensing platform based on volumetric detection of nanoparticles on 3D structures. Biosensors and Bioelectronics. 79 (2016) 423- 429].
  • the detection limits determined by these dependences were 0.14, 0.12, and 0.30 ng / ml for botulinum neurotoxins of serotypes A, B, and E, respectively, and the dynamic range of quantitative measurement of concentration was 3 orders of magnitude.
  • Example 2 Multiplex analysis of the content in a liquid sample of a surface antigen of hepatitis B virus, antibodies to it and antibodies to the nuclear antigen of the virus
  • module A for the detection of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) with a conjugate of magnetic particles with polyclonal antibodies to HBsAg deposited on zone 2; module B) - for the detection of antibodies to HBsAg with a HBsAg fragment deposited on zone 2; module B) - for the detection of antibodies to the nuclear antigen of the virus (HBcAg) with the HBcAg fragment deposited on zone 2.
  • HBsAg hepatitis B virus surface antigen
  • the multiplex device is placed, as in Example 1, in the measuring cell of the device for detecting the number of magnetic particles near the reading zones of 6, 7, 8 modules.
  • the measuring sections 14, 15, 16 constituting the measuring cell of the detector of the number of magnetic particles, induction response signals are recorded, depending on the number of magnetic particles that are connected on each reading zone of the modules (test strips) of the said multiplex device.
  • To register magnetic tags use the method of determining the number of magnetic particles by their nonlinear magnetization reversal [AV Orlov, VA Bragina, M.R. Nikitin, PI Nikitin. Rapid dry-reagent immunomagnetic biosensing platform based on volumetric detection of nanoparticles on 3D structures. Biosensors and Bioelectronics. 79 (2016) 423-429].
  • the calibration data determine the concentration of analytes in the sample and carry out a correlation comparison of the concentrations of analytes in one sample under approximately the same external conditions, which are used to increase the reliability and speed of diagnosis or determine the phase of an infectious disease.
  • Example 3 Multiplex analysis of the content in the liquid sample of ochratoxin A, zearalenone and aflatoxin B 1
  • Each of the modules is designed to determine one of the haptens: ochratoxin A, zearalenone and aflatoxin B1.
  • a conjugate of 200 nm Estapor magnetic particles (Merck Millipore, Germany) with antibodies to the hapten for detection of which it is intended is applied to zone 2 of the placement of moving objects associated with magnetic particles in each of the test strips. From the obtained three modules, a multiplex device is formed so that a liquid sample is supplied along the modules.
  • the multiplex device is placed inside the hollow cartridge, the corresponding portion of which is brought into the container containing the sample to be brought into contact with the reception zones of sample 1 on the modules of the multiplex device. After 10 minutes, the multiplex device is placed, as in Example 1, in the measuring cell of the detector of the number of magnetic particles near the read zones of 6, 7, 8 modules and the number of magnetic particles that are bound in each read zone of the multiplex device is counted.
  • the calibration data determine the concentration of each of the analyzed haptens for a competitive immunoassay format.
  • each of the modules is designed to determine one of five different nucleic acid molecules (oligonucleotides):
  • module B for the determination of 5'-TACGAGTTGAGAATCCTGAATGCG-3 ';
  • module D) to determine 5'-CGCGGTCTCAGGATATTTTTTTTGGATATATGGTACGA-3 '; module E) - for the determination of 5'-AGACCATCCTGGCTAGTCTGTTGTCTCTACTAAAAATA-3 '.
  • oligonucleotides are applied, partially complementary to other parts of the determined oligonucleotides, and the oligonucleotide of the same type is applied to each module:
  • a multiplex device is formed from the above-mentioned modules so that a liquid sample is supplied to the modules. Mentioned multiplex device is placed inside the hollow cartridge 10, the corresponding section of which is brought into contact with the analyzed liquid sample. After 40 minutes, the multiplex device is placed, as in Example 1, in the measuring cell of the device for detecting the number of magnetic particles near the readout zones 6, 7, 8 of the respective modules and the number of magnetic particles that are bound in each readout zone of the multiplex device is counted and according to calibration data determine the content of analytes - nucleic acid molecules in the sample.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к области биохимических анализов, и позволяет определять количественно концентрацию в образце нескольких аналитов одновременно. Способ и устройство для мультиплексного определения одновременно нескольких аналитов в жидком образце основаны на использовании модулей в виде иммунохроматографических тест-полосок и магнитных частиц в качестве детектируемых меток. На каждом модуле (тест-полоске) формируют, по крайней мере одну зону считывания, которую выполняют с возможностью взаимодействия с аналитом в образце и селективной (специфической) фиксации магнитных меток, конъюгированных с распознающими рецепторами. На основе набора модулей с пространственно разнесенными зонами считывания формируют мультиплексное устройство в картридже из материала, проницаемого для внешнего магнитного поля, который снабжен участком для обеспечения миграции образца вдоль всех модульных тест полосок. Считывание количества магнитных меток, оказавшихся специфически связанными на каждой из зон считывания мультиплексного устройства, проводится путем воздействия внешним зондирующим магнитным полем и регистрации индукционных сигналов отклика с помощью детектора магнитных частиц. На основе регистрации таких сигналов и калибровочных данных одновременно определяют концентрацию нескольких аналитов в образце. Технический результат состоит в обеспечении мультиплексности без ухудшения таких аналитических характеристик, как порог обнаружения, динамический диапазон и т.д.; в устранении повышенных требований к кросс-реактивности используемых реагентов для определяемого набора аналитов; в обеспечении простоты конструирования тест-системы для мультиплексного биохимического анализа под каждый конкретный набор аналитов, а также в обеспечении возможности мультиплексного анализа непрозрачных и/или сильно окрашенных сред.

Description

Способ мультиплексного анализа с помощью магнитных меток и устройство для его осуществления
Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к области биохимических анализов, и позволяет определять количественно или качественно наличие в образце нескольких аналитов одновременно.
Биохимические анализы широко применяются в различных областях человеческой деятельности, таких как медицина, ветеринария, контроль пищевой продукции и кормов, экологический мониторинг, наркоконтроль и т.д. Мультиплексность биохимических анализов, то есть способность одновременно детектировать несколько аналитов в одном образце, повышает скорость обнаружения, обеспечивает согласованные результаты и увеличивает достоверность, например медицинской диагностики, за счет детекции комбинации биомаркеров заболеваний вместо единичного показателя. Распространенным подходом к мультиплексированию является применение иммунохроматографических тест-полосок на основе оптических меток, таких как золотые наночастицы, окрашенные латексные частицы, квантовые точки и т.д. [Li J., Macdonald J. Multiplexed lateral flow biosensors: Technological advances for radically improving point-of-care diagnoses. Biosensors and Bioelectronics. 83 (2016) 177-192]. В иммунохроматографических аналитических системах на мембранную тест-полоску наносят реагенты, необходимые для выявления определяемого аналита; контакт тест-полоски с анализируемым жидким образцом инициирует протекание специфических взаимодействий в процессе миграции жидкости и метки с соответствующим рецептором через мембрану тест-полоски, специфическое связывание меток в заранее определенных зонах распознавания (тестовых линиях), на которые нанесены
соответствующие реагенты для обнаружения аналита. Результат анализа определяют путём считывания оптических меток с помощью приборов или визуально. Такие анализы
характеризуются простотой, быстротой проведения, минимальной трудоемкостью, высокой экономичностью, могут проводиться непосредственно рядом с пациентом или пользователем вне лабораторных условий.
Известен способ и устройство мультиплексирования на иммунохроматографической тест- полоске с применением оптических меток, в котором на одной стандартной тест-полоске располагают нескольких тестовых линий или зон распознавания [патент US 7,858,396].
Недостатками стандартного подхода применения нескольких тестовых линий (зон распознавания) на одной тест-полоске являются: неравные условия для распознающих рецепторов на разных тестовых линиях по отношению к мигрирующим образцу и меткам; повышенные требования к специфичности из-за кросс-реактивности биохимических реагентов; сниженная чувствительность мультиплексного анализа по сравнению с однопараметрическим определением аналита на тест- полосках с одной тестовой линией [Li J., Macdonald J. Multiplexed lateral flow biosensors:
Technological advances for radically improving point-of-care diagnoses. Biosensors and Bioelectronics. 83 (2016) 177-192].
Известен также способ и устройство мультиплексирования с помощью оптических меток, в котором зоны распознавания располагаются на одной тест-полоске в виде массива пятен или отдельных пятен по диагонали к направлению миграции жидкого образца [патент US 6, 100,099]. Недостатками этого способа являются искажение миграционных параметров жидкого образца на каждой из зон распознавания, а также взаимодействие только части жидкого образца с каждой зоной распознавания.
Общим недостатком способов, основанных на оптических метках, является считывание результата только с поверхности тест-полоски, при этом большая часть меток, находящихся в толще пористого материала тест-полоски, не учитывается даже при приборном считывании результата анализа. Кроме того, анализ такими способами непрозрачных или сильно окрашенных жидких сред затруднителен.
Использование магнитных частиц в качестве меток в иммунохроматографическом
иммуноанализе позволяет обойти указанные общие недостатки оптических способов, а также более предпочтительно для количественных анализов. В частности, известен
иммунохроматографический способ, реализованный в однопараметрическом устройстве [патент US 6,607,922], в котором суперпарамагнитные маркеры на тестовой линии
иммунохроматографической тест-полоски считываются детектирующей катушкой. Также известен однопараметрический способ магнитного иммунохроматографического теста [патент US 9,329,181 ], выбранный в качестве прототипа, в котором на тест-полоске формируют зону приема образца, зону считывания (тестовую линию) и используют подвижный объект, связанный с магнитными частицами; тест-полоску изготавливают из пористого материала, который позволяет жидкому образцу, аналитам и подвижному объекту перемещаться из зоны приема образца в направлении зоны считывания и через зону считывания; зону считывания на тест-полоске выполняют с возможностью взаимодействия с аналитом в жидком образце и селективной
(специфической) фиксации упомянутого подвижного объекта; воздействуют зондирующим (опрашивающим) магнитным полем на область вблизи зоны считывания упомянутой тест-полоски и регистрируют индукционный сигнал отклика, зависящий от количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на зоне считывания тест-полоски; используют упомянутый сигнал отклика для определения содержания аналита в образце, что совпадает с существенными признаками предлагаемого способа.
Однако, прототип способа имеет следующие недостатки. Прототип предназначен для однопараметрического анализа. Потенциальное расширение прототипа для реализации мультиплексных анализов с помощью известных подходов, например с использованием несколько тестовых линий (зон распознавания) на одной тест-полоске, приведет к недостаткам,
аналогичным обсуждавшимся выше:
- тестовые линии (зоны распознавания) будут находиться не в равных условиях по отношению к очередности взаимодействия с образцом и подвижным объектом с магнитными метками, что приведет к снижению аналитических характеристик теста на второй и последующих линиях;
- несколько тестовых линий на одной тест-полоске приведут к необходимости учета фактора кросс-реактпвности биохимических реагентов, что повысит требования к специфичности (селективности) используемых реагентов;
- отсутствие гибкости мультиплексного анализа по отношению к замене любого из целевых аналитов, т.е. замена даже одного из целевых аналитов практически приведет к необходимости разработки новой тест-полоски с несколькими тестовыми линиями;
- мультиплексность будет достигнута за счет падения чувствительности определения каждого отдельного аналита.
Таким образом, требуемый технический результат состоит в обеспечении
мультиплексное™ без ухудшения таких аналитических характеристик, как порог обнаружения, динамический диапазон и т. д.; в устранении повышенных требований к кросс-реактивности используемых реагентов для определяемого набора аналитов; в обеспечении простоты
конструирования тест-системы для мультиплексного биохимического анализа под каждый конкретный набор аналитов, а также обеспечении возможности мультиплексного анализа непрозрачных и/или сильно окрашенных сред.
Для преодоления указанных недостатков и достижения указанного технического результата предложен способ мультиплексного определения одновременно нескольких аналитов в жидком образце, состоящий в том, что анализ проводят с использованием модулей в виде иммунохроматографических тест-полосок и магнитных частиц в качестве детектируемых меток; на каждой из упомянутых тест-полосок формируют зону приема образца, по крайней мере одну зону считывания и используют подвижный объект, связанный с магнитными частицами; каждую из упомянутых тест-полосок изготавливают из пористого материала, который позволяет жидкому образцу, аналитам и подвижному объекту перемещаться из зоны приема образца в направлении зоны считывания и через зону считывания; зоны считывания на каждой из упомянутых тест- полосок выполняют с возможностью взаимодействия с разными аналитами в жидком образце и селективной (специфической) фиксации упомянутого подвижного объекта; в упомянутом способе формируют аналитическое мультиплексное устройство, в котором упомянутые модули (тест- полоски) ориентируют таким образом, что направления от зоны приема образца к зоне считывания тест-полосок приблизительно параллельны между собой; пространственно разносят положения каждой из зон считывания упомянутых тест-полосок вдоль приблизительно общего направления от зоны приема образца к зоне считывания; располагают упомянутое мультиплексное устройство внутри картриджа, который выполняют из материала, проницаемого для внешне генерируемого магнитного поля; упомянутый картридж снабжают по крайней мере одним участком для приема жидкого образца, который позволяет привести в контакт жидкий образец с зонами приема образца на тест-полосках упомянутого мультиплексного устройства; позиционируют упомянутый картридж в измерительной ячейке детектора количества магнитных частиц вблизи каждой из зон считывания тест-полосок упомянутого мультиплексного устройства; воздействуют зондирующим (опрашивающим) магнитным полем на область вблизи каждой из упомянутых зон считывания упомянутого мультиплексного устройства и регистрируют индукционные сигналы отклика, зависящие от количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на каждой зоне считывания тест-полосок упомянутого мультиплексного устройства; используют упомянутые сигналы отклика для определения содержания аналитов в образце.
Кроме того, упомянутые тест-полоски размещают в виде трехмерной структуры внутри картриджа, по крайней мере часть которого выполняют цилиндроподобной формы. Под цилиндроподобной понимается любая пространственная форма, имеющая постоянное сечение в плоскостях, перпендикулярных оси, совпадающей с приблизительно общим направления от зоны приема образца к зоне считывания, в частности, представляющая в поперечном сечении круг, овал, эллипс и тому подобные.
Кроме того, измерительную ячейку упомянутого детектора количества магнитных частиц выполняют в виде нескольких измерительных секций, каждая из которых регистрирует сигналы отклика, зависящие от количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на одной из зон считывания упомянутого мультиплексного устройства.
Кроме того, регистрируют временные задержки между сигналами отклика с упомянутых измерительных секций; значения величин упомянутых временных задержек используют для определения содержания аналитов с повышенной точностью.
Кроме того, регистрируют временные задержки между сигналами отклика с упомянутых измерительных секций; значения величин упомянутых временных задержек используют для определения содержания аналитов с повышеной точностью путем учета скорости перемещения упомянутых подвижных объектов на каждой из тест-полосок и контроля стабильности
упомянутого мультиплексного устройства.
Кроме того, регистрируют временные задержки между сигналами отклика с упомянутых измерительных секций; значения величин упомянутых временных задержек используют для определения содержания аналитов с повышеной точностью путем учета параметров миграции жидкого образца, таких как, например, вязкость, температура, наличие микродисперсных примесей и включений, через упомянутый пористый материал.
Кроме того, регистрируют динамику изменения во времени сигналов отклика с упомянутого детектора количества магнитных частиц; параметры упомянутой динамики изменения сигналов используют для определения содержания аналитов в образце с уменьшенной (сокращенной) продолжительностью. Тангенс угла наклона зависимости изменения сигналов отклика от времени зависит от концентрации аналитов, поэтому его можно использовать для быстрого определения концентрации аналита, не дожидаясь, пока сигнал отклика выйдет на приблизительно
стационарное значение.
Кроме того, пространственное положение картриджа относительно упомянутой
измерительной ячейки детектора количества магнитных частиц последовательно изменяют и регистрируют сигналы отклика в области вблизи каждой зоны считывания упомянутого мультиплексного устройства. В одном из вариантов способа достаточно иметь единственную измерительную ячейку упомянутого детектора, тогда положение мультиплексного устройства сканируют вдоль измерительной ячейки для последовательной регистрации сигналов отклика на каждой зоне считывания.
Кроме того, для каждой опрашиваемой зоны считывания упомянутого мультиплексного устройства определяют информационный сигнал, равный разности сигнала отклика вблизи опрашиваемой зоны считывания и сигнала отклика в области, удаленной по направлению к другой ближайшей зоне считывания на расстояние, приблизительно равное половине расстояния между опрашиваемой и другой ближайшей зоной считывания упомянутого мультиплексного устройства; упомянутый информационный сигнал используют для определения содержания аналитов в образце с применением калибровочных данных. Такая процедура позволяет учесть
неспецифически связавшиеся магнитные частицы в пористом материале.
Кроме того, пространственно разносят положения зон считывания упомянутого
мультиплексного устройства на расстояние, приблизительно равное от 3 мм до 15 мм.
Кроме того, определяют информационный сигнал, равный разности сигнала отклика вблизи опрашиваемой зоны считывания и сигнала отклика в области мультиплексного устройства, удаленной на расстояние, приблизительно равное от 1 ,5 мм до 6 мм; упомянутый
информационный сигнал используют для определения содержания аналитов в образце с применением калибровочных данных.
Кроме того, упомянутый картридж выполняют из оптически частично прозрачного материала или имеющим частично прозрачное окно, через которое инспектируют пространственное размещение упомянутых тест-полосок.
Кроме того, упомянутые несколько измерительных секций детектора количества магнитных частиц выполняют в виде индукционных катушечных систем, которые возбуждают зондирующее (опрашивающее) переменное магнитное поле в области вблизи каждой из упомянутых зон считывания мультиплексного устройства и регистрируют индукционные сигналы отклика упомянутых магнитных частиц; упомянутые индукционные катушечные системы соединяют с единым процессорным блоком упомянутого детектора количества магнитных частиц; упомянутый процессорный блок задает по крайней мере две частоты зондирующего переменного магнитного поля и выделяет из индукционного сигнала отклика спектральные компоненты на комбинаторных частотах зондирующего магнитного поля; упомянутые спектральные компоненты используют для определения количества магнитных частиц на каждой из упомянутых зон считывания
мультиплексного устройства и определения содержания аналитов в образце по калибровочным данным.
Кроме того, модульная тест-полоска может быть заламинирована материалом, по крайне мере частично проницаемым для внешне генерируемого магнитного поля, так, что зона приема образца может быть приведена в контакт с жидким образцом. Это позволяет более плотно размещать модули внутри картриджа.
Кроме того, каждую тест-полоску выполняют имеющей контрольную линию с нанесёнными лигандами для связывания с рецепторами (например, антителами, антигенами, синтетическими и натуральными белками, молекулами нуклеиновых кислот и тому подобных), размещёнными на упомянутом подвижном объекте; при этом пространственные положения контрольных линий тест- полосок приблизительно совпадают в плоскости, перпендикулярной упомянутому приблизительно общему направлению из зоны приема образца к зоне считывания. Это позволяет контролировать с наибольшей полнотой сохранность функциональных свойств используемых реагентов.
Кроме того, упомянутые тест-полоски выполняют с применением антител на упомянутых зонах считывания для мультиплексного определения ботулинических нейротоксинов нескольких серотипов (А, В, Е и F).
Кроме того, упомянутые тест-полоски выполняют с применением распознающих рецепторов (например антител, антигенов, натуральных или синтетических белков, пептидов, молекул нуклеиновых кислот, молекулярных отпечатков в полимерах и тому подобных) на упомянутых зонах считывания и определяют одновременно концентрации нескольких биомаркеров
заболеваний (например онкологических, кардиологических, инфекционных, желудочно- кишечных, аутоиммунных, аллергических и прочих); также по их значениям проводят
корреляционное сопоставление концентраций биомаркеров в одном образце при приблизительно одинаковых внешних условиях. Такая процедура мультиплексного анализа с корреляционным сопоставлением результатов, в частности, увеличивает надежность и быстроту выявления соответствующих заболеваний.
Кроме того, упомянутые тест-полоски выполняют с применением белковых коньюгатов гаптенов (таких как малые молекулы микотоксинов, лекарственных препаратов, антибиотиков, гармонов, витаминов, наркотиков, микроэлементов, синтетических и природных ядов и тому подобных малых молекул) для определения нескольких гаптенов (малых молекул) в конкурентных форматах иммуноанализа.
Кроме того, упомянутые тест-полоски выполняют с применением одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот с разными нуклеотидными последовательностями на упомянутых зонах считывания тест-полосок и определяют одновременно нескольких молекул, по крайней мере частично комплементарных к упомянутым молекулам нуклеиновых кислот. Подобный анализ может использоваться в сочетании с предварительным проведением полимеразной цепной реакции (ПЦР), в частности для сверхчувствительной диагностики инфекций.
Для иллюстрации изобретения на чертежах фиг. 1 -5 показан один из его возможных вариантов. Однако, представленные конкретные количества, способы, составы, характеристики и устройства не являются ограничением изобретения. Кроме того, приведенные чертежи выполнены не в масштабе.
Список фигур чертежей:
Фиг. 1. Схема модуля для аналитического мультиплексного устройства Фиг. 2. Схема аналитического мультиплексного устройства
Фиг. 3. Зависимость индукционного сигнала от концентрации ботулинического нейротоксина серотипа А при мультиплексном определении в образце одновременно трех нейротоксинов разных серотипов (А, В и Е).
Фиг. 4. Зависимость индукционного сигнала от концентрации ботулинического нейротоксина серотипа В при мультиплексном определении в образце одновременно трех нейротоксинов разных серотипов (А, В и Е).
Фиг. 5. Зависимость индукционного сигнала от концентрации ботулинического нейротоксина серотипа Е при мультиплексном определении в образце одновременно трех нейротоксинов разных серотипов (А, В и Е).
На фиг. 1 -5 показан пример реализации способа мультиплексного
иммунохроматографического анализа с помощью магнитных меток, состоящего из следующих элементов: 1 - зона приема образца; 2 - зона размещения подвижных объектов, связанных с магнитными частицами; 3 - пористый материал, например, нитроцеллюлозная мембрана; 4 - адгезивная подложка; 5 - адсорбирующий материал; 6, 7 и 8 - зоны считывания на разных модулях; 9 - контрольная линия; 10 - картридж; 1 1 - дозатор; 12 - жидкий образец; 13 - процессорный блок детектора количества магнитных частиц; 14, 15, 16, 17 - измерительные секции, составляющие измерительную ячейку детектора количества магнитных частиц; 1 8 - блок отображения результатов определения аналитов; 19 и 20 - функциональные связи; 21 , 22, 23 - результаты определения аналитов, полученные на каждой зоне считывания; 24 - результат регистрации магнитных частиц на контрольной линии модулей (тест-полосок); 25 - схематичное представление процесса сборки модулей в аналитическое мультиплексное устройство.
Пунктирными линиями в верхней части рисунка схематично показаны пространственные положения зон считывания и контрольной линии внутри картриджа, а стрелки внизу рисунка схематично показывают соответствие результатов определения аналитов 21 , 22, 23 измерительным секциям 14, 15, 16 детектора количества магнитных частиц, а также результат регистрации магнитных частиц на контрольной линии 24 измерительной секции 17 детектора.
На фиг. 3 - 5 жирной пунктирной горизонтальной линией показано значение суммы сигнала отрицательного контроля (при отсутствии детектируемого аналита в образце) и удвоенного стандартного отклонения сигналов отклика.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
Изготавливают модули в виде иммунохроматографических тест-полосок; каждый модуль предназначен для определения в образце по крайней мере одного из детектируемых аналитов. Для изготовления модуля на адгезивной подложке 4 (фиг. 1 ) закрепляют пористый материал 3 и формируют зону приема образца 1 , а также зону размещения подвижных объектов, связанных с магнитными частицами 2. В предпочтительной реализации на зону 2 наносят конъюгаты магнитных частиц с рецепторами, такими как антитела, антигены или конъюгаты на их основе, или одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, к тем аналитам, для детекции которых предназначен данный модуль. На пористом материале 3 формируют зону считывания 6 (фиг. 1 ) путем нанесения распознающих агентов, позволяющих определять аналит. Так, для определения белковых молекул в сэндвич-формате на зону считывания 6 наносят антитела к определяемому аналиту; для определения в конкурентном формате малых молекул (гаптенов), имеющих один антигенный эпитоп, на зону 6 наносят конъюгат гаптена (или его эмулятора) с белковой молекулой; для определения молекул нуклеиновых кислот на зону 6 наносят молекулы с соответствующей последовательностью нуклеиновых кислот; или иные распознающие агенты, широко известные из уровня техники [Li J., Macdonald J. Multiplexed lateral flow biosensors:
Technological advances for radically improving point-of-care diagnoses. Biosensors and Bioelectronics. 83 (2016) 1 77-192]. В одном из вариантов способа на пористом материале 3 формируют также контрольную линию 9 путем нанесения лигандов для связывания с рецепторами, размещёнными на упомянутом подвижном объекте с магнитными частицами. Из изготовленных таким образом модулей (тест-полосок) формируют, как описано выше, мультиплексное устройство, причем зоны считывания у модулей (тест-полосок), предназначенных для определения разных аналитов, пространственно разнесены вдоль приблизительно общего направления от зоны приема образца к зоне считывания (позиции 6, 7 и 8 на фиг. 2).
С помощью дозатора, например пипетки, или другим способом наносят исследуемый образец на участок для приема жидкого образца картриджа 10, за счет чего инициируется протекание специфических взаимодействий в процессе миграции магнитных частиц с рецепторами и жидкости вдоль пористого материала (мембраны) тест-полоски. В сэндвич-формате в случае присутствия в образце определяемых аналитов происходит связывание магнитных частиц в соответствующих зонах считывания мультиплексного устройства. В конкурентном формате в случае отсутствия в образце определяемых аналитов происходит связывание магнитных частиц в соответствующих зонах считывания, а по мере увеличения концентрации гаптенов в образце специфическое связывание магнитных частиц уменьшается.
Для считывания результатов анализа размещают мультиплексное устройство в измерительной ячейке детектора количества магнитных частиц так, чтобы измерительные секции 14, 15, 16, 17 находились вблизи зон считывания 6, 7, 8 и контрольных полос 9 модулей, входящих в мультиплексное устройство. С помощью процессорного блока 13 устройства определения количества магнитных частиц воздействуют на ближайшую окрестность каждой из зон считывания опрашивающим магнитным полем, после чего регистрируют индукционные сигналы отклика 21 , 22, 23, 24, зависящие от количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на каждой зоне считывания. Такими индукционными сигналами могут служить, например, спектральные компоненты на комбинаторных частотах зондирующего переменного магнитного поля, имеющего две частоты, упомянутые спектральные компоненты возникают за счет нелинейного перемагничивания магнитных наночастиц и используются для определения количества магнитных частиц [A.V. Orlov, V.A. Bragina, М.Р. Nikitin, P.I. Nikitin. Rapid dry-reagent immunomagnetic biosensing platform based on volumetric detection of nanoparticles on 3D structures. Biosensors and Bioelectronics. 79 (2016) 423-429].)]. Для регистрации упомянутых индукционных сигналов могут быть использованы датчики Холла [патент US 6,518,747], феррозондовые магнетометры или другие известных датчики магнитного поля, например на основе гигантского магнитного сопротивления или импеданса. По данным сигналов отклика магнитных частиц с помощью упомянутого процессорного блока 13 определяется содержание аналита в образце, а результаты отображаются на блоке отображения результатов определения аналитов 18.
Реализация совокупности указанных признаков способа позволила достичь указанный выше технический результат, а именно:
- мультиплексный анализ реализуется без ухудшения основных аналитических характеристик, таких как порог обнаружения, динамический диапазон и т. д. по сравнению с
однопараметрическим определением аналита на тест-полосках с одной тестовой линией;
- не предъявляется повышенных требований к кросс-реактивности используемых реагентов, в частности, из-за того, что миграция образца разнесена в трехмерном пространстве и
осуществляется по разным тест-полоскам;
- обеспечивается простота конструирования тест-системы для мультиплексного
биохимического анализа под каждый конкретный набор аналитов, поскольку реализуется возможность составлять мультиплексное устройство из заранее приготовленных модулей - тест- полосок с разным пространственным положением зон считывания,
- обеспечивается возможность мультиплексного анализа непрозрачных и/или сильно окрашенных сред.
Более того, неожиданно обнаружилось, что в сигнал отклика от любой зоны распознавания не вносят существенного вклада фоновые сигналы неспецифически связанных магнитных частиц на остальных модулях. Еще более интересным оказался факт, что фоновым сигналом можно пренебречь, если в качестве информационного сигнала для определения концентрации аналита принимать разность сигнала отклика вблизи опрашиваемой зоны считывания и сигнала отклика в области, удаленной по направлению к другой ближайшей зоне считывания на расстояние /, где / - либо половина расстояния между опрашиваемой и другой ближайшей зоной считывания, либо лежит в диапазоне от 1 ,5 до 6 мм. Это удешевляет и упрощает устройство, реализующее данный способ, при сохранении высокой точности количественного определения концентрации каждого аналита в жидком образце.
Указанный выше аналог [патент US 6,607,922] является и аналогом предлагаемого
устройства. Недостатки известного устройства аналогичны вышеуказанным недостаткам соответствующего способа.
Указанный выше прототип [патент US 9,329,181 ], выбран и в качестве прототипа
предлагаемого устройства, в котором тест-полоска имеет зону приема образца, зону считывания и подвижный объект, связанный с магнитными частицами; тест-полоска изготовлена из пористого материала, который позволяет жидкому образцу, аналиту и подвижному объекту перемещаться из зоны приема образца в направлении зоны считывания и через зону считывания; зона считывания тест-полоски выполнена с возможностью взаимодействия с аналитом в жидком образце и селективной (специфической) фиксации упомянутого подвижного объекта; тест-полоска расположена внутри картриджа, который выполнен из материала, по крайней мере, частично проницаемого для внешне генерируемого магнитного поля; упомянутый картридж имеет, по крайней мере, один участок для приема жидкого образца, который позволяет привести в контакт жидкий образец с зоной приема образца упомянутой тест-полоски,
что совпадает с существенными признаками предлагаемого устройства.
Однако, прототип устройства имеет следующие недостатки. Прототип предназначен для однопараметрического анализа. Потенциальное расширение прототипа для мультиплексных анализов с помощью известных подходов, например с использованием несколько тестовых линий на одной тест-полоске, приведет к недостаткам, аналогичным обсуждавшимся выше:
- тестовые линии (зоны распознавания) будут находиться не в равных условиях по
отношению к очередности взаимодействия с образцом и подвижным объектом с магнитными метками, что приведет к снижению аналитических характеристик теста на второй и последующих линиях;
- несколько тестовых линий на одной тест-полоске приведут к необходимости учета фактора кросс-реактивности биохимических реагентов, что повысит требования к специфичности (селективности) используемых реагентов;
- будет отсутствовать гибкость мультиплексного анализа по отношению к замене любого из целевых аналитов, т.е. замена даже одного из целевых аналитов практически приведет к необходимости разработки новой тест-полоски с несколькими тестовыми линиями;
- мультиплексность будет достигаться за счет падения чувствительности определения каждого отдельного аналита.
Для преодоления указанных недостатков предложено устройство для мультиплексного определения нескольких аналитов в жидком образце, состоящее из модулей в виде
иммунохроматографических тест-полосок; каждая из упомянутых тест-полосок имеет зону приема образца, по крайней мере одну зону считывания и подвижный объект, связанный с магнитными частицами; каждая из упомянутых тест-полосок изготовлена из пористого материала, который позволяет жидкому образцу, аналитам и подвижному объекту перемещаться из зоны приема образца в направлении зоны считывания и через зону считывания; зоны считывания упомянутых тест-полосок выполнены с возможностью взаимодействия с разными аналитами в жидком образце и селективной (специфической) фиксации упомянутого подвижного объекта, в котором упомянутые тест-полоски ориентированы таким образом, что направления от зоны приема образца к зоне считывания тест-полосок приблизительно параллельны между собой; пространственные положения каждой из зон считывания упомянутых тест-полосок разнесены вдоль приблизительно общего направления от зоны приема образца к зоне считывания; упомянутые тест-полоски расположены внутри картриджа, который выполнен из материала, по крайней мере частично проницаемого для внешне генерируемого магнитного поля; упомянутый картридж имеет по крайней мере один участок для приема жидкого образца, который позволяет привести в контакт жидкий образец с зонами приема образца упомянутых тест-полосок.
Кроме того, упомянутый картридж имеет пространственную конфигурацию, позволяющую воздействовать внешним зондирующим (опрашивающим) магнитным полем на области вблизи каждой из упомянутых зон считывания тест-полосок и регистрировать индукционные сигналы отклика, зависящие от количества магнитных частиц на каждой зоне считывания тест-полосок.
Кроме того, упомянутый картридж выполнен из оптически частично прозрачного материала или имеет частично прозрачное окно, позволяющее инспектировать пространственное размещение упомянутых тест-полосок.
Кроме того, упомянутый картридж вблизи упомянутых зон считывания имеет наибольший размер d в поперечном сечении, перпендикулярном упомянутому приблизительно общему направлению от зоны приема образца к зоне считывания тест-полосок, в диапазоне от примерно 3 мм до примерно 15 мм.
Кроме того, положения зон считывания упомянутых тест-полосок пространственно разнесены друг от друга вдоль упомянутого направления от зоны приема образца к зоне считывания тест- полосок на расстояния, приблизительно равные от половины величины упомянутого размера картриджа d/2 до величины 2d.
Кроме того, положения зон считывания упомянутых тест-полосок пространственно разнесены друг от друга вдоль упомянутого приблизительно общего направления от зоны приема образца к зоне считывания тест-полосок на расстояния в диапазоне от примерно 3 мм до примерно 12 мм.
Кроме того, упомянутые тест-полоски пространственно размещены в виде трехмерной структуры внутри картриджа, который имеет участок цилиндроподобной формы. Под
цилиндроподобной понимается любая пространственная форма, имеющая постоянное сечение в плоскостях, перпендикулярны оси, совпадающей с приблизительно общим направления от зоны приема образца к зоне считывания, в частности, представляющая в поперечном сечении круг, овал, эллипс и тому подобные.
Кроме того, каждая тест-полоска имеет контрольную линию с нанесёнными лигандами для связывания с рецепторами, размещёнными на упомянутом подвижном объекте; при этом пространственные положения контрольных линий тест-полосок приблизительно совпадают в плоскости, перпендикулярной упомянутому приблизительно общему направлению из зоны приема образца к зоне считывания.
Кроме того, упомянутые тест-полоски выполнены с применением антител на упомянутых зонах считывания для мультиплексного определения ботулинических нейротоксинов нескольких серотипов (А, В, Е и F).
Кроме того, упомянутые тест-полоски выполнены с применением распознающих рецепторов (например антител, молекул антигенов, натуральных или синтетических белков, пептидов, нуклеиновых кислот, молекулярных отпечатков в полимерах) на упомянутых зонах считывания для одновременного определения концентрации нескольких биомаркеров заболеваний (например онкологических, кардиологических, инфекционных, желудочно-кишечных, аутоиммунных, аллергических) и с возможностью корреляционного сопоставления значений концентраций биомаркеров в одном образце при приблизительно одинаковых внешних условиях.
Кроме того, упомянутые тест-полоски выполнены с применением белковых коньюгатов гаптенов (таких как малые молекулы микотоксинов, лекарственных препаратов, антибиотиков, гармонов, витаминов, наркотиков, микроэлементов, синтетических и природных ядов и тому подобных малых молекул) для определения нескольких гаптенов (малых молекул) в конкурентных форматах иммуноанализа.
Кроме того, упомянутые тест-полоски выполнены с применением одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот (олигонуклеотидов) с разными нуклеотидными последовательностями на упомянутых зонах считывания тест-полосок для одновременного определения нескольких молекул, по крайней мере частично комплементарных к упомянутым молекулам нуклеиновых кислот.
Кроме того, для более плотного размещения внутри картриджа модуль может быть заламинирован материалом, проницаемым для внешне генерируемого магнитного поля, так, чтобы зона приема образца могла быть приведена в контакт с жидким образцом. Это позволяет более плотно размещать модули внутри картриджа.
Предлагаемое устройство изготавливают следующим образом.
Изготавливают модули в виде иммунохроматографических тест-полосок; каждый модуль предназначен для определения в образце по крайней мере одного из детектируемых аналитов. Для изготовления модуля на адгезивной подложке 4 закрепляют пористый материал 3 и формируют зону приема образца 1 , а также зону размещения подвижных объектов, связанных с магнитными частицами 2. В предпочтительной реализации на зону 2 наносят конъюгаты магнитных частиц с рецепторами, такими как антитела, антигены или конъюгаты на их основе, или одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот к тем аналитам, или антителам к ним, для детекции которых предназначен данный модуль. На пористом материале 3 формируют зону считывания 6 (фиг. 1 ) путем нанесения распознающих агентов, позволяющих определять аналит. Так, для определения белковых молекул в сэндвич-формате на зону считывания 6 наносят антитела к определяемому аналиту; для определения в конкурентном формате малых молекул (гаптенов), имеющих один антигенный эпитоп, на зону 6 наносят конъюгат гаптена (или его эмулятора) с белковой молекулой; для определения молекул нуклеиновых кислот на зону 6 наносят молекулы с соответствующей последовательностью нуклеиновых кислот; или иные распознающие агенты, широко известные из уровня техники [Li J., Macdonald J. Multiplexed lateral flow biosensors:
Technological advances for radically improving point-of-care diagnoses. Biosensors and Bioelectronics. 83 (2016) 177-192]. В одном из вариантов способа на пористом материале 3 формируют также контрольную линию 9 путем нанесения лигандов для связывания с рецепторами, размещёнными на упомянутом подвижном объекте с магнитными частицами. Схематичное представление процесса сборки модулей в аналитическое мультиплексное устройство показано на фиг. 2 ( позиция 25). У сформированного, как описано выше, мультиплексного устройства зоны считывания модулей (тест-полосок), предназначенных для определения разных аналитов, пространственно разнесены вдоль приблизительно общего направления от зоны приема образца к зоне считывания (позиции 6, 7 и 8 на фиг. 2).
Устройство применяется следующим образом: с помощью пипетки или другим способом наносят исследуемый образец на участок для приема жидкого образца картриджа 10, за счет чего инициируется протекание специфических взаимодействий в процессе миграции магнитных частиц с рецепторами и жидкости вдоль пористого материала (мембраны) тест-полоски. В сэндвич- формате в случае присутствия в образце определяемых аналитов происходит связывание магнитных частиц в соответствующих зонах считывания мультиплексного устройства. В конкурентном формате в случае отсутствия в образце определяемых аналитов происходит связывание магнитных частиц в соответствующих зонах считывания, а по мере увеличения концентрации гаптенов в образце специфическое связывание магнитных частиц уменьшается.
Считывание результатов анализа с предлагаемого мультиплексного устройства осуществяется как указано выше при описании соответствующего способа.
Реализация совокупности указанных признаков устройства позволила достичь указанный выше технический результат, а именно:
- устройство позволяет проводить мультиплексносный анализ без ухудшения основных аналитических характеристик, таких как порог обнаружения, динамический диапазон и т. д. по сравнению с однопараметрическим определением аналита на тест-полосках с одной тестовой линией;
- для изготовления устройства не предъявляются повышенные требования к кросс- реактивности используемых реагентов для определяемого набора аналитов, в частности, из-за того, что миграция образца осуществляется по разным пространственно разнесенным модулям;
- устройство обеспечивает простоту и гибкость конструирования мультиплексных тест-систем путем сборки заранее приготовленных модулей с ранесенными в пространстве зонами
распознавания (тестовыми линиями) для определения в образце требуемого набора аналитов;
- устройство удешевляет и упрощает анализ нескольких аналитов одновременно, в том числе, в непрозрачных и/или сильно окрашенных средах;
- устройство позволяет осуществлять мультиплексный анализ, в том числе, в полевых условиях или вблизи пациента (так называемая point-of-care диагностика).
Примечательным является факт, что при регистрации индукционных сигналов с зон распознавания указанного устройства вклад фоновых сигналов неспецифически связанных магнитных частиц на остальных модулях незначителен. Более того, фоновым сигналом можно вообще пренебречь, если устройство опрашивается внешним детектором количества магнитных частиц с формированием информационного сигнала, равного разности сигнала отклика вблизи опрашиваемой зоны считывания и сигнала отклика в области, удаленной по направлению к другой ближайшей зоне считывания на расстояние /, равное минимуму из двух величин: 1 ) половина расстояния между опрашиваемой и другой ближайшей зоной считывания, 2) диапазон от 1 ,5 до 6 мм. Это позволяет обеспечить высокую точность количественного определения концентрации каждого аналита с помощью предлагаемого мультиплексного устройства с применением калибровочных данных, а также существенно сократить продолжительность определения концентраций нескольких аналитов за счет предложенного синергетического подхода.
Проведенные эксперименты подтвердили работоспособность указанных объектов
изобретения - способа и устройства для мультиплексного определения одновременно нескольких аналитов в жидком образце.
Пример 1. Мультиплексный анализ содержания в жидком образце ботулинических
нейротоксинов разных серотипов (А, В и Е)
Изготавливают три модуля в виде иммунохроматографических тест-полосок, использующих магнитные частицы в качестве меток; каждый из модулей предназначен для определения одного из ботулинических нейротоксинов типов А, В и Е. Каждая тест-полоска имеет ширину 3 мм, в качестве пористого материала 3 используется нитроцеллюлозная мембрана. На зону 2 размещения подвижных объектов, связанных с магнитными частицами, каждой из тест-полосок наносят конъюгат 200-нм магнитных частиц Estapor (Merck Millipore, Германия) с антителами к тому серотипу ботулинического нейротоксина, для детекции которого она предназначена. Для формирования зон считывания 6, 7 и 8 на расстоянии 14 мм, 22 мм и 30 мм от переднего края нитроцеллюлозной мембраны наносят антитела к ботулиническим нейротоксинам серотипов А, В и Е, соответственно. Из полученных трех модулей формируют мультиплексное устройство так, чтобы обеспечивалась подача жидкого образца вдоль модулей. Затем мультиплексное устройство располагают внутри полого цилиндрического картриджа 1 0 длиной 95 мм и внутренним диаметром 4,5 мм, выполненного из полиэтилена.
Анализируемый жидкий образец 12 объемом 180 мкл, содержащий ботулинические нейротоксины серотипов А, В и Е, наносят на участок картриджа для приведения в контакт с зонами приема образца 1 на модулях мультиплексного устройства. Через приблизительно 25 мин мультиплексное устройство помещают в измерительную ячейку устройства детекции количества магнитных частиц вблизи зон считывания 6, 7, 8 модулей. С помощью измерительных секций 14, 1 5, 16, составляющих измерительную ячейку детектора количества магнитных частиц, регистрируют индукционные сигналы отклика, зависящие от количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на каждой зоне считывания модулей (тест-полосок) упомянутого мультиплексного устройства. Для регистрации магнитных меток используют метод определения количества магнитных частиц по их нелинейному перемагничиванию [A.V. Orlov, V.A. Bragina, М.Р. Nikitin, P.I. Nikitin. Rapid dry-reagent immunomagnetic biosensing platform based on volumetric detection of nanoparticles on 3D structures. Biosensors and Bioelectronics. 79 (2016) 423-429].
На фиг. 3, фиг. 4, фиг. 5. представлены зависимости зарегистрированных индукционных сигналов отклика от концентрации ботулинических нейротоксинов серотипов А, В и Е, соответственно, при проведении мультиплексного тестирования образцов с разным содержанием ботулинических нейротоксинов. На фиг. 3 - 5 жирной пунктирной горизонтальной линией показан уровень сигнала, равный сумме сигнала отрицательного контроля (при отсутствии детектируемого аналита в образце) и соответствующего удвоенного стандартного отклонения сигналов отклика, который обычно используется для определения предела детекции аналита [A.V. Orlov, V.A. Bragina, М.Р. Nikitin, P.I. Nikitin. Rapid dry-reagent immunomagnetic biosensing platform based on volumetric detection of nanoparticles on 3D structures. Biosensors and Bioelectronics. 79 (2016) 423- 429].
Определенные по данным зависимостям пределы детекции составили 0.14, 0.12 и 0.30 нг/мл для ботулинических нейротоксинов серотипов А, В и Е, соответственно, а динамический диапазон количественного измерения концентрации составил 3 порядка.
Пример 2. Мультиплексный анализа содержания в жидком образце поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к нему и антител к ядерному антигену вируса
Мультиплексный анализа наличия как антигена вируса гепатита В, так и антител к его фрагментам необходим для более точной медицинской диагностики: различные сочетания результатов этих анализов позволяют эффективно определять фазу заболевания пациента, оценивать активность вируса, а также обнаруживать наличие инфекции в прошлом. Изготавливают три модуля в виде иммунохроматографических тест-полосок: модуль А) - для детекции поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) с нанесенным на зону 2 конъюгатом магнитных частиц с поликлональными антителами к HBsAg; модуль Б) - для детекции антител к HBsAg с нанесенным на зону 2 фрагментом HBsAg; модуль В) - для детекции антител к ядерному антигену вируса (HBcAg) с нанесенным на зону 2 фрагментом HBcAg. Для приготовления конъюгатов используют 50-нм магнитные частицы, синтезированные по методике, изложенной в [М.Р. Nikitin, V.O. Shipunova, S.M. Deyev and P.I. Nikitin. Biocomputing based on particle disassembly. Nature Nanotechnology. Vol. 9 (2014) pp. 716-722]. Для формирования зон считывания 6, 7, 8 на расстоянии 14 мм, 22 мм и 30 мм от переднего края нитроцеллюлозной мембраны наносят: для модуля А) - поликлональные антитела к HBsAg; для модуля Б) - фрагмент HBsAg; для модуля В) - фрагмент HBcAg. Из полученных трех модулей формируют мультиплексное устройство так, чтобы обеспечивалась подача жидкого образца вдоль модулей, и располагают его внутри цилиндрического картриджа 10, выполненного из полиэтилена. Участок картриджа для приема жидкого образца погружают в емкость, содержащую анализируемый образец. Через 30 мин мультиплексное устройство помещают, как и в Примере 1 , в измерительную ячейку устройства детекции количества магнитных частиц вблизи зон считывания 6, 7, 8 модулей. С помощью измерительных секций 14, 15, 16, составляющих измерительную ячейку детектора количества магнитных частиц, регистрируют индукционные сигналы отклика, зависящие от количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на каждой зоне считывания модулей (тест-полосок) упомянутого мультиплексного устройства. Для регистрации магнитных меток используют метод определения количества магнитных частиц по их нелинейному перемагничиванию [A.V. Orlov, V.A. Bragina, М.Р. Nikitin, P.I. Nikitin. Rapid dry-reagent immunomagnetic biosensing platform based on volumetric detection of nanoparticles on 3D structures. Biosensors and Bioelectronics. 79 (2016) 423-429].
По калибровочным данным определяют концентрацию аналитов в образце и проводят корреляционное сопоставление значений концентраций аналитов в одном образце при приблизительно одинаковых внешних условиях, которое используют для повышения надежности и быстроты постановки диагноза или определения фазы инфекционного заболевания.
Пример 3. Мультиплексный анализа содержания в жидком образце охратоксина А, зеараленона и афлатоксина В 1
Изготавливают три модуля в виде иммунохроматографических тест-полосок, использующих магнитные частицы в качестве меток; каждый из модулей предназначен для определения одного из гаптенов: охратоксина А, зеараленона и афлатоксина В1 . На зону 2 размещения подвижных объектов, связанных с магнитными частицами, каждой из тест-полосок наносят конъюгат 200-нм магнитных частиц Estapor (Merck Millipore, Германия) с антителами к тому гаптену, для детекции которого она предназначена. Из полученных трех модулей формируют мультиплексное устройство так, чтобы обеспечивалось подача жидкого образца вдоль модулей. Для формирования зон считывания на расстоянии 14 мм, 22 мм и 30 мм от переднего края нитроцеллюлозной мембраны наносят соответственно: конъюгаты бычьего сывороточного альбумина с охратоксином А или зеараленоном или афлатоксином В1. Затем мультиплексное устройство располагают внутри полого картриджа, соответствующий участок которого для приведения в контакт с зонами приема образца 1 на модулях мультиплексного устройства погружают в емкость, содержащую анализируемый образец. Через 10 мин мультиплексное устройство помещают, как в Примере 1 , в измерительную ячейку детектора количества магнитных частиц вблизи зон считывания 6, 7, 8 модулей и подсчитывают количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на каждой зоне считывания мультиплексного устройства. По калибровочным данным определяют концентрацию каждого из анализируемых гаптенов для конкурентного формата иммуноанализа.
Пример 4. Мультиплексный анализ содержания пяти различных одноцепочечных
ол игону кл еотидов
Изготавливают пять модулей в виде иммунохроматографических тест-полосок, каждый из модулей предназначен для определения одного из пяти различных молекул нуклеиновых кислот (олигонуклеотидов):
модуль А) - для определения 5'-AUGACCUAUGAAUUAACAGAC-3';
модуль Б) - для определения 5'-CATCAAGAGCCATGCCTGATAGAACTGTTCCGGC-3';
модуль В) - для определения 5'-TACGAGTTGAGAATCCTGAATGCG-3';
модуль Г) - для определения 5'-CGCGGTCTCAGGATATTTTTTTTGGATAGATGGTACGA-3'; модуль Д) - для определения 5'-AGACCATCCTGGCTAGTCTGTTGTCTCTACTAAAAATA-3'.
Для приготовления конъюгатов используют 100-нм магнитные частицы, синтезированные по методике, изложенной в [М.Р. Nikitin, V.O. Shipunova, S.M. Deyev and P.l. Nikitin. Biocomputing based on particle disassembly. Nature Nanotechnology. Vol. 9, pp. 716-722 (2014)]. На зону 2 размещения подвижных объектов каждой из тест-полосок наносят соответствующий конъюгат магнитных частиц с олигонуклеотидами, частично комплементарными к определяемым, а именно: для модуля А) на магнитные частицы наносят 5'-GTCTGTCAA-3' ;
для модуля Б) на магнитные частицы наносят 5'-GCCGGAACAGTTC-3 ' ;
для модуля В) на магнитные частицы наносят 5'-TCTCAACTCGTA-3';
для модуля Г) на магнитные частицы наносят 5'-TATCCTGAGACCGCGTTTTTTTTTT-3' ;
для модуля Д) на частицы наносят - 5'-GGGGTTTCACCGTGTTAGCCAGGATGGTCT-3'.
Для формирования зон считывания 6, 7, 8 на расстоянии 10 мм, 15 мм, 20 мм, 25 мм, 30 мм от переднего края нитроцеллюлозной мембраны наносят олигонуклеотиды, частично комплементарные к другим участкам определяемых олигонуклеотидов, причем на каждый модуль наносится олигонуклеотид одного типа:
на модуль А) наносят 5 -ATAGGTCAT-3';
на модуль Б) наносят 5 '-ТАТС AGGC ATGGCTCTTG ATG-3 ' ;
на модуль В) наносят 5'-CGCATTCAGGAT-3';
на модуль Г) наносят 5'-TCGTACCATCTATCC-3';
на модуль Д) наносят 5'-CGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGAC-3'.
Из упомянутых модулей формируют мультиплексное устройство так, чтобы обеспечивалась подача жидкого образца к модулям. Упомянутое мультиплексное устройство располагают внутри полого картриджа 10, соответствующий участок которого приводят в контакт с анализируемым жидким образцом. Через 40 мин мультиплексное устройство помещают, как и в Примере 1 , в измерительную ячейку устройства детекции количества магнитных частиц вблизи зон считывания 6, 7, 8 соответствующих модулей и подсчитывают количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на каждой зоне считывания мультиплексного устройства, и по калибровочным данным определяют содержания аналитов - молекул нуклеиновых кислот в образце.
Подобный анализ в сочетании с предварительным проведением полимеразной цепной реакции, позволяет реализовать сверхчувствительную регистрацию инфекционных патогенов или диагностику инфекционных заболеваний.

Claims

Формула изобретения
1 . Способ мультиплексного определения одновременно нескольких аналитов в жидком образце, состоящий в том, что анализ проводят с использованием модулей в виде
иммунохроматографических тест-полосок и магнитных частиц в качестве детектируемых меток; на каждой из упомянутых тест-полосок формируют зону приема образца, по крайней мере одну зону считывания и используют подвижный объект, связанный с магнитными частицами; каждую из упомянутых тест-полосок изготавливают из пористого материала, который позволяет жидкому образцу, аналитам и подвижному объекту перемещаться из зоны приема образца в направлении зоны считывания и через зону считывания;
зоны считывания на каждой из упомянутых тест-полосок выполняют с возможностью взаимодействия с разными аналитами в жидком образце и селективной (специфической) фиксации упомянутого подвижного объекта,
отличающийся тем, что
формируют аналитическое мультиплексное устройство, в котором упомянутые тест-полоски ориентируют таким образом, чтобы направления от зоны приема образца к зоне считывания тест- полосок были приблизительно параллельны между собой;
пространственно разносят положения каждой из зон считывания упомянутых тест-полосок вдоль приблизительно общего направления от зоны приема образца к зоне считывания;
располагают упомянутое мультиплексное устройство внутри картриджа, который выполняют из материала, проницаемого для внешне генерируемого магнитного поля;
упомянутый картридж снабжают по крайней мере одним участком для приема жидкого образца, который позволяет привести в контакт жидкий образец с зонами приема образца на тест- полосках упомянутого мультиплексного устройства;
позиционируют упомянутый картридж в измерительной ячейке детектора количества магнитных частиц вблизи каждой из зон считывания тест-полосок упомянутого мультиплексного устройства;
воздействуют зондирующим (опрашивающим) магнитным полем на область вблизи каждой из упомянутых зон считывания упомянутого мультиплексного устройства и регистрируют индукционные сигналы отклика, зависящие от количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на каждой зоне считывания тест-полосок упомянутого мультиплексного устройства; используют упомянутые сигналы отклика для определения содержания аналитов в образце.
2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что упомянутые тест-полоски размещают в виде трехмерной структуры внутри картриджа, по крайней мере часть которого выполняют
цилиндроподобной формы.
3. Способ по п.1 , отличающийся тем, что измерительную ячейку упомянутого детектора количества магнитных частиц выполняют в виде нескольких измерительных секций, каждая из которых регистрирует сигналы отклика, зависящие от количества магнитных частиц, оказавшихся связанными на одной из зон считывания упомянутого мультиплексного устройства.
4. Способ по п.З, отличающийся тем, что регистрируют временные задержки между сигналами отклика с упомянутых измерительных секций; значения величин упомянутых временных задержек используют для определения содержания аналитов с повышенной точностью.
5. Способ по п.З, отличающийся тем, что регистрируют временные задержки между сигналами отклика с упомянутых измерительных секций; значения величин упомянутых временных задержек используют для определения содержания аналитов с повышенной точностью путем учета скорости перемещения упомянутых подвижных объектов на каждой из тест-полосок и контроля стабильности упомянутого мультиплексного устройства.
6. Способ по п.З, отличающийся тем, что регистрируют временные задержки между сигналами отклика с упомянутых измерительных секций; значения величин упомянутых временных задержек используют для определения содержания аналитов с повышенной точностью путем учета параметров миграции жидкого образца (вязкости, температуры, наличия
микродисперсных примесей и включений) через упомянутый пористый материал.
7. Способ по п.1 , отличающийся тем, что регистрируют динамику изменения во времени сигналов отклика с упомянутого детектора количества магнитных частиц; параметры упомянутой динамики изменения сигналов используют для определения содержания аналитов в образце с уменьшенной (сокращенной) продолжительностью.
8. Способ по п.1 , отличающийся тем, что пространственное положение картриджа
относительно упомянутой измерительной ячейки детектора количества магнитных частиц последовательно изменяют и регистрируют сигналы отклика в области вблизи каждой зоны считывания упомянутого мультиплексного устройства.
9. Способ по п.1 , отличающийся тем, что для каждой опрашиваемой зоны считывания упомянутого мультиплексного устройства определяют информационный сигнал, равный разности сигнала отклика вблизи опрашиваемой зоны считывания и сигнала отклика в области, удаленной по направлению к другой ближайшей зоне считывания на расстояние, приблизительно равное половине расстояния между опрашиваемой и другой ближайшей зоной считывания упомянутого мультиплексного устройства; упомянутый информационный сигнал используют для определения содержания аналитов в образце с применением калибровочных данных.
10. Способ по п.1 , отличающийся тем, что пространственно разносят положения зон считывания упомянутого мультиплексного устройства на расстояние, приблизительно равное от 3 мм до 15 мм.
1 1. Способ по п.10, отличающийся тем, что определяют информационный сигнал, равный разности сигнала отклика вблизи опрашиваемой зоны считывания и сигнала отклика в области мультиплексного устройства, удаленной на расстояние, приблизительно равное от 1 ,5 мм до 6 мм; упомянутый информационный сигнал используют для определения содержания аналитов в образце с применением калибровочных данных.
12. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутый картридж выполняют из оптически частично прозрачного материала или имеющим частично прозрачное окно, через которое инспектируют пространственное размещение упомянутых тест-полосок.
13. Способ по п.З, отличающийся тем, что упомянутые несколько измерительных секций детектора количества магнитных частиц выполняют в виде индукционных катушечных систем, которые возбуждают зондирующее (опрашивающее) переменное магнитное поле в области вблизи каждой из упомянутых зон считывания мультиплексного устройства и регистрируют
индукционные сигналы отклика упомянутых магнитных частиц; упомянутые индукционные катушечные системы соединяют с единым процессорным блоком упомянутого детектора количества магнитных частиц; упомянутый процессорный блок задает по крайней мере две частоты зондирующего переменного магнитного поля и выделяет из индукционного сигнала отклика спектральные компоненты на комбинаторных частотах зондирующего магнитного поля; упомянутые спектральные компоненты используют для определения количества магнитных частиц на каждой из упомянутых зон считывания мультиплексного устройства и определения содержания аналитов в образце по калибровочным данным.
14. Устройство для мультиплексного определения нескольких аналитов в жидком образце, состоящее из модулей в виде иммунохроматографических тест-полосок;
каждая из упомянутых тест-полосок имеет зону приема образца, по крайней мере одну зону считывания и подвижный объект, связанный с магнитными частицами;
каждая из упомянутых тест-полосок изготовлена из пористого материала, который позволяет жидкому образцу, аналитам и подвижному объекту перемещаться из зоны приема образца в направлении зоны считывания и через зону считывания;
зоны считывания упомянутых тест-полосок выполнены с возможностью взаимодействия с разными аналитами в жидком образце и селективной (специфической) фиксации упомянутого подвижного объекта,
отличающееся тем, что
упомянутые тест-полоски ориентированы таким образом, что направления от зоны приема образца к зоне считывания тест-полосок приблизительно параллельны между собой;
пространственные положения каждой из зон считывания упомянутых тест-полосок разнесены вдоль приблизительно общего направления от зоны приема образца к зоне считывания;
упомянутые тест-полоски расположены внутри картриджа, который выполнен из материала, по крайней мере частично проницаемого для внешне генерируемого магнитного поля;
упомянутый картридж имеет по крайней мере один участок для приема жидкого образца, который позволяет привести в контакт жидкий образец с зонами приема образца упомянутых тест- полосок.
15. Устройство по п.14, отличающееся тем, что упомянутый картридж имеет
пространственную конфигурацию, позволяющую воздействовать внешним зондирующим
(опрашивающим) магнитным полем на области вблизи каждой из упомянутых зон считывания тест-полосок и регистрировать индукционные сигналы отклика, зависящие от количества магнитных частиц на каждой зоне считывания тест-полосок.
16. Устройство по п.14, отличающееся тем, что упомянутый картридж выполнен из оптически частично прозрачного материала или имеет частично прозрачное окно, позволяющее
инспектировать пространственное размещение упомянутых тест-полосок.
17. Устройство по п.15, отличающееся тем, что упомянутый картридж вблизи упомянутых зон считывания имеет наибольший размер d в поперечном сечении, перпендикулярном упомянутому приблизительно общему направлению от зоны приема образца к зоне считывания тест-полосок, в диапазоне от примерно 3 мм до примерно 15 мм.
18. Устройство по п.17, отличающееся тем, что положения зон считывания упомянутых тест- полосок пространственно разнесены друг от друга вдоль упомянутого направления от зоны приема образца к зоне считывания тест-полосок на расстояния, приблизительно равные от половины величины упомянутого размера картриджа d/2 до величины 2d.
19. Устройство по п.14, отличающееся тем, что положения зон считывания упомянутых тест- полосок пространственно разнесены друг от друга вдоль упомянутого приблизительно общего направления от зоны приема образца к зоне считывания тест-полосок на расстояния в диапазоне от примерно 3 мм до примерно 12 мм.
20. Устройство по п.14, отличающееся тем, что упомянутые тест-полоски пространственно размещены в виде трехмерной структуры внутри картриджа, который имеет участок
цилиндроподобной формы.
21. Устройство по п.20, отличающееся тем, что каждая тест-полоска имеет контрольную линию с нанесёнными лигандами для связывания с рецепторами, размещёнными на упомянутом подвижном объекте; при этом пространственные положения контрольных линий тест-полосок приблизительно совпадают в плоскости, перпендикулярной упомянутому приблизительно общему направлению из зоны приема образца к зоне считывания.
22. Устройство по п.14, отличающееся тем, что упомянутые тест-полоски выполнены с применением антител на упомянутых зонах считывания для мультиплексного определения ботулинических нейротоксинов нескольких серотипов (А, В, Е и F).
23. Устройство по п.14, отличающееся тем, что упомянутые тест-полоски выполнены с применением распознающих рецепторов (антител, антигенов, натуральных или синтетических белков, пептидов, молекул нуклеиновых кислот, молекулярных отпечатков в полимерах) на упомянутых зонах считывания для одновременного определения концентрации нескольких биомаркеров заболеваний (онкологических, кардиологических, инфекционных, желудочно- кишечных, аутоиммунных, аллергических) и с возможностью корреляционного сопоставления значений концентраций биомаркеров в одном образце при приблизительно одинаковых внешних условиях.
24. Устройство по п.14, отличающееся тем, что упомянутые тест-полоски выполнены с применением белковых коньюгатов гаптенов (малых молекул: микотоксинов, лекарственных препаратов, антибиотиков, гармонов, витаминов, наркотиков, микроэлементов, синтетических и природных ядов) для определения нескольких гаптенов (малых молекул) в конкурентных форматах иммуноанализа.
25. Устройство по п.14, отличающееся тем, что упомянутые тест-полоски выполнены с применением одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот е разными нуклеотидными последовательностями на упомянутых зонах считывания тест-полосок для одновременного определения нескольких молекул, по крайней мере частично комплементарных к упомянутым молекулам нуклеиновых кислот.
PCT/RU2017/000724 2016-09-30 2017-09-29 Способ мультиплексного анализа с помощью магнитных меток и устройство для его осуществления WO2018063034A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016138725A RU2016138725A (ru) 2016-09-30 2016-09-30 Способ мультиплексного анализа с помощью магнитных меток и устройство для его осуществления
RU2016138725 2016-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018063034A1 true WO2018063034A1 (ru) 2018-04-05

Family

ID=61759986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000724 WO2018063034A1 (ru) 2016-09-30 2017-09-29 Способ мультиплексного анализа с помощью магнитных меток и устройство для его осуществления

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2016138725A (ru)
WO (1) WO2018063034A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113660899A (zh) * 2019-04-01 2021-11-16 吉温成象有限公司 体内免疫测定系统
CN117434141A (zh) * 2023-10-13 2024-01-23 中国计量科学研究院 样品检测方法、装置、计算机设备和存储介质

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6203757B1 (en) * 1998-12-02 2001-03-20 Bionike, Inc. Fluid sample distriution system for test device
RU2166751C1 (ru) * 2000-03-09 2001-05-10 Никитин Петр Иванович Способ анализа смеси биологических и/или химических компонентов с использованием магнитных частиц и устройство для его осуществления
US20110117672A1 (en) * 2006-03-21 2011-05-19 Magnisense Technology Limited Magnetic immunochromatographic test method and device

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6203757B1 (en) * 1998-12-02 2001-03-20 Bionike, Inc. Fluid sample distriution system for test device
RU2166751C1 (ru) * 2000-03-09 2001-05-10 Никитин Петр Иванович Способ анализа смеси биологических и/или химических компонентов с использованием магнитных частиц и устройство для его осуществления
US20110117672A1 (en) * 2006-03-21 2011-05-19 Magnisense Technology Limited Magnetic immunochromatographic test method and device

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLAZHEYEVSKIY M.Y. ET AL., DEVELOPMENT OF THE KINETIC - SPECTROPHOTOMETRIC METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF ZOPICLONE IN TABLETS BY THE PERHYDRO LYSIS REACTION/ VISNIK FARMATSP, vol. 3, 2014, pages 38 - 41, XP055498380 *
CHING K.H. ET AL.: "Rapid and selective detection of botulinum neurotoxin serotype-A and with single immunochromatographic test strip", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 380, 2012, pages 23 - 29, XP028488744 *
SONG S. ET AL.: "Multiplex Lateral Flow Immunoassay for Mycotoxin Determination", ANAL.CHEM., vol. 86, 2014, pages 4995 - 5001, XP055473681 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113660899A (zh) * 2019-04-01 2021-11-16 吉温成象有限公司 体内免疫测定系统
CN113660899B (zh) * 2019-04-01 2024-05-14 吉温成象有限公司 体内免疫测定系统
CN117434141A (zh) * 2023-10-13 2024-01-23 中国计量科学研究院 样品检测方法、装置、计算机设备和存储介质

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016138725A (ru) 2018-04-02
RU2016138725A3 (ru) 2018-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nikitin et al. Multiplex biosensing with highly sensitive magnetic nanoparticle quantification method
US10732111B2 (en) Automated immunoanalyzer system for performing diagnostic assays for allergies and autoimmune diseases
Klein et al. Development of a multiplexed giant magnetoresistive biosensor array prototype to quantify ovarian cancer biomarkers
US10488408B2 (en) Detection of target molecules in a sample by using a magnetic field
JP2008544246A5 (ru)
US10151750B2 (en) Magnetic and/or electric label assisted detection system and method
JP2008544246A (ja) 正確な磁気バイオセンサー
US20070224604A1 (en) Method of Determining the Presence and/or Concentration of Substances of Interest in Fluids
US20120244630A1 (en) Multiplexed analyte concentration measurement
US20210164974A1 (en) Chromatographic strip comprising multiple test lines, diagnostic kit comprising same, and qualitative, semi-quantitative or quantitative analysis method comprising multiple competitive reaction measurement steps
EP2449382B1 (en) Magnetic sensor device, method of operating such a device and sample
WO2018063034A1 (ru) Способ мультиплексного анализа с помощью магнитных меток и устройство для его осуществления
WO2010086772A1 (en) System and method for assay
EP3295163B1 (en) Devices and methods for increasing magnetic sensor sensitivity
US9823241B2 (en) Processing of a sample fluid with target components
CN105738616A (zh) 双重放大荧光免疫标记探针的制备方法及应用、用其制备荧光免疫层析试剂条的方法
US20140011190A1 (en) Method for performing a rapid test
US20090029347A1 (en) Method for Identifying Multiple Analytes Using Flow Cytometry
US20240168021A1 (en) Lateral flow test methods
Nikitin et al. Multiplex express in vitro diagnostics based on magnetic nanoparticles
Liang et al. Magnetoresistive (MR) biosensor
Saito et al. No-Wash Immunoassay for Low Affinity Target Molecule Detection Based on Giant Magneto-Resistive Bio-Sensing Techniques
US20070172886A1 (en) Reaction module for biological analysis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17856892

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17856892

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1