CN107656059B - 一种用于p53蛋白的荧光检测剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于p53蛋白的荧光检测剂，包括磁性纳米粒子、双链DNA、以及包覆在磁性纳米粒子表面用于与双链DNA连接的功能层；所述的双链DNA由DNA‑1单链和DNA‑2单链杂交得到；所述的DNA‑1为羧基寡核苷酸探针，序列为：COOH‑(CH2)6‑TTT TTT TCC GGG CAT GCC CGG CAT TGC‑3′；所述的DNA‑2为DNA‑1的部分互补序列，序列为：5′‑GGG CAT GCC C‑3′。本发明还公开了所述的荧光检测剂的制备方法和在检测野生型p53蛋白中的应用。该制剂的制备成本低，使用该制剂能够敏感、快速、精确的捕获p53蛋白，实现p53蛋白的超灵敏、高选择性、高准确度的检测，而且检测限低，能够定量分析检测正常细胞和癌细胞裂解液中的p53蛋白，可用于临床癌症诊断和癌症早期发现。

Description

一种用于p53蛋白的荧光检测剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于p53蛋白检测技术领域；具体涉及一种野生型p53蛋白的荧光检测剂。
背景技术
癌症的发病率逐年上升，已成为威胁人类健康的主要疾病之一。据估计，如果癌症可以在早期发现和治疗，那么癌症死亡率的会降低大约30％。因此，癌症生物标志物的早期检测已成为癌症筛查和预后研究的热点。p53蛋白作为肿瘤抑制因子和转录因子蛋白，在细胞周期、凋亡和DNA修复中起着重要的调控作用。p53蛋白分为野生型和突变型两种。在所有的癌症中，p53基因的突变增加到大约50％，并且在各种各样的人类癌症中，这种基因突变导致突变型p53蛋白的积累和野生型p53蛋白的减少。因此，p53蛋白的有效检测一直是临床研究和癌症早期诊断的重点。这种特异的相互作用已作为一种抗体替代品来检测p53蛋白。
现有的检测方法主要用来检测野生型的p53蛋白。
目前，有许多于能敏感检测p53蛋白的方法。各种技术，包括表面增强拉曼散射(SERS)，化学发光，电化学方法和葡萄糖计等已被用于p53蛋白的检测。例如公开号为CN104977277A的中国专利文献公开了一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡，所述囊泡内部包裹有能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金，同时囊泡表面修饰有异硫氰酸荧光素标记的抗变异p53蛋白抗体。再如，公开号为CN103276087A的中国专利文献公开了高灵敏度的蛋白检测方法，例如，方式一、直接包被法进行管壁固相PLA：蛋白质或抗体直接吸附到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测；方式二、交联剂固定法进行管壁固相PLA：蛋白质或抗体通过戊二醛交联到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测。
然而，目前大多数被报道的检测p53蛋白的方法是基于抗体与抗原特异性结合作用的免疫检测。抗体的昂贵成本和抗体修饰的复杂功能化步骤限制了其临床应用。
发明内容
为解决现有检测膜蛋白方法的步骤繁琐及造价高的问题，本发明提供了一种DNA功能化修饰的用于p53蛋白的荧光检测剂，旨在提高荧光检测p53蛋白的灵敏度，降低实验成本，简化实验步骤。
本发明第二目的在于，提供了一种所述的荧光检测剂的制备方法。
本发明的第三目的在于，提供了所述的荧光检测剂的应用。
一种用于p53蛋白的荧光检测剂，包括磁性纳米粒子、双链DNA、以及包覆在磁性纳米粒子表面用于与双链DNA连接的功能层；所述的双链DNA由DNA-1单链和DNA-2单链杂交得到；
所述的DNA-1为羧基寡核苷酸探针，序列为：COOH-(CH2)6-TTT TTT TCC GGG CATGCC CGG CAT TGC-3′；
所述的DNA-2为DNA-1的部分互补序列，序列为：5′-GGG CAT GCC C-3′。
本发明所述的荧光检测剂，包括磁性纳米粒子，包覆在磁性纳米粒子表面的功能层，以及通过功能层的活性基团固定的双链DNA。本发明所提供的荧光检测剂基于基因探针原理，独创性地利用DNA高特异性的结合p53蛋白，通过荧光法检测细胞裂解液中的p53蛋白；相较于现有的抗原-抗体检测方法，本发明的检测剂基于荧光技术的生物标记物检测、成本更低，灵敏度更高、具有良好的选择性；另外，操作简单、信号量化方便。
选用磁性纳米粒子相比于其他纳米粒子，除容易分离外，使测试的灵敏度、检测限等有所提高。
现有具有磁性的纳米粒子均可用至本发明中，作为优选，所述的磁性纳米粒子为磁性Fe3O4NPs、Fe(0)纳米粒子中的至少一种。
磁性Fe3O4NPs的效果更优，且具有经济、易分离等优势。
本发明中，功能层通过其表面的功能连接基团与DNA-1的侧基连接固定；例如，通过氨基、羧基等官能团实现连接。
作为优选，所述的功能层通过表面修饰的氨基与DNA-1单链连接。本发明优选的荧光检测剂，在磁性纳米粒子的表面包覆功能层，所述的功能层的表面修饰有功能连接基团(例如氨基)，通过功能连接基团与DNA-1单链的羧酸侧基连接。也即是，本发明中，功能层作为纽带，将磁性纳米粒子和DNA探针连接。
进一步优选，所述的功能层包括包覆在磁性纳米粒子表面的的PAA，以及修饰在PAA表面的氨化的葡聚糖。
在磁性纳米粒子的表面包覆一层PAA，PAA含有丰富羧酸基，得到表面羧酸修饰的磁性纳米粒子；随后通过PAA的羧酸与氨化的葡聚糖中的氨基反应，使磁性纳米粒子的表面带有氨基，进而用于后续的DNA探针的连接固定。
本发明中，通过所述的功能层对磁性纳米粒子表面进行功能化，并作为连接纽带，与DNA探针连接，如此可进一步提高磁性纳米粒子的稳定性、生物相容性和功能化。进一步优选，采用氨化的葡聚糖能够与氨基/羧基进行官能化，以促进靶向配体的结合；葡聚糖修饰的磁性纳米粒子有利于DNA的固定化，可进一步提升了检测剂的亲水性、生物相容性、生物降解性，此外，还能出人意料地提升检测选择性，降低非特异性吸附。
本发明一种优选的荧光检测剂，为一种DNA功能化修饰磁性Fe3O4NPs，包括：将葡聚糖(氨化的葡聚糖)沉积在吸附有PAA的Fe3O4NPs表面，随后用由DNA-1和DNA-2杂交所得的双链DNA修饰。
本发明还提供了一种所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的制备方法，将氨化的葡聚糖修饰在吸附有PAA的磁性纳米粒子表面，随后与DNA-1单链进行固化反应，再后与DNA-2进行杂交反应，即得。本发明制备方法简单，且制得的检测剂的灵敏度高、检测限低。
本发明所述的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将磁性纳米粒子分散在PAA溶液中振动孵育后，分离得到PAA包覆的磁性纳米粒子；
步骤(2)：PAA包覆的磁性纳米粒子与氨化的葡聚糖反应，得到葡聚糖修饰的磁性纳米粒子；
步骤(3)：葡聚糖修饰的磁性纳米粒子、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和DNA-1进行固化反应，随后再与DNA-2进行杂交反应，得到所述的检测剂。
理论上，DNA-1固定在磁性纳米粒子越多，提供的捕捉p53蛋白的结合位点越多。但在达到最佳覆盖率后，由于磁性纳米粒子表面的DNA达到饱和，p53的捕获和DNA交换因空间阻碍而停止，最终导致反应减弱。研究发现，DNA-1加入的量优选为1-7OD。
进一步优选，DNA-1加入的量为5OD。
作为优选，固化反应的温度为37±1℃。固化反应时间为4.5～5.5h(优选为5h)。
作为优选，DNA-2加入的量为1～7OD。优选地，DNA-2的投加量和DNA-1的投加量相同。
杂交反应温度为85～95℃；进一步优选为90℃。
杂交反应的时间优选为4～6min；进一步优选为5min。
本发明一种更优选的检测剂的制备方法，是将Fe3O4NPs加入到PAA溶液中振动孵育后，产物用磁铁收集再水洗几次，然后用磁铁收集得到PAA包覆的Fe3O4NPs；然后往PAA包覆的Fe3O4NPs溶液中加入葡聚糖溶液，得到葡聚糖修饰的Fe3O4NPs；随后，往葡聚糖修饰的Fe3O4NPs溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，再加入DNA-1溶液反应后收集产物；最后，将DNA-2加入到上述溶液中反应后，得到DNA功能化修饰的磁性Fe3O4NPs。
PAA吸附在Fe3O4NPs的表面，使表面带负电有利于下一步的实验操作；更有利于提升Fe3O4NPs的稳定性。
本发明还提供了一种所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，用于野生型p53蛋白的检测。
本发明所述的应用，优选的检测过程为：将待测试样与所述的荧光检测剂共同孵育、反应，随后加入荧光颜料标记的DNA-3，进行交换反应；反应结束后测定荧光发射差值，定量待测试样中p53蛋白含量；
所述的DNA-3为DNA-1的互补序列。
将DNA功能化修饰的磁性纳米粒子(本发明所述的检测剂)和p53蛋白反应(共同孵育)，p53被DNA功能化修饰的磁性Fe3O4NPs捕获后，加入荧光标记的DNA-3来代替DNA-2，捕获p53的DNA功能化修饰的磁性Fe3O4NPs中的DNA-2不被DNA-3替代，使得荧光强度降低，从而将样品中的p53含量测定转化为测定空白样品与p53样品之间荧光发射的差值。
本发明中，荧光标记的DNA(DNA-3)作为信号探针，通过热力学替代部分互补的DNA与完全互补的DNA之中的部分互补DNA，被固定在磁性纳米粒子的表面。由于捕获的p53蛋白在DNA域上抑制了DNA置换过程，减少了荧光发射量，能够定量测定p53蛋白。因此，与传统的免疫检测相比，捕获和检测p53蛋白的成本低、效益高。该方法能够从实际样品中检测p53，而不需要进行大量的样品预处理、分离或使用专用仪器。这种新的p53蛋白检测更简便、灵敏，在正常和癌细胞中，作为一个临床检测p53蛋白将在临床诊断有很大的潜力。
作为优选，荧光颜料为Cy-5、Cy-3中的至少一种。
作为优选，所述的荧光染料标记的DNA-3为DNA-1的互补序列。
进一步优选，所述的DNA-3由荧光染料Cy-5标记，序列为：Cy5-5′-GCA ATG CCGGGC ATG CCC GCA-3′。
作为优选，待测试样与荧光检测剂孵育温度为37±1℃
本发明人发现，合适的孵育时间，可使p53蛋白充分锚定在DNA上，有助于p35的敏感检测。
作为优选，孵育的时间为大于或等于30min。研究发现，随着孵育时间的增加，荧光强度逐渐衰减，30min时荧光衰减幅度达到稳定值，再延长孵育时间不会改善信号。
作为优选，孵育的时间为30min。
DNA-3的加入量为1～7OD。优选地，DNA-3的投加量和DNA-1的投加量相同。研究表明，DNA-3的加入量为5OD时，荧光效果最强，从而可以反推，在将DNA-1锚定在磁性纳米粒子中的最合适的DNA-1的浓度为5OD。
作为优选，交换反应过程的温度为37±1℃。
本发明中，交换反应过程中，合适的DNA-3与检测剂的交换时间，有助于荧光信号的高效输出。在交换时间为10-50min内，荧光信号输出随交换时间的增加而增加，在40min后趋于稳定值。
作为优选，DNA-3与DNA-2的交换时间为40min。
作为优选，检测过程的温度为37±1℃
本发明中，p53蛋白为野生型p53蛋白。本发明方法可独创性地选择性检测野生型p53蛋白。
本发明中，进一步研究了不同浓度野生型p53蛋白存在下荧光信号的变化情况，发现，荧光发射信号强度与靶向p53蛋白的浓度有关，荧光强度随p53浓度的增加而降低。分别测定空白样品、含有p53蛋白的样品在663nm处的荧光，空白样品、含有p53蛋白荧光强度差与p53蛋白浓度成正比。
作为优选，野生型p53蛋白检测中，野生型p53蛋白的检测范围从1pM-2nM，最小检测限为0.1pM。
相对现有技术，本发明的技术方案的特色：
(1)本发明提供了一种通过将目标生物标志物的定量转化成荧光发射测定的方法。
(2)与传统的使用单克隆抗体作为识别探针，结合酶的抗体作为信号探针相比，不需要依赖人工与仪器复杂进行检测，费用更低。
(3)利用该方法能够低成本、简便、灵敏、快速准确的进行p53蛋白的检测，而且能够定量测量p53蛋白，这使得该方法在一些疾病的研究以及临床诊断上具有良好的应用前景。
附图说明
图1为Fe3O4NPs以及实施例1制得的荧光检测剂的TEM图；以及Fe3O4NPs、PAA/Fe3O4NPs和dextran/PAA/Fe3O4NPs的Zeta电位图；其中，(a)和(b)分别为Fe3O4NPs和DNA-2/DNA-1/dextran/PAA/Fe3O4NPs的TEM图，其中图(a)的标尺：100nm，(b)的标尺：20nm；(c)中分别为1.Fe3O4NPs，2.PAA/Fe3O4NPs，3.dextran/PAA/Fe3O4NPs的Zeta电位图。
图2为所制得的荧光探针在663nm处空白以及待测样品中的荧光强度图，其中，(a)2nM的p53蛋白存在下；(b)无p53蛋白下的荧光强度；
图3(a)为DNA-3与在磁性纳米粒子表面DNA-2在不同的交换时间时的荧光强度；(b)为p53蛋白锚定在DNA上的不同孵育时间所对应的荧光强度；(c)为将不同量的DNA固定在Fe3O4NPs上之后测得的荧光强度；
图4(a)为不同浓度p53蛋白存在下，用所制得的荧光探针测得的荧光强度；(b)利用标准曲线法定量测定野生型p53蛋白，为在1pM-2nM范围内一系列浓度梯的p53蛋白所对应的荧光强度。F和F0分别是p53蛋白存在和不存在两种实验条件下的强度。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，基于本发明的原理对本发明所做出的各种改动或修改同样落入本发明权利要求书所限定
实施例1：
步骤(1)葡聚糖修饰的Fe3O4NPs的制备：
Fe3O4NPs通过热溶剂法制得。具体过程如下：将1.0g FeCl3·6H2O溶解到20mL乙二醇溶液中，然后加入3.0g醋酸钠和0.7g聚乙二醇。搅拌30min后，将混合物转移至聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，200℃下反应8h后，冷却到室温。沉淀用乙醇洗几遍，60℃干燥，即可得Fe3O4NPs。
接着，用PAA通过层层自组装技术修饰Fe3O4NPs。具体过程如下：将1mL Fe3O4NPs(1mg mL-1)溶液加入到10mL PAA(1mg mL-1)溶液中，超声孵育15mim后，用磁铁收集再水洗几次，然后用磁铁收集PAA包覆的Fe3O4NPs(PAA/Fe3O4NPs)。最后，将10mL氨基化的葡聚糖(1mg mL-1)溶液加入到1mL PAA/Fe3O4NPs(1mg mL-1)溶液中，超声孵育15mim后，水洗几遍即可得到葡聚糖修饰的Fe3O4NPs(dextran/PAA/Fe3O4NPs)。
由图1(a)可见，制得的Fe3O4NPs粒径均一，直径为50nm；(b)可见Fe3O4NPs、PAA/Fe3O4NPs、dextran/PAA/Fe3O4NPs的Zeta电位分别为6.5mV、-39mV、25mV。Zeta电位正负交替出现，表明功能层逐步在Fe3O4NPs表面成功生长。
步骤(2)DNA-2/DNA-1/dextran/PAA/Fe3O4NPs的制备：
首先，将150μL EDC和150μL NHS加入到步骤(1)制得的dextran/PAA/Fe3O4NPs(1mgmL-1)溶液中，15min后，加入5OD DNA-1溶液。反应5h后，用磁铁收集DNA-1修饰的dextran/PAA/Fe3O4NPs(DNA-1/dextran/PAA/Fe3O4NPs)。最后，将部分互补序列DNA-2加入，90℃下反应5min，使其与DNA-1杂交，再用磁铁收集产物并用二次水洗三次，得荧光检测剂(DNA-2/DNA-1/dextran/PAA/Fe3O4NPs)。
由图1(b)可见制得的DNA-2/DNA-1/dextran/PAA/Fe3O4NPs粒径均一。
实施例2：
步骤(1)dextran/PAA/Fe3O4NPs的制备：同实施例1的步骤1
步骤(2)DNA-2/DNA-1/dextran/PAA/Fe3O4NPs的制备：同实施例1的步骤2
步骤(3)将p53蛋白用含有20nM的二硫苏糖醇(DTT)的PBS稀释，然后加入到DNA-2/DNA-1/dextran/PAA/Fe3O4NPs溶液中，反应30min(孵化时间)后，用磁铁收集并用PBS洗三遍，再用磁铁收集捕获了p53蛋白的纳米粒子。随后，加入Cy-5标记的DNA-3来代替DNA-2(交换反应)，37℃加热反应4h(交换反应时间)后，将纳米粒子(荧光检测剂)收集然后重新分散在PBS溶液中，测试荧光发射值在663nm的荧光强度，如图2(b)。
为了探讨利用该策略检测p53蛋白的可行性，将2nM p53蛋白加入到DNA-2/DNA-1/dextran/PAA/Fe3O4NPs溶液中，然后进行DNA的替代和磁铁分离后，发现在有p53蛋白存在下荧光发射强度明显减低，如图2(a)，表明p53蛋白能够用来抑制荧光染料靶向DNA对磁性纳米粒子表面DNA的替代。因此，样品中p53的含量能够转化为空白样品与p53样品之间的荧光发射差。
实施例3
和实施例1相比，为了探讨磁性纳米粒子表面DNA的覆盖率对检测灵敏度的影响。将1-7OD不同浓度梯度的DNA-1分别加入到1mL dextran/PAA/Fe3O4NPs(1mg mL-1)溶液中，得到DNA-1修饰的磁性纳米粒子共7组，随后分别往每组中加入与DNA-1相对应量的DNA-2，来与DNA-1杂化。然后，每组中分别加入1nM p53蛋白溶液以及与DNA-1等量的DNA-3。随后各组用磁铁分离，测量溶液的荧光强度。通过图3(c)，反推在5OD下，DNA-1负载量最高。
实施例4
和实施例2相比，区别仅在于，筛查DNA-3的加入量与荧光强度的关系：
具体为，和实施例2相比，区别仅在于，DNA-3的加入量分别为1-7OD。荧光强度数据见图3(c)所示，从图中可知加入随着DNA-3的量增加，荧光强度增加，当DNA-3的加入量为5OD时，荧光强度值达到最大，之后荧光强度又降低。这表明越多的双链DNA固定在Fe3O4NPs的表面，将提供更多的p53蛋白结合位点来捕获p53蛋白。
实施例5
和实施例2相比，区别仅在于，筛查DNA-3和所述的荧光检测剂的DNA-2的交换时间：
具体为，交换时间为10min、20min、30min、40min、50min。荧光强度数据见图3(a)所示，从图3(a)中可知荧光输出随交换时间的增加而增加，在40min后趋于平稳。因此，40min的交换时间被选定为DNA-2和DNA-3置换过程的最佳时间。
实施例6
筛查不同孵化温度下的检测效果：
具体为，和实施例2相比，区别仅在于，孵化时间为10min、20min、30min、40min、50min。
荧光强度数据见图3(b)所示，从图3(b)中可知当孵化时间为30min时，荧光衰减幅度达到稳定值，而延长孵育时间没有提高荧光信号。
实施例7
和实施例2相比，区别仅在于，探查P35蛋白与本发明所述的荧光检测剂的线性关系：
具体为：和实施例2相比，区别仅在于，步骤(3)中，p35蛋白浓度的浓度为1pM-2nM中十个不同的浓度。
荧光强度数据见图4所示，从图4(a)中可知荧光发射与靶点p53的浓度有关，荧光强度随p53蛋白浓度的增加而降低。从图4(b)中可知在663nm处，空白样品与p53蛋白样本之间的荧光发射强度之差与p53浓度成比例，检测范围为1pM-2nM(R2＝0.999)，检测限为0.1pM。

Claims (8)

1.一种用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，其特征在于，将所述的荧光检测剂用于野生型p53蛋白的检测：
检测过程为：将待测试样与所述的荧光检测剂共同孵育、反应，随后加入荧光颜料标记的DNA-3，进行交换反应，反应结束后测定荧光发射差值，定量待测试样中p53蛋白含量；
所述的荧光检测剂包括磁性纳米粒子、双链DNA、以及包覆在磁性纳米粒子表面用于与双链DNA连接的功能层；所述的双链DNA由DNA-1单链和DNA-2单链杂交得到；
所述的DNA-1为羧基寡核苷酸探针，序列为：COOH-(CH2)6-TTT TTT TCC GGG CAT GCCCGG CAT TGC-3′；
所述的DNA-2为DNA-1的部分互补序列，序列为：5′-GGG CAT GCC C-3′；
所述的DNA-3为DNA-1互补序列；DNA-3序列为：Cy5-5′-GCA ATG CCG GGC ATG CCCGCA-3′ 。
2.如权利要求1所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，其特征在于，所述的磁性纳米粒子为磁性Fe3O4 NPs、零价铁纳米粒子中的至少一种。
3.如权利要求2所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，其特征在于，所述的功能层通过表面修饰的氨基与DNA-1单链连接。
4.如权利要求1~3任一项所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，其特征在于，所述的功能层包括包覆在磁性纳米粒子表面的的PAA，以及修饰在PAA表面的氨化的葡聚糖。
5.如权利要求1所述的所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，其特征在于，荧光颜料为Cy-5、Cy-3中的至少一种。
6.如权利要求5所述的所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，其特征在于，待测试样与荧光检测剂孵育的时间大于或等于30 min；
DNA-3的加入量为1~7 OD；交换反应过程的温度为37±1°C；交换反应时间为10-50min；
检测过程的温度为37±1°C。
7.如权利要求6所述的所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，其特征在于，野生型p53蛋白的检测限为0.1 pM。
8.如权利要求7所述的所述的用于p53蛋白的荧光检测剂的应用，其特征在于，野生型p53蛋白的检测范围为1 pM - 2 nM。
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