CN102809650A - 生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板，包括聚苯乙烯微孔板。所述聚苯乙烯微孔板的每个微孔内预先包被有1.5-3.0微克生物素标记的牛丙种球蛋白、2.7-3.3微克链霉亲和素，并用封闭溶液封闭。使用本发明的酶标板，可不直接包被捕获抗体，而是将捕获抗体标记生物素，利用生物素-亲和素系统将捕获抗体在与待检抗原反应的过程中，与固相材料(微孔板)结合，从而达到固相吸附和分离的目的，解决了传统直接包被捕获抗体所带来的抗体利用率低，包被量不能满足要求，减缓反应到达平衡时间的缺陷。

Description

生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法

技术领域

本发明属于酶免疫分析技术，具体涉及一种生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法。

背景技术

标记免疫分析是一种免疫分析与示踪(标记)技术相结合的分析技术。抗原(antigen，Ag)和相应抗体(antibody，Ab)之间存在空间结构的互补关系，两种分子相遇时会发生特异性结合形成抗原抗体复合物(AgAb)；示踪技术是将高灵敏性物质(放射性同位素、发光剂等)标记在抗原或抗体分子上形成标记抗原(Ag^*)或标记抗体(Ab^*)；这样，可以通过测定示踪物质(标记物)便可以检测Ag^*(Ab^*)或复合物Ag^*Ab(AgAb^*)。抗原抗体反应具有高度特异性，示踪技术具有高敏感性，二者的完美结合赋予标记免疫分析高敏感性和高特异性，并广泛应用于生物和医学领域中超微量物质的检测。

在标记免疫分析技术中，如示踪物质的特性不会因结合抗原(抗体)而发生改变，且在反应体系中，标记抗原(抗体)往往是过量的，抗原抗体反应结束后，仍然会存在剩余的、未结合的标记抗原(抗体)，称之为游离标记物。此时，测定前必须分离结合状态标记物(Ag^*Ab)和游离状态标记物(Ag^*)，通常测定结合状态标记物(Ag^*Ab)才能反映抗原抗体反应的强度。如在测定前需要分离结合状态标记物和游离状态标记物，一般称为非均相免疫分析。非均相免疫分析通常采用固相吸附法去除游离标记物(Ag^*)。固相吸附分离法是将抗原(抗体)吸附在固相载体表面，使免疫反应在固相载体表面上进行，待测物质(抗体或抗原)、标记抗体(抗原)均可通过免疫反应结合在固相材料表面，未结合物质(含游离标记物)存在于液相中。此时，弃去液相并经洗涤，便可去除游离标记物。

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是常用的标记免疫技术之一，以酶作为标记物，采用固相吸附分离模式。以双抗体夹心反应模式为例，测定原理如下：应用聚苯乙烯(96孔酶标板)作为固相材料，通过非特异性吸附方式连接特异性抗体(也称捕获抗体)，此过程称为包被。加入待检标本，如标本中含有相应抗原，必将被特异性抗体捕获，于固相材料表面形成免疫复合物，未结合物质游离于液相中，通过洗涤方式即可去除。此时在加上酶标记抗体(也称指示抗体)，酶标抗体与待检抗原结合，形成捕获抗体-待检抗原-标记抗体复合物，过剩的标记抗体(游离标记物)存在于液相中，倾倒液体，并洗涤即可去除游离标记物。最终加入显色底物，酶催化底物显色，通过测定吸光度值反映抗原抗体反应强度(待测抗原含量)。

将捕获抗体吸附在固相材料表面，并保留原有生物活性不变，此过程称为包被(或制备酶标板)。目前，抗体包被仍采用非特异性吸附技术：将捕获抗体用包被缓冲液(磷酸盐或碳酸盐)稀释至一定浓度，加入96孔微量反应板内。由于聚苯乙烯具有吸附蛋白特性，能够吸附抗原或抗体，经过一段时间温育后，抗原或抗体即被固定于固相材料标本，同时保留原有生物活性。由于包被液中蛋白浓度很低，抗体或抗原分子不能完全覆盖所有结合位点。为防止后续反应时发生非特异性吸附，需在加入高浓度牛血清白蛋白(BSA)(1％～2％)进行封闭空白位点。酶标板经真空干燥、真空包装即可。

上述传统包被技术具有流程简单、操作方便等优点，并被广泛应用。但是，此种将抗体分子直接吸附于固相材料表面，特别是96孔微量反应板(微孔内壁)存在以下缺陷，这些缺陷严重影响酶联免疫技术的检测性能。

(1)抗体固相化影响原有生物活性

捕获抗体与固相材料结合，导致抗体空间分子构象不同于液相。抗原抗体反应依赖于空间构象，抗体固相化所导致的构象变化必然会影响抗体的利用效率，不利于抗原抗体结合。

(2)微孔内壁有限面积限制抗体包被量

由于微孔内壁的表面积有限，包被的抗体分子数量有限，加上固相化导致利用率的降低，导致有效抗体分子数量不能满足检测体系的要求，由此会缩小检测范围，影响检测效果。

(3)抗体固相化影响与抗原反应的速率

由于固相表面抗体分子处于静止状态，界面反应动力学显示固相抗体分子与液相中抗原相碰撞几率远小于液相反应。由此，抗体固相化必然会增加抗原抗体反应达到平衡所需的时间。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种预先包被有生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法，可以解决传统直接包被捕获抗体所带来的上述缺陷(抗体利用率低，包被量不能满足要求，反应到达平衡时间较长)。使用此种酶标板，可不直接包被捕获抗体，而是将捕获抗体标记生物素，利用生物素-亲和素系统将捕获抗体在与待检抗原反应同时，与固相材料(微孔板)结合，从而达到固相吸附和分离的目的。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板，包括聚苯乙烯微孔板。所述聚苯乙烯微孔板的每个微孔内预先包被有1.5-3.0微克生物素标记的牛丙种球蛋白、2.7-3.3微克链霉亲和素，并用封闭溶液封闭。

优选的，每个微孔内预先包被有2.25微克生物素标记的牛丙种球蛋白、3.0微克链霉亲和素，并用250微升封闭溶液封闭。

优选的，所述封闭溶液由如下组分制得：

NaH₂PO₄ 2H₂O     0.29g

Na₂HPO₄ 12H₂O    2.9g

ACA              2g

NaCl             8.76g

ddH₂O  900 ml，  调pH＝7.3-7.5

牛血清白蛋白     4.0g

蔗糖             35g

Procilin 300     0.5ml

加ddH₂O定溶至1000ml。

优选的，所述聚苯乙烯微孔板为96孔聚苯乙烯微孔板。

生物素(biotin，B)分子量为244.31，为双环结构：I环为咪唑酮环，是与亲和素(或链霉亲和素)结合的部位；II为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原或抗体等。

链霉亲合素(streptavidin，SA)，分子量65KD，由四条相同的肽链组成，一个链霉亲合素分子能结合四个生物素分子。生物素与链霉亲和素相结合的亲和常数达到10¹⁵L/mol，具有特异性、高效性、稳定性等诸多性能。

牛丙种球蛋白(bovine gamma globulin，BGG)分子量150KD，与牛血清白蛋白(Bovineserum albumin，BSA，分子量66KD)相比，单个牛丙种球蛋白分子可标记数量更多的生物素，通过连接链霉亲和素后，将伸出多个“触手”，结合更多生物素标记捕获抗体。此外，牛丙种球蛋白介于固相材质和捕获抗体之间，将使捕获抗体分子远离固相界面，能过提供更大空间，更容易结合待测抗原-酶标记抗体，如此叠加效应会增加微孔板表面抗体分子数量，有效拓宽检测范围。

本发明还提供了一种制备所述酶标板的方法，包括如下步骤：

(1)制备生物素标记的牛丙种球蛋白溶液；

(2)制备酶标板：

1)在聚苯乙烯微孔板的每个微孔中加入150微升，经缓冲液-I稀释至10-20微克/毫升的生物素标记的牛丙种球蛋白溶液，将微孔板放在密封的容器内，室温下放置16-18小时；

2)甩净微孔内溶液，并拍干；用缓冲液-I洗涤微孔板2次，每次每孔加300微升缓冲液-I，静置20秒，吸干；为保证均一性，优选用洗板机洗涤微孔板。

3)甩净微孔内溶液，并拍干；

4)每个微孔中再加入150微升，经缓冲液-II稀释至18-22微克/毫升的链霉亲和素溶液，将微孔板放在密封的容器内，室温下放置2小时；

5)甩净微孔内溶液，并拍干；用缓冲液-II洗涤微孔板2次，每次每孔加300微升缓冲液-II，静置20秒，吸干；为保证均一性，最佳用洗板机洗涤微孔板。

6)每个微孔中再加入封闭溶液250微升，将微孔板放在密封的容器内，4℃，放置过夜。

7)重复步骤3)；

8)将经步骤7)得到的聚苯乙烯微孔板真空干燥至少6小时，得所述的酶标板；

所述缓冲液-I由如下组分制得：

ddH₂O        900ml

Tris         6.05g

NaCl         8.77g

调pH＝8.0，加0.5ml Procilin 300，再加ddH₂O定容至1000ml；

所述缓冲液-II由如下组分制得：

ddH₂O           900ml

NaH₂PO₄.2H₂O    4.68g

Na₂HPO₄.12H₂O   7.16g

NaCl            8.77g

L-Tryptophan    0.2g

调pH＝8.0，加ddH₂O定容至1000ml。

优选的，步骤(1)中所述生物素标记的牛丙种球蛋白溶液由如下方法制备得到：

(1)用O.1M，pH9.5的碳酸盐缓冲液溶解牛丙种球蛋白，并稀释至0.5-1.0mg/ml；

(2)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与牛丙种球蛋白的摩尔比为(20-10)∶1，优选18∶1的比例将二者混合，并在室温下搅拌反应3-6小时，优选4小时；

(3)将经步骤(2)反应后的液体用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲盐水于4℃透析24小时，去除游离生物素；

(4)用紫外吸收测定经步骤(3)标记好生物素标记的牛丙种球蛋白溶液蛋白含量。

本发明还提供了一种试剂盒，其组成包括生物素标记的捕获抗体以及上述的预先包被有生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板。

该试剂盒的主要作用过程是：

①将牛丙种球蛋白标记生物素分子，形成生物素标记牛丙种球蛋白，此种物质能够通过传统包被技术包被在固相材料表面。

②加入链霉亲和素于微孔板内，链霉亲和素通过生物素分子与牛丙种球蛋白结合；

③将捕获抗体标记生物素分子，制备生物素标记的捕获抗体；

④检测时将待检标本、生物素标记的捕获抗体同时加入上述微孔板内，生物素标记的捕获抗体既与待检抗原反应形成免疫复合物，同时又可以结合微孔板表面的链霉亲和素，从而使免疫复合物(捕获抗体-待检抗原)吸附在固相材料表面；

⑤按酶联免疫传统方式洗涤去除未参加反应物质后，加入酶标记抗体，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶标记抗体。当标本中含有相应的抗原时，会形成捕获抗体-抗原-酶标抗体的复合物，未结合的物质通过洗涤去除。加入显色底物显色，通过测量颜色的变化来判断标本中抗原的浓度。

所述试剂盒尤其适合用于促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)酶联免疫法中。优选的，所述试剂盒中，所述生物素标记的捕获抗体是生物素化EPO抗体，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的EPO抗体。该试剂盒的一种具体实施方式包括如下组分：

(1)本发明所述的生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板；

(2)生物素化EPO抗体(即生物素标记的捕获抗体)；

(3)辣根过氧化物酶标记的EPO抗体(即酶标记抗体)；

(4)标准品；

(5)质控血清；

(6)常规酶联免疫法洗液；

(7)常规酶联免疫法显色液A，主要成分是双氧水；

(8)常规酶联免疫法显色液B，主要成分是四甲基联苯胺；

(9)终止液，常规酶联免疫法终止液，主要成分是稀硫酸。

本发明具有的优点和积极效果是：

1、如图1-4所示，与经典直接包被捕获抗体相比，本发明的抗体分子没有直接连接至固相载体表面，而是将抗体分子置于液相中。此种方式由于抗体在液相中保持原有空间构象，利于与待测抗原结合，同时，如抗体在液相中，与抗原反应速度高于经典直接包被模式，有效抗体分子数目高于经典直接包被模式。例如：在酶联免疫法定量检测促红细胞生成素项目中，如将捕获抗体(单克隆抗体)直接包被微孔板，因抗体与固相载体连接后导致生物活性受到严重影响，不能形成良好剂量-反应曲线。相反，如采用本技术发明生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板，并用生物素标记捕获抗体后，能够得到良好剂量-反应曲线，如图5所示。

2、生物素化的牛丙种球蛋白能够有效拓宽检测范围。如图6所示，在酶联免疫法定量检测甲种胎儿球蛋白(AFP)项目中，如将捕获抗体(单克隆抗体)直接包被微孔板，所获得的剂量-反应曲线于150纳克/毫升处趋于平缓；相反，如采用生物素标记牛丙种球蛋白-链霉亲和素的酶标板，并用生物素标记捕获抗体后，所获得的剂量-反应曲线于250纳克/毫升处才趋于平缓，

附图说明

图1是常规的经典直接包被模式。

图2是本发明酶标板所采用的间接包被模式。

图3是常规的经典直接包被模式中微孔板的使用过程。

图4是本发明酶标板的使用过程。

图5是不同包被模式的促红细胞生成素剂量-反应曲线。

图6是不同包被模式的甲种胎儿球蛋白剂量-反应曲线，

图中，a是直接包被模式下的剂量-反应曲线；b是本发明所采用的间接包被模式下剂量-反应曲线。

图7是促红细胞生成素标准品的剂量-反应曲线。

图1-4中，1、微孔板；2、捕获抗体；3、生物素标记的牛丙种球蛋白；4、链霉亲和素；5、生物素标记捕获抗体；6、待测抗原；7、酶标记抗体。

图1是常规的经典直接包被模式，也就是依靠微孔板的物理吸附作用，直接将捕获抗体连接在固相载体表面，捕获抗体在吸附过程中不能确保结合抗原的部分(抗原结合片段，Fab)暴漏在外面；同时，因捕获抗体直接靠近固相载体，受空间位阻效应影响，此种包被模式不利于结合(捕获)相应抗原。

图2是本发明酶标板所采用的间接包被模式。首先，将牛丙种球蛋白标记生物素，再经经典模式吸附再固相载体上，加入链霉亲和素后，与生物素结合后形成丙种球蛋白-生物素-链霉亲和素的特殊结构。此种结构使捕获抗体不再直接连接固相载体(游离液相中)，只有在加入待检抗原和生物素化捕获抗体后，才能依靠生物素-亲和素反应，使免疫(抗原-抗体)复合物结合固相载体。此外，牛血清丙种球蛋白为大分子蛋白(分子量150KD)，牛丙种球蛋白-生物素-链霉亲和素的特殊结构为结合生物素化捕获抗体提供立体空间，不再是平面结构，此种结构不仅会增加结合抗体分子的数量，而且也会减少空间位阻效应，存进抗原抗体结合反应。

当采用双抗体夹心检测抗原的酶联免疫法测定程序时，图3为直接包被条件下的使用过程过程：加入待测抗原，待测抗原与固相表面捕获抗体结合形成免疫复合物(此步反应是固相抗体与液相抗原反应)，洗涤去除未结合物质；再加入酶标抗体，形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体复合物，过剩的标记抗体经洗涤去除。

图4为采用本发明酶标板的使用过程：加入待测抗原和生物标记捕获抗体(二者均在液相中)，在液相中抗原-抗体结合形成免疫复合物，该复合物再通过生物素-亲和素系统结合在固相载体表面，从而实现与未结合物质的分离，余下步骤与经典直接包被模式相同。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1

一、一种本发明所述酶标板，涉及的主要原料如下：

Ⅰ96孔聚苯乙烯微孔板

96孔聚苯乙烯微孔板，透明，国产和进口均可，应具备较强蛋白吸附性能和良好透光性，优选美国康宁公司产品。

Ⅱ制备生物素标记牛丙种球蛋白

牛丙种球蛋白为美国Sigma公司产品；活化生物素为美国Sigma公司产品；

IⅡ链霉亲和素

链霉亲和素为美国Sigma公司产品。使用时，按照每块96微孔板15ml体积(150微升/单个微孔)配制。量取包被缓冲液-Ⅱ体积=15ml×预包被数量(块)，加入链霉亲和素储存液，调整蛋白浓度至20微克/毫升，得链霉亲和素溶液。

Ⅳ牛血清白蛋白

牛血白蛋白为美国Sigma公司产品，也可使用国产牛血清白蛋白，要求具有较好溶解性，充分溶解后无絮状物，配制封闭溶液的蛋白浓度为0.4克/100毫升。

二、生物素标记牛丙种球蛋白溶液、缓冲液-Ⅰ、缓冲液-Ⅱ和封闭溶液的制备

Ⅰ、生物素标记牛丙种球蛋白溶液的制备：

(1)用0.1M，pH9.5的碳酸盐缓冲液溶解牛丙种球蛋白，并稀释至0.5-1.0mg/ml；

(2)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素与牛丙种球蛋白的摩尔比为18∶1的比例将二者混合，并在室温下搅拌反应4小时；

(3)将经步骤(2)反应后的液体用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)于4℃透析24小时，去除游离生物素；

(4)用紫外吸收测定经步骤(3)标记好生物素标记的丙种球蛋白溶液蛋白含量。此溶液为储存液。使用时，按照每块96微孔板15ml体积(150微升/单个微孔)配制。量取缓冲液-Ⅰ体积=15ml×预包被数量(块)，加入生物素标记牛丙种球蛋白储存液，调整蛋白浓度至15微克/毫升。

0.1M，pH9.5的碳酸盐缓冲液

0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲盐水溶液

IⅠ缓冲液-Ⅰ，用于稀释生物素标记牛丙种球蛋白和包被生物素标记牛丙种球蛋白后洗涤微孔板。

Ⅲ缓冲液-Ⅱ，用于稀释链霉亲和素和包被链霉亲和素后洗涤微孔板。

Ⅳ封闭溶液

使用时，按照每块96微孔板25ml体积(250微升/单个微孔)配制。

本发明酶标板的制备方法，包括如下步骤：

(1)在聚苯乙烯微孔板的每个微孔中加入150微升，经缓冲液-Ⅰ稀释至15微克/毫升的生物素标记的牛丙种球蛋白溶液，轻轻震荡，将微孔板放在密封的容器内，室温(18～25℃)下放置16-18小时。

(2)甩净微孔内溶液，并在干净的毛巾上拍干。用缓冲液-Ⅰ洗涤微孔板2次，每次每孔加300微升缓冲液-Ⅰ，静置20秒，吸干；为保证均一性，最佳用洗板机洗涤微孔板。

(3)甩净微孔内溶液，并在干净的毛巾上拍干。

(4)每个微孔中再加入150微升，经缓冲液-Ⅱ稀释至20微克/毫升的链霉亲和素溶液，轻轻震荡，将微孔板放在密封的容器内，室温下放置2小时。

(5)甩净微孔内溶液，并在干净的毛巾上拍干。用缓冲液-Ⅱ洗涤微孔板2次，每次每孔加300微升缓冲液-Ⅱ，静置20秒，吸干；为保证均一性，最佳用洗板机洗涤微孔板。

(6)加入封闭液体积为250微升/孔，将微孔板放在密封的容器内，4℃，放置过夜(16～18小时)。

(7)重复上述“(3)”

(8)将微孔板放真空干燥至少6小时；取出后放置于干燥室并真空包装。

实施例2

一种用于促红细胞生成素酶联免疫法诊断试剂盒，包括如下组分：

(1)实施例1制备得到的酶标板：96孔(12条×8孔)

(2)生物素化EPO抗体：6ml

(3)EPO酶标抗体：10ml

(4)标准品：6瓶，每瓶1.0ml。浓度是0ng/ml，0.5ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，30ng/ml

(5)定值质控血清：2瓶，每瓶1.0ml

(6)洗液：20ml，10倍浓缩，用前蒸馏水稀释

(7)显色底物A：7.0ml。

(8)显色底物B：7.0ml。

(9)终止液：7.0ml。

所述试剂盒的制备方法如下：

(1)制备实例1所述的酶标板

(2)制备生物素化EPO抗体

抗体原料：EPO抗体——鼠抗人促红细胞生成素单克隆抗体，商品化试剂(英国ABCAM公司，Anti-EPO antibody，，货号：ab20375)；

将待标记生物素的EPO抗体装入透析袋中，置0.1M碳酸氢钠溶液(pH9.5)中充分透析，期间换液数次；将活化生物素以适当浓度(通常为20g/L)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中。将生物素缓慢、逐滴加到搅拌中的抗体溶液中，在室温下搅拌1h。在4℃下用0.1M，pH7.4的PBS溶液透析24h，期间换液数次，充分除去未结合的游离生物素，以1∶1的比例加入贮存液，分装后4℃保存。

(3)制备EPO酶标抗体

抗体原料：EPO抗体——羊抗人促红细胞生成素多克隆抗体，商品化试剂(英国ABCAM公司，Anti-EPO antibody，货号：ab30545)；

采用改良过碘酸钠法标记。将待标记酶的EPO抗体装入透析袋中，置0.3M碳酸盐缓冲液中透析过夜；取出透析后抗体加入已活化的HRP，避光，搅拌，偶联1h。置平衡液(0.01MPBS)中透析酶结合物粗品。取出已透析酶结合物，上样于已平衡好的G-200凝胶柱，用平衡液洗脱，收集，即为纯化的酶标记物。用0.45μm的滤膜过滤除菌，以1∶1的比例加入贮存液，分装后4℃放置备用。

(4)配制标准品：

标准品采用重组促红细胞生成素(国产)，用基质液配制，浓度为0ng/ml，0.5ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，30ng/ml。各点标准品经国际质控血清进行标定。

基质液配制方法：主要成分为胎牛血清，经220g/L的硫酸铵沉淀后离心、过滤，先后对10倍体积的生理盐水和0.05M硼酸透析过夜，然后56℃灭活1h，然后加入0.02g/L的硫酸庆大霉素和0.5ml/L的Proclin300，最后用0.45um的滤膜过滤除菌，分装，4℃放置备用。

(5)配制定值质控血清

用混合血清配制，经多次测定后赋值并确定质控范围。两个质控血清的浓度分别为1ng/ml和5ng/ml。

(6)配制洗液(10倍)

常规酶联免疫法洗液

(7)配制显色底物A

常规酶联免疫法显色液A(主要成分双氧水)

用1M柠檬酸或10MNaOH调节pH值至5.3，去双蒸水定容至500ml，分装，4℃储存。

(8)配制显色底物B

常规酶联免疫法显色液B(主要成分四甲基联苯胺)

上述配制过程注意避光，调节pH值3.0，用双蒸水定容至500ml，分装4℃储存

(9)配制终止液

常规酶联免疫法终止液

ddH₂O(双蒸水)        400ml

12M浓硫酸(H₂SO₄)     13.9ml

混匀，用双蒸水定容至500ml，分装4℃储存。

(10)试剂盒组装

将实施例1制备得到的酶标板、生物素化EPO抗体、EPO酶标抗体、标准品、质控血清、洗液、显色底物A、显色底物B、终止液组装成试剂盒成品。

实施例3

一种实施例2制备得到的促红细胞生成素酶联免疫法诊断试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)取出试剂盒所有组分并准备待测血清标本，平衡至室温，按所需取出微孔板条。

(2)分别向微孔中加入50μl标准品、质控血清、标本，再分别加入50μl生物素化EPO抗体，震动10-20秒混匀，37℃水浴30分钟；

(3)扣除微孔中液体，用洗液洗涤5次，在干净的毛巾上拍干。

(4)每孔加入100μl EPO酶标抗体，震动10-20秒混匀，37℃水浴30分钟。

(5)重复步骤(3)。

(6)每孔分别滴加1滴(50μl)显色底物A和显色底物B，置于室温(18-25℃)避光显色15分钟。

(7)每孔加入1滴终止液，轻轻震动几次混匀。

(8)在15分钟内，以630nm作为参考波长，测量450nm处的吸光度(A450nm)。

(9)计算

以标准品的吸光度为Y轴，浓度为X轴作图，用计算机软件(四参数拟合函数)获得数学函数，得到标准曲线图7。根据质控血清和标本的吸光度值，从标准曲线上反算EPO的浓度。如果样品经过稀释，在计算其浓度时应乘以相应的稀释倍数。

样本的测定实例如表1所示。

表1剂量-反应曲线和标本测定实例

实施例4

实施例2所制备的促红细胞生成素酶联免疫法诊断试剂盒的性能检测。

以鼠抗人促红细胞生成素单克隆抗体作为捕获抗体，羊抗人促红细胞生成素多克隆抗体标记辣根过氧化物酶作为标记抗体，采用传统直接包被模式、生物素牛血清白蛋白-链霉亲和素间接包被模式、生物素牛丙种球蛋白-链霉亲和素间接包被模式进行比较。

生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素间接包被模式，包被过程与本发明相同，只是用牛血清白蛋白-取代生物素化牛丙种球蛋白

直接包被模式为经典包被模式：用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释包被抗体(抗体浓度为3-10微克/毫升)。每孔加入包被液150微升，置4℃16-18小时，弃包被溶液后常规封闭(1％牛血清白蛋白或脱脂奶)。

试验结果如表2和图5所示。从实验结果可以看出，在使用经典包被模式和生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素模式时，捕获抗体均不能正常工作(未显示生物活性，未出现剂量-反应曲线)，只有采用生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素模式，随着检测体系中EPO升高，信号值增强而显示良好的剂量-反应曲线。表明了本发明可以使传统模式不工作的抗体，通过牛血清丙种球蛋白提供的空间效应，最大限度降低因抗体与固相载体连接产生的位阻效应，从而使捕获抗体保留原有生物活性。

表2不同模式剂量-反应曲线(促红细胞生成素)

实施例5

一种甲种胎儿球蛋白(AFP)试剂盒，包括如下组分：

(1)实施例1制备得到的酶标板：96孔(12条×8孔)；

(2)生物素化AFP抗体；

(3)AFP酶标抗体；

(4)甲种胎儿球蛋白标准品；

(5)定值质控血清：同实施例2。

(6)常规酶联免疫法洗液，同实施例2。

(7)常规酶联免疫法显色液A，同实施例2。

(8)常规酶联免疫法显色液B，同实施例2。

(9)常规酶联免疫法终止液，同实施例2。

所述甲种胎儿球蛋白试剂盒，其性能检测如表3和图6所示，检测结果显示，在酶联免疫法定量检测甲种胎儿球蛋白(AFP)项目中，如将捕获抗体(单克隆抗体)直接包被微孔板，所获得的剂量-反应曲线于150纳克/毫升处趋于平缓；相反，如采用生物素标记牛丙种球蛋白-链霉亲和素的酶标板，并用生物素标记捕获抗体后，所获得的剂量-反应曲线于250纳克/毫升处才趋于平缓，表明本发明的生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板能有效拓宽检测范围。

表3不同模式剂量-反应曲线(甲胎蛋白试剂盒)

实施例6

实施例5的甲种胎儿球蛋白(AFP)试剂盒的性能测试。

两种包被模式均分为两个主要阶段：捕获抗体与待测抗原反应阶段和酶标抗体与待测抗原反应阶段，本发明所述缩短反应达到平衡时间指第一阶段时间，即：捕获抗体和待测抗原反应到达平衡所需时间。表4中的数据为用相同捕获抗体、相同第二阶段反应时间，以甲胎蛋白浓度100ng/ml吸光度值(A)作为观察是否达到平衡参数。结果显示，直接模式30分钟并未达到最大吸光度值(100ng/ml)，延长时间吸光度值继续增加，说明反应未达到平衡；而间接包被模式30分钟并未达到最大吸光度值，延长时间吸光度值不再继续增加，说明反应已达到平衡，表明了本发明能有效缩短抗体抗原反应到达平衡的时间。

表4不同模式反应到达平衡所需时间(甲胎蛋白试剂盒)

以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一种生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板，包括聚苯乙烯微孔板，其特征在于：聚苯乙烯微孔板的每个微孔内预先包被有1.5-3.0微克生物素标记的牛丙种球蛋白、2.7-3.3微克链霉亲和素，并用封闭溶液封闭。

2.根据权利要求1所述的酶标板，其特征在于：每个微孔内预先包被有2.25微克生物素标记的牛丙种球蛋白、3.0微克链霉亲和素，并用250微升封闭溶液封闭；优选的，所述封闭溶液由如下组分制得：

NaH₂PO₄2H₂O     0.29g

Na₂HPO₄12H₂O    2.9g

ACA             2g

NaCl            8.76g

ddH₂O900ml，调pH＝7.3-7.5

牛血清白蛋白    4.0g

蔗糖            35g

Procilin 300    0.5ml

加ddH₂O定溶至1000ml。

3.根据权利要求1或2所述的酶标板，其特征在于：所述聚苯乙烯微孔板为96孔聚苯乙烯微孔板。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述酶标板的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备生物素标记的牛丙种球蛋白溶液；

(2)制备酶标板：

1)在聚苯乙烯微孔板的每个微孔中加入150微升，经缓冲液-I稀释至10-20微克/毫升的生物素标记的牛丙种球蛋白溶液，将微孔板放在密封的容器内，室温下放置16-18小时；

2)甩净微孔内溶液，并拍干；用缓冲液-I洗涤微孔板2次，每次每孔加300微升缓冲液-I，静置20秒，吸干；

3)甩净微孔内溶液，并拍干；

4)每个微孔中再加入150微升，经缓冲液-II稀释至18-22微克/毫升的链霉亲和素溶液，将微孔板放在密封的容器内，室温下放置2小时；

5)甩净微孔内溶液，并拍干；用缓冲液-II洗涤微孔板2次，每次每孔加300微升缓冲液-II，静置20秒，吸干；

6)每个微孔中再加入封闭溶液250微升，将微孔板放在密封的容器内，4℃，放置过夜；

7)重复步骤3)；

8)将经步骤7)得到的聚苯乙烯微孔板真空干燥至少6小时，得所述的酶标板；

所述缓冲液-I由如下组分制得：

ddH₂O     900ml

Tris      6.05g

NaCl      8.77g

调pH＝8.0，加0.5ml Procilin 300，再加ddH₂O定容至1000ml；

所述缓冲液-II由如下组分制得：

ddH₂O           900ml

NaH₂PO₄.2H₂O    4.68g

Na₂HPO₄.12H₂O   7.16g

NaCl            8.77g

L-Tryptophan    0.2g

调pH＝8.0，加ddH₂O定容至1000ml。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述生物素标记的牛丙种球蛋白溶液由如下方法制备得到：

(1)用0.1M，pH 9.5的碳酸盐缓冲液溶解牛丙种球蛋白，并稀释至0.5-1.0 mg/ml；

(2)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与牛丙种球蛋白的摩尔比为(20-10)∶1比例将二者混合，并在室温下搅拌反应3-6小时，优选4小时；

(3)将经步骤(2)反应后的液体用0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲盐水于4℃透析24小时，去除游离生物素；

(4)用紫外吸收测定经步骤(3)标记好生物素标记的牛丙种球蛋白溶液蛋白含量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：按照生物素与牛丙种球蛋白的摩尔比18∶1比例将二者混合。

7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于：步骤2)和5)中用洗板机洗涤微孔板。

8.一种试剂盒，其特征在于：包括生物素标记的捕获抗体以及权利要求1-3任一项所述的酶标板。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的捕获抗体是生物素化EPO抗体，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记的EPO抗体。

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