CN102809657B - 食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102809657B CN102809657B CN201210313953.4A CN201210313953A CN102809657B CN 102809657 B CN102809657 B CN 102809657B CN 201210313953 A CN201210313953 A CN 201210313953A CN 102809657 B CN102809657 B CN 102809657B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- biotin
- reaction plate
- enzyme reaction
- streptavidin
- allergen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供一种食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括：(1)预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板、(2)生物素标记的食物变应原、(3)生物素标记抗人IgG抗体、(4)人IgG标准品、(5)阳性质控血清、(6)酶标记抗人IgG抗体、(7)常规酶标清洗液、(8)显色液A、(9)显示液B和(10)终止液。本发明的试剂盒使得检测人员可以根据被检者的具体情况灵活选择所需检测的食物变应原，将生物素标记变应原和待测血清同时加入微孔板内，实现即时包被，并且包被和检测过程同步进行，大大降低了检测成本，提高了检测灵活性，实现个性化检测。
Description
技术领域
本发明属于酶联免疫检测领域，尤其是涉及一种食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
变态反应性疾病是现代社会中常见的一种疾病，它是由广泛存在的变应原引发的，我国大约有5-10％的人受变应原的侵扰。引发过敏反应的物质称为变应原，其中食物是一种重要变应原。人体对食物敏感可引起食物变态反应，目前认为主要有两种类型：由IgE介导的速发型过敏反应，反应通常发生迅速，病症明显；由IgG介导的迟发型变态反应，此种反应通常在接触食物几小时或几天后才会出现反应症状，如长期疲劳、关节炎、荨麻疹、湿疹、头痛、肠胃功能失调及其它慢性症状。通常情况下，将由食物引起，IgG介导的异常反应称之为食物不耐受。食物不耐受患者体内会产生食物特异性IgG抗体，检测血清特异性IgG抗体对于确定不耐受食物鉴别和诊断具有重要价值。目前临床上常采用检测特异性抗体来确定引起患者不耐受的食物类型，而酶联免疫吸附实验是常用的检测方法。
传统的食物变应原IgG抗体酶联免疫检测法通常采用的都是直接包被模式，即由生产厂家预先将变应原固相化于作为载体的聚苯乙烯微孔板上，供检测人员直接使用。其原理是将变应原成份包被于固相载体表面，用其结合患者血清中的特异性抗体，再通过进一步结合酶标记抗体进行显色反应来判断结果，从而确定患者血清中是否存在包被抗原所对应的特异性抗体。然而，引起食物过敏的物质种类繁多，同一患者可对多种食物过敏，并且存在明显的个体差异。在检测时往往需要同时进行多种变应原的检测，而每一个患者所需的检测组合又各不相同。
传统试剂常常由生产厂家将多种变应原同时包被于微孔板制成类似套餐性质的检测组合，由于采用直接包被法，组合方式无法改变。而实际工作中，每一患者的检测需要各不相同，食物过敏组合是个性化的，这往往与厂家提供的项目组合产生冲突，造成多余的检测和漏检，同时会增加检测成本。例如：目前国内实验室主要使用由BIOMERICA公司生产的酶联免疫法试剂盒，该试剂盒可同时检测6例患者，每例患者可检测(必须检测)14种食物变应原，组合方式不能改变。此外，该试剂盒在固定位置可测定2条标准曲线，对血清特异性IgG进行定量。因此，此试剂盒只能进行两次测定，每次测定3例患者血清。
发明内容
为了克服传统直接包被模式制备的食物过敏酶标反应板无法满足患者个性化需求的不足，本发明引入生物素-链霉亲和素间接包被模式，对酶标反应板的包被制作环节进行改进。变应原不需预先包被，而是标记上生物素，与包被了亲和素的微孔反应板同时提供给检测人员。检测人员可以根据被检者的具体情况灵活选择所需食物变应原，将生物素标记变应原和待测血清同时加入微孔板，实现即时包被，并且包被和检测过程同步进行，大大降低了检测成本，提高了检测灵活性，真正实现个性化检测。
生物素(biotin，B)分子量为244.31，现已能人工合成，制备方便。生物素基本结构为双环结构：I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的部位；II环为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体等。生物素与生物大分子结合后并不影响生物大分子和生物素原有的生物活性，即生物素标记抗体同时具备与亲和素和相应抗原结合之特性。
链霉亲合素(streptavidin，SA)，分子量65KD，由四条相同的肽链组成，一个链霉亲合素分子能结合四个生物素分子。与亲和素相比，链霉亲和素对生物素具有高度亲和力(亲和常数为1015/mol)，与生物素结合后形成非常稳定复合物，很难解离。基于生物素与链霉亲和素相结合这一特性所建立的体系称为生物素-亲和素系统。
本发明采用的技术方案是：
一种食物不耐受血清特异性IgG酶联免疫检测试剂盒，主要包括：
(1)预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板；
(2)生物素标记的食物变应原；
(3)生物素标记抗人IgG抗体；
(4)人IgG标准品；
(5)阳性质控血清；
(6)酶标记抗人IgG抗体
(7)常规酶标清洗液
(8)显色液A：含0.054％(V/V)H2O2的磷酸盐柠檬酸缓冲液；
(9)显示液B：含0.48g/L TMB的柠檬酸缓冲液；
(10)终止液：1mol/L H2SO4溶液。
本发明试剂盒的主要作用过程如下：
在微孔板(酶标反应板)上包被连接了生物素的牛血清白蛋白，再进一步连接链霉亲和素，形成生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素通用反应板，即预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板；将常见的多种食物变应原分别标记生物素，使用时根据患者的病史等情况选择所需的生物素标记的食物变应原分别加入酶标反应板，同时加入21倍稀释的患者血清，血清中的特异性抗体(即特异性IgG)与相应生物素标记的食物变应原结合形成免疫复合物(变应原-特异性抗体复合物)；由于该复合物含有生物素分子，它通过生物素和预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板上的链霉亲和素结合，从而将复合物固定于微孔板上，之后的反应过程和结果判读过程同传统的酶联免疫检测模式，即洗板去除未结合成分，再加入酶标记的第二抗体(酶标抗人IgG抗体)同固定于微孔板的待测抗体结合，通过酶催化底物显色而得出结果。如果血清中不含该特异性抗体，则反应不能顺利进行，最终不会显色。特异性IgG含量可通过标准曲线获得。
标准曲线的制作需要5个测试孔，分别加入加入生物标记抗人IgG抗体和不同浓度的标准品；洗板去除未结合成分，再加入酶标记的第二抗体(酶标抗人IgG抗体)同固定于微孔板的待测抗体结合，通过酶催化底物显色而得出结果并绘制标准曲线。
阳性质控测试孔加样方式同待测血清标本。
优选的，所述试剂盒中，
预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板的每个微孔中包被有0.75微克的生物素化牛血清白蛋白和0.45微克的链霉亲和素。
生物素标记的食物变应原的蛋白浓度为10-20微克/毫升，优选15微克/毫升；
生物素标记抗人IgG抗体的蛋白浓度为2-4微克/毫升，优选3微克/毫升；
用于做标准曲线的人IgG标准品含有六个浓度，分别是0U/ml”、“50U/ml”、“100U/ml”、“200U/ml”和“400U/ml；
酶标记抗人IgG抗体的稀释比例1∶12000。
优选的，所述生物素标记的食物变应原为牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、小麦变应原、花生变应原、腰果变应原、蟹变应原和黄豆变应原中的一种或几种，更优选的，所述试剂盒包括了上述八种食物变应原。
优选的，所述酶标反应板是可拆卸式96孔聚苯乙烯微孔板。
本发明还提供了一种制备所述试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)在酶标反应板上包被生物素化牛血清白蛋白，再进一步连接链霉亲和素，得到预包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板；
(2)用生物素标记的食物变应原；
(3)制备生物素标记抗人IgG抗体；
(4)预包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板、生物素标记的食物变应原、生物素标记抗人IgG抗体、人IgG标准品、阳性质控血清、酶标记抗人IgG抗体、常规酶标清洗液、显色液A、显示液B和终止液组装成成品。
本发明具有的优点和积极效果是：
1、本发明克服了传统的直接包被模式不能满足患者个性化检测需求的不足，便于检测人员根据需要灵活选择项目组合，提高了检测试剂的通用性和利用率，同时避免无关项目的检测和试剂浪费，相当于从“雕版印刷”改进为“活字印刷”，由于包被和检测过程的同步进行，反应时间和操作程序并未增加，并且使得操作更加方便。
2、简化试剂盒的制备工艺。现有产品需要将96孔酶标反应板各孔分别包被不同的食物变应原，并做好标记，然后根据需要进行组装。本发明提供的酶标反应板所包被的生物分子相同(生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素)，且包被程序完全相同，如此改进大幅度简化酶标板的制备工艺，且避免了由于变应原组装出现错误影响检测结果的情况。
3、传统直接包被模式中，食物变应原直接包被在固相材料表面，由于受空间位阻效应的影响，会影响抗原与待测抗体结合。本发明所采取的间接包被模式，将生物素标记食物变应原置于液相中，与液相中的待测抗体反应，形成免疫复合物后再通过生物素分子与酶标板的链霉亲和素结合，此种方式由于食物变应原在液相中保持原有空间构象，利于与待测抗体结合。
附图说明
图1是直接包被和间接包被模式的比较，
图2是标准曲线测定和特异性IgG测定反应原理示意图，
图3是直接包被和间接包被反应模式的比较。
图4是血清IgG定量剂量-反应曲线。
图1-图3中，
1、酶标反应板的单个孔，2、食物变应原(已知抗原)，3、生物素化牛血清白蛋白，4、链霉亲和素，5、生物素标记的食物变应原，6、待测抗体(特异性IgG)，7、酶标记抗人IgG抗体，8、生物素标记抗人IgG抗体，9、人IgG标准品。
图1中的a为直接包被模式，食物变应原直接包被于固相载体表面，不同反应孔包被不同食物变应原；
图1中的b为间接包被模式，微孔板各孔分别包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素；食物变应原不直接包被而是标记生物素，并置于液相中，检测时生物素标记的食物变应原与待测抗体结合后再借助生物素亲和素系统结合于固相材料表面。
图2中，a显示标准曲线定量测定IgG的原理：生物素标记的抗人IgG抗体与不同浓度的人IgG标准品反应形成免疫复合物(生物素抗人IgG抗体-人IgG)，借助生物素-亲和素系统，此复合物被固定于固相材料表面；再加入酶标记抗人IgG抗体，形成双抗体夹心复合物(生物素抗人IgG-人IgG-酶标抗人IgG)。
图2中，b显示特异性IgG测定原理：生物素标记的食物变应原(生物素抗原)与待测血清中特异性IgG反应形成免疫复合物(生物素抗原-特异性IgG)，借助生物素-亲和素系统，此复合物被固定于固相材料表面；再加入酶标记抗人IgG抗体，形成双抗体夹心复合物(生物素抗原-特异性IgG-酶标抗人IgG)。此外，特异性IgG含量可通过标准曲线获得。
图3中，a为直接包被模式，包被于固相材料的食物变应原与液相中的待检IgG结合形成免疫复合物，此过程为固相抗原与液相抗体之间的反应。因食物变应原已被固定于特定检测孔，此孔只能用于检测本抗原相对应的IgG抗体。
图3中，b为间接包被模式，待测抗体和生物素标记的食物变应原均处于液相中，此种反应效率高于固相与液相之间的反应；二者形成免疫复合物的同时借助生物素-亲和素系统再用固相载体结合。此为，微孔板各孔均为通用孔，可根据检测食物抗体种类不同，选择相应生物素标记的食物变应原。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
一种食物不耐受血清特异性IgG酶联免疫检测试剂盒，包括如下组分：
(1)预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板
(2)多种生物素标记的食物变应原，包括生物素标记的牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、小麦变应原、花生变应原、腰果变应原、蟹变应原和黄豆变应原；
(3)生物素标记抗人IgG抗体(羊抗人IgG抗体，ABCAM公司，货号ab48386)
(4)不同浓度的人IgG标准品(将纯品IgG(ABCAM公司，货号ab91102)用含1％小牛血清的pH 7.40.1M PBS配制成5个不同浓度作为标准品，标准品浓度分别是“0U/ml”、“50U/ml”、“100U/ml”、“200U/ml”、“400U/ml”，标准品经国际质控血清校准。)
(5)阳性质控血清(阳性质控血清由50例食物特异性IgG中等轻度阳性血清(100～200U/ml)混合后获得，此血清分别含有八种食物特异性IgG，使用时视为临床标本一同检测。)
(6)酶标记抗人IgG抗体(Southern Biotech公司，货号6140-05；稀释比例1∶12000，用含10％小牛血清的pH 7.40.1M PBS稀释即可)
(7)常规酶标清洗液
(8)显色液A：含0.054％(V/V)H2O2的磷酸盐柠檬酸缓冲液；
(9)显示液B：含0.48g/L TMB的柠檬酸缓冲液；
(10)终止液：1mol/L H2SO溶液。
所述试剂盒通过如下方法制备得到：
(1)溶液配制
(1)稀释液I
调pH至8.0，加0.5ml Procilin 300，加ddH2O定容至1L。
(2)生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液
用稀释液I将生物素化牛血清白蛋白稀释，终浓度为5μg/ml，充分搅拌混匀。
(3)稀释液II
调pH至8.0，加ddH2O定容至1L。
(4)链霉亲和素包被缓冲液
用稀释液II将链酶亲和素稀释，终浓度为3μg/ml，充分搅拌混匀。
(5)封闭溶液
调pH至7.3-7.5
BSA (牛血清白蛋白) 2.0g
蔗糖 17.5g
Procilin 300 0.25ml
加ddH2O定容至500ml
(6)磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.4)
ddH2O (双蒸水) 3600ml
NaH2PO4·2H2O(磷酸二氢钠) 11.84g
Na2HPO4·12H2O(磷酸氢二钠) 116g
调pH至7.3-7.45，加ddH2O定容至4L。
(7)碳酸氢钠缓冲液(0.1mol/L，pH9.5)
NaHCO3 (碳酸氢钠) 8.4g
ddH2O (双蒸水) 800ml
用1mol/L NaOH和6mol/L HCL调节pH值至9.5，去离子水定容至1L。
(8)显色液A，市售商品，也可通过如下方法制备得到：
调节pH至5.3，ddH2O定容至500ml，分装，4℃储存。
(9)显色液B，市售商品，也可通过如下方法制备得到：
上述反应注意避光，调节pH值3.0，用ddH2O定容至500ml，分装，4℃储存。
(10)终止液
用常规方法将98％的浓硫酸用ddH2O配制成1mol/L的酶标终止液，4℃储存。
(11)0.1M，pH 8.0的Tris-HCl溶液
Tris(三羟甲基氨基甲烷) 12.12克
ddH2O(双蒸水) 70毫升
充分溶解后，用HCl调节pH至8.0，加ddH2O定容至100毫升
(2)生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素酶标反应板的制备
(1)在空白酶标反应板(可拆卸式96孔聚苯乙烯微孔板)的每个微孔中加入150微升生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液，将酶标反应板放在密封的容器内，18-25℃，温浴16-18小时；
(2)甩净包被缓冲液，用稀释液I洗酶标反应板2次，300微升每孔，每次需静置10分钟。
(3)甩净稀释液，并在干净的毛巾上拍干。
(4)在酶标反应板的每个微孔再加入150微升链霉亲和素包被缓冲液，将酶标反应板放在密封的容器内，18-25℃，温浴2小时；
(5)甩净包被缓冲液，用稀释液Ⅱ洗酶标板2次，300微升每孔，每次需静置10分钟。
(6)重复(3)。
(7)在酶标反应板的每个微孔再加入250微升封闭溶液，将酶标反应板放在密封的容器内，4℃，温浴过夜；
(8)甩净封闭溶液，并在干净的毛巾上拍干。将微孔板真空干燥至少6小时。取出后放置于干燥室及时真空包装备用。
(3)生物素标记的变应原的制备
(1)将用常规方法将纯化好的用于检测特异性抗体的食物变应原浓度调整为约5毫克每毫升，分别用0.1摩尔每升，pH9.5的NaHCO3缓冲液透析，过夜，并于280nm处测吸光度值，计算蛋白总量，得蛋白溶液。
(2)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素与变应原的摩尔比为20∶1的比例，将生物素缓慢、逐滴加入得蛋白溶液中，边滴加边搅拌，全加入后室温搅拌条件下继续反应1h；。
(3)将反应后的液体用0.1mol/L磷酸盐缓冲液于4℃透析24小时，其中换液数次，充分除去未结合的生物素，用0.1M，pH 8.0的Tris-HCl溶液将生物素标记的食物变应原的蛋白浓度稀释至为10-20微克/毫升，优选15微克/毫升；
(4)将每种候选的变应原标记生物素后，分别装于试剂瓶中，与生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素酶标反应板配套使用。
(4)生物标记的抗人IgG抗体的制备方法同生物素标记的变应原的制备，用0.1M，pH 8.0的Tris-HCl溶液将生物素标记抗人IgG抗体的蛋白浓度稀释至2-4微克/毫升，优选3微克/毫升。
(4)将以下组分组装成试剂盒：
A预包被生物素化牛血清白蛋白-链酶亲和素酶标反应板
B生物素标记的食物变应原
C生物素标记的抗人IgG
D人IgG标准品
E阳性质控血清
F酶标记抗人IgG抗体
G常规酶标清洗液
H显色液A
I显色液B
G终止液。
实施例2
一种实施例1制备的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
1、根据检测目的和患者病史等情况，检测人员可从提供的生物素标记的食物变应原中自由选择出要检测的一种或多种变应原进行项目组合，如选择牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、小麦变应原、花生变应原、腰果变应原、蟹变应原和黄豆变应原中的一种或几种的组合物。
2、通过如下方法使用所述试剂盒：
(1)准备根据需要取出酶标反应板(预先包被有生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素)。测试孔数量为：样本数×系数+5个标准曲线点+阳性质控血清，系数为每个样本测定食物变应原种类数。将生物素标记的食物变应原试剂、酶标记抗人IgG抗体、显色液A、显色液B、终止液等放置室温条件下平衡20min以上。
(2)稀释标本用pH7.40.1mol/L PBS将血清标本稀做21倍稀释，即10μl待测血清加入200微升PBS溶液，血清稀释可在稀释微孔板中进行。
(3)加样与温浴标准曲线测试孔分别加入100μl生物标记的抗人IgG抗体和25μl不同浓度的人IgG标准品；样品和质控血清测试孔分别加入25μl已稀释待检样本(或质控血清)和100μl生物素标记的食物变应原溶液，充分混匀，置37℃水浴60min。
(4)洗板取出酶标反应板，弃反应液，用常规酶标洗液将微孔板洗涤5次，最后一次拍干液体。
(5)加酶标抗体加入酶标抗人IgG(标记抗体)，125μl/孔，置37℃中水浴30min。
(6)洗板重复步骤“(4)”。
(7)显色加入显色液A和显色液B，各50μl/孔；室温、避光条件下反应15min；各孔继续加入终止液50μl；充分混匀后读取A450nm。
(8)结果判断首先，以标准品浓度为横坐标(X)，相应浓度的A450nm纵坐标(Y)，采用四参数拟合方式绘制剂量-反应曲线，即特异性IgG定量标准曲线，并获得数学函数模型。其次，应用绘制剂量-反应曲线或数学函数模型，通过测定的A450nm获得相应特异性IgG的浓度。
特异性IgG定量标准曲线的制作如下：
分别以不同浓度的(“0U/ml”、“50U/ml”、“100U/ml”、“200U/ml”、“400U/ml”)人IgG标准品为横坐标，吸光度(A450nm)为纵坐标，采用四参数Logistic曲线拟合方式，生物素标记抗IgG抗体稀释度为1∶8000(2-4微克/毫升)，酶标记抗-人IgG稀释度为1∶12000，标准曲线如所图4所示。
特异性IgG标准分为4级：
阴性：小于等于50U/ml；
弱阳性：大于50U/ml并小于等于100U/ml；
中等阳性：大于100U/ml并小于等于200U/ml；
强阳性：大于200U/ml；
实施例3
本发明的试剂盒的性能检测如下：
精密度测定
以蛋、奶为例：分别选取阴性血清、蛋清和牛奶阳性血清、强阳性血清，分别进行批内测定和批间测定，各测定10次，获得酶联免疫法测定特异性IgG的批内、批间精密度，如表1和表2所示。
从表1和表2中结果可以看出，本发明的试剂盒具有较好的精密度，能够达到酶联免疫诊断试剂的基本要求。
表1蛋清特异性IgG精密度测试结果
表2牛奶特异性IgG精密度测试结果
特异性测定
以蛋奶为例，分别选取其他食物(虾、蟹、豆类、羊肉、牛肉)等不耐受患者血清，应用间接包被模式测定蛋清特异IgG和牛奶特异IgG，分别计算与这些物质交叉反应率(蛋清或牛奶IgG/交叉物质IgG)。结果显示：用本发明的试剂盒测定蛋清特异IgG时，与虾、蟹、豆类、羊肉、牛肉特异性IgG无交叉反应(交叉反应率低于0.5％)；测定牛奶特异性IgG 时，与虾、蟹、豆类、羊肉等特异性IgG无交叉反应(交叉反应率低于0.5％)，但发现与牛肉特异性IgG存在交叉反应，交叉反应率为4.2％。
与参比试剂比对结果
以美国Biomerica酶联免疫(间接法)作为参比方法，间接包被酶联免疫法分别测定牛奶特异性IgG和蛋清特异性IgG。结果如表3、表4所示：蛋清特异性IgG测定结果：敏感度为90.7％(39/43)，特异度为95.0％(38/40)，准确度为92.8％(77/83)；阳性预测值为95.1％(39/41)，阴性预测值为90.5％(38/42)。同时，牛奶特异性IgG测定结果：敏感度为92.1％(35/38)，特异度为90.0％(36/40)，准确度为91.0％(71/78)；阳性预测值为89.7％(35/39)，阴性预测值为92.3％(36/39)。
表3本发明试剂盒与参比试剂检测结果(蛋清)
表4本发明试剂盒与参比试剂检测结果(牛奶)
以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (5)
1.一种食物不耐受血清特异性IgG酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：
(1)预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板；
(2)生物素标记的食物变应原；
(3)生物素标记抗人IgG抗体；
(4)人IgG标准品；
(5)阳性质控血清；
(6)酶标记抗人IgG抗体；
(7)常规酶标清洗液；
(8)显色液A：含0.054％(V/V)H2O2的磷酸盐柠檬酸缓冲液；
(9)显示液B：含0.48g/L TMB的柠檬酸缓冲液；
(10)终止液：1mol/L H2SO4溶液；
预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板的每个微孔中包被有0.75微克的生物素化牛血清白蛋白和0.45微克的链霉亲和素；
生物素标记的食物变应原的蛋白浓度为15微克/毫升；
生物素标记抗人IgG抗体的蛋白浓度为3微克/毫升；
用于做标准曲线的人IgG标准品含有五个浓度，分别是0U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml和400U/ml。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的食物变应原为牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、小麦变应原、花生变应原、腰果变应原、蟹变应原和黄豆变应原中的一种或几种。
3.一种制备权利要求1或2所述试剂盒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)在酶标反应板上包被生物素化牛血清白蛋白，再进一步连接链霉亲和素，得到预包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板；
(2)用生物素标记食物变应原；
(3)制备生物素标记抗人IgG抗体；
(4)预包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板、生物素标记的食物变应原、生物素标记抗人IgG抗体、人IgG标准品、阳性质控血清、酶标记抗人IgG抗体、常规酶标清洗液、显色液A、显示液B和终止液组装成成品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)包括如下步骤：
[1]配制稀释液Ⅰ、稀释液Ⅱ、封闭溶液；
稀释液Ⅰ由如下组分制备得到：
稀释液Ⅱ由如下组分制备得到：
封闭溶液由如下组分制备得到：
[2]配制生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液
用稀释液Ⅰ将生物素化牛血清白蛋白稀释至5μg/ml；
[3]配制链霉亲和素包被缓冲液
用稀释液Ⅱ将链霉亲和素稀释至3μg/ml；
[4]制备预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板
①在空白酶标反应板的每个微孔中加入150微升生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液，将酶标反应板放在密封的容器内，18-25℃，温浴16-18小时；
②甩净包被缓冲液，用稀释液Ⅰ洗酶标反应板2次，300微升每孔，每次静置10分钟；
③甩净稀释液，并拍干；
④在酶标反应板的每个微孔再加入150微升链霉亲和素包被缓冲液，将酶标反应板放在密封的容器内，18-25℃，温浴2小时；
⑤甩净包被缓冲液，用稀释液Ⅱ洗酶标反应板2次，300微升每孔，每次静置10分钟；
⑥甩净稀释液，并拍干；
⑦在酶标反应板的每个微孔再加入250微升封闭溶液，将酶标反应板放在密封的容器内，4℃，温浴过夜；
⑧甩净封闭溶液，并拍干，将酶标反应板真空干燥至少6小时，得预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：用生物素标记食物变应原包括如下步骤：
①将纯化好的用于检测特异性抗体的变应原调整为5毫克每毫升，分别用0.1摩尔每升，pH9.5的NaHCO3缓冲液透析，过夜，并于280nm处测吸光度值，计算蛋白总量，得蛋白溶液；
②将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与变应原的摩尔比为20:1的比例，将生物素缓慢滴入蛋白溶液中，边滴加边搅拌，全加入后室温搅拌条件下继续反应1h；
③将反应后的液体用0.1摩尔每升的PBS于4℃透析24小时，充分除去未结合的生物素后，即得到所述生物素标记的变应原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210313953.4A CN102809657B (zh) | 2012-08-29 | 2012-08-29 | 食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210313953.4A CN102809657B (zh) | 2012-08-29 | 2012-08-29 | 食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102809657A CN102809657A (zh) | 2012-12-05 |
| CN102809657B true CN102809657B (zh) | 2015-07-29 |
Family
ID=47233417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210313953.4A Expired - Fee Related CN102809657B (zh) | 2012-08-29 | 2012-08-29 | 食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102809657B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016058237A1 (zh) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | 苏州浩欧博生物医药有限公司 | 一种过敏原阳性血清的纯化制备方法 |
| CN110672856A (zh) * | 2019-09-27 | 2020-01-10 | 广州博厚健康科技有限公司 | 一种基于多重微阵列的食物不耐受特异性IgG检测试剂盒 |
| CN115792248A (zh) * | 2023-02-13 | 2023-03-14 | 江西赛基生物技术有限公司 | 食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1424345A1 (en) * | 2001-05-14 | 2004-06-02 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Method for extracting gluten contained in heat-processed and non-heat-processed foodstuffs, compatible with an enzyme-linked immunosorbent assay, composition and kits comprising said composition |
| CN101109750A (zh) * | 2007-07-27 | 2008-01-23 | 杭州浙大生科生物技术有限公司 | 食物过敏原特异性IgG ELISA检测试剂盒及其制备方法 |
| KR20090029868A (ko) * | 2007-09-19 | 2009-03-24 | 한국생명공학연구원 | 체액 내 간암 마커로서의 아넥신 2 및 이를 이용한 간암진단 키트 |
| CN102207501A (zh) * | 2011-03-22 | 2011-10-05 | 沃克(天津)生物科技有限公司 | 生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法 |
| CN102331495A (zh) * | 2011-06-21 | 2012-01-25 | 沃克(天津)生物科技有限公司 | 食物过敏原检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102520157A (zh) * | 2011-12-22 | 2012-06-27 | 北京海瑞祥天生物科技有限公司 | 食物过敏原IgG抗体检测用微孔板、试剂盒、制备方法及检测方法 |
| CN102636650A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-08-15 | 沃克(天津)生物科技有限公司 | 牛奶过敏原检测板及其制备方法 |
-
2012
- 2012-08-29 CN CN201210313953.4A patent/CN102809657B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1424345A1 (en) * | 2001-05-14 | 2004-06-02 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Method for extracting gluten contained in heat-processed and non-heat-processed foodstuffs, compatible with an enzyme-linked immunosorbent assay, composition and kits comprising said composition |
| CN101109750A (zh) * | 2007-07-27 | 2008-01-23 | 杭州浙大生科生物技术有限公司 | 食物过敏原特异性IgG ELISA检测试剂盒及其制备方法 |
| KR20090029868A (ko) * | 2007-09-19 | 2009-03-24 | 한국생명공학연구원 | 체액 내 간암 마커로서의 아넥신 2 및 이를 이용한 간암진단 키트 |
| CN102207501A (zh) * | 2011-03-22 | 2011-10-05 | 沃克(天津)生物科技有限公司 | 生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法 |
| CN102331495A (zh) * | 2011-06-21 | 2012-01-25 | 沃克(天津)生物科技有限公司 | 食物过敏原检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102520157A (zh) * | 2011-12-22 | 2012-06-27 | 北京海瑞祥天生物科技有限公司 | 食物过敏原IgG抗体检测用微孔板、试剂盒、制备方法及检测方法 |
| CN102636650A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-08-15 | 沃克(天津)生物科技有限公司 | 牛奶过敏原检测板及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102809657A (zh) | 2012-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103364568B (zh) | 一种层粘连蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN102331495B (zh) | 食物过敏原检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN102998467B (zh) | β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN108445230B (zh) | 基于纳米抗体的降钙素原化学发光检测试剂及检测方法 | |
| CN106771147B (zh) | 一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶a2试剂盒及其使用方法 | |
| CN102590497A (zh) | 胱氨酸蛋白酶抑制剂c检测试剂盒 | |
| CN102539784B (zh) | 心肌肌钙蛋白i检测试剂盒 | |
| CN103837674A (zh) | 特异性IgE抗体的检测方法、该方法所使用的试剂盒以及该试剂盒的制备和使用方法 | |
| CN102998465B (zh) | 血管紧张素ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN102998466A (zh) | 生长激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN102207501A (zh) | 生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法 | |
| CN102809657B (zh) | 食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN108398555A (zh) | 一种胃蛋白酶原i（pgi）检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN103033627A (zh) | 一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法和试剂盒 | |
| CN102876634B (zh) | 孕马血清促性腺激素双抗体夹心elisa试剂盒 | |
| CN109001471A (zh) | 游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光检测试剂盒及其制备方法和使用方法 | |
| CN102998462B (zh) | Ⅲ型前胶原磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN101561433A (zh) | 一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒 | |
| CN107247138A (zh) | 一种测定d‑二聚体含量中化学发光板的包被方法 | |
| CN101201359B (zh) | 检测中期因子浓度的elisa试剂盒及其使用方法 | |
| CN102809650B (zh) | 生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法 | |
| CN109142337A (zh) | 空间邻近化学发光法检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及其检测方法 | |
| CN102749461B (zh) | 游离β人绒毛膜促性腺激素化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN107843733A (zh) | 一种妊娠相关血浆蛋白a的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 | |
| CN102680713B (zh) | 竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊c肽检测试剂盒及制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160111 Address after: 300060, AsiaInfo building, No. 35, Nanjing Road, Tianjin, Hexi District 1402 Patentee after: Tianjin Zhongqi Huake Biological Technology Development Co. Ltd. Address before: 300384 Tianjin City, Nankai District Huayuan Rong Yuan Road No. 16, Xinmao science and Technology Park A block I unit 6 Patentee before: Watson & Crick (Tianjin) Biotechnology Co., Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150729 Termination date: 20180829 |