CN102520157A - 食物过敏原IgG抗体检测用微孔板、试剂盒、制备方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了食物过敏原IgG抗体检测用微孔板，所述微孔板上包被有多种不同种类的食物过敏原蛋白；本发明还公开了包含上述微孔板的食物过敏原IgG抗体检测用试剂盒、制备方法及检测方法。本发明可在一块微孔板上同时进行多种指标的检测(2-90种左右)，而且可定量分级，为医生对疾病严重程度的判定与指导治疗提供了有力的依据，同时也解决了单一指标的检测费时费力，成本高的问题。

Description

食物过敏原IgG抗体检测用微孔板、试剂盒、制备方法及检测方法

技术领域

本发明涉及酶联免疫吸附检测领域，具体地，涉及食物过敏原IgG抗体检测用微孔板、试剂盒、制备方法及检测方法。

背景技术

随着社会的发展与科技的进步，人们的生活节奏越来越快，食物种类日渐繁杂。随之而来的是，肠易激综合征、慢性疲劳综合征、失眠等诸多症状也困扰着越来越多的人群，越来越多的人患上了慢性疾病，还有更多的人处于亚健康状态。可是这部分人去医院检测时往往又查不出病症，不能明确病因并采取相应的治疗手段。在欧美等发达国家，针对这类人群的检测技术有了明显的发展，开始利用酶联免疫检测技术检测人体血清中的食物特异性抗体水平，从而找到食物与健康的关系，这一技术被称为食物不耐受检测技术。此项技术正在迅速被发达国家的临床医院及健康体检中心接受，并取得良好的效果。

食物不耐受是一种复杂的变态反应性疾病，人的免疫系统把进入体内的某种或多种食物当作是有害物质，并针对这些物质产生过度的保护性免疫反应，产生食物特异性IgG抗体，IgG抗体与食物颗粒形成免疫复合物(III型变态反应)，可能引起所有组织(包括血管)发生炎症反应，并表现为全身各系统的症状与疾病。

统计资料显示，约50％以上人群存在不同程度的食物不耐受现象，根据英国过敏协会的资料，人群中有高达45％的人对某些食物不耐受，食物不耐受可发生于各个年龄段，其主要表现为食物不耐受引起的长期慢性症状。研究表明，食物不耐受的影响可遍及全身各系统，比如在胃肠道系统，食物不耐受可发生于从口到肛门的所有消化器官，常见症状表现为腹胀、消化不良、腹泻、腹痛等，病情迁延，临床表现既可以在消化道局部，又可以在远离消化道的部位，常因缺乏有效的诊断手段被临床忽略而延误诊。食物不耐受也是肠道激惹综合征(IBS)的原因之一(1992，Jone setal.1996，Bischoff et al.)，而在食物诱发的肠炎患者中，食物与肠炎的相关性也相当高(1984，MaDonald et al.)。诸如此类的症状或疾病往往对病人的工作生活造成严重的影响，如果因此而接受药物治疗，不但无法根除疾病的根源，而且可能给病人和家属带来沉重的经济负担。

由于食物过敏原的种类繁多，常见的、具代表性的种类也有十多种，现有的检测食物过敏原IgG抗体的方法主要为ELISA方法，但都是单一指标的检测，一个样本需要多种试剂盒同时检测，成本昂贵，且费时费力，且往往因为指标检测不全面而找不到病因，很难满足临床的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点和不足，提供一种可同时检测多种食物过敏原IgG抗体的微孔板。

本发明的另一个目的在于提供一种可同时定量检测多种食物过敏原IgG抗体的试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供上述食物过敏原IgG抗体检测用微孔板的制备方法。

本发明的第四个目的在于提供上述食物过敏原IgG抗体检测用试剂盒的制备方法。

本发明的第五个目的在于提供食物过敏原IgG抗体的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

食物过敏原IgG抗体检测用微孔板，所述微孔板上包被有多种不同种类的食物过敏原蛋白。

食物过敏原IgG抗体检测用试剂盒，包括样本稀释液、用于制作标准曲线的标准血清、阳性对照、浓缩清洗液、酶标抗体结合液、底物液、终止液，还包括上述的包被有多种不同种类的食物过敏原蛋白的微孔板。

进一步地，所述样本稀释液为载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中；所述标准血清为阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中；所述阳性对照为阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，浓度为50U/ml；所述浓缩清洗液为吐温溶于磷酸盐缓冲液中；所述酶标抗体结合液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体和载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中；所述底物液包括底物液A和底物液B；所述底物液A为四甲基联苯胺溶于柠檬酸缓冲液中；所述底物液B为过氧化氢溶于醋酸盐缓冲液中；所述终止液为含硫酸的溶液。

食物过敏原IgG抗体检测用微孔板的制备方法，包括以下步骤：

将多种不同种类的食物过敏原蛋白按浓度0.01-50μg/ml溶于碳酸、磷酸、或醋酸缓冲液中，混匀，加入微孔板内，每孔50-200μl，4℃孵育过夜或37℃孵育1-5小时，用含吐温的磷酸盐缓冲液洗板后，再在微孔板内加入封闭液每孔50-200μl，4℃孵育过夜或室温、37℃孵育1-5小时，弃去孔内液体，干燥微孔板，干燥后将微孔板封入铝箔袋中。

食物过敏原IgG抗体检测用试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用上述制备方法制备包被有多种不同种类的食物过敏原蛋白的微孔板；

(2)称取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中配制样本稀释液；

(3)将辣根过氧化物酶与抗人IgG抗体进行标记，称取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入海藻糖配制酶稀释液，将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体溶于酶稀释液中配制酶标抗体结合液；

(4)称取四甲基联苯胺溶于柠檬酸缓冲液中配制底物液A；

(5)量取过氧化氢溶于醋酸盐缓冲液中配制底物液B；

(6)量取吐温溶于磷酸盐缓冲液中配制浓缩清洗液；

(7)量取硫酸溶于纯水中配制终止液；

(8)量取阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入PC-300配制标准血清；

(9)量取阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入PC-300配制阳性对照，阳性对照的浓度为50U/ml；

(10)将配制好的液体分装到相应的小瓶中；

(11)按照试剂盒的组分贴上标签，将各组分放入试剂盒的相应位置组装成完整的试剂盒。

食物过敏原IgG抗体的检测方法，包括如下步骤：

(1)在微孔板相应孔内加入经倍比稀释的标准血清以及阳性对照和经稀释的样本，孵育，清洗；

(2)加酶标抗体结合液，孵育，清洗；

(3)加入底物液，孵育；

(4)加入终止液，酶标仪读数判定；

所述酶标仪读数判定标准为：浓度大于50U/ml的为阳性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明可在一块微孔板上同时进行多种指标的检测(2-90种左右)，而且可定量分级，为医生对疾病严重程度的判定与指导治疗提供了有力的依据，同时也解决了单一指标的检测费时费力，成本高的问题。

2、目前，食物过敏原IgG抗体检测试剂90％以上是国外产品，价格昂贵，成本高，给个人、家庭甚至国家都带来的巨大的经济负担，这使得食物不耐受检测技术在中国的推广应用受到了很大程度的限制。且其试剂盒临界值的确定是根据国外健康人群的抗体浓度水平确立的，由于地区、人种及饮食习惯的差异，这类产品并不真正适用于亚洲人群，有时候会造成检测的假性结果。本发明采集我国健康体检人群的血清，确立完全适用我国的正常参考值范围。本发明制备的试剂盒具有极其好的社会效益和非常可观的经济效益。

具体实施方式

实施例1：14种食物过敏原I gG抗体检测用微孔板及试剂盒的制备

1、将14种食物过敏原蛋白(牛肉、鸡肉、鳕鱼、玉米、蟹、蛋清/蛋黄、蘑菇、牛奶、猪肉、大米、虾、大豆、西红柿、小麦)按10μg/ml溶于50mM的碳酸缓冲液中，混匀。

2、按一定的排列顺序加入微孔板内(每孔100μl)，4℃孵育过夜，用含吐温的磷酸盐缓冲液洗板3次后，再在微孔板内加入封闭液(含2％BSA的磷酸缓冲液)，每孔200μl，4℃孵育过夜。

3、弃去孔内液体，室温过夜干燥微孔板，干燥后将微孔板封入铝箔袋中。

4、称取10gBSA溶于1升50mM磷酸盐缓冲液中配制样本稀释液，按50ml每瓶进行分装。

5、将辣根过氧化物酶与抗人IgG抗体(3∶1)以过碘酸钠法进行标记。

6、称取10gBSA溶于1升50mM磷酸盐缓冲液中并加入保护剂海藻糖配制酶稀释液，将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(1∶2000)溶于酶稀释液中配制酶标抗体结合液，按30ml每瓶进行分装。

7、称取0.2g四甲基联苯胺(TMB)溶于l升柠檬酸缓冲液中配制底物液A，按10ml每瓶进行分装。

8、量取0.6ml过氧化氢溶于1升醋酸盐缓冲液中配制底物液B，按10ml每瓶进行分装。

9、量取10ml吐温溶于1升磷酸盐缓冲液中配制浓缩清洗液，按30ml每瓶进行分装。

10、量取50ml硫酸溶于1升纯水中配制终止液，按10ml每瓶进行分装。

11、量取阳性血清(1∶800)溶于磷酸盐缓冲液中并加入保护剂PC-300配制标准血清，按1ml每瓶进行分装。

12、量取阳性血清(1∶2400)溶于磷酸盐缓冲液中并加入保护剂PC-300配制阳性对照，按1ml每瓶进行分装。

13、按照试剂盒的组分贴上标签，将微孔板、样本稀释液、酶标抗体结合液、标准血清、阳性对照、浓缩清洗液、底物液A和B、终止液、说明书放入试剂盒的相应位置，组装成完整的试剂盒。

实施例2：食物过敏原IgG抗体的检测方法

使用前请将所有试剂平衡至室温。

1、准备绘制标准曲线：

取4支12x75mm玻璃管，分别标记50，100，200和400U/ml。依次在这4个管中加入150μl血清稀释液。在标有400U/ml的管中加入150μl 14种食物过敏原IgG抗体标准血清。混合后，取150μl加入到标有200U/ml的管中；再混合后，取150μl加入到标有100U/ml的管中；同样混合后，取150μl加入到标有50U/ml的管中。这样就得到了浓度分别为100，200和400U/ml IgG抗体标准血清各150μl，浓度为50U/ml IgG抗体标准血清300μl。从每管中各取100μl加入到微孔板内：以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并按三次多项式计算回归方程。

2、将浓缩清洗液(3∶200)30ml加到蒸馏水或去离子水中，使终体积为2000ml，混匀，配得清洗缓冲液。

3、使用前30分钟将底物液A和B等比例混合。(10ml显色剂可用于1整块微孔板的显色。显色剂请在一小时内使用。)

4、在反应孔中加入100μl血清稀释液，反应孔中加入100μl阳性对照。

5、样本用样本稀释液100倍稀释：取10μl血清加到1ml样本稀释液中，混匀。

6、将100μl稀释的患者血清加入到剩余反应孔内。所有反应孔的液体量必须为100μl。

7、用封口膜或塑料袋封闭微孔板，置室温(22-25℃)孵育1小时。

8、孵育后，用300μl工作清洗液清洗每个反应孔，需清洗3次。如果选用自动清洗仪，请参照厂家说明进行3次循环清洗，并将清洗容量设为300μl。

9、在所有反应孔中加入100μl抗人IgG抗体-辣根过氧化物酶结合液。

10、置室温(22-25℃)孵育30分钟。

11、重复步骤4清洗微孔板。

12、在所有反应孔中加入100μl工作底物混合液。

13、封闭微孔板，置室温(22-25℃)孵育10分钟。

14、在所有反应孔中加入50μl终止液(此时反应孔中的溶液由蓝色变为黄色)。

15、用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度值。

16、通过标准曲线换算，测得的样品孔大于50U/ml时，结果为阳性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.食物过敏原IgG抗体检测用微孔板，其特征在于，所述微孔板上包被有多种不同种类的食物过敏原蛋白。

2.食物过敏原IgG抗体检测用试剂盒，包括样本稀释液、用于制作标准曲线的标准血清、阳性对照、浓缩清洗液、酶标抗体结合液、底物液、终止液，其特征在于，还包括权利要求1所述的微孔板。

3.根据权利要求2所述的食物过敏原IgG抗体检测用试剂盒，其特征在于：

所述样本稀释液为载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中；

所述标准血清为阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中；

所述阳性对照为阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，浓度为50U/ml；

所述浓缩清洗液为吐温溶于磷酸盐缓冲液中；

所述酶标抗体结合液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体和载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中；

所述底物液包括底物液A和底物液B；

所述底物液A为四甲基联苯胺溶于柠檬酸缓冲液中；

所述底物液B为过氧化氢溶于醋酸盐缓冲液中；

所述终止液为含硫酸的溶液。

4.食物过敏原IgG抗体检测用微孔板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将多种不同种类的食物过敏原蛋白按浓度0.01-50μg/ml溶于碳酸、磷酸、或醋酸缓冲液中，混匀，加入微孔板内，每孔50-200μl，4℃孵育过夜或37℃孵育1-5小时，用含吐温的磷酸盐缓冲液洗板后，再在微孔板内加入封闭液每孔50-200μl，4℃孵育过夜或室温、37℃孵育1-5小时，弃去孔内液体，干燥微孔板，干燥后将微孔板封入铝箔袋中。

5.食物过敏原IgG抗体检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用如权利要求4所述制备方法制备包被有多种不同种类的食物过敏原蛋白的微孔板；

(2)称取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中配制样本稀释液；

(3)将辣根过氧化物酶与抗人IgG抗体进行标记，称取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入海藻糖配制酶稀释液，将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体溶于酶稀释液中配制酶标抗体结合液；

(4)称取四甲基联苯胺溶于柠檬酸缓冲液中配制底物液A；

(5)量取过氧化氢溶于醋酸盐缓冲液中配制底物液B；

(6)量取吐温溶于磷酸盐缓冲液中配制浓缩清洗液；

(7)量取硫酸溶于纯水中配制终止液；

(8)量取阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入PC-300配制标准血清；

(9)量取阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入PC-300配制阳性对照，阳性对照的浓度为50U/ml；

(10)将配制好的液体分装到相应的小瓶中；

(11)按照试剂盒的组分贴上标签，将各组分放入试剂盒的相应位置组装成完整的试剂盒。

6.食物过敏原IgG抗体的检测方法，包括如下步骤：

(1)在微孔板相应孔内加入经倍比稀释的标准血清以及阳性对照和经稀释的样本，孵育，清洗；

(2)加酶标抗体结合液，孵育，清洗；

(3)加入底物液，孵育；

(4)加入终止液，酶标仪读数判定；

其特征在于，所述酶标仪读数判定标准为：浓度大于50U/ml的为阳性。