CN105785008A - 一种食物不耐受检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种食物不耐受检测试剂盒，所述试剂盒含有包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂和含辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体的溶液。本发明通过鉴定食物提取液中致敏蛋白组分，通过从食物提取液中分离纯化致敏组分蛋白或通过基因重组获得致敏组分蛋白，将每种食物的分离纯化或重组制备的致敏组分蛋白混合包被载体，提高了试剂盒的检测灵敏度和特异性。

Description

一种食物不耐受检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及检测试剂盒，具体地说，涉及一种食物不耐受检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

超敏反应(hypersensitivity)是指机体对某些抗原初次应答后，再次接触相同抗原时则免疫应答被增强。在摄入的抗原量较大或机体的免疫处于高应答状态时，则因免疫应答过强而导致组织损伤为主的特异性免疫应答。1970年Parish发现并证明IgG抗体是介导超敏反应的.正常情况下，食物进入胃肠道应消化为氨基酸、单糖水平被吸收。但由于个体差异性，胃肠道黏膜的缺损和胃肠道黏膜IgA分泌的缺损导致食物蛋白质未被消化直接进入人体，在血清内产生了特异性食物IgG抗体。食物IgG在体内参与的超敏反应包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型超敏反应。

正常情况下，健康的肠胃系统内由肠壁细胞、粘液层、肠壁细菌形成保护层，阻止未消化食物分子进入体内循环系统。即使有个别食物分子进入系统，机体正常的满意系统也会分泌巨噬细胞进行消除。一般情况下，当粘膜分泌IgA缺陷或肠壁细胞损伤，酶缺乏和其它因素导致“渗漏”型的胃肠道系统不能形成有效的屏障，大量未消化的食物大分子进入体内循环系统诱发免疫应答，即使正常的免疫系统也无法将过多的食物分子进行彻底清除，导致体内食物特异性IgG免疫复合物积累，从而引起不耐受。

传统的食物过敏(IgE介导)是身体免疫系统对正常物质产生的过度反应，发病迅速，通常在几分种到2小时内发病。食物IgG介导则完全不同，不会危及生命但引起身体慢性疾病的发生，人们通常很难在吃下食物48小时后自我发现引起不适的食物种类。食物不耐受的临床表现包括消化道症状(腹痛、腹泻、口臭、口腔溃疡、胃肠胀气)、皮肤症状(湿疹、荨麻疹、皮肤淀粉样变)、呼吸(哮喘、慢性咳嗽、慢性鼻炎、鼻窦炎)、神经(头晕、头痛、偏头痛、睡眠障碍)、精神(焦虑、犹豫、注意力涣散、暴躁易怒、坐立不安)、鸡肉骨骼(关节炎、关节疼痛)、泌尿生殖(尿频、尿急、阴道瘙痒、阴道分泌物异常)、心血管(胸部疼痛、高血压、心律不齐、心律过快)以及其他临床症状(体重快速变动、高血糖、肥胖、磨牙等).

此后，通过检测血清内食物特异性IgG测定，达到食物IgG抗体介导的过敏性疾病的诊断，血清中的sIgG浓度与过敏性的疾病的轻重程度成正比关系。

现在市场上的食物不耐受检测试剂盒主要以酶联免疫的方法，本发明提供的试剂盒主要技术特点：

1)磁珠微粒法

磁微粒涉及的磁分离方法可重复性好，操作简单，不需要昂贵的仪器设备，不影响被分离生物材料的生物学性状和功能；而且由于磁微粒的性能，可以将免疫检测实现自动化，用于大规模样本的检测，其反应动力学较传统免疫检测方法快，并且具有更大的固相结合表面。

2)化学发光免疫法

化学发光免疫分析(Chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)技术是继放免(RIA)和酶免(EIA)之后开发的一种先进的超微量免疫分析方法，最先由Arakama于20世纪70年代中期报道。由于它灵敏度高、简便快速、便于自动化操作，而且无有害物质，从而受到市场的普遍欢迎。在发达国家已经成为常规的检测方法。

3)包被固相载体为致敏组分蛋白混合液

目前，关于检测特异性IgE和特异性IgG试剂盒在制备工艺中，均是将导致过敏的物质提取，用提取液包被固相载体。天然物质的提取液中含有糖类、蛋白类、矿物质、微量元素，通常致敏的蛋白成分在天然提取液中占有很小的比例。用天然物质提取液包被固相载体，非致敏组分蛋白会竞争的结合到固相载体上，对于在天然物质提取液中占有比例低的致敏组分蛋白包被到固相载体上的概率更少，导致临床检测的灵敏度和特异性下降。

如申请号为200710070198.0的中国专利申请，公开了一种食物过敏原特异性IGGELISA检测试剂盒，包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白的酶标板、人IGG标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液。但其是用食物提取液直接包被载体，且通过其检测试剂盒阴性的10例病例数可知，这10例患者血清仅仅对一种食物一种组分致敏蛋白产生了阳性反应，对同一种食物其它致敏组分蛋白不产生阳性反应；过敏反应患、者与患者之间存在差异性，天然物质的提取液中含有糖类、蛋白类、矿物质、微量元素，通常致敏的蛋白成分在天然提取液中占有很小的比例。用天然物质提取液包被固相载体，非致敏组分蛋白会竞争的结合到固相载体上，对于在天然物质提取液中占有比例低的致敏组分蛋白包被到固相载体上的概率更少，导致临床检测的灵敏度和特异性下降。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高灵敏度和特异性的食物不耐受检测试剂盒及其制备方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种食物不耐受检测试剂盒，所述试剂盒含有包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂和含辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体的溶液。

进一步地，所述致敏蛋白来自牛肉、鳕鱼、鸡肉、鸡蛋、牛奶、猪肉、虾、玉米、小麦、大米、西红柿、大豆、蘑菇和花生中的一种或多种。

更进一步地，上述食物的致敏蛋白具体如下：

来自牛肉的致敏蛋白为：BSA和gamma-globulin；

来自鳕鱼的致敏蛋白为：Gadm1、Gadm45kD、Gadc1和Gadc41kD；

来自鸡肉的致敏蛋白为：Cha1、Cha3；

来自鸡蛋的致敏蛋白为：Gald1、Gald2、Gald3、Gald4、Gald5、Gald6、YGP42、Galdphosvtin；

来自牛奶的致敏蛋白为：Bosd4、Bosd5、Bosd7、Bosd6、β-Casein、-Casein；

来自猪肉的致敏蛋白为：Pom14、Pom15；

来自虾的致敏蛋白为：Tropomyosin；Meatel、Penal、Penml、penil、penml、Litv2、Penm2；

来自玉米的致敏蛋白为：Zeam14、Zeam25、Zeam27KD、Zeam50KD；

来自小麦的致敏蛋白为：Tria12、Tria14、Tria18、TriaGluten、TriabetaGliadin、TriagammaGliadin、TriaOmega-2Gliadin、Tria25、Tria26；

来自大米的致敏蛋白为：OrysLTP、OryaA/T1、OrysGlyOXalaseⅠ、Orys12；

来自西红柿的致敏蛋白为：Lyce1、Lyce2、Lyce3、LYcechitinase、LycGlucanase、Lycperoxidase、LycePME、LyceLAT52；

来自大豆的致敏蛋白为：Glm1、Glym2、Glym3、Glym4、Glum2SAlaumin、GlumT1；

来自蘑菇的致敏蛋白为：Mua43、Mua67；

来自花生的致敏蛋白为：Arah1、Arah2、Arah3、Arah4、Arah5、Arah6、Arah7、Arah、Arah9、ArahOlenosin、ArahAgglutinin。

在制备试剂盒时，针对检测的目标食物，所述试剂盒需含有上述提供的来自该食物的全部致敏蛋白。

进一步地，所述抗人IgG抗体为鼠抗人IgG单克隆抗体、羊抗人IgG多克隆抗体、兔抗人IgG多克隆抗体和鸡抗人IgG多克隆抗体中的一种或多种。

作为优选，所述抗人IgG抗体为鼠抗人IgG单克隆抗体。

所述含辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体的溶液为将辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体用0.01MPH7.4Tris-HCL2％BSA稀释液按1:1000～1:8000的比例配制而成。

进一步地，所述包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂的制备方法为：

(1)将所述食物致敏蛋白混合；

(2)将直径0.15μm的磁珠微粒用戊二醛活化，室温混匀2～5小时，用0.01mol/LPBS缓冲液冲洗4次，并将该溶液进行悬浮，浓度为0.1mg/ml～2.5mg/ml；然后，每毫升悬液中分别加入步骤(1)中混合的致敏蛋白10μg，于20～40℃混匀孵育3～10小时；

用等体积的0.01MPBS2％～5％BSAPH7.0～7.4缓冲液于20～40℃孵育2～8小时；

用2％BSA0.01～0.1MTtis-HClPH7.5～PH9.0缓冲液清洗三次，并用该溶液配制成磁珠微粒浓度0.1～1.0mg/ml，即得所述的包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂。

作为优选，所述食物致敏蛋白混合时，任意两种致敏蛋白的摩尔浓度比不大于1:10。以避免某一致敏蛋白的浓度过小，影响检测。

进一步地，所述试剂盒还包括：校准品检测试剂、校准品、校准品检测管、样品检测管、洗涤液。

其中，所述校准品检测试剂为包被抗人IgG抗体的磁珠微粒；所述校准品为含有人IgG的阳性血清，4个浓度：0IU/ml、50IU/ml、100IU/ml、400IU/ml；所述校准品检测管装有校准品检测试剂；所述样品检测管装有包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂。

本发明还进一步提供了所述试剂盒在食物不耐受检测中的应用，所述应用的具体方法为：

1)在校准品检测管中加入50μL磁珠微粒试剂，加入50μL校准品；在样本检测管中加入50μL磁珠微粒试剂，然后加入50μL血清样本，37℃孵育5～15min；

2)将孵育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次清洗后，取出磁场，震荡使磁珠微粒充分混悬；

3)向步骤2)中的检测管中加入100μL辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体，37℃孵育5～15min；

4)将孵育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次清洗后，取出磁场，震荡使磁珠微粒充分混悬；

5)添加磁场，使步骤4)处理后的磁珠微粒在磁场中分离，去除上清液，然后加入发光底物A和底物B，取出磁场，充分混匀厚茧检测5min内相对发光强度值。

本发明的有益效果在于：

本发明通过鉴定食物提取液中致敏蛋白组分，通过从食物提取液中分离纯化致敏组分蛋白或通过基因重组获得致敏组分蛋白，将每种食物的分离纯化或重组制备的致敏组分蛋白混合包被载体，提高了试剂盒的检测灵敏度和特异性。

附图说明

图1为零浓度点和相邻浓度点连点拟合曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1食物致敏组分蛋白的鉴定

1.二维电泳(双向电泳)

称取牛肉、鸡肉、大豆、玉米、花生、猪肉、海虾、海蟹、鳕鱼、小麦、大米、蘑菇、西红柿、牛奶、鸡蛋原料各10g，按1:25(W:V)加入50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，4℃搅拌24h。将提取结束后的提取液用8μm滤膜澄清过滤，再将粗提液经0.8μm、0.45μm、0.22μm滤膜依次过滤。过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。

将牛肉、鸡肉、大豆、玉米、花生、猪肉、海虾、海蟹、鳕鱼、小麦、大米、蘑菇、西红柿、牛奶、鸡蛋提取液各1mg经SDA-PAGE分离后再经等电点电泳分离。

2.免疫印迹试验

阳性血清来源：首都医科大学附属北京世纪坛医院；

阳性血清数量：每种食物30份阳性血清；

将每种食物30份阳性血清按1：100稀释，将每种食物每一份稀释后的阳性血清5ml加入步骤1中双向电泳的分离胶37℃孵育2h，孵育结束后用PBST溶液洗涤4次；再加入5ml1:4000辣根过氧化酶标记鼠抗人IgG抗体37℃孵育1h，孵育结束后，用PBST洗涤4次，再加入5ml底物液避光显色30min。将每种食物30份阳性血清的免疫印迹鉴定的组份汇总，就是本发明食物致敏组分蛋白组份。

实施例2食物不耐受检测试剂盒的制备方法

食物致敏组分蛋白：北京新华联协和药业有限责任公司制备。

辣根过氧化酶标记鼠抗人IgG抗体：购自Abcam.inc。

1)含辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体的溶液的制备：将1.25ml辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG抗体，加入到10000ml0.01MPH7.4Tris-HCl2％BSA缓冲液中。

2)包被食物致敏组分蛋白的磁珠微粒试剂的制备方法为：牛肉：BSA和gamma-globulin按1：1混合；鳕鱼：Gadm1、Gadm45kD、Gadc1和Gadc41kD按1：1：1：1混合；鸡肉:Cha1、Cha3按1：1混合；鸡蛋：Gald1、Gald2、Gald3、Gald4、Gald5、Gald6、YGP42、Galdphosvtin按1：1：1：1：1：1：1：1比例混合；牛奶：Bosd4、Bosd5、Bosd7、Bosd6、β-Casein、ɑ-Casein按1：1：1：1：1：1比例混合；猪肉：Pom14、Pom15按1：1比例混合；虾：Tropomyosin；Meatel、Penal、Penml、penil、penml、Litv2、Penm2按1：1：1：1：1：1：1：1：1比例混合；玉米：Zeam14、Zeam25、Zeam27KD、Zeam50KD按1：1：1:1比例混合；小麦：Tria12、Tria14、Tria18、TriaGluten、TriabetaGliadin、TriagammaGliadin、TriaOmega-2Gliadin、Tria25、Tria26按1：1：1：1：1：1：1：1：1比例混合；大米：OrysLTP、OryaA/T1、OrysGlyOXalaseⅠ、Orys12按1：1：1：1比例混合；西红柿：Lyce1、Lyce2、Lyce3、LYcechitinase、LycGlucanase、Lycperoxidase、LycePME、LyceLAT52按1：1：1：1：1：1：1：1比例混合；大豆：Glm1、Glym2、Glym3、Glym4、Glum2SAlaumin、GlumT1按1：1：1：1：1：1比例混合；蘑菇：Mua43、Mua67按1：1比例混合；花生：Arah1、Arah2、Arah3、Arah4、Arah5、Arah6、Arah7、Arah、Arah9、ArahOlenosin、ArahAgglutinin；按1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1:1比例混合；

3)将直径0.15μm的磁珠微粒用戊二醛活化，室温混匀4h，用0.01mol/LPBS缓冲液冲洗4次，并将该溶液进行悬浮，浓度为0.5mg/ml；然后，每毫升悬液中分别加入步骤(1)中混合的致敏组分蛋白10μg，于37℃混匀孵育5h；用等体积的0.01MPBS2％BSAPH7.4缓冲液于37℃孵育6h；最后，用2％BSA0.01Ttris-HClPH8.5缓冲液清洗三次。并用该溶液配制成磁珠微粒浓度0.1mg/ml，即得所述的包被食物致敏组分蛋白的磁珠微粒试剂；

4)化学发光底物液A和B以及洗涤液的配制：

化学发光底物液A：在双蒸水中加入Tris和浓HCl配制成0.1MpH7～9的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入Luminol、TritonX100和化学发光增强剂，混匀；

化学发光底物液B：在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1MpH4～6的柠檬酸缓冲液，在此缓冲液中H₂O₂溶液，混匀；

使用前将化学发光底物液A和B按1:1的体积比混合后使用；

洗涤液的配制：在双蒸水中依次加入NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄和Tween20，混匀即得。

实施例3-16

与实施例2的区别在于，针对不同的检测目标，试剂盒采用不同的致敏蛋白对磁珠微粒进行包被，具体如下：

实施例17-20

实施例17-20与实施例2的区别在于，将实施例2中的鼠抗人IgG单克隆抗体分别替换成羊抗人IgG多克隆抗体(实施例17)、兔抗人IgG多克隆抗体(实施例18)、鸡抗人IgG多克隆抗体(实施例19)和鼠抗人IgG单克隆抗体与鸡抗人IgG多克隆抗体的混合物(实施例20)。

实施例21试验分析性能评价

(一)最低检测极限

用含5％新生牛血清的PBS溶液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD。根据0浓度和相邻浓度校准品之间的浓度－RLU值结果进行两点回归拟合得出线性方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限。

表10浓度的检测RLU值

1806	1826	1753	1660
				1632	1847	1823	1790
1728	1698	1754	1805
				1845	1827	1803	1902
1924	1805	1795	1897

零浓度化学发光值均值X＝1790.68

SD＝75.74

X+2SD＝1942.16(y＝5049.33X+1790.68)

B点发光值＝4315.35

将零浓度点和邻近浓度点连点拟合曲线，参见图1。

将0浓度点的X+2SD带入两点拟合曲线，最低检测限＝0.03U/ml。

(二)线性

将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中最低浓度样本须接近线性范围的下限。按试剂盒说明书进行操作，将每一浓度样本检测1次，使用最小二乘法(将每一浓度值和稀释比例)或双对数法(将每一浓度化学发光值和稀释比例取对数)进行直线拟合，计算线性相关系数r。

表2线性相关系数r

(三)精密度评价

(1)批内精密度

将实施例2制备的试剂盒一批，分别测定低、中、高三种不同浓度的血清，平行检测10次，得出的分析内变异系数为4.35％～8.38％。结果参见表3。

表3批内CV

测定血清浓度(U/ml)	测定次数	批内CV(％)
			0.35	10	8.38
0.7	10	6.87
			1.2	10	4.35

(2)批间精密度

将实施例2制备的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清，平行检测10次，每份血清得到30个浓度值，统计分析变硬系数为5.57％～8.15％。结果参见表4。

表4批间CV

测定血清浓度(U/ml)	测定次数	批内CV(％)
			0.35	30	8.15
0.7	30	7.85
			1.2	30	5.57

(四)稳定性评价

对实施例3的试剂盒分别在4℃和37℃放置，置于4℃试剂盒分别于1月、3月、6月、9月、12月和15月取样检测，置于37℃的试剂盒，分别于3天、6天和9天取样检测，结果表明试剂盒的最低检测限、线性、批内精密度、批间精密度等均在正常范围之内，试剂盒有效期可达12个月。

实施例22临床分析性能评价

本发明以临床病史和临床医生的综合判断为金标准，考察试剂盒检测结果和金标准对比的总一致率、阳性一致率、阴性一致率、线性相关性。本发明食物不耐受检测试剂盒临床评价试验在首都医科大学附属北京世纪坛医院和湖南省儿童医院两家临床中心开展，共入组315例患者，受试者：男＝120例，女＝195例；年龄范围3个月～64岁，男性受试者的年龄中位数为36岁。315例受试者中，食物不耐受阳性病人为234例，食物不耐受阴性病人为80例。检测结果：总一致率99％，阳性一致率93.8％，阴性一致率98.7％(见表)，线kappa值为0.92。

表5临床试验评价结果

总一致率	阳性一致率	阴性一致率	Kappa值
				99％	93.8％	98.7％	0.92

实施例23特异性评价

将实施例22中的234例患者血清分别用实施例2的食物组分致敏蛋白检测试剂盒和浙大迪迅生物基因工程有限公司生产制备的“食物特异性抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫法)”检测。

具体检测方法为：

1)在校准品检测管中加入50μL磁珠微粒试剂，加入50μL校准品；在样本检测管中加入50μL磁珠微粒试剂，然后加入50μL血清样本，37℃孵育5～15min；

2)将孵育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次清洗后，取出磁场，震荡使磁珠微粒充分混悬；

3)向步骤2)中的检测管中加入100μL辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体，37℃孵育5～15min；

4)将孵育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次清洗后，取出磁场，震荡使磁珠微粒充分混悬；

5)添加磁场，使步骤4)处理后的磁珠微粒在磁场中分离，去除上清液，然后加入发光底物A和底物B，取出磁场，充分混匀厚茧检测5min内相对发光强度值。

以校准品浓度0IU/ml、50IU/ml、100IU/ml为横坐标，对应校准品浓度的化学发光值为纵坐标，以校准品浓度值对对应化学发光值做线性回归，插入三项式方程，建立标准曲线方程。将待检测样本的化学发光值带入标准曲线方程，计算出待检测样本的浓度；当样本浓度≥50IU/ml，为阳性，当样本浓度＜50IU/ml，为阴性。

结果如下表：

表6：不同试剂盒检测的结果

由表6知：由实施例2制备的食物致敏组分蛋白混合包被磁珠微粒检测试剂盒检测结果与结合病史医生综合判断的结果相比，总一致率99％，阳性一致率93.8％，阴性一致率98.7％。而浙大迪迅生物基因工程公司生产制备的“食物特异性抗体IgG检测试剂盒”检测结果：阳性例数215例，阴性例数100例。从以上结果分析，本发明实施例2制备的试剂盒均是利用从天然食物提取液中分离纯化或基因重组得到的致敏组分蛋白包被载体，而浙大迪迅的试剂盒是用食物提取液直接包被载体。从本发明制备的试剂盒检测结果阳性，浙大迪迅检测试剂盒阴性的10例病例数可知，这10例患者血清仅仅对一种食物一种组分致敏蛋白产生了阳性反应，对同一种食物其它致敏组分蛋白不产生阳性反应；过敏反应患者与患者之间存在差异性，天然物质的提取液中含有糖类、蛋白类、矿物质、微量元素，通常致敏的蛋白成分在天然提取液中占有很小的比例。用天然物质提取液包被固相载体，非致敏组分蛋白会竞争的结合到固相载体上，对于在天然物质提取液中占有比例低的致敏组分蛋白包被到固相载体上的概率更少，导致临床检测的灵敏度和特异性下降。本发明通过鉴定食物提取液中致敏蛋白组分，通过从食物提取液中分离纯化致敏组分蛋白或通过基因重组获得致敏组分蛋白，将每种食物的分离纯化或重组制备的致敏组分蛋白混合包被载体，提高了试剂盒的检测灵敏度和特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种食物不耐受检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂和含辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体的溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述致敏蛋白来自牛肉、鳕鱼、鸡肉、鸡蛋、牛奶、猪肉、虾、玉米、小麦、大米、西红柿、大豆、蘑菇和花生中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，

来自牛肉的致敏蛋白为：BSA和gamma-globulin；

来自鳕鱼的致敏蛋白为：Gadm1、Gadm45kD、Gadc1和Gadc41kD；

来自鸡肉的致敏蛋白为：Cha1、Cha3；

来自鸡蛋的致敏蛋白为：Gald1、Gald2、Gald3、Gald4、Gald5、Gald6、YGP42、Galdphosvtin；

来自牛奶的致敏蛋白为：Bosd4、Bosd5、Bosd7、Bosd6、β-Casein、-Casein；

来自猪肉的致敏蛋白为：Pom14、Pom15；

来自虾的致敏蛋白为：Tropomyosin；Meatel、Penal、Penml、penil、penml、Litv2、Penm2；

来自玉米的致敏蛋白为：Zeam14、Zeam25、Zeam27KD、Zeam50KD；

来自小麦的致敏蛋白为：Tria12、Tria14、Tria18、TriaGluten、TriabetaGliadin、TriagammaGliadin、TriaOmega-2Gliadin、Tria25、Tria26；

来自大米的致敏蛋白为：OrysLTP、OryaA/T1、OrysGlyOXalaseⅠ、Orys12；

来自西红柿的致敏蛋白为：Lyce1、Lyce2、Lyce3、LYcechitinase、LycGlucanase、Lycperoxidase、LycePME、LyceLAT52；

来自大豆的致敏蛋白为：Glm1、Glym2、Glym3、Glym4、Glum2SAlaumin、GlumT1；

来自蘑菇的致敏蛋白为：Mua43、Mua67；

来自花生的致敏蛋白为：Arah1、Arah2、Arah3、Arah4、Arah5、Arah6、Arah7、Arah、Arah9、ArahOlenosin、ArahAgglutinin。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG抗体为鼠抗人IgG单克隆抗体、羊抗人IgG多克隆抗体、兔抗人IgG多克隆抗体和鸡抗人IgG多克隆抗体中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG抗体为鼠抗人IgG单克隆抗体。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂的制备方法为：

(1)将所述食物致敏蛋白混合；

(2)将直径0.15μm的磁珠微粒用戊二醛活化，室温混匀2～5小时，用0.01mol/LPBS缓冲液冲洗4次，并将该溶液进行悬浮，浓度为0.1mg/ml～2.5mg/ml；然后，每毫升悬液中分别加入步骤(1)中混合的致敏蛋白10μg，于20～40℃混匀孵育3～10小时；

用等体积的0.01MPBS2％～5％BSAPH7.0～7.4缓冲液于20～40℃孵育2～8小时；

用2％BSA0.01～0.1MTtis-HClPH7.5～PH9.0缓冲液清洗三次，并用该溶液配制成磁珠微粒浓度0.1～1.0mg/ml，即得所述的包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述食物致敏蛋白混合时，任意两种致敏蛋白的摩尔浓度比不大于1:10。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：校准品检测试剂、校准品、校准品检测管、样品检测管、洗涤液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品检测试剂为包被抗人IgG抗体的磁珠微粒，所述校准品为含有人IgG的阳性血清，所述校准品检测管装有校准品检测试剂，所述样品检测管装有包被食物致敏蛋白的磁珠微粒试剂。

10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在食物不耐受检测中的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：

1)在校准品检测管中加入50μL磁珠微粒试剂，加入50μL校准品；在样本检测管中加入50μL磁珠微粒试剂，然后加入50μL血清样本，37℃孵育5～15min；

2)将孵育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次清洗后，取出磁场，震荡使磁珠微粒充分混悬；

3)向步骤2)中的检测管中加入100μL辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体，37℃孵育5～15min；

4)将孵育后的检测管在磁场中分离，去除上清液，经洗液多次清洗后，取出磁场，震荡使磁珠微粒充分混悬；

5)添加磁场，使步骤4)处理后的磁珠微粒在磁场中分离，去除上清液，然后加入发光底物A和底物B，取出磁场，充分混匀厚茧检测5min内相对发光强度值。