CN101115996A

CN101115996A - 用于评价个体变应原敏感性的方法

Info

Publication number: CN101115996A
Application number: CNA2006800043439A
Authority: CN
Inventors: A·普罗希特; C·梅茨-法夫尔; A·韦罗特; G·保利; S·拉弗; R·瓦伦塔; N·莫特-卢克施; P·瓦郎
Original assignee: Biomay AG
Current assignee: Biomay AG
Priority date: 2005-02-09
Filing date: 2006-02-09
Publication date: 2008-01-30
Also published as: US20080261215A1; AU2006212688A1; JP2008530537A; AT501347B1; WO2006084299A2; EP1849010A2; AT501347A1; CA2594410A1; WO2006084299A3; WO2006084299A8

Abstract

本发明公开了一种用于评价个体的变应原敏感性和/或变应原免疫治疗临床效果的方法，其包括以下步骤：采集至少两个来自接受或打算接受用至少一种纯的变应原或其衍生物免疫治疗个体的样本，所述样本选自血液或者其成分、结缔组织、鼻的、支气管的、皮肤或者消化道的活组织检查物质，其中所述样本包含对所述变应原产生应答时能够释放介质的细胞，将所述样本与所述变应原或其衍生物接触，并且确定从所述样本中释放出的介质的量，并且通过比较所述量来评价个体在治疗前的变应原敏感性和/或评价免疫治疗的临床效果。

Description

用于评价个体变应原敏感性的方法

技术领域

本发明涉及监测变应原免疫治疗效果的方法。

背景技术

变态反应是免疫系统的功能障碍，其中个体是过敏性的，对被称为变应原的、典型的本质上无害物质产生免疫反应。参与变态反应的主要抗体是IgE。每个个体都具有不同的IgE抗体，并且每个变态反应物质刺激产生其本身特定的IgE产物。因此，结合定义的变应原的IgE抗体仅仅与该变应原产生反应。IgE的恒定区(Fc区域)能够结合特定的细胞受体，其能够释放组胺或者其它炎症介质、细胞因子和/或蛋白酶进入周围组织。释放组胺的细胞主要是肥大细胞和嗜碱粒细胞。当结合细胞的IgE通过变应原接触并交联时，就会引发释放组胺。

特别地，组胺引起主要的变态反应。例如在鼻、眼和窦房结中释放的组胺刺激打喷嚏、流鼻涕和眼睛发痒；在肺部释放的组胺会引起气道的内层(lining)的收缩和膨胀，并引起分泌稠黏液；在皮肤释放的组胺会引起疹或荨麻疹；在消化系统释放的组胺会引起胃痉挛和腹泻。

典型的反应原来自植物花粉，比如黑麦草、豕草、梯牧草和白桦树花粉、霉菌孢子，药物比如青霉素类、磺胺嘧啶类(sulfanomides)、水杨酸盐类和局部麻醉剂类，食物比如坚果、海鲜，蛋类，豌豆、豆类、花生以及其他豆类、牛奶，昆虫产物比如蜜蜂蛰毒、黄蜂螫毒、蟑螂和尘螨，及动物毛发和皮屑。

存在许多变态反应的医学治疗方法。在医学实践中通常使用三种主要的方法：化疗、免疫疗法以及其它的医学方法。

在化疗中，拮抗药常被用于阻断变态反应介质的反应，防止细胞活化和去颗粒化过程。它们包括抗组胺剂、肾上腺皮质素、肾上腺素(肾上腺素制剂(epinephrine))、胆茶碱和色甘酸钠。这些药物有助于减轻过敏性症状，但是在长期缓解病症中起的作用很小。它们在某些患有过敏症的患者的急性恢复中起紧急作用。

在其它药物中，医生们认为许多治疗方法在治疗过敏症中是有效的，尤其是传统中药。然而，这些中没有一种得到良好的品质证据的支持。

最有前景的治疗形式可能是免疫疗法。在免疫疗法过程中，个体逐渐接种，以抗逐渐增加剂量的相应免疫原。这样可以减轻过敏的严重行或者完全消除过敏症。另外，可以注射单克隆的抗-IgE抗体。这些抗体结合游离的IgE，其发出用于破坏的这些信号源。但它们不会结合已经在嗜碱粒细胞和肥大细胞上的Fc受体的IgE，因为这将刺激过敏性炎症应答。

在变态反应免疫反应中使用的蛋白质和糖蛋白通常是从以下物质中提取的，比如花粉，霉菌，毛皮和昆虫毒液。根据临床评价，每周一次或两次以递增的剂量重复皮下注射引起疾病的变应原或其衍生物的溶液，直至达到维持剂量。然后，每2到4周注射该维持剂量。

为了以一种成功的方法实现免疫治疗，必须进行对所述疗法进程的监测。

例如，Wantke等(Clin Exp Allergy 23(1993)992-995)公开了监测用于过敏性结膜炎(rhinoconjunctivitis)的免疫疗法的方法。其中作者分析了自发性组胺释放，即，在免疫治疗前和免疫治疗后的病人中，不加入变应原而释放的组胺，并且，其还显示暴露于变应原后的释放进入血液中的组胺在治疗4个月后明显减少。但是，该方法不能用于评估对某种特定的变应原和治疗的特定效果的敏感性改变。

Stephan等(Allergy 44(1989)453-459)经超过五年的时间通过分析变应原诱发组胺在全血中的释放研究了蜂毒免疫疗法的效果。但是，该项研究的作者并没有将组胺释放的结果和临床参数联系在一起，例如，皮肤敏感性，因此也没有数据证实使用所述试验可测定和反映给定变应原的临床敏感性。而且，在治疗前后获得的样本也不能互相比较。

Yuta等(Arerugi 51(2002)634-648)研究了从嗜碱粒细胞中释放的组胺，其用于评价过敏性鼻炎的免疫治疗。作者分析了治疗开始时和免疫治疗6个月后的样本，并表明了治疗的积极效果。在这篇文献中，分析了治疗前后获得的样本，作者仅能够表明该短暂记录(rush protocol)导致细胞衰竭，但并未表明组胺释放减少。在这篇文献中，其表明在免疫治疗诱导的“封闭性抗体”之前短暂免疫治疗已经开始发挥作用，即，在几小时或者几天之后。这可以解释为细胞的衰竭。然而，对在治疗几周后出现的封闭性抗体的效果评估是很重要的。因此，必须采用IgG抗体仍旧存在于例如全血中的分析测定。与此相反，在Yuta等人的文章中，细胞被清洗过，因此，不能测定此阻滞IgG的干扰。

除了组胺释放之外，用于评价嗜碱细胞和肥大细胞活性的其它方法是已知的，其包括测量leutrienes的释放(Van Rooyen&Anderson，R.J.Immunol.Methods 2004，288，1-7)，纤维蛋白溶酶(TairaM等.，J.Asthma 2002，39，315-322)和其它肥大细胞或嗜碱细胞产物的释放，当特异性变应原激活肥大细胞和嗜碱细胞时，释放这些产物。此外，由于个体暴露在变应原中导致活性的标记物比如CD63和CD203c的上调也可以通过流式细胞计量法测定(Hauswirth A.W.等J.Allergy Clin.Immunol.2002，110，102-109)。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供检测个体变应原免疫治疗的可能的临床有效性和进程和个体变应原敏感性的体外途径和方法。

因此，本发明提供一种评价个体变应原敏感性和/或变应原免疫疗法的临床有效性的方法，其包括步骤：

-采集至少两个来自接受或打算接受用至少一种纯的变应原或其衍生物免疫治疗个体的样本，所述样本选自血液或者其成分、结缔组织、鼻的、支气管的、皮肤的或者消化道的活组织检查物质，其中所述样本包含对所述变应原产生应答时能够释放介质的细胞，

-使所述样本与所述变应原或其衍生物接触，和

-确定从所述样本中释放出的介质含量，并且评价个体在治疗前的变应原敏感性和/或通过比较所述含量来评价免疫治疗的临床效果。

为了保证有效的治疗，对个体变应原敏感性和/或临床效果，以及变应原免疫治疗的进程的评价是很重要的，例如，所述评价通过改变变应原的给药剂量和/或给药时间间隔。因此，需要一种可靠的方法来监测免疫治疗，该方法能够直接反应个体在免疫治疗过程中对某类型的变应原蛋白酶传染性因子的敏感性。与变应原特殊结合的IgE量的检测证实其并不适于确定个体对于某种类型的变应原的致敏性程度，因为存在于个体中的IgE量与从肥大细胞和嗜碱性细胞释放出的介质之间没有直接的相关性。所以，包含介质释放细胞的个体样本的介质释放是优选的。令人惊奇的是，根据本发明的方法提供了与传统使用的皮肤过敏试验相比，如果不是相同的也是相当的结果。

从个体采集到的样本优选地与免疫治疗中相同的变应原接触。但是，也有可能用过敏原提取物进行免疫治疗，并用基本上纯化的(“纯的”)变应原来监测所述治疗。

当然，根据本发明的方法也可以通过确定个体变应原在治疗过程中的敏感性来监测变应原免疫治疗的进程。

根据本发明的“变应原”是能够诱导产生特异性抗体(IgE)的分子或分子混合物，IgE触发介质释放细胞释放介质，且引起个体继发的过敏应变效应。当然，“变应原”也能够诱导产生不同于IgE的抗体(例如，IgG)。然而，在根据本发明的方法中使用的变应原优选为纯化的，即，变应原实质上由一种单一的变应原分子组成，其中纯度超过90％(w/w)，优选95％(w/w)，最优选99％(w/w)。由于使用了基本上纯化的或者分离的变应原，才有可能以可再现的方式确定和计量在免疫治疗中和在根据本发明的方法中使用的变应原。与此相反，取决于特定的纯化条件，变应原提取物包含不同浓度的特异性变应原。此外，过敏原提取物也可以包含多于一种变应原，其可以以不同浓度存在于提取物中(需要的变应原的量不能以精确的方式定义)，并且可以进一步引起交叉反应(例如见Marth K等(2004)J.Allergy Clin.Immunol.113：470-474；Marth K et al.(2004)XXIII EAACI congress abstract book 597：181；Akkerdaas HJ etal.(2003)Arb.Paul Ehrlich Inst.Bundesamt Sera ImpfstoffeFrankf.a.M.94：87-95)。此外，变应原提取物可能含有影响所述提取物稳定性的杂质或其他物质。该问题也可通过使用基本上纯化的或者‘纯的”变应原来避免。

如在本文中使用的术语“衍生的”变应原是指经过修饰的变应原(删除、定点突变、截短等等)，它们仍显示出与衍生其的天然变应原相同的变应原性质和IgE结合性。

根据本发明的一个优选的实施选方式，所述介质选自组胺、纤维蛋白溶酶、前列腺素、白三烯，尤其是半胱氨酰白三烯，嗜酸细胞阳离子蛋白、细胞因子比如白介素(IL)，特别是IL-2R、CD63、CD203c及其组合。

将所述个体暴露于变应原之后，个体的变应性反应主要是由肥大细胞释放的介质引起的。这些介质产生了变应性反应的早期症状(例如喷嚏、搔痒)，且生成刺激产物并渗透到粒细胞循环的局部组织中(例如，嗜酸性细胞)。该介质可由通过脱粒(组胺或蛋白酶)或重新合成所述介质之后从细胞中释放(Quraishi S.A等人，JAOASupplement 5，104：S7-S15)。根据本发明，也可确定了除介质之外的激活标记物(例如Yoshimura C等(2002)J Allergy ClinImmunol.109：817-23)。

样本是血液或其成分(例如血浆、血清)、结缔组织、鼻的、支气管的、皮肤或者消化道的活组织检查物质。

介质释放细胞可以发现于血液及其成分、结缔组织和某些其它组织中。令人惊奇地发现，当使用纯的变应原，尤其是当使用全血时，根据本发明的方法非常精密地反映出表皮敏感性。与此相反，特异性IgE的测定与表皮的敏感性并不相关。因此，本发明所采用的样本可以是血液样本(优选肝素化血(heparinised blood))或者结缔组织。

在根据本发明的方法中使用的介质释放细胞可以是从样本中分离出来的。由于这种分离，可除去存在于所述样本中的其它可能的干扰物质。例如，特别是考虑到在样品与变应原接触时测定释放进入样本中的介质量的过程中，血液可以包含能提供高背景的释放介质。这一问题可以通过在样本暴露于变应原之前，测定存在于其中的介质量来避免。另一方面，试验数据显示组胺释放与皮肤敏感性之间基本上没有相关性，例如存在。因此，根据本发明是使用的样本在与变应原或其衍生物接触之前并不是分离的或洗过的。这一点可以通过以下事实来推导，当洗涤介质释放细胞时，样本中所有的抗体都被去除，包括其应当在变应原治疗期间诱导的那些IgG抗体，和其将起阻断抗体的作用以减少IgE变应原复合物的量(因为其与IgE分子竞争)的那些IgG抗体(参见，例如Stahl-Skov等人(1977)Clin.Exp.Immunol.27：432-439)。

优选地，所述细胞为肥大细胞和/或嗜碱细胞和/或嗜酸细胞。

肥大细胞和嗜碱细胞为当暴露在变应原中时释放大多数介质，尤其是组胺的细胞。肥大细胞存在于皮肤、肺和胃肠道的结缔组织中，而嗜碱性细胞存在于血液中。这些细胞可以通过已知的方法分离，并可用于根据本发明的方法中。用于肥大细胞的分离试验设计参见Jamur MC等(J Histochem Cytochem.1997 45：1715-1722)，MasseyWA(J Immunol.1991 147：1621-7)，用于嗜碱性细胞的分离方法参见Valent P.(Proc.Natl.Acad.Sci USA 1989，86，5542-5546)。

根据本发明的一个优选实施例，所述样本进一步包含免疫球蛋白(Ig)，尤其是免疫球蛋白G(IgG)。

所述过程优选地用包含IgG的样本来例如，全血样本来进行。在这些样本中存在IgG是优选的，因为其使得将所述细胞暴露于变应原时能测定阻断IgG的干扰。在变应原免疫治疗过程中，产生了靶向于所述变原的IgGs。当将个体与所述变应原接触，并阻止变应原与IgE结合时，这些IgGs结合变应原。因为，变应原结合IgGs的产物直接参与个体对变应原的应答，从而，影响个体对变应原的敏感性，因此，所述该样本优选地应当包括IgGs。

为了评价个体对变应原的敏感性或者变应原免疫疗法的临床效果，优选地在所述个体接受免疫治疗前后采集样本。

为监测和评价免疫治疗的效果，有必要在治疗前和治疗过程中测定个体对于变应原的敏感性。因此，在治疗的不同阶段确定介质释放。在治疗过程中，变应原的敏感性理想地下降。而且，在治疗前的一个或多个时间点测定介质释放可能有助于在治疗过程中定量所述变应原。

根据本发明的另一个优选地的实施方案，所述样本是在所述个体在接受免疫治疗后采集的。

当然，免疫治疗也可以通过在首次给予包含一种变应原的药物后分析样本来单独评价。

优选地，至少一个样本为在所述个体接受免疫治疗后最长1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、5天、10天、4周、6个月、12个月、24个月和36个月后采集。

被分析的样本可以在首次给予变应原药物后一个确定的时间段后被采集。同时单独确定释放的介质之间的时间间隔最好是在1小时、2小时、6小时，、12小时、2天、5天、1周、2周、4周、2个月、4个月、6个月、12个月、24个月之间变化。

根据本发明的一个实施方案，所述变应原是重组产生的。

有效的变应原免疫治疗和精确测定介质释放的方法优选地用由重组产生的变应原进行。由于基因工程很可能产生一种高含量的特异性变应原，并分离所述变应原。变应原通常直接分离自包含变应原的原料(例如，花粉)，并且由于所述变应原包含在提取物中，所述变应原通常是不同的变应原和潜在的致敏性物质的混合物的一部分。甚至纯化的“天然的变应原”包含各种亚型，这些亚型中的某些可能甚至是高过敏性的或非过敏性的，从而，给出错误的测试结果(FerreiraF.等.，J.Exp.Med.1996，183，599-609)。这一问题可以由变应原的重组产品而避免。用于对个体给药使用的变应原也可以用于根据本发明的方法中。

所述变应原优选地包括至少一个删除部分，至少一个替代部分或者至少一个插入部分。

在治疗过程中，无论患者是否对低变应原或者它们的衍生物变得敏感，都可使用这些低变应原或者其衍生物。

根据本发明一个优选的实施方案，所述变应原通过基因工程重组所述变应原片段而被修饰。

优选地，使所述样本与不同浓度的所述变应原接触。

从介质释放细胞释放出的介质的量取决于根据本发明的方法中应用的变应原的浓度。用于诱导不同量的介质释放的变应原的浓度越高，从个体采集到的细胞的敏感性就越低，反之亦然。因此，介质释放量的确定需要采用不同浓度的变应原。

优选地，所述变应原的浓度选自1ng/ml到100μg/ml的范围内，优选1pg/ml至10μg/ml的范围内。

根据一个优选的实施方案，确定包含在从个体采集的样本中的细胞介质总量。

为了测定存在于细胞中的介质总量，将这些细胞例如经过几次冻融循环而进行裂解。确定的介质量表明所述介质可能通过所述细胞释放，该值可以被用于确定细胞对于某一变应原的细胞致敏度。

细胞致敏度(degree of cellular sensitisation)优选地是通过确定能诱导10％，优选30％的所述细胞介质的总量的所述变应原的浓度来定义。

细胞致敏度是免疫治疗进程的指针，因为它显示了占10％，优选20％，25％，30％的存在于介质释放细胞中的介质的总量的细胞的浓度。在一个理想的变应原免疫治疗过程中，使用的变应原浓度将增加，因为从所述细胞释放一定量介质的高浓度的变应原表明细该胞比先前测定的细胞敏感性低。而且，也可以评价诱导介质释放的最大剂量。这样就产生了剂量响应曲线，和用于测定所述曲线在变应原免疫治疗过程中的变化。

因此，个体的变应原敏感性和/或变应原免疫治疗的临床效果优选地通过观察在所述免疫治疗过程中细胞的致敏度来评价。

根据本发明一个优选的实施方案，样本中的介质通过免疫法和/或色谱法来测定，优选的方法选自放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、逆转录酶多聚酶链式反应、免疫荧光流式细胞计量法及其组合。

所有这些方法已经被确定接近临床的敏感性。然而，这些方法中没有一种用于观察在血清学，嗜碱细胞激活作用(basophilactivation)和皮肤敏感性中纯的变应原(例如Pierkes M.等JAllergy Clin Immunol.(1999)103：326-32；Di Lorenzo G.等，J Allergy Clin Immunol.(1997)100：832-7)。

本发明使用的优选的变应原包括所有如在www.allergen.org/List.htm中可获得的所有主要的蛋白质变应原。根据本发明特定优选的变应原包括大部分的变应原，如大部分的白桦花粉变应原，如Bet v 1，大部分的梯牧草花粉变应原，如Phl p 1、Phl p 2、Phl p 5和Phl p 6，大部分的房尘螨变应原，如Der p 1、Der p 2，大部分的猫变应原，如Fel d 1，大部分的蜜蜂和黄蜂变应原(见列表)，其它抑制蛋白，特别是Phl p 12，其他的白桦变应原，尤其是Bet v 4，储螨(storage mite)变应原，尤其是Lep d 2，和在表1中列出的变应原。

表1：本发明优选的变应原(包括参考实施例)

变应原

物种名称

变应原名称生物化学ID MW cDNA或者参考

或者旧名蛋白质 Acc.No.

豚草(Ambrosia artemisiifolia)

短豕草(short ragweed)

Amb a 1 抗原E 8 C 8，20

Amb a 2 抗原K 38 C 8，21

Amb a 3 Ra3 11 C 22

Amb a 5 Ra5 5 C 11，23

Amb a 6 Ra6 10 C 24，25

Amb a 7 Ra7 12 P 26

三裂叶豚草(Ambrosia trifida)

巨型豕草(giant ragweed)

Amb t 5 Ra5G 4.4 C 9，10，27

北艾(Artemisia vulgaris)

艾蒿(mugwort)

Art v 1 27-29 C 28

Art v 2 35 P 28A

Art v 3脂质转移蛋白 12 P 53

Art v 4 抑制蛋白 14 C 29

向日葵(Helianthus annuus)

向日葵(sunflower)

HeI a 1 1 34 29A

HeI a 2 抑制蛋白 15.7 C Y15210

山靛(Mercurialis annua)

Mer a 1 抑制蛋白 14-15 C Y13271

石竹目(Caryophyllale)

灰菜(Chenopodium album)

藜(lamb’s-quarters)，黎(pigweed)，

Che a 1 17 C AY049012，29B

白藜(white goosefoot)

Che a 2 抑制蛋 14 C AY082337

Che a 3 polcalcin 10 C AY082338

钾猪毛菜(Salsola kali)

俄国蓟草(Russian-thistle)

Sal k 1 43 P 29C

蔷薇目(Rosales)

葎草(Humulus japonicus)

日本蛇麻草(Japanese hop)

Hum j 4w C AY335187

犹大墙草(Parietaria judaica)

Par j 1脂质转移蛋白1 15 C 参考变应原异构体

(isoallergens)的列表

Par j 2脂质转移蛋白2 C 参考变应原异构

体的列表

Par j 3 抑制蛋白 C 参考变应原异构

体的列表

Parietaria officinalis

Par o 1脂质转移蛋白 15 29D

B.草

禾草目(Poales)

绊根草(Cynodon dactylon)

百慕大草(Bermuda grass)

Cyn d 1 32 C 30，S83343

Cyn d 7 C 31，X91256

Cyn d 12 抑制蛋 14 C 31a，Y08390

Cyn d 15 9 C AF517686

Cyn d 22w 烯醇化酶数据审理中(pending)

Cyn d 23 Cyn d 14 9 C AF517685

Cyn d 24发病机理相关的p. 21 P 审理中

鸭茅(Dactylis glomerata)

野茅(orchard grass)

Dac g 1 AgDg1 32 P 32

Dac g 2 11 C 33，S45354

Dac g 3 C 33A，U25343

Dac g 5 31 P 34

草甸羊茅(Festuca pratensis)

牛尾草(meadow fescue)

Fes p 4w 60 -

绒毛草(Holcus lanatus)

天鹅绒草(velvet grass)

HoI I 1 C Z27084

黑麦草(Lolium perenne)

rye grass

Lol p 1 group I 27 C 35，36

Lol p 2 group II 11 P 37，37A，X73363

Lol p 3 group III 11 P 38

Lol p 5 Lolp IX，Lol p Ib 31/35 C 34，39

Lol p 11 hom：胰蛋白酶抑制剂16 39A

喜湿虉草(Phalaris aquatica)

金黄草(canary grass)

Pha a 1 C 40，S80654

猫尾草(Phleum pratense)

梯牧草(timothy)

Phl p 1 27 C X78813

Phl p 2 C X75925，41

Phl p 4 P 41A

Phl p 5 Ag25 32 C 42

Phl p 6 C Z27082，43

Phl p 11胰蛋白酶抑制剂族. 20 C AF521563，43A

Phl p 12抑制蛋白 C X77583，44

Phl p 13多聚半乳糖醛酸酶 55-60 C AJ23884B

草地早熟禾(Poa pratensis)

肯塔基蓝草(Kentucky blue grass)

Poa p 1 组I 33 P 46

Poa p 5 31/34 C 34，47

假高梁(Sorghum halepense)

石茅高梁(Johnson grass)

Sor h 1 C 48

C.树

槟榔目(Arecales)

海枣(Phoenix dactylifera)

椰枣(date palm)

Pho d 2 抑制蛋白 14.3 C Asturias p.c.

山毛榉目(Fagales)

普通赤杨(Alnus glutinosa)

红桦(alder)

Aln g 1 17 C S50892

白桦(Betula verrucosa)

西南桦(birch)

Bet v 1 17 C 参考变应原异构体

的列表

Bet v 2 抑制蛋白 15 C M65179

Bet v 3 C X79267

Bet v 4 8 C X87153，S54819

Bet v 6 h：异黄酮还原酶 33.5 C 参考变应原异构

体的列表

Bet v 7 亲环蛋白 18 P P81531

欧洲鹅耳枥(Carpinus betulus)

铁树(hornbeam)

Car b 1 17 C 参考变应原异构

体的列表

欧洲板栗(Castanea sativa)

板栗(chestnut)

Cas s 1 22 P 52

Cas s 5甲壳酶

Cas s 8脂质转移蛋 9.7 P 53

欧榛(Corylus avellana)

榛树(hazel) Cor a 1 17 C 参考变应原异构

体的列表

Cor a 2抑制蛋白 14 C

Cor a 8脂质转移蛋白 9 C

Cor a 9 llS球蛋白样蛋白 40/？C Beyer p.c.

Cor a 10腔结合蛋白. 70 C AJ295617

Cor a 11 7S豌豆球蛋白样蛋白 48 C AF441864

美洲白橡(Quercus alba)

白栎(White oak)

Que a 1 17 P 54

唇形目(Lamiales)

木犀科(Oleaceae)

欧梣(Fraxinus excelsior)

岑树(ash) Fra e 1 20 P 58A，AF526295

普通女贞(Ligustrum vulgare)

女贞子(privet)Lig v 1 20 P 58A

欧盟成员国橄榄(Olea europea)

橄榄树(olive)

Ole e 1 16 C 59，60

Ole e 2抑制蛋白 15-18 C 60A

Ole e 3 9.2 60B

Ole e 4 32 P P80741

Ole e 5 超氧化剂物歧化酶 16 P P80740

Ole e 6 10 C 60C，U86342

Ole e 7 ？ P 60D，P81430

Ole e 8 Ca²⁺-结合蛋白 21 C 60E，AF078679

Ole e 9 beta-1，3-葡聚糖酶46 C AF249675

Ole e 10糖基水解酶族 11 C 60F，AY082335

欧洲丁香(Syringa vulgaris)

紫丁香(lilac)Syr v 1 20 P 58A

车前草科(Plantaginaceae)

长叶车前(Plantago lanceolata)

English plantain

Pla 1 1 18 P P842242

松杉目(Pinales)

Cryptomeria japonioa

sugi

Cry j 1 41-45 C 55，56

Cry j 2 C S7，D29772

Cupressus arisonica

柏树(cypress)

Cup a1 43 C A1243570

地中海柏木(Cupressus sempervirens)

线杉(common cypress)

Cup s 1 43 C 参考变应原异构

体的列表

Cup s 3w 34 C ref pending

美国雪松(Juniperus ashei)

刺柏(mountain cedar)

Jun a 1 43 P P81294

Jun a 2 C 57A，AJ404653

Jun a 3 30 P 57B，P81295

杜松木(Juniperus oxycedrus)

希腊阿伯刺桧(prickly juniper)

Jun o 4 hom：钙调蛋白 29 C 57C，AF031471

Juniperus sabinoides

香柏(mountain cedar)

Jun s 1 50 P 58

维吉尼亚雪松(Juniperus virginiana)

东方红柏(eastern red cedar)

Jun v 1 43 P P81825，58B

悬铃木科(Platanaceae)

二球悬铃木(Platanus acerifolia)

London plane tree

Pla a 1 18 P P82817

Pla a 2 43 P P82967

Pla a 3脂质转移蛋白 10 P Iris p.c.

D.螨(Mites)

粗脚粉螨(Acarus siro) 节肢动物

螨(mite)

Aca s 13脂肪酸结合蛋 14* C AJ006774

热带无爪螨(Blomia tropicalis)

螨(mite)

Blo t 1半胱氨酸蛋白酶 39 C AF277840

Blo t 3胰蛋白酶 24* C Cheong p.c.

Blo t 4 a淀粉酶 56 C Cheong p.c.

Blo.t 5 C U59102

Blo t 6糜蛋白酶 25 C Cheong p.c.

Blo t 10原肌球蛋白 33 C 61

Blo t 11副肌球蛋 110 C AF525465，61A

Blo t 12 Btlla C U27479

Blo t 13 Bt6，脂肪酸结合蛋 C U58106

Blo t 19抗微生物肽族 7.2 C Cheong p.c.

粉尘螨(Dermatophagoides farinae)

美洲屋尘瞒(American house dust mite)

Der f 1 半胱氨酸蛋白酶 25 C 69

Der f 2 14 C 70，70A，参考变

应原异构体的列表

Der f 3胰蛋白酶 30 C 63

Der f 7 24-31 C SW：Q26456，71

Der f 10原肌球蛋白 C 72

Der f 11副肌球蛋白 98 C 72A

Der f 14 mag3，载脂蛋 C D17686

Der f 15 98k甲壳酶 98 C AF178772

Der f 16凝溶胶蛋白/绒毛蛋白 53 C 71A

Der f 17 Ca结合EF蛋白 53 C 71A.

Der f 18w 60k甲壳酶 60 C Weber p.c.

家尘螨(Dermatophagoides microceras)

屋尘螨(house dust mite)

Der m 1 半胱氨酸蛋白酶 25 P 68

屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)

欧洲屋尘螨(European house dust mite)

Der p 1抗原Pl，半胱氨酸蛋白酶25 C 62，参考变

应原异构体的列表

Der p 2 14 C 62A-C，参考变

应原异构体的列表

Der p 3胰蛋白酶 28/30 C 63

Der p 4淀粉酶 60 P 64

Der p 5 14 C 65

Der p 6 糜蛋白酶 25 P 66

Der p 7 22/28 C 67

Der p 8谷胱甘肽转移酶 C 67A

Der p 9溶胶原丝氨酸蛋白 P 67B

Der p 10原肌球蛋白 36 C Y14906

Der p 14载脂蛋白样蛋白 C Epton p.c.

梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)

螨(mite) Eur m 2 C 参考变应原异构

体的列表

Eur m 14 载脂蛋白 177 C AF149827

家食甜螨(Glycyphagus domesticus)

储螨(storage mite)

GIy d 2 C 72B，参考变应

原异构体的列表

害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)

储螨(storage mite)

Lep d 2 Lep d 1 15 C 73，74，

74A，参考变应

原异构体的列表

Lep d 5 C 75，AJ250278

Lep d 7 C 75，AJ271058

Lep d 10 原肌球蛋白 C 75A，AJ250096

Lep d 13 C 75，AJ250279

腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)

储螨(storage mite)

Tyr p 2 C 75B，Y12690

E.动物

Bos domesticus

牛(domestic cattle)

Bos d 2 Ag3，lipocalin 20 C 76，参考变应原

异构体的列表

(也参考食品)

Bos d 3 Ca-binding S100 hom.11 C L39834

Bos d 4 a乳清蛋白 14.2 C M18780

Bos d 5 -乳清蛋白 18.3 C X14712

Bos d 6 血清白蛋白 67 C M73993

Bos d 7 免疫球蛋白 160 77

Bos d 8 酪蛋白 20-30 77

犬科(familiaris)

家犬(Canis domesticus)

Can f 1 25 C 78，79

狗(dog)

Can f 2 27 C 78，79

Can f 3白蛋白 C S72946

Can f 4 18 P A59491

马(Equus caballus)

马(domestic horse)

Equ c 1 lipocalin 25 C U70823

Equ c 2 lipocalin 18.5 P 79A，79B

Equ c 3 Ag3-白蛋 67 C 79C，X74045

Equ c 4 17 P 79D

Equ c 5 AgX 17 P Goubran Botros p.c.

Felis dortiesticus

猫cat(唾液(saliva))

Fel d 1 cat-1 38 C 15

Fel d 2 白蛋 C 79E，X84842

Fel d 3 抑半胱氨酸 11 C 79F，AF238996

蛋白酶蛋白

Fel d 4 lipocalin 22 C AY497902

Fel d 5w免疫球蛋白A 400 Adedoyin p.c.

Fel d 6w免疫球蛋白M

800-

1000

Adedoyin p.c.

Fel d 7w 免疫球蛋白G 150 Adedoyin p.c.

豚鼠(Cavia porcellus)

豚鼠(guinea pig)

Cav p 1 lipocalin homologue 20 P SW：P83507，80

Cav p 2 17 P SW：P83508

小鼠(Mus musculus)

小鼠(mouse)(尿液)

Mus m 1 MUP 19 C 81，81A

家鼠(Rattus norvegius)

大鼠(rat)(尿液)

Rat n 1 17 C 82，83

F.真菌(霉菌)

1.子囊菌门(Ascomycota)

1.1子囊菌纲(Dothideales)

链格孢(Alternaria alternata)

Alt a 1 28 C U82633

Alt a 2 25 C 83A，U62442

Alt a 3热休克蛋白. 70 C U87807，U87808

Alt a 4 prot.disulfideisomerase 57 C X84217

Alt a 6酸性核糖体蛋P2 11 C X78222，U87806

Alt a 7 YCP4蛋 22 C X78225

Alt a 10醛脱氢酶 53 C X78227，P42041

Alt a 11烯醇化酶 45 C U82437

Alt a 12酸性核糖体蛋白P1 11 C X84216

草本枝孢(Cladosporium herbarum)

Cla h 1 13 83B，83C

Cla h 2 23 83B，83C

Cla h 3核糖体脱氢酶 53 C X78228

Cla h 4酸性核糖体蛋白P2 11 C X78223

Cla h 5 YCP4蛋 22 C X78224

Cla h 6烯醇化酶 46 C X78226

Cla h 12酸性核糖体蛋P1 11 C X85180

1.2曲霉菌目(Eurotiales)

黄曲霉(Aspergillus flavus)

Asp fl 13碱性丝氨酸蛋白酶 34 84

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)

Asp f 1 18 C M83781，S39330

Asp f 2 37 C U56938

Asp f 3过氧化物酶体蛋白 19 C U20722

Asp f 4 30 C AJ001732

Asp f 5金属蛋白酶 40 C Z30424

Asp f 6 Mn过氧化物超氧 26.5 C U53561

化剂物歧化酶

Asp f 7 12 C AJ223315

Asp f 8核糖体蛋白P2 11 C AJ224333

Asp f 9 34 C AJ223327

Asp f 10天冬氨酸蛋白酶 34 C X85092

Asp f 11肽酰-脯氨酰异构酶 24 84A

Asp f 12热休克蛋白P90 90 C 85

Asp f 13碱性丝氨酸蛋白酶 34 84B

Asp f 15 16 C AJ002026

Asp f 16 43 C g3643813

Asp f 17 C AJ224865

Asp f 18空泡丝氨酸蛋白酶 34 84C

Asp f 22w 烯醇化酶 46 C AF284645

Asp f 23 L3核糖体蛋 44 C 85A，AF464911

黑曲霉(Aspergillus niger)

Asp n 14 β-木糖苷酶 105 C AF108944

Asp n 18空泡丝氨酸蛋白酶 34 C 84B

Asp n 25 3-植酸酶B 66-100C 85B，P34754

Asp n？ 85 C Z84377

米曲霉(Aspergillus oryzae)

Asp o 13碱性丝氨酸蛋白酶 34 C X17561

Asp o 21 TAKA-淀粉酶A 53 C D00434，M33218

短密青霉(菌)(Penicillium brevicompactum)

Pen b 13碱性丝氨酸蛋白酶 33 86A

产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)

(formerly P.notatum)

Pen ch 13碱性丝氨酸蛋白酶 34 C 87

Pen ch 18空泡丝氨酸蛋白酶 32 87

Pen ch 20 N-acetyl glucosaininiclas 68 87A

桔青霉(Penicillium citrinum)

Pen c 3过氧化物酶体膜蛋白 18 86B

Pen c 13碱性丝氨酸蛋白酶 33 86A

Pen c 19热休克蛋白.P70 70 C U64207

Pen c 22w烯醇化酶 46 C AF254643

Pen c 24 伸因子1β C AY363911

草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)

Pen o 18空泡丝氨酸蛋白酶 34 87B

1.3肉座菌目(Hypocreales)

大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)

Fus c 1核糖体蛋白P2 11* C AY077706

Fus c 2硫氧还蛋白样蛋 13* C AY077707

1.4散囊菌目(Onygenales)

Trichophyton rubsum

Tri r 2 C 88

Tri r 4丝氨酸蛋白酶 C 88

断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)

Tri t 1 30 P 88A

Tri t 4丝氨酸蛋白酶 83 C 88

1.5酵母菌目(Saccharomycetales)

白色念珠菌(Candida albicans)

Cand a 1 40 C 89

Cand a 3过氧化物酶体蛋白 29 C AY136739

念珠菌(Candida boidinii)

Cand b 2 20 C J04984，J04985

2.担子(真)菌亚门(Basidiomycotina)

2.1层菌纲(Hymenomycetes)

裸盖菇属(Psilocybe cubensis)

Psi c 1

Psi c 2 亲环蛋白 16 89A

毛头鬼伞(Coprinus comatus)

shaggy cap

Cop c 1亮氨酸拉链蛋 11 C AJ132235

Cop c 2 AJ242791

Cop c 3 AJ242792

Cop c 5 AJ242793

Cop c 7 AJ242794

2.2锈菌(Urediniomycetes)

胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa

Rho m 1烯醇化酶 47 C 89B

Rho m 2空泡丝氨酸蛋白酶 31 C AY547285

2.3 Ustilaqinomycetes

糠秕马拉色(氏)霉菌(Malassezia furfur)

Mala f 2 MFl，过氧化物酶体 21 C ABO11804，90膜蛋白

Mala f 3 MF2，过氧化物酶体 20 C ABO11805，90膜蛋白

Mala f 4线粒体苹果酸脱氢酶 35 C AF084828，90A

鳞斑霉属(Malassezia sympodialis)

Mala s 1 C X96486，91

Mala s 5 18* C AJ011955

Mala s 6 17* C AJ011956

Mala s 7 C AJ011957，91A

Mala s 8 19* C AJ011958，91A

Mala s 9 37* C AJ011959，91A

Mala s 10热休克蛋白.70 86 C AJ428052

Mala s 11 Mn过氧化物超 23 C AJ548421

氧化剂物歧化酶

3.半知菌亚门(Deuteromycotina)

3.1结节菌目(Tuberculariales)

附球(真)菌属(Epicoccum purpurascens)

(formerly E.nigrum)

Epi p 1 丝氨酸蛋白酶 30 P SW：P83340，91B

G.昆虫(Insects)

Aedes aegyptii

蚊子(mosquito)

Aed a 1 三磷酸腺苷 68 C L12389

双磷酸酶

Aed a 2 37 C M33157

蜜蜂(Apis mellifera)

蜜蜂(honey bee)

Api m 1 磷脂酶A2 16 C 92

Api m 2 透明质酸酶 44 C 93

Api m 4 蜂毒肽 3 C 94

Api m 6 7-8 P Kettner p.c.

Api m 7 CUB 氨酸蛋白酶39 C AY127579

Bombus pennsylvanicus

熊蜂(bumble bee)

Bom p 1 磷脂酶 16 P 95

Bom p 4 蛋白酶 P 95

德国小蠊(Blattella germanica)

德国蟑螂(German cockroach)

Bla g 1 Bd90k C

Bla g 2天冬氨酸蛋白酶 36 C 96

Bla g 4 calycin 21 C 97

Bla g 5谷胱甘肽转移酶 22 C 98

Bla g 6肌钙蛋白C 27 C 98

美洲大蠊(Periplaneta americana)

美国蟑螂(American cockroach)

Per a 1 Cr-PII C

Per a 3 Cr-PI 72-78 C 98A

Per a 7 原肌球蛋白 37 C Y14854

摇蚊(Chironomus kiiensis)

蠓(midge)

Chi k 10 原肌球蛋白 32.5* C AJ012184

地方摇蚊(Chironomus thummi thummi)

蠓(midge)

Chi t 1-9 红蛋白 16 C 99

Chi t 1.01组分III 16 C P02229

Chi t 1.02 组分IV 16 C P02230

Chi t 2.0101组分I 16 C P02221

Chi t 2.0102组分IA 16 C P02221

Chi t 3 组分II-β 16 C P02222

Chi t 4 组分IIIA 16 C P02231

Chi t 5 组分VI 16 C P02224

Chi t 6.01 组分VIIA 16 C P02226

Chi t 6.02组分IX 16 C P02223

Chi t 7 组分VI1B 16 C P02225

Chi t 8 组分VIIl 16 C P02227

Chi t 9 组分X 16 C P02228

猫栉头蚤(Ctenocephalides felis felis)

猫蚤(cat flea)

Cte f 1

Cte f 2 MIb 27 C AF231352

Cte f 3 25 C

松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa)

pine processionary moth

Tha p 1 15 P PIR：A59396，99A

衣鱼(Lepisma saccharina)

衣鱼(silverfish)

Lep s 1 原肌球蛋白 36 C AJ309202

大黄蜂(Dolichovespula maculata)

white face hornet

Dol m 1 磷脂酶Al 35 C 100

Dol m 2 透明质酸酶 44 C 101

Dol m 5 抗原5 23 C 102，103

长黄胡蜂(Dolichovespula arenaria)

yellow hornet

Dol a 5 抗原5 23 C 104

Polistes annularies

黄蜂wasp

Pol a 1 磷脂酶Al 35 P 105

Pol a 2 透明质酸酶 44 P 105

Pol a 5 抗原5 23 C 104

胡蜂(Polistes dominulus)

Medit erranean paper wasp

Pol d 1 Hoffman p，c.

Pol d 4丝氨酸蛋白酶 32-34 C Hoffman p.c.

Pol d 5 P81656

Polistes exclamans

黄蜂(wasp)

Pol e 1 磷脂酶Al 34 P 107

Pol e 5 抗原5 23 C 104

纸巢蜂(Polistes fuscatus)

黄蜂(wasp)

Pol f 5 抗原5 23 C 106

柞蚕马蜂(Polistes gallicus)

黄蜂(wasp)

Pol g 5 抗原5 24 C P83377

长足胡蜂(Polistes metricus)

黄蜂(wasp)Pol m 5

抗原5 23 C 106

黄边胡蜂(Vespa crabo)

European hornet

Vesp c 1磷脂酶 34 P 107

Vesp c 5抗原5 23 C 106

日环胡蜂(Vespa mandarina)

giant asian hornet

Vesp m 1 Hoffman p.c

Vesp m 5 P81657

Vespula flavopilosa

yellowjacket Ves f 5 抗原 5 23 C 106

胡蜂(Vespula germanica)

yellowjacket Ves g 5 抗原 5 23 C 106

额斑脸黄胡蜂(Vespula maculifrons)

yellowjacket

Ves m 1磷脂酶Al 33.5 C 108

Ves m 2透明质酸酶 44 P 109

Ves m 5抗原5 23 C 104

Vespula pennsylvanica

yellowjacket

Ves p 5 抗原5 23 C 106

Vespula squamosa

yellowjacket

Ves s 5 抗原5 23 C 106

Vespula vidua

黄蜂(wasp) Ves vi 5

抗原5 23 C 106

黄胡蜂(Vespula vulgaris)

yellowjacket

Ves v 1 磷脂酶Al 35 C 105A

Ves v 2 透明质酸酶 44 P 105A

Ves v 5 抗原5 23 C 104

Myrmecia pilosula

Australian jumper ant

Myr p 1 C X70256

Myr p 2 C S81785

热带火蚁(Solenopsis geminata)

tropical fire ant

Sol g 2 Hoffman P.C

Sol g 4 Hoffman P.C

红火蚁(Solenopsis invicta)

fire ant

Sol i 2 13 C 110，111

Sol i 3 24 C 110

Sol i 4 13 C 110

黑火蚁(Solenopsis saevissima)

Brazilian fire ant

Sol s 2 Hoffman p.c.

Triatoma protracta

California kissing bug

Tria p1 Procalin 20 C AF179004，111A.

H.食品

鳕鱼(Gadus callarias)

cod

Gad c 1 变应原M 12 C 112，113

大西洋鲑(Salmo salar)

大西洋鲑(Atlantic salmon)

Sal s 1 微清蛋白 12 C X97824

Bos domesticus

domestic cattle

Bos d 4 α乳清蛋白 14.2 C M18780

(milk)

Bos d 5 β-乳球蛋白 18.3 C X14712

也参考动物(see also animals)

Bos d 6 清白蛋白 67 C M73993

Bos d 7 免疫球蛋白 160 77

Bos d 8 caseins 20-30 77

家鸡(Gallus domesticus)

鸡(chicken)

Gal d 1 卵类粘蛋白 28 C 114，115

Gal d 2 卵类白蛋白 44 C 114，115

Gal d 3 Ag22，伴清蛋白 78 C 114，115

Gal d 4 溶菌酶 14 C 114，115

Gal d 5 血清白蛋白 69 C X60688

刀额新对虾(Metapenaeus ensis)

嘏(shrimp) Met e 1 原肌凝蛋 C U08008

褐对虾(Penaeus aztecus)

嘏(shrimp)Pen a 1 原肌凝蛋白 36 P 116

Penaeus indicus

嘏(shrimp)Pen i 1 原肌凝蛋白 34 C 116A

斑节对虾(Penaeus monodon)

黑虎虾(black tiger shrimp)

Pen m 1 原肌凝蛋 38 C

Pen m 2 精氨酸激酶 40 C AF479772，117

太平洋褶柔鱼(Todarodes pacificus)

squid

Tod p 1 原肌凝蛋 38 P 117A

散大蜗牛(Helix aspersa)

brown garden snail

Hel as 1 原肌凝蛋白 36 C Y14855，117B

南非鲍螺(Haliotis midae)

鲍鱼(abalone)

Hal m 1 49 117C

食用蛙(Rana esculenta)

edible frog

Ran e 1 微清蛋白α 11.9*C AJ315959

Ran e 2 微清蛋白β 11.7*C AJ414730

芥菜(Brassica juncea)

oriental mustard

Bra j 1 2S白蛋白 14 C 118

欧洲油菜(Brassica napus)

油菜(rapeseed)

Bra n 1 2S白蛋 15 P 118A，P80208

芜菁(Brassica rapa)

芜菁(turnip)

Bra r 2 hom：prohevein 25 P81729

大麦(Hordeum vulgare)

大麦(barley)Hor v 15 BMAI-I 15 C 119

Hor v 16 α淀粉酶

Hor v 17 β-淀粉酶

Hor v 21 gamma-3大麦醇溶蛋白 34 C 119A，

SW：P80198

黑麦(Secale cereale)

黑麦rye sec c 20 黑麦醇溶蛋白参考同等

位基因列表

小麦(Triticum aestivum)

小麦(wheat)

Tri a 18 凝集素

Tri a 19 omega-5麦醇溶蛋 65 P PIR：A59156

玉米(Zea mays)

玉米(maise，corn)

Zea m 14 脂质转移蛋白. 9 P P19656

早稻(Oryza sativa)

稻(rice)

Ory s 1 C 119B，031771

旱芹(Apium graveolens)

芹菜(celery)

Api g 1 hom：Bet v 1 16* C Z48967

Api g 4 抑制蛋 AF129423

Api g 5 55/58 P P81943

胡萝卜(Daucus carota)

胡萝卜(carrot)Dau c 1 hom：Bet v 1 16 C 117D，

参考变应原异构

体的列表

Dau c 4 抑制蛋 C AF456482

欧榛(Corylus avel lana)

榛子(hazelnut)

Cor a 1.04 hom：Bet v 1 17 C 参考变应原异构

体的列表

Cor a 2 抑制蛋 14 C AF327622

Cor a 8 脂质转移蛋白 9 C AF329829

苹果(Malus domestica)

苹果(apple) Mald 1 hom：Bet v 1 C 参考变应

原异构体的列表

Mald 2 hom：竹芋蛋白 C AJ243427

Mal d 3脂质转移蛋白 9 C Pastorello p.

c.

Mal d 4抑制蛋白 14.4* C参考变应

原异构体的列表

梨(Pyrus communis)

梨(pear)Pyr c 1 hom：Bet v 1 18 C AF05730

Pyr c 4抑制蛋白 14 C AF129424

Pyr c 5 hom：异黄酮还原酶 33.5 C AF071477

鳄梨(Persea americana)

酪梨(avocado)Pers a 1 内切壳多糖酶 32 C Z78202

杏(Prunus armeniaca)

杏(apricot)

Pru ar 1 hom：Bet v 1 C U93165

Pru ar 3脂质转移蛋白 9 P

甜樱桃(Prunus avium)

甜樱桃(sweet cherry)

Pru av 1 hom：Bet v 1 C U66076

Pru av 2 hom：竹芋蛋白 C U32440

Pru av 3脂质转移蛋白 10 C AF221501

Pru av 4抑制蛋 15 C AF129425

Prunus doinestics

欧李(European plum)

Pru d 3脂质转移蛋白 9 P 119C

桃(Prunus persica)

桃(peach)Pru p 3脂质转移蛋白 10 P P81402

pru p 4抑制蛋白 14 C参考变应

原异构体的列表

芦笋(Asparagus officinalis)

芦笋(Asparagus)

Aspa o 1脂质转移蛋白 9 P 119D

番红花(Crocus sativus)

番红花(saffron crocus) Cro s 1 21 Varasteh A-R p.c.

莴苣(Lactuca sativa)

莴苣(lettuce)

Lac s 1 脂质转移蛋 9 Vieths p.c.

葡萄(Vitis vinifera)

葡萄(grape)

Vit v 1脂质转移蛋 9 P P80274

香蕉(Musa x paradisiaca)

香蕉(banana) Mus xp 1 抑制蛋白15 C AF377948

风梨(Ananas comosus)

凤梨(pineapple)

Ana c 1抑制蛋白 15 C AF377949

Ana c 2菠萝蛋白酶 22.8*C 119E-G，D14059

柠檬(Citrus liraon)

柠檬(lemon)

Cit 1 3脂质转移蛋白 9 P Torrejon p.c.

橙(Citrus sinensis)

甜橙(sweet orange)

Cit s 1 germin样蛋白 23 P Torrejon p.c.

Cit s 2抑制蛋白 14 P Torrejon p.c.

Cit s 3脂质转移蛋 9 P Torrejon p.c.

荔枝(Litchi chinensis)

荔枝(litchi)

Lit c 1 抑制蛋 15 C AY049013

白芥(Sinapis alba)

黑芥子(yellow mustard)

Sin a 1 2S 蛋 14 C 120

大豆(Glycine max)

大豆(soybean) Gly m 1 HPS 7 P 120A

Gly m 2 8 P A57106

Gly m 3 抑制蛋白 14 C 参考变应原异构

体的列表

GIy m 4 (SAM22)PR-10 prot. 17 C X60043，120B

绿(Vigna radiata)

绿豆(mung bean)

Vig r 1 PR-10蛋白 15 C AY792956

花生(Arachis hypogaea)

花生(peanut)

Ara h 1 豌豆球蛋白 63.5 C L34402

Ara h 2 羽扇豆球蛋白 17 C L77197

Ara h 3 大豆球蛋白 60 C AF093541

Ara h 4 大豆球蛋白 37 C AF086821

Ara h 5 抑制蛋白 15 C AF059616

Ara h 6 hom：羽扇豆球蛋白 15 C AF092846

Ara h 7 hom：羽扇豆球蛋白 15 C AF091737

Ara h 8 PR-10蛋 17 C AY328088

扁豆(Lens culinaris)

扁豆(lentil)

Len c 1 豌豆球蛋白 47 C 参考变应原异

构体的列表

Len c 2种子生物素酰化的蛋白66 P 120C

Pisum savitum

豌豆(pea)

Pis s 1豌豆球蛋白 44 C 参考变应原异

构体的列表

Pis s 2 convicilin 63 C 审理中

中华猕猴桃(Actinidia chinensis)

奇异果(kiwi)

Act c 1半胱氨酸蛋白酶 30 P P00785

Act c 2竹芋蛋白样蛋白 24 P SW：P81370，121

辣椒(Capsicum annuum)

bell pepper

Cap a lw osmotin样蛋白 23 C AJ297410

Cap a 2抑制蛋白 14 C AJ417552

番茄(Lycopersicon esculentum)

番茄(tomato)

Lyc e 1抑制蛋白 14 C AJ417553

Lyc e 2 b-呋喃果糖苷酶 50 C 参考变应原异构

体的列表

Lyc e 3脂质转移蛋白. 6 C U81996

马铃薯(Solanum tuberosum)

马铃薯(potato)

Sola t 1 patatin 43 P P15476

Sola t 2组织蛋白酶D抑制剂 21 P P16348

Sola t 3半胱氨酸蛋白酶抑制剂21 P P20347

Sola t 4天冬氨酸蛋白酶抑制剂16+4 P P30941

巴西坚果(Bertholletia excelsa)

巴西坚果(Brazil nut)

Ber e 1 2S白蛋白 9 C P04403，M17146

Ber e 2 11S球蛋白种子贮存蛋白29 C AY221641

东部黑核桃(Juglans nigra)

黑核桃(black walnut)

Jug n 1 2S 蛋白 19* C AY102930

Jug n 2豌豆球蛋白-样蛋白 56* C AY102931

胡桃(Juglans regia)

English walnut

Jug r 1 2S白蛋白 C U66866

Jug r 2豌豆球蛋白 44 C AF066055

Jug r 3脂质转移蛋白 9 P Pastorello

腰果(Anacardium occidentale)

腰果(Cashew)

Ana o 1豌豆球蛋白样蛋白 50 C 参考变应原异

构体的列表

Ana o 2 球蛋白样蛋白 55 C AF453947

Ana o 3 2S白蛋白 14 C AY081853

蓖麻(Ricinus communis)

蓖麻(Castor bean)

Ric c 1 2S白蛋白 C P01089

芝麻(Sesamum indicum)

芝麻(sesame)

Ses i 1 2S白蛋白 9 C 121A，AF240005

Ses i 2 2S白蛋白 7 C AF091841

ses i 3 7S豌豆球蛋白样球蛋白 45 C AF240006

Ses i 4油质蛋白 17 C AAG23840

Ses i 5油质蛋白 15 C AAD42942

甜瓜(Cucumis melo)

甜瓜(muskmelon)

Cuc m 1丝氨酸蛋白酶 66 C D32206

Cuc m 2抑制蛋白 14 C AY271295

Cuc m 3 pathogenesis-rel p.PR-I 16*P P83834

I.其它的

海兽胃线虫(Anisakis simplex)

线虫(nematode)

Ani S 1 24 P 121B，A59069

Ani S 2 副肌球蛋白 97 C AF173004

Ani S 3 原肌凝蛋白 41 C 121C，Y19221

A(ni S 4 9 P P83885

软蜱科(Argas reflexus)

鸽壁虱(pigeon tick)

Arg r 1 17 C AJ697694

猪蛔虫

worm Asc s 1 10 P 122

番木瓜(Carica papaya)

番木瓜(papaya)

Car p 3w papain 23.4* C 122A，M15203

Dendronephthya nipponica

soft coral

Den n 1 53 P 122B

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)

rubber(latex)

Hev b 1 延长因子 58 P 123，124

Hev b 2 1，3-葡聚糖酶 34/36 C 125

Hev b 3 24 P 126，127

Hev b 4 微螺旋复合物 100-115 P 128

的组分

Hev b 5 16 C U42640

Hev b 6.01 hevein前体 20 C M36986，p02877

Hev b 6.02 hevein 5 C M36986，p02877

Hev b 6.03 C-末端片断 14 C M36986，p02877

Hev b 7.01 hom：patatin 42 C U80598

from B-serum

Hev b 7.02 hom：patatin from C-serum 44 C AJ223038

Hev b 8抑制蛋白 14 C 参考变应

原异构体的列表

Hev b 9烯醇化酶 51 C AJ132580

Hev b 10 Mn过氧化物超氧 26 C 参考变应原异

化剂物歧化酶构体的列表

Hev b 11 class 1甲壳酶 C 参考变应原异构

体的列表

Hev b 12脂质转移蛋白 9.3 C AY057860

Hev b 13酯酶 42 P P83269

人类

人自体变应原

Hom s 1 73* C Y14314

Hom s 2 10.3* C X80909

Hom s 3 20.1* C X89985

Hom s 4 36* C Y17711

Hom s 5 42.6* C P02538

非洲白木(Triplochxton scleroxylon)

欧斐切木(obeche)

Trip s 1 1型甲壳酶 38.5 P Kespohl p.c.

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编码这些变应原的核酸序列的知识使得它们可重组产生。因此，特别地，这些变应原优选地使用在免疫治疗中和在本发明的方法中。

本发明的另一方面是涉及评价个体的变应原敏感性和/或变应原免疫治疗临床效果的方法，其包括步骤：

-采集在对IgE-变应原复合物产生应答时能释放介质的细胞，

-使所述细胞与所述个体的血清和/或血浆接触，所述血清和血浆为用至少一个纯的变应原或其衍生物刺激(spike)，

-确定从所述样本中释放出的介质量，并评价个体在治疗前的变应原敏感性和/或通过比较所述量来评价免疫治疗的临床效果。

能够释放介质的细胞通常包含结合其的IgE分子。这些细胞能够从接受本发明的方法的个体所获得的样本中分离或者从其它个体样本中分离。当然，在根据本发明的方法中，也可能使用能结合IgE的细胞系。

根据本发明的方法特别适用于确定个体的变应原敏感性，因为其能够确定出变应原特异性的IgE和IgG分子在所述个体的血浆和血清中的比率。因为只有IgE-变应原复合物而非游离的IgE能够诱导介质从介质释放细胞比如白细胞中的释放，介质释放水平与存在于样本中的IgE复合物的量相关。依次地，在所述样本中的IgE复合物的量与变应原特异性IgE、变应原和除IgE之外的变应原特异性抗体的量相关，该变应原特异性抗体如IgG、IgA或IgM，IgM与IgE竞争游离的变应原并随后抑制IgE变应原复合物的形成。这意味着低水平的变应原特异性IgE或者高水平的变应原特异性IgG导致低水平的IgE复合物形成，因此引起介质释放减少。

变应原在所述血清和/或血浆中的浓度优选地为1ng/ml至100μg/ml之间，更优选地为1pg/ml至10μg/ml之间。

本发明的另一个方面涉及一种试剂盒，该试剂盒用于评价个体的变应原敏感性和/或用至少一种变应原进行变应原免疫治疗的临床效果，其包括

-至少一种变应原，用于诱导能够释放介质的细胞对变应原产生应答时释放介质，

-用于检测介质的方法，和

-任选地至少一个介质标准。

在本文中提供的所述试剂盒包括至少一种变应原，其可用于诱导来自包含在样品中的介质释放细胞的介质释放。然后，直接地或优选地在除去样品的固体部分后检测在反应混合物的上层清液中释放的介质。任选地，用于检测结合所述变应原的IgE分子的方法也包括在本发明的试剂盒中。当IgE结合介质释放细胞和变应原结合时，IgE能够结合不同的变应原，并介导的从所述细胞释放介质。然而，IgE对变应原的特异性通常在血液中不能检测到，且仅当某个人对变应原变得敏感时才会产生。为了精确的确定样本中的介质量(用于提供标准曲线)，介质标准可以是试剂盒的任选部分。

优选地，所述细胞是肥大细胞和/或嗜碱细胞和/或嗜酸细胞。

根据本发明的另一个优选实施方案，变应原选自大部分的白桦花粉变应原，尤其是Bet v 1和Bet v 4、大部分的梯牧草花粉变应原，尤其是Phl p1、Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7、大部分的房尘螨变应原，尤其是Der p l和Der p2、大部分的猫变应原，Fel d1、大部分的蜜蜂变应原、大部分的黄蜂变应原、抑制蛋白，特别是Phl p 12和储螨变应原，尤其是Lep d2及在表1中列出的变应原。

用于检测介质的方法优选抗体。

如上所述，优选通过免疫治疗检测介质。因此，所述试剂盒可以提供至少一种能够结合特异性介质的抗体。优选地可使用酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或者横向流动装置(lateralflow devices)。

本发明的另一个方面涉及用于评价变应原敏感性或用至少一种变应原进行变应原免疫治疗的临床效果的试剂盒，所述变应原包含至少两种下述成分：

-至少一种变应原，用于诱导对变应原产生应答时能够释放介质的细胞的介质释放，

-用于检测介质的方法，

-至少一个介质标准，和

-对IgE-变应原复合物产生应答时能够释放介质的细胞。

本发明通过下述的图形和实施例进行做进一步说明，但不受其限制。

附图说明

图1显示了来自真皮内终点滴定法(X轴：给出第一阳性反应的变应原浓度)和rBet v 1-特异性血清IgE(Y轴：kU/L CAP系统)的相关性结果。

图2显示了来自嗜碱细胞组胺释放(X轴：给出30％组胺释放的变应原浓度)和rBet v 1-特异性血清IgE(Y轴：kU/L CAP系统)的相关性结果。

图3显示了真皮内终点滴定法(X轴：给出第一阳性反应的变应原浓度)和嗜碱细胞组胺释放(Y轴：给出30％组胺释放的变应原浓度)结果之间的关系。

图4显示了通过CAP确定的Bet v 1-特异性IgE(X轴：kU/L)和通过标记的a-链确定的rBet v 1-特异性IgE(Y轴：每分钟计数(c.p.m.)；1∶5血清稀释)之间的相关系。

图5显示了嗜碱细胞组胺释放的结果(X轴：最大组胺释放(％))和皮肤单刺试验(Y轴：通过2μg/ml重组Bet v1皮肤单刺试验诱发的风团反应(mm²)的结果之间的相关性。

具体实施方式

实施例

实施例1：

通过变应原交联结合IgE抗体的效应细胞(肥大细胞和嗜碱粒细胞)对I型变态反应的速发型症状的诱导作用是至关重要的事件(Ka-wakami T，等，Nat Rev Immunol(2002)2：773-86)。正如Prausnitz和Küstner(Prausnitz C，等，Centralbe F Bact 1 AbtOrig(1921)86：160-8)的经典试验所描述的，该事件依赖三个因素，即，变应原-特异性IgE抗体、效应细胞和变应原。因为IgE抗体的特征描述和能够精确地测定变应原-特异性IgE抗体的量的诊断测验的发展，某些试验已经研究了变应原-特异性血清IgE抗体水平和过敏患者对变应原的生物敏感性之间的关系(Stenius B等，ClinAllergy(1971)1：37-55；Bryant DH等，Clin Allergy(1975)5：145-57；Pauli G等，Clin Allergy(1977)7：337-46；BousquetJ等Clin Allergy(1987)17：529-36；Witteman AM等J AllergyClin Immunol(1996)97：16-25；Niederberger V，等J InvestDermatol(2001)117：848-51；Norman PS等J Allergy ClinImmunol(1973)52：210-24；Lichtenstein LM等J Allergy ClinImmunol(1971)47：103(A37))。现已确定变应原-特异性0血清IgE的是出现速发型反应的必要条件，但是变应原-特异性IgE的量是否与给定的变应原的速发型敏感症有关还有很多争论。为描述这一问题，过去进行的几乎所有研究都是使用变应原提取物，如变应原和非变应原分子的混合物(Stenius B等，Clin Allergy(1971)1：37-55；Bousquet J等，Clin Allergy(1987)17：529-36；NormanPS等J Allergy Clin Immunol(1973)52：210-24；LichtensteinLM等，J Allergy Clin Immunol(1971)47：103(A37))。这也是为什么这些研究不能在分子水平分析变应原-特异性IgE水平和生物学活性之间相关性的原因。最近的研究报道了这些参数之间具有相当大的差异，所述研究采用纯化的天然的和重组的变应原来重新研究皮肤敏感性和变应原-特异性IgE水平之间的相关性(Witteman AM等，J Allergy Clin Immunol(1996)97：16-25；Niederberger V等J Invest Dermatol(2001)117：848-51)。在该实施例当中，纯化重组体Bet v 1，大部分的的白桦花粉变应原作被用作进一步研究变应原-特异性IgE水平、效应细胞应答反应以及在活体内敏感性之间关系的代表性工具。在18个白桦花粉过敏的人群中，其根据熟知的临床标准且排除花粉的季节选择，定量对指定量的结构折叠的重组体Bet v 1应答的皮肤敏感性和嗜碱性粒细胞脱粒。比较生物学的试验结果和血清学试验结果。为了评价Bet v 1-特异性IgE抗体水平，采用两种不同的测定：一种是检测任意Bet v 1-特异性IgE，另一种是检测能够与效应细胞结合的Bet v 1-特异性IgE。

材料和方法

研究人群

对患者的检查是在白桦花粉季节开始前的一月和四月之间进行。该项研究包括18名患者，8名女性和10名男性，年龄均在28到58岁之间(平均年龄：45.6岁)，他们均具有白桦花粉过敏史，并且白桦花粉提取物单刺皮肤试验呈阳性。所有患者都至少在三年前首次被诊断患有中度到严重的鼻炎。5名患者在白桦花粉季节患有轻度哮喘，12名患者对蔷薇科水果(苹果、桃、杏和扁桃)、茄科蔬菜(土豆，西红柿)和伞形科蔬菜(芹菜和胡萝卜)具有口腔过敏症状。进行用呼吸器官过敏原的皮肤单刺试验(stallergenes，France)来证实致敏特性，所述过敏原包括房尘螨、真菌变应原混合物、狗和猫的皮屑、蟑螂、草、树(包括白桦、橄榄和岑树)以及杂草花粉。患者的特征为下表1中列出的。

表1.被研究人群的血清学、嗜碱细胞组胺释放和皮肤实验的临床数据结果

N	起始	年龄	Symptom	阳性单刺实验	食品变态反应	+ID实验	30％HR	IgE分类	特异IgE(kU/L)(S)	总IgE(kU/L)(T)	(S/T)％	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
N	起始	年龄	Symptom	阳性单刺实验	食品变态反应	+ID实验	30％HR	IgE分类	特异IgE(kU/L)(S)	总IgE(kU/L)(T)	(S/T)％	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4	123456789101112131415161718	F-TS-FW-FF-JJG-SS-SB-AO-CL-NM-CH-CP-DH-MW-SB-EB-MW-BS-B	583353514950393744435849415328504640	R-CR-CR-CR-CR-CR-CR-C，AR-CR-C，AR-C，AR-CR-C，AR-CR-C，AR-CR-CR-CR-C	m，b，o，gbb，obm，bb，o，w，cb，ab，o，a，wb，ab，ob，o，am，b，a，gm，b，om，bb，gb，o，gm，b，g，o，w.cb	a，c，p，al，na，p，na，p，apa，c，pa，naa，c，ap，p，n，ca，caa，c，p，al， nan，ala，pa，ca，k	10^-30.3×10^-110^-110^-30.3×1010.3×101010^-510^-310^-410^-20.3×10^-10.3×10^-210.3×10^-210^-11	0.3×10^-20.3×10^-210^-10.3×10^-310^-10.3×10^-20.3×10^-110^-110^-20.3×10^-310^-4110^-20.3×10^-110^-210^-310^-11	343534454343543342	12.124.15.2259.917.141.12079.926.64.5122717.451.545.5144.7421.41.65	30.614211.512833168432311156.911394.582.272.390.916.591.3NA	39.516.945.446.851.824.546.534.623.165.42018.462.662.915.428723.4NA	0.240.7980.5371.0660.1870.2870.2980.6581.3250.50.5051.0430.1830.2360.3890.140.3440.113	0.150.1110.0790.1060.0740.0810.0830.090.0980.1730.10.0750.0590.1610.0690.0640.0860.061	0.1810.0920.7880.0720.0650.0810.0810.830.0740.0630.0680.0650.0650.0750.0790.0680.0750.065	0.1310.4080.0820.1980.0750.1030.0710.2090.1360.060.2080.1290.0620.8890.0780.0650.1110.074

症状：R，鼻炎；C，结膜拓：A，哮喘。

阳性单刺实验：m，螨；b，桦树；o，橄榄树；g，大麻；w，野草：a，岺树.c，猫

食品变应原：a，苹果；ap，杏；c，樱桃；p，桃；al，杏仁；n，坚果；k，kiwi，ce，芹菜；ca，胡萝卜

ID实验，具皮内实验；HR，组胺释放(以μg/mL计的值)；c.p.m.，每分钟计数。

研究设计

为了分析变应原-特异性IgE水平、皮肤敏感性以及嗜碱性粒细胞脱粒之间可能的关系，对患者抽血，并在同一天对他们的皮肤进行测试。进行该分析，要严格避开白桦花粉季节以避免季节性变应原接触带来的影响。在进行研究前至少一周，患者不得服用抗过敏药或者消炎药。没有一名患者在过去5年以上的时间内接受过变应原特异性免疫治疗。在征得同意后，采集血液用于嗜碱细胞组胺释放和用于血清样本。然后，立即采用终点滴定法进行真皮内皮肤试验(Grammer LC等，J Allergy Clin Immunol(1985)76：123-7)。

测定并量化变应原-特异性抗体

变应原-特异性IgG1到IgG4亚型水平与变应原-特异性IgM和IgA水平都通过酶联免疫吸附试验来测定，其采用如上所述的同种型特异性单克隆抗体(Vrtala S等，J Allergy Clin Immunol(1996)97：781-7)。结果显示双份测定的平均值，且显示相应于结合抗体的量的OD值。

嗜碱细胞组胺释放测试

根据Tanisaki等人描述的方法，在一个剂量响应模式中进行用rBet v 1和抗-IgE作为阳性对照的全血中激发免疫反应(Tanisaki Y等，Int Arch Allergy Appl Immunol(1984)73：141-5)。将10毫升静脉血注入一个含有1毫升肝素的塑料注射器当中。将250μl不同浓度的rBet v 1(从10^-4到10mg/ml)或者抗-IgE(从10^-4到10^-3，especific，Dako，Glostrup，Denmark)加入到含有500ml在氨基丁三醇(10mmol/l Tris、136mmol/l NaCl、2.7mmol/l KCl、0.23mmol/lMgCl₂、1.8mmol/L CaCl₂、5.5mmol/l葡萄糖；pH 7.3)中1∶4稀释的全血的试管中。将混合溶液在37℃下培养30分钟。反应停止，通过在375xg下冷离心(4℃)5分钟分离细胞。如前所述，取200μl无细胞上清液用采用酰化组胺单克隆抗体(Immunotech，Marseille，France)放射免疫测定法进行组胺定量化(Morel AM，等J Allergy ClinImmunol(1988)82：646-54)。通过反复融冻使细胞溶解后，测定全部的组胺。所有的试验都按双份进行。用于描述嗜碱细胞敏感性的参数是诱导组胺释放总量的30％的最低变应原浓度。

真皮内试验

阈值真皮内皮肤试验是通过在胳膊侧部注射0.03ml的10倍稀释的rBet v 1来进行的。从1000mg/ml的溶液连续稀释配制溶液，并且试验的首次稀释液为10mg/ml。该试验注射后15分钟读数。记录风团区域和红斑。当诱导的风团区域超过了由注射引起的风团区域时，认为测试呈阳性，并且诱导产生阳性测试结果的最低变应原浓度用于与其它参数的比较(Grammer LC，等，J Allergy Clin Immunol(1985)76：123-7)。

数据的统计分析

通过使用VisualStats Professional软件(version 2003)的Spearman s非参量检验测定不同参数之间的相关性。

结果

rBet v 1-特异性免疫球蛋白E水平与皮肤对rBet v 1的敏感性之间几乎没有关系。

为了比较rBet v 1-特异性IgE水平与皮肤敏感性，通过CAP进行测定rBet v 1-特异性IgE水平，其与诱导真皮内试验风团反应呈阳性的rBet v 1阈浓度相关。图1显示了变应原-特异性IgE水平与皮肤敏感性之间没有相关性(r＝-0.007，P＝0.977)。观察到在患者体内变应原-特异性IgE和皮肤敏感性之间存在较大偏差。例如，患者8显示出较高的Bet v 1-特异性IgE水平(79.9kU/l)，但是仅在10mg/ml的rBet v 1(表1)显示出阳性ID反应。另一方面，患者10具有低的rBet v 1-特异性IgE(4.5kU/l)，但是对Bet v 1(1ng/ml rBet v1的阳性ID测试反应)的皮肤敏感性比患者8大1000倍。7名具有相似的rBet v 1-特异性IgE水平(17.126.6kU/l)的患者(2，5，7，9，11，12和17)显示出极宽的皮肤rBet v 1敏感性范围(从3到105mg/ml)(表1)。

rBet v 1-特异性IgE水平与rBet v 1-相关的嗜碱细胞敏感性之间几乎没有相关性

图2(IgE vs.30％组胺释放)显示出rBet v 1-特异性IgE水平与Bet v 1-诱导的嗜碱细胞敏感性之间也缺乏相关性(图2：r＝-0.113，P＝0.656)。诱发30％的组胺释放的rBet v 1浓度从10^-3到1mg/ml之间变化。对于给定的rBet v 1-特异性IgE水平(RAST class 3：4.5117.1kU/l)，诱发30％组胺释放的rBet v l的浓度在1000倍的范围内变化(110^-3mg/ml)。

rBet v 1-诱发的嗜碱细胞组胺释放与皮肤敏感性之间的相关性

图3显示，真皮内试验和嗜碱细胞组胺释放试验结果之间具有比血清学和生物学试验结果之间更好的相关性。引发30％组胺释放的rBet v 1浓度和真皮内风团反应之间具有显著倾向(r＝0.614；P＝0.007)。那些在rBet v 1-特异性IgE水平和生物学试验结果之间显示出极差相关性的患者(例如患者8和10)，他们的真皮内试验结果与嗜碱细胞组胺释放进行比较时显示出较好的相关性(表1)。进行其它实验结果是为了解释下述给出的血清学试验和生物学试验之间的偏差。

rBet v 1-特异性免疫球蛋白G亚类、免疫球蛋白A和免疫球蛋白M的测定结果。

已经描述了Bet v 1-过敏症患者的血清含有Bet v 1-特异性IgG抗体，它可以干扰IgE结合Bet v 1或者识别Bet v 1分子而不是IgE的抗原表位，因此对于IgE结合Bet v 1没有影响(Visco V等人JImmunol(1996)157：956-62；Denepoux S，等FEBS Lett(2000)465：39-46)。因此，确定了rBet v 1-特异性IgG的水平(IgG1 IgG4；表1)。所述患者显示出不同的rBet v 1-特异性IgG1 IgG4亚类的应答，在IgG1和IgG4亚类中具有最显著的响应。血清中并未检测到显著水平的rBet v 1-特异性IgA和IgM抗体，排除了这些抗体类别可能影响IgE对Bet v 1的识别。

评价Bet v 1-特异性免疫球蛋白E占所有IgE的百分数

如果Bet v 1-特异性IgE仅仅占所有IgE的百分数低，那么组胺释放的不足和皮肤反应性可以通过以下事实来解释：嗜碱细胞和肥大细胞主要被抗其它变应原的IgE占据。因此，确定了总的IgE值，并且可以计算Bet v 1-特异性IgE比例。这一实施例中的患者具有相对较低的总IgE值(＜168kU/L)，而且没有在低的Bet v 1-特异性IgE百分比和弱的生物学应答之间相关性。例如，在显示出高的敏感性的患者11中，Bet v 1-特异性IgE仅仅占总的IgE的20％。另一方面，虽然患者13为低敏感性的，但是总体62.6％的IgE直接抗Bet v 1(表1)。

讨论

变应原-特异性IgE抗体水平、效应细胞的敏感性以及临床敏感性之间是否存在相关性一直是存在争论的问题。某些研究显示变应原-特异性血清IgE抗体与变应原-引发的速发型反应之间存在明显的相关性，甚至当采用多种变应原和非变应原成分的复合混合物时，而这使得难于比较皮肤试验和RAST(Stenius B等人，Clin Allergy(1971)1：37-55；Bousquet J等人，Clin Allergy(1987)17：529-36；Norman PS等人，J Allergy Clin Immunol(1973)52：210-24；Lichtenstein LM等人.J Allergy Clin Immunol(1971)47：103(A37))。最近，其它采用纯的变应原的研究(Witteman AM等，JAllergy Clin Immunol(1996)97：16-25)和重组变应原(NiederbergerV等J Invest Dermatol(2001)117：848-51)已经证实了在抗体水平和生物学敏感性之间存在相当大的偏差。

已经完成了使用确定纯度和结构上折叠的变应原的临床研究(例如，大部分的白桦花粉变应原，Bet v l)，其用于研究在分子水平特异性IgE与嗜碱性粒细胞脱粒和皮肤敏感性之间的相关性。发现在这三个方法学和白桦敏感性的临床相关之间存在良好一致；然而，记录了变应原-特异性IgE水平、嗜碱细胞敏感性和活体内的敏感性(例如，皮肤敏感性通过终点滴定法确定)之间的巨大差异。在某些病人当中，观察到了很低的特异性IgE水平，但是同时观察到在嗜碱性粒细胞脱粒和皮肤测试中较高的敏感性，反之亦然。已有文献的回顾显示出缺乏对皮肤测试、嗜碱细胞组胺释放和特异性IgE水平之间的比较研究。少数可以利用的研究显示出不同的结果，并且采用的是粗的变应原提取物。例如，Norman等(Norman PS等，J Allergy Clin Immunol(1973)52：210-24)发现三项测试在诊断豕草花粉症方面有良好的一致性。Lich-tenstein等人(Lichtenstein LM等，J Allergy Clin Immunol(1971)47：103(A37))发现皮肤测试和组胺释放之间在数量上具有显著的相关性。然而，在这一实例中并没有进行特异性IgE的测定。致敏性白细胞和肥大细胞对抗原的响应可取决于大量因素。

低的敏感性和弱组胺释放的一种可能是仅有很小比例的总血清IgE为变应原-特异性IgE。因此，测定总的IgE水平，并计算变应原-特异性IgE的百分比。然而，发现低百分比的变应原-特异性IgE反应和弱的生物学活性之间具有相关性。特异性-IgE占总IgE的低比例可能是引起对给定变应原的弱的生物反应的原因，这在多种敏感性受试者中可能是非常重要的(Norman PS等人，J Allergy Clin Immunol(1973)52：210-24；Conroy MC等人J Immunol(1977)118：1317-21；MacGlashan DW Jr等人，J Immunol(1986)136：2231-9)。

存在其它因素，其可引起变应原-特异性IgE水平和生物学反应之间的偏差，但是它们即使在采用纯化的变应原的系统中都无法确定。它们包括嗜碱细胞和肥大细胞敏感性的个体差异，因为IgE-受体细胞表面密度有差异，所述表面密度为通过血清IgE水平调节的一个参数(Conroy MC等J Immunol(1977)118：1317-21；Malveaux FJ等，J Clin Invest(1978)62：176-81；Dembo M等，J Immunol(1978)121：345-53；MacGla-shan DW Jr等J Allergy Clin Immunol(1999)104：492-8)。不同细胞敏感性已经通过在相似总量和变应原-特异性IgE血清浓度情况下的剂量响应曲线的可变移动(测定50％或30％的敏感性)得到证实(Conroy MC等J Immunol(1977)118：1317-21；MacGlashan DW Jr.，J Allergy Clin Immunol(1993)91：605-15)。

此外，显示在嗜碱粒细胞上具有相等数量IgE分子的人可以释放他们组胺含量的0-100％的(Conroy MC等J Immunol(1977)118：1317-21)。在表皮肥大细胞中也被观察到相同的情况(Petersen LJ等，J Allergy Clin Immunol(1996)97：672-9；Bordignon V，Pet al.，Invest Allergol Clin Immunol(2000)10：78-82)。而且，已经显示出发生的早期信号事件包括酪氨酸激酶(sykkinase)和IP3产物，其与特异性IgE水平或者嗜碱细胞敏感性无关(MacGlashan DW Jr.，JAllergy Clin Immunol(1993)91：605-15；Miura K等，J Immunol(2001)167：7027；MacGlashan DW Jr.，J Immunol(2003)170：4914-25)。

最新证据表明肥大细胞也可以受到Toll-样受体影响(MarshallJS等，Int Arch Allergy Immunol(2003)132：87-97)。然而，试验使用的rBet v 1制剂并不包括内毒素。

最后，有可能地是IgE抗体的存在影响了血清学和生物学的测试结果，所述抗体具有诱导不同过敏活性的抗原表位的不同亲和力或结合特异性.

结论是，该研究从分子水平上证实变应原-特异性血清IgE水平与细胞和体内试验测定的生物学敏感性之间没有必然的相关性。然而，发现在皮肤试验和嗜碱细胞组胺释放测试之间具有稳定的相关性。

实施例2：

为了在治疗前确定病人的敏感性以使得给予正确剂量，使用全血的嗜碱细胞组胺释放试验。具有高敏感性的患者将比低敏感性患者注射更小的剂量。治疗前，采用纯化的变应原建立剂量应答曲线。同时，用抗-IgE刺激细胞以确定全部细胞的敏感性，其可以影响对于变应原的敏感性。通常在治疗4-8周后，在抗变应原的IgG抗体变得可检测后，将可以控制治疗的成功性。因为，阻断IgG抗体可能是引起敏感性降低的原因，同时确定对所给变应原的IgG水平是很有用的。此外，采用纯化的变应原和抗-IgE再次测定剂量响应。比较给予最大细胞活化的剂量(即最大组胺释放或者CD203c增量调节)或者测定给出一定程度活化的剂量，并且用处理前获得的试验结果进行比较。材料和方法如在实施例1中描述的。

实施例3：

如描述的(Stahl-Skov等1977.J Exp Immunol 27：432-439)，当用洗过的粒细胞制剂进行嗜碱细胞组胺释放试验时，没有发现组胺释放数据和皮肤敏感性之间的相关性。

组胺释放可使用来自过敏患者的嗜碱细胞进行。用葡聚糖沉积将它们浓缩，分离，洗涤，再悬浮在组胺释放缓冲液中，并暴露于在37℃下的96-孔滴定板(TPP，Trasadingen，Switzerland)中不同浓度的重组体Bet v1(10^-5，10^-4，，10^-3，10^-2，10^-1，1μg/ml)或抗IgE mAbE-124-2-8(1μg/ml)中30分钟。培养后，离心分离细胞。回收不含细胞的上清液，通过采用市售放射免疫测定法分析组胺含量(Immunotech，Marseille，France)。将组胺释放表达为在细胞溶解产物中测定的总组胺的百分数(Valent等，1989，Proc Natl Acad SciUSA 86：5542-5546)。

如描述的(Pauli等，1996，J Allergy Clin Immunol 97：1100-1109)，采用连续稀释的重组Bet v 1进行皮肤单刺试验。

从暴露于重组Bet v 1(HR％-max)的嗜碱细胞释放的最大量组胺与皮肤单刺试验反应(mm²)没有相关性(SPT 2μg/ml)(r＝0.224，P＝0.342)(图5)。

Claims

1.用于评价个体的变应原敏感性和/或变应原免疫治疗的临床效果的方法，其包括步骤：

-采集至少两个来自接受或打算接受用至少一种纯的变应原或其衍生物进行免疫治疗的个体的样本，所述样本选自血液或者其部分、结缔组织、鼻的、支气管的、皮肤或者消化道的活组织检查材料，其中所述样本包含对所述变应原产生应答时能够释放介质的细胞，

-使所述样本与所述变应原或其衍生物接触，和

-确定从所述样本中释放出的介质的量，并且通过比较所述量来评价个体在治疗前的变应原敏感性和/或评价免疫治疗的临床效果。

2.用于评价个体的变应原敏感性和/或变应原免疫治疗的临床效果的方法，其包括步骤：

-采集在对IgE-变应原复合物产生应答时能释放介质的细胞，

-使所述细胞与所述个体的血清和/或血浆接触，所述个体用至少一个纯的变应原或其衍生物刺激，和

-确定从所述样本中释放出的介质的量，并通过比较所述量来评价个体在治疗前的变应原敏感性和/或评价免疫治疗的临床效果。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述介质选自组胺、纤维蛋白溶酶、前列腺素、白三烯，特别是半胱氨酰白三烯、嗜酸细胞阳离子蛋白、细胞因子，如白介素类(IL)，尤其是IL-2R、CD63、CD203c及其组合。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述细胞为肥大细胞和/或嗜碱性细胞和/或嗜酸性细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于所述样本中进一步包含免疫球蛋白(Ig)，特别是免疫球蛋白G(IgG)。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于所述样本在所述个体接受免疫治疗前后采集。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于所述样本在所述个体接受免疫治疗后采集。

8.根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于至少一个样本是在所述个体接受免疫治疗之后最多1小时、12小时、24小时、10天、4周、6个月以及36个月采集。

9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于所述变应原是重组产生的。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述变应原包含至少一个缺失，至少一个替换或者至少一个插入。

11.根据权利要求9的方法，其特征在于所述变应原为通过基因工程重组所述变应原片段来修饰的。

12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其特征在于使所述样本与不同浓度的所述变应原接触。

13.根据权利要求12的方法，其特征在于所述变应原浓度选自1ng/ml至100μg/ml的范围，优选1pg/ml至10μg/ml的范围。

14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其特征在于进一步确定所述细胞的介质的总量。

15.根据权利要求14的方法，其特征在于细胞的致敏度为通过测定诱导占所述细胞的介质总量的10％，优选30％的释放的所述变应原的浓度来定义。

16.根据权利要求15的方法，其特征在于个体的变应原敏感性和/或变应原免疫治疗的临床效果通过观察在所述免疫治疗过程中的细胞致敏度来评价。

17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其特征在于所述样本中的该介质通过免疫法和/或色谱法确定的。

18.根据权利要求17的方法，其特征在于所述方法选自放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、逆转录酶多聚酶链式反应、免疫荧光流式细胞计量术及其组合。

19.根据权利要求1至18中任一项的方法，其特征在于所述变应原选自大部分的白桦花粉变应原，特别是Bet v 1和Bet v 4，大部分的梯牧草花粉变应原，特别是Phl p1、Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7，大部分的房尘螨变应原，特别是Der p1和Der p2，大部分的猫变应原Fel d1，大部分的蜜蜂变应原，大部分的黄蜂变应原，抑制蛋白，尤其是Phl p12和储螨变应原，尤其是Lep d2。

20.用于评价个体变应原敏感性或者对至少一种变应原进行变应原免疫治疗的临床效果的试剂盒，其包括

-至少一种变应原，用于诱导对变应原产生应答时能够释放介质的细胞释放介质，

-用于检测介质的方法，和

-任选地至少一个介质标准。

21.用于评价个体的变应原敏感性或者对至少一种变应原进行变应原免疫治疗的临床效果的试剂盒，包含至少两种下述成分：

-用于检测介质的方法，

-至少一种介质标准，和

-对IgE-变应原复合物产生应答时能够释放介质的细胞。

22.根据权利要求21的试剂盒，其特征在于所述细胞是肥大细胞和/或嗜碱性细胞和/或嗜酸性细胞。

23.根据权利要求20-22中任一项的试剂盒，其特征在于所述变应原选自大部分的白桦花粉变应原，特别是Bet v1和Bet v4，大部分的梯牧草花粉变应原，特别是Phl p1、Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7，大部分的房尘螨变应原，特别是Der p1和Der p2，大部分的猫变应原Fel d1，大部分的蜜蜂变应原。大部分的黄蜂变应原，抑制蛋白，尤其是Phl p12和储螨变应原，尤其是Lep d2。

24.根据权利要求20-23中任一项的试剂盒，其特征在于所述用于检测介质的方法选自由抗体组成的组。