CN107561291A - Pru p 3蛋白在制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了Pru p 3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒的新的应用。本发明提供的采用Pru p 3蛋白制备的试剂盒，联合BAT用于预测桃过敏反应严重程度，其预测效果优于目前临床最常用的体外检测方法即桃及其组分sIgE检测。

Description

Pru p 3蛋白在制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒中 的应用

技术领域

本发明涉及检测试剂制备领域，具体涉及Pru p 3蛋白在制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒中的应用。

背景技术

桃过敏是我国常见的食物过敏形式。桃过敏患者进食或接触桃后，可出现接触部位如唇、舌和咽等部位黏膜肿胀、瘙痒，即口腔黏膜变态反应综合征(oral allergysyndrom,OAS)，甚至更严重的全身反应(systemic reaction，SR)而危及生命。目前食物过敏尚无根治方法，主要防治措施是避免接触食物过敏原，当发生严重过敏反应时需使用肾上腺素进行急救。在日常生活中，做到完全避免接触过敏原有时很困难。因此，临床上迫切需要客观的检测指标帮助医生对食物过敏患者发生过敏反应的严重程度进行评估，识别潜在的可能发生严重过敏反应的患者，从而为其开具肾上腺素等急救药物提供客观依据。但迄今为主，临床尚缺乏一种可用来预测食物过敏反应严重程度的检测指标。

目前，临床上诊断食物过敏主要基于进食敏感食物后发生急性过敏反应的病史和皮肤试验/血清特异性IgE(specific IgE,sIgE)检测。皮肤试验，因受操作者技术和所用试剂影响，特异性和敏感性受限，且存在发生过敏反应的风险，使其在临床应用中大大受限。血清sIgE检测操作简便、安全，已广泛应用于临床，包括放射性变应原吸附试验、酶联免疫吸附试验和CAP变应原检测系统(CAP system)，其中CAP system是目前公认的检测血清sIgE抗体的金标准。但是，该方法检测的sIgE是血清中游离的抗体，只有当此抗体与嗜碱性粒细胞和(或)肥大细胞结合，同时遇到过敏原形成“抗原桥”才能发挥生物学效应。因此，sIgE阳性只能反映机体处于致敏状态，并不能有效评估过敏反应发生的严重程度。近年来，组分检测在食物过敏中的应用越来越受到关注。由于它使用纯的引起致敏的变应原蛋白，因此提高了过敏原检测的特异性。在国外，花生过敏发病率较高，研究发现Ara h 2是花生主要致敏蛋白，对该组分致敏提示其进食花生易发生过敏症状。虽然组分检测在花生过敏诊断中非常有价值，但其在评估花生过敏反应严重程度中的作用有限。

嗜碱性粒细胞和肥大细胞是参与I型超敏反应的重要效应细胞，其中，嗜碱性粒细胞尤其与食物诱发的严重过敏反应关系密切。近年来，人们利用流式细胞术(flowcytometry,FCM)来检测嗜碱性粒细胞膜表面活化标志物的变化，即嗜碱性粒细胞活化试验(basophil activation test,BAT)，目前尚无关于BAT在预测桃过敏反应严重程度中的研究报道。

目前BAT临床研究中常用的两个特异性标志物是CD63和CD203c。其中，CD63又称为溶酶体相关膜糖蛋白3(LAMP-3)，是一个四跨膜超家族蛋白(transmembrane 4superfamily，TM4SF)，可表达于多种细胞表面，如单核细胞、血小板和嗜碱性粒细胞。当嗜碱性粒细胞处于静息状态时，CD63只表达于胞内颗粒中，很少表达于膜表面；而在激活状态时，嗜碱性粒细胞脱颗粒发生易位，CD63与细胞膜融合并高表达于细胞膜表面，成为活化的嗜碱性粒细胞的特异性标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供Pru p 3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒中的应用，制备的试剂盒可用于预测桃过敏反应的严重程度。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

Pru p 3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒。

一种用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，包括桃致敏蛋白Pru p 3蛋白。

如上所述的预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，所述Pru p 3蛋白的工作浓度为10～50ng/ml，其缓冲液为PBS。

如上所述的桃过敏反应严重程度检测试剂盒，还包括刺激缓冲液、刺激质控、抗CD63-FITC和抗CCR3-PE的预混试剂、红细胞裂解液。

如上所述的桃过敏反应严重程度检测试剂盒，优选地，所述刺激缓冲液中含白介素-3，所述白介素-3的工作浓度为3～6ng/ml，所述缓冲液为PBS缓冲液；

所述刺激质控中含工作浓度为0.5～12.5ug/ml抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体，作为阳性对照；

所述抗CD63-FITC和抗CCR3-PE的预混试剂中抗CD63-FITC的浓度为0.1～1.0mg/ml，所述抗CCR3-PE的浓度为5～30μg/ml；

所述红细胞裂解液中含NH₄CL 100～150mmol/L，Tris 10～30mmol/L，pH7.0～7.4。

如上所述的桃过敏反应严重程度检测试剂盒，优选地，所述Pru p 3蛋白的工作浓度为25ng/ml，所述白介素-3的工作浓度为4.5ng/ml；

所述刺激质控中含工作浓度为2.5μg/ml的抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体；

所述抗CD63-FITC的浓度为0.5mg/ml，所述抗CCR3-PE的浓度为10μg/ml；

所述NH₄CL为139.6mmol/L，所述Tris为16.96mmol/L，pH7.2。

本发明的有益效果在于：

本发明中采用Pru p 3蛋白制备的试剂盒，联合BAT用于预测桃过敏反应严重程度，其预测效果优于目前临床最常用的体外检测方法即桃及其组分sIgE检测。

附图说明

图1为实施例2中FCS/SSC直方图上细胞分群。

图2为选择嗜碱性粒细胞CCR3^pos/SSC^low。

图3为实施例2中以Pru p 3作为刺激物时OAS组(局部过敏组)嗜碱性粒细胞活化的结果。

图4为实施例2中以Pru p 3作为刺激物时SR组(全身过敏组)嗜碱性粒细胞活化的结果。

具体实施方式

本发明目的是寻找评估桃过敏反应严重程度的体外检测指标及检测试剂。本发明的发明人在前期研究中发现Pru p 3蛋白是我国桃过敏的主要致敏蛋白。进一步地，经本发明研究证实，Pru p 3蛋白联合BAT可以预测桃过敏反应的严重程度。对桃有严重过敏反应的患者嗜碱性粒细胞受到桃主要致敏蛋白Pru p 3刺激后，其嗜碱性粒细胞活化比例将明显增加，释放大量血管活性介质，这也是导致严重过敏症状发生的原因。本发明通过采用桃主要致敏蛋白Pru p 3刺激嗜碱性粒细胞，通过检测嗜碱性粒细胞表面CD63表达水平，计算CD63阳性的嗜碱性粒细胞的百分比即嗜碱性粒细胞活化率，作为评估过敏反应严重程度的指标。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

实施例1

Pru p 3蛋白联合BAT预测桃过敏反应严重程度的方法：

采集受试者的肝素抗凝血，取50ul患者全血样本依次加入100ul刺激缓冲液、50ul相应的刺激物，混匀后，加入20ul荧光抗体试剂(抗CD63-FITC和抗CCR3-PE预混试剂)，轻柔混合，37℃水浴孵育15分钟。后加入2ml预热(18-28℃)的红细胞裂解液，轻柔混合，在18-28℃条件下避光孵育5-10分钟。离心力300g，离心5分钟，丢弃上清，重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集50000-100000个白细胞，在前向角散射(FCS)/侧向角散射(SSC)直方图上白细胞分成三群(淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)，在侧向角散射低值(SSC^low)区域找到全部嗜碱性粒细胞CCR3^pos群，收集嗜碱性粒细胞数量>300个。计算CD63阳性细胞在获得的嗜碱性粒细胞中的百分比，即为嗜碱性粒细胞活化率。本发明的发明人经大量实验确定以Pru p 3作为刺激物，通过测定的嗜碱性粒细胞活化率，即可预测桃过敏反应严重程度，当嗜碱性粒细胞活化率≧30％预测其进食桃易发生全身过敏反应；当嗜碱性粒细胞活化率<30％，且≧15％，则预测其进食桃易发生局部过敏反应(口腔黏膜变态反应综合征)；当嗜碱性粒细胞活化率<15％提示其无桃过敏反应。

实施例2

本实施例用于说明本发明的Pru p 3蛋白联合BAT预测桃过敏反应严重程度的方法与现有技术进行比较。

将桃过敏患者，根据其进食桃后出现过敏反应严重程度分为OAS组(局部过敏组，26例)和SR组(全身过敏组，30例)；其中，OAS组仅表现为唇、舌和咽等局部接触部位出现黏膜肿胀、瘙痒症状，SR组出现全身荨麻疹、呼吸困难、消化道症状包括恶心、腹痛腹泻，甚至血压下降、晕厥等症状。

采用的BAT变应原刺激物：桃总蛋白(提取方法如下)；纯化的桃主要致敏蛋白Prup 3蛋白(可购自美国Alpco公司)。每个反应体系中，以刺激缓冲液(含白介素-3)作为阴性对照，以抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体(anti-FCεRI，购自美国Alpco公司)作为阳性对照。

Pru p 3蛋白联合BAT预测桃过敏反应严重程度的检测，具体步骤如下：

(1)采集肝素抗凝血，混匀血样。在每个患者的样本管中加入100μl刺激缓冲液和50μl患者全血样本，同时多做几个平行样用于步骤(2)。

(2)每个患者的待测管中分别加入50μl相应的刺激物：刺激缓冲液(阴性对照)、anti-FCεRI(阳性对照)、桃变应原(采用的是桃总蛋白，浓度100ng/ml)、Pru p 3(工作浓度为25ng/ml)，轻柔混合。其中，桃变应原作为对比例。

(3)上述加有刺激物的管中分别加入20ul荧光抗体试剂(抗CD63-FITC和抗CCR3-PE预混试剂)轻柔混合，盖上管盖，37℃水浴孵育15分钟。

(4)每管中加入2ml预热(18-28℃)的红细胞裂解液，轻柔混合，在18-28℃条件下避光孵育5-10分钟。

(5)离心力300g，离心5分钟，丢弃上清。

(6)600-800μl PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测，收集到数据采用FloMax软件分析。

其中，桃总蛋白采用如下提取方法获得：

1.配置蛋白提取液：10mmol/L PBS(PH 7)中依次加入2％聚乙烯聚吡咯烷酮、2mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10mmol/L乙二基二硫代氨基甲酸酯。

2.取新鲜的桃皮，按4：1(wt/vol)加入上述蛋白提取液中，温度4℃持续搅拌30分钟。离心力15000g，温度4℃离心30分钟。

3.离心后的上清液经过0.2um滤膜过滤。

4.过滤后的桃蛋白变应原浸液采用PBS透析24h。

5.Bradford法检测其蛋白浓度为325μg/ml。

刺激缓冲液：含白介素-3，工作浓度为4.5ng/ml的PBS溶液；桃变应原(100ng/ml)：采用PBS溶液；Pru p 3(25ng/ml)：采用PBS溶液；

荧光抗体试剂：抗CD63-FITC和抗CCR3-PE预混试剂中抗CD63-FITC的浓度为0.5mg/ml，抗CCR3-PE的浓度为10ug/ml，溶液为PBS，PH 7.4；红细胞裂解液：NH₄CL139.6mmol/L，Tris 16.96mmol/L，PH7.2。

以OAS组为例，检测步骤如下：

①收集50000-100000个白细胞，在前向角散射(FCS)/侧向角散射(SSC)直方图上白细胞分成三群(淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)，如图1所示。

②设置门1(R1)，在侧向角散射低值(SSC^low)区域找到全部嗜碱性粒细胞CCR3^pos群，结果如图2所示，收集的嗜碱性粒细胞数量>300个。

③计算CD63阳性细胞(FITC高亮荧光；Q2)在R1设置中获得的嗜碱性粒细胞中的百分比，图3所示的是以Pru p 3作为刺激物时嗜碱性粒细胞活化率。

以SR组为例，步骤同上述①-③，如图4所示，为SR组以Pru p 3作为刺激物时嗜碱性粒细胞活化率。

采用ImmunoCAP方法(目前公认sIgE检测的金标准)对上述两组(OAS和SR组)患者桃及桃主要致敏蛋白Pru p 3sIgE水平进行检测(可采用Phadia,Thermo FisherScientific试剂进行)。sIgE≥0.35kUA/L为阳性。桃sIgE、Pru p 3sIgE分别指两组患者桃和Pru p 3sIgE检测水平，BAT-桃、BAT-Pru p 3分别指以桃总蛋白和Pru p 3作为刺激物时两组患者嗜碱性粒细胞活化率，结果见表1。表1中数据以中位数(范围)表示，P<0.05表示两组数据有统计学差异。结果显示，以Pru p 3作为刺激物进行BAT，SR组嗜碱性粒细胞活化率明显高于OAS组(P＝0.002)，而桃sIgE、Pru p 3sIgE和BAT-桃的检测结果在两组患者中无差别。表明上述四种检测方法中，仅Pru p 3联合BAT可区分OAS和SR患者。

表1Pru p 3联合BAT可区分桃过敏反应严重程度

以Pru p 3联合BAT预测桃过敏患者发生全身过敏反应的风险，其敏感度为96.7％，特异度92.3％，阳性预计值和阴性预计值分别为90.6％和96.0％，结果如表2所示。可见，Pru p 3蛋白联合BAT可作为预测桃过敏反应严重程度理想的体外检测指标，该检测中嗜碱性粒细胞活化率越高，提示其进食桃易发生严重过敏反应。BAT可以用不到0.1ml的外周血检测150-2000个嗜碱性粒细胞在变应原作用下的活化情况，因此临床检测所需标本量少。同时，BAT极为近似地在体外模拟了I型超敏反应的发病过程，是预测桃过敏反应严重程度安全有效的体外检测指标。

表2Pru p 3联合BAT在预测桃过敏反应严重程度中的价值

Claims (6)

1.Pru p 3蛋白用于制备预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒。

2.一种用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，其包括Pru p 3蛋白。

3.如权利要求2所述的用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，所述Pru p 3蛋白的工作浓度为10～50ng/ml，其缓冲液为PBS。

4.如权利要求2所述的用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，还包括刺激缓冲液、刺激质控、抗CD63-FITC和抗CCR3-PE的预混试剂、红细胞裂解液。

5.如权利要求4所述的用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，所述刺激缓冲液中含工作浓度为3～6ng/ml白介素-3；

所述刺激质控中含工作浓度为0.5～12.5μg/ml抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体，作为阳性对照；

所述抗CD63-FITC和抗CCR3-PE的预混试剂中抗CD63-FITC的浓度为0.1～1.0mg/ml，所述抗CCR3-PE的浓度为5～30μg/ml；

所述红细胞裂解液中含NH₄CL 100～150mmol/L，Tris 10～30mmol/L，pH7.0～7.4。

6.如权利要求5所述的用于预测桃过敏反应严重程度检测试剂盒，其特征在于，所述Pru p 3蛋白的工作浓度为25ng/ml，所述白介素-3的工作浓度为4.5ng/ml；

所述刺激质控中含工作浓度为2.5μg/ml的抗高亲和性IgE受体的单克隆抗体；

所述抗CD63-FITC的浓度为0.5mg/ml，所述抗CCR3-PE的浓度为10μg/ml；

所述NH₄CL为139.6mmol/L，所述Tris为16.96mmol/L，pH7.2。