CN113832223A - 高血压血清细胞外囊泡蛋白标志物及其应用 - Google Patents

高血压血清细胞外囊泡蛋白标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了细胞外囊泡，特别是血清细胞外囊泡中的SPARC作为高血压或高血压相关疾病的标志物的应用；本申请还提供了相应试剂盒、检测方法和检测系统。实验表明使用细胞外囊泡作为标志物诊断高血压或预测高血压及相关疾病风险有良好的敏感性和特异性，具备临床应用前景。

Description

高血压血清细胞外囊泡蛋白标志物及其应用
技术领域
本申请属于医学检测，特别是高血压检测领域。具体地，本申请提供了细胞外囊泡，特别是血清细胞外囊泡中的SPARC作为高血压或高血压相关疾病的标志物的应用；本申请还提供了相应试剂盒、检测方法和检测系统。
背景技术
高血压是心血管疾病的主要危险因素，也是中国人死亡的首要原因【1】。一项全国性调查显示，我国18岁以上人群约2.4亿患有高血压【2】。目前我国高血压可调节的危险因素研究仍旧缺乏，但可以肯定的是改善高血压及相关疾病症状会极大的减少致残致死率。
血压(BP)控制机制，例如心输出量、外周血管阻力和循环血容量，会导致多种高血压表型。每种机制都可能在不同程度上增加高血压患者的血压，为每个患者选择最合适的治疗方法是很重要的。高血压发病机制涉及肾素-血管紧张素-醛固酮系统【3】，血管平滑肌【4】和血管内皮功能障碍【5】，以及受损的血小板功能【6】和抗利尿激素【3】等相关因素。但是，对大多数情况下，对高血压病发病机制仍无法清楚描述。例如，内皮功能障碍，这不仅是高血压的使动因素，而且导致高血压进一步恶化【7】。因此，探索价格适宜、微创或非侵入性诊断工具来辅助血压监测，评估高血压进展阶段，并建立高血压的早期评价指标，例如内皮细胞或平滑肌损伤的初始阶段，有很重要的临床意义，这将这有助于临床医生对心血管疾病的精准诊疗。血液是最常用的临床液体活检样本来源，监测血清或血浆的蛋白组分也成为现在评价疾病易感性、是否患病以及疾病进程重要手段。已经有很多血清/血浆蛋白作为疾病的标志物在临床诊断中广泛检测。目前，通过血清进行高血压和对照人群的比较血液样本研究及生物标志物鉴定已经有一些报道，例如，流行病学数据表明，血浆脂联素水平是肥胖相关高血压发展的生物标志物和可能的介质【8】。
细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是高血压潜在的生物标志物来源。EV是几乎所有细胞都可以分泌的且存在于各种体液中的纳米级小囊泡【9】。由于EV携带蛋白质、RNA和脂质，因此它们还被称为效应器和细胞间沟通的桥梁。EV的内容物还可以反映母细胞的状态。分泌细胞对EVs的内容物具有靶向精密调节和高度选择性，在不同病理生理状态下，细胞分泌出包含有特定内容物的EVs至细胞外环境(血液、尿液、唾液、前列腺液、羊水和胸腔积液等)中【10】，以旁分泌的方式作用于周围的细胞或通过体液进行系统分布【11】。因此，EVs可以作为新的生物标志物来源以优化临床相关的高血压的精准诊断，确定早期终末器官损伤，并确定高血压的新机制，从而指导和优化高血压临床治疗。高血压分子标志物目前已经报道的主要是来源于高血压患者液态活检样品(包括尿液，血液，唾液)的蛋白、代谢性小分子、miRNA等标志物，与这些标志物相比，使用EVs内容物作为诊断生物标志物有明显的优势：(1)EVs含有组织、细胞或疾病特异性的蛋白质和核酸；(2)脂质双层为细胞外囊泡内的RNA、DNA和蛋白质提供保护，使其免受细胞外环境中的核酸酶和蛋白酶的影响；(3)EVs的相对硬度使其有可能使用广泛的方法从一系列体液(即血浆、血清、尿液、唾液、精液、乳汁、水液和脑脊液)中分离和富集。EV的这些优势使其作为生物标志物的来源更有突出的优点和前景。至从2016年1月21日第一家细胞外囊泡诊断公司(Exosome Diagnostics,Inc.)成立并且推出了以ExoDxTMLung(ALK)为代表的诊断试剂盒用于临床诊断以来，国际上和国内多家以细胞外囊泡为基础的诊断公司相继成立，致力于细胞外囊泡的疾病生物标志物的研究和相关产品的研发。
SPARC也被称为BM-40或者骨连接蛋白，是一种32KD的细胞糖蛋白，主要通过调节细胞粘附、增殖和基质沉积来调节细胞与细胞外基质的相互作用【12】。SPARC在形态发生和重塑与修复的组织中高度表达【13】。而血小板生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子的活性受SPARC的负向调节【14】。在冠状动脉疾病患者中，脂肪组织及血浆中SPARC表达升高。SPARC还介导了与糖尿病和肥胖相关的病理机制。例如，在糖尿病肾病的啮齿动物模型【15】及糖尿病合并纤维化性肾损伤患者【16】的肾活检结果显示SPARC表达明显升高；另外，研究人员在人脂肪组织中检测了SPARC水平发现，其表达在皮下脂肪中占主导地位且SPARC的表达还受到脂肪含量、瘦素、血糖以及胰岛素水平的影响【17】。肥胖人群SPARCmRNA表达高于非肥胖人群,同时SPARC还能通过Wnt/连环蛋白信号途径抑制脂肪形成【18】。SPARC的临床相关研究主要集中于糖尿病及其并发症，原发性高血压中SPARC的相关研究很有限，仅有的几篇基础研究表明在血管紧张素II诱导的高血压对肾脏的损害在SPARC敲除小鼠中得到了改善【19】；SPARC表达的增加还有助于压力超负荷心脏中胶原蛋白的合成后处理并增加舒张期硬度【20】。而细胞外囊泡中的SPARC水平与系统性高血压相关性的临床研究尚未见报道。
发明内容
为了进一步研究SPARC水平与系统性高血压相关性，我们用了Luminex定量检测手段，通过比较高血压患者和非高血压患者的血清EV蛋白差异，鉴定到了血清细胞外囊泡蛋白酸性富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)在高血压患者的血清细胞外囊泡表达增加，并且与非高血压对照相比，含量变化有显著统计学差异。
一方面，本申请提供了检测细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂在制备诊断高血压或预测高血压及相关疾病风险的试剂盒中的应用。
进一步地，所述检测细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂包括细胞外囊泡提取试剂。
进一步地，所述检测细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂包括测量细胞外囊泡中的SPARC含量或测量细胞外囊泡中SPARCmRNA水平的试剂。
进一步地，所述测量细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂为Luminex试剂、ELISA试剂、质谱用试剂、流式细胞术试剂或western blot试剂；优选
Figure BDA0003277702230000031
检测法试剂。
另一方面，本申请提供了细胞外囊泡中的SPARC作为高血压或高血压及相关疾病风险的标志物的应用。
另一方面，本申请提供了一种诊断高血压或预测高血压及相关疾病风险的非诊断方法，其特征在于，所述方法包括检测细胞外囊泡中的SPARC含量的步骤。
进一步地，所述检测细胞外囊泡中的SPARC含量的步骤包括细胞外囊泡提取步骤，以及测量血清细胞外囊泡中的SPARC含量或测量细胞外囊泡中SPARCmRNA水平的步骤。
进一步地，所述检测细胞外囊泡中的SPARC含量使用
Figure BDA0003277702230000032
法、ELISA、质谱、流式细胞术或western blot；优选
Figure BDA0003277702230000033
法。
进一步地，所述方法中细胞外囊泡中的SPARC含量高于19.428ng/mL时，认为样本主体有高血压或患高血压及相关疾病风险高。
进一步地，所述细胞外囊泡为血清中的细胞外囊泡。
进一步地，所述高血压为原发高血压。
进一步地，所述高血压相关疾病包括糖尿病、肥胖、心血管病、脑出血。
另一方面，本申请提供了执行上述方法的系统，所述系统包括ELISA检测仪器、Luminex液相芯片蛋白分析平台仪器、流式细胞仪、质谱仪或western blot检测设备。
本申请中的血清细胞外囊泡提取试剂可以为本领域中已知的或研究中的血清细胞外囊泡提取方法中所用的试剂，包括但不限于超速离心、密度梯度离心、沉淀、分子排阻、微流控、免疫吸附等方法，这些方法及其中可用的试剂本领域技术人员公知或可以参考已知的教科书或者文献确定。
本申请中的测量血清细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂可以为本领域中已知或研究中的测量血清细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂，包括但不限于
Figure BDA0003277702230000041
试剂、ELISA试剂、质谱用试剂、流式细胞术试剂、western blot试剂等，这些方法及其中可用的试剂本领域技术人员公知或可以参考已知的教科书或者文献确定。
本申请中测量细胞外囊泡中SPARCmRNA水平的试剂可以为本领域中已知或研究中的测量细胞外囊泡中SPARCmRNA水平的试剂，包括但不限于基于PCR的方法如各种定量PCR，基于探针杂交的方法如FISH、northern blot等，这些方法及其中可用的试剂本领域技术人员公知或可以参考已知的教科书或者文献确定。
本申请中试剂和方法可用于人类样本，灵长类或其他哺乳动物样本经过适当的调整也可以使用。样本优选为血清，也可以使用血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、水液、汗液和脑脊液等含有细胞外囊泡的样本，相应的细胞外囊泡提取方法本领域技术人员公知或可以参考已知的教科书或者文献确定
本申请中SPARC、Secreted protein acidic and rich in cysteine、BM-40和骨连接蛋白可以交换使用，表达相同的意思；其具体氨基酸序列可能随着样本来源、突变等原因有所区别，但均在本申请保护范围之内。
本申请中的高血压，包括但不限于各种原发和继发高血压，如遗传导致的、精神因素导致的、生活习惯导致的、药物导致的、其他疾病导致的高血压，优选原发高血压。高血压诊断根据不同诊断标准可能有所变化，不局限于本申请实施例中采用的ESC和ESH的2018版本标准。
本申请中的高血压相关疾病，是指现有知识中或者研究中的与高血压有关联的疾病，包括但不限于肥胖、脑出血、头痛、心血管病如冠心病、心绞痛、房颤、动脉硬化、眼底出血和下肢动脉硬化等疾病。
本申请的方法可用于诊断或非诊断用途，非诊断用途包括临床实验中样本的分析和选择、科研用途、宏观人口健康状况检测等。
执行本申请检测方法的系统本领域技术人员可以通过本领域常规知识构建，包含组件包括但不限于各步骤所用的仪器，如离心机、荧光检测仪器、PCR仪器、数据分析用仪器等。
有益效果：
1.发明的生物标志物用来提高诊断或辅助诊断原发性高血压的敏感度和特异性，并针对个体原发性高血压进行下一步诊断或治疗。
2.本发明的生物标志物用来检测疾病治疗的有效性。该生物标志物可以协助检测治疗方案例如血管紧张素转化酶抑制和血管紧张素II受体抑制剂等在治疗高血压以及高血压相关疾病的有效性。
3.本发明的生物标志物，血清细胞外囊泡SPARC，用来检测高血压相关疾病的疾病进程。
4.本发明的生物标志物，血清细胞外囊泡SPARC为患有或疑似有高血压的个体提供疾病分级、筛选、监测或为治疗方案提供依据。
5.本发明的生物标志物的目标的是判断高血压及其相关疾病患病风险。这个发明提供了用血清细胞外囊泡SPARC的含量来鉴定患者是否有罹患高血压及其相关疾病的风险；同时这项发明也建立了一套系统的检测患者的程序。例如，拥有较高水平的血清细胞外囊泡SPARC(例如1mL血清提取的血清细胞外囊泡中SPARC高于248ng)的受试者，将需要更加频繁地接收临床高血压检测或血液检测。这个程序的具体地实施将依据受试个体地年龄，性别，健康程度，体重，尤其是细胞外囊泡SPARC蛋白指标的不同而有所变化。在一些实施方案中，推荐的SPARC的检测程序不是必须基于此发明所涉及的高低值，这些检测值可以根据生物样本的来源以及其他检测方式的不同分成不同的水平。
6.对于高血压临床诊断，血清细胞外囊泡SPARC蛋白含量联合临床血压检测能够更加准确高血压的患病风险及程度。即本发明提供了方法、试剂盒、设备和系统，用于将测试高血压标记物的结果与收缩压及舒张压关联。而收缩压和舒张压是目前判断高血压的关键指标。
7.血清细胞外囊泡SPARC蛋白变化符合度越高，则罹患高血压的风险越大。测试的灵敏度的和特异性可进一步通过结合身体体征血压和相关临床状况(例如，中风、衰老、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、血脂指标和冠心病)的结果与基于血清细胞外囊泡检测表达水平来决定。当这些信息提示存在高血压的可能性增加时，1mL患者血液样本即可提示该患者可能有高血压病史自己不清楚或新发现高血压或有；有罹患高血压风险。
8.将结果加以组合，增加了高血压的进一步诊断的准确定。即，将血压监测与生物标记物组合更加准确地发现患者病理状态并区分出高血压。例如血清细胞外囊泡SPARC在无高血压人群及高血压人群中的增加指示高血压状态，但如果在肥胖人群及高血压人群就可以增大高血压诊断的特异性。
附图说明
图1为本申请基本实验流程图；
图2为血清细胞外囊泡提取的方法流程图；
图3为典型血清细胞外囊泡的鉴定图；
图4为血清细胞外囊泡SPARC诊断高血压的ROC曲线分析图。
具体实施方式
实施例1实验样本来源和基本实验方法
血清来源及收集：
所有研究对象在入组前都酌情给予书面知情同意。该方案得到了北京安贞医院医学伦理委员会的批准(No.20175)，并遵守了《赫尔辛基宣言》。中国临床实验注册号ChiCTR-ROC-17011027。所有研究对象来源于北京安贞医院高血压科及耳鼻喉头颈外科。为了减少样品的混杂性和减少其他疾病对实验数据的干扰，本研究严格排除继发性高血压、妊娠、肿瘤、精神神经异常等疾。另外，我们收集了包括临床/生化因素在内的研究对象特征数据。人口统计学数据、风险因素和实验室参数都是从临床记录中获得的。具体要求如下：
1.1原发性高血压患者入组要求原发性高血压(EH)诊断标准采用2018年欧洲心脏病学会(European Society of Cardiology，ESC)和欧洲高血压学会(European Societyof Hypertension，ESH)联合发布2018年高血压管理指南的标准，指出高血压诊断标准为：在未使用降压药物的情况下，收缩压(SBP)≥140mmHg和(或)舒张压(DBP)≥90mmHg。排除继发性高血压、心肌梗死、冠心病、脑卒中、肾脏疾病、药物成瘾或者其他严重的疾病后，最后确定原发性高血压。所有健康对照者均无原发性高血压家族史。所有程序均按照当地医院伦理审查委员会批准的方案进行，并从所有参与者获得知情同意书。高血压组79人。
对照组要求研究对象无肿瘤，无高血压患者，非高血压组42人。
人体测量：
人体测量测定和抽血都是在一天内进行的。身高和体重的测量是在参与者穿着轻薄的室内服装和赤脚的情况下进行的，使用的是经过校准的便携式电子称和便携式不灵活的身高测量杆。血压是在坐位休息5分钟后测量的，在右上臂至少测定三次，分析中使用平均值。身体质量指数(BMI)采用标准BMI公式计算：身体质量(公斤)除以身高的平方(平方米)。不吸烟者是指从未吸烟或在加入本研究前≥1年内停止吸烟的患者。所有剩下的受试者都被归类为吸烟者。饮酒者被定义为每日酒精摄入量≥每周三次。参与者被要求在前一天晚上21:00以后不要进食。用血清收集管从每个参与者身上抽取隔夜空腹血样。然后在4℃下以3,000g离心10分钟。随后，血清样本在收集后2小时内储存在-80℃的冷冻室中。在进行化验前，样品在4℃下解冻。血糖(Glucose)、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)，总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TG)的水平是在北京安贞医院的实验室里用标准的酶法测量的(Biotecnica Instruments,Italy)。
表1.患者基础临床信息。
Figure BDA0003277702230000071
Figure BDA0003277702230000081
血清细胞外囊泡提取：
EVs的分离遵循国际细胞外囊泡协会的规范，采用分步离心法(如图2所示)，具体如下。取晨血血清2mL，用PBS等量稀释，先清洗细胞，在4℃下4,000×g离心30分钟后，去除细胞碎片和聚集物并留取上清；在Beckman(USA)超速离心机110,000×g,4℃下离心70分钟，随后将EVs颗粒重新悬浮在1.5mL无菌PBS中(0.22μm滤器过滤后)，再次110,000×g,4℃离心70分钟，沉淀就是纯化的血清细胞外囊泡，随后，弃去上清液将血清细胞外囊泡冻存于-80℃冰箱。
电镜下细胞外囊泡验证：
血清细胞外囊泡经过超速离心后，进行大小和形态测定，首先利用负染技术将细胞外囊泡染色，在80千伏的加速电压下，由透射电子显微镜捕获细胞外囊泡大小和形状(Hitachi H-7650,Tokyo,Japan)。
测量血清细胞外囊泡SPARC水平：
磁性
Figure BDA0003277702230000082
检测法是一种基于磁珠的抗体微阵列，建立在夹心免疫测定原理之上，可用于评估单个样品中的生物标志物水平。根据说明，所有血清样本都用无菌PBS以1:2的稀释度进行检测。在96孔板中加入50微升/孔的标准品，稀释的微粒子混合物再加入每孔；随后，将板子放在振荡器上于室温下800转孵育2小时；用100微升/孔的洗涤缓冲液洗去每孔的液体，共计三次；每孔添加50微升稀释的生物素-抗体混合物并盖住，在振荡器上于室温下800转孵育1小时；用100微升/孔的洗涤缓冲液洗去每孔的液体，共计三次；之后，每孔添加50微升稀释的链霉菌素-赤藓红素结合物并盖住，在振荡器上于室温下800转孵育30分钟；用100微升/孔的洗涤缓冲液洗去每孔的液体，共计三次；每孔添加100微升的洗涤缓冲液洗并在振荡器上于室温下800转孵育2分钟；最后，用基于Luminex的多重检测板(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)用过Bio-Plex分析仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)测量和分析血清细胞外囊泡SPARC水平，检测内和检测间的变异系数分别小于5％和10％。
统计学分析：
统计分析由统计软件包(SPSS)25.0版(IBM公司，Armonk，NY)进行。连续变量用平均值±标准差或中位数(四分位数范围)表示，分类变量用数字(百分比)表示。在这些分析中，对偏态分布的变量进行了对数正态转换。两组之间的基线特征用非参数的曼-惠特尼U检验、独立t检验或卡方检验进行比较。简单和多元线性回归分析被用来研究血清细胞外囊泡SPARC水平和其他参数值之间的关联。通过多变量逻辑回归分析确定血清细胞外囊泡SPARC水平与高血压之间的关联。多变量调整后的OR与95％的置信区间(CI)一起呈现。血清细胞外囊泡SPARC的差异表达以小提琴图的形式呈现，在Graphpad prism 9.0.0版中生成。P<0.05(双尾)表示统计学意义。
实施例2实验结果和分析
血清细胞外囊泡的分离纯化：
通过超速离心和过滤的方法纯化了高血压组血清细胞外囊泡。通过电镜观察人血清细胞外囊泡的大小和形状，发现细胞外囊泡为圆形，大部分直径小于100nm(图3)。
研究对象中血清细胞外囊泡SPARC水平和其他临床特征：
将已检测的总人群血清细胞外囊泡SPARC水平进行二分位分箱，将人群分为大于248,ng/mL(N＝60)及小于248,ng/mL(N＝61)。我们发现年龄、BMI、收缩压、舒张压及有无高血压在组间有明显差异(表1)。
血清细胞外囊泡SPARC水平与人体测量值、生物化学和临床参数的关系：
我们使用Spearman's rho相关分析研究了总体研究对象血清细胞外囊泡SPARC水平与临床和生化变量的相关性。结果显示，当全部研究对象一起分析时，血清细胞外囊泡SPARC水平与年龄(r＝-0.474，p<0.001)、血糖(r＝-0.207，p＝0.023)、超敏C-反应蛋白(r＝-0.179，p＝0.049)、BMI(r＝0.239，p＝0.008)及舒张压(r＝0.189，p＝0.038)具有相关性。此外，在高血压组中，血清细胞外囊泡SPARC水平与年龄(r＝-0.479，p<0.001)、血糖(r＝-0.273，p＝0.015)、BMI(r＝0.307，p＝0.006)及舒张压(r＝0.225，p＝0.036)呈现相关性。然而，在非高血压组中，细胞外囊泡SPARC水平仅与年龄之间有相关性(r＝-0.390，p＝0.011)(表2)。我们进一步使用Spearman's rho相关分析研究了高血压研究对象血清细胞外囊泡SPARC水平与临床和生化变量的相关性。结果显示，在接受治疗的高血压患者中血清细胞外囊泡SPARC水平与年龄(r＝-0.573，p<0.001)、血糖(r＝-0.285，p＝0.049)及BMI(r＝0.357，p＝0.013)具有相关性。此外，在新诊断高血压患者中，血清细胞外囊泡SPARC水平仅与年龄(r＝-0.479，p<0.001)相关(表3)。这部分结果显示SPARC主要与高血压人群中的舒张压升高相关，提示SPARC作为细胞外基质成分，或主要影响血管的舒张压。
表2.研究对象中与血清细胞外囊泡SPARC相关的变量的相关性分析。
Figure BDA0003277702230000101
Figure BDA0003277702230000111
表3.高血压研究对象中与血清细胞外囊泡SPARC相关的变量的相关性分析。
Figure BDA0003277702230000112
Figure BDA0003277702230000121
研究对象中血清细胞外囊泡SPARC水平与有无高血压有关的多元逻辑回归(Logisticregression)：
我们构建了包含协变量的多变量逻辑回归模型，进一步评估血清细胞外囊泡SPARC与高血压的关联。单变量分析表明(表4)，血清细胞外囊泡SPARC水平与高血压相关(OR(95％CI):1.088(1.039-1.138),P＝0.001)。调整了常规的高血压危险因素，包括年龄、性别、吸烟、饮酒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C-反应蛋白后，血清细胞外囊泡SPARC水平的增加显示出更高的OR值(OR(95％CI):1.105(1.046-1.200),P＝0.001)。随后我们将全部研究对象分为肥胖组和非肥胖组(表4)，在非肥胖组中单变量分析表明，血清细胞外囊泡SPARC水平与高血压相关(OR(95％CI):1.075(1.012-1.142),P＝0.019)，调整完年龄、性别、吸烟、饮酒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C-反应蛋白后发现，OR值有所增加(OR(95％CI):1.091(1.002-1.188),P＝0.046)；在肥胖组中单变量分析表明，血清细胞外囊泡SPARC水平与高血压相关(OR(95％CI):1.114(1.041-1.191),P＝0.002)，调整完年龄、性别、吸烟、饮酒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C-反应蛋白后发现，OR值有所增加(OR(95％CI):1.186(1.064-1.322),P＝0.002)。之后，我们将全部研究对象分为年轻组和非年老组(表5)，在年轻组中单变量分析表明，血清细胞外囊泡SPARC水平与高血压相关(OR(95％CI):1.056(1.005-1.110),P＝0.030)，调整完年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C-反应蛋白后发现，OR值有所增加(OR(95％CI):1.112(1.033-1.128),P＝0.021)；在老年组中单变量分析表明，血清细胞外囊泡SPARC水平与高血压相关(OR(95％CI):1.199(1.081-1.330),P＝0.001)，调整完年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C-反应蛋白后发现，OR值有所增加(OR(95％CI):1.361(1.145-1.698),P<0.001)。将全部研究对象分为高hs-CRP组和低hs-CRP组(表6)，在低hs-CRP组中单变量分析表明，血清细胞外囊泡SPARC水平与高血压相关(OR(95％CI):1.099(1.025-1.179),P＝0.008)，调整完年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、甘油三酯。后发现，OR值有所增加(OR(95％CI):1.112(1.033-1.198),P＝0.005)；在高hs-CRP组中单变量分析表明，血清细胞外囊泡SPARC水平与高血压相关(OR(95％CI):1.087(1.013-1.153),P＝0.018)，调整完年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、甘油三酯。后发现，OR值有所增加(OR(95％CI):1.147(1.045-1.198),P＝0.004)。基于上述统计学分析，血清细胞外囊泡SPARC水平的升高是高血压的独立危险因素。
表4.血清细胞外囊泡SPARC与全部研究对象中肥胖与高血压的关系。
Figure BDA0003277702230000131
模型1包括：年龄、性别、吸烟、饮酒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C-反应蛋白。肥胖:BMI>30kg/m2。
表5.血清细胞外囊泡SPARC与全部研究对象中年龄与高血压的关系。
Figure BDA0003277702230000132
Figure BDA0003277702230000141
模型1:年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C-反应蛋白。
年老>60岁。
表6.血清细胞外囊泡SPARC与全部研究对象中低或高hs-CRP与高血压的关系。
Figure BDA0003277702230000142
模型1：年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、甘油三酯。
ROC曲线评估血清细胞外囊泡SPARC诊断高血压效能：
ROC曲线如图4所示，血清细胞外囊泡SPARC ROC曲线下面积为0.854(95％置信区间：0.782-0.927，p<0.001)，找到约登指数最大的点作为临界值(约登指数＝灵敏度与特异度之和减去1)。血清细胞外囊泡SPARC浓度高于19.428ng/mL时诊断高血压的敏感性和特异性分别为95.06％和62.50％；阳性预测值为83.70％，阴性预测值86.21％，因此本因子灵敏度极高提示了漏诊率低，但特异度相对低提示存在少部分假阳性结果，因此对于原发性高血压的诊断提供了很大的帮助。血清细胞外囊泡中SPARC作为高血压生物标志物有良好的临床应用前景。
表7.血清细胞外囊泡SPARC预测高血压的ROC曲线敏感独、特异度及阳性预测值、阴性预测值
Figure BDA0003277702230000151
显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
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Claims (13)

1.检测细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂在制备诊断高血压或预测高血压及相关疾病风险的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述检测细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂包括细胞外囊泡提取试剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述检测细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂包括测量细胞外囊泡中的SPARC含量或测量细胞外囊泡中SPARCmRNA水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述测量细胞外囊泡中的SPARC含量的试剂为
Figure FDA0003277702220000011
检测法试剂、ELISA试剂、质谱用试剂、流式细胞术试剂或western blot试剂；优选
Figure FDA0003277702220000012
检测法试剂。
5.细胞外囊泡中的SPARC作为高血压或高血压相关疾病的标志物的应用。
6.诊断高血压或预测高血压及相关疾病风险的非诊断方法，其特征在于，所述方法包括检测细胞外囊泡中的SPARC含量的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述检测细胞外囊泡中的SPARC含量的步骤包括细胞外囊泡提取步骤，以及测量血清细胞外囊泡中的SPARC含量或测量细胞外囊泡中SPARCmRNA水平的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述测量细胞外囊泡中的SPARC含量的步骤中使用
Figure FDA0003277702220000013
法、ELISA、质谱、流式细胞术或western blot；优选
Figure FDA0003277702220000014
法。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其中所述方法中细胞外囊泡中的SPARC含量高于19.428ng/mL时，认为样本主体有高血压或患高血压及相关疾病风险高。
10.根据权利要求1-9任一项所述的应用或方法，其中所述细胞外囊泡为血清中的细胞外囊泡。
11.根据权利要求1-10任一项所述的应用或方法，其中所述高血压为原发高血压。
12.根据权利要求1-11任一项所述的应用或方法，其中相关疾病包括糖尿病、肥胖、心血管病、脑出血。
13.执行根据权利要求6-12任一项所述方法的系统，其特征在于，所述系统包括ELISA检测仪器、Luminex液相芯片蛋白分析平台仪器、流式细胞仪、质谱仪或western blot检测设备。
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