KR20080063326A - 아토피성 피부염 마커와 그의 이용기술 - Google Patents

아토피성 피부염 마커와 그의 이용기술 Download PDF

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사토시 미야타
가오루 미야자키
치에 야스다
아키히로 이와마쯔
젠로 이케자와
미치코 아이하라
가야노 모리야마
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가부시키가이샤환케루
고리츠다이가쿠호진 요코하마시리츠다이가쿠
기린 홀딩스 가부시키가이샤
자이단호우진 기하라키넨 요코하마세이메이카가쿠 신코우자이단
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Abstract

본 발명은 아토피성 피부염의 질환 마커가 될 수 있는 물질을 탐색하는 것을 목적으로 하여, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 아토피성 피부염을 판정하는 방법으로서, 상기 특정 단백질은 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하거나, 또는 아토피성 피부염 소인(素因)의 정도에 따라 발현이 변화하는 것인 상기 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따르면, 아토피성 피부염의 염증도 또는 아토피성 피부염 발증의 위험도를 판정하기 위한 키트 및 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 효과가 있는 물질을 동정(同定)하는 방법도 제공된다.

Description

아토피성 피부염 마커와 그의 이용기술{Atopic dermatitis marker and technique of using the same}
본 발명은 아토피성 피부염 마커와 그의 이용기술에 관한 것이다.
아토피성 피부염은 유전적 요인이나 환경요인 등 다양한 요인에 의해 발증하여, 그 메커니즘은 명확하지 않다. 현재 아토피성 피부염은 전적으로 육안적 소견으로 진단되고 있어, 임상의에 의한 주관이 개입되므로 객관성이 부족하다. 특히 아토피성 피부염 중에서도 치료법을 결정하는 피진(皮疹)의 중증도를 판단하는 것은 어려운 과제로 되어 있다. 또한, 사회 일반적으로도 아토피성 피부염 치료의 큰 기둥인 스테로이드 외용제의 기피 풍조가 강해지고 있기 때문에, 적절한 치료 및 약에 대한 적절한 양도 요망되고 있다. 병상의 악화, 개선의 지표 또한 치료효과의 표현으로서 아토피성 피부염의 중증도를 분류할 수 있는 아토피성 피부염 마커를 탐색한다는 것은 중요한 과제이다.
현재, 아토피성 피부염 마커로서는 IgE가 사용되고 있다. 그러나, IgE의 항체가의 상승을 나타내는 질환은 아토피성 피부염 이외에도 기관지천식, 간경변 등에서도 보여져, IgE의 항체값이 높은 값이어도 반드시 아토피성 피부염과는 결부되지 않는 경우가 있다. 최근 새로운 지견(知見)으로는 SCCA1이 아토피성 피부염 환 자의 피부나 혈중에서 발현이 높아지고 있는 점으로부터 새로운 바이오마커로서의 가능성이 시사되고 있다(비특허문헌 1). 또한, NGF, Substance P, IL-16 등도 아토피성 피부염 환자의 혈청 중 마커로서 유용하다는 보고가 있다(비특허문헌 2 및 3). 또한, 아토피성 피부염의 염증부와 비염증부의 피부를 사용하여 아토피성 피부염의 바이오마커를 망라적으로 조사하는 방법이 행해지고 있다. 예를 들면 DNA 마이크로 어레이를 사용한 유전자 발현의 해석을 토대로 하여 아토피성 피부염 관련 유전자를 동정(同定)하고, 질환 마커로서 특허신청이 되어 있다(특허문헌 1 및 2). 별도로, 아토피성 피부염 환자의 피부조직으로부터 얻은 표피 각화세포나 섬유아세포를 배양 후에 세포로부터 단백질을 추출하고, 2차원 전기영동에 의해 분리 후, 질량분석장치로 아토피성 피부염 마커를 동정한 보고가 있다(비특허문헌 4 및 5).
그러나, 지금까지 아토피성 피부염 모델 마우스의 피부조직 중 단백질을 사용하여 프로테옴 해석을 행한 예는 없다. 또한, 인간에서 아토피성 피부염에 관해 실시된 프로테옴 해석은, 피부로부터 세포를 채취하여 초대 배양 후에 프로테옴 해석을 행하고 있어, 인간의 아토피성 피부염의 상태를 직접 반영하고 있다고는 말하기 어렵다.
특허문헌 1: 일본국 특허공개 제2005-110602호 공보
특허문헌 2: 국제공개 제WO01-065259호 팸플릿
비특허문헌 1: Clin. Exp. Allergy 2005; 35: 1327-1333
비특허문헌 2: Br. J. Dermatol. 2002 Jul; 147(1): 71-79
비특허문헌 3: Br. J. Dermatol. 2006 Jun; 154(6): 1112-1117
비특허문헌 4: Proteomics 2004, 4, 3446-3455
비특허문헌 5: Proteomics 2006, 6, 1362-1370
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
아토피성 피부염의 객관적인 마커로서 진단 및 치료에 유용한 것을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 아토피성 피부염 마커를 이용하여 아토피성 피부염의 예방 또는 치료에 유용한 성분을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 아토피성 피부염 모델 마우스(NC/Nga 마우스) 합텐을 도포하여, 인위적으로 아토피성 피부염을 발생시켰다. 동시에, 아토피성 피부염을 억제하는 것이 알려져 있는 락토페린 처리를 행하여 염증을 억제하였다. 이때의 피부조직을 사용하여, 아토피성 피부염의 발증에 따라 변동하는 단백질을 조사하였다. 분석방법으로서, 2차원 전기영동(2-DE)과 질량분석(MS)을 사용하는 프로테옴 해석을 행하고, 동정된 단백질에 대해서는 추가로 면역블로팅으로 그 변화를 확인하였다.
그 결과, 아토피성 피부염의 발증에 수반하여 발현이 증가하는 단백질로서는 FA BP-5, 아포리포프로테인 A1(Apolipoprotein A1), 비멘틴(Vimentin), Rho GDI 등이 동정되었다. 한편, 아토피성 피부염의 발증에 수반하여 발현이 감소하는 단백질로서는 갈렉틴(Galectin)-1, -3, -4, -7, -8 등의 갈렉틴류, 세포골격계 단백질인 데스민(Desmin), 모에신(Moesin), 에즈린(Ezrin), 라딕신(Radixin), 또한 아넥신 II(Annexin II), 에놀라아제 1(Enolase 1), FABP-4, PARK7, HSP70, HSP90 등이 동정되었다. 이들 단백질의 대부분은 합텐 처리에 더해서 락톤페린 처리하면 역변동을 나타내, 아토피성 피부염 발증의 유무와 발현의 증감이 밀접하게 상관하는 것이 명확해졌다.
또한, 전술과 같이 하여 발견한 아토피성 피부염 마커와 인간의 아토피성 피부염의 염증도와의 상관을 조사하기 위해, 아토피성 피부염 발증자 및 건강한 정상인 자원봉사자로부터, 비침습적으로 안전하고 간편하게 각질층(角層) 채취가 가능한 각질층 체커를 사용하여 각질층을 채취하고, 그로부터 단백질을 추출하여 아토피성 피부염 마커의 발현을 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 조사하였다. 그 결과, 아토피성 피부염의 염증도 증가에 수반하여 혈청알부민(Serum albumin), 면역글로불린 G(Immunoglobulin G), 아넥신 II, 아포리포프로테인 A1, FABP-5, 에놀라아제 1, 갈렉틴-7의 발현이 증가하는 것이 명확해졌다. 한편, 아토피성 피부염의 염증도 증가에 수반하여 발현이 감소하는 단백질로서 아르기나아제 I(Arginase I), 우라실-DNA 글리코실라아제(Uracil-DNA glycosylase)가 동정되었다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
1. 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 하기 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 아토피성 피부염을 판정하는 방법으로서, 상기 특정 단백질은 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 것인 상기 방법.
특정 단백질은 다음의 23종류이다.
(1) 갈렉틴-1(Galectin-1), 갈렉틴-3(Galectin-3), 갈렉틴-4(Galectin-4), 갈렉틴-7(Galectin-7), 갈렉틴-8(Galectin-8)로 이루어진 갈렉틴군으로부터 선택되는 단백질,
(2) HSP70, HSP90으로 이루어진 HSP군으로부터 선택되는 단백질,
(3) 비멘틴(Vimentin), Rho GDI, 데스민(Desmin), 모에신(Moesin), 에즈린(Ezrin), 라딕신(Radixin)으로 이루어진 세포골격계 단백질군으로부터 선택되는 단백질,
(4) FABP-4, FABP-5로 이루어진 FABP군으로부터 선택되는 단백질,
(5) 그 외 혈청알부민(Serum albumin), 면역글로불린 G(Immunoglobulin G), 아넥신 II(Annexin II), 아포리포프로테인 A1(Apolipoprotein A1), 에놀라아제 1(Enolase 1), PARK7, 아르기나아제 I(Arginase I), 우라실 DNA 글리코실라아제(Uracil DNA glycosylase).
2. 피부세포 및/또는 피부조직이 각질층 체커에 의해 채취된 피부의 각질층인 1. 기재의 방법.
3. 특정 단백질의 발현을 단백질 레벨에서 측정하는 1. 기재의 방법.
4. 특정 단백질의 유전자 발현을 RNA 레벨에서 측정하는 1. 기재의 방법.
5. 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 하기 특정 단백질로서, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 상기 특정 단백질의 발현을 측정할 수 있는 시약을 포함하는, 아토피성 피부염을 판정하기 위한 키트.
특정 단백질은 다음의 23종류이다.
(1) 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8로 이루어진 갈렉틴군으로부터 선택되는 단백질,
(2) HSP70, HSP90으로 이루어진 HSP군으로부터 선택되는 단백질,
(3) 비멘틴, Rho GDI, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신으로 이루어진 세포골격계 단백질군으로부터 선택되는 단백질,
(4) FABP-4, FABP-5로 이루어진 FABP군으로부터 선택되는 단백질,
(5) 그 외 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아넥신 II, 아포리포프로테인 A1, 에놀라아제 1, PARK7, 아르기나아제 I, 우라실 DNA 글리코실라아제.
6. 피부세포 및/또는 피부조직 채취용 각질층 체커를 구비한 5. 기재의 키트.
7. 시약이, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체인 5. 기재의 키트.
8. 시약이, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프로브인 5. 기재의 키트.
9. 시약이, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머로 되는 한쌍의 핵산 프라이머인 5. 기재의 키트.
10. 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 효과가 있는 물질을 동정하는 방법으로서, 이하의 공정:
(a) 피험물질과 피부세포 및/또는 피부조직을 접촉시키는 공정,
(b) 공정 (a)에서 피험물질과 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직을 소정 시간 배양하는 공정,
(c) 공정 (b)에서 배양한 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 하기 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 공정으로서, 상기 특정 단백질은 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 것인 상기 공정, 및
(d) 공정 (c)에서 측정한 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 대조의 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현과 비교함으로써, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현에 대한 피험물질의 효과를 평가하는 공정을 포함하는 상기 방법.
특정 단백질은 다음의 23종류이다.
(1) 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8로 이루어진 갈렉틴군으로부터 선택되는 단백질,
(2) HSP70, HSP90으로 이루어진 HSP군으로부터 선택되는 단백질,
(3) 비멘틴, Rho GDI, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신으로 이루어진 세포골격계 단백질군으로부터 선택되는 단백질,
(4) FABP-4, FABP-5로 이루어진 FABP군으로부터 선택되는 단백질,
(5) 그 외 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아넥신 II, 아포리포프로테인 A1, 에놀라아제 1, PARK7, 아르기나아제 I, 우라실 DNA 글리코실라아제.
발명의 효과
본 발명에 의해, 아토피성 피부염에 있어서의 진단 및 중증도를 측정하는 평가계를 확립할 수 있다. 이 평가계를 사용하여, 종래법에 비해 보다 객관적으로 아토피성 피부염의 중증도 및 발증 위험을 판정할 수 있다. 또한, 아토피성 피부염의 중증도 및 발증 위험을 판정하기 위한 키트 및 아토피성 피부염의 염증을 억제하는 효과가 있는 성분을 동정하는 방법도 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 4개의 실험조건((1) 합텐(-)/락토페린(-), (2) 합텐(-)/락토페린(+), (3) 합텐(+)/락토페린(-), (4) 합텐(+)/락토페린(+))에서 사용한 마우스의 피부 상태를 나타낸다.
도 2(a)는 아토피성 피부염 모델 마우스의 피부조직을 사용한 2차원 전기영동의 결과를 나타낸다(합텐(-)/락토페린(-) 및 합텐(+)/락토페린(-)의 실험조건).
도 2(b)는 아토피성 피부염 모델 마우스의 피부조직을 사용한 2차원 전기영동의 결과를 나타낸다(합텐(-)/락토페린(+) 및 합텐(+)/락토페린(+)의 실험조건).
도 3은 아토피성 피부염 모델 마우스의 피부조직에 있어서 갈렉틴의 발현변화를 나타낸다.
도 4는 아토피성 피부염 모델 마우스의 피부조직에 있어서 세포골격계 단백질 및 HSP 단백질의 발현변화를 나타낸다.
도 5는 아토피성 피부염 모델 마우스의 피부조직에 있어서 단백질의 발현변화를 나타낸다.
도 6은 아토피를 발증하고 있는 샘플에서 발현이 증가하고 있는 단백질에 대해 질량분석장치(MALDI TOF-MS)를 사용하여 동정한 결과를 나타낸다.
도 7은 아토피성 피부염 환자의 피부조직에 있어서 단백질의 발현변화를 나타낸다.
도 8의 (a)와 (b)는 아토피성 피부염 환자의 중증도와 단백질 발현량의 상관을 나타낸다.
도 9(a)(b)는 에놀라아제 1, FABP-5, SCCA2, 아포리포프로테인 A1, 혈청알부민의 각 5종 마커 단백질의 각 샘플에 있어서의 발현강도를 정량화한 결과를 환자의 중증도별로 정리한 것을 나타낸다.
도 10(a)~(f)는 건강한 정상인과 아토피성 피부염 기왕력자(旣往歷者)에 있어서 경피 수분증산량과 마커 발현량의 상관을 나타낸다.
도 11(a)~(f)는 건강한 정상인과 아토피성 피부염 기왕력자에 있어서 각질세포면적과 마커 발현량의 상관을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 아토피성 피부염을 판정하는 방법을 제공한다. 특정 단백질은 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 것이다.
「발현이 변화하는」 태양으로서는, 단백질 및/또는 그의 유전자 발현 유무가 변하는 것, 발현량이 증감하는 것 등을 들 수 있다.
특정 단백질은 아포리포프로테인 A1, FABP-4, FABP-5, 비멘틴, Rho GDI, 아넥신 II, 에놀라아제 1, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, PARK7, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신, HSP70, HSP90, 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아르기나아제 I 및 우라실-DNA 글리코실라아제로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 선택하는 단백질은 1종이어도 되고, 복수종이어도 된다.
상기 23종의 특정 단백질은 다음과 같이 된다.
(1) 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8로 이루어진 갈렉틴군으로부터 선택되는 단백질,
(2) HSP70, HSP90으로 이루어진 HSP군으로부터 선택되는 단백질,
(3) 비멘틴, Rho GDI, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신으로 이루어진 세포골격계 단백질군으로부터 선택되는 단백질,
(4) FABP-4, FABP-5로 이루어진 FABP군으로부터 선택되는 단백질,
(5) 그 외 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아넥신 II, 아포리포프로테인 A1, 에놀라아제 1, PARK7, 아르기나아제 I, 우라실 DNA 글리코실라아제.
아포리포프로테인 A1(Apolipoprotein A1)은 분자질량 30,778 Da의 분비 단백질이다. 조직으로부터의 콜레스테롤의 유출을 촉진하거나 간장에 콜레스테롤을 역수송하는 작용을 하고 있다. 킬로미크론(chylomicron)이나 플라즈마(plasma) HDL에 많이 존재하는 분비 단백질로, 피부조직에 있어서는 건선(표피의 규칙적인 비후(肥厚)와 부전각화(不全角化)를 특징으로 한다)에서 발현하고 있다는 것이 알려져 있다. 유전자 서열정보(Apolipoprotein A1, Nucleic Acids Res. 11: 2827-2837(1983), P02647). 아미노산 서열정보(Apolipoprotein A1, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 623-630(1978), M27875).
FABP-5(Fatty acid binding protein-5)는 분자질량 15,033 Da의 세포내 단백질이다. 주로 표피에 존재하는 단백질로 건선(표피의 규칙적인 비후와 부전각화를 특징으로 한다) 조직에서 발현이 상승하는 점으로부터 동정되었다. 지방산(올레산)이나 소수성의 리간드와 결합하는 세포내 단백질로, 지방산의 흡수, 수송, 대사, 또한 세포의 증식이나 분화 등에 관여한다. 증식 중의 표피 각화세포에서는 FABP-5의 발현은 적으나, 분화 유도에 의해 약 2배로 증가한다. 건선에서 고발현하고 있는 S100A7(칼슘 의존성의 시그널링 프로테인)과도 결합하여, 표피 각화세포의 분화 단계에서는 접착반(focal adhesion) 유사 구조에 국재한다. 유전자 서열정보(Fatty acid binding protein-5, J. Invest. Dermatol. 99: 299-305(1992), BC070303). 아미노산 서열정보(Fatty acid-binding protein, epidermal, Biochem. J. 302: 363-371(1994), Q01469).
비멘틴(Vimentin)은 분자질량 53,520 Da의 세포골격계 단백질이다. 클래스 III 타입의 중간경 필라멘트를 구성하는 단백질. 많은 간엽계(間葉系) 세포내에 광범위하게 망목상(網目狀)으로 분포하고, 외계로부터의 기계적인 스트레스에 대해 세포에 강도를 부여한다. 인산화에 의해 구축 구조가 조절을 받는다. 플렉틴, 시네민과 같은 결합 단백질의 존재도 알려져 있다. 유전자 서열정보(Vimentin, Nucleic Acids Res. 18: 6692-6692(1990), M14144). 아미노산 서열정보(Vimentin, Electrophoresis 18: 588-598(1997), P08670).
Rho GDI(Rho GDP-dissociation inhibitor 1)는 분자질량 23,207 Da의 세포내 단백질이다. 표피 각화세포의 분화시에 고발현한다. Rho 단백질의 GDP형으로부터 GTP형으로의 변환을 억제적으로 조절한다. 이에 따라, Rho GDI를 세포에 강제 발현함으로써 스트레스 파이버나 접착반 등이 소실되고, 세포내의 액틴 골격계가 붕괴된다. 유전자 서열정보(Rho GDP-dissociation inhibitor 1, Exp. Cell Res. 209: 165-174(1993), X69550). 아미노산 서열정보(Rho GDP-dissociation inhibitor, P52565).
아넥신 II(Annexin II)는 분자질량 38,473 Da의 세포내 단백질이다. 일부 세포외로 분비된다는 보고도 있다. 칼슘으로 제어되는 막 결합 단백질로 이 단백질에는 2개의 칼슘 이온이 결합한다. 세포막 근방에 국재하고 있다. 2조(組) 있는 아넥신 리피트 중, 1개는 칼슘이 결합하고, 1개는 인지질이 결합한다. 이 단백질은 세포막에 있는 인지질에 결합하고 있는 액틴이나 세포골격계 단백질과 가교하거나, t-PA(tissue plasminogen activator)를 매개로 하여 플라스미노겐을 활성화한다. 유전자 염기서열정보(Annexin A2, Gene 95: 243-251(1990), BC015834). 아미노산 서열정보(Annexin A2, J. Biol. Chem. 266: 5169-5176(1991), P07355).
에놀라아제 1(Enolase 1)은 분자질량 47,038 Da의 세포내 단백질이다. 2-포스포-D-글리세레이트=포스포에놀피루베이트+H2O(2-phospho-D-glycerate=phosphoenolpyruvate+H2O)의 효소활성을 가져 해당계로 작용한다. 또한 일부는 세포 증식, 알레르기에도 관여한다는 보고가 있다. 백혈구나 신경에서는 세포표면에 있어서 플라스미노겐의 활성화를 제어하여 피브린을 형성하는데 관여하고 있다. 이량체의 안정한 구조를 가지는데에는 마그네슘이 필요하다. 세포질내에 국재하나, 호모다이머만 세포막에도 보여진다. α-에놀라아제는 거의 모든 조직에 발현하고, β-에놀라아제는 근조직, γ-에놀라아제는 신경조직에만 발현하고 있다. 유전자 서열정보(Alpha enolase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 6741-6745(1986), M14328). 아미노산 서열정보(Alpha enolase, Enzyme Protein 48: 37-44(1995), P06733).
갈렉틴-1(Galectin-1)은 분자질량 14,585 Da의 세포내 단백질이다. 세포외로 분비되는 것도 있다. 심장, 위, 골격근, 신경, 흉선, 신장, 태반 등에 존재한다. β-갈락토시드나 CD45, CD3, CD4 등에 결합한다. 세포의 증식 촉진효과, 세포사의 유도, 또한 면역응답에 영향을 주는 것이 알려져 있다. 또한, 라미닌, 인테그린 등의 세포외 매트릭스의 구성성분이나 세포 수용체에 특이적으로 결합하여, 세포 접착이나 이동에 큰 영향을 주고 있다. 유전자 서열정보(Galectin-1, J. Biol. Chem. 264: 1310-1316(1989), BT006775), 아미노산 서열정보(Galectin-1, J. Biochem. 104: 1-4(1988), P09382).
갈렉틴-3(Galectin-3)는 분자질량 35,678 Da의 세포내 단백질이다. IgE에 결합하는, 갈락토오스 특이적인 렉틴. 주된 발현은 대장의 상피나 활성화 마크로파지에 있어서 보여진다. 갈렉틴-3는 표피 각화세포에 의해 생산되어 피부의 랑게르한스섬의 표면에 존재하고, IgE와 결합하여 면역계를 조절하고 있다는 보고가 있다. 유전자 서열정보(Galectin-3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 7324-7328(1990), AB006780). 아미노산 서열정보(Galectin-3, P17931).
갈렉틴-4(Galectin-4)는 분자질량 35,941 Da의 세포내 단백질이다. 갈렉틴-4는 결장암세포주인 T84로부터 단리되어, 세포와 기질간의 접착부위나 세포간에서의 접착부위에 존재한다. 유전자 서열정보(Galectin-4, Eur. J. Biochem. 248: 225-230(1997), AB006781). 아미노산 서열정보(Galectin-4, P56470).
갈렉틴-7(Galectin-7)은 분자질량 14,944 Da의 세포내 단백질이다. 일반적으로는 세포간끼리, 세포와 세포외 매트릭스간에서 세포의 증식을 제어하고 있다. 아포토시스 관련 단백질로 JNK의 활성이나 시토크롬 C의 방출을 제어하고 있다. 세포질, 핵, 또한 세포외로도 분비되고 있다. 인간 표피에서 최초로 클로닝된 갈렉틴 서브패밀리의 멤버로, 배양 표피 각화세포의 연구로부터 갈렉틴 7은 각질화의 정도에 영향을 받지 않고, 모든 표피세포에 발현한다. 유전자 서열정보(Galectin-7, Dev. Biol. 168: 259-271(1995), L07769). 아미노산 서열정보(Galectin-7, J. Biol. Chem. 270: 5823-5829(1995), P47929).
갈렉틴-8(Galectin-8)은 분자질량 35,539 Da의 세포내 단백질이다. 갈렉틴-8은 간장, 심장, 근육, 신장, 뇌 등 폭넓은 조직에 발현하고 있다. 또한, 전립선암에서 특이적으로 발현하고 있어, 정상 전립선이나 양성(良性) 비대부에는 인정되지 않는다. 배(胚)에서는 거의 존재하지 않으나, 성체(成體)의 각 조직에서는 매우 높은 발현이 보여진다. 유전자 서열정보(Galectin-8, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 7252-7257(1996), X91790). 아미노산 서열정보(Galectin-8, O00214).
PARK7은 분자질량 19,891 Da의 세포내 단백질이다. PARK7은 파킨슨병에 관계한 단백질로서 동정되었으나, 그 후 피부의 창상 치유과정에서의 재상피화(re-epithelialization)에 관여하는 것이 명확해졌다. 또한 그 입체구조로부터 프로테아제로서도 작용하고 있을 가능성이 시사되고 있다. 유전자 서열정보(Parkinson disease 7, Biochem. Biophys. Res. Commun. 231: 509-513(1997), BC008188). 아미노산 서열정보(DJ-1 protein, Q99497).
데스민(Desmin)은 분자질량 53,405 Da의 세포골격계 단백질이다. 세포구조나 강도의 유지에 작용하고 있는 클래스 III의 중간경 필라멘트의 일종. 섬유상 폴리펩티드의 중합체로 평활근(平滑筋)이나 횡문근(橫紋筋)에 존재하고 있다. 유전자 서열정보(Desmin, Gene 78: 243-254(1989), U59167). 아미노산 서열정보(Desmin, P17661).
에즈린(Ezrin)은 분자질량 69,268 Da의 세포내 단백질이다. 하기의 모에신(Moesin), 라딕신(Radixin)은 동족의 분자. 주로 세포골격계 단백질을 세포막에 연결하는 작용을 하고 있다. 세포막의 마이크로빌리(microvilli)라고 불리는 사상(絲狀) 돌기의 내측에 국재한다. 장(腸) 상피세포의 마이크로빌리를 구성하고 있다. 티로신키나아제에 의해 인산화된다. 유전자 서열정보(Ezrin, J. Biol. Chem. 264: 16727-16732(1989), X51521). 아미노산 서열정보(Ezrin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224: 666-674(1996), P15311).
라딕신(Radixin)은 분자질량 68,564 Da의 세포내 단백질이다. 주로 세포골격계 단백질과 세포막을 연결하는 작용을 하고 있다. 유전자 서열정보(Radixin, Genomics 16: 199-206(1993), L02320). 아미노산 서열정보(Radixin, P35241).
모에신(Moesin)은 분자질량 67,689 Da의 세포내 단백질이다. 주로 세포골격계 단백질과 세포막을 연결하는 작용을 하고 있다. 이상(異常) 분화를 한 표피 각화세포에 있어서 발현이 저하한다는 보고가 있다. 유전자 서열정보(Moesin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8297-8301(1991), M69066). 아미노산 서열정보(Moesin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8297-8301(1991), P26038).
FABP-4(Fatty acid-binding protein-4)는 분자질량 14,588 Da의 세포내 단백질이다. 지방세포에 지질을 수송하는 작용을 갖고 있다. 주로 세포내의 지방산이나 레티노산(retinoic acid)과 결합하고 있다. 지방세포의 분화단계에 의존하여 발현이 증가한다. FABP-5와 높은 상동성을 갖고 있다. 유전자 서열정보(Fatty acid-binding protein, adipocyte, Biochemistry 28: 8683-8690(1989), BT006809). 아미노산 서열정보(Fatty acid-binding protein, adipocyte, P15090).
HSP70(Heat shock protein 70)은 분자질량 70,052 Da의 세포내 단백질이다. 통상, 세포내에서 분자 샤페론(molecular chaperone)으로서 기능하고, 단백질의 폴딩, 수송, 집합이나 분해 등에 관여하고 있다. 또한, 미토콘드리아나 ER에서의 HSP70의 작용은 단백질을 정상적으로 이전시키는 것이다. HSP90과 협조하여 세포내의 시그널 전달에도 관여한다. 유전자 염기서열정보(Heat shock 70 kDa protein 1A, Immunogenetics 32: 242-251(1990), BC002453). 아미노산 서열정보(Heat shock 70 kDa protein 1, P08107).
HSP90(Heat shock protein 90)은 분자질량 85,453 Da의 세포내 단백질이다. 세포가 고온에 노출되면, HSP90은 구조를 바꿔 다른 단백질의 불가역적 변성을 방지하는 분자 샤페론으로서 작용한다. 또한, 어떤 종의 세포에서는 시그널 전달에 관여한다는 보고가 있다. 유전자 염기서열정보(Heat shock protein 90, Nucleic Acids Res. 17: 7108-7108(1989), X15183). 아미노산 서열정보(Heat shock protein 90, J. Biol. Chem. 264: 2431-2437(1989), P07900).
혈청알부민(Serum albumin)은 혈청에 다량으로 포함되는 분자질량 69,367 Da의 분비 단백질이다. 혈청알부민의 기본적 기능은 혈액의 교질삼투압(oncotic pressure)의 유지와 각종 물질의 담송(擔送)이다. 유전자 서열정보(Serum albumin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 71-75(1982)., V00494). 아미노산 서열정보(Serum albumin, FEBS Lett. 58: 134-137(1975)., P02768).
IgG: 면역글로불린 G(Immunoglobulin G)는 분자질량 42,632 Da의 분비 단백질이다. 인간의 전 면역글로불린의 75%를 차지하고 있다. IgG의 생리활성으로서는 보체(補體)의 활성화, 마크로파지로의 흡수 증강, 태반 통과성 등이 있다. 한편, 면역글로불린 G는 면역글로불린 IgG의 큰 서브 유닛(H사슬)으로, 유전자의 클래스 스위치에 의해 발현된다. 혈청 중에 다량으로 존재하고, 반감기도 길다. 경쇄(L사슬)와 함께 다양한 항체분자를 형성하여, 면역반응에 있어서 중심적인 역할을 한다. 유전자 서열정보(Immunoglobulin gamma, Nucleic Acids Res. 16: 11824-11824(1988)., X14356). 아미노산 서열정보(Immunoglobulin gamma, Protein Sci. 13: 2819-2824(2004)., P12314).
아르기나아제 I(Arginase I)는 분자질량 34,735 Da의 세포내 단백질이다. L-아르기닌(L-arginine)을 L-오르니틴(L-ornithine)과 요소로 가수분해하는 한방향 반응효소. 간장에 국재하나, 신장, 뇌, 유선(乳腺), 피부에도 아주 조금 인지된다. 결손되면 아르기닌 혈증을 일으켜, 정신발육지연, 경련성 사지마비를 초래한다. 유전자 서열정보(Arginase type I, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 412-415(1987)., AY074488). 아미노산 서열정보(Arginase-1, P05089).
우라실-DNA 글리코실라아제(Uracil-DNA glycosylase)는 분자질량 34,645 Da의 세포내 단백질이다. DNA 중의 시토신이 탈아미노화하면 우라실이 되고, 아데닌과 염기쌍을 형성하여 변이가 유기(誘起)된다. 이를 방지하기 위해, 탈아미노화로 생성된 데옥시우리딘의 N-글리코실 결합을 가수분해하는 효소이다. 이소폼(isoform)이 2종류 존재한다. 이소폼 I은 세포내에서는 미토콘드리아, 또한 조직분포로서는 근육에 국재한다. 이소폼 II는 증식하고 있는 조직세포의 핵에 많은 발현이 보여진다. 유전자 서열정보(Uracil-DNA glycosylase, EMBO J. 8: 3121-3125(1989)., X15653). 아미노산 서열정보(Uracil-DNA glycosylase, EMBO J. 8: 3121-3125(1989)., P13051).
상기의 단백질은 전구체 단백질이어도 되고, 성숙 단백질이어도 되며, 또한 절단형이어도 되고, 비절단형이어도 된다. 전구체 단백질로서는, 프로 단백질, 프레프로 단백질 등을 들 수 있다. 단백질, 프레프로 단백질 등에는 시그널 펩티드를 갖는 것도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현을 측정해도 되고, 그의 유전자 발현을 측정해도 된다. 예를 들면, 노던 블롯법, RT-PCR법, 웨스턴 블롯법, 면역조직 화학분석법, ELISA법, 항체 칩, cDNA 마이크로 어레이, 형광 공명 에너지 전이(FRET; Fluorescence resonance energy transfer) 측정법 등으로 측정할 수 있다.
특정 단백질의 발현을 단백질 레벨에서 특정하기 위해서는, 측정 대상이 되는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하면 된다. 항체는 단일클론항체, 다중클론항체 중 어느 것이어도 된다. 이들 항체는 공지의 방법으로 제조할 수 있고, 또한 시판되고 있는 것도 있다. 웨스턴 블롯법으로 측정하는 경우에는, 항체는 125I표지 프로테인 A, 퍼옥시다아제 결합 IgG 등을 사용하여 이차적으로 검출된다. 면역조직 화학분석법으로 측정하는 경우에는, 항체는 형광색소, 페리틴, 효소 등으로 표지하면 된다.
특정 단백질의 유전자 발현을 RNA 레벨에서 측정하기 위해서는, 측정 대상이 되는 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프로브를 사용하면 된다(노던 블롯법으로 측정하는 경우). 또는, 측정의 대상이 되는 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머로 되는 한쌍의 핵산 프라이머를 사용하면 된다(PCR법으로 측정하는 경우). 핵산 프로브 및 핵산 프라이머는 측정 대상이 되는 단백질의 유전자 정보를 토대로 하여 설계할 수 있다. 핵산 프로브는 통상, 약 15~1500 염기의 것이 적당하다. 핵산 프로브는 방사성 원소, 형광색소, 효소 등으로 표지하면 된다. 핵산 프라이머는 통상, 약 15~30 염기의 것이 적당하다.
본 발명에 있어서, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현 유무를 검출해도 되고, 발현량을 측정해도 된다. 단백질 및/또는 그의 mRNA 발현 유무는 소정 위치에 있어서 스폿이나 밴드 출현의 유무에 의해 확인할 수 있다. 단백질 및/또는 그의 mRNA 발현량은 스폿이나 밴드의 염색강도에 의해 측정할 수 있다. 또는, 단백질 및/또는 그의 mRNA를 정량해도 된다. 복수의 유전자 발현이나 복수의 단백질 발현을 동시에 검출하기 위해서는, DNA 어레이(프로브를 기판에 고정)(NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, DECEMBER 2002, 951-960), 프로테인 칩(항체를 기판에 고정)(NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, SEPTEMBER 2002, 683-695), 루미넥스(NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 1, JUNE 2002, 447-456) 등의 검출법을 사용하는 것이 바람직하다.
피부세포 및/또는 피부조직은 판정의 대상이 되는 시험대상체에 유래하는 것이면 되고, 시험대상체의 생물종으로서는 인간, 돼지, 원숭이, 침팬지, 개, 소, 토끼, 랫트, 마우스 등의 포유동물을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 아토피성 피부염을 판정하기 위해서는, 피부 생체검사 시료, 또는 그로부터 얻어지는 배양 피부세포, 배양 피부조직 등을 사용할 수 있다. 피부 생체검사 시료로서는, 후술의 실시예에 기재한 바와 같이, 피부의 각질층을 테이프(각질층 체커)에 의해 채취한 것을 사용해도 된다.
피부세포로서는 표피 각화세포, 피부 섬유아세포, 랑게르한스세포, 멜라닌세포, 비만세포, 내피세포, 피지세포, 모유두(毛乳頭)세포, 모모기(毛母基)세포 등을 들 수 있다. 피부세포는 공지의 방법에 의해 피부로부터 채취할 수 있다(분자생물학 연구를 위한 신세포 배양 실험법, p57-71, 요도샤, 1999).
피부조직으로서는 피부의 각질층, 표피, 진피 등을 들 수 있다. 피부조직은 공지의 방법에 의해 피부로부터 채취할 수 있다(Acta. Derm. Venereol., 85, 389-393, 2005).
피부 생체검사 시료는 세포여도 되고, 조직이어도 된다. 피부 생체검사 시료로서는 후술의 실시예에 기재하는 바와 같이, 피부의 각질층을 각질층 체커 등의 테이프에 의해 채취한 것을 사용하면 된다. 각질층 체커는 각질층의 부전각화도(不全角化度)나 세포면적을 측정하고, 피부 거침의 정도나 각질층의 턴오버 속도를 평가하기 위한 각질층 샘플을 채취할 때에 종래부터 사용되고 있다(화장품의 유용성·평가기술의 진보와 장래 전망, 일본 화장품 기술자회, 약사일보사, p95-96). 카운슬링 점포나 자택에서 간단하고 안전하게 각질층 샘플을 채취할 수 있어, 비침습으로 각질층으로부터 단백질을 얻는 방법으로서 매우 유용하다.
본 발명의 일례로서, 아토피성 피부염은 이하와 같은 기준으로 판정할 수 있다.
실시예 1(도 8)에 나타내는 에놀라아제 1, FABP-5, SCCA2, 아포리포프로테인 A1, 알부민 및 아넥신 II 등의 각종 항체를 사용한 분석예와 같이, 아토피성 피부염을 발증하고 있는 자원봉사자로부터 피부 검체를 입수하고, 수종의 마커 단백질의 발현량, 또는 그의 유전자 발현량을 측정하여, 질병의 증상과 발현량의 관계를 명확하게 한다.
아토피성 피부염 발증자의 발증부위(분석 검체)와 비발증부위(발증자 대조 검체), 및 아토피성 피부염 비발증자의 상동부위(비발증자 대조 검체)에 있어서 발현량의 비교로부터, 분석 검체의 아토피성 피부염의 증상 정도나 발증 원인의 판정을 한다. 이와 같이 하여, 마커 단백질의 분석 결과를, 다양한 증상을 나타내는 아토피성 피부염의 진단이나 치료에 도움이 되게끔 할 수 있다.
본 발명은 아토피성 피부염을 판정하기 위한 키트도 제공한다. 본 발명의 키트는 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 특정 단백질로서, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 상기 특정 단백질의 발현을 측정할 수 있는 시약을 포함한다.
일례로서, 본 발명의 키트는 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 시약으로서 포함한다.
특정 단백질은 아포리포프로테인 A1, FABP-4, FABP-5, 비멘틴, Rho GDI, 아넥신 II, 에놀라아제 1, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, PARK7, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신, HSP70, HSP90, 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아르기나아제 I 및 우라실 DNA 글리코실라아제로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다.
키트에는 또한, 피부조직을 채취하기 위한 테이프, 테이프 상의 단백질을 면역화학적으로 검출하기 위한 시약 일식, 취급설명서 등이 포함되어도 된다. 취급설명서에는 키트의 사용방법 외에, 아토피성 피부염의 판정기준 등도 기재해두면 좋다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프로브를 시약으로서 포함한다.
특정 단백질은 아포리포프로테인 A1, FABP-4, FABP-5, 비멘틴, Rho GDI, 아넥신 II, 에놀라아제 1, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, PARK7, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신, HSP70, HSP90, 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아르기나아제 I 및 우라실 DNA 글리코실라아제로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다.
키트에는 또한, 피부조직을 채취하기 위한 테이프, 테이프 상의 피부조직으로부터 RNA를 추출하기 위한 시약류, RNA를 노던 블롯법으로 분석하기 위한 시약류, 취급설명서 등이 포함되어도 된다. 취급설명서에는 키트의 사용방법 외에, 아토피성 피부염의 판정기준 등도 기재해두면 좋다.
또한 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머로 되는 한쌍의 핵산 프라이머를 시약으로서 포함한다.
특정 단백질은 아포리포프로테인 A1, FABP-4, FABP-5, 비멘틴, Rho GDI, 아넥신 II, 에놀라아제 1, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, PARK7, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신, HSP70, HSP90, 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아르기나아제 I 및 우라실 DNA 글리코실라아제로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다.
키트에는 또한, 피부조직을 채취하기 위한 테이프, 테이프 상의 피부조직으로부터 RNA를 추출하기 위한 시약류, RNA를 RT-PCR법으로 분석하기 위한 시약류, 취급설명서 등이 포함되면 된다. 취급설명서에는 키트의 사용방법 외에, 아토피성 피부염의 판정기준 등도 기재해두면 좋다.
본 발명은 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 효과가 있는 물질을 동정하는 방법도 제공한다. 이 방법은 이하의 공정:
(a) 피험물질과 피부세포 및/또는 피부조직을 접촉시키는 공정,
(b) 공정 (a)에서 피험물질과 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직을 소정 시간 배양하는 공정,
(c) 공정 (b)에서 배양한 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 공정으로서, 상기 특정 단백질은 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 것인 상기 공정, 및
(d) 공정 (c)에서 측정한 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 대조의 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현과 비교함으로써, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서의 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현에 대한 피험물질의 효과를 평가하는 공정을 포함한다.
피험물질은 어떤 물질이어도 되고, 단백질, 펩티드, 비타민, 호르몬, 다당, 올리고당, 단당, 저분자화합물, 핵산(DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 모노뉴클레오티드 등), 지질, 상기 이외의 천연화합물, 합성화합물, 식물추출물, 식물추출물의 분획물, 그들의 혼합물 등을 들 수 있다.
피부세포 및/또는 피부조직에 대해서는 전술한 바와 같다.
피험물질과 피부세포 및/또는 피부조직과의 접촉은 어떤 방법에 의해도 된다. 예를 들면, 피험물질을 피부세포 및/또는 피부조직의 배양액에 첨가하는 방법, 피험물질을 도포 또는 고정한 배양용기 또는 배양시트 상에서 피부세포 및/또는 피부조직을 배양하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 인간 또는 인간 이외의 포유동물(예를 들면 마우스, 랫트, 모르모트, 토끼, 돼지 등) 등의 생체를 사용하여, 피험물질을 직접 피부에 도포하는 방법, 피험물질을 경구 투여하는 방법이어도 된다.
피부세포 및/또는 피부조직의 배양시간은 특별히 한정되지 않는다. 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현에 대한 피험물질 효과의 유무를 확인할 수 있는 정도의 시간이면 된다.
예를 들면, 피부세포로서 인간 정상 표피 각화세포를 사용한 경우에는, 12~48시간이 적당하고, 12~24시간이 바람직하다. 여기서 「피부세포 및/또는 피부조직을 배양한다」는 것은, 피부세포 및/또는 피부조직을 생육·증식시키는 것을 말한다. 이것에는, 단리한 피부세포 및/또는 피부조직을 생육·증식시키는 것 이외에, 피부세포나 피부조직을 갖는 생체 자체를 생존시키는 것, 사육하는 것, 배양하는 것 등도 포함된다.
비교의 대조가 되는 피부세포 및/또는 피부조직은 피험물질을 접촉시키기 전의 피부세포 및/또는 피부조직이어도 되고, 피험물질을 접촉시키지 않는 것 이외는 동일한 처리를 행한 피부세포 및/또는 피부조직이어도 된다.
특정 단백질은 아포리포프로테인 A1, FABP-4, FABP-5, 비멘틴, Rho GDI, 아넥신 II, 에놀라아제 1, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, PARK7, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신, HSP70, HSP90, 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아르기나아제 I 및 우라실 DNA 글리코실라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일례로서, 피험물질을 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서, 아포리포프로테인 A1, FABP-5, 비멘틴, Rho GDI, 아넥신 II, 에놀라아제 1, 혈청알부민 또는 면역글로불린 G 중 어느 것의 발현량이 대조와 비교하여 감소하고 있어, 피험물질이 이들 중 어느 하나의 단백질 발현을 감소시키는 효과가 있다고 평가된 경우에는, 이 피험물질은 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 효과가 있는 물질이라고 동정할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 예로서, 피험물질을 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서, FABP-4, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, PARK7, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신, HSP70, HSP90, 아르기나아제 I 또는 우라실 DNA 글리코실라아제의 발현량이 대조와 비교하여 증가하고 있어, 피험물질이 이들 중 어느 하나의 단백질 발현을 증가시키는 효과가 있다고 평가된 경우에는, 이 피험물질은 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 효과가 있는 물질이라고 동정할 수 있다.
이하, 실시예를 토대로 하여 본 발명을 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
재료와 실험방법
1. 아토피성 피부염 모델 마우스(NC/Nga 마우스)의 합텐 처리
아토피성 피부염 모델 마우스(NC/Nga 마우스)는 6주령의 수컷을 입수하여(NC/Nga slc, 산쿄 라보 서비스 주식회사), 통상적인 조건하에 있어서 사육하였다. NC/Nga 마우스는 몇 개의 계통이 있고, 본 연구에서 사용한 계통은 통상적인 환경하에서 사육하는 것만으로는 아토피성 피부염은 발증하지 않아, DNFB(Dinitorofluorobenzene)와 같은 면역 유도제를 처리함으로써 비로소 아토피성 피부염을 발증하는 계통이다. 이에, 0.1%의 DNFB 용액(합텐)을 주 1회씩 합계 4주간, 양쪽 귀 및 좌우 등부 피부에 도포하였다.
또한 동시에 아토피성 피부염의 염증을 완화시키는 락토페린을 1 ㎍/㎖로 음료수에 용해하여 투여하였다.
마우스의 실험조건으로서, (1) 합텐(-)/락토페린(-), (2) 합텐(-)/락토페린(+), (3) 합텐(+)/락토페린(-), (4) 합텐(+)/락토페린(+)을 각 3마리씩 사용하였다.
2. 아토피성 피부염 모델 마우스의 피부조직으로부터의 단백질 추출
합텐/락토페린으로 4주간 처리한 마우스의 피부조직을 잘라내고, 조직편을 나이프로 잘게 썰어, 사전에 용기중량을 측정해둔 원심관으로 옮겨, 조직 중량을 측정한다. 조직 중량×0.85 ㎎ 우레아, 조직 중량×0.1 ㎕ 1.5% SDS, 조직 중량×0.1 ㎕ 8.5% 트리톤 X-100, 조직 중량×0.05 ㎕ 2-ME의 버퍼를 첨가하여 HG30 호모지나이저(homogenizer)(HITACHI사)로 호모지나이즈 한다. 15,000 rpm(15,000×g), 10℃에서 30분간 원심하고, 상청을 회수 후, 추가로 그 상청을 50,000 rpm(100,000×g), 10℃에서 1시간 원심하여, 그 상청을 샘플로 하였다. 단백질량은 도트·블롯법에 의해 정량하였다.
3. 아토피성 피부염 환자의 피부조직으로부터의 단백질 추출
아토피성 피부염 환자의 염증을 일으키고 있는 부위(주로 팔)와 염증부위로부터 가까운 염증을 일으키고 있지 않은 부위에 각질층 체커(아사히 바이오메드사)를 붙이고, 각질층을 채취하였다. 또한 대조로서 아토피성 피부염을 발증하고 있지 않은 인간으로부터도 샘플을 회수하였다. 각질층 체커는 하나의 부위에 대해서 같은 개소에서 3장을 사용하여 회수하였다. 1장의 실당 50 ㎕의 1×샘플 버퍼(83 mM Tris-HCl(pH 6.8), 2.7% SDS, 28% 글리세린)에서 스크레이퍼를 사용하여 실로부터 샘플을 긁어냈다. 15000 rpm(15,000×g), 4℃, 10분으로 원심 후 상청을 회수하고, DC 프로테인 어세이(BIO-RAD사)를 사용하여 단백 정량을 행하였다.
4. 2차원 겔 전기영동(2-DE)
4-1 1차원째 등전점 전기영동
60 ㎍의 단백질을 겔 팽윤액(5 M 우레아, 2 M 티오우레아, 0.5% 양성전해질(ampholytes)(pH 3.5~10)(Amersham Biosciences사), 0.0025% 오렌지 G, 2.5 mM TBP, 1% Triton X-100)과 전량이 340 ㎕가 되도록 혼합한 후, Immobiline Dry- Strip gel(18 ㎝, pH 3-10, NL)(Amersham Bioscience사)에 20℃에서 하룻밤 팽윤시켰다. 아나테크사의 장치를 사용하고, 1차원째는 20℃에서 500 V-2시간, 700 V-1시간, 1000 V-1시간, 1500 V-1시간, 2000 V-1시간, 3000 V-1시간, 3500 V-10시간의 프로그램으로 등전점 전기영동을 행하였다. 영동 후, 겔을 SDS 평형화 버퍼(5.8 M 우레아, 0.06 M 티오우레아, 0.5% 디티오트레이톨(DTT)(w/v), 25% 글리세롤, 0.0025% BPB)로 실온에서 1시간 평형화하였다.
4-2 2차원째 SDS-PAGE
2차원째는 Tris-Tricine계의 버퍼(음극 버퍼: 0.05 M Tris, 0.05 M tricine, 0.05% SDS, 양극 버퍼: 1 M Tris-HCl(pH 8.8))를 사용하여 18 ㎝×18 ㎝, 7.5% 아크릴아미드겔에 있어서 SDS-PAGE를 행하였다.
4-3 전기영동 블롯법
SDS-PAGE 종료 후의 겔을 세미드라이 타입 전사장치(니혼 에이도사)를 사용하고, PVDF막(ProBlott Membranes(Applied Biosystems사)) 20 ㎝×20 ㎝에 150 ㎃의 정전류로 2시간 전사하였다. 전사 버퍼는 양극 1액: 0.3 M Tris-HCl(pH 10.4), 20% 메탄올, 양극 2액: 25 mM Tris-HCl(pH 10.4), 20% 메탄올, 음극액: 25 mM Tris-HCl(pH 10.4), 20% 메탄올, 40 mM 6-아미노 헥산산(와코 순약 공업)을 사용하였다. 전사 후는 TTBS 버퍼(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)(BIO-RAD사), 500 mM NaCl, 0.3% Tween-20(BIO-RAD사)으로 20분간, 3회 세정한 후, MQW로 2분간, 3회 세정하였다. 다음으로 막을 실링하여 50 ㎖의 금 콜로이드 용액(Colloidal Gold Total Protein Stain(BIO-RAD사))으로 채우고, 1~2시간 진탕시켜 단백질을 염색하였다. 막을 염색 후, 금 콜로이드 용액을 제거하고, 순수(純水)로 1시간, 5회 세정한 후, 건조시켰다.
5. 단백질의 동정
5-1 PVDF막 상 단백질의 환원 S-알킬화와 프로테아제 소화
PVDF막에 전사된 단백질의 스폿 부분을 잘라내고, 튜브에 넣어 환원용 버퍼(8 M 구아니딘-HCl(pH 8.5), 0.5 M 트리스베이스, 0.3% EDTA-2Na(w/v), 5% 아세토니트릴을 100~300 ㎕ 첨가하였다. 환원용 버퍼에 용해한 DTT(dithiothreitol) 1 ㎎ 상당분을 첨가하고 튜브 내를 질소 가스로 치환하여 실온, 1시간 정치하여 단백질의 환원을 행하였다. 반응 종료 전에 1 M NaCl에 용해한 모노 요오드 초산 3 ㎎ 상당분을 첨가하여 차광상태에서 15~20분간 교반을 계속하여 S-카르복시메틸화를 행하였다. 종료 후 PVDF막을 꺼내 순수로 5분간 교반 세정하고, 그 후 2% 아세토니트릴 중에서 동일하게 교반하였다. PVDF막을 꺼내 Lys-C 소화용 버퍼(70% 아세토니트릴/20 mM Tris-HCl(pH 9.0))를 넣은 튜브로 옮겨 2~3회 헹군 후 완전히 잠길 정도로 Lys-C 소화용 버퍼를 첨가하여 1시간 소화하였다.
5-2 질량분석과 펩티드 매스 핑거프린팅(peptide mass finger printing)
프로테아제 소화한 용액을 7배 희석하여 아세토니트릴 농도를 10%로 하였다. 전처리로서 ZipTipc 18 피펫 칩(MILLIPORE사)의 충전제 부분을 활성화하기 위해 50% 아세토니트릴/0.1% TFA(trifluoro-acetic acid)로 수회, 2% 아세토니트릴/0.1% TFA(trifluoro-acetic acid)로 수회 흡인, 배출을 반복하였다. 다음으로 활성화한 ZipTipc 18 피펫 칩으로 프로테아제 소화액을 수회 흡인, 배출하여 단편화 펩티드 를 충전 부분에 흡착시켰다. 추가로 2% 아세토니트릴/0.1% TFA(trifluoro-acetic acid)를 수회 흡인, 배출하여 염류를 제거하였다. 50% 아세토니트릴/0.1% TFA(trifluoro-acetic acid)에 용해한 포화 매트릭스 용액 0.5~1 ㎕를 흡인하여 10초 정도 놓아둔 후, 질량분석계 부속의 타겟 프로브에 적하하였다. 샘플을 건고시키고, 질량분석계(MALDI-TOF MS)로 측정하였다. 얻어진 질량치를 토대로 데이터 베이스(MS-Fit, Mascot Search)에 등록되어 있는 단백질의 동정을 행하였다.
6. 웨스턴 블롯법
웨스턴 블롯용의 샘플을 사용하여 라엠리(Laemmli)의 Tris-Glycin계에 의해 SDS-PAGE를 행하였다. SDS-PAGE 후, 겔을 1 ㎠당 0.8 ㎃의 정전류로 PVDF막(MILLIPORE사)에 전사 후, 5% 스킴밀크/PBS(-)를 사용하여 4℃에서 하룻밤 블로킹하였다. 막을 0.1% Tween20/PBS(-)로 3회 세정한 후, 1차 항체를 실온에서 1시간 반응시켰다. 다음으로 2차 항체로서 비오틴화 항염소 IgG(Biotinylated anti-goat IgG)(Vector Laboratories사)(1:1000 희석)로 1시간 진탕한 경우에는 알칼리포스파타아제-콘쥬게이티드 아비딘 D(Vector Laboratories사)(1:1000 희석)를 1시간 반응시켜 0.6 ㎎/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트, 1.2 ㎎/㎖ 니트로블루테트라졸리움, 0.1 M Tris-HCl(pH 9.5), 5 mM MgCl2로 발색시켰다. 또한 2차 항체에 HRP 표지 항마우스 IgG(HRP labeled anti-mouse IgG)(Amersham Bioscience사)(1:1000 희석), HRP 표지 항토끼 IgG(Amersham Bioscience사)(1:1000 희석), HRP 표지 항랫트 IgG(Amersham Bioscience사)(1:1000 희석), HRP 표지 항염소 IgG(Santa Cruz 사)(1:1000 희석)를 사용한 경우에는 Enhanced chemiluminescence(ECL)(Amersham Bioscience사) 키트를 사용하여 형광 발색에 의해 검출하였다. 사용한 1차 항체의 종류와 희석도는 다음과 같다: 마우스 항HSP70 단일클론항체(Santa Cruz Biotechnology사)(1:1000 희석), 토끼 항아넥신 II 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology사)(1:1000 희석), 마우스 항HSP90 단일클론항체(Santa Cruz Biotechnology사)(1:1000 희석), 랫트 항GRP94 단일클론항체(Stressgeen사)(1:1000 희석), 마우스 항갈렉틴-1 단일클론항체(R&D Systems사)(1:1000 희석), 랫트 항갈렉틴-3 단일클론항체(R&D Systems사)(1:1000 희석), 마우스 항갈렉틴-4 단일클론항체(R&D Systems사)(1:1000 희석), 마우스 항갈렉틴-7 단일클론항체(R&D Systems사)(1:1000 희석), 마우스 항갈렉틴-8 단일클론항체(R&D Systems사)(1:1000 희석), 염소 항갈렉틴-9 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology사)(1:1000 희석), 토끼 항데스민 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology사)(1:1000 희석), 염소 항비멘틴 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology사)(1:1000 희석), 토끼 항에놀라아제-1 다중클론항체(Santa Cruz Biotechnology사)(1:1000 희석), 토끼 항에즈린/라딕신/모에신 다중클론항체(Chemicon사)(1:1000 희석), 염소 항FABP-4 다중클론항체(G-T research사)(1:1000 희석), 마우스 항아포리포프로테인 A1 단일클론항체(ICN biomedicals사)(1:1000 희석), 염소 항아포리포프로테인 A1(Abcom사)(1:1000 희석), 염소 항PARK7 다중클론항체(Abcom사)(1:1000 희석), 마우스 항Rho GDI 단일클론항체(Santa Cruz Biotechnology사)(1:1000 희석), 염소 항FABP-5 다중클론항체(R&D System사)(1:1000 희석), 마우스 항SCCA2 단일클론항체(Santa Cruz Biotechnology 사)(1:1000 희석), 토끼 항FABP-5 다중클론항체(BioVendor사)(1:5000 희석), 토끼 항인간 알부민 다중클론항체(Inter-Cell사)(1:1000 희석).
7. 각질세포면적의 감소도 측정
각질층 체커를 환부에 눌러 대어 각질층 세포를 박리하였다. 각질층 세포를 채취한 각질층 체커를 1% 브릴리언트 그린, 0.5% 겐티아나 바이올렛 수용액으로 염색 후, 디지털 마이크로스코프(VHX-100, KEYENCE Co, Ltd., Japan)를 사용하여 관찰하였다(가시부치들의 방법을 개변, JSCCJ, 23, 1, 1989). 얻어진 화상의 각질세포면적을 전문 판정원의 육안 평가에 의해 5단계(스코어 1: 작다, 스코어 2: 약간 작다, 스코어 3: 보통, 스코어 4: 약간 크다, 스코어 5: 크다)로 스코어링하였다.
8. 경피 수분증산량의 측정
시판의 Tewameter(TEWAMETER TM210, Courage+Khazaka electronic GmbH사제)를 사용하여 측정하였다. 그 측정원리는 피부표면으로부터 공기중으로 수분이 Fick의 법칙에 따라 확산한다고 가정하고, 피부 상 수 ㎜의 2점의 증기압을 구해 표피로부터 증산하는 수분량을 산출한다.
9. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의한 마커 단백질의 측정
96-well ELISA용 플레이트에 인산 완충용액(PBS)으로 0.2 ㎕/㎕로 희석한 각질층 단백질 용액을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 4℃에서 18시간 흡착시켰다. 각질층 단백질 용액을 제거 후, 블로킹 용액{1%의 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 PBS}에 침지하고, 37℃에서 1시간 블로킹하였다. 세정액{0.05%의 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄모노라우레이트(와코 순약)를 포함하는 PBS}으로 세정 후, 1차 항체 용액{세정 액으로 5 ㎎/㎖로 조제한 각종 항체}을 50 ㎕/웰씩 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 세정 후, 2차 항체 용액{세정액으로 1 ㎎/㎖로 조제한 HRP(Horseradish peroxidase)화 항마우스 면역글로불린 G(VECTOR LABORATORIES) 또는 세정액으로 1 ㎎/㎖로 조제한 HRP(Horseradish peroxidase)화 항토끼 면역글로불린 G(VECTOR LABORATORIES)}을 50 ㎕/웰씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 세정 후, Enhanced chemiluminescence(ECL)(Amersham Bioscience사) 키트를 사용하여 화학 발광반응을 행하고, 화학발광 검출기(Spectra Max Lmax II 384, Molecular devices)에 의해 검출, 수치화하였다.
실험결과
1. 아토피성 피부염 모델 마우스의 합텐 처리
본 연구에서 사용한 아토피성 피부염 모델 마우스(NC/Nga 마우스)는 통상적인 환경하에서 합텐 처리하여 사육하면, 합텐 처리 4주간 후에 육안적으로 확인할 수 있는 아토피성 피부염과 혹사한 피부염을 발증하였다. 본 연구에서는, 아토피성 피부염에 효과가 있는 것이 나타내어지고 있는 락토페린(타액이나 혈액에도 포함되어 있는 철 이온과 결합하는 분자량 8만의 단백질)을 마시는 물에 섞어 마시게 하였다. 합텐 및 락토페린을 처리하여 사육한 결과, 합텐 도포 처리한 마우스에서는 등부에 인간의 아토피성 피부염과 혹사한 염증이 보여졌으나, 합텐 도포 처리하고, 추가로 락토페린을 섞은 물을 마시게 한 마우스에서는 합텐 도포 처리만 한 것보다도 염증이 억제되었다(도 1). 합텐 처리에 의한 아토피 발증에 수반하여 발현이 변화한 단백질이, 락토페린 처리에 의한 아토피 증상의 완화에 의해, 무처리와 동일 한 레벨까지 돌아가 있다면, 그 단백질이 유망한 마커가 된다고 생각된다.
2. 아토피성 피부염 모델 마우스의 피부조직을 사용한 2차원 전기영동에 의한 해석
아토피성 피부염에 관여하는 단백질을 동정하기 위해 합텐 도포처리 또는 미처리, 락토페린 처리 또는 미처리 마우스의 피부를 2차원 전기영동하고, 변화하는 단백질에 대해서 해석하였다.
무처리(대조) 마우스, 합텐 도포한 마우스, 대조에 락토페린을 마시게 한 마우스, 및 합텐 도포하고 추가로 락토페린을 마시게 한 마우스의 피부(합텐 도포에서는 염증이 있었던 부위)를 골라내고, 중량에 맞추어 샘플 버퍼를 첨가하여, 폴리트론형 호모디나이저로 파쇄한 후, 15000 rpm(15,000×g), 30분 원심 후 상청을 회수하였다. 그 상청을 100,000×g, 1시간으로 초원심하고, 상청을 샘플로서 사용하였다. 2차원 전기영동은 1차원째를 pH 3-10의 스트립 겔, 2차원째를 7.5% 아크릴아미드겔을 사용하여 행하였다. 금 콜로이드 염색을 행하고, 변화하는 단백질을 검출하여, 변화가 보여진 단백질에 대해서 질량분석기 장치(MALDI-TOF MS)를 사용하여 분자의 동정을 행하였다(도 2(a)(b)). 그 결과, 분석한 단백질 49개 중, 동정된 단백질은 43개였다. 동정된 단백질 중 합텐 처리한 마우스(아토피성 피부염의 염증을 일으키고 있는 마우스)에서 발현이 증가하고 있는 것으로서는 FABP-5, 아포리포프로테인 A1, 비멘틴 등이 동정되었으나, 미지의 단백질도 4종 있었다. 한편, 합텐 처리한 마우스에서 발현이 감소하고 있는 것으로서는 갈렉틴-3, 데스민, PARK7 등이 동정되었다. 또한, 동정된 단백질의 대부분은 케라틴 5, 케라틴 16, 데스민, 비멘틴, 모에신 등의 골격계 단백질이었다.
3. 아토피성 피부염 모델 마우스를 사용한 변화하는 단백질의 항체에서의 확인
상기에서 나타낸 아토피성 피부염 발증에 따라 변화하는 단백질의 발현을 확인하기 위해 각종 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의한 해석을 행하였다. 먼저, 2차원 전기영동의 결과로부터 동정된 단백질 중에 갈렉틴-3가 포함되어 있었던 것으로부터 갈렉틴 패밀리에 주목하여 확인을 행하였다. 갈렉틴은 당 단백질의 일종으로, 통상의 시그널 서열을 갖지 않으나, 면역반응 등의 자극을 받거나, 또는 자극 없이 세포외로 방출된다. 각 갈렉틴 분자는 상이한 조직분포를 나타내고, 면역조절, 세포·기질간 접착, 세포간 접착, 창상 치유 등 상이한 생리현상으로의 관여가 보고되고 있다(J. Biol. Chem. 264: 1310-1316(1989), J. Biochem. 104: 1-4(1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 7324-7328(1990), Eur. J. Biochem. 248: 225-230(1997), Dev. Biol. 168: 259-271(1995), J. Biol. Chem. 270: 5823-5829(1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 7252-7257(1996) 참조).
이에, 갈렉틴-3 이외에도 갈렉틴 패밀리에 포함되는 갈렉틴-1, -3, -4, -7, -8, -9의 항체를 사용하여 아토피성 피부염의 모델 마우스의 피부에서의 발현량 변화를 조사하였다(도 3). 그 결과, 갈렉틴-1, -3, -4, -7, -8에 대해서는, 합텐을 처리한 마우스는 처리하지 않은 마우스(대조 마우스)에 비해 발현량이 감소하고 있었다. 한편, 갈렉틴-1, -4, -7, -8에 대해서는, 합텐을 처리한 마우스에서도 락토페린을 마시게 한 마우스에서는 그 발현량이 합텐을 처리하지 않은 마우스(대조 마우스)에 가까운 레벨까지 회복하고 있는 것을 알 수 있었다. 갈렉틴-9은 합텐 처리에 의한 변화는 보이지 않았던 점으로부터 아토피성 피부염과의 관련성은 낮다고 생각된다.
세포골격계 단백질인 데스민, 모에신/에즈린/라딕신, 비멘틴에 대해서도 동일하게 분석하였다(도 4). 합텐 처리한 마우스는 처리하지 않은 대조 마우스에 비해 데스민의 발현량은 감소하나, 모에신/에즈린/라딕신(50 KDa 절단형), 및 비멘틴의 양이 증가하였다. 특히 모에신/에즈린/라딕신에서는 합텐 처리에 의해 저분자량의 절단형이 현저하게 증가했으나, 락토페린 투여에 의한 감소는 없었다. 또한, 모에신/에즈린/라딕신은 동일 패밀리에 속하는 단백질로, 2차원 전기영동에 의한 분석으로는 모에신이 동정되었다. 금번에 사용한 항체는 이들 3종을 인식하는 것이므로, 염증에 의해 모에신 또는 다른 단백질이 단독 또는 복수로 고발현한 것이라고 생각된다.
열 쇼크 단백질인 HSP70, HSP90, HSP94에 관해서는 합텐 처리한 마우스에서는 처리하지 않은 것(대조 마우스)에 비해 HSP70, HSP90의 발현량이 감소했으나, GRP94의 발현은 합텐 처리, 무처리에 관계없이 변화하지 않았다(도 4).
또한 FABP-4(fatty acid binding protein-4), FABP-5(fatty acid binding protein-5), 에놀라아제 1, PARK7(DJ-1), 아넥신 II, 아포리포프로테인 A1, Rho GDI에 대해서 웨스턴 블로팅에 의한 분석을 행하였다(도 5). 그 결과, 아넥신 II, 에놀라아제 1, FABP-4, PARK7에 대해서는 합텐을 처리한 마우스는 처리하지 않은 마우스(대조 마우스)에 비해 발현량이 감소하였다. 또한, FABP-4 이외에서는 합텐 처리한 마우스에서도 락토페린을 마시게 한 마우스에서는 그 발현량이 합텐을 처리하지 않은 마우스(대조 마우스)에 가까운 레벨까지 회복하였다. 한편, Rho GDI, FABP-5, 아포리포프로테인 A1에 대해서는, 합텐 처리한 마우스에서는 처리하지 않은 마우스(대조 마우스)에 비해 발현이 증가하였다(도 5). Rho GDI는 세포간의 접착을 약하게 하는 것이 알려져 있어, 이 단백질의 아토피 발증에 의한 증가는 아토피성 피부염에 있어서 피부의 이탈에 관여할 가능성이 있다.
4. 아토피성 피부염 환자의 피부조직을 사용한 SDS-PAGE에 의한 해석
상기의 결과로부터 아토피성 피부염 모델 마우스를 사용한 아토피성 피부염 마커의 후보가 좁혀졌다. 그러나, 이들 단백질이 인간에 있어서 아토피성 피부염의 마커가 될 수 있는지를 조사할 필요가 있다. 이에 실제로 아토피성 피부염 발증자의 염증부위(도 6, A.P.)와 비염증부위(Control), 아토피성 피부염이 발증하지 않은 자원봉사자의 상동부위(Control)로부터 각질 체커라고 불리는 실상(seal-shaped)의 것을 사용하여 샘플을 채취하였다. 인간 피부의 동일 개소로부터 실 3장 분의 샘플을 회수하고, 그로부터 1×SDS 샘플 버퍼를 사용하여 피부조직을 용해시켰다. 그 후, 아토피 발증자(2인)와 비발증자(3인)의 샘플을 사용하여 SDS-PAGE하고, 아토피를 발증하고 있는 샘플에서 발현이 증가하고 있는 단백질에 대해서 질량분석장치(MALDI TOF-MS)를 사용하여 동정하였다. 그 결과, 아넥신 II, 편평상피세포 암종 항원-1(squamous cell carcinoma antigen-1; SCCA1), 편평상피세포 암종 항원-2(SCCA2), 지방산 결합 단백질-5(fatty acid binding protein-5; FABP-5), 혈청알부민 및 면역글로불린 G의 발현이 아토피 발증과 함께 증가하는 것이 판명되었다(도 6). 한편, 아르기나아제 I 및 우라실-DNA 글리코실라아제의 발현이 아토피 발증자에서는 감소하고 있는 것이 명확해졌다(도 6).
5. 아토피성 피부염 환자의 피부조직을 사용한 각종 항체에 의한 해석
아토피성 피부염 모델 마우스를 사용한 웨스턴 블로팅에 의한 해석에서는 17종류의 단백질에서 변화가 보여졌다. 이들 단백질이 인간의 아토피성 피부염에서의 발증시에도 동일한 변화가 보여지는지를 조사하였다(도 7). 또한, 동시에 아토피성 피부염 환자의 피부조직을 사용한 SDS-PAGE 해석에 의해 변화가 보여진 단백질에 대해서도 검토하였다.
아넥신 II에 대해서는, 아토피성 피부염 발증자의 발증부위(도 7, A.P.)에서는 비발증부위(Control)에 비해 발현이 증가하고 있고, 또한 아토피 비발증자의 밴드와 비교하여 분자량이 약간 작았다. 그 이유는 명확하지 않으나, 그 분자적 차이가 아토피성 피부염 발증자와 비발증자의 체질의 차이에 관계할 가능성이 생각된다.
에놀라아제 1, 편평상피세포 암종 항원-2(SCCA2)에 대해서는, 아토피성 피부염 발증자 1인에 있어서 발증부위에서 증가하고 있었다.
PARK7에 관해서는, 아토피성 피부염 발증자에 따라 발현의 증감이 일정하지 않으나, 아토피 비발증자에 비해 아토피성 피부염 발증자에서는 전반적으로 감소하는 경향이 보여졌다.
또한, 아포리포프로테인 A1에 관해서는, 아토피성 피부염 비발증자, 및 아토피성 피부염 발증자의 비발증부위에서는 발현이 전혀 보이지 않으나, 아토피성 피부염 발증부위에서만 발현이 증가하는 것이 명확해졌다.
이상의 결과를 표 1에 정리한다.
Figure 112008027823442-PCT00001
6. 환자의 피부조직을 사용한 각종 항체에 의한 해석
아토피성 피부염 모델 마우스 및 소수의 아토피성 피부염 환자의 피부조직에서 검출된 아토피성 피부염 마커 후보의 실용성을 확인하기 위해, 피부과의의 진료를 받은 아토피성 피부염 환자 자원봉사자 17명(남성 7명, 여성 10명)과, 비발증자 자원봉자사 15명(남성 10명, 여성 5명)의 피부 샘플을 사용하여, 아토피성 피부염의 중증도와의 상관성을 조사하였다. 아토피성 피부염 환자의 중증도(일본 피부과학회 아토피성 피부염 치료 가이드라인 2004 개정판)에 의한 분류로는 중증도 1이 1명, 2가 7명, 3이 6명, 4가 3명이었다. 아토피성 피부염 자원봉사자 17명에 관해서는 아토피성 피부염의 중증도와 상관이 있는 것이 이미 알려져 있는 혈중에서의 호산구, IgE, LDH 등의 데이터도 취했다. 피부샘플은 각질 체커로 채취하고, 6종의 단백질 발현을 웨스턴 블로팅법으로 분석하였다(도 8(a)(b)).
에놀라아제 1에 관해서는 아토피성 피부염 비발증자 피부에서는 검출되지 않았던 것에 대해, 아토피성 피부염 환자 피부에서는 넓게 발현이 보여졌다. 환자 중에서 비염증부보다도 염증부에서의 발현이 많았던 환자는 17명 중 12명이었다. 반대로 감소하고 있는 환자는 2명이었다.
지방산 결합 단백질-5(FABP-5)는 비발증자 피부에서는 1명을 제외하고 거의 검출되지 않았던 것에 대해, 아토피성 피부염 환자의 염증부에서는 중증도에 따라 강한 발현이 보여졌다. 비염증부보다도 염증부에서의 발현이 많았던 환자는 17명 중 13명이었다.
편평상피세포 암종 항원 2(SCCA2)는 비발증자 1명에서 약한 발현이 인지되었으나, 아토피성 피부염 환자 피부에서는 발현이 명확하게 증가하고 있었다. 비염증부보다도 염증부에서의 발현이 많았던 환자는 17명 중 9명이었다. 반대로 감소하고 있는 환자는 1명이었다. FABP-5에 비해 발현의 치우침이 보였다.
아포리포프로테인 A1(apolipoprotein A1)에 관해서는, 비발증자 피부에서는 1명에서 약한 발현이 인지되고, 아토피성 피부염 환자에서는 특정 환자에서 강하게 검출되는 경향이 있었다. 비염증부보다도 염증부에서의 발현이 많았던 환자는 17명 중 9명이고, 감소하고 있는 환자는 1명이었다.
혈청알부민은 아토피성 피부염 환자 전원에서 비교적 강하게 검출되고, 전체적으로 염증부와 비염증부의 차이가 작았다. 비발증자에서는 1명을 제외하고 발현은 약했다.
아넥신 II(Annexin II)에 대해서는, 발현이 약하지만 아토피성 피부염 환자 피부에서는 넓게 검출되고, 비발증자에서는 거의 검출되지 않았다. 비염증부보다도 염증부에서의 발현이 많았던 환자는 17명 중 6명이고, 감소하고 있는 환자도 6명이었다.
발현강도가 낮았던 아넥신 II를 제외하고, 에놀라아제 1, FABP-5, SCCA2, 아포리포프로테인 A1, 혈청알부민의 각 5종 마커 단백질의 각 샘플에 있어서의 발현 강도를 정량화하였다. 그 결과를 환자의 중증도 별로 정리한 것을 도 9(a)(b)에 나타낸다.
FABP-5, 혈청알부민, 에놀라아제 1은 환자 피부의 중증도와 높은 상관성을 나타낸 점으로부터, 환자의 중증도 판정에 이용할 수 있다. 혈청알부민은 비염증부에서도 검출되는 점으로부터, 아토피성 피부염 발증에 관계하는 환자의 체질을 반영하는 것으로 생각된다. 아포리포프로테인 A1과 SCCA2는 발현의 치우침이 보이고, 또한 아넥신 II는 비염증부에서의 발현이 높은 것이 특징적이다. 이들 마커의 발현도 또한 환자의 특질(特質)을 반영하고 있을 가능성이 있다.
이상의 결과를 표 2에 정리한다.
Figure 112008027823442-PCT00002
7. 아토피성 피부염 기왕력자에서의 마커의 유용성 검증
아토피성 피부염으로 통원 경험이 있는 사람은 약 634만명이고, 아토피성 피부염의 증상을 나타내는 알레르기 피부의 사람은 약 1200만명으로 추정되고 있다. 또한, 아토피성 피부염에는 약제 치료에 더해서 보습제에 의한 스킨케어가 유용하다는 것이 나타내어져 있어(다가미 하치로우, Fragrance Journal, p13-19, 2003년 6월), 의약부외품이나 화장품으로 스킨케어를 행하는 사람이 많이 존재한다. 이와 같은 점으로부터, 본 연구에서 발견한 마커의 이용으로서, 피부과의의 아토피성 피부염 진단에 더해, 카운슬링의 장에서의 피부 진단이나 자택에서의 피부 진단으로의 응용이 생각된다. 이에, 과거에 아토피성 피부염을 발증하고, 피부과의에게 치료를 받은 경험이 있는 아토피성 피부염 기왕력자를 대상으로, 아토피성 피부염 마커 후보의 실용성을 확인하였다.
아토피성 피부염의 특징적인 변화로서, 각질 배리어 기능저하에 의한 경피 수분증산량(TEWL)의 항진, 부전각화에 의한 각질세포면적의 감소나 유핵세포의 각질 중에서의 존재가 명확해져 있다(Tagami H. et al., J. Invest. Dermatol. Symp. Proc., 6, 1, 87~94, 2001). 이에, TEWL의 항진도 및 각질세포면적의 감소도를 아토피성 피부염의 염증도의 지표로서, 후보 마커의 유용성을 검증하였다.
건강한 정상인 11명, 아토피성 피부염 기왕력자 10명의 자원봉사자를 대상으로서 평가하였다. 건강한 정상인 및 아토피성 피부염 기왕력자의 정상부로서 상완(上腕) 내측부를 사용하고, 아토피성 피부염 기왕력자의 염증부로서 염증이 발생한 부위(팔꿈치의 내측부 7명, 목 1명, 손가락 사이부 1명, 무릎의 안쪽부 1명)를 사용하여, TEWL의 항진도 및 각질세포면적의 감소도와 6종의 후보마커(FABP-5, 갈렉틴-7, 에놀라아제 1, SCCA2, 아포리포프로테인 A1, 아넥신 II)의 발현도와의 상관을 조사하였다. 각질세포면적의 감소도는 박리각질층 염색법에 의해, TEWL의 항진도는 Tewameter에 의해 측정하였다. 후보 마커 6종의 발현도는 건강한 정상인 및 아토피성 피부염 기왕력자의 정상부로서 상완 내측부를 사용하고, 아토피성 피부염 기왕력자의 염증부로서 염증이 발생한 부위를 사용하여, 각질층 체커에 의해 각질층을 채취하고, 그로부터 단백질을 추출하여 ELISA법에 의해 측정하였다.
TEWL의 항진도와 6종의 후보 마커(FABP-5, 갈렉틴-7, 에놀라아제 1, SCCA2, 아포리포프로테인 A1, 아넥신 II)의 발현도와의 상관을 조사한 결과를 도 10에 나타낸다. 도 10의 그래프 X축에 나타낸 TEWL은 건강한 정상인과 아토피성 피부염 기왕력자의 정상부에서 거의 동등했으나, 아토피성 피부염 기왕력자의 염증부에서 항진하고 있었다. 도 10(a)~(c)의 그래프 Y축에 나타낸 FABP-5, 갈렉틴-7, 에놀라아제 1의 3종 마커의 발현은 건강한 정상인 및 아토피성 피부염 기왕력자의 정상부에 비해 아토피성 피부염 기왕력자의 염증부에서, TEWL의 항진과 상관하여 항진이 보여졌다.
한편, 도 10(d)~(f)의 그래프 Y축에 나타낸 SCCA2, 아포리포프로테인 A1, 아넥신 II의 3종 마커의 발현도는, 건강한 정상인<아토피성 피부염 기왕력자의 정상부<아토피성 피부염 기왕력자의 염증부로, 아토피성 피부염 발증 위험도의 진단에 유용한 것으로 생각되었다.
각질세포면적의 감소도와 6종의 후보 마커(FABP-5, 갈렉틴-7, 에놀라아제 1, SCCA2, 아포리포프로테인 A1, 아넥신 II)의 발현도와의 상관을 조사한 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11의 그래프 X축에 나타낸 각질세포면적은 건강한 정상인과 아토피성 피부염 기왕력자의 정상부에서 거의 동등했으나, 아토피성 피부염 기왕력자의 염증부에서 감소하고 있었다. 도 11(a)~(c)의 그래프 Y축에 나타낸 FABP-5, 갈렉틴-7, 에놀라아제 1의 3종 마커의 발현량은, 각질세포면적의 감소와 상관하여 건강한 정상인 및 아토피성 피부염 기왕력자의 정상부에 비해 아토피성 피부염 기왕력자의 염증부에서 항진이 보여졌다. 한편, 도 11(d)~(f)의 그래프 Y축에 나타낸 SCCA2, 아포리포프로테인 A1, 아넥신 II의 3종 마커의 발현도는, 건강한 정상인<아토피성 피부염 기왕력자의 정상부<아토피성 피부염 기왕력자의 염증부로, 아토피성 피부염 발증 위험도의 진단에 유용한 것으로 생각되었다.
아토피성 피부염의 염증도 및 아토피성 피부염 발증의 위험도에 수반하여 발현이 증가하는 단백질 및 감소하는 단백질을 발견하였다. 이들 단백질의 발현변동 을 검정함으로써, 아토피성 피부염의 원인이나 증상과 관계하는 보다 정확한 진단이나 발증 위험도의 판정이 가능해진다. 또한, 이들 마커를 아토피성 피부염의 치료제 개발이나 민감피부용 화장품 및 건강식품으로의 개발 등에 이용할 수 있다.

Claims (10)

  1. 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 하기 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 아토피성 피부염을 판정하는 방법으로서, 상기 특정 단백질은 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 것인 상기 방법.
    특정 단백질은 다음의 23종류이다.
    (1) 갈렉틴-1(Galectin-1), 갈렉틴-3(Galectin-3), 갈렉틴-4(Galectin-4), 갈렉틴-7(Galectin-7), 갈렉틴-8(Galectin-8)로 이루어진 갈렉틴군으로부터 선택되는 단백질,
    (2) HSP70, HSP90으로 이루어진 HSP군으로부터 선택되는 단백질,
    (3) 비멘틴(Vimentin), Rho GDI, 데스민(Desmin), 모에신(Moesin), 에즈린(Ezrin), 라딕신(Radixin)으로 이루어진 세포골격계 단백질군으로부터 선택되는 단백질,
    (4) FABP-4, FABP-5로 이루어진 FABP군으로부터 선택되는 단백질,
    (5) 그 외 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아넥신 II(Annexin II), 아포리포프로테인 A1(Apolipoprotein A1), 에놀라아제 1, PARK7, 아르기나아제 I, 우라실 DNA 글리코실라아제.
  2. 제1항에 있어서, 피부세포 및/또는 피부조직이 각질층 체커에 의해 채취된 피부의 각질층인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 특정 단백질의 발현을 단백질 레벨에서 측정하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 특정 단백질의 유전자 발현을 RNA 레벨에서 측정하는 방법.
  5. 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 하기 특정 단백질로서, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 상기 특정 단백질의 발현을 측정할 수 있는 시약을 포함하는, 아토피성 피부염을 판정하기 위한 키트.
    특정 단백질은 다음의 23종류이다.
    (1) 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8로 이루어진 갈렉틴군으로부터 선택되는 단백질,
    (2) HSP70, HSP90으로 이루어진 HSP군으로부터 선택되는 단백질,
    (3) 비멘틴, Rho GDI, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신으로 이루어진 세포골격계 단백질군으로부터 선택되는 단백질,
    (4) FABP-4, FABP-5로 이루어진 FABP군으로부터 선택되는 단백질,
    (5) 그 외 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아넥신 II, 아포리포프로테인 A1, 에놀라아제 1, PARK7, 아르기나아제 I, 우라실 DNA 글리코실라아제.
  6. 제5항에 있어서, 피부세포 및/또는 피부조직 채취용 각질층 체커를 구비한 키트.
  7. 제5항에 있어서, 시약이, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체인 키트.
  8. 제5항에 있어서, 시약이, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프로브인 키트.
  9. 제5항에 있어서, 시약이, 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 특정 단백질의 mRNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 프라이머로 되는 한쌍의 핵산 프라이머인 키트.
  10. 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 효과가 있는 물질을 동정하는 방법으로서, 이하의 공정:
    (a) 피험물질과 피부세포 및/또는 피부조직을 접촉시키는 공정,
    (b) 공정 (a)에서 피험물질과 접촉시킨 피부세포 및/또는 피부조직을 소정 시간 배양하는 공정,
    (c) 공정 (b)에서 배양한 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 하기 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 측정하는 공정으로서, 상기 특정 단백질은 아토피성 피부염의 염증에 수반하여 발현이 변화하는 것인 상기 공정, 및
    (d) 공정 (c)에서 측정한 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현을 대조의 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현과 비교함으로써, 피부세포 및/또는 피부조직에 있어서 특정 단백질의 발현 및/또는 그의 유전자 발현에 대한 피험물질의 효과를 평가하는 공정을 포함하는 상기 방법.
    특정 단백질은 다음의 23종류이다.
    (1) 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8로 이루어진 갈렉틴군으로부터 선택되는 단백질,
    (2) HSP70, HSP90으로 이루어진 HSP군으로부터 선택되는 단백질,
    (3) 비멘틴, Rho GDI, 데스민, 모에신, 에즈린, 라딕신으로 이루어진 세포골격계 단백질군으로부터 선택되는 단백질,
    (4) FABP-4, FABP-5로 이루어진 FABP군으로부터 선택되는 단백질,
    (5) 그 외 혈청알부민, 면역글로불린 G, 아넥신 II, 아포리포프로테인 A1, 에놀라아제 1, PARK7, 아르기나아제 I, 우라실 DNA 글리코실라아제.
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