WO2006019037A1 - 肝線維化ステージの判定方法 - Google Patents

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WO2006019037A1
WO2006019037A1 PCT/JP2005/014757 JP2005014757W WO2006019037A1 WO 2006019037 A1 WO2006019037 A1 WO 2006019037A1 JP 2005014757 W JP2005014757 W JP 2005014757W WO 2006019037 A1 WO2006019037 A1 WO 2006019037A1
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prion
glypican
liver
decorin
gene
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PCT/JP2005/014757
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Maiko Mori
Hiroki Wagatsuma
Yoshiyuki Takahara
Shuhei Nishiguchi
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Ajinomoto Co., Inc.
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Definitions

  • the present invention relates to a liver fibrosis stage by measuring the expression level of a gene whose expression level varies during the fibrosis process of the liver, or the amount of protein encoded by the gene.
  • the present invention relates to a detailed determination method, a test reagent used in the method, a novel hepatic fibrosis inhibitor, and a screening method thereof.
  • liver fibrosis an abnormal fiber structure is formed in the liver, and the fiber structure expands as it progresses. Finally, a nodule in which the liver lobe structure mainly composed of liver parenchymal cells is surrounded by fibers. Occurs throughout. The blood that flows into the liver is spread throughout the liver by capillaries, and the capillaries gather and drain from the liver. This condition is the basis for maintaining the health of the liver and the liver function and maintaining the whole body. However, when a nodule due to the fiber structure occurs, this blood flow does not spread to the liver and the liver function is not fully exhibited.
  • liver cancer increases due to oxidative stress received by the liver itself, repeated injury and repair, and excessive enhancement of hepatocyte activity necessary to maintain the function of few hepatocytes. The above is the transition of liver fibrosis.
  • Liver fibrosis is mainly caused by viral infection.
  • hepatitis C virus and hepatitis B virus are often the cause.
  • Inflammation caused by viral infection is calmed down by immune response In many cases, viruses are not completely erased. This repetition continues for years.
  • Inflammation that has been infected by the virus is acute hepatitis.
  • chronic hepatitis hepatic fibrosis is caused by hepatitis, the fiber structure increases, nodules occur, and systemic damage due to the fiber structure. Is called the disease name cirrhosis.
  • Hepatitis can also be caused by long-term drinking and drug administration due to the power of viral infection.
  • Fibrosis occurs from fatty liver where fat accumulates in the liver There is also a case. Acute hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis and worsening of the disease are in good agreement with the progression of liver fibrosis.
  • liver biopsy abbreviated liver biopsy
  • the degree of fibrosis is classified as Fl, 2,3,4 according to the progression of fibrosis
  • F4 is equivalent to cirrhosis (Staging according to the degree of fibrosis in the liver histological standard of chronic hepatitis called Inuyama classification: Reference materials: Hepatic pathology clinical science medical school p331-332, 19th Inuyama symposium, Inuyama symposium record publication edition, Chugai Medical, pl42-188).
  • liver fibrosis is a very slow disease progression that generally progresses from F1 to F4 over decades. Patient burden Since liver biopsy that cannot be performed many times diagnoses the fibrosis process over a long period of time, it is required that the diagnosis of liver biopsy accurately capture the pathology. In this way, liver biopsy is the basic means of diagnosing liver fibrosis, but there are three problems. 1) In the determination process of liver biopsy, tissue specimens are prepared and pathological examination is performed, but the subjectivity of the examiner determines the diagnosis. In the F1 to 4 stage classification, there are few cases where the same sample is diagnosed with different stages when the person or facility to be diagnosed changes.
  • Liver biopsy mainly identifies fibers by staining and diagnoses the degree of fibrosis. Judgment is made by looking at the fibers as a result of hepatocyte activity, and the virus has already been removed and the fibrosis activity in the liver has subsided. It is impossible to identify the state of production or the state where liver activity is impaired. From now on, it is necessary to diagnose whether the fibrosis is progressing in the direction in which the fibrosis progresses or whether it has already subsided.
  • liver biopsy involves the risk of damaging the liver and increasing the burden on the patient. Accompanying hospitalization, the burden on doctors as well as patients is large. Liver biopsy is minimal, and repeated liver biopsy and fibrosis in the same patient are minimal. If it is predicted that the temperature will be normal, it is not usually performed, so a sufficient diagnosis cannot be made. In addition, since liver biopsy diagnoses a small part of the entire liver, the diagnosis depends on the sampling location. Sampling is performed while looking at diagnostic imaging, but errors due to sampling are unavoidable.
  • liver biopsy is to measure serum markers. Measurement of hyaluronic acid, collagen or fragments thereof, which are fiber components, is used (Non-patent Document 1).
  • Hyaluronic acid which is used as a fiber-derived serum marker, increases in serum concentration in response to liver fibrosis, but also in serum inflammation even in the liver inflammation state that reflects force of liver fibrosis Since it fluctuates, it is difficult to determine only fibrosis (Non-Patent Documents 6 and 7).
  • serum collagen typelll collagen, typelV collagen, etc. or their fragments
  • laminin levels can distinguish liver cirrhosis from normal liver. It is not possible to diagnose early stage progression of liver fibrosis. In the early stages of fibrosis, there are many cases where there is no clear subjective symptom. After F4, that is, cirrhosis occurs, hepatic fibrosis is usually detected after the subjective symptom appears. After F4, the probability of progression to liver cancer, which is difficult to improve fibrosis, is extremely high. It is difficult to detect the fiber structure by image diagnosis using ultrasound and NMR, and it cannot be applied to the diagnosis of fibrosis.
  • Patent Document 1 discloses a number of hepatic fibrosis markers including lumican and glypican3 as hepatic fibrosis markers (Table 4). However, there is an increase in the expression of these markers and liver fibrosis. It is unclear whether any of the stages (Fl, 2, 3, 4) corresponds, and what cell activity these markers reflect in the liver. The inspection method of this, especially the initial inspection method is still well established.
  • liver fibrosis is a long-term disease that, when discovered, is difficult to treat, making drug development difficult, and limited means of monitoring the fibrosis process. Makes the development of these medicines difficult Is a major cause.
  • organ fibrosis is not limited to liver, but occurs in all organs such as blood vessels, lungs, spleen, and kidneys.
  • the mechanism of its onset is not necessarily clear, but activation of monosite cells (Kupffer cells in the liver), activation of stellate cells (hepatic stellate cells in the liver) and fiber production, both Damage to parenchymal cells (liver parenchymal cells in the liver) and effects on the entire organ.
  • T The progression of the disease is considered to be common in fibrosis of the wrong organ.
  • the development of diagnostic and therapeutic drugs for these fibrosis has the same problems as liver fibrosis.
  • Non-Patent Literature l Flisiak R Maxwell et al. Hepatogastroenterology, 2002 49 (47), 1369-7 2
  • Non-Patent Document 2 Castera L Hartmann DJ, J Hepatol, 2000, 23 (3), 412-8
  • Non-Patent Document 3 Hirayama C et al, J Gastroenterol, 1996 31 (2), 242-8,
  • Non-Patent Document 4 Montalto G et al, Presse Med. 1996, 20,25 (2), 59-62
  • Non-Patent Document 5 Schneider M. et al, Hepatogastroenterology, 1989, 36 (6), 506-10
  • Non-Patent Document 6 TaoJ et al World J Gastroenterol. 2003 9 (11): 2497-500
  • Non-Patent Document 7 Cai WM et al, Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2003 11 (1): 23-5
  • Non-Patent Document 8 Shirai H et al, FEBS Letters 399, 1-8, 1996
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-259877
  • an object of the present invention is to determine a liver fibrosis stage using a gene or protein whose expression is increased or decreased in the fibrosis process and a test reagent, and to increase or decrease the expression in the liver fibrosis process. Screening method for compounds that control the expression and activity of genes or proteins to be expressed, and expression increases or decreases in liver fibrosis It is intended to provide an inhibitor of liver fibrosis that controls genes or proteins
  • the present inventors obtain an objective marker that can be used to accurately determine the stage of liver fibrosis that cannot be performed by a histological examination of a biopsy sample, which has conventionally relied only on human experience.
  • the first is to further improve the diagnostic accuracy by finding multiple objective markers that well reflect the fibrosis stage and combining them.
  • the gene expression of the liver in the process of progression of liver fibrosis in the rat liver fibrosis model was comprehensively measured by gene chip to determine the liver fibrosis marker gene. Many were identified.
  • liver fibrosis markers It is extremely difficult to measure with a chip. Therefore, we attempted to identify a number of effective liver fibrosis markers from a very small amount of RNA by measuring candidate genes in advance in a rat liver fibrosis model and selecting them carefully. If a large number of liver fibrosis markers are obtained, combining these makes it possible to accurately determine the liver fibrosis stage, and the liver fibrosis stage can be classified more precisely than the current stage. become. Furthermore, stage determination that greatly increases the risk of carcinogenesis can be determined accurately.
  • the present invention is as follows.
  • Protein force encoded by each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 60 in patient tissue or body fluid Group power as selected One or more proteins selected or substantially the same as the protein
  • a method for determining a liver fibrosis stage comprising a step of measuring the concentration of the protein or a partial peptide thereof, and a step of determining a liver fibrosis stage based on the measured value.
  • liver fibrosis stage is determined by comparing the concentration of the protein or partial peptide in a patient with the concentration in a healthy person.
  • the method for measuring the protein or partial peptide concentration is selected from the group consisting of Western plot method, Enzyme imno assay method, radio immuno assay method, liquid chromatography method and dot blot method. (1) to (3), the determination method of any one of the above.
  • a method for determining a liver fibrosis stage comprising: measuring an expression level of a gene having a base sequence; and determining a liver fibrosis stage based on the measurement value.
  • the expression level of the gene can be measured by a method using a gene chip, an RT-PCR method, The determination method according to any one of (5) to (7), which is carried out by any method of the Zamblot method.
  • a drug candidate substance is added to cultured liver cells, and each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 60 and a group force having a gene power having substantially the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence is selected.
  • the expression level of the gene or the amount of the gene encoded by the gene or the amount of the protein encoded by the gene in the cell or the amount secreted by the cellular force is measured.
  • a screening method for a hepatic fibrosis inhibitor wherein a substance that varies the amount of the protein is screened.
  • Liver comprising at least one selected from a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence encoded by any one of SEQ ID NOS: 1 to 60 or a partial peptide thereof
  • a kit for screening fibrosis inhibitors comprising at least one selected from a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence encoded by any one of SEQ ID NOS: 1 to 60 or a partial peptide thereof.
  • a hepatic fibrosis inhibitor comprising an antisense oligonucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to any one of SEQ ID NOS: 1 to 60 or a partial sequence thereof.
  • liver fibrosis comprising a sense strand having a partial sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 60 and a double-stranded RNA having a complementary strand strength having a sequence complementary to the sense strand Agent.
  • a liver comprising an antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence encoded by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 60 or a partial peptide thereof Fibrosis inhibitor.
  • composition for gene therapy for suppressing liver fibrosis comprising a vector comprising DNA having SEQ ID NOs: 1 to 60, any one of the nucleotide sequences or a partial sequence thereof.
  • SEQ ID NOS: 1 to 60 comprising an antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence encoded by one of the base sequences, or a partial peptide thereof Reagent for liver fibrosis test.
  • a reagent for examination of liver fibrosis comprising: BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION [0015] ⁇ 1> Determination method of liver fibrosis stage of the present invention
  • the expression level of a gene whose expression fluctuates in the process of liver fibrosis or the amount of protein encoded by the gene is measured.
  • a gene whose expression level is to be measured a gene having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 60 whose association with liver fibrosis has been clarified in the present invention can be used. . Specifically, it is the following gene. For each gene, the accession number of the human gene tjenBank is also given.
  • SEQ ID NO: 1 arachidonate 5- lipoxygenase-activating protein (ALOX5AP) NM—00162
  • SEQ ID NO: 2 calgranulin A NM— 002964
  • SEQ ID NO: 3 FAS Antigen (TNF superfamily member 6) NM—001066
  • SEQ ID NO: 4 IL1 beta NM—000576
  • SEQ ID NO: 5 interleukin 1 receptor antagonist (IL1RN) NM— 000577
  • SEQ ID NO: 6 lysozyme NM—000239
  • SEQ ID NO: 7 natural killer cell proteinase 1 (NK cell proteinase 1) NM— 004131
  • SEQ ID NO: 8 TGF beta NM— 000660
  • SEQ ID NO: 9 TGF beta 3 NM— 003239
  • SEQ ID NO: 10 TNF-alpha NM—000594
  • SEQ ID NO: 11 biglycan NM—001711
  • SEQ ID NO: 12 collagen, type I, alpha 1 (COL1A1) NM— 000088
  • SEQ ID NO: 13 collagen, type III, alpha 1 (COL3A1) NM— 000090
  • SEQ ID NO: 14 collagen, typelV, alpha 1 (COL4A1) NM— 001845
  • SEQ ID NO: 15 decorin NM—001920
  • SEQ ID NO: 17 follistatin NM— 006350
  • SEQ ID NO: 18 glypican 3 NM—004484
  • SEQ ID NO: 19 hyaluronan-mediated motility receptor (HMMR) NM— 012484
  • SEQ ID NO: 20 lectin galactose binding soluble 1 (LGALS1) NM— 002305
  • SEQ ID NO: 21 lumican NM—002345
  • SEQ ID NO: 22 lysyl oxidase NM—002317
  • SEQ ID NO: 23 lysyl oxidase- like 1 NM— 005576
  • SEQ ID NO: 24 matrix Gla protein NM— 000900
  • SEQ ID NO: 25 matrix metalloproteinase 2 (MMP2) NM— 004530
  • SEQ ID NO: 26 proline 4-hydroxylase alpha polypeptide I (P4HA1) NM— 000917
  • SEQ ID NO: 27 Plasminogen activator inhibitor- 1 (PAI1) NM— 000602
  • SEQ ID NO: 28 pleiotrophin NM.002825
  • SEQ ID NO: 29 prion NM—000311
  • SEQ ID NO: 30 sialoprotein NM—000582
  • SEQ ID NO: 31 transgelin NM— 003186
  • SEQ ID NO: 33 betaine-homocysteine methyltransferase (BHMT) NM— 001713
  • SEQ ID NO: 34 cystathionine- beta-synthase (CBS) NM— 000071
  • SEQ ID NO: 35 cysteine dioxygenase, type I (CDOI) NM— 001801
  • SEQ ID NO: 36 C / EBPbeta (CEBPB) NM— 005194
  • SEQ ID NO: 37 cystathionase (cystathionine gammalyase) (CTH) NM— 001902
  • SEQ ID NO: 38 cysteinyl leukotriene receptor 2 (CYSLTR2) NM— 020377
  • SEQ ID NO: 39 defensin beta 1 NM— 005218
  • SEQ ID NO: 40 glutathione S-transferase Al (GSTA1) NM—145740
  • SEQ ID NO: 42 IGF1 NM— 000618
  • SEQ ID NO: 43 interleukin 6 receptor (IL6R) NM— 000565
  • SEQ ID NO: 44 lipopolysaccharide binding protein (LBP) NM— 004139
  • SEQ ID NO: 45 methionine adenosyltransferase I, alpha (MAT1A) NM— 000429
  • SEQ ID NO: 46 methionine adenosyltransferase II, beta (MAT2B) NM— 013283 ⁇
  • Self column 47 5-methyltetrahydrofolate- homocysteine methyltransferase (MTR) NM —000254
  • SEQ ID NO: 48 glutathione reductase (GSR) NM— 000637
  • SEQ ID NO: 49 leukotriene A4 hydrolase (LTA4H) NM— 000895
  • SEQ ID NO: 51 cysteinyl leukotriene receptor 1 (CYSLTRl) NM— 006639
  • SEQ ID NO: 52 leukotriene B4 receptor 2 (LTB4R2) NM— 019839
  • SEQ ID NO: 54 DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 1 (DNMTl) NM— 001379
  • SEQ ID NO: 55 S-adenosylhomocysteine hydrolase (AHCY) NM— 000687
  • SEQ ID NO: 58 Hepatocyte nuclear factor 6 (HNF6) NM— 004498
  • ⁇ ⁇ ⁇ 1 J3 ⁇ 4 ⁇ 0: endothelial differentiation, sphingolipid G—protein— coupled receptor5 (E DG5) NM— 004230
  • each SEQ ID NO. may be a gene having a sequence substantially identical to the base sequence shown.
  • “substantially the same” includes, for example, a gene that is hybridized under stringent conditions with the polynucleotide having the above base sequence.
  • stringent conditions for example, in column f, at a salt concentration corresponding to 60 ° C, 1 X SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 X SSC, 0.1% SDS, The conditions for washing 2 to 3 times are preferable.
  • the expression level of one kind of gene may be measured, or the expression levels of two or more genes may be measured.
  • the expression level can be measured by, for example, isolating RNA (total RNA or mRNA) from patient tissues or body fluids, synthesizing cDNA, and then measuring by PCR or DNA chip, or by biopsy.
  • the obtained tissue can be used for in situ staining or RNA can be used for Northern plotting.
  • patient tissues include liver-derived tissues obtained at the time of liver biopsy, liver-derived cells detached from the liver into the blood, various blood cells, and body fluids include blood, lymph, and intercellular infiltrates. Examples include fluid, urine, tears, and saliva.
  • blood is the preferred body fluid, which is preferred for tissues obtained by liver biopsy.
  • the liver fibrosis stage (degree of progression of liver fibrosis) can be examined and diagnosed based on the expression level of the selected gene.
  • the expression level of the basis of judgment may be the absolute value of the expression level of each gene !, but it is a gene that is less likely to fluctuate during the fibrosis process (such as dalyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)) It may be a relative value standardized by the expression level.
  • GPDH dalyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the degree of fibrosis of the liver is classified as Fl, 2, 3, 4 according to the progression of fibrosis, and F4 corresponds to cirrhosis (the degree of fibrosis in the hepatic histological standard of chronic hepatitis called the Inuyama classification) Staging by degree: Reference materials: Hepatic pathology clinical science medical school p331-332, 19th Inuyama symposium, Inuyama symposium publishing edition, Chugai medical company, pl42-188).
  • the determination method of the present invention it is possible to determine which of these stages is classified.
  • the classification is not necessarily limited to F1 to F4, and determination may be made using a classification corresponding to this classification or a more detailed classification.
  • the expression level may be measured over time in the same patient, and the stage variation may be determined based on the variation in the expression level. That is, since the expression level of each of the genes varies depending on the stage, it is possible to determine the stage variation based on the variation in the expression level of the selected gene. For example, in the case of the biglycan gene (SEQ ID NO: 11), it varies significantly between F1 and F2. Therefore, when the expression level of the biglycan gene in the same patient is measured sequentially, the liver fibrosis changes from F1 to F2. It can be determined that the progress has been made.
  • the stage can also be determined from a single measurement result. For example, for each gene, the stage can be determined by calculating the expression level in each stage and examining which stage the measurement value applies to. For example, Table 8 and Table 9 It can be determined with reference to.
  • the determination may be made by comparing the measurement result with a value in a healthy person (normal value). Since the expression level of each of the above genes is significantly decreased or increased compared with that of a healthy person, the stage can be determined by comparison with the value of the healthy person.
  • the fibrosis stage may be determined by combining measured values of a plurality of genes, preferably four or more genes among the above genes. More accurate determination is possible by combining a plurality of genes. For example, the following methods are mentioned.
  • a function such as a linear discriminant function that indicates the correlation between the expression levels of a plurality of selected genes and each fibrosis stage is constructed.
  • the measured value of the expression level of each gene is applied to the function to calculate the value for each stage, and by comparing the calculated values, it is possible to determine which stage the patient is in fibrosis.
  • the function which shows the correlation between the expression level of a gene and each fibrosis stage can use the function used in a normal statistical method.
  • Tables 11 to 13 show examples of combinations that are effective for judgments derived from linear discriminant functions.
  • the liver may be further determined whether or not the liver is in an active period. That is, among the above genes, there are genes that increase due to acute inflammation (see Table 2), and when the expression level of the gene increases, it can be determined that the liver is in the active phase.
  • a determination may be further made based on information on which type of cell in the liver each gene is derived from. That is, Kupffer cells play a central role in producing inflammation and inducing inflammation. Astrocytes play a central role in the production of extracellular matrix responsible for fibrosis as well as producing cytoforce in. Liver parenchymal cells play a central role in liver function, which is linked to some physical abnormality of the patient.
  • Table 2 summarizes which cells each gene is derived from.
  • the above gene can be used not only for liver fibrosis but also for determining the degree of fibrosis in various liver diseases accompanied by liver fibrosis.
  • liver cancer changes Predicting the rate of progress of the base that causes liver cancer and predicting the recovery rate
  • the increase or decrease in the expression of the fibrosis marker gene is roughly proportional to the increase or decrease in the expression of the protein that is the product.
  • the protein secreted outside the cell is naturally reflected in the concentration of the protein in the serum. Even proteins that are not secreted leak into the serum due to the destruction of hepatocytes and are reflected in the serum protein concentration.
  • the amount of protein encoded by the gene can be measured, and fibrosis can be determined based on the measured value.
  • the amino acid sequence information of the protein encoded by each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 60 can be obtained by referring to the above GenBank Accession numbers.
  • the amino acid sequence of the protein may be substituted depending on the race or the like, the protein to be measured in the determination method of the present invention is substantially the same protein as the above protein. May be.
  • the substantially identical protein refers to a protein having a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added in the amino acid sequence encoded by the above base sequence.
  • the term “several” means 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5.
  • the protein to be quantified in the present invention is a part of the above protein. Even a minute peptide.
  • immunochemical detection methods using antibodies such as the enzyme immunoassay (ELISA) method, the radioimmunoassay (RIA) method, and antibody chips (such as glass)
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • antibody chips such as glass
  • a method using a protein chip adjusted to a density, a Western plot method, a method using immunostaining of a tissue section, or the like can be used.
  • MS mass spectrum
  • MS mass spectrum analysis detection method
  • MS mass spectrum analysis detection method
  • MS mass spectrum analysis detection method
  • MS mass spectrum analysis detection method
  • the protein sequence of the marker gene is extracted from the database, and a sequence that is predicted to be directed to the protein surface or a peptide sequence that includes a portion having a different protein sequence in the administration animal described later is selected.
  • a peptide portion existing on the protein surface can be predicted using Insightll or the like, a protein three-dimensional structure prediction software manufactured by Accelrys (Non-Patent Document 8), and a peptide sequence can be selected.
  • the selected peptide is synthesized using a peptide synthesizer or the like. This peptide mixture is administered to animals such as rabbits and mice to produce specific antibodies against the peptides.
  • ELISA plates can be prepared, and the sandwich method can be used. This can improve the specificity of the ELISA, but it can also be performed with a single type of antibody. Using these antibodies, ELISA plates are prepared. If an antibody is produced, it can be detected by various immunostainings limited to ELISA. For example, the above-described antibody chip.
  • Proteins of interest can be quantified with a mass spectrometer (MS) after directly removing serum or removing abundant proteins such as serum albumin. Using MS, it is possible to quantify the fragments of the full-length protein.
  • MS mass spectrometer
  • Determination of liver fibrosis stage based on protein can be performed in the same manner as the above-described determination of gene expression level.
  • the test reagent of the present invention is a reagent that can be used in the determination method of the present invention.
  • a reagent for measuring the expression level of a gene for example, one or more kinds selected from a gene group having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 60 (or homologous sequences thereof or a part thereof) are used. Examples thereof include a probe for detecting a gene or a reagent including a primer for amplifying the gene. In this case, an enzyme for gene amplification, a buffer for hybridization, etc. may be further included.
  • test reagent of the present invention may be a DNA chip carrying a plurality of genes among the above genes.
  • examples of the reagent for measuring the amount of protein include a reagent containing an antibody for detecting one or more of the proteins encoded by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 60.
  • a secondary antibody may be further included.
  • it may be a protein chip carrying one or more proteins among the proteins encoded by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 60.
  • the liver fibrosis inhibitor of the present invention includes liver fibrosis including an antisense oligonucleotide having a base sequence complementary to a part of one or more of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 60. Inhibitors may be mentioned.
  • the antisense oligonucleotide may be modified with phosphoroate or the like.
  • the length of the antisense oligonucleotide is not particularly limited, but is preferably 15 to 20 mer.
  • the hepatic fibrosis inhibitor of the present invention may be one in which an antisense oligonucleotide is included in a ribosome or the like.
  • the dose of the hepatic fibrosis inhibitor of the present invention varies depending on the patient's symptoms, but 5 mg / kg / day to 30 mg / kg / day is preferred, and 10 to 20 mg / kg / day is more preferred.
  • the liver fibrosis inhibitor of the present invention comprises a sense strand having a partial sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 60 and a double-stranded RNA having a complementary strand strength having a sequence complementary to the sense strand. It may be contained.
  • Such double-stranded RNA can suppress liver fibrosis by suppressing gene expression by an action called RNAi (RNA interference:!? NA interference).
  • the liver fibrosis inhibitor of the present invention is any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 60 or It may also be a gene therapeutic yarn for suppressing liver fibrosis, comprising a vector containing a DNA having the partial sequence.
  • a vector an adenovirus vector or a retrovirus vector can be used.
  • the liver fibrosis inhibitor of the present invention is also a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 60 or It may contain an antibody against the partial peptide. Proteins can be expressed by incorporating the gene that encodes them into an expression vector, introducing the gene in the form of ribosomes or virus particles, and expressing the protein in the introduced in vivo cells.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Further, it may be an F (ab ′) antibody or an F (ab ′) antibody. Antibodies can be obtained by conventional antibody production methods.
  • Any gene whose expression changes with liver fibrosis can be a drug discovery target. That is, for the marker gene or the gene product shown in Table 3 that has a positive correlation with liver fibrosis, screening for a hepatic fibrosis inhibitor is performed by selecting an agent that works in the direction of suppressing this expression. Can do. For example, a drug is added to cultured liver cells such as Kupffer cells, hepatic stellate cells, or liver parenchymal cells, and changes in the expressed genes in the cells are measured by PCR, or the amount of protein in the cultured cell supernatant is measured by ELISA. It is possible to select a drug that suppresses expression of the gene or gene product and suppresses liver fibrosis by performing drug screening using a method such as
  • a drug that works in the direction of enhancing this expression is selected to screen for hepatic fibrosis inhibitors.
  • a drug is added to cultured liver cells such as Kupffer cells, hepatic stellate cells, or liver parenchymal cells, and the gene expression variation in the cells is measured by PCR, or the protein content of the cultured cell supernatant is measured by ELISA.
  • drug screening or the like it is possible to select a drug that enhances the expression of the gene or gene product and suppresses fibrosis.
  • the drug selected by the screening method of the present invention is a low molecular compound, a peptide. Any of a peptide, a natural product, etc. may be sufficient.
  • the present invention further provides a screening kit that can be used in the above screening method.
  • the screening kit include a reagent containing a reagent for measuring the expression level of the gene or a reagent containing a reagent for measuring the amount of protein.
  • liver regeneration is suppressed in liver fibrosis. Suppression of liver regeneration is considered to be one of the causes of liver fibrosis, and normalizing the expression of these genes will lead to treatment of liver fibrosis.
  • CYSLTR2 Cysteinyl leukotriene receptor 2
  • LTB4R2 leukotriene B4 receptor 2
  • Liver biopsy tissue that can be obtained with the consent of the Ethics Committee and with the consent of the patient is the amount of histological examination residue, ie, diameter lmm x length 1 to 2mm. Since gene expression is not sufficient to measure globally, candidate genes were selected in advance in a rat liver fibrosis model and clinical samples were measured for candidate genes. In selecting a candidate gene in this rat model! 1) Immediately after the rat liver fibrosis model, the liver was not affected by the liver and the drug during liver inflammation (when fibrosis-inducing drug DMN was administered). In addition, RNA was prepared and gene gene p was used to measure comprehensive gene expression fluctuations. Accompanied by fibrosis!
  • liver fibrosis progresses mainly due to the involvement of three types of cells: liver cells, stellate cells, and Kupffer cells that make up the liver.
  • liver cells As the liver fibrosis progresses in the rat liver fibrosis model, the liver is collected over time, and hepatocytes, stellate cells, and Kupffer cells are separated from the collected liver, and gene expression is comprehensively measured.
  • genes whose expression changes with fibrosis genes specific for each cell (expression in other cells is 10% or less) were used as cell-specific markers. Information on the cell specificity of the gene selected in 1) was given.
  • DMN dimethylnitrosamine
  • DMN 10 mg / 2 ml / kg was intraperitoneally administered to 6-week-old rats 3 times a week for 4 weeks.
  • DMN dose was determined by conversion based on body weight measured at 9:00 on the day of administration.
  • the administration schedule is shown in Table 1.
  • Rats 0, 4, 7, 14, 21, and 28 were opened under ether anesthesia, sacrificed by exsanguination, the liver removed, compressed to a thickness of about 5 mm with a clamp, and frozen in liquid nitrogen at -80 degrees Saved with.
  • the supernatant was discarded, 70% ethanol was added to the precipitated pellet, and the pellet was rinsed by removing 70% ethanol after centrifugation at 15000 rpm at 4 ° C for 15 minutes.
  • the rinsed pellet was dried at room temperature for 5 minutes, and DEPC (jetyl pyrocarbonate) -treated water was added thereto to dissolve the pellets. It was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis that the total RNA fraction thus obtained was purified.
  • Gene Chip measurement was performed using Aifymetrix gene chip and measuring equipment. Gene chip gene analysis was performed according to the protocol recommended by Alfymetrix. The procedure is shown below.
  • double-stranded cDNA was synthesized from the prepared total RNA using SUPERSCRIPT Choice System manufactured by Gibco BRL.
  • a piotin-labeled cRNA probe was synthesized from the double-stranded cDNA synthesized above using the Bio Array High Yield RNA Transcript Labeling Kit manufactured by Enzo.
  • Double-stranded cDNA 5 1, DEPC-treated water 17 1, 10 X HY buffer 4 1, 10 X Biotin labeled ribonucleotides 4 1, 10 X DTT 4 1, 10 X RNase inhibitor mix 4 1, 20 X T7 RNA polymerase 2 ⁇ 1 was mixed and reacted at 37 ° C. for 4 hours.
  • the RNeasy mini spin column adsorbed and washed with the piotin-labeled cRNA probe as described above was transferred to a new centrifuge tube.
  • DEPC-treated water 30 / zl was added and left at room temperature for 1 minute. Centrifugation was performed at 8000 rpm for 15 seconds to elute the purified piotin-labeled cRNA probe solution.
  • the purified piotin-labeled cRNA probe solution was fragmented.
  • Mix piotin-labeled cRNA probe solution and 5 X Fragmentation buffer add 1/5 of the final solution volume) to adjust the concentration of piotin-labeled cRNA probe to 0.5 g / 1.
  • the reaction was allowed to proceed for a minute. 1% agarose gel electrophoresis was performed, and it was confirmed that the probe was fragmented to a length of about 100 bases.
  • Fragmented biotin-labeled cRNA probe 60 ⁇ g, control oligonucleotied B2 (5 nM) 1 2 1, 100 X control cRNA cocktail 12 ⁇ 1, -syn sperm DNA (10 mg / ml) 12 ⁇ 1, acetylated BSA (50 mg / mg ) 12 ⁇ l, 2 X MES hybridization buffer 600 ⁇ 1 was added and adjusted to 1200 ⁇ l with DEPC-treated water (hereinafter referred to as “hybridization cocktail”).
  • Hybridization cocktail DEPC-treated water
  • Heated denaturation cocktail was heated at 99 ° C for 5 minutes, placed at 45 ° C for 5 minutes, and then centrifuged at 15000 rpm at room temperature for 5 minutes. The supernatant was collected from a test chip (TEST2 Chip) at 80 ⁇ 1 and a rat chip (RG-U34A,) at 200 ⁇ 1 and used for hybridization.
  • the Genechip was returned to room temperature, and prehybridization was performed at 60 rpm for 10 minutes at 45 ° C in 1 X MES buffer (801 for Test2 chip, 20001 for rat chipset). Next, the pre-hybridization solution was removed, the above-mentioned heat-denatured noisy hybridization cocktail was added, and hybridization was performed at 45 ° C. for 16 hours at 60 rpm.
  • Hybridization data analysis was performed using analysis software MicroArraySuite 5.0 from Aifymetrix.
  • the expression level of each gene was expressed as a relative value (Average Differences) with the average value of the expression of all the genes as 100.
  • the gene chip probe set name is a management number corresponding to each gene, named by aflfymetrix.
  • the Gene is a collection of DNA sequences registered in GenBank for each gene (transcript) species and each organism species.
  • Rat model analysis ability Selection of hepatic fibrosis marker candidates and liver inflammation markers: Genes that change expression relative to normal rat liver gene expression change expression in the acute phase, expression change in the chronic phase Genes that change in expression in both phases.
  • the force of continuous administration of DMN on the first, second, and third days of the experiment was used.
  • the liver on the fourth day was used as a sample in the acute inflammatory phase.
  • the drug was withdrawn on the 5th, 6th, and 7th, and the liver on the 7th was designated as a sampnore in the chronic inflammatory phase.
  • One week after the start of the experiment the 8th and 8th powers were again administered 8, 9, 10 and DMN, and the 11th, 12th, 13th and 14th days were withdrawn. It was.
  • administration and withdrawal were repeated, and the livers on the 21st and 28th days were used as samples in the chronic inflammation period. It was considered that genes whose expression changes during the acute inflammation phase correspond to the active phase of hepatitis in the clinic, and genes whose expression changes during the chronic inflammation phase corresponds to hepatitis or cirrhosis in the inactive phase.
  • DMN moon dried fiber model was prepared in the same manner as above, and Kupffer cells, hepatic stellate cells, and liver parenchyma were taken from the removed liver on days 0 (normal), 4, 7, 14, 21, and 28, respectively. Cells were separated. The separation method is shown below. These separation methods are general methods for separating cells, and most of the cells are target cells, but the possibility that some other cells are mixed cannot be denied. Therefore, cell fractions separated according to the following separation method are defined as Kupffer cells, hepatic stellate cells, and liver parenchymal cells.
  • each cell (Tappa cells, liver parenchymal cells, hepatic stellate cells) was separated on days 0, 4, 7, 14, 21, and 28 after administration.
  • Liver cells were dispersed and collected by liver collagenase perfusion method and suspended in HANKs solution. The supernatant after centrifugation at 50 g for lmin is further centrifuged using an L-triator centrifuge (Hitachi CR21EZ), and the tapper cell fraction separated at a flow rate of 40 ml / min to 50 ml / min at 3250 rpm is obtained. It was collected. The suspension was suspended in RPMI 164010% FCS medium and seeded in a 6-well flat bottom plate at a cell density of 10 5 cells / ml. Incubate for 1.5-2 hr in a 37 ° C CO incubator
  • the culture medium was removed, and 1 ml of ISOGEN was collected to recover Kupffer cell RNA.
  • hepatocytes are contained in the precipitate obtained by centrifugation after perfusion with liver collagenase. Therefore, 50 ml of HANKS was added to the precipitate and washed by pipetting, and the precipitate was recovered by centrifugation at 50 g for lmin. This washing operation of HANKs was repeated 5 times. 1 ml of ISOGEN was added to the precipitate 100 1 after the final centrifugation to collect RNA from hepatocytes.
  • Liver cells were dispersed by collagenase perfusion method, layered on Nicodenz solution, and subjected to equilibrium density gradient centrifugation to collect hepatic stellate cell fraction. Adjust the cell density to 10 5 cells / ml, seed it in a 6-well flat bottom plate, and incubate for 1.5-2 hr in a 37 ° C CO incubator.
  • Hepatic stellate cell RNA was collected using 1 ml of ISOGEN.
  • a gene that satisfies all the following conditions was defined as a cell-specific expression gene.
  • the expression level is called Present at one or more of each time point. At more than one point in each time point, the expression level is more than 10 times that of other cells.
  • the gene is an expression variable gene characteristic in the acute inflammatory phase, a characteristic expression variable gene in the chronic inflammatory phase, an extracellular matrix that gradually increases in expression as the fibrosis progresses, its components, and molecules related to its generation.
  • Table 2 shows a list with various information added to the selected genes. Inflammatory classification A is increased in acute inflammation, C is increased in chronic inflammation, and AC is increased in both genes. In Refseq, the GenBank registration number of each gene is shown.
  • TGF-beta 1 and TGF-beta 3 are fibrosis markers of TGF-beta 1 that are related to the family (Flisiak R et al Hepato gastroenterology 2002, 49 (47), 1369-72, 2002, Lu LG et al World J Gastroenterol, 9 (11), 2574-8,2003)
  • TGF beta 3 is a family of beta 1, it is a different molecule and has a different role (Seong J et al, Int J Radiat Oncol Biol Phys., 46 (3): 639-4 3., 2000).
  • COLIAI collagen type I apha 1
  • COL3Al collagen type III alpha 1
  • N-terminal propeptide there is a report using detection of N-terminal propeptide as a fibrosis marker (Lu LG et al World J Gastroenterol, 9 (11), 2574-8, 2003, Leonardi S et al.
  • liver biopsy samples are classified into F1, 2, 3, and 4 representing the degree of fibrosis and Al and A2 as active periods representing the degree of active period, and A0 as inactive period (these classifications are (Determined by pathological findings at one center). A total of 37 samples were measured for each F stage, 16, 8, 7, 6 people.
  • the biopsy sample stored in ISOGENlml was stirred to remove 200 ⁇ l of black mouth form and stirred gently. After standing at room temperature for 2 minutes, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 10 minutes, and the aqueous layer was transferred to a new centrifuge tube. To this aqueous layer, an equal amount of 2-propanol was added, left at room temperature for 5 minutes, and then centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was discarded, 70 o / o ethanol was added to the precipitated pellet, and the mixture was centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C for 15 minutes, and then the 70% ethanol was removed to rinse the pellet. The rinsed pellet was dried at room temperature for 5 minutes, and DEP C (jetyl pyrocarbonate) -treated water was added thereto to dissolve the pellet.
  • DEP C jetyl pyrocarbonate
  • Quantitative PCR was performed using TaqMan MGB probe.
  • a blank means that the correlation coefficient is greater than -0.3 and less than 0.3.
  • Table 6 summarizes the strengths that can semi-iJ3 ⁇ 4U F1 and F2, F2 and F3, F3 and F4. At the same time, Table 6 shows the susceptibility to the influence of the tee (activity period). Marker genes that are less susceptible to the active period are more useful. Genetic markers (Table 6) that determine progression between F stages are diagnosed using biopsy samples or serum. When doing this, it can be used to determine stage progress. This may be useful for further classification between stages.
  • lyso zyme As a marker to determine the initial change in fibrosis (change from F1 to F2), lyso zyme, TuF beta, TGF beta 3, TNF-alpha, Biglycan, C0L3Al, Decorin, EDG2, lys yl oxidase—like 1, pieiotrophin, prion ⁇ transgelin, MTR, CYSLTR2, ID 1, JunB, can be used.
  • TNF-alpha, Decorin, and Pleiotrophin were found to be less affected by the active period.
  • lumican, P4HA1, PAI1, Prion ⁇ BHMT, GSTA1, IGF1, MAT1A, MAT2B, AHCY, LTB4R2, and MET are used as markers for determining fibrosis mid-term fluctuation (change from F2 to F3).
  • BHMT, MAT2B, and LTB4R2 were found to be less susceptible to the effects of the active period.
  • P4HA is used as a marker (change from F3 to F4) to determine the late changes in fibrosis
  • the gene expression values of all samples were classified for each fiber stage group, and a significant difference test was performed between the groups.
  • the ability to include markers that are clinically used as markers for liver fibrosis as subjects for analysis There have been no studies with the purpose of discriminating between liver fibrosis stages in detail. Two samples were t-tested, and a risk factor of 0.05 was determined to be significant.
  • Table 7 shows the genetic markers with significant differences that can be used for each discrimination.
  • Late stage discrimination F4 F1 2,3 Biglycan hepatic stellate cell deconn hepatic stellate cell
  • Glypican 3 Hepatic stellate cell tropomyosin 1 Hepatic stellate cell
  • CEBPB hepatocytes defensin beta 1 hepatocytes
  • ILl beta lysozyme ⁇ TGF beta ⁇ TGF beta 3, TNF— alpha ⁇ Biglycan ⁇ COL3Al, COL4Al, dec orin, EDG2, Glypican 3, Lumican, lysyl oxidase Lysyl oxidase—like 1, matrix la protein, MMP2, pleiotrophin, sialoprotein, transgelin, tropomyosin 1, AHCY, defensin beta 1, GSTA1, IGF1, and IL6R.
  • Calgranuli n A, ILl beta, Lysozyme, TGF beta, COL4Al, Transgelin, JunB can be used as markers for discriminating the middle stage of liver fibrosis and other stages.
  • Biglycan, decorin, Glypican «3, tropomyosin 1, then ⁇ , aefensin beta 1, uSTAK MATlA ⁇ can be used as markers for discriminating the late stage of liver fibrosis and other stages.
  • Biglycan C0L1A1, COL3Al, Shio L4Al, decorin, Glypican «3, Lumican, lysyl oxidase, lysyl oxidase—like 1, MMP2, P4HA1, PAI1, Prion ⁇ Sialoprotein AHCY, BHMT, CBS CD01, CEBP B, GSTA1, IGF1, IL6R, MAT1A, MAT2B, LTB4R2, MET can be used.
  • Kupffer cells are characterized by markers that represent inflammatory activity in the early stages of fibrosis.
  • Hepatic stellate cells are characterized by many markers that increase gradually throughout the entire fibrosis stage. This indicates that hepatic stellate cells are central cells that produce fibers. There is no early marker, indicating that hepatic stellate cells are activated as a result of early inflammation.
  • a group of genes that increase in the middle phase and decrease in expression when the growth rate reaches a steady state exists as a medium-term marker, and a characteristic marker exists as a late marker that increases in expression after the growth and differentiation reaches a steady state.
  • hepatic parenchymal cells are affected by the activity of Kupffer cells and hepatic stellate cells, the expression of genes varies, so it is logical that markers representing early, middle, late, and total fibrosis stages are evenly distributed. It is correct. Markers specific to each stage are effective for stage classification.
  • JunB, CEBPB (c / EBPbeta), IL6R (interleukin 6 receptor), MET (c-met), ID1 (Inhi bitor of DNA binding 1), and IGFl are involved in liver regeneration, and during fibrosis This decrease in expression means suppression of liver regeneration and is a meaningful marker for inhibition of liver regeneration.
  • Tables 8 and 9 show specific threshold values used for actual stage discrimination. This value is a numerical value measured by ABI PRISM 7700 Sequence Detector using TaqMan MGB probe and expressed as a relative value when the Gapdh gene expression is 1000. If the measurement device and the measurement probe are different, the numerical value changes, so correction using the standard substance (corresponding mRNA) is required.
  • Gla protein 10.13 19.33
  • stage determination can be made accurate by combining several markers.
  • discriminant analysis is to construct a linear discriminant function based on the initial sample and to predict which group (that is, which stage of liver fibrosis) the data observed in the future will belong to. Therefore, when a linear discriminant function is constructed using the obtained composite marker, it is actually often used to estimate the correct answer rate when discriminating against newly observed data in the future.
  • the validation method was used (calculation was performed using SAS standard functions).
  • Table 10 shows a list of genes that obtained a correct answer rate of 80% or higher by the cross-validation method (numbers are not ranked).
  • Table 11 shows an example of a cross-validated correct answer rate of 80% or more for composite markers and linear discriminant functions constructed using them. The ability to describe the discriminant function when performing stage discrimination using these markers. This is an example.
  • Various discriminant functions can be created by combining the markers shown in Table 10.
  • expression data is obtained using a measurement method different from this patent, or when the measurement unit of the data is different, it is generally used for observation data that does not use the coefficients of the linear discriminant function as they are. Therefore, it is necessary to standardize the data and correct the coefficients. In that case, although the coefficients are different, the predicted correct answer rate by the composite marker obtained by the above calculation is guaranteed.
  • Stagel discriminant function -9.9704 + Glypican 3 expression level X 0.00409 + transgelin expression level X 0.02573+ Pai I expression level X (-0.0457) + Prion expression level X 1.13351.
  • Stage2 discriminant function -21.178 + expression level of Glypican 3 X 0.00724 + expression level of transgelin X 0.06036 + expression level of Pai I X (-0.0881) + expression level of Prion X 1.6362.
  • Stage4 discriminant function -13.056 + expression level of Glypican 3 X 0.05668 + expression level of transgelin X (-0.0057) + expression level of Pai I X (-0.047) + expression level of Prion X 1.14014
  • the stage with the largest discriminant value is determined as the stage of liver fibrosis.
  • transgelin.prion 79.3% transgelin.prion, lumican, glypican 3,
  • LGALS1 prion, lysyl oxidase, glypican 3, PA ",
  • matrix Gla protein 77.8% matrix Gla protein, P4HA1, prion, sialoprotein, giypican 3,
  • transgelin.prion 77.8% transgelin.prion, lumican, EDG2, glypican 3,
  • transgelin.prion 77.8% transgelin.prion, lumican, glypican 3, follistatin,
  • transgelin.prion sialoprotein, glypican 3
  • transgelin.prion lysyl oxidase— like 1, lypican 3, PA ",
  • transgelin.prion lysyl oxidase, tropomyosin 1, PAI1,
  • transgelin.prion tropomyosin 1, lypican 3, PAI1
  • GOL3A1 75.7% GOL3A1 'prion, pleiotrophin, glypican 3, PAI1,
  • transgelin 75.7% transgelin, prion, lumican, pleiotrophin, glypican 3,
  • transgelin 75.7% transgelin, prion, EDG2, glypican 3, PA ",
  • transgelin 75.7% transgelin, prion, pleiotrophin, sialoprotein, glypican 3,
  • transgelin 75.7% transgelin, prion, sialoprotein, glypican 3, ⁇ ,
  • transgelin 75.7% transgelin, prion, sialoprotein, glypican 3, follistatin.
  • GALS 1 75.7% GALS 1, prion, lysyl oxidase-like 1, glypican 3, PAI1,
  • biglycan.prion sialoprotein, glypican 3, follistatin,
  • Gla protein .prion 74.6% matrix Gla protein .prion, sialoprotein, glypican 3, follistatin,
  • transgelin 74.2% transgelin, prion, pleiotrophin, glypican 3,
  • transgelin 74.2% transgelin, prion, glypican 3, follistatin,
  • GOL1 A1 transgelin, prion, pleiotrophin, glypican 3
  • COL1 A1 prion, lysyl oxidase, glypican 3, follistatin,
  • transgelin 74.2% transgelin, prion, COL4A1, glypican 3, follistatin,
  • transgelin.prion pleiotrophin, glypican 3, follistatin,
  • LGALS1 prion, pleiotrophin, lysyl oxidase, glypican 3,
  • transgelin 74.0% transgelin, LGALS1, prion, tropomyosin 1, PAI1,
  • transgelin.prion 73.7% transgelin.prion, lumican, sialoprotein, glypican 3,
  • transgelin.prion 73.7% transgelin.prion, lumican, glypican 3, PA ",
  • biglycan.prion 73.6% biglycan.prion, lumican, sialoprotein, glypican 3,
  • biglycan.prion lysyl oxidase, tropomyosin 1, PAIl,
  • transgelin.prion pleiotrophin
  • lysyl oxidase PAI1
  • prionjysyl oxidase like 1, tropomyosin 1, PAI1, follistatin.
  • transgelin.prion sialoprotein, tropomyosin 1, glypican 3,
  • LGALS1 prion, pleiotrophin, tropomyosin 1, PAIl,
  • transgelin.prion 72.6% transgelin.prion, lysyl oxidase-like 1, PAI1,
  • MMP2 transgelin, prion, glypican 3, follistatin,
  • transgelin 71.6% transgelin, prion, tropomyosin 1, glypican 3,
  • biglycan.prion pleiotrophin, sialoprotein, glypican 3
  • biglycan.prion lysyl oxidase-like 1, sialoprotein, glypican 3
  • biglycan.prion sialoprotein, glypican 3, PA ",
  • LGALS1 prion, sialoprotein, glypican 3, PAI1,
  • transgelin.prion tropomyosin 1, PAI1, follistatin,
  • LGALS1 prion, tropomyosin 1, PAI1, follistatin,
  • LGALS1 prion, glypican 3
  • GOL1A1 prion, lysyl oxidase-like 1, glypican 3,
  • COL1A1 matrix Gla protein
  • prion lysyl oxidase
  • matrix Gla protein .prion lysyl oxidase, lysyl oxidase-like 1, PAI1
  • matrix Gla protein .prion lysyl oxidase-like 1, sialoprotein

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Abstract

患者の体液又は組織中の、配列番号1～60のいずれかの塩基配列を有する遺伝子群より選ばれる１または２種以上の遺伝子、または前記塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子の発現量を測定し、該測定値に基いて肝線維化ステージを判定する。

Description

肝線維化ステージの判定方法
技術分野
[0001] 本発明は、肝臓の線維化過程にお!ヽて発現レベルが変動する遺伝子の発現量、 または該遺伝子にコードされるタンパク質の量を測定することによる、肝線維化ステ ージの詳細なる判定方法、該方法に用いる検査試薬ならびに新規肝線維化症抑制 剤およびそのスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 肝線維化においては肝臓中に異常な線維構造が生じ、進展と共に線維構造が拡 大し、最終的には肝実質細胞が中心となり構成される肝葉構造が線維により囲まれ た結節が全体に生じる。肝に流入する血液は毛細血管により肝全体に行き渡り、また 毛細血管が集合して肝より流出する。この状態が肝の健康維持と肝機能が発揮され 体全体が維持される基本であるが、線維構造による結節が生じると、この血流が肝細 部に行き渡らなくなり肝機能が十分発揮されなくなる。この結果、全身の健康が維持 できなくなり、疲労感、倦怠感が生じ、場合によっては腹水が生じたり、血中アンモ- ァ濃度が上昇する結果、脳症を引き起こしたりする。また、肝自体が受ける酸化ストレ ス、傷害と修復の繰り返し、少なくなつた肝細胞での機能維持に必要となる過剰な肝 細胞活動の亢進等が原因となって肝癌の発生頻度が上昇する。以上が肝線維化の 推移である。
[0003] 肝線維化は主としてウィルス感染が原因となる。特に C型肝炎ウィルス、 B型肝炎ゥ ィルスが原因である場合が多い。ウィルス感染が引きおこす炎症は免疫反応で沈静 化される力 ウィルスは完全に消去されない場合が多ぐ再びウィルスが増殖し炎症 力 S起きる。この繰り返しが何年も継続する。ウィルスが感染しておきる炎症を急性肝炎 、ウィルスが排除できずに炎症が継続する場合を慢性肝炎、肝炎により肝線維化が 生じて線維構造が増大し、結節が生じたり、線維構造による全身障害がおきてくる状 態を肝硬変という病名で呼んでいる。肝炎はウィルス感染ば力りでなぐ長期にわた る飲酒や薬物投与によっても生じる。脂肪が肝に蓄積する脂肪肝から線維化が生じ る場合もある。急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変と病状が増悪することと、肝線維化の進 行とはよく一致している。
[0004] 肝線維化の診断は、少量の肝臓組織を体外から刺した針で採取し、この組織検査 により肝線維化度を判定する、いわゆる肝生体検査 (略して肝生検）により行われる。 線維化度合いは線維化進行に合わせて Fl,2,3,4と分類され、 F4は肝硬変に相当す る（犬山分類といわれる慢性肝炎の肝組織学的基準における線維化の程度によるス テージング：参考資料:肝蔵病学 clinical Science医学書院 p331〜332、 第 19回 犬山シンポジウム、犬山シンポジウム記録刊行会編、中外医学社、 pl42〜188)。肝 線維化は一般に数十年をかけて次第に F1から F4へ進行する、大変ゆっくりした病気 進行である。患者の負担力 何度も行なえない肝生検で、長期に渡る肝線維化過程 を診断するのであるから、肝生検の診断が的確に病状をとらえることが要求される。こ のように肝生検は肝線維化診断の基本となる手段であるが 3つの問題がある。 1)肝 生検の判定工程においては組織標本をつくり、病理学的検査を行なうが、検査する 人の主観が診断を左右する。 F1から 4のステージ分類は診断する人や施設が変わる と同一サンプルでもステージが異なって診断される場合が少なくな 、。 2)病理学的 検査は肉眼的におこなわれる為に F1 ,2,3,4の 4段階に分類することが限界で、線維 化の進展を連続した数値ィ匕することができない。発癌の危険性が増加するのは F3と F4の中間にあるといわれており、 F3と F4の間を連続的に線維化進展を数値ィ匕するこ とが望まれている。 3)肝生検は主として線維を染色により識別し、その状態力も線維 化の程度を診断する。肝細胞の活動の結果としての線維を見て判断しており、ウィル スがすでに除去されて肝臓での線維化活動が沈静化された状態とこれから肝臓中の 細胞が活性ィ匕し、線維を産生したり、肝臓の活動が障害を受けている状態などを識 別することが出来ない。これから線維化が進展する方向に向力うの力、すでに沈静化 されて 、るのかを診断する必要がある。
[0005] これら 3つの問題点に加えるに、以下の問題点は肝生検に代わる肝線維化診断法 開発の必要性を示唆している。肝生検は肝に傷をつけるために患者への負担が大き ぐ危険を伴う。入院を伴い、患者のみならず医師の負担も大きい。肝生検の実施は 最小限の実施にとどめられており、同一患者に何度も肝生検することや線維化が軽 度であることが予想される場合は通常行なわれないため、十分な診断が出来ない。ま た肝生検は肝全体のごく一部を切り出して診断するために、サンプリングした場所に より診断が左右される。画像診断を見ながら、サンプリングは行われるがサンプリング による誤差は免れない。
[0006] そこで、これら問題点を解決した肝線維化診断法が望まれて 、る。肝生検に代わる 診断として、血清中のマーカーを測定する方法がある。線維の成分であるヒアルロン 酸やコラーゲンあるいはそのフラグメントの測定などが用いられている（非特許文献 1
〜5)。
線維由来の血清マーカーとして用いられているヒアルロン酸、は、肝線維化に対応し て血清中濃度が上昇するが、肝線維化状態を反映するば力りでなぐ肝の炎症状態 でも血清中濃度が変動するため、線維化のみを判定することが難しい (非特許文献 6 、 7)。また、血清中コラーゲン（typelll collagen, typelV collagenなどあるいはそのフ ラグメント)や laminin量は肝硬変と正常肝を区別することは出来る力 肝線維化の初 期のステージ進行を診断することが出来ない。肝線維化初期は明確な自覚症状が 無い場合も多ぐ F4以降、すなわち肝硬変になって、自覚症状が出てから肝線維化 が発見されることが通例である。 F4以降は線維化を改善することが難しぐ肝癌に進 展して死亡する確率が極めて高くなる。超音波や NMRを用いる画像診断によっては 線維構造の検出は困難であり、線維化の診断に適用できていない。
[0007] また、特許文献 1は、肝線維化マーカーとして lumican, glypican3を含む多数の肝線 維化マーカー（表 4)を開示して 、るが、これらのマーカーの発現増加と肝線維化のス テージ（Fl,2,3,4)のいずれが対応するか否力、更に、これらのマーカーが肝におけ るいかなる細胞の活動を反映しているかが不明なこともあり、肝線維化ステージの検 查方法、とりわけ初期における検査方法は未だ確立して ヽな 、と 、える。
[0008] 一方、肝線維化の進展を抑制したり、すでに存在する線維を減少させる治療薬は 存在しない。また肝線維化に伴って起きる種々の症状や新たな疾患の発生リスクを 抑制する薬剤に関しても殆ど無い。肝線維化は長期カゝかって形成される疾患であり、 発見されたときは治療困難となっていることが薬剤開発を困難にしており、その線維 化過程をモニターする手段が限られていることはこれら医薬の開発を困難なものにし ている大きな原因である。
[0009] また、臓器の線維化症は肝蔵に限らず、血管、肺、脾臓、腎臓とあらゆる臓器に生 じる。その発症の機序は必ずしも明確でないが、モノサイト系細胞 (肝ではクッパー細 胞)の活性化、これにより誘導される星細胞 (肝では肝星細胞)の活性化と線維の生 産、両者から影響される実質細胞 (肝では肝実質細胞)の障害、臓器全体への影響 t ヽぅ疾患の進行過程は ヽずれの臓器の線維化症でも共通と考えられて ヽる。これら 線維化症に対する検査'診断や治療薬の開発は肝線維化症と同様の問題点をかか えている。
非特許文献 l : Flisiak R Maxwell et al.Hepatogastroenterology, 2002 49(47), 1369-7 2
非特許文献 2 : Castera L Hartmann DJ, J Hepatol, 2000, 23(3),412- 8
非特許文献 3 : Hirayama C et al, J Gastroenterol, 1996 31(2),242-8,
非特許文献 4 : Montalto G et al, Presse Med. 1996, 20,25(2),59- 62
非特許文献 5 : Schneider M. et al, Hepatogastroenterology, 1989, 36(6), 506-10,, 非特許文献 6 : TaoJ et al World J Gastroenterol. 2003 9(11) : 2497-500
非特許文献 7 : Cai WM et al, Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2003 11(1): 23-5 非特許文献 8 : Shirai H et al, FEBS Letters 399, 1-8, 1996
特許文献 1：特開 2003-259877号公報
発明の開示
[0010] 肝線維化の各ステージに伴って発現が変動して、肝線維化の検査 '診断の指標と なりうる遺伝子又はタンパク質は知られておらず、それらの変動を指標とする肝線維 ィ匕ステージの判定方法も知られていない。また、一方で、これらの遺伝子を標的とし てその発現を変動させたり、遺伝子産物であるタンパク質の機能を抑制または促進し て正常の状態に回復させたりする薬剤のスクリーニング方法が望まれている。
従って、本発明の課題は、肝線維化過程において発現が上昇又は低下する遺伝 子あるいはタンパク質を用いる肝線維化ステージの判定方法及び検査試薬、肝線維 化過程にお!、て発現が上昇又は低下する遺伝子あるいはタンパク質の発現や活性 を制御する化合物のスクリーニング方法、肝線維化において発現が上昇又は低下す る遺伝子あるいはタンパク質を制御する肝線維化の抑制剤などを提供することにある
[0011] そこで、本発明者らは、従来は人の経験にのみ頼ってきた生体検査サンプルの組 織学的検査では出来ない正確な肝線維化ステージの判定に使用できる客観的マー カーを得ることに加えて、さらに 2つの手段により、診断精度を向上させることを考え た。
第一は、肝線維化ステージをよく反映する客観的マーカーを複数発見し、これらを 組合わせることによりさらに診断精度を向上させることである。臨床に即した多数のマ 一力一を発見する為に、まずラット肝線維化モデルの肝線維化進行過程における肝 臓の遺伝子発現を gene chipで網羅的に測定して肝線維化マーカー遺伝子を多数 同定した。さらにこれらの変動遺伝子について、定量的 PCR法を用いて、肝線維化 患者の各線維化ステージの肝生検サンプルでの遺伝子発現変動を測定するという 2 ステップの方法をとつた。患者の同意をとり、倫理委員会の同意を得て、測定に供す ることが出来る生検サンプルは極めて少量であるために、ここから質のよい RNAを十 分量調製することは容易ではなぐ gene chipで測定することは極めて困難である。そ こでラット肝線維化モデルで前もって候補遺伝子を測定し、候補を厳選することにより 、極めて少量の RNAより有効な肝線維化マーカーを数多く同定することを試みた。多 数の肝線維化マーカーがえられれば、これらを組合わせることにより肝線維化ステー ジを正確に判別することが可能になり、また肝線維化ステージを現状より細密なステ ージ分類が可能になる。さらに、発癌の危険性が大きく増大するステージ判定も、精 密に判定できる。
[0012] 第 2に、単に肝線維化に伴い増減する指標として用いるだけでなぐ各マーカーの 挙動を解釈し診断するためには、各マーカーの細胞特異性の情報など生体内での 意味付けを与えることが重要である点に着目した。上記のようにして選択した遺伝子 に各細胞特異性の情報を付加し、肝線維化過程で起きている現象を推定すること〖こ より、肝線維化進行過程での肝で生じている現象を把握し精密な検査を可能とする ことが出来る。線維化がこれからさらに進展するのか、すでに終息したの力も推定す ることがでさる。 これらの診断を可能にすべぐ鋭意検討を行った。
[0013] その結果、肝線維化のステージ毎に発現量が顕著に異なる遺伝子を見出した。本 発明者らは、これらの遺伝子又はコードされるタンパク質の量を測定することで肝線 維化ステージを正確に判定でき、さらに、これらの遺伝子又はタンパク質を利用する ことで新規な肝線維化の抑制剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った
[0014] すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)患者の組織又は体液中の、配列番号 1〜60のそれぞれの塩基配列にコードさ れるタンパク質力 なる群力 選ばれる 1種または 2種以上のタンパク質もしくは該タ ンパク質と実質的に同一のタンパク質若しくはそれらの部分ペプチドの濃度を測定 する工程と、該測定値に基いて肝線維化ステージを判定する工程を含む、肝線維化 ステージの判定方法。
(2)前記タンパク質または部分ペプチドの濃度の測定を、同一患者の複数の時点 において行う、（1)の判定方法。
(3)前記タンパク質または部分ペプチドの患者における濃度を、健常人における濃 度と比較することにより肝線維化ステージを判定する、 (1)の判定方法。
(4)前記タンパク質又は部分ペプチド濃度の測定を、ウェスタンプロット法、ェンザ ィムィムノアッセィ法、ラジオィムノアッセィ法、液体クロマトグラフィー法及びドットブロ ット法力もなる群より選択される測定方法により行うことを特徴とする、 (1)〜（3)の 、 ずれかの判定方法。
(5)患者の体液又は組織中の、配列番号 1〜60のそれぞれの塩基配列を有する遺 伝子力 なる群より選ばれる 1または 2種以上の遺伝子、または該塩基配列と実質的 に同一の塩基配列を有する遺伝子の発現量を測定する工程と、該測定値に基いて 肝線維化ステージを判定する工程を含む、肝線維化ステージの判定方法。
(6)前記遺伝子群から選択される 4種類以上の遺伝子の発現量を測定し、各遺伝 子の発現量の組み合わせに基いて肝線維化ステージを判定する、 (5)の判定方法。
(7)患者の組織が、肝臓由来の組織である、（5)または (6)の判定方法。
(8)前記遺伝子の発現量の測定を、遺伝子チップを用いる方法、 RT-PCR法、ノー ザンブロット法のいずれかの方法により行う、 (5)〜（7)のいずれかの判定方法。
(9)肝培養細胞に薬剤候補物質を添加し、配列番号 1〜60のそれぞれの塩基配 列及び該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子力 なる群力 選ば れる 1種又は 2種以上の遺伝子の前記細胞内での発現量、または、前記遺伝子によ つてコードされるタンパク質の前記細胞内の量もしくは前記細胞力 分泌される量を 測定することにより、前記遺伝子の発現量または前記タンパク質の量を変動させる物 質をスクリーニングする、肝線維化抑制剤のスクリーニング方法。
(10)配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはその部分べプチ ドから選ばれる少なくとも 1種類を含む、肝線維化抑制剤のスクリーニング用キット。
(11)配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列又はその部分配列に相補的若しくは 実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる 肝線維化抑制剤。
(12)配列番号 1〜60の 、ずれかの塩基配列の部分配列を有するセンス鎖及び該 センス鎖に相補的な配列を有する相補鎖力 なる 2本鎖 RNAを含有してなる肝線維 化抑制剤。
( 13)配列番号 1〜60の 、ずれかの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプ チドに対する抗体を含有してなる肝線維化抑制剤。
(14)配列番号 1〜60の!、ずれかの塩基配列又はその部分配列を有する DNAを含 むベクターを含有してなる肝線維化抑制のための遺伝子治療用組成物。
( 15)配列番号 1〜60の!、ずれかの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質若しくはその部分ぺプ チドに対する抗体を含有してなる肝線維化検査用試薬。
(16)配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基 配列もしくはその部分配列に相補的な配列を有するプローブ、または前記塩基配列 を有する遺伝子を増幅するためのプライマーを含有してなる肝線維化検査用試薬。 発明を実施するための最良の形態 [0015] < 1 >本発明の肝線維化ステージの判定方法
本発明の判定方法においては、まず、肝線維化の過程で発現の変動する遺伝子 の発現量、または該遺伝子によってコードされるタンパク質量を測定する。
[0016] 発現量測定の対象とする遺伝子としては、本発明において肝線維化との関連が明 らかとなつた配列番号 1〜60で表される塩基配列を有する遺伝子を使用することがで きる。具体的には、以下の遺伝子である。なお、各遺伝子については、ヒト遺伝子の tjenBankの Accession番 も^:した。
[0017] 配列番号 1： arachidonate 5- lipoxygenase- activating protein (ALOX5AP) NM— 00162
9
配列番号 2 : calgranulin A NM— 002964
配列番号 3： FAS Antigen (TNF superfamily member 6) NM— 001066
配列番号 4 : IL1 beta NM— 000576
配列番号 5： interleukin 1 receptor antagonist (IL1RN) NM— 000577
配列番号 6 : lysozyme NM— 000239
配列番号 7 : natural killer cell proteinase 1 (NK cell proteinase 1) NM— 004131 配列番号 8 : TGF beta NM— 000660
配列番号 9 : TGF beta 3 NM— 003239
配列番号 10 : TNF-alpha NM— 000594
配列番号 11： biglycan NM— 001711
配列番号 12： collagen, type I, alpha 1 (COL1A1) NM— 000088
配列番号 13： collagen, type III, alpha 1 (COL3A1) NM— 000090
配列番号 14 : collagen, typelV, alpha 1 (COL4A1) NM— 001845
配列番号 15 : decorin NM— 001920
酉己歹1 J¾=号 16 : endothelial differentiation, lysophosphatidic acid G— protein— coupled re ceptor2 (EDG2) NM— 001401
配列番号 17 :follistatin NM— 006350
配列番号 18 : glypican 3 NM— 004484
配列番号 19： hyaluronan- mediated motility receptor (HMMR) NM— 012484 配列番号 20 : lectin galactose binding soluble 1 (LGALS1) NM— 002305
配列番号 21： lumican NM— 002345
配列番号 22： lysyl oxidase NM— 002317
配列番号 23 : lysyl oxidase- like 1 NM— 005576
配列番号 24 : matrix Gla protein NM— 000900
配列番号 25： matrix metalloproteinase 2 (MMP2) NM— 004530
配列番号 26： proline 4- hydroxylase alpha polypeptide I (P4HA1) NM— 000917 配列番号 27： Plasminogen activator inhibitor- 1 (PAI1) NM— 000602
配列番号 28 : pleiotrophin NM.002825
配列番号 29： prion NM— 000311
配列番号 30 : sialoprotein NM— 000582
配列番号 31 :transgelin NM— 003186
配列番号 32 tropomyosin 1 NM— 000366
配列番号 33： betaine- homocysteine methyltransferase (BHMT) NM— 001713 配列番号 34： cystathionine- beta- synthase (CBS) NM— 000071
配列番号 35： cysteine dioxygenase, type I (CDOI) NM— 001801
配列番号 36： C/EBPbeta (CEBPB) NM— 005194
配列番号 37： cystathionase (cystathionine gamma- lyase) (CTH) NM— 001902 配列番号 38： cysteinyl leukotriene receptor 2 (CYSLTR2) NM— 020377
配列番号 39 : defensin beta 1 NM— 005218
配列番号 40： glutathione S- transferase Al (GSTA1) NM— 145740
酉己歹1 J番号 4丄： Inhibitor of DNA binding 1, helix-loop-helix protein (splice variation) (I
Dl) NM— 002165
配列番号 42 : IGF1 NM— 000618
配列番号 43： interleukin 6 receptor (IL6R) NM— 000565
配列番号 44： lipopolysaccharide binding protein (LBP) NM— 004139
配列番号 45： methionine adenosyltransferase I, alpha (MAT1A) NM— 000429 配列番号 46 : methionine adenosyltransferase II, beta (MAT2B) NM— 013283 酉己列番号 47： 5- methyltetrahydrofolate- homocysteine methyltransferase (MTR) NM —000254
配列番号 48： glutathione reductase (GSR) NM— 000637
配列番号 49 : leukotriene A4 hydrolase (LTA4H) NM— 000895
配列番号 50： JunB NM.002229
配列番号 51： cysteinyl leukotriene receptor 1 (CYSLTRl) NM— 006639
配列番号 52： leukotriene B4 receptor 2 (LTB4R2) NM— 019839
配列番号 53： leukotriene C4 synthase (LTC4S) NM— 000897
配列番号 54 : DNA (cytosine- 5-)- methyltransferase 1 (DNMTl) NM— 001379 配列番号 55： S-adenosylhomocysteine hydrolase (AHCY) NM— 000687
酉己歹 U番号 56： glutamate— cysteine ligase, catalytic subunit (GCLC) NM— 001498 配列番号 57 : gamma-glutamyltransferase 1 (GGTl) NM— 005265
配列番号 58： Hepatocyte nuclear factor 6 (HNF6) NM— 004498
配列番号 59 : c- met (MET) NM.000245
酉己歹1 J¾=号り 0： endothelial differentiation, sphingolipid G— protein— coupled receptor5 (E DG5) NM— 004230
[0018] なお、ヒトでは、人種や民族の違いなどによって遺伝子配列に多型や変異が生じる ことがあるため、本発明の判定方法において発現量測定の対象とする遺伝子は、各 配列番号で示される塩基配列と実質的に同一の配列を有する遺伝子であってもよい 。ここで、「実質的に同一」とは、例えば、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドとスト リンジェントな条件でノヽイブリダィズする遺伝子を挙げることができる。ストリンジェント な条件としては、 f列えば、、 60°C、 1 X SSC, 0. 1%SDS、好ましくは、 0. 1 X SSC、 0 . 1%SDSに相当する塩濃度で、 1回より好ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられ る。
[0019] 本発明の判定方法においては、上記遺伝子のうち、 1種類の遺伝子の発現量を測 定してもょ 、し、 2種以上の遺伝子の発現量を測定してもよ 、。
発現量の測定は、例えば、患者の組織や体液カゝら RNA (全 RNAまたは mRNA)を単 離し、 cDNAを合成したのちに、 PCR法や DNAチップで測定する方法や、生検により 得られた組織を用いて in situ染色する方法、 RNAを用いてノーザンプロット法などを 用いて行うことができる。ここで、患者の組織としては肝生検の際に得られる肝臓由来 の組織、肝より血中に離脱した肝由来細胞、各種血球などが挙げられ、体液としては 、血液、リンパ液、細胞間浸潤液、尿、涙、唾液などが挙げられる。この中でも組織は 肝生検で得られる組織が好ましぐ体液は血液が好ま ヽ。
[0020] 本発明にお ヽては、選択された遺伝子の発現量に基づ!/ヽて肝線維化ステージ (肝 線維化の進行の程度)を検査'診断することができる。判定の基礎とする発現量は、 各遺伝子の発現量の絶対値であってもよ!、が、肝線維化過程で変動しにくい遺伝子 (ダリセルアルデヒド 3リン酸脱水素酵素（GAPDH)など）の発現量で標準化した相 対値であってもよい。
[0021] 肝臓の線維化度合いは線維化進行に合わせて Fl,2,3,4と分類され、 F4は肝硬変 に相当する（犬山分類といわれる慢性肝炎の肝組織学的基準における線維化の程 度によるステージング：参考資料:肝蔵病学 clinical Science医学書院 p331〜332 、 第 19回犬山シンポジウム、犬山シンポジウム記録刊行会編、中外医学社、 pl42 〜188)。
したがって、本発明の判定方法では、この中のどのステージに分類されるかを判定 することができる。ただし、必ずしも F1〜F4の分類には制限されず、これに相当する 分類やさらに細分化された分類を使用して判定してもよい。
[0022] 本発明の判定方法では、同一患者において経時的に発現量の測定を行い、その 発現量の変動に基づいてステージの変動を判定してもよい。すなわち、上記遺伝子 はそれぞれ、ステージによって発現量が変動するため、選択した遺伝子の発現量の 変動に基づいてステージの変動を判定することができる。例えば、 biglycan遺伝子（ 配列番号 11)の場合、 F1と F2の間で有意に変動するので、同一患者の biglycan遺伝 子の発現量を逐次測定し、変動した場合に、肝線維化が F1から F2に進行したと判定 することができる。
[0023] また、 1回の測定結果からステージを判定することもできる。例えば、各遺伝子につ いて、あら力じめ、各ステージにおける発現量を数値ィ匕しておき、測定値がどのステ ージに当てはまるかを調べることにより、ステージの判定ができる。例えば、表 8や表 9 を参考にして判定することができる。
さらに、測定結果を健常人における値 (正常値)と比較することによって判定を行つ てもよ 、。上記遺伝子は 、ずれも発現量が健常人と比較して有意に減少または増加 しているため、健常人の値との比較によりステージ判定が可能である。
[0024] 本発明の判定方法においては、さらに、上記遺伝子のうちの複数の遺伝子、好まし くは 4種類以上の遺伝子の測定値を組み合わせることにより線維化ステージを判定し てもよい。複数の遺伝子を組み合わせることにより、より正確な判定が可能である。 例えば、以下のような方法が挙げられる。
すなわち、まず、選択された複数の遺伝子の発現量と各線維化ステージの間の相 関を示す、線形判別関数などの関数を構築する。ついで、各遺伝子の発現量の測 定値を該関数に当てはめてステージごとの値を算出し、その計算値を比較することに より患者の線維化がどのステージにあるかを判定することができる。なお、遺伝子の 発現量と各線維化ステージの間の相関を示す関数は通常の統計学的手法において 使用される関数を用いることができる。
線形判別関数によって導かれた判定に有効な組合わせの例を表 11〜13に示す。
[0025] 本発明の判定方法においては、さらに、肝臓が活動期にあるか否かについて判定 を行ってもよい。すなわち、上記遺伝子の中には急性炎症で増加する遺伝子が存在 し (表 2参照）、該遺伝子の発現量が増加する場合は、肝臓が活動期にあるということ が判定できる。
[0026] 本発明の判定方法においては、さらに、各遺伝子が肝臓のどの種類の細胞に由来 するかの情報に基づく判定を行ってもよい。すなわち、クッパー細胞はサイト力イン等 を産生し、炎症を誘導する役割の中心となる。星細胞は、サイト力インを産生するとと もに、線維化の原因である細胞外マトリクスを産生する役割の中心となる。肝実質細 胞は肝蔵機能の中心的役割を持ち、この機能が障害は患者の何らかの身体的異常 とつながる。
したがって、たとえばクッパー細胞の炎症に関するサイト力イン遺伝子発現が上昇し ていれば、炎症が進んでいることが推測され、星細胞の細胞外マトリクス遺伝子発現 が上昇して 、れば線維化が進行して 、ることが予測され、肝実質細胞のメチォニン 代謝酵素系遺伝子発現が低下して 、れば、患者の発癌リスクが上昇して 、ることが 予測される。これらの各細胞の機能とあわせて、肝線維化ステージの診断が可能とな る。
各遺伝子がどの細胞に由来するかについて表 2にまとめた。
[0027] なお、上記の遺伝子は肝線維化症に限らず、肝線維化を伴う各種肝疾患における 線維化程度の判定にも用いることが出来る。
例えば、
1、肝線維化力 肝癌にいたる変化の把握:肝癌を発生させる素地の進展速度の予 測、回復速度の予測
2、劇症肝炎時の肝再生力の把握:予後予測、治療選択
3、ウィルス性肝炎におけるインターフェロン治療の有効性予測
4、脂肪肝力 NASH (非ウィルス性、非アルコール性肝硬変）への進展予測 などの診断に用いることが可能である。
[0028] 線維化マーカー遺伝子の発現増加又は減少は、その産物であるタンパク質の発現 増加又は減少と概ね比例する。細胞外へ分泌されるタンパク質は当然血清中の当該 タンパク質の濃度に反映される。分泌されないタンパク質でも肝細胞の破壊により血 清中へもれ出て、血清中タンパク質濃度に反映される。
したがって、本発明の判定方法においては、上記遺伝子にコードされるタンパク質 の量を測定し、該測定値に基づ ヽて線維化の判定を行うこともできる。
[0029] 配列番号 1〜60のそれぞれの塩基配列にコードされるタンパク質のアミノ酸配列情 報は、上述した GenBankの Accession番号を参照することで入手できる。ただし、タン ノ ク質のアミノ酸配列には人種の違いなどによって置換等が生じることがあるので、 本発明の判定方法において測定対象とするタンパク質は、上記タンパク質と実質的 に同一のタンパク質であってもよい。ここで、実質的に同一のタンパク質とは、上記塩 基配列にコードされるアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸が置換、欠失、 付加された配列を有するタンパク質などをいう。なお、数個とは、 2〜20個、好ましく は 2〜10個、より好ましくは 2〜5個をいう。また、タンパク質は生体内でプロセシング を受けることがあるので、本発明にお 、て定量するタンパク質は上記タンパク質の部 分ペプチドであってもよ 、。
[0030] タンパク質を定量する場合、抗体を用いた免疫化学的検出法、例えば、ェンザィム ィムノアッセィ（ELISA)法、ラジオィムノアッセィ（RIA)法、や抗体チップ（ガラスなどの 単体に抗体を高密度にはったプロテインチップ）を用いる方法、ウェスタンプロット法 、組織切片の免疫染色による方法などを用いることができる。また、マススペクトル (M S)分析検出法を用いることも出来る。例えばチップ上あるいはカラムなどで分画後、 チップ上あるいはカラム力 の溶出液中のタンパク質を MSで分子量測定する方法に よる。さらに、液体クロマトグラフィー法やドットプロット法を採用することもできる。
[0031] 一例として、患者血清を試料に用い、血清中のタンパク質量を定量する方法につ いて述べる。
まず、マーカー遺伝子のタンパク配列をデータベースより引き出し、タンパク質表面 に向いていると予測される配列や後記の投与動物でタンパク質配列が異なる部分を 含むペプチド配列を選択する。具体的には、 Accelrys社製タンパク質立体構造予測 ソフトウェアー Insightll等でタンパク質表面に存在するペプチド部分を予測し (非特 許文献 8)、ペプチド配列を選択することが出来る。この選択されたペプチドをべプチ ド合成機などを用いて合成する。このペプチド混合物をゥサギやマウスなどの動物に 投与してペプチドに対する特異抗体を作製する。異なる配列のペプチド混合物を違 つた個体に投与して、異なる認識部位を持つ抗体を作製すると ELISA用のプレート作 製が可能となり、サンドイッチ法を用いることが出来る。これにより、 ELISAの特異性を 向上させることができるが、一種類の抗体でも ELISAを実施することができる。これら 抗体を用いて ELISA用のプレートを作製する。抗体ができれば ELISAに限らす種々の 免疫染色により検出できる。たとえば前述の抗体チップである。
血清を直接あるいは血清アルブミンなどの多量存在タンパク質を除く操作をした後 に質量分析機 (MS)で対象のタンパク質を定量することができる。 MSを用いると、完 全長のタンパク質ば力りでなぐそのフラグメントも定量することができる。
タンパク質に基く肝線維化ステージの判定は、上記の遺伝子発現量の判定と同様 にして行うことができる。
[0032] < 2>本発明の肝線維化検査用試薬 本発明の検査用試薬は本発明の判定方法に用いることのできる試薬である。遺伝 子の発現量を測定する試薬としては、例えば、配列番号 1〜60のいずれかの塩基配 列（またはその相同配列またはそれらの一部）を有する遺伝子群より選ばれる 1又は 2 種以上の遺伝子を検出するためのプローブ、または該遺伝子を増幅するためのブラ イマ一を含む試薬が挙げられる。この場合、さらに、遺伝子増幅用の酵素、ハイプリ ダイゼーシヨン用バッファーなどを含んで 、てもよ 、。
また、本発明の検査用試薬は、上記遺伝子のうち複数の遺伝子を担持した DNAチ ップであってもよい。
[0033] 一方、タンパク質量を測定する試薬としては、例えば、配列番号 1〜60の塩基配列 にコードされるタンパク質のうちの 1または 2以上のタンパク質を検出するための抗体 を含む試薬が挙げられる。この場合、さらに 2次抗体などを含むものであってもよい。 また、配列番号 1〜60の塩基配列にコードされるタンパク質のうちの 1または 2以上 のタンパク質が担持されたプロテインチップであってもよい。
[0034] < 3 >本発明の肝線維化抑制剤
本発明の肝線維化抑制剤としては、配列番号 1〜60の塩基配列のうちの 1または 2 以上の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチ ドを含む肝線維化抑制剤が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチ ォエートなどにより修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの 長さは特に制限されないが、 15〜20merが好ましい。本発明の肝線維化抑制剤は、 アンチセンスオリゴヌクレオチドがリボソームなどに包含されるものであってもよい。本 発明の肝線維化抑制剤の投与量は患者の症状などによっても異なるが、 5 mg/kg/ 日〜30mg/kg/日が好ましぐ 10〜20mg/kg/dayがより好ましい。
本発明の肝線維化抑制剤は、配列番号 1〜60の 、ずれかの塩基配列の部分配列 を有するセンス鎖及び該センス鎖に相補的な配列を有する相補鎖力 なる 2本鎖 RN Aを含有するものであってもよい。このような 2本鎖 RNAは、 RNAi (RNA interference: !? NA干渉)と呼ばれる作用により遺伝子発現を抑制することによって肝線維化を抑制 することができる。
さらに、本発明の肝線維化抑制剤は、配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列又は その部分配列を有する DNAを含むベクターを含有してなる肝線維化抑制のための遺 伝子治療用糸且成物であってもよい。ベクターとしては、アデノウイルスベクターゃレト ロウィルスベクターなどを用いることができる。
[0035] 本発明の肝線維化抑制剤はまた、配列番号 1〜60で表される塩基配列によってコ ードされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質若しくはその部分ペプチドに対する抗体を含有するものであってもよい。タンパク 質はこれをコードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、リボソームやウィルス粒 子の形で遺伝子導入し、導入された生体内細胞でタンパク質として発現させてもょ ヽ 。抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。さらに、 F (ab')化抗体や F (ab')化抗体であってもよい。抗体は通常の抗体作製法によって
2
得ることができる。
[0036] < 4 >肝線維化抑制剤のスクリーニング方法
肝線維化に伴い発現変動する遺伝子は全て創薬ターゲットとなりうる。即ち、表 3に 示される肝線維化に正相関を示すマーカー遺伝子又は当該遺伝子産物については 、この発現を抑制する方向に働く薬剤を選択することにより肝線維化抑制剤をスクリ 一-ングすることができる。例えば、クッパー細胞、肝星細胞または肝実質細胞など の肝培養細胞に薬剤を添加し、 PCRで該細胞内の発現遺伝子変動を測定したり、培 養細胞上清のタンパク量を ELISAで測定したりする方法等を用いてドラッグスクリー- ングを実施することにより、当該遺伝子又は遺伝子産物の発現を抑制し、肝線維化を 抑制する薬剤を選択することが可能である。
一方、表 3にお 、て肝線維化に負の相関を示す遺伝子又は遺伝子産物につ 、て は、この発現を増強する方向に働く薬剤を選択することにより肝線維化抑制剤をスク リー-ングすることができる。例えば、クッパー細胞、肝星細胞または肝実質細胞など の肝培養細胞に薬剤を添加し、 PCRで該細胞内の遺伝子発現変動を測定したり、培 養細胞上清のタンパク量を ELISAで測定したりする方法等を用いて、ドラッグスクリー ユングを実施することにより、当該遺伝子又は遺伝子産物の発現を増強し、肝線維 化を抑制する薬剤を選択することが可能である。
なお、本発明のスクリーニング方法によって選択される薬剤は、低分子化合物、ぺ プチド、天然物などのいずれであってもよい。
本発明はさらに、上記スクリーニング方法において用いることのできるスクリーニング キットを提供する。スクリーニングキットとしては、上記遺伝子の発現量を測定するた めの試薬又はタンパク質量を測定するための試薬を含むキットなどが挙げられる。
[0037] 具体的には、含硫アミノ酸代謝関連酵素 (表 1、配列番号 38-49)の異常は、循環器 疾患のリスクファクターとなるホモシスティンの血中濃度を上昇させることが知られて おり、また、メチル基ドナーとして重要な S-アデノシルメチォニンのメチル基転移反応 の低下を招き DNAの低メチレーシヨンをまねくことが知られて!/、る。 DNAの低メチレ一 シヨンは発癌のリスクファクターと言われている。したがって、含硫アミノ酸代謝関連酵 素発現の正常化は創薬ターゲットとなる。
JunB、 CEBPB (c/EBPbeta)、 IL6R (interleukin 6 receptor), MET (c— met)、 ID1 (Inhi bitor of DNA binding 1)、 IGFlは肝再生に関与しており、これらの発現が異常となるこ とは肝線維化において肝再生が抑制されていることを意味する。肝再生の抑制が肝 線維化症の原因の一つであると考えられており、これら遺伝子の発現を正常化するこ とは肝線維化症の治療につながる。
[0038] CYSLTR2 (Cysteinyl leukotriene receptor 2)、 LTB4R2 (leukotriene B4 receptor 2) はロイコトリェンの作用に関連し、炎症反応に関連する。これら遺伝子発現を正常化 すること又はこれらのリガンドーレセプターのシグナル伝達を正常化することは肝線 維化症の治療につながる。
実施例
[0039] 倫理委員会の承認を受け、患者の同意を得て実際入手できる肝生検組織は組織 検査の残渣、即ち直径 lmm X 長さ 1から 2mm程度の量である。遺伝子発現を網 羅的に測定するには不十分であるために、前もってラットの肝線維化モデルで候補 遺伝子を選択し、候補遺伝子に関して、臨床サンプルを測定した。このラットモデル で候補遺伝子を選択するにあたって!/、くつかの工夫を行なった。 1)ラット肝線維化モ デルにお 1ヽて肝臓を肝炎症期 (線維化誘発薬剤 DMN投与時)の肝臓と薬剤の影響 がなくなる 1週間後の肝臓を経時的に採取し、肝臓全体カゝら RNAを調整して gene chi pで網羅的遺伝子発現変動を測定した。線維化に伴!、発現変動するが肝炎症期で 変動しない遺伝子と肝炎症期のみで変動する遺伝子とに分類した。 2)肝線維化症 は主として肝臓を構成する肝細胞、星細胞、クッパー細胞の 3種の細胞が関係して病 状が進行する。ラット肝線維化モデルの肝線維化進行にともなって、経時的に肝臓を 採取し、さらに採取肝臓から肝細胞、星細胞、クッパー細胞をそれぞれ分離して遺伝 子発現を網羅的に測定し、肝線維化に伴い発現変動する遺伝子の中で、各細胞に 特異的な (他の細胞での発現が 10%以下)遺伝子を細胞特異的マーカーとした。 1) で選択した遺伝子が如何なる細胞特異性であるかの情報を付与した。
[0040] 1. DMN (dimethylnitrosamine)肝線維化モデルラットの作製及び遺伝子発現量解析 肝炎力 線維化が進行して肝硬変に到る過程のモデルとしてよく用いられる DMN 投与ラットモデルを用いて、肝における遺伝子発現の経時的変化を Gene chipで解析 した。
DMNモデルラットの作製および肝の遺伝子発現測定は以下のように行った。
1-1)ラットの飼育
CRJ社: (SD)IGSラット 6週齢を使用した。飼育条件は温度 23±3°C、湿度 50±20%、 明期 7:00〜19:00にて、 CRF-1 (オリエンタル酵母）と水の自由摂取により飼育を行つ た。
購入後 5日間の検疫期間の後、体重が等しくなるように群分けを行い 6週齢ラットに 週 3回 4週間、 DMN 10mg/2ml/kgを腹腔内投与した。 DMN投与量は投与日の 9:00 に測定した体重に基づき換算して決定した。投与スケジュールを表 1に示す。
[0041] [表 1]
表 1
Figure imgf000019_0001
[0042] 1-2)肝臓の摘出
ラットからの肝臓摘出は以下のように行った。
0、 4、 7、 14、 21、 28曰目の各ラットについてエーテル麻酔下開腹して放血屠殺し肝臓 を摘出し、クランプで約 5mmの厚さに圧縮して液体窒素で凍結し- 80度で保存した。
[0043] 1- 3)gene chip測定 1-3-1)全 RNAの精製
ラット肝臓 1グラムに対し、 10mlの ISOGEN (日本ジーン）をカ卩え、ホモジェナイズし た。得られたホモジネートを遠心し、上清を回収した。この上清に、加えた ISOGENlm 1にっき 200 1のクロ口ホルムをカ卩え、軽く撹拌した。室温に 2分放置後、 15000回転、 4°Cで 10分間遠心分離し、水層を新しい遠心チューブに移した。この水層に、それと 等量の 2-プロパノールをカ卩え、室温に 5分放置後、 15000回転、 4°Cで 15分間遠心し た。上清を捨て、沈殿したペレットに 70%エタノールを加え、 15000回転、 4°Cで 15分 間遠心後、 70%エタノールを除去することにより、ペレットをリンスした。リンスしたペレ ットを室温で 5分間乾燥させ、これに DEPC (ジェチルピロカーボネート）処理水を加え 、ペレットを溶解させた。こうして得られた全 RNA画分が精製されたことを、 1 %ァガロ ースゲル電気泳動により確認した。
Gene Chip測定は Aifymetrix社の gene chipと測定装置を用いた。 Gene Chipによる 遺伝子発現解析は、 Alfymetrix社が推奨するプロトコールに準拠して行った。以下に 手順を示す。
1-3-2)プローブ合成
(i)二本鎖 cDNA合成
まず、調製した全 RNAから、 Gibco BRL社製の SUPERSCRIPT Choice Systemを用 い、二本鎖 cDNA合成を行った。全 RNA 15 μ g、 T7- (dT) primer lOOpmolを DEPC処
24
理水に溶解し、 11 μ 1とした。 70°Cで 10分間反応後、氷冷し、 5 X 1st strand cDNA buf fer (Gibco BRL社製） 4 1、 0.1 X DTT (ジチオスレィトール、 Gibco BRL社製） 2 1、 10 mM dNTP mix (Gibco BRL社製） 1 μ 1を加え、 42°C、 2分間保温した。これに逆転写酵 素（Superscript II RT) 2 gを加えた後、 42°Cで 1時間反応させた。
前記反応液に、 DEPC処理水、 5 X 2nd strand reaction buffer 30 μ 1、 10mM dNTP 3 μ 1、 DNAリガーゼ 10U/ μ \ 1 μ \, DNAポリメラーゼ I 10U/ μ Ι μ ^ RNaseH 2U/ μ 1 をカロえて混合した後、 16°Cで 2時間反応させた。この後、 T4 DNAポリメラーゼ 5U/ 1
2 1を加え、 16°Cで 5分反応させた。これに、 0.5M EDTA 10 1を加えた。この反応 液に等量の（フエノール：クロ口ホルム = 1： 1)溶液を加え、これらが入ったチューブを 上下に振って混ぜ合わせた。この混合液を、 15000rpm、 4°Cで 10分間遠心分離し、 水層を新しい遠心チューブに移した。この水層に、 3Mの酢酸ナトリウムを 1/10量、 10 0%エタノールを 3倍量カ卩え、よく混合した。 - 80°Cで 10分放置したのち、 15000rpm、 4 °Cで 10分間遠心した。沈殿したペレットを 70%エタノールで 2回リンスし、室温で 5分 間乾燥した後、 DEPC処理水を 12 μ 1加えた。
[0045] (ii)ピオチン標識 cRNAプローブの合成
次に上記で合成した二本鎖 cDNAから、 Enzo社製 Bio Array High Yield RNA Trans cript Labeling Kitを使用して、ピオチン標識 cRNAプローブを合成した。二本鎖 cDNA 5 1、 DEPC処理水 17 1、 10 X HY buffer 4 1、 10 Xピオチン標識リボヌクレオチド（ Biotin labeled ribonucleotides) 4 1、 10 X DTT 4 1、 10 X RNase inhibitor mix 4 1、 20 X T7 RNAポリメラーゼ 2 μ 1を混合し、 37°Cで 4時間反応させた。
次に、上記のようにして合成したピオチン標識 cRNAプローブ溶液から、未反応の Bi otin labeled ribonucleotidesを、 Qiagen社製 RNeasyを使用して除いた。ビォチン標識 cRNAプローブ溶液に、 DEPC処理水 160 μ 1を加え、 RLT buffer 700 μ 1を混合し、つ いで 100%エタノール 500 μ 1を加え、よく混合した。この溶液を、 700 μ 1ずつ RNeasy m ini spin columnに加え、 8000rpmで 15秒間遠心した。溶出液を、再度 RNeasy mini spi n columnに加え、 8000rpmで 15秒間遠心した。次に、 RPE buffer 500 μ 1を RNeasy min i spin columnに加え、 8000rpmで 15秒間遠心した。再度 RPE buffer 500 μ 1を RNeasy mini spin columnにカ卩え、 15000rpmで 2分間遠心した。
上記のようにしてピオチン標識 cRNAプローブを吸着させ、洗浄した RNeasy mini spi n columnを、新しい遠心チューブに移した。この RNeasy mini spin columnに DEPC処 理水 30 /z lを加え、室温で 1分間放置した。 8000rpmで 15秒間遠心し、精製されたピオ チン標識 cRNAプローブ溶液を溶出させた。
次に、精製されたピオチン標識 cRNAプローブ溶液の断片化を行った。ピオチン標 識 cRNAプローブ溶液、 5 X Fragmentation buffer (最終溶液量の 1/5量を加える）を混 合して、ピオチン標識 cRNAプローブ濃度が 0.5 g/ 1となるよう調整し、 94°Cで 35分 間反応させた。 1%ァガロースゲル電気泳動を行い、プローブがおおよそ 100塩基前 後の長さに断片化されているのを確認した。
[0046] 1-3-3)ハイブリダィゼーシヨン ノ、イブリダィゼーシヨンは、まずテストチップ (TEST2 Chip)で断片化ビォチン標識 c RNAプローブの出来を評価し、問題がないことを確認した後に本試験を行った。本試 験には、ラットチップ（RG- U34A)を用いた。このラットチップセットには、計 7000種のラ ット既知遺伝子が含まれている。テストチップ、ラットチップセットのいずれも、以下の 手順でノ、イブリダィゼーシヨンを行った。
断片化ビォチン標識 cRNAプローブ 60 μ g、コントロール oligonucleotied B2 (5nM) 1 2 1、 100 X control cRNAカクテル 12 μ 1、 -シン精子 DNA(10mg/ml) 12 μ 1、ァセチ ル化 BSA(50mg/mg) 12 μ 1、 2 X MESハイブリダィゼーシヨンバッファー 600 μ 1を加え、 DEPC処理水で 1200 μ 1に調整した（以下、「ハイブリダィゼーシヨンカクテル」と呼ぶ） 。ノ、イブリダィゼーシヨンカクテルを 99°C、 5分加熱して熱変性を行い、 45°Cに 5分間 置いた後、 15000rpm、室温で 5分間遠心した。上清を、テストチップ（TEST2 Chip)で は 80 μ 1、ラットチップ（RG- U34A,)では 200 μ 1分取し、ハイブリダィゼーシヨンに使用 した。
Genechipを室温にもどし、 1 X MES buffer(Test2 chipは 80 1、ラットチップセットは 2 00 1)、 45°Cで 10分、 60rpmでプレハイブリダィゼーシヨンを行った。次に、プレハイ ブリダィゼーシヨン液を除去し、前記の熱変性させたノヽイブリダィゼーシヨンカクテル を添加し、 45°C、 16時間、 60rpmでハイブリダィゼーシヨンを行った。
[0047] 1-3-4)洗浄、染色及びスキャニング
Gene chip力らノヽイブリダイゼーシヨンカクテノレを除去し、 non stringent wash bufferを 入れ、 Fluidic station (Aifymetrix社製）にて洗浄及び染色を行った。洗浄及び染色は 、 Test2 Chipでは Fluidic stationの Mini_euklプロトコールに従い、ラットチップでは Eu kGE-WS2プロトコールに従って行った。洗浄及び染色終了後、スキャナ一にてチッ プのスキャニングを行 、、画像データを取り込んだ。
[0048] 1-3-5)データ解析
ハイブリダィゼーシヨンのデータ解析は、 Aifymetrix社の解析ソフト MicroArraySuite 5.0によって行った。各遺伝子の発現量は、全遺伝子の発現の平均値を 100とし、そ れに対する相対値（Average Differences)で表した。表中、ジーンチッププローブセッ ト名は、 aflfymetrix社によって命名された、各遺伝子に対応する管理用背番号である 。ュ-ジーンは GenBankに登録された DNA配列を、遺伝子 (転写産物)種ごと、及び 生物種ごとにまとめたものである。
[0049] 2.ラットモデル解析力 肝線維化マーカー候補および肝炎症マーカーの選択： 正常ラット肝の遺伝子発現に対して発現変動している遺伝子を急性期に発現変動 する遺伝子、慢性期に発現変動する遺伝子、両方の期で発現変動する遺伝子に分 した。
表 1に示すように、実験開始 1, 2, 3日目に DMNを連続投与する力 4日目の肝を 急性炎症期のサンプルとした。 5日、 6日、 7日と休薬し、 7日の肝を慢性炎症期のサ ンプノレとした。実験開始 1週間後、 8曰力ら再び 8、 9、 10曰と DMNを投与し、 11曰、 1 2日、 13日、 14日と休薬し、 14日の肝を慢性炎症期のサンプルとした。同様に投与 と休薬を繰り返し、 21日、 28日の肝を慢性炎症期のサンプルとした。急性炎症期に 発現変動する遺伝子は臨床では肝炎の活動期に対応し、慢性炎症期に発現変動す る遺伝子は臨床では非活動期の肝炎または肝硬変に対応すると考えた。
[0050] 急性炎症期 (活動期) Z慢性炎症期 (非活動期）に特徴的マーカー遺伝子選択は 以下のように行った。
DMN投与肝線維化モデルラットの Gene Chip解析データを用いて、 DMN投与 0日 目力ら 28日目までの経時的発現変動が（1)少なくとも 1点以上で Present (Presentとは MicroArray Suite 5.0により統計的有意な発現値であることを示す。信頼性が低い場 合は Absentと判定した。）、かつ、（2) 0日目と比べて 1.5倍以上発現変動する遺伝子 を抽出した。続いて、 GeneSpringソフトウェアの K- meansクラスタリング法を用いること により、特徴的な 10種類の変動パターンを作成し、その変動パターンに相関の高い 遺伝子を抽出した。この処理によって、投与 4日目のみで発現変動している遺伝子ク ラスター (急性炎症期特徴的マーカー遺伝子）、投与 4日目と後期の両方で発現変 動して 、る遺伝子クラスター (急性炎症期および慢性炎症期 、ずれにも発現変動す るマーカー遺伝子）、後期のみで発現変動して 1ヽる遺伝子クラスター (慢性炎症期特 徴的マーカー遺伝子）に分類を行った。
[0051] 3.ラットモデル解析力 得た肝線維化マーカー候補および肝炎症マーカー候補の 細胞特異性情報の付与： 上記同様に DMN月干線維ィ匕モデノレを作成し、 0日（正常）、 4日、 7日、 14日、 21日、 28日にそれぞれ、摘出肝から、クッパー細胞、肝星細胞、肝実質細胞を分離した。 分離法を以下に示す。これら分離方法は各細胞を分離する一般的な方法で、大部 分の細胞は目的の細胞であるが、多少他の細胞が混入している可能性は否定でき ない。よって下記分離法に従って分離した細胞画分をクッパー細胞、肝星細胞、肝 実質細胞と定義する。
[0052] 3-1)ラット肝臓力もの各細胞分離手順
•DMN投与肝線維化モデルラットより、投与 0、 4、 7、 14、 21、 28日目に各細胞（タツパ 一細胞、肝実質細胞、肝星細胞)の分離を行った。
[0053] 3-1-1)クッパー細胞の分離
肝コラゲナーゼ灌流法により肝臓細胞を分散し回収して HANKs液に懸濁した。 50g で lmin遠心後の上清について、さらにエルトリエーター遠心機（日立 CR21EZ)を用い て遠心分離を行 、、回転数 3250rpmで流量 40ml/minから 50ml/minで分離されるタツ パー細胞画分を回収した。 RPMI 164010%FCS培地に懸濁し、細胞密度を 105 cells/ml として、 6穴平底プレートに播種した。 37°Cの COインキュベーター内で 1.5〜2 hr培養
2
してプレートに接着。培地を除き ISOGEN 1mlをカ卩えてクッパー細胞 RNAを回収した。
[0054] 3-1-2)肝実質細胞
クッパー細胞を分離する時に、肝コラゲナーゼ灌流後の遠心で得られる沈殿に肝 実質細胞が含まれる。そこでこの沈殿に HANKSを 50ml添カ卩してピペッティングによる 洗い操作を行い、 50gで lmin遠心して沈殿を回収した。この HANKsの洗い操作を 5回 繰り返した。最後の遠心後の沈殿 100 1に ISOGEN 1mlを加えて肝実質細胞の RNA を回収した。
[0055] 3-1-3)肝星細胞
コラゲナーゼ灌流法により肝臓細胞を分散し、 Nicodenz溶液に重層して平衡密度 勾配遠心を行い、肝星細胞画分を回収した。細胞密度を 105 cells/mlに調整して 6穴 平底プレートに播種し、 37°Cの COインキュベーター内で 1.5〜2 hr培養してプレート
2
に接着させた。 ISOGEN 1mlをカ卩えて肝星細胞の RNAを回収した。
[0056] 3-2)細胞特異的マーカー： 3-2-1)各細胞特異的遺伝子抽出のための Gene Chipデータ解析
各細胞別 Gene Chipデータに対して、以下の条件を全て満たす遺伝子を各細胞特 異的発現遺伝子とした。
(1)各時点のうち 1点以上で発現量が Presentとコールされている。各時点のうち 1点 以上で、他の細胞よりも 10倍以上の発現量の差をもつ。
(2)各時点のうち 1点以上で、 0日目と比較して 2倍以上発現量が変動する。
肝線維化過程で変動する遺伝子をさらに細胞特異的に分類した。
[0057] 3-3-)ラットモデルカ 肝線維化症における診断マーカー候補の選択：
上記の解析結果から、急性炎症期に特徴的発現変動遺伝子、慢性炎症期に特徴 的発現変動遺伝子、線維化進行に伴い次第に発現増加する細胞外マトリクス、その 成分およびその生成に関連する分子と考えられる遺伝子などを診断マーカーとして 選択し、また肝線維化症抑制剤のターゲットとして有望と思われる遺伝子を選択した 。選択した遺伝子に対して、種々の情報を付加したリストを表 2に示す。炎症期分類 の Aは急性炎症で増カロ、 Cは慢性炎症で増カロ、 ACは両方で増加する遺伝子を示す 。 Refseqでは、各遺伝子の GenBankの登録番号を示した。
[0058] [表 2-1]
表 2
Figure imgf000026_0001
[表 2-2] 35 CD01 NM.052809 NM— 001801 一 肝実質細胞 含硫アミノ酸代謝系
36 CEBPB NM.024125 NM— 005194 一 肝実質細胞 肝再生関連
3フ CTH NM.017074 N .001902 一 肝実質細胞 含硫アミノ酸代謝系
38 CYSLTR2 N J 33413 N .020377 一 肝実質細胞 □ィコトリ工ン合成系
39 defensin beta 1 NM_031810 刚—005218 A 肝実質細胞 炎症関速
40 GSTA1 圖 _031509 NM一 145740 一 肝実質細胞 . 含硫アミノ酸代謝系
41 ID1 N _012797 一 002165 AC 肝実質細胞 肝再生関連
42 IGF1 N J 78866 NM_000618 - 肝実質細胞 肝再生関連
43 IL6R ^017020 NM.000565 - 肝実質細胞 肝再生関連
44 LBP XM— 346679 刚—004139 A 肝実質細胞 炎症関連
45 AT1A XM— 346484 NM.000429 一 肝実質細胞 含硫アミ/酸代謝系
46 MAT2B ― NM.013283 ― 肝実質細胞 含硫アミノ酸代謝系
47 MTR NM_030864 NM— 000254 - 肝実質細胞 含硫ア 酸代謝系
48 GSR XM.344528 N _000637 AC 一 含硫ア 酸代謝系
49 LTA4H XM.235057 N .000895 AC - ロイコトリ 3：ン合成系
50 JunB NM.021836 NM.002229 A ― 肝再生
51 CYSLTR1 NM— 053641 NM— 006639 ― ― ロイコトリ Iン合成系
52 LTB4R2 NM.053640 N .019839 - ― ロイコトリ Iン合成系
53 LTC4S NM— 053639 NM_000897 - - ロイコトリ!ン合成系
54 DNMT1 N .053354 NM— 001379 一 一 含硫アミノ酸代謝系
55 AHCY NM.017201 NM— 000687 ― 一 含硫アミノ酸代謝系
56 GCLC NM.012815 刚— 001498 一 一 含硫アミノ酸代謝系
57 GGT1 J05515 NM— 005265 - - 含硫アミノ酸代謝系
58 HNF6 NM.022671 NM— 004498 一 一 肝再生関連
59 MET XM-346692 NM— 000245 一 一 肝再生関連
60 EDG5 圖— 017192 NM.004230 ― 一 ― 表 2のリストの中で以下に示す遺伝子は既に肝線維化マーカーとしての報告があり 、ポジティブコントロールとして取り上げた。 TGF-beta 1と TGF-beta 3はファミリ一関 係にある TGF- beta 1の線維化マーカーとしての記述多くある（Flisiak R et al Hepato gastroenterology 2002, 49(47), 1369—72, 2002, Lu LG et al World J Gastroenterol, 9(11), 2574-8,2003) TGF beta 3は beta 1のファミリーではあるが違う分子であり、異な る役割を持つ報告がある (Seong J et al, Int J Radiat Oncol Biol Phys. , 46(3):639- 4 3., 2000)。 TGF-beta3の臨床的肝線維化マーカーとしての意義を示した報告は無い 。 proline-4-hydroxylaseは肝線維化マーカーとして有効でな 、と V、う報告が少なくな いが (Mazzoran L et al, Eur J Gastroenterol Hepatol., 10(2): 125-31, 1998，、 Fabris C et al, Ann Clin Biochem, 34 ( Pt 2): 151-5， 1997.)、肝線維化診断マーカーとしの 有用性を示す報告もある (Okabe K. et al.Rinsho Byori. 1992 Dec;40(12): 1258-64、 L eonardi S et al, Med Pediatr Oncol, 41(1), 17—20,2003)。 COLIAI (collagen type I a lpha 1)に関しては線維化マーカーとして C末端プロペプチドの検出（コラーゲンは細 胞外分泌直後に N末端と C末端力 プロペプチドが切り取られる）を用いた報告が多 V、が診断マーカーとしての有効性の報告は多くな 、。複合マーカーとしての有用性 がしめされて 、る（Lin DY, Dig Dis Sci. 40(1):21- 7、 1995)。 COL3Al(collagen type III alpha 1)に関しては線維化マーカーとして N末端プロペプチドの検出を用いた報 告があり（ Lu LG et al World J Gastroenterol, 9(11), 2574—8,2003、 Leonardi S et al, Med Pediatr Oncol, 41(1), 17- 20,2003)臨床診断に用いられている。 COL4Al(colla gen type IV alpha 1)は線維化マーカー複合指標の一部として (Lu LG et al World J Gastroenterol, 9(11), 2574-8,2003)線維化初期の線維化マーカーとしての有用性の 記述があり、臨床診断にもちいられている。 （Matsumoto E et al, Acta Pathol Jpn, 39( 4), 217-23, 1989), MMP2(matrix metalloproteinase 2)は肝線維化マーカーとしての 可能性が報告されている Boeker KH et al、 Clin Chim Acta. 316,:71- 81 , 2002J, Ko bayashi H et al, Pediatr Surg. 37(7): 1030—3., 2002) 0
[0060] 4,臨床サンプルの測定
次に、上記で選択された遺伝子について、臨床力も得たヒトの肝生検サンプルでの 遺伝子発現を測定した。肝生検サンプルは線維化の程度を表す F1 , 2, 3, 4の分類 と活動期の程度をあらわす活動期として Al , A2 ,非活動期として A0の分類がなされ ている（これらの分類は一施設の病理所見で判定された)。各 Fステージそれぞれ 16 、 8、 7、 6人、計 37サンプルを測定した。
[0061] 4-l) RNAの抽出
ISOGENlml中に保存された生検サンプルを攪拌して 200 μ 1のクロ口ホルムをカロえ、 軽く撹拌した。室温に 2分放置後、 15000回転、 4°Cで 10分間遠心分離し、水層を新し い遠心チューブに移した。この水層に、それと等量の 2-プロパノールをカ卩え、室温に 5分放置後、 15000回転、 4°Cで 15分間遠心した。上清を捨て、沈殿したペレットに 70 o/oエタノールを加え、 15000回転、 4°Cで 15分間遠心後、 70%エタノールを除去するこ とにより、ペレットをリンスした。リンスしたペレットを室温で 5分間乾燥させ、これに DEP C (ジェチルピロカーボネート）処理水を加え、ペレットを溶解させた。 [0062] 4- 2) cDNA合成
ABI社の High- capacity cDNA Archive kitを用いた。プロトコールは説明書に従った
10 X RT Buffer 10 1、 NTP 4ul、 random primer 10 1、 Multiscribe RT 5 1、 RNaseO UT 2.5 μ 1、 DEPC water 18.5 μ 1、 RNA(1 ^ g) 50 ^ 1を混合して、 25°Cで lOmin反応し 、さらに 37°Cで 120min反応した。
[0063] 4-3)遺伝子発現解析
TaqMan MGB probeを用いて定量的 PCRを行った。
各遺伝子について、 20 X Target Assay Mix, cDNA template, 2 X Taqman Universa 1 Master Mix 12.5ulを調製し、 PCR反応を行った。反応条件は、 50°C2min→95°C10m in→ (95°C15sec→60°Clmin) X 40サイクルとした。また、各遺伝子の発現量は、 Gapd h遺伝子の発現を 1000としたときの倍率で示した。
[0064] 4-4) t-検定による線維化ステージ進行の判定マーカー選択
それぞれの臨床マーカー候補遺伝子について、全検体の遺伝子発現値を各線維 ィ匕ステージ群ごとに分類し、各群間の有意差検定を行った。解析対象に臨床ですで に肝線維化マーカーとして用いられているマーカーもふくまれる力 肝線維化ステー ジ間の詳細な判別する目的で検討された例はないので、これらも含めて解析した。 2 標本の t-検定を行い、危険率 pく 0.05を有意差ありと判定した。各 Fステージ間で有 意差がつく遺伝子に関して臨床サンプル解析をまとめた (表 3)。各遺伝子の略称は 上述したとおりである。
[0065] [表 3]
表 3.遺 変動の難t テージ間の有意差^ ¾ ※厶。◊これらの印がついナ： Fステージ間は； 差あり (Pく 0.05)
Figure imgf000030_0001
また Fステージ間で有意差があった遺伝子に関して、各 Fステージごとに Αステージ (急性炎症)とのピアソン相関係数を算出した。 テージと相関に低い遺伝子を表 4 に、相関の高い遺伝子を表 5に示した
[0067] [表 4] 表 4. 各 Fス亍ージにおいて、 A分類 (活動期）と相関の低い肝線維化マ一カーとその相関係数
Figure imgf000031_0001
F4の中での計算は F4サンプルにおいて非活動期の割合が少なく信頼性にとぼしい為、表記しない。 空欄は相関係数が 0.3以上または- 0.3以下を意味する。
[0068] [表 5] 表 5. 各 Fステージ (こおいて A分類 (活動期）と相関の高い肝線維化マーカー
Figure imgf000032_0001
F4の中での計算は F4サンプルにおし、て非活動期の割合が少なく信頼性にとぼしい為、表記しない。
空欄は相関係数が- 0.3より大きく、 0.3より小さいことを意味する。 表 3, 4, 5に示した結果力ら、 F1と F2、 F2と F3, F3と F4を半 iJ¾Uすることの出来るマ 一力一を表 6にまとめた。同時に テージ (活動期）の影響の受けやすさを表 6に表 示した。活動期の影響を受けにくいマーカー遺伝子がより有用である。 Fステージ間 の進行を判定する遺伝子マーカー (表 6)は生検サンプルまたは血清を用いた診断を する際に、ステージ進行を判定するに用レ、ることができる。ステージ間の更に詳細な 分類を行うに有用と考えられる。
[表 6]
表 6. 線維化ステージ間の判別の為のマ一カー遺伝子
Figure imgf000033_0001
o 活動期の影饗を識別する両方のステージで受けにくい
厶 活動期の影眢を識別する片方のステージで受けやすい
活動期の影饗を識别する両方のステージで受けやすい [0071] 以上より、線維化の初期変動（F1から F2への変動）を判定するマーカーとして、 lyso zyme、 TuF beta、 TGF beta 3、 TNF— alpha、 Biglycan、 C〇L3Al、 Decorin、 EDG2、 lys yl oxidase— like 1、 pieiotrophin、 prion ^ transgelin、 MTR、 CYSLTR2、 ID 1、 JunB、 を用いることができる。特に、 TNF- alpha、 Decorin、 pleiotrophin,は活動期の影響を 受けにくいことがわ力つた。
[0072] また、線維化の中期変動（F2から F3への変動）を判定するマーカーとして、 lumican 、 P4HA1、 PAI1、 Prionゝ BHMT、 GSTA1、 IGF1、 MAT1A、 MAT2B、 AHCY、 LTB4R2、 MET,を用いることができる。特に BHMT、 MAT2B、 LTB4R2、は活動期の影響を受け にくいことがわかった。
[0073] さらに、線維化の後期変動を判定するマーカー（F3から F4への変動）として、 P4HA
1、 prionを用いることができることがわかった。
[0074] 4-5) t-検定による線維化ステージ判定マーカーの選択
それぞれの臨床マーカー候補遺伝子について、全検体の遺伝子発現値を各線維 ィ匕ステージ群ごとに分類し、各群間の有意差検定を行った。解析対象に臨床ですで に肝線維化マーカーとして用いられているマーカーもふくまれる力 肝線維化ステー ジ間の詳細な判別する目的で検討された例はないので、これらも含めて解析した。 2 標本の t-検定を行い、危険率 pく 0.05を有意差ありと判定した。
[0075] 以下の群間の有意差を検定した。
1、肝線維化初期ステージとそれ以外のステージを判別する（F1と F2, 3, 4)
2、肝線維化中期ステージとそれ以外のステージを判別する（F2, 3と F1, 4)
3、肝線維化後期ステージとそれ以外のステージを判別する（F4と F1, 2, 3)
4、肝線維化ステージの前半と後半を判別する（F1, 2と F3, 4)
各判別に用いることの出来る有意差を持つ遺伝子マーカーを表 7に示した。
[0076] [表 7-1] 表 7. 単一マーカーによる肝線維化ステージ判別
Figure imgf000035_0001
[表 7-2] 後期ステージ判別 F4 F1 ,2,3 Biglycan 肝星細胞 deconn 肝星細胞
Glypican 3 肝星細胞 tropomyosin 1 肝星細胞
CEBPB 肝実質細胞 defensin beta 1 肝実質細胞
GSTA1 肝実質細胞 AT1A 肝実質細胞 肝線維化前半と後半 F1 ,2 F3,4 Biglycan 肝星細胞 の判別 COし 1A1 肝星細胞
COL3A1 肝星細胞
COL4A1 肝星細胞 decorin 肝星細胞
Glypican 3 肝星細胞
Lumican 肝星細胞 lysyl oxidase 肝星細胞 lysyl oxidase-like 1 肝星細胞 MP2 肝星細胞
P4HA1 肝星細胞
PAI1 肝星細胞
Prion 肝星細胞
Sialoprotein 肝星細胞
AHCY 肝実質細胞
BHMT 肝実質細胞
CBS 肝実質細胞
CD01 肝実質細胞
CEBPB 肝実質細胞
GSTA1 肝実質細胞
IGF1 肝実質細胞
IL6 肝実質細胞
MAT1A 肝実質細胞
MAT2B 肝実質細胞
LTB4R2 ―
MET 一 以上をまとめると、以下のことがわかった。 肝線維化初期ステージとそれ以外のステージを判別するマーカーとして、 ILl beta 、 lysozymeゝ TGF betaゝ TGF beta 3、 TNF— alphaゝ Biglycanゝ COL3Al、 COL4Al、 dec orin 、 EDG2、 Glypican 3、 Lumican、 lysyl oxidase 、 lysyl oxidase— like 1 、 matrix la protein 、 MMP2、 pleiotrophin 、 sialoprotein、 transgelin、 tropomyosin 1、 AHCY、 defe nsin beta 1、 GSTA1、 IGF1、 IL6R、を用いることができる。
肝線維化中期ステージとそれ以外のステージを判別するマーカーとして、 calgranuli n A、 ILl beta, Lysozyme, TGF beta, COL4Al、 Transgelin、 JunB、を用いることがで きる。
肝線維化後期ステージとそれ以外のステージを判別するマーカーとして、 Biglycan 、 decorin 、 Glypican «3、 tropomyosin 1、 し βΒΡΒ、 aefensin beta 1、 uSTAK MATlAゝ を用いることができる。
肝線維ィ匕ステージの前半と後半を判別するマーカーとして、 biglycan, C0L1A1、 C OL3Al、 し〇L4Al、 decorin 、 Glypican «3、 Lumican、 lysyl oxidase 、 lysyl oxidase— like 1 、 MMP2、 P4HA1、 PAI1、 Prionゝ Sialoproteinゝ AHCY、 BHMT、 CBSゝ CD01、 CEBP B、 GSTA1、 IGF1、 IL6R、 MAT1A、 MAT2B、 LTB4R2、 MET,を用いることができる。
[0078] 表 6および 7に示した判別マーカーに細胞特異性の情報を付加した。クッパー細胞 は線維化初期ステージの炎症活動を表すマーカーが特徴的である。肝星細胞は全 線維化ステージわたって次第に増加するマーカーが多 、ことが特徴である。これは 肝星細胞が線維を産生する中心的細胞であることを示している。初期マーカーは存 在せず、肝星細胞が初期炎症の結果活性化されることを示している。中期に増加し、 増殖分ィ匕が定常状態になると発現が低下する遺伝子群が中期マーカーとして、増殖 分化が定常状態となつてから発現増加する後期マーカーとして特徴的マーカーが存 在する。これらはステージ分類に重要な意味をもつ。肝実質細胞ではクッパー細胞 や肝星細胞の活動の影響を受けて、遺伝子発現が変動すると考えると、初期、中期 、後期および全線維化ステージを表すマーカーが均等に分散していることは理にか なっている。各ステージに特異的マーカーはステージ分類に有効である。
[0079] 例えば、一連の含硫アミノ酸代謝関連酵素である BHMT、 CBS、 CD01、 GSTA1、 M AT1A、 MAT2B、 MTR、 AHCYをコードする遺伝子の発現が線維化ステージ前半から 後半へ以降する時期にほぼ同調して発現低下することは特筆される。肝線維化にお いて血中メチォニンが上昇することが報告されているが、これら代謝酵素の活性低下 と関連すると思われる。含硫アミノ酸代謝関連酵素は線維化ステージ進行に連動す る重要な診断マーカーである。
[0080] JunB、 CEBPB (c/EBPbeta)、 IL6R (interleukin 6 receptor), MET (c— met)、 ID1 (Inhi bitor of DNA binding 1)、 IGFlは肝再生に関与しており、線維化過程でこれら発現が 低下することは、肝再生の抑制を意味しており、肝再生阻害に関する意味あるマーカ 一である。
このようにマーカーの細胞特異性と線維化ステージ特異性双方を考慮すると各マ 一力一を用いた肝線維化過程の肝の状態をより詳細に診断を下すことができる。
[0081] 実際にステージ判別するに際し用いる具体的閾値を表 8および 9に示した。この値 は ABI PRISM 7700 Sequence Detectorにより、 TaqMan MGB probeを用いて測定し、 Gapdh遺伝子発現を 1000とした場合の相対値として表示した数値である。測定装置、 測定プローブが異なると、数値が変化するために標準物質 (対応 mRNA)を用いた補 正が必要となる。
[0082] [表 8-1]
表 8. ステージ'判別に用いる閱値 (BO*信頼点)
F2一 3 F3一 4 F1— 234 34 F123一 4 F14— 23 遗伝子名 以下 以上 以下 以上 以下 以上 以下 以上 以下 以上 以下 以上 以下 以上
COL4A1 19.08 47.62 20.54 36.14 20.94 50.04
JunB 36.12 55.48 39.23 54.41
Transgelin 11.83 41.63 17.74 41.2 21.03 46.61
Lysozyme 166.35 503.01 226.27 438.87 254.87 503.19
TGF beta 53.55 86.29 55.99 82.99 60.41 90.19 calgranulin A 14.17 21.67
IL1 beta 2.73 3.77 2.93 4.07
MAT1A 329.08 699.12 424.15 702.51 328.57 591.43
CEBPB 212.3 318.62 161.83 281.65
Biglycan 185.64 243.6 197.73 260.53 173.89 263.61 220.12 269.34
decorin 235.74 311.4 268.83 362.23 218.73 363.59 303.77 383.71
Gtypican 3 19.74 82.6 -14.63 93.09 51.97 98.83
defensin beta 1 367.08 532.48 422.82 563.08
tropomyosin 1 29.39 75.33 42.45 80.99
GSTA1 1969.21 3197.1 2194.53 2898.91 2314.24 3291.14 1987.07 2809.67
COL1A1 14.98 35.84
lysyl oxidase 0.85 1.67 0.79 1.47
PAH 8.24 46.24 11.35 24.71
CBS 262.14 443.48
BHMT 767.83 1261.4 795.83 1354.25
CD01 66.01 94.09
AHCY 94.15 115.53 93.84 127.86 89.12 150.22
P4HA1 14.12 41.46 12.63 21.33 21.84 33.24
MP2 14.22 24.88 9.41 24.85
COし 3A1 130.62 200.8 150.5 312.92 141.5 260.7
Prion 18.37 24.37 16.33 22.21 13.55 17.35 16.36 20.36
IL6R 100.19 159.63 100.92 186.06
IGF1 31.19 49.15 32.82 53.64 30.38 67.52
MET 49.04 85.28 51.68 94.32
Lumican 25.6 79.54 32.17 62.55 25.72 53.26
MAT2B 94.91 141.83 101.04 142.12
LTB4R2 2.15 2.95 2.2 3
lysyl oxidase-like 1 0.61 1.55 1.09 2.03 0.79 1.85
Sialoprotein 13.14 38.14 12.12 29.52
MTR 9.25 13.47
ID 1 341.38 824.78
CYSLTR2 0.74 2.2
EDG2 1.42 2.6 1.69 2.63
TNF-alpha 2.01 4.83 2.38 3.74
Pleiotrophin 2.47 3.79 2.53 3.69
TGF beta 3 3.2 4.94 3.36 5.16
matrix Gla protein 10.13 19.33
ABI PRISM 7700 Sequence Detectorにより、 TaqMan MGB probeを用いて測定し、 Gapdh遺伝子発現を 1000とした場合の相対値として表示した。
表 9. ステージ'判別に用いる闆値 (9554信頼点)
F1一 2 F2— 3 F3_4 F1— 234 ' F123— 4 :::¾■:¾ F14_?3. :
遣伝子名 以下 以上 以下 以上 以下 以上 以下 以上 以下 以上 以下 以上 以下 以上
C0L4A1 1.51 65.19 11.7 44.98 4.54 66.44
JunB 23.75 67.85 30.84 62.8 transgelin 62.53 4.19 54.75 6.74 60.9 lysozyme 739.03 107.94 557.2 116.66 641.4
TGF beta 30.61 109.23 40.61 98.37 43.77 106.83 calgranulin A 10.04 25.8
IL1 beta 2.17 4.33 2.3 4.7 AT1A 79.33 948.87 273.11 853.55 151.17 768.83
CEBPB 153.72 377.2 86.81 356.67
biglycan 146.35 282.79 160.88 297.38 124.3 313.2 181.35 308.11
decorin 190.42 356.72 214.5 416.56 139.95 442.37 240.81 446.67
Glypican 3 121.3 154.13 11.38 139.42
defensin beta
1 271.59 627.97 312.36 673.54
tropomyosin 1 2.43 102.29 12.1 111.34
GSTA1 1213.43 3952.85 1802.49 3290.95 1781.79 3823.59 1410.36 3386.38
COL1A1 3.21 47.61
lysyl oxidase 0.37 2.15 0.42 1.84
PAI1 76.17 4.09 31.97
CBS 163.52 542.1
BH T 464.03 1565.19 492.82 1657.26
^83900 せΦ) ¾^一^ θ8446004〜〜〜-
Figure imgf000042_0001
ABI PRISM 7700 Sequence Detectorにより、 TaqMan MGB probeを用いて測定し、 Gapdh遺伝子発現を 1000とした場合の相対値として表示した。
すに有効である。単独ではステージ判断が困難でも、いくつかのマーカーを組み合 わせることによりステージ判断を正確にすることができる。
[0085] 4-4) , 4-5)で用いた単独マーカー選択を目的とした統計解析法とは別の、複数マ 一力一を用いて線維化ステージ判別式を作るに適した統計解析法を採用した。対象 とするマーカー遺伝子は表 1に示す全遺伝子を用いた。解析対象に臨床ですでに 肝線維化マーカーとして用いられているマーカーもふくまれる力 複合指標として肝 線維化ステージの詳細な判別する目的で検討された例はないので、これらマーカー も含めた解析を行った。
[0086] 複数のマーカーによる線維化ステージを予測する判別式をつくるために、多群の線 形判別法を用いた。線形判別関数の導出は，得られた観測値と各群の平均との間 のマハラノビスの汎距離が，最小となるような群に判別しょうという考え方に基づいた 。統計パッケージの SASにより、総計 37肝生検サンプルの 62遺伝子について、最大 5 遺伝子までの組み合わせたマーカーによる線形判別式の予測式を計算し、肝線維 ィ匕ステージを予測できる遺伝子を探した。
判別分析の目的は、初期標本に基づいて線形判別関数を構築し、将来観測される データがどの群（つまり、肝線維化のどのステージ）に属するものであるかを予測する ことである。そこで、得られた複合マーカーにより、線形判別関数を構築した場合、将 来新たに観察されたデータに対して判別を行ったときの正答率を推定するに、実際 上よく使われて 、る交差検証法 (Cross-validation method)を用いた (SASの標準機能 により計算を行った)。
交差検証法で 80%以上の正答率が得られた遺伝子の一覧は表 10に示した (番号は 順位ではない)。
[0087] [表 10] 表 1 0. 80%以上の交差検証済み正答率を与える複合マーカー
Figure imgf000044_0001
複合マーカーとそれらを用いて構築した線形判別関数の交差検証法済みの正答 率 80%以上の例として、表 11に示した。これらのマーカーを用いてステージ判別す る場合の判別関数を記する力 これは一例で、表 10に示すマーカーの組み合わせ で種々の判別関数を作ることが出来る。また、本特許と異なる測定方法を用いて発現 のデータが得られた場合、あるいはデータの測定単位が異なる場合、線形判別関数 の係数をそのまま使うではなぐ観測データに対して、一般に使われてレ、るデータの 基準化を行い、係数の修正が必要である。その場合、係数が異なるものの、以上の 計算で得られた複合マーカーによる予測正答率は保証されている。 P T/JP2005/014757
44
[表 11]
表 1 1 . 正答率 80%以上のマーカ一組み合わせ
Figure imgf000045_0001
例えば、 prion, glypican 3, Pai I, transgelinの 4遺伝子で線形判別関数を構築した 場合、本研究のデータから、 4ステージの判別関数は以下のように計算され、
Stagelの判別関数 = -9.9704 + Glypican 3の発現量 X 0.00409 + transgelinの発現 量 X 0.02573+ Pai Iの発現量 X (- 0.0457) + Prionの発現量 X 1.13351。
Stage2の判別関数 = -21.178 + Glypican 3の発現量 X 0.00724 + transgelinの発現 量 X 0.06036+ Pai Iの発現量 X (-0.0881) + Prionの発現量 X 1.6362。
Stage3の判別関数 = -7.6521 + Glypican 3の発現量 X 0.00513 + transgelinの発現 量 X 0.07092+ Pai Iの発現量 X 0.05417 + Prionの発現量 X 0.71611。
Stage4の判別関数 = -13.056 + Glypican 3の発現量 X 0.05668 + transgelinの発現 量 X (- 0.0057)+ Pai Iの発現量 X (- 0.047) + Prionの発現量 X 1.14014
この四つのマーカーの観測値をそれぞれの式に代入した結果、一番大きい判別値 が得られたステージは肝線維化のステージと判断する。
[0091] 次に、各細胞特異的遺伝子に限定して、同様に解析をおこなった。クッパー細胞特 異的遺伝子（10種)、肝星細胞特異的遺伝子 (22遺伝子)、肝実質細胞（15遺伝子 )を対象として解析した。クッパー細胞および肝実質細胞特異的遺伝子に限定すると 、高い正答率が得られないが、肝星細胞特異的遺伝子に限定すると、高い正答率が 得られた。肝星細胞特異的遺伝子に限定した場合で、交差検証法で 70%以上の正答 率を与える遺伝子の一覧は表 12に示した。複合マーカーとしてそれらを用いて構築 した線形判別関数の交差検証法済みの正答率の例として、表 13に示した。
[0092] [表 12]
表 1 2.正答率 70%以上を与える肝星細胞特異的複合マーカー
1 Biglycan
2 COL1A1
3 COL3A1
4 COL4A1
5 Decorin
6 EDG2
7 Follistatin
8 Glypican 3
9 HMMR
10 LGALS1
11 Lumican
12 lysyl oxidase
13 lysyl oxidase - like 1
14 matrix Gla protein
15 M P2
16 P4HA1
17 PA"
18 pleiotrophin
19 Prion
20 Sialoprotein
21 Transgelin
22 tropomyosin 1 ]
正答率 70%以上を与える肝星細胞特異的複合マーカーの組み合わせ
Figure imgf000048_0001
[表 13- 2] 80.9% decorin .prion, EDG2, sialoprotein, glypican 3，
80.9% decorin .prion, EDG2, glypican 3, PA" ,
80.9% decorin .prion, pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3,
80.9% decorin .prion, pleiotrophin , glypican 3， PAI1 ,
80.9% decorin .prion, HMMR, sialoprotein, glypican 3,
80.9% decorin .prion, HMMR, glypican 3, PAI1 ,
80.9% decorin .prion, lysyl oxidase— like 1, glypican 3, PAI1,
80.9% decorin .prion, sialoprotein, tropomyosin 1, glypican 3,
80.9% decorin .prion, tropomyosin 1 , lypican 3， PA" ,
80.9% decorin .prion, glypican 3, PAI1 , follistatin,
80.9% matrix Gla protein .prion, glypican 3, PA" , follistatin,
80.9% P4HA1, prion, lysyl oxidase-like 1, lypican 3, PAI1,
80.3% prion.glypican 3, PAI1,
80.3% biglycan, prion, glypican 3, PA" ,
80.3% LGALSl, prion, glypican 3, PAI1,
80.3% prion.tropomyosin 1, lypican 3, PAIl,
80.3% biglycan,し GALS 1, prion, glypican 3, PAI1,
80.3% biglycan.prion, pleiotrophin， glypican 3, PA",
80.3% biglycan,prion, lysyl oxidase , glypican 3, PAI1,
80.3% M P2.LGALS1, prion, glypican 3, PAI1,
80.3% LGALS1, prion, tropomyosin 1, lypican 3, ΡΑΠ,
80.3% prion.pleio rophin , tropomyosi 1 , glypican 3， PAI1,
80.3% prion/tropomyosin 1 , glypican 3, PAI1 , follistatin,
79.8% COL1A1.P4HA1, prion, glypican 3, PAI1,
79.8% matrix Gla protein .prion, pleiotrophin , glypican 3, PAIl,
79.8% P4HA1, prion, pleiotrophin， glypican 3, PAI1,
79.8% P4HA1, prion, HMMR, glypican 3, PA",
79.8% transgelin.prion, HMMR, glypican 3, PAI1 ,
79.8% LGALSl, prion, HMMR, glypican 3, PAI1 ,
79.8% prion'HMMR, lysyl oxidase , glypican 3, PAI1,
79.3% COL3A1 , rion, glypican 3,
79.3% prion.sialoprotein, glypican 3,
79.3% decorin ,P4HA1, prion, glypican 3,
79.3% decorin ,COし 3A1, prion, glypican 3,
79.3% decorin .transgelin, prion, glypican 3,
79.3% decorin , prion, lysyl oxidase-like 1, glypican 3，
79.3% MP2,prion, glypican 3, PAI1,
79.3% transgelin.prion, lumican, glypican 3,
79.3% prion.sialoprotein, glypican 3, follistatin,
79.3% COL1A1, decorin , matrix Gla protein , prion, glypican 3,
79.3% GOし 1A1 , decorin , M P2, prion, glypican 3,
79.3% COL1A1.M P2, COL3A1, prion, glypican 3,
79.3¾ COL1A1.COL3A1, LGALS1, prion, glypican 3,
[表 13-3] 79.3% COL1 A1.COL3A1 , prion, glypican 3, follistatin,
79.3% COL1A1 ,し GALS1 , prion, glypican 3, PA" ,
79.3% decorin .matrix Gla protein , COL3A1 , prion, glypican 3,
79.3% decorin .matrix Gla protein , transgelin, prion, glypican 3,
79.3% decorin .matrix Gla protein , prion, lumican, glypican 3,
79.3% decorin .matrix Gla protein , prion, sialoprotein, glypican 3，
79.3% decorin .matrix Gla protein , prion, glypican 3, PAI1,
79.3% decorin ,P4HA1 , COL3A1 , prion, glypican 3,
79.3% decorin ,P4HA1 , prion, glypican 3, PAI1 ,
79.3% decorin ,M P2, COL3A1 , prion, glypican 3，
79.3% decorin ,MMP2, prion, sialoprotein, glypican 3,
79.3% decorin ,M P2, prion, glypican 3, PAI1 ,
79.3% decorin ,COL3AI , prion, HMMR, glypican 3,
79.3% decorin ,COL3A1 , prion, lysyl oxidase， glypican 3,
79.3% decorin ,COL3A1 , prion, sialoprotein, glypican 3,
79.3¾ decorin .transgelin, prion, lumican, glypican 3,
79.3% decorin 'transgelin, prion, EDG2, glypican 3,
79.3% decorin .prion, lysyl oxidase , sialoprotein, glypican 3,
79.3% decorin .prion, lysyl oxidase， glypican 3, PAI1，
79.3% decorin .prion, lysyl oxidase-like 1， sialoprotein, glypican 3,
79.3% matrix Gla protein .prion, lysyl oxidase , glypican 3, PAI1 ,
79.3% P4HA1 , prion, lumican, sialoprotein, glypican 3,
79.3% MMP2,prion, pleiotrophin , glypican 3, PAIl,
79.3% prionjumican, sialoprotein, glypican 3, follistatin,
78.9% transgelin, prion, COL4A1 , glypican 3, PAI1 ,
78.7% biglycan,prion, tropomyosin 1 , PA" ,
78.7% prion'lysyl oxidase , glypican 3, PAI1 ,
78.7% prion.glypican 3, PAI1 , follistatin,
78.7% matrix Gla protein .prion, tropomyosin 1 , lypican 3, PAI1 ,
78.7% P4HA1 , prion, glypican 3, PAI1, follistatin,
78.7% biglycan,LGALS1 , prion, pleiotrophin , PAI1 ,
78.7% biglycan,LGALS1 , prion, tropomyosin 1 , PAI1,
78.7% LGALS1 , prion, lysyl oxidase , glypican 3, PA",
78.7% し GAし S1 ,prion， glypican 3, PAI1 , follistatin,
78.3% biglycan.prion, EDG2, glypican 3, PA",
78.2% matrix Gla protein ,MMP2, prion, tropomyosin 1 , PAI1 ,
77.8% P4HA1 , prion, lysyl oxidase-like 1 , lypican 3,
77.8% COL3A1.prion, pleiotrophin , glypican 3,
77.8% COL3A1.prion, lysyl oxidase , glypican 3,
77.8% COL1A1, matrix Gla protein , P4HA1, prion, glypican 3,
77.8% COL1A1.P4HA1 , prion, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
77.8% COL1A1.COL3A1 , prion, HMMR, glypican 3,
77.8% decorin ,COL3A1 , prion, pleiotrophin , glypican 3,
[表 13-4] 77.8% decorin .C0L3A1 , prion, lysyl oxidase - like 1 , glypican 3,
77.8% decorin ,prion, sialoprotein, glypican 3, follistatin,
77.8% matrix Gla protein ,P4HA1 , prion, sialoprotein, giypican 3,
77.8% P4HA1 ,COL3AI , prion, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
77.8% P4HA1.prion, lumican, lysyl oxidase , glypican 3,
77.8% P4HA1.prion, sialoprotein, glypican 3, follistatin,
77.8% transgelin.prion, lumican, EDG2, glypican 3,
77.8% transgelin.prion, lumican, glypican 3, follistatin,
77.3% transgelin.prion, sialoprotein, glypican 3,
77.3% prion,COL4A1, glypican 3, ΡΑΠ ,
77.3% prion.lumican, sialoprotein, giypican 3,
77.3¾ prion, lysyl oxidase-like 1, glypican 3, PAI1 ,
77.3% COL1A1.decorin , prion, tropomyosin 1 , lypican 3,
77.3% COL1A1 ,COL3A1 , prion, glypican 3, PA" ,
77.3% COL1A1.prion, lysyl oxidase-like 1 , lypican 3, PAI1 ,
77.3% decorin .COL3A1 , prion, lumican, glypican 3,
77.3% decorin .prion, COL4A1 , tropomyosin 1 , lypican 3，
77.3% decorin ,prion, COL4A1 , glypican 3, PAI1 ,
77.3% decorin .prion, pleiotrophin , lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
77.3% decorin .prion, sialoprotein, glypican 3, PAI1 ,
77.3% matrix Gla protein .prion, COL4A1 , glypican 3, PAI1 ,
77.3% COL3A1.transgelin, prion, glypican 3, ΡΑΠ ,
77.3% transgelin.prion, lysyl oxidase— like 1, lypican 3, PA",
77.3% prion,COL4A1 , lumican, glypican 3, PAI1 ,
77.3% prion,COL4A1, pleiotrophin , glypican 3, PA",
77.3% prion,COL4A1 , HMMR, glypican 3, PAI1 ,
77.3% prionjysyl oxidase-like 1, glypican 3, PA", follistatin,
77.2% biglycan, prion, pleiotrophin , PAI1 ,
77.2% P4HA1, prion, lysyl oxidase , glypican 3, PAI1 ,
77.2% transgelin.prion, lysyl oxidase , tropomyosin 1 , PAI1 ,
77.2% transgelin.prion, tropomyosin 1 , lypican 3, PAI1 ,
76.7% prion,lumican, glypican 3,
76.7% decorin .prion, lumican, glypican 3，
76.7% biglycan.prion, sialoprotein, glypican 3,
76.7% COL1A1.biglycan, COL3A1 , prion, glypican 3,
76.7¾ COL1 A1 , biglycan, prion, glypican 3, PAI1 ,
76.7% COL1 A1, prion, tropomyosin 1 , glypican 3, PAI1 ,
76.7% decorin .biglycan, prion, sialoprotein, glypican 3,
76.7% decorin ,biglycan, prion, sialoprotein, follistatin,
76.7% decorin .biglycan, prion, glypican 3, PAI1,
76.7% matrix Gla protein , biglycan, prion, glypican 3, PAI1 ,
76.7% biglycan,COL3A1, prion, HMMR, glypican 3,
76.7% biglycan.prion, HMMR, sialoprotein, glypican 3,
[表 13- 5] 76.7% biglycan.prion, glypican 3, PA" , follistatin,
76.7% COL3A1.prion, tropomyosin 1 , glypican 3, PA【1 ,
76.7% COL3A1 , prion, glypican 3, PAI1 , follistatin,
76.7% prion.lysyl oxidase - like 1, tropomyosin 1, lypican 3, PAI1,
76.6% P4HA1 ,MMP2, prion, glypican 3, PAI1 ,
76.2% matrix Gla protein .COL3A1 , prion, glypican 3,
76.2% matrix Gla protein .prion, sialoprotein, glypican 3,
76.2% P4HA1.COL3A1 , prion, glypican 3,
76.2% P4HA1.prion, sialoprotein, glypican 3,
76.2% MMP2.COL3A1, prion, glypican 3,
76.2% COL3A1 , prion, HMMR, glypican 3,
76.2% prion.HMMR, sialoprotein, glypican 3,
76.2% COL1A1 , decorin , P4HA1 , prion, glypican 3,
76.2% COL1A1, decorin , prion, glypican 3, follistatin,
76.2% COL1A1.matrix Gla protein , COL3A1 , prion, glypican 3,
76.2% COL1A1 ,P4HA1 , COL3A1 , prion, glypican 3,
76.2% COL1A1 ,COL3A1 , prion, pleiotrophin , glypican 3,
76.2¾ COL1A1.COL3A1 , prion, lysyl oxidase- like 1, glypican 3,
76.2% decorin ,P4HA1 , prion, lysyl oxidase— like 1 , glypican 3,
76.2% decorin ,P4HA1 , prion, sialoprotein, glypican 3,
76.2% decorin ,M P2, prion, lumican, glypican 3,
76.2% decorin ,COL3A1 , prion, glypican 3, follistatin,
76.2% decorin .transgelin, prion, pleiotrophin , glypican 3,
76.2% decorin .transgelin, prion, tropomyosin 1 , lypican 3,
76.2% decorin .prion, lumican, lysyl oxidase , glypican 3,
76.2% matrix Gla protein .COL3A1 , prion, HMMR, glypican 3,
76.2% matrix Gla protein .prion, HMMR, sialoprotein, glypican 3,
76.2% P4HA1.COL3A1 , prion, HMMR, glypican 3,
76.2% P4HA1.transgelin, prion, lumican, glypican 3,
76.2% P4HA1 , transgelin, prion, sialoprotein, glypican 3,
76.2% P4HA1 , prion, lysyl oxidase , glypican 3, follistatin,
76.2% MP2,COL3A1 , prion, glypican 3, PAI1 ,
76.2% MMP2,prion, HMMR, glypican 3, PAI1 ,
76.2% COL3A1.prion, lysyl oxidase , lysyl oxidase— like 1， glypican 3,
76.2% prion.HMMR, sialoprotein, glypican 3, follistatin,
75.7% transgelin.prion, glypican 3,
75.7% COL1 A1 , decorin , prion, glypican 3,
75.7% COL1A1.transgelin, prion, glypican 3,
15.，％ COL1A1, prion, sialoprotein, glypican 3,
75.7% decorin .matrix Gla protein , prion, glypican 3,
75.7% decorin .prion, EDG2, glypican 3,
75.7% COL3A1 , prion, lumican, glypican 3,
75.7% COL3A1.prion, sialoprotein, glypican 3,
[表 13- 6] 75.7% transgelin, prion, COL4A1 , glypican 3,
75,7% LGALS1, prion, sialoprotein, glypican 3,
75.7% prion, pleiotrophin， sialoprotein, glypican 3,
75.7% COL1A1Tdecorin , LGALS1 , prion, glypican 3,
75.7% COL1A1.decorin， prion, lumican, glypican 3,
75.7% GOL1A1 , decorin， prion, H MR, glypican 3,
75.7% COL1A1 , decorin , prion, lysyl oxidase， glypican 3，
75.7% GOし 1A1 , decorin , prion, sialoprotein, glypican 3,
75.7% COL1A1 ,P4HA1 , prion, lumican, glypican 3，
75.7% COL1A1 ,P4HA1 , prion, glypican 3, follistatin,
75.7% COL 1 A 1 ,transgelin, prion, C0L4A1, glypican 3,
75.7% COL1A1 , transgelin, prion, glypican 3， follistatin,
75.7% COLIAl .prion, lumican, glypican 3， follistatin,
75.7% COLIAl .prion, sialoprotein, glypican 3, follistatin,
75.7% decorin ,matrix Gla protein， prion, lysyl oxidaseHike 1 , glypican 3，
75.7% decorin .P4HA1 , prion, lumican, glypican 3,
75.7% decorin .COL3A1 , transgelin, prion, glypican 3,
75.7% decorin .COL3A1,し GALS 1, prion, glypican 3,
75.7% decorin .transgelin, prion, glypican 3, follistatin,
75.7% decorin .LGALS1 , prion, sialoprotein, glypican 3，
75.7% decorin ,prion, COL4A1 , lumican, glypican 3,
75.7% decorin , prion, COL4A1 , lysyl oxidase - like 1 , glypican 3,
75.7% matrix Gia protein .prion, sialoprotein, glypican 3， PAI1 ,
75.7% P4HA1.COL3A1 , prion, lumican, glypican 3,
75.7% P4HA1 , prion, COL4A1 , lumican, glypican 3,
75.7% P4HA1 'prion, COL4A1 , glypican 3, follistatin,
75.7% P4HA1 , prion, lysyl oxidase一 Hke 1 , sialoprotein, glypican 3，
75.7% MP2.COL3A1 , prion, lysyl oxidase , tropomyosin 1，
75.7% MMP2，し GAし S1 , prion, lysyl oxidase , glypican 3,
75.7% MP2,prion, lumican, lysyl oxidase， glypican 3，
75.7% COL3A1.transgelin, prion, COL4A1, glypican 3,
75.7% COし 3A1 ,prion, lumican, pleiotrophin , glypican 3,
75.7% GOL3A1 'prion, pleiotrophin , glypican 3, PAI1 ,
75.7% COL3A1 , prion, lysyl oxidase - like 1, glypican 3, ΡΑΠ ,
75.7% COL3A1.prion, sialoprotein, glypican 3, follistatin,
75.7% transgelin, prion, lumican, pleiotrophin , glypican 3，
75.7% transgelin, prion, EDG2, glypican 3， PA" ,
75.7% transgelin,prion, pleiotrophin， sialoprotein, glypican 3，
75.7% transgelin, prion, sialoprotein, glypican 3， ΡΑΠ ,
75.7% transgelin, prion, sialoprotein, glypican 3， follistatin.
75.7% し GALS 1 , prion, lysyl oxidase - like 1, glypican 3, PAI1,
75.7% LGAし S1 'prion, sialoprotein, glypican 3， follistatin,
75.7% prion,COL4A1 , glypican 3， PAI1 , follistatin,
[表 13-7] 75.7% prionjumican, pleiotrophin， sialoprotein, glypican 3，
75.7% prionjumican, lysyl oxidase， sialoprotein, glypican 3，
75.7% prionjumican, glypican 3, PAI1 , follistatin,
75.7% prion.pleiotrophin， sialoprotein, glypican 3, PAI1 ,
75.7% prion.pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3， follistatin,
75.7% prionjysyl oxidase， lysyl oxidase-like 1， glypican 3, PAI1 ,
75.7% prionjysyl oxidase-like 1， sialoprotein, glypican 3, follistatin,
75.6% P4HA1 , prion, glypican 3， PAI1 ,
75.6% matrix Gla protein .LGALS1 , prion, glypican 3, PAI1,
75.6% P4HA1 tbiglycan, prion, glypican 3, PA【1 ,
75.6% MMP2，transgelin, prion, tropomyosin 1， PAIl ,
75.2% P4HA1.prion, lumican, glypican 3，
75.2% prionjumican, lysyl oxidase— like 1 , glypican 3，
75.2% COL1A1.decorin , matrix Gla protein , prion, follistatin,
75.2% COL1A1 tCOL3A1 , prion, tropomyosin 1， glypican 3，
75.2% decorin ,P4HA1 , biglycan, prion, glypican 3，
75.2% decorin ,P4HA1 , prion, glypican 3, follistatin,
75.2% decorin .biglycan, COL3A1, prion, glypican 3，
75.2% decorin .prion, lysyl oxidase-like 1， tropomyosin 1， glypican 3,
75.2% decorin .prion, sialoprotein, tropomyosin 1, follistatin,
75.2% matrix Gla protein，biglycan, prion, tropomyosin 1 , PAIl ,
75.2% P4HA1 ,COL3A1, prion, glypican 3, follistatin,
75.2% big!ycan，GOL3A1， prion, glypican 3， follistatin,
75.2% biglycanrtransgelin, prion, glypican 3, PAIl ,
75.2% biglycan,prionr pleiotrophin , tropomyosin 1， PA" ,
75.2% biglycan.prion, HMMR, glypican 3, PAI1 ,
75.2% biglycan.prion, sialoprotein, glypican 3， follistatin,
75.2% prionjysyl oxidase， tropomyosin 1 , lypican 3, PAI1 ,
74.6% P4HA1,transgelin, prion, glypican 3,
74.6% COL3A1 , prion, EDG2, glypican 3，
74.6% COL3A1 , prion, lysyl oxidase - like 1， glypican 3,
74.6% COL1 A1.MMP2, prion, tropomyosin 1 , ΡΑΠ ,
74.6% COL1A1.COL3A1, prion, lysyl oxidase , glypican 3，
74.6% matrix Gla protein .COL3A1 , prion, pleiotrophin， glypican 3，
74.6% matrix G!a protein .prion, lumican, EDG2, glypican 3,
74.6% matrix Gla protein ,prion, EDG2, sialoprotein, glypican 3,
74.6% matrix Gla protein .prion, sialoprotein, glypican 3， follistatin,
74.6% P4HA1 ,COL3A1, prion, pleiotrophin， glypican 3, フ 4.6% P4HA1.LGALS1, prion, sialoprotein, glypican 3，
74.6¾ MMP2.COL3A1 , prion, pleiotrophin， glypican 3,
74.6% CO L3A1.prion, pleiotrophin， HMMR, glypican 3,
74.6% COL3A1 , prion, pleiotrophin， lysyl oxidase， glypican 3,
74.6% COL3A1 , prion, HMMR, lysyl oxidase， glypican 3，
[表 13-8] 74.6% prionjumican, lysyl oxidase , glypican 3, follistatin,
74.6% prion,EDG2, lysyl oxidase , sialoprotein, glypican 3,
74.6% prion, lysyl oxidase , sialoprotein, glypican 3, follistatin,
74.2% COL1A1 , prion, glypican 3,
74.2% decorin .prion, glypican 3,
74.2% COU A1丄 GALS1 , prion, glypican 3,
74.2% COL1A1.prion, lumican, glypican 3，
74.2% COL1A1 , prion, pleiotrophin， glypican 3，
74.2% COL1 A1 , prion, lysyl oxidase , glypican 3,
74.2% COL1A1.prion, glypican 3, follistatin,
74.2% decorin ,し GALS1 , prion, glypican 3,
74.2¾ decorin .prion, HMMR, glypican 3,
74.2% transgelin, prion, pleiotrophin， glypican 3,
74.2% transgelin, prion, glypican 3, follistatin,
74.2% し GAし S1 ,prion, lysyl oxidase , glypican 3，
74.2% prion,COL4A1 , lumican, glypican 3,
74.2% prion,COL4A1, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
74.2% COL1A1 , decorin , prion, pleiotrophin , glypican 3,
74.2% COL1A1 , decorin , prion, lysyl oxidase-like 1 , lypican 3,
74.2% COL1A1, transgelin, LGALS1 , prion, glypican 3,
74.2% GOL1 A1 , transgelin, prion, pleiotrophin , glypican 3,
74.2% COL1A1.LGALS1 , prion, pleiotrophin , glypican 3,
74.2% COL1 A 1 , LGALSl, prion, glypican 3, follistatin,
74.2% COL1 A1 , prion, lumican, pleiotrophin , glypican 3,
74.2% GOL1 A1 , prion, lumican, HMMR, glypican 3,
74.2% COLlAl .prion, lumican, sialoprotein, glypican 3,
74.2% COL1 A1 , prion, EDG2, glypican 3, PAI1 ,
74.2% COL1A1 , prion, pleiotrophin , lysyl oxidase , glypican 3，
74.2% COL1A1 , prion, pleiotrophin · glypican 3， follistatin,
74.2% COL1 A1 , prion, lysyl oxidase , glypican 3, follistatin,
74.2% decorin .matrix Gla protein , P4HA1 , prion, glypican 3,
74.2% decorin .matrix Gla protein , prion, EDG2, glypican 3,
74.2% decorin .transgelin, LGALS1 , prion, glypican 3,
74.2% decorin .transgelin, prion, sialoprotein, glypican 3,
74.2% decorin ,LGALS1, prion, lysyl oxidase-like 1, lypican 3,
74.2% decorin ,LGALS1 , prion, glypican 3, follistatin,
74.2% decorin .prion, lumican, glypican 3, follistatin,
74.2% matrix Gla protein ,prion, EDG2, glypican 3, ΡΑΠ ,
74.2% MP2,prion, lysyl oxidase , lysyl oxidase-like 1 , lypican 3,
74.2% COL3A1.prion, lumican, lysyl oxidase , glypican 3,
74.2% COL3A1.prion, pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3,
74.2% COL3A1.prion, HMMR, glypican 3, PAI1 ,
74.2% COL3A1.prion, lysyl oxidase , sialoprotein, glypican 3,
[表 13- 9] 74.2% COL3A1.prion, lysyl oxidase , glypican 3, PA" ,
74.2% transgelin, prion, GOし 4A1 , pleiotrophin， glypican 3,
74.2% transgelin, prion, COL4A1, glypican 3, follistatin,
74.2% transgelin.prion, pleiotrophin , glypican 3, follistatin,
74.2% transgelin.prion, HMMR, sialoprotein, glypican 3,
74.2% LGALS1 , prion, pleiotrophin , lysyl oxidase , glypican 3,
74.2% prion,COL4A1, lumican, pleiotrophin , glypican 3,
74.2% prion,COL4A1, lumican, tropomyosin 1, PAI1 ,
74.2% prion,COL4Al, lumican, tropomyosin 1, follistatin,
74.2% prion,COL4A1, lumican, glypican 3, follistatin,
74.2% prion, COL4A1, lysyl oxidase— like 1， tropomyosin 1 , ΡΑΠ ,
74.2% prion, COL4A1, sialoprotein, glypican 3, PAtl,
74.2% prion.pleiotrophin , lysyl oxidase - like 1, glypican 3, PAI1 ,
74.2% prion'lysyl oxidase , sialoprotein, glypican 3, PAIl,
74.0% MMP2, transgelin, prion, PAI1 ,
74.0% prion,EDG2, tropomyosin 1, PAI1 ,
74.0% P4HA1,biglycan, prion, tropomyosin 1 , PAI1 ,
74.0% P4HA1,LGALS1 , prion, glypican 3, PAI1,
74.0% P4HA1.prion, EDG2, glypican 3, PAI1,
74.0% P4HA1, prion, tropomyosin 1, glypican 3, PAI1,
74.0% transgelin, LGALS1, prion, tropomyosin 1 , PAI1 ,
73.7% COL1A1.COL3A1 , prion, COL4A1, glypican 3,
73.7% COL1A1.COL3A1 , prion, lumican, glypican 3,
73.7% COL1A1, prion, lumican, glypican 3, PAI1,
73.7% decorin .prion, EDG2, lysyl oxidase— like 1 , glypican 3，
73.7% COL3A1.transgelin, prion, lumican, glypican 3，
73.7% COL3A1 , prion, COL4A i, lumican, glypican 3,
73.7% transgelin.prion, lumican, sialoprotein, glypican 3,
73.7% transgelin.prion, lumican, glypican 3, PA"，
73.6% prion.glypican 3,
73.6% decorin，し GAし S1 , prion,
73.6% biglycan.prion, PAI1，
73.6% prion.lysyl oxidase— like 1 , lypican 3,
73.6 biglycan,LGALS1 , prion, PA".
73.6% COL3A1 , prion, glypican 3, follistatin,
73.6% prionjumican, HMMR, glypican 3,
73.6» prion,EDG2, glypican 3, PAIl,
73.6% decorin .prion, lumican, HMMR, glypican 3,
73.6% decorin .prion, lumican, lysyl oxidase - like 1, lypican 3,
73.6% matrix Gla protein ,P4HA1, COL3A1, prion, glypican 3,
73.6% matrix Gla protein ,P4HA1, prion, lumican, glypican 3,
73.6% P4HA1 , prion, lumican, lysyl oxidase-like 1， glypican 3,
73.6% P4HA1 , prion, pleiotrophin , lysyl oxidase-like 1, glypican 3,
[表 13 - 10] 73.6% biglycan,COL3A1, prion, lysyl oxidase - like 1， lypican 3,
73.6% biglycan.transgelin, prion, tropomyosin 1, PAI1,
73.6% biglycan.prion, lumican, sialoprotein, glypican 3，
73.6% biglycan.prion, lysyl oxidase , tropomyosin 1, PAIl,
73.6% MMP2,transgelin, LGAし S1， prion, PAIl,
73.6% COL3A1, prion, pleiotrophin , glypican 3, follistatin,
73.6% COL3A1, prion, lysyl oxidase , glypican 3, follistatin,
73.6% transgelin.prion, pleiotrophin , lysyl oxidase , PAI1,
73.6% prion,EDG2, glypican 3, PAI1, follistatin,
73.6% prionjysyl oxidase— like 1， tropomyosin 1 , PAI1 , follistatin.
73.1% prion.lumican, sialoprotein,
73.1% decorin .prion, COL4A1, PA",
73.1% biglycan.prion, lumican, glypican 3,
73.1% COL3A1, prion, glypican 3, PAIl,
73.1% COL1A1,biglycan, prion, HMMR, glypican 3,
73.1% decorin ,biglycan, prion, COL4A1 , tropomyosin 1 ,
73.1% decorin .LGALS1, prion, COL4A1, PA",
73.1% decorin 'prion, COL4A1, EDG2, PAI1,
73.1% decorin .prion, COL4A1, pleiotrophin , PA",
73.1% decorin .prion, COL4A1, tropomyosin 1, follistatin,
73.1% decorin .prion, lumican, EDG2, glypican 3,
73.1% decorin .prion, lumican, glypican 3， PA",
73.1% matrix Gla protein ,COL3A1, prion, glypican 3, PAIl,
73.1% P4HA1, prion, lysyl oxidase - like 1, PAI1, follistatin,
73.1% biglycan,MMP2, LGALS1, prion, PA",
73.1% biglycan.prion, COL4A1, glypican 3, PAIl,
73.1% biglycan.prion, lumican, glypican 3, PA",
73.1% biglycan.prion, pleiotrophin , lysyl oxidase - like 1 , PA" ,
73.1% biglycan.prion, lysyl oxidase - like 1, glypican 3, PAI1,
73.1% P2,prion, EDG2, glypican 3, ΡΑΠ,
73.1% transgelin.prion, sialoprotein, tropomyosin 1, glypican 3,
73.1% prion,COL4A1, tropomyosin 1, glypican 3, PAI1,
73.1% prion.sialoprotein, tropomyosin 1 , glypican 3, PAI1，
73.1% decorin .iumican, glypican 3,
73.1% prion,EDG2, sialoprotein, glypican 3，
73.1% COL1A1.P4HA1, M P2, prion, glypican 3,
73.1% COL1A1.P4HA1, prion, pleiotrophin , glypican 3,
73.1% COL1 A1,P4HAI, lumican, pleiotrophin , glypican 3，
73.1% COL1 Al.transgelin, prion, lysyl oxidase-like 1, PAI1,
73.1% decorin ,P4HA1, prion, HMMR, glypican 3,
73.1% decorin ,MMP2, prion, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
73.1% decorin .transgelin, prion, HMMR, glypican 3,
73.1% decorin , prion, HMMR, lysyl oxidase-like 1, glypican 3,
[表 13-11] 73.1 % decorin .prion, lysyl oxidase , lysyl oxidase-like 1 , lypican 3,
73.1 % P4HA1, MP2, COL3A1 , prion, glypican 3,
73.1% P4HA1. MP2, prion, sialoprotein, glypican 3,
73.1% P4HA1 ,COし 3A1 , prion, lysyl oxidase , glypican 3,
73.1% P4HA1.transgelin, prion, pleiotrophin , glypican 3,
73.1 % P4HA1.transgelin, lumican, pleiotrophin , glypican 3，
73.1 % P4HA1.prion, EDG2, sialoprotein, glypican 3,
73.1 % P4HA1 , prion, HMMR, sialoprotein, glypican 3,
73.1 % P4HA1 , prion, lysyl oxidase , lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
73.1 % biglycan.prion, lumican, sialoprotein, tropomyosin 1 ,
73.1% M P2.COL3A1 , prion, HMMR, glypican 3,
73.1 % prion.lumican, EDG2, sialoprotein, glypican 3,
73.1 % prion,EDG2, HMMR, sialoprotein, glypican 3,
73.1 % prion,EDG2, sialoprotein, glypican 3, follistatin,
73.0% matrix Gla protein .prion, tropomyosin 1 , PA" ,
73.0% P4HA1.prion, glypican 3, follistatin,
73.0% prion.pleiotrophin , tropomyosin 1 , PA" ,
73.0% matrix Gla protein ,P4HA1 , prion, PAI1 , follistatin,
73.0% LGALS1, prion, pleiotrophin , tropomyosin 1 , PAIl,
72.6% COL1A1.matrix Gla protein , prion, glypican 3,
72.6% COL1 A1.P4HA1 , prion, glypican 3,
72.6% COL1A1.MMP2, prion, glypican 3,
72.6% COL1A1.prion, HMMR, glypican 3,
72.6% decorin ,M P2, prion, glypican 3，
72.6% decorin ,ρποπ, pleiotrophin , glypican 3,
72.6% decorin .prion, lysyl oxidase , glypican 3，
72.6» decorin .prion, glypican 3, follistatin,
72.6% matrix Gla protein .transgelin, prion, glypican 3，
72.6% P4HA1.prion, COL4A1 , glypican 3，
72.6% MMP2,prion, lysyl oxidase , glypican 3,
72.6% M P2,prion, sialoprotein, glypican 3,
72.6% transgelin.prion, HMMR, glypican 3，
72.6% transgelin.prion, lysyl oxidase-like 1 , PAI1 ,
72.6% prion,EDG2, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
72.6% prionjysyl oxidase-like 1, sialoprotein, glypican 3,
72.6% COL1A1 , decorin , transgelin, prion, glypican 3,
72.6% COL1A1.decorin , prion, EDG2, glypican 3,
72.6% COL1A1.decorin , COL4A1, lumican, glypican 3,
72.6% COL1A1.matrix Gla protein , transgelin, prion, glypican 3,
72.6% C0L1A1 , matrix Gla protein , prion, lumican, glypican 3，
72.6% COL1A1 , matrix Gla protein , prion, HMMR, glypican 3,
72.6% COL1A1. MP2, transgelin, prion, glypican 3,
72.6% COL1A1.MMP2, LGALS1, prion, glypican 3,
[表 13-12] 4757
58
Figure imgf000059_0001
[表 13-13] P T/JP2005/014757
59
Figure imgf000060_0001
[表 13- 14] 72.2% decorin，し GALS1, prion, COL4A1 , glypican 3,
72.2% decorin ,LGALS1 , prion, lumican, glypican 3，
72.2% decorin .prion, GOし 4A1， EDG2, glypican 3，
72.2% decorin，prion， COL4A1 , HMMR, glypican 3，
72.2% decorin .prion, COし 4A1， lysyl oxidase , glypican 3，
72.2% decorin .prion, COL4A1 , glypican 3， follistatin,
72.2% matrix Gla protein ,prion， lumican, glypican 3， PA11，
72.2% MMP2ttransgelin, prion, lysyl oxidase-like 1， glypican 3,
72.2% MMP2(transgelin, prion, glypican 3， follistatin,
72.2% MMP2，LGAし S1， prion, lysyl oxidase， tropomyosin 1，
72.2% M P2,prion, COL4A1 , lysyl oxidase , tropomyosin 1，
72.2% COL3A1,LGALS1 , prion, lumican, glypican 3,
72.2% COL3A1.LGALS1, prion, sialoprotein, glypican 3,
72.2% LGALS1, prion, pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3，
72.2% prion,COL4A1， lysyl oxidase-like 1， glypican 3, PAI1 ,
72.0% prion'sialoprotein,
72.0% matrix Gla protein ,ρποη, glypican 3,
72.0% biglycan.prion, sialoprotein,
72.0% matrix Gla protein .prion, lumican, glypican 3，
72.0% matrix Gla protein .prion, HMMR, glypican 3，
72.0% biglycan,COL3A1 ( prion, glypican 3,
72.0% biglycan.prion, lysyl oxidase， ΡΑΠ ,
72.0% MMP2,prion, lysyl oxidase-like 1, glypican 3，
72.0% decorin .matrix Gla protein， MMP2, COL3A1 , prion,
72.0% decorin ,biglycan, prion, sialoprotein, tropomyosin 1，
72.0% decorin ,M P2, LGALSI , prion, glypican 3,
72.0% decorin，prion， C0L4A1, tropomyosin 1 , PAI1 ,
72.0% matrix Gla protein tP4HA1 , prion, pleiotrophin， glypican 3，
72.0% matrix Gla protein ,biglycant COL3A1 , prion, glypican 3，
72.0% matrix Gta protein tbiglycan, prion, sialoprotein, glypican 3,
72.0% matrix Gla protein ,MMP2， COL3A1 , prion, glypican 3,
72.0% matrix Gla protein ,MMP2, prion, glypican 3, PAI1 ,
72.0% matrix Gla protein .prion, lumican, HMMR, glypican 3,
72.0% P4HA1 ,biglycan, prion, lysyl oxidase— like 1 , sialoprotein,
72.0% bigiycan,MMP2, prion, sialoprotein, glypican 3，
12.0% biglycan,COL3A1, prion, sialoprotein, glypican 3，
72.0% biglycan,し GALS1 , prion, lysyl oxidase， PAI1，
72.0% biglycan.prion, EDG2, sialoprotein, glypican 3,
72.0% biglycan.prion, sialoprotein, tropomyosin 1， follistatin,
72.0% MMP2,COL3A1 , prion, glypican 3， follistatin,
72.0% LGALS1 , prion, EDG2, glypican 3， PA" ,
72.0% prion, lumican, lysyl oxidase-like 1， glypican 3， follistatin,
71.6% decorin 'matrix Gla protein , prion,
[表 13-15] 71.6% prion.tropomyosin 1, lypican 3,
71.6% COL1A1, biglycan, prion, glypican 3,
71.6% decorin .matrix Gla protein , prion, ΡΑΠ,
71.6% biglycan.prion, EDG2, PAI1,
71.6% transgelin,prion, tropomyosin 1， glypican 3,
71.6% prion.lumican, pleiotrophin , glypican 3，
71.6% prion.sialoprotein, glypican 3, PAI1,
71.6% COL1A1, decorin , matrix Gla protein , prion, PAI1,
71.6% COL1A1, decorin , biglycan, prion, glypican 3,
71.6% COL1A1, decorin , transgelin, prion, follistatin,
71.6% COL1A1, matrix Gla protein , biglycan, prion, glypican 3,
71.6% COL1A1, biglycan, prion, sialoprotein, glypican 3,
71.6% COL1A1, biglycan, prion, glypican 3, follistatin,
71.6% decorin .matrix Gla protein , biglycan, prion, glypican 3,
71.6% decorin .matrix Gla protein , COL3A1, prion, PAI1,
71.6¾ decorin , matrix Gla protein， transgelin, prion, PA" ,
71.6% decorin .matrix Gla protein , LGALSI, prion, PAI1,
71.6% decorin ,P4HA1, prion, COL4A1, PA",
71.6% decorin .biglycan, prion, EDG2, glypican 3,
71.6% decorin .biglycan, prion, lysyl oxidase— like 1, glypican 3,
71.6% decorin ,COL3A1, prion, tropomyosin 1, PA",
71.6% decorin .transgelin, LGALS1, prion, sialoprotein,
71.6% decorin .transgelin, LGALS1, prion, PAI1,
71.6% decorin .transgelin, prion, lysyl oxidase , PAI1,
71.6% decorin .transgelin, prion, tropomyosin 1 , PAI1 ,
71.6% decorin ,LGALS1, prion, sialoprotein, follistatin,
71.6% decorin ,LGALS1, prion, tropomyosin 1, glypican 3,
71.6% biglycan, P2, prion, tropomyosin 1, PAI1,
71.6% biglycan, MP2, prion, glypican 3, PA",
71.6% biglycan,COL3A1, prion, tropomyosin 1, PAI1,
71.6% biglycan,LGALS1, prion, EDG2, PAI1,
71.6% biglycan.prion, COL4A1, lysyl oxidase-like 1， tropomyosin 1,
71.6% biglycan.prion, COL4A1, tropomyosin 1, PAI1,
71.6% biglycan.prion, EDG2, tropomyosin 1, PAI1,
71.6% biglycan.prion, pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3,
71.6% biglycan.prion, lysyl oxidase-like 1 , sialoprotein, glypican 3,
71.6% biglycan.prion, sialoprotein, glypican 3, PA",
71.6% COL3A1丄 GALS1, prion, glypican 3, PA",
71.6% COL3A1, prion, COL4A1, tropomyosin 1, glypican 3，
71.6¾ COL3A1, prion, lumican, glypican 3, follistatin,
71.6% LGALS1, prion, COL4A1, glypican 3, PAI1,
71.6% LGALS1, prion, sialoprotein, glypican 3, PAI1,
71.6% prion,COL4A1, pleiotrophin， tropomyosin 1, glypican 3,
[表 13- 16] 71.6% prion,COL4A1 , lysyl oxidase-like 1, tropomyosin 1， lypican 3,
71.6% prion.lumican, pleiotrophin , glypican 3, follistatin.
71.6% prion,EDG2, lysyl oxidase , glypican 3, ΡΑΠ ,
71.6% prion.sialoprotein, glypican 3, PAI1 , follistatin,
71.5% decorin Jumican, sialoprotein, glypican 3,
71.5% P4HA1 , prion, lysyl oxidase , glypican 3,
71.5% decorin ,P4HA1 , transgelin, prion, glypican 3,
71.5% decorin P4HA1 , prion, lysyl oxidase , glypican 3,
71.5% decorin ,P4HA1 , pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3,
71.5% matrix Gla protein ,P4HA1 , transgelin, prion, glypican 3,
71.5% matrix Gla protein ,COL3A1, prion, lysyl oxidase , glypican 3,
71.5% P4HA1.COL3A1 , prion, EDG2, glypican 3,
71.5% P4HA1, transgelin, prion, lysyl oxidase-like 1 , PAI1 ,
71.5% P4HA1, transgelin, pleiotrophin , glypican 3, follistatin,
71.5% P4HA1, prion, lysyl oxidase , sialoprotein, glypican 3,
71.5% COL3A1 , prion, EDG2, HMMR, glypican 3,
71.5% COL3A1 , prion, HMMR, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
71.5% prion.lumican, lysyl oxidase , lysyl oxidase-like 1 , lypican 3,
71.4% prion/tropomyosin 1 , PAI1 , ollistatin,
71.4% matrix Gla protein .prion, tropomyosin 1 , PA", follistatin,
71.4% P4HA1.prion, tropomyosin 1 , PA", follistatin,
71.4% transgelin.prion, tropomyosin 1 , PAI1, follistatin,
71.4% LGALS1 , prion, tropomyosin 1 , PAI1 , follistatin,
71.4% prionjysyl oxidase， tropomyosin 1, PAI1 , follistatin,
71.1 % LGALS1, prion, glypican 3,
71.1% prionjysyl oxidase , glypican 3,
71.1% COL1A1.prion, EDG2, glypican 3,
71.1 % GOL1A1, prion, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
71.1% matrix Gla protein .prion, pleiotrophin , glypican 3,
71.1% transgelin.prion, EDG2, glypican 3,
71.1% prion.pleiotrophin , lysyl oxidase， glypican 3,
71.1% prionjysyl oxidase , sialoprotein, glypican 3,
71.1% prionjysyl oxidase , glypican 3, follistatin,
71.1 % COL1A1.matrix Gla protein , LGALS1 , prion, glypican 3,
71.1 % COL1A1 , matrix Gla protein , prion, lysyl oxidase , glypican 3,
71.1% COL1 A1.matrix Gla protein , prion, lysyl oxidase-like 1， glypican 3,
71.1 % COL1A1.matrix Gla protein , prion, sialoprotein, glypican 3,
71.1 % COL1A1.matrix Gla protein , prion, glypican 3, follistatin.
71.1 ¾ COL1A1.P4HA1 , transgelin, prion, glypican 3,
71.1 ¾ COL1A1.P4HA1 , LGALS1 , prion, glypican 3.
71.1 % COL1A1.P4HA1 , prion, HMMR, glypican 3,
71.1 % COL1A1.P4HA1 , prion, sialoprotein, glypican 3,
71.1 % COし 1A1.MMP2, prion, lysyl oxidase-like 1, glypican 3,
[表 13-17] 71.1% COL1A1.M P2, prion, sialoprotein, glypican 3,
71.1% COL1A1.COL3A1, prion, EDG2, glypican 3,
71.1% COL1A1.COL3A1, prion, tropomyosin 1, PA",
71.1% COL1 A1.transgelin, prion, lysyl oxidase , glypican 3,
71.1% COL1A1.LGALS1, prion, EDG2, glypican 3,
71.1% COL1A1丄 GALS1, prion, HMMR, glypican 3，
71.1% COL1A1, prion, EDG2, pleiotrophin , glypican 3,
71.1% COL1A1. prion, EDG2, glypican 3, follistatin,
71.1% COL1A1, prion, pleiotrophin , HMMR, glypican 3,
71.1% COL1A1, prion, pleiotrophin , lysyl oxidase-like 1, lypican 3,
71.1% COL1A1.prion, HMMR, lysyl oxidase , glypican 3,
71.1% COL1A1, prion, HMMR, glypican 3, follistatin,
71.1% COLIAI.prion, lysyl oxidase , lysyl oxidase-like , glypican 3，
71.1% COL1A1.prion, lysyl oxidase-like 1, lypican 3, follistatin,
71.1% decorin ,P4HA1, prion, EDG2, glypican 3,
71.1% decorin ,COL3A1, LGALS1, lumican, glypican 3,
71.1% decorin ,LGALS1, prion, HMMR, glypican 3，
71.1% decorin .LGALS1, prion, lysyl oxidase , glypican 3,
71.1% decorin .prion, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3， follistatin,
71.1% matrix Gla protein P4HA1, prion, COL4A1, glypican 3,
71.1% matrix Gla protein .COL3A1, prion, EDG2, glypican 3,
71.1% matrix Gla protein ,COL3A1, prion, sialoprotein, glypican 3,
71.1% matrix Gla protein .transgelin, prion, EDG2, glypican 3,
71.1% matrix Gla protein .transgelin, prion, pleiotrophin , glypican 3,
71.1% matrix Gla protein .transgelin, prion, glypican 3, follistatin,
71.1% matrix Gla protein丄 GALS1, prion, lysyl oxidase , glypican 3,
71.1% matrix Gla protein ,し GALS1, prion, sialoprotein, glypican 3,
71.1% matrix Gla protein .prion, EDG2, lysyl oxidase-like 1, lypican 3，
71.1% matrix Gla protein , prion, pleiotrophin , HMMR, glypican 3,
71.1% matrix Gla protein .prion, pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3,
71.1% matrix Gla protein .prion, lysyl oxidase , lysyl oxidase-like 1, PAI1, matrix Gla protein .prion, lysyl oxidase-like 1, sialoprotein,
71.1%
glypican 3,
71.1% P4HA1.COL3A1, transgelin, prion, glypican 3,
71.1% P4HA1.COL3A1, prion, sialoprotein, glypican 3,
71.1% P4HA1.transgelin, prion, COL4A1, glypican 3,
71.1% P4HA1, transgelin, prion, lysyl oxidase-like , glypican 3,
71.1% P4HA1.prion, COL4A1 , pleiotrophin , glypican 3,
71.1% P4HA1, prion, COL4A1 , lysyl oxidase-like 1, glypican 3,
71.1% P4HA1, prion, pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3,
71.1% MP2.COL3A1, prion, lysyl oxidase-like 1, lypican 3,
71.1% MMP2.COL3A1, prion, sialoprotein, glypican 3,
71.1% MMP2,prion, COL4A1, lysyl oxidase-like 1, glypican 3,
[表 13 - 18] 71.1 % MP2,prion, pleiotrophin , sialoprotein, glypican 3,
71.1 % COL3A1.prion, EDG2, pleiotrophin , glypican 3,
71.1 % COL3A1 , prion, EDG2, lysyl oxidase , glypican 3,
71.1 % transgelin.LGALSl , prion, COL4A1 , glypican 3,
71.1 % transgelin,LGALS1 , prion, EDG2, glypican 3,
71.1 % transgelin丄 GAし S1， prion, pleiotrophin， glypican 3,
71.1 % transgelin.LGALSl , prion, lysyl oxidase-like 1 , glypican 3,
71.1 % transgelin.prion, COL4A1 , lysyl oxidase , glypican 3,
71.1 % transgelin.prion, EDG2, pleiotrophin , glypican 3,
71.1 ¾ transgelin.prion, EDG2, tropomyosin 1 , PAI1 ,
71.1% transgelin.prion, EDG2, glypican 3, follistatin,
71.1% transgelin.prion, lysyl oxidase-like 1, tropomyosin 1, PAI1 ,
71.1 % prion,COL4A1 , EDG2, tropomyosin 1 , ΡΑΠ ,
71.1 % prion,COL4A1 , pleiotrophin , lysyl oxidase-like 1 , lypican 3,
71.1% prion, COL4A1 , lysyl oxidase-like 1 , lypican 3, follistatin,
71.1% prion.pleiotrophin , lysyl oxidase， glypican 3, follistatin,
71.0% decorin .matrix Gla protein , prion, sialoprotein,
71.0% decorin ,P4HAI, prion, follistatin,
71. OX decorin .prion, pleiotrophin , sialoprotein,
71.0% matrix Gla protein .prion, PAI1 , follistatin,
71.0% COL1 A1.biglycan, COL3A1 , prion, follistatin,
71.0% decorin .matrix Gla protein , COL3A1 , prion, follistatin,
71.0% decorin .matrix Gla protein , prion, EDG2, sialoprotein,
71.0% decorin .matrix Gla protein , prion, pleiotrophin , sialoprotein,
71.0% decorin .matrix Qla protein , prion, sialoprotein, follistatin,
71.0% decorin ,P4HA1, prion, EDG2, PAI1 ,
71.0% decorin ,P4HA1 , prion, sialoprotein, follistatin,
71.0% decorin ,P4HA1, prion, PAIl , follistatin,
71.0% decorin .biglycan, prion, pleiotrophin , sialoprotein,
71.0% decorin .biglycan, prion, HMMR, sialoprotein,
71.0% decorin ,MMP2, prion, sialoprotein, follistatin,
71.0% decorin .transgelin, prion, PAI1 , follistatin,
71.0% decorin ,LGALS1 , prion, EDG2, PA" ,
71.0% decorin .prion, EDG2, tropomyosin 1 , PA" ,
71.0% decorin .prion, tropomyosin 1 , PAIl , follistatin,
71.0% biglycan,LGALS1 , prion, PAI1 , follistatin,
71.0% prion,sialoprotein, tropomyosin 1 , glypican 3, follistatin,
70.9% P4HA1.prion, tropomyosin 1 , PA" ,
70.9% matrix Gla protein ,P4HA1 , prion, tropomyosin 1， PAI1 ,
70.9% P4HA1.biglycan, prion, pleiotrophin , PAI1 ,
70.9% P4HA1.biglycan, prion, HMMR, PAI1 ,
70.9% P4HA1 , prion, EDG2, tropomyosin 1 , PA",
70.6% COL1A1.prion, COL4A1 , glypican 3,
[表 13- 19] JP2005/014757
65
Figure imgf000066_0001
[表 13- 20] T/JP2005/014757
66
Figure imgf000067_0001
[表 13- 21] 70.0% COL1A1.MMP2, COL3A1 , transgelin, prion,
70.0% COL1 A1，COし 3A1， transgelin, prion, follistatin,
70.0% COL1A1，LGALS1， prion, lysyl oxidase， glypican 3， フ 0.0% COL1 A1 ,LGAし S1 , rion, tropomyosin 1 , glypican 3，
70.0% COL1A1 , prion, pleiotrophin， tropomyosin 1， PAIl ,
70.0% COL1A1.prion, lysyl oxidase , tropomyosin 1， glypican 3,
70.0% decorin .matrix Gla protein， P4HA1 , COL3AI , prion,
70.0% decorin ,matrix Gla protein ' P4HA1 , prion, PAI1 ,
70.0% decorin , matrix Gla protein， COL3A1 , prion, lysyl oxidase ,
70.0% decorin , matrix Gla protein， transgelin, LGALSl , prion.
70.0% decorin f matrix Gla protein , LGALS1 , prion, sialoprotein,
70.0% decorin ,P4HA1 , COL3A1, prion, pleiotrophin，
70.0% decorin，P4HA1 , COL3A1, prion, sialoprotein,
70.0% decorin ,P4HA1 , prion, tropomyosin 1， glypican 3,
70.0% decorin .biglycan, prion, HM R, glypican 3,
70.0% decorin .biglycan, prion, glypican 3， follistatin,
70.0% decorin ,COL3A1 , LGALSl , prion, EDG2,
70.0% decorin ,transgelin, LGALS1, prion, EDG2，
70.0% decorin .transgelin, LGALSl， prion, pleiotrophin，
70.0% decorin .transgelin, LGALS1 , prion, lysyl oxidase ,
70.0% decorin .LGALS1 , prion, COL4A1 , tropomyosin 1 ,
70.0% decorin，し GALSI, prion, EDG2, sialoprotein,
70.0% matrix Gla protein rDiglycan, prion, EDG2, PAI1，
70.0% P4HA1 ,し GAし S1， prion, lumican, glypican 3，
70.0% P4HA1.prion, lumican, pleiotrophin , glypican 3，
70.0% P4HA1 , prion, lumican, sialoprotein, tropomyosin 1 ,
70.0% P4HA1, prion, sialoprotein, glypican 3, PAI1 ,
70.0% biglycan,COL3A1, prion, lumican, HMMR,
70.0% b lycan，COし 3A1， prion, lumican, glypican 3,
70.0% biglycan'prion, COL4A1 , lysyl oxidase— like 1， glypican 3，
70.0% biglycan'prion, sialoprotein, tropomyosin 1， ΡΑΠ ,
70.0% C O L3 A 1 , L GALS 1 , prion, pleiotrophin , glypican 3，
70.0% COL3A1 fLGALS1 t prion, lysyl oxidase， glypican 3,
70.0% COL3A1.LGALS1 , prion, glypican 3， follistatin,
70.0% transgelin.prion, pleiotrophin , sialoprotein, tropomyosin 1 ,
70.0% transgelin, prion, sialoprotein, tropomyosin 1， ΡΑΠ ,
70.0% LGALS1.prion, COL4A1 , tropomyosin 1, PAIl ,
70.0% LGALSl , prion, pleiotrophin， sialoprotein, tropomyosin 1，
70.0% prion,C0L4A1 , pleiotrophin , tropomyosin 1， PAI1 ,
70.0% prion,COL4A1, lysyl oxidase , tropomyosin 1 , PAI1 ,
70.0% priontCOL4A1 , lysyl oxidase， glypican 3, ΡΑΠ ,
70.0% prion.lumican, sialoprotein, tropomyosin 1 , glypican 3,
70.0% prion, lumican, tropomyosin 1 , PAI1 , follistatin,
[表 13 - 22] 70.0% priontEDG2, pleiotrophin , glypican 3， PAI1 ,
70.0% prion,HMMR, sialoprotein, tropomyosin 1 , glypican 3，
70.0% prionjysyl oxidase , sialoprotein, tropomyosin 1 , PAI1 ,
[0094] 星細胞特異的遺伝子に限定して判別式をつくると、限定しない解析 (表 10)に比べ 、正答率が高いマーカーの組み合わせを数多く作ることができた。これは線維産生の 中心である肝星細胞が肝線維化ステージと直接、深く関わって!/、ること示して 、る。 肝星細胞特異的マーカーを複数用いれば、現在の肝線維化のステージ判定だけで なぐこれから線維化が進展する方向にあるのか、線維化は終息に向カゝうのかを判定 できる点も有益である。
産業上の利用の可能性
[0095] 本発明の診断方法により、肝線維化の状況（下記に示す Fステージの段階)を客観 的に判定でき、 4段階の分類よりさらに細かい分類が可能となる。またマーカーに附 属する細胞特異性の情報により単にステージの如何なる段階であるかば力りでなぐ 炎症が拡大する方向にあるの力 終息する方向にあるの力、線維化が拡大する方向 にあるのか、終息する方向にあるの力、発癌の危険性が増大する方向にあるのかそ の危険性は無 、のか等、今まで不可能であった診断を可能とした。
一方、血清タンパク質マーカーを用いれば、患者の負担が軽減され、容易に診断 することが可能となる。患者への負担が少なくなることは、自覚症状が無い、肝線維 化初期の段階は特に有効である。また、治療すべき患者の早期発見につながる。更 に、血清タンパク質マーカーを用いた診断方法は、経時的な診断をも可能にするた め、線維化の進行あるいは回復状況のモニターが可能となり、治療の有効性判断、 治療法の選択、病後の予測、回復の可能性予測等にも有用である。
さらには、線維量以外に肝線維化症の症状に連動する肝の異常を示す血清タンパ ク質マーカー、たとえば肝の代謝機能の変化を示す血清タンパク質マーカーを用い ることにより、代謝機能変化を調べることが可能となった。これは患者の自覚症状と関 連するば力りでなぐ肝癌発生のリスクを示す場合もあり、極めて有用である。
また、本発明で得られた肝疾患に関する遺伝子マーカーは単にマーカーとして意 義があるば力りでなぐ肝線維化症の進行の原因であり、疾患がおよぼす種々の症 状の原因や将来発生する可能性のある新たな疾患のリスクファクターと考えられ、さら に肝線維化症に限らず他の臓器の線維化症や肝臓での他の疾患に関連することが 予想されるため極めて有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 患者の組織又は体液中の、配列番号 1〜60のそれぞれの塩基配列にコードされるタ ンパク質力もなる群力も選ばれる 1種または 2種以上のタンパク質もしくは該タンパク 質と実質的に同一のタンパク質若しくはそれらの部分ペプチドの濃度を測定するェ 程と、該測定値に基いて肝線維化ステージを判定する工程を含む、肝線維化ステー ジの判定方法。
[2] 前記タンパク質または部分ペプチドの濃度の測定を、同一患者の複数の時点におい て行うことを特徴とする、請求項 1記載の判定方法。
[3] 前記タンパク質または部分ペプチドの患者における濃度を、健常人における濃度と 比較することにより肝線維化ステージを判定する、請求項 1記載の判定方法。
[4] 前記タンパク質又は部分ペプチド濃度の測定を、ウェスタンプロット法、ェンザィムィ ムノアッセィ法、ラジオィムノアッセィ法、液体クロマトグラフィー法及びドットブロット法 力もなる群より選択される測定方法により行うことを特徴とする、請求項 1〜3のいずれ か一項に記載の判定方法。
[5] 患者の体液又は組織中の、配列番号 1〜60のそれぞれの塩基配列を有する遺伝子 力 なる群より選ばれる 1または 2種以上の遺伝子、または該塩基配列と実質的に同 一の塩基配列を有する遺伝子の発現量を測定する工程と、該測定値に基！ヽて肝線 維化ステージを判定する工程を含む、肝線維化ステージの判定方法。
[6] 前記遺伝子群から選択される 4種類以上の遺伝子の発現量を測定し、選択された遺 伝子の発現量の組み合わせに基!、て肝線維化ステージを判定する、請求項 5に記 載の判定方法。
[7] 患者の組織が、肝臓由来の組織である、請求項 5または 6に記載の判定方法。
[8] 前記遺伝子の発現量の測定を、遺伝子チップを用いる方法、 RT-PCR法、ノーザン ブロット法のいずれかの方法により行う、請求項 5〜7のいずれか一項に記載の判定 方法。
[9] 肝培養細胞に薬剤候補物質を添加し、配列番号 1〜60のそれぞれの塩基配列およ び該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる 1 種又は 2種以上の遺伝子の前記細胞内での発現量、または、前記遺伝子によってコ ードされるタンパク質の前記細胞内の量もしくは前記細胞力 分泌される量を測定す ることにより、前記遺伝子の発現量または前記タンパク質の量を変動させる物質をス クリーニングする、肝線維化抑制剤のスクリーニング方法。
[10] 配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはその部分ペプチドから選 ばれる少なくとも 1種類を含む、肝線維化抑制剤のスクリーニング用キット。
[11] 配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列又はその部分配列に相補的若しくは実質的 に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる肝線維 化抑制剤。
[12] 配列番号 1〜60の 、ずれかの塩基配列の部分配列を有するセンス鎖及び該センス 鎖に相補的な配列を有する相補鎖力 なる 2本鎖 RNAを含有してなる肝線維化抑制 剤。
[13] 配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドに 対する抗体を含有してなる肝線維化抑制剤。
[14] 配列番号 1〜60の!、ずれかの塩基配列又はその部分配列を有する DNAを含むベタ ターを含有してなる肝線維化抑制のための遺伝子治療用組成物。
[15] 配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質若しくはその部分ペプチドに 対する抗体を含有してなる肝線維化検査用試薬。
[16] 配列番号 1〜60のいずれかの塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列もし くはその部分配列に相補的な配列を有するプローブ、または前記塩基配列を有する 遺伝子を増幅するためのプライマーを含有してなる肝線維化検査用試薬。
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