CN109443876A - 肝纤维化标志物质控品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝纤维化标志物质控品，是由基质稀释液和透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PIIINP）及IV型胶原（ColⅣ）、甘胆酸（CG）制成的冻干品。本发明制备的质控品均一性和稳定性好，不受运输、温度等因素影响，可适用于不同仪器型号、不同试剂定量检测，不同地域、不同实验室人员检测操作。质控品复溶后检测过程稳定时间较长，具备检测重复性、准确性高，能满足临床对肝纤维化标志物检测的质量控制要求，可以更准确地检测临床样本检测结果的准确性。

Description

肝纤维化标志物质控品及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术，尤其是涉及一种肝纤维化标志物质控品，本发明还涉及该质控品的制备方法。
背景技术
肝纤维化的形成是由于肝脏控制基质形成与沉积和基质降解与清除之间平衡的丧失，从而引起结缔组织的过度沉积进而纤维化。肝纤维化是慢性肝病的共同病理学基础，随着各种不同的慢性肝脏疾病的进展可逐渐形成肝纤维化。
肝纤维化的诊断主要有肝活检样本的组织学检查、影像学检测和血清学检测。目前评价肝纤维化程度及其活动度的指标，最可靠的仍是肝活检样本的组织学检查，被称为诊断肝纤维化的“金标准”。现代影像学手段如B型超声、CT、磁共振成像（MRI）等技术可以发现肝纤维化的某些征象，可作为诊断的辅助手段之一。血清学检测可以对肝组织纤维化不同阶段做出相对准确的诊断，反映肝脏纤维化的发展变化情况，也可大致反映抗纤维化治疗的临床效果。
对于肝纤维化定量检测项目评价还没有很好的质控样本。商品化的试剂厂商提供的质控品不能适用肝纤维化所有定量项目检测。由于质控品是实现体外诊断试剂临床检测及监督检验结果一致的主要工具，因此，亟待开发出安全、稳定、有效、准确性高的能适用肝纤维化标志物定量检测的质控品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性好，检测重复性、准确性高，适应性广的肝纤维化标志物质控品，本发明还提供该质控品的制备方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的肝纤维化标志物质控品，是由基质稀释液和透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PIIINP）及IV型胶原（ColⅣ）、甘胆酸（CG）制成的冻干品。
所述透明质酸（HA）的含量为50-800 ng/mL，所述层粘连蛋白（LN）的含量为40-600ng/mL，所述III型前胶原（PIIINP）的含量为2-90 ng/mL，所述IV型胶原（ColⅣ）的含量为40-750 ng/mL，所述甘胆酸（CG）的含量为1-30μg/mL。
所述基质稀释液是由体积比1:3的肝纤阴性混合血清和去激素血清组成。
所述基质稀释液中含有0.1~0.5%的Proclin300和Bro。
本发明肝纤维化标志物质控品的制备方法包括下述步骤：
第一步，将成品血清在50~60℃水浴锅中处理1~2h，然后用高速离心机（3500r/min≤转速≤8000r/min）离心10分钟，恢复室温后放置于2～8℃保存；
第二步，将第一步处理后等血清与去激素血清进行混合；
第三步，在混合血清中依次加入Proclin300和Bro，充分搅拌混匀后形成基质稀释液，测定透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PIIINP）、IV型胶原（ColⅣ）、甘胆酸（CG）的本底值，然后放置于2～8℃保存；
第四步，在第三步得到的基质稀释液中添加透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PIIINP）、IV型胶原（ColⅣ）、甘胆酸（CG）至设定值，得到肝纤维化标志物质控品母液；
第五步，取第四步得到的肝纤维化标志物质控品母液在全自动化学发光测定仪上进行检测，分别获得透明质酸、层粘连蛋白、III型前胶原、IV型胶原、甘胆酸检测值为相应6个水平设定值的质控品溶液，然后将其分装至棕色玻璃瓶内；
第六步，将棕色玻璃瓶放入预冷后的干燥机内进行真空冷冻干燥处理，得到冻干的肝纤维化标志物质控品放置于2～8℃冰箱保存。
其中第一步中使用的成品血清由血液中生物源性病原体感染性标志物指标均为阴性的健康供血者提供。
所述生物源性病原体包括HBsAg、抗HCV、抗特异性TP、抗HIV。
所述分装在棕色玻璃瓶内的质控品含量为3.0mL/瓶或1.0mL/瓶。
本发明的优点在于制备的质控品均一性和稳定性好，不受运输、温度等因素影响，可适用于不同仪器型号、不同试剂定量检测，不同地域、不同实验室人员检测操作。质控品复溶后检测过程稳定时间较长，具备检测重复性、准确性高，能满足临床对肝纤维化标志物检测的质量控制要求，可以更准确地检测临床样本检测结果的准确性。同时由于本发明质控品为冻干品，可使血液中肝纤维化标志物活性稳定，2～8℃环境效期可达24个月，质量可靠，准确度高；由于冻干质控品粘稠度低，容易复溶与混匀，开瓶后2-8℃保存可稳定14天，开瓶后分装放置-20℃保存可稳定12个月；质控品原料来源广泛，制作简单，且不含稳定剂、固定剂，成本低廉；冻干质控品性能稳定、使用简便、准确度高，可用于室间质量评价组织者对不同检测系统定量测定肝纤维化项目评价，使各实验室间具备可比性。同时可作为室内质控品，监测肝纤维化标志物定量分析检测系统的稳定性。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明进行详细说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明实施例中所用的试剂和检测仪器均为市售产品，采用的方法为本领域常规的试验方法。
实施例1 制备肝纤维化标志物质控品
以肝纤维化标志物六个水平（Q1:HA-70ng/mL，LN-70ng/mL，PIIINP-5ng/mL，CIV-50ng/mL，CG-1.5μg/mL；Q2:HA-100ng/mL，LN-100ng/mL，PIIINP-10ng/mL，CIV-100ng/mL，CG-2.5μg/mL；Q3:HA-150ng/mL，LN-150ng/mL，PIIINP-15ng/mL，CIV-150ng/mL，CG-5.0μg/mL；Q4:HA-250ng/mL，LN-250ng/mL，PIIINP-35ng/mL，CIV-250ng/mL，CG-10μg/mL；Q5:HA-500ng/mL，LN-500ng/mL，PIIINP-50ng/mL，CIV-500ng/mL，CG-25μg/mL；Q6:HA-700ng/mL，LN-700ng/mL，PIIINP-70ng/mL，CIV-700ng/mL，CG-40μg/mL）。
1、选择血液中生物源性病原体如HBsAg、抗HCV、抗特异性TP、抗HIV等感染性标志物指标均为阴性的健康成人作合格供血者，收集肝纤维化阴性混合血清；
2、将上述肝纤维化阴性混合血清56℃水浴锅处理2h，然后用高速离心机（3500r/min≤转速≤8000r/min）离心10分钟，等恢复室温后置于2～8℃保存；
3、将上述肝纤维化阴性混合血清与去激素血清按1:3进行混合，搅拌均匀后放置2～8℃保存；
4、在混合血清中依次加入0.2%的Proclin300和Bro，充分搅拌混匀后形成基质稀释液，测定透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PIIINP）、IV型胶原（ColⅣ）、甘胆酸（CG）的本底值，透明质酸（HA）本低值≤50ng/mL，层粘连蛋白（LN）本低值≤80ng/mL，III型前胶原（PIIINP）本低值≤5ng/mL，IV型胶原（ColⅣ）本低值≤50ng/mL，甘胆酸（CG）本低值≤1.5μg/mL，然后放置于2～8℃保存；
5、将透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PIIINP）、IV型胶原（ColⅣ）、甘胆酸（CG）按各水平浓度添加到基质稀释液中至设定值，得到肝纤维化标志物质控品母液；
6、取1ml肝纤维化标志物质控品在在Autolumo A2000全自动化学发光测定仪上进行检测，分别获得透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PIIINP）、IV型胶原（ColⅣ）、甘胆酸（CG）检测值为六个水平设定值的肝纤维化质控品溶液，然后将六水平以每瓶3.0mL的量分别装至褐色玻璃瓶内；
7、将棕色玻璃瓶放入预冷至-40℃的干燥机内进行真空冷冻干燥处理24h，冻干温度-80℃，真空度10.0 Pa，得到冻干的肝纤维化标志物质控品成品放置于2～8℃冰箱保存。
实施例2 本发明质控品的性能测试
对肝纤维化标志物质控品的均匀性和稳定性进行评估。通过对性能评估结果进行统计分析，验证各项指标是否符合实验设计要求。
1、均匀性验证
取同批号的各水平质控品10瓶，每瓶质控品分别用相应试剂测试1次，按公式1、2计算10个测试结果的平均值（）和标准差S1；
另用上述10瓶质控品中的1瓶连续测试10次，计算10个测试结果的平均值（）和标准差S2；按下列公式计算瓶间变异系数CV，结果应不大于10.0%。
公式 1
公式 2
公式 3
公式 4
当S1<S2时，令CV瓶间=0
式中：
----平均值；
S----标准差；
n----测量次数；
Xi----指定参数第i次测量值。
按照上述公式进行计算，结果统计如下：
表1. 均匀性检测结果
由以上结果可知，各水平质控品瓶间变异系数CV均不大于10.0%，符合要求。
1、稳定性验证
2.1复溶稳定性
质控品开瓶复溶后在2℃～8℃放置14天，与新复溶的质控品同时进行检测，检测结果的相对偏差应在±15.0%范围内。检测结果统计如下：
表2. 复溶稳定性检测结果
结果显示，质控品复溶后于2℃～8℃放置14天，与新开封的质控品各水平检测结果平均值的相对偏差均在±15.0%范围内，符合要求。
2.2热稳定性
将质控品各水平于37℃放置14天，用相应试剂检测质控品各水平，结果应在给定的范围内，结果见下表：
表3. 37℃放置14天检测结果
结果显示，试剂盒于37℃放置14天，各水平质控品检测结果在给定范围内，符合要求。

Claims (8)

1.一种肝纤维化标志物质控品，其特征在于：所述质控品是由基质稀释液和透明质酸、层粘连蛋白、III型前胶原及IV型胶原、甘胆酸制成的冻干品。
2.根据权利要求1所述的肝纤维化标志物质控品，其特征在于：所述透明质酸的含量为50-800 ng/mL，所述层粘连蛋白的含量为40-600 ng/mL，所述III型前胶原的含量为2-90ng/mL，所述IV型胶原的含量为40-750 ng/mL，所述甘胆酸的含量为1-30μg/mL。
3.根据权利要求1所述的肝纤维化标志物质控品，其特征在于：所述基质稀释液是由体积比1:3的肝纤阴性混合血清和去激素血清组成。
4.根据权利要求3所述的肝纤维化标志物质控品，其特征在于：所述基质稀释液中含有0.1~0.5%的Proclin300和Bro。
5.一种肝纤维化标志物质控品的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
第一步，将成品血清在50~60℃水浴锅中处理1~2h，然后用高速离心机离心10分钟，恢复室温后放置于2～8℃保存；
第二步，将第一步处理后等血清与去激素血清进行混合；
第三步，在混合血清中依次加入Proclin300和Bro，充分搅拌混匀后形成基质稀释液，测定透明质酸、层粘连蛋白、III型前胶原、IV型胶原、甘胆酸的本底值，然后放置于2～8℃保存；
第四步，在第三步得到的基质稀释液中添加透明质酸、层粘连蛋白、III型前胶原、IV型胶原、甘胆酸至设定值，得到肝纤维化标志物质控品母液；
第五步，取第四步得到的肝纤维化标志物质控品母液在全自动化学发光测定仪上进行检测，分别获得透明质酸、层粘连蛋白、III型前胶原、IV型胶原、甘胆酸检测值为相应6个水平设定值的质控品溶液，然后将其分装至棕色玻璃瓶内；
第六步，将棕色玻璃瓶放入预冷后的干燥机内进行真空冷冻干燥处理，得到冻干的肝纤维化标志物质控品放置于2～8℃冰箱保存。
6.根据权利要求5所述的肝纤维化标志物质控品的制备方法，其特征在于：所述第一步中使用的成品血清由血液中生物源性病原体感染性标志物指标均为阴性的健康供血者提供。
7.根据权利要求6所述的肝纤维化标志物质控品的制备方法，其特征在于：所述生物源性病原体包括HBsAg、抗HCV、抗特异性TP、抗HIV。
8.根据权利要求5所述的肝纤维化标志物质控品的制备方法，其特征在于：所述分装在棕色玻璃瓶内的质控品含量为3.0mL/瓶或1.0mL/瓶。
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