CN103399158A - 一种检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒 - Google Patents

一种检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒，其中偶联抗体的微球包括偶联了Ⅲ型前胶原肽和/或金属蛋白酶组织抑制因子-1捕获抗体的荧光微球中；偶联了Ⅳ型胶原肽、纤维连接蛋白、转化生长因子-β1、血小板衍化生长因子、肿瘤坏死因子α捕获抗体、血管紧张素II的捕获抗体的荧光微球中的一种或多种；偶联了血清透明质酸捕获抗体的荧光微球和/或偶联了层粘蛋白捕获抗体的荧光微球。可联合检测多种反映肝纤维化不同阶段的肝纤维化相关标志物，检测时间由常规的几小时缩短到十几分钟；所需血清样品量少，只需1μL血清样品即可完成多种标志物的检测；操作简单，且诊断成本低。

Description

一种检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒
技术领域
本发明涉及一种体外检测试剂盒，尤其涉及一种检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒及其制备方法、以及一种无创检测肝纤维化相关标志物的方法。
背景技术
肝纤维化(Liver Fibrosis)是各种慢性肝病的共同病理基础，也是肝脏损伤的最终共同路径。各种病毒、免疫和毒物及代谢损伤等不同病因引起的慢性肝脏疾病，如果得不到及时的诊断和治疗，可逐渐发展成为肝纤维化、直至最终发展成肝硬化、门脉高压、肝癌和肝衰竭。现在认为肝纤维化是一个有潜在治愈可能的动态过程，因此早期诊断肝纤维化显得尤为重要。
目前国内外报道的诊断肝纤维化的方法较多，主要以病理组织学检查、影像学检查及血清学指标检测为主，其中肝穿刺活检一直被视为肝纤维化诊断的金标准（肝穿刺活体组织病理检查102例分析，郑建铭、施光峰等，内科理论与实践，2009年第4卷第2期），但因其为创伤性检查及国内各地临床水平的限制，再加上存在取样误差，尤其是早期的肝纤维化取材更困难，所以作为常规诊断及病程随访的方法很不现实。因此，发展快速、灵敏度高、特异性好、可多次重复的无创性诊断新技术，特别是血清学的诊断技术，发展多指标、无创性液态芯片肝纤维化诊断新技术，能够为临床慢性肝病、肝纤维化诊治和疗效预后评估提供有力的工具。
数个血清肝纤维化因子的检测是临床肝病患者的一项重要的检查项目，既往多采用ELISA方法、放射性免疫法等手段。例如《酶联免疫法(ELISA)在检测肝纤维化指标中的应用》（黄龙等，现代临床医学生物工程学杂志，2005年04期）探讨酶联免疫法(ELISA)在检测血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CIV)、层粘蛋白(LN)中的应用，方法利用ELISA与放射免疫分析法(RIA)分别检测116例慢性肝炎组、215例正常组和36例肝硬化组的血清HA、PCⅢ、CIV、LN,比较二者的优缺点.结果两种方法结果无差异(p0.05).结论ELISA法准确、简便和安全，可代替RIA法。
虽然标志物分别检测、联合分析虽能在不同程度上反映肝脏纤维化的程度，但由于每种标志物都需要一种放射或酶联免疫试剂盒，因而这些多指标检测方法存在所需血清用量大、检测时间长、诊断费用高、操作复杂、联合分析困难等不足。因而利用已有科技进展，开发多指标无创伤检测肝纤维化的新技术，将具有较好的社会意义和经济推广价值。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供了一种检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒，可实现同时无创检测数个肝纤维化相关标志物，血清用量小、检测时间短、操作简单。
本发明的第一个方面是提供了一种检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒，所述液相蛋白芯片试剂盒包括偶联抗体的微球，所述偶联抗体的微球包括早期微球、活动期微球和后期微球；其中，
所述早期微球为偶联了反映早期肝纤维化的标志物的捕获抗体的荧光微球，选自偶联了Ⅲ型前胶原肽（PIIIP）捕获抗体的荧光微球、偶联了金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）捕获抗体的荧光微球中的一种或两种；
所述活动期微球为偶联了反映活动期肝纤维化的标志物的捕获抗体的荧光微球，选自偶联了Ⅳ型胶原肽（PIV）捕获抗体的荧光微球、偶联了纤维连接蛋白（FN）捕获抗体的荧光微球、偶联了转化生长因子-β1（TGF-β1）捕获抗体的荧光微球、偶联了血小板衍化生长因子（PDGF-BB）捕获抗体的荧光微球、偶联了肿瘤坏死因子α（TNF-α）捕获抗体的荧光微球、偶联了血管紧张素II（AngII）捕获抗体的荧光微球中的一种或多种；
所述后期微球为偶联了反映肝纤维化后期的标志物的捕获抗体的荧光微球，选自偶联了血清透明质酸（HA）捕获抗体的荧光微球、偶联了层粘蛋白（Laminin）捕获抗体的荧光微球中的一种或两种。
优选地，所述早期微球为偶联了金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）捕获抗体的荧光微球。
优选地，所述活动期荧光微球由偶联了转化生长因子-β1（TGF-β1）捕获抗体的荧光微球、偶联了Ⅳ型胶原肽（PIV）捕获抗体的荧光微球组成。
优选地，所述后期荧光微球为偶联了层粘蛋白（Laminin）捕获抗体的荧光微球。
其中，所述荧光微球为荧光色编码微球，每种荧光微球的荧光色均不相同。
优选地，所述荧光微球为羧基活化的乳胶颗粒。
其中，所述乳胶颗粒为医用塑料颗粒，例如聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）、聚乙烯（PE）、聚氯乙烯（PVC）、ABS、尼龙（PA）等。
优选地，所述液相蛋白芯片试剂盒还包括信号标记的检测抗体，每一种检测抗体分别抗一种肝纤维化的标志物且对应于微球上偶联的捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标记物的不同抗原表位。
其中，所述信号标记可以采用生物素标记或其他本领域常规的免疫标记方法如荧光素、酶、化学发光剂等，优选为采用生物素标记。
优选地，所述液相蛋白芯片试剂盒还包括标准品，所述标准品为微球上偶联的捕获抗体对应的标志物的标准品或健康人血清标本。
优选地，所述液相蛋白芯片试剂盒还包括质控品，所述质控品包含阳性对照品和阴性对照品。
本发明的第二个方面是提供一种无创检测肝纤维化相关标志物的方法，采用上述任意一种液相蛋白芯片试剂盒，包括以下步骤：
1）在实验板的相应孔中分别加入标准品的混合溶液、质控品和待测血清样品；
2）在实验板的孔中放入偶联抗体的微球的混合悬液；
3）孵育，使标志物与微球上偶联的捕获抗体发生免疫反应；
4）洗涤后，加入信号标记的检测抗体，孵育，使检测抗体与微球上捕获抗体捕获的标志物发生免疫反应；
5）洗涤后，检测分析得到检测结果；
其中，步骤1）和2）的顺序可交换。
优选地，步骤3）中，孵育条件具体为：4℃下孵育过夜，或者25-35℃下震摇孵育0.5-2h。
优选地，步骤4）中，孵育条件具体为：25-35℃下震摇实验板孵育15-45min。
优选地，还包括前处理步骤：将待测血样离心处理，收集上清液，得到待测血清样品。
本发明的第三个方面是提供一种上述液相蛋白芯片试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，取荧光微球，对微球表面的羧基进行活化以利于偶联；
步骤2，向步骤1处理得到的活化微球加入相应的捕获抗体的缓冲液，孵育；
步骤3，封闭步骤2处理后得到的微球表面的未结合位点，即得捕获抗体的荧光微球。
其中，步骤1中，活化羧基采用的活化剂可以为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）、N,M二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）中的一种或多种，优选地，活化羧基采用的活化剂为sulfo-NHS和EDC。
优选地，所述制备方法还包括前处理步骤：清洁荧光微球。
本发明提供的检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒，可联合检测多种反映肝纤维化不同阶段的肝纤维化相关标志物，检测时间由常规的几小时缩短到十几分钟；所需血清样品量少，只需1μL血清样品即可完成多种标志物的检测；操作简单，适合一般分子生物学检测人员使用，无需丰富的专业知识，实验结果由相应的分析仪器自动读取，排除了主观性错误；且诊断成本低。
附图说明
图1为本发明提供的液相蛋白芯片试剂盒联合检测TIMP-1标准曲线；
图2为本发明提供的液相蛋白芯片联合检测TGF-β1标准曲线；
图3为本发明提供的液相蛋白芯片联合检测collagen IV标准曲线；
图4为本发明提供的液相蛋白芯片联合检测Laminin标准曲线。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
一、检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒的制备
1、血清学标志物的筛选
肝纤维化形成牵涉到致病机体反应、反应细胞、细胞因子、细胞外间质(ECM)过量表达、胶原合酶活性增加以及降解酶活性下降等。本发明优选地采用下述的10种灵敏度高、特异性相对较好的血清学标志物：
反映早期肝纤维化的标志物：III型前胶原肽（PIIIP）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）；
反映活动期的标志物：IV型胶原肽(PIV)、纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子-β1（TGF-βl）、血小板衍化生长因子（PDGF-BB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、血管紧张素II（Ang II）；
反映肝纤维化后期的标志物：血清透明质酸(HA)、层粘蛋白（Laminin）。
可进行标志物的适当增减、以达到最佳的检测效果。早期标志物TIMP-1（IV期肝纤维化平均浓度：252±17μg/L）、中期标志物TGF-β1（IV期肝纤维化平均浓度：201.68±48.3μg/L）和PIV（IV期肝纤维化平均浓度：295.5±167.2μg/L）、后期标志物LN（IV期肝纤维化平均浓度：152±95μg/L）数量级别一致，故采取联合检测这四种标志物。
2、偶联抗体的微球的制备
取4种不同荧光色编码的商品化乳胶颗粒，针对不同的标志物TIMP-1、PIV、TGF-β1、Laminin，采用羧基活化技术修饰不同荧光色编码的乳胶颗粒，分别键合单一标志物的捕获抗体，流程如下：
洗涤微球→活化微球表面羧基→稳固微球表面羧基→加入偶联目标蛋白→4°孵育过夜交联→洗涤交联剂→稳定交联度→封闭非特异结合位点→加入贮存液。
具体为：
1）取4种不同荧光色编码的商品化乳胶颗粒（微球），TIMP-1、TGF-β1、PIV和LN的捕获抗体各对应一种乳胶颗粒；每种乳胶颗粒经超声雾化和旋涡震荡充分重悬后，用活化缓冲液（0.1mol/L NaH2PO4溶液pH6.2）洗涤2次；
2）将1）处理后的微球置于1.5mL的Eppendorf管中，管中反应体系包括80μLNaH2PO4缓冲液、表面活化剂sulfo-NHS和EDC（均为50g/L，新鲜配制）各10μL，室温下孵育20min，进行微球表面的羧基活化，以利于偶联；
3）漂洗后的活化微球加入500μL偶联缓冲液（0.05mol/L MES，pH5.0，其中含125μg相应捕获抗体），4℃下孵育过夜；
4）洗涤后，用200μL封闭/保存缓冲液PBS-TBN（含浓度0.1%BSA、0.02%Tween-20、0.05%NaN3的PBS缓冲液，pH为7.4）封闭微球表面的未结合位点，即得偶联抗体的微球。加入分析缓冲液（0.1%BSA，0.01mol/L叠氮钠，0.01mol/L PBS，pH为7.4）稀释，在血球计数仪下计算微球浓度，并调整微球浓度为1000个/μL，4℃避光保存备用。
3、生物素标记检测抗体
1）检测抗体的生物素标记
配制0.1mol/L磷酸钠缓冲液。
将TIMP-1、TGF-β1、PIV和LN的检测抗体分别以0.1mol/L磷酸钠缓冲液配制成10mg/ml的检测抗体溶液。
用少量DMSO溶解BAC-SulfoNHS，加入0.1mol/L磷酸钠缓冲液至BAC-SulfoNHS的终浓度为10mg/mL。
将每一种检测抗体溶液分别与BAC－SulfoNHS溶液按摩尔比5:1-20:1（例如10:1）的比例混合。
将混合液在室温（25-35℃）下轻轻搅拌30min或者2-8℃下2hrs。
2）已标记检测抗体的纯化
以0.01M PBS平衡Sephadex G25凝胶过滤柱。
将反应混合液加入柱顶端，收集流穿组分（fraction1）。
以9ml PBS洗脱，以1ml为单位，分部收集组分。
合并含有蛋白的分部收集组分，得到生物素标记的检测抗体。
将制备好的偶联抗体的微球和生物素标记的检测抗体各自包装，然后组装成检测试剂盒，备用。
二、液相蛋白芯片试剂盒的应用
在96反应板的每个孔中加入能选择性识别标志物TIMP-1、PIV、TGF-β1、或Laminin的相应捕获抗体修饰的四种不同荧光色编码乳胶颗粒的混合悬液；
在96反应板的的相应孔中加入四种标志物的标准混合溶液或健康人血清标本、质控品和待测血清样品，使相关标志物都分别与乳胶颗粒上固定的相应捕获抗体发生选择性免疫反应；
洗涤后加入同一种荧光标记的选择性识别不同标志物的四种生物素标记的检测抗体的混合溶液，使检测抗体与微球上捕获抗体捕获的标志物发生免疫反应；
洗涤后让反应液中的乳胶颗粒逐个通过两束激光。激光器1照射后所获得的数据（乳胶颗粒的荧光色编码）显示该乳胶颗粒所携带标志物的类型；激光器2照射后所获得的数据（第二抗体上荧光探针的发光强度）显示该乳胶颗粒所携带这种标志物的含量。每种标志物的含量各取大约50个乳胶颗粒在瞬间经激光照射、电脑处理后以数据信息的形式记录下来。
采用TGF-β1、TIMP-1标准品为USCNLIFE公司提供的标准品；采用Laminin，Collagen IV标准品为临床定量过的高浓度某位患者血清。该患者层粘蛋白：564.08ug/L，IV型胶原406ug/L，均为较高的数值，作为标准品使用。collagen IV，Laminin有同时临床血清ELISA检测结果。
全部待测血清标本为上海市同济医院2005年11月至2008年5月住院肝硬化患者59例，男41例，女18例；年龄40岁～75岁，平均年龄52岁。正常对照14例，为非肝病正常人，为健康志愿者。
检测结果如表1-6所示，得到的标准曲线如图1-4所示，其中表1、2、3和5的X15-X84对应的描述项为病人的住院号。
同时ELISA法检测collagen IV的浓度结果表明，异常值为3人，阳性率为5%。同时ELISA法检测Laminin的浓度结果表明：异常值为4人，阳性率为6%。
综检测结果得出：液态芯片检测的正常人TIMP-1浓度为5.54±1.77μg/L，高于正常值的肝硬化患者的TIMP-1阳性检出率为36%；液态芯片检测的正常人TGF-β1为1.38±0.61μg/L，高于正常值的肝硬化患者的TGF-β1阳性检出率为30%；液态芯片检测的正常人collagen IV浓度为1.99±0.94μg/L，高于正常值的肝硬化患者的collagen IV阳性检出率为51%；液态芯片检测的正常人Laminin浓度为23.41±10.16μg/L，高于正常值的肝硬化患者的collagen IV阳性检出率为30%。同时我院临床ELISA检测到的肝硬化患者的collagen IV、Laminin的检测阳性率分别为5%和6%，而液态芯片的collagen IV、Laminin的检测阳性率分别33%、15%，与ELISA比较采用SPSS10.5中的t检验结果表明P<0.01，表明两种检测方法比较液态芯片技术检测效率提高明显。
我们还对TIMP-1和TGF-β1的数值进行ELISA试剂盒验证，实验步骤按照试剂盒提供的步骤进行，绘制标准曲线，但由于标本超过了该ELISA试剂盒检测的线性范围，所以未能得出相关浓度。这从另一方面说明液态芯片技术能更加灵敏的检测到肝纤维化指标。
表1  联合检测肝硬化TIMP-1的浓度
分析物 类型 孔位 描述 荧光强度 浓度(μg/L)
TIMP-1 eS1 A7,A8,A9 标准品 15548 4.99
TIMP-1 eS2 B7，B9 标准品 12431 2.51
TIMP-1 eS3 C7，C8，C9 标准品 7808.5 1.24
TIMP-1 eS4 D7，D8，D9 标准品 4549.7 0.63
TIMP-1 eS5 E8，E9 标准品 2586 0.31
TIMP-1 eS6 F7，F8，F9 标准品 118 0
TIMP-1 X1 A1 对照 2942 3.66
TIMP-1 X2 B1 对照 2567 3.09
TIMP-1 X3 C1 对照 5096 7.25
TIMP-1 X4 D1 对照 5210.5 7.45
TIMP-1 X5 E1 对照 7195 11.19
TIMP-1 X6 F1 对照 4528 6.26
TIMP-1 X7 G1 对照 3354.5 4.31
TIMP-1 X8 H1 对照 3996 5.36
TIMP-1 X9 A2 对照 3968.5 5.31
TIMP-1 X10 B2 对照 1922 2.14
TIMP-1 X11 C2 对照 4847.5 6.81
TIMP-1 X12 D2 对照 4291 5.85
TIMP-1 X13 E2 对照 5122.5 7.29
TIMP-1 X14 F2 对照 5110.5 7.27
TIMP-1 X15 G2 189431 4037.5 5.43
TIMP-1 X16 H2 13598 9927.5 17.31
TIMP-1 X19 C3 118998 5841.5 8.59
TIMP-1 X20 D3 213446 3328.5 4.27
TIMP-1 X21 E3 213769 2768 3.39
TIMP-1 X22 F3 197639 5289 7.59
TIMP-1 X23 G3 127640 6062 9
TIMP-1 X24 H3 212391 4514 6.23
TIMP-1 X25 A4 212513 3759 4.97
TIMP-1 X26 B4 145044 6523.5 9.88
TIMP-1 X27 C4 213178 4779 6.69
TIMP-1 X28 D4 212720 6320 9.49
TIMP-1 X29 E4 167267 4399 6.04
TIMP-1 X30 F4 197148 4559 6.31
TIMP-1 X31 G4 212753 6539 9.91
TIMP-1 X32 H4 185091 6246 9.35
TIMP-l X33 A5 17487l 5120 7.29
TIMP-1 X34 B5 212966 3224 4.1
TIMP-1 X35 C5 179262 6008 8.9
TIMP-1 X36 D5 213193 2671.5 3.24
TIMP-1 X39 G5 140482 7605 12.03
TIMP-1 X40 H5 1772125 5321 7.65
TIMP-1 X41 A6 213193 7010 10.82
TIMP-1 X42 B6 187501 4618 6.41
TIMP-1 X43 C6 180902 4660 6.48
TIMP-1 X44 D6 212358 6123.5 9.12
TIMP-1 X46 F6 172994 3759 4.97
TIMP-1 X47 G6 I02585 2364 2.78
TIMP-1 X49 A7 184922 2591.5 3.12
TIMP-1 X50 B7 100447 3935.5 5.26
TIMP-l X51 C7 178846 6772.5 10.36
TIMP-1 X52 D7 201345 10979 20.18
TIMP-l X53 E7 135754 2324 2.72
TIMP-1 X54 F7 136506 3110.5 3.92
TIMP-1 X55 G7 207017 1985 2.23
TIMP-1 X57 A8 197639 3060.5 3.85
TIMP-1 X59 C8 153254 6218 9.29
TIMP-1 X60 D8 132533 9007.5 15.08
TIMP-l X61 E8 207876 1769 1.93
TIMP-1 X63 G8 19638O 4757 6.65
TIMP-1 X64 H8 184699 3141.5 3.97
TIMP-l X65 A9 206617 2379 2.8
TIMP-l H66 B9 104284 3589 4.69
TIMP-l X67 C9 201517 6974 10.75
TIMP-1 X68 D9 196065 3876.5 5.16
TIMP-l X69 E9 181395 2305.5 2.7
TIMP-l X70 F9 207729 4022 5.4
TIMP-l X71 G9 208570 4424 6.08
TIMP-1 X72 H9 206617 3541.5 4.61
TIMP-1 X75 C10 206168 1587.5 1.68
TIMP-l X76 D10 196516 4534 6.27
TIMP-1 X77 E10 201143 5159 7.36
TIMP-1 X78 F10 205603 3732 4.92
TIMP-1 X79 G10 201517 8280 13.45
TIMP-1 X80 H10 186600 5026.5 7.12
TIMP-1 X81 A11 132050 4344 5.94
TIMP-1 X82 B11 196065 4522 6.25
TIMP-l X83 C11 191409 3727.5 4.31
TIMP-l X84 D11 166808 5979 8.85
表2  联合检测肝硬化TGF-β1的浓度
分析物 类型 孔位 描述 荧光强度 浓度(μg/L)
TGF-betal eS1 A7，A8，A9 标准品 23686 4.74
TGF-beta1 eS2 B7,B9 标准品 20300 2.36
TGF-beta1 eS3 C7，C8，C9 标准品 12959 1.09
TGF-beta1 eS4 D7，D8，D9 标准品 9766.2 0.68
TGF-beta1 eS5 E8，E9 标准品 5366.5 0.31
TGF-beta1 eS6 F7，F8，F9 标准品 405.8 0
TGF-beta1 X1 A1 对照 1393 0.8
TGF-beta1 X2 B1 对照 924 0.53
TGF-beta1 X3 C1 对照 1535 0.88
TGF-beta1 X4 D1 对照 1799 1.02
TGF-beta1 X5 E1 对照 2411 1.34
TGF-beta1 X6 F1 对照 3956.5 2.2
TGF-beta1 X7 G1 对照 4780.5 2.7
TGF-beta1 X8 H1 对照 3019 1.67
TGF-beta1 X9 A2 对照 3247 1.79
TGF-beta1 X10 B2 对照 3091 1.71
TGF-beta1 X11 C2 对照 2867 1.58
TGF-beta1 X12 D2 对照 1092 0.63
TGF-beta1 X13 E2 对照 2057 1.15
TGF-beta1 X14 F2 对照 2450 1.36
TGF-beta1 X15 G2 18943 1530 0.87
TGF-beta1 x16 H2 135982 981 0.57
TGF-beta1 X19 C3 118998 1233 0.71
TGF-beta1 X20 D3 213446 1035.5 0.6
TGF-beta1 X21 E3 213769 141
TGF-beta1 X22 F3 197639 1873 1.06
TGF-beta1 X23 G3 127640 873 0.5
TGF-beta1 X24 H3 212391 515.5 0.24
TGF-beta1 X25 A4 212513 441 0.14
TGF-beta1 X26 B4 145044 2303 1.28
TGF-beta1 X27 C4 213178 2176 1.22
TGF-beta1 X28 D4 212720 1538.5 0.88
TGF-beta1 X29 E4 167267 965 0.56
TGF-beta1 X30 F4 197148 686 0.38
TGF-beta1 X31 G4 212753 515 0.24
TGF-beta1 H32 H4 185091 1125.5 0.65
TGF-beta1 X33 A5 174871 346.5
TGF-beta1 X34 B5 212966 843 0.48
TGF-beta1 X35 C5 179262 1474 0.84
TGF-betal X36 D5 213193 328.5
TGF-beta1 X40 H5 1772125 414 0.08
TGF-beta1 X41 A6 213193 798 0.45
TGF-beta1 X43 C6 180902 544.5 0.26
TGF-beta1 X44 D6 212358 456.5 0.17
TGF-beta1 X46 F6 172994 1274 0.73
TGF-beta1 X47 G6 102585 1675 0.95
TGF-beta1 X48 H6 140482 1116 0.65
TGF-beta1 X49 A7 184922 471 0.19
TGF-beta1 X50 B7 100447 1006 0.58
TGF-betal X51 C7 178846 892 0.51
TGF-beta1 x52 D7 201345 2787.5 1.54
TGF-beta1 X53 E7 135754 971 0.56
TGF-beta1 X54 F7 136506 2448 1.36
TGF-beta1 H55 G7 207017 560 0.28
TGF-beta1 X57 A8 197639 1209 0.7
TGF-beta1 X59 C8 153254 973 0.56
TGF-beta1 X60 D8 132533 4375 2.45
TGF-beta1 X61 E8 207876 1691 0.96
TGF-beta1 X62 F8 187501 534 0.25
TGF-beta1 X63 G8 196380 963.5 0.56
TGF-beta1 X64 H8 184699 1761 1
TGF-beta1 X65 A9 206617 400
TGF-beta1 X66 B9 104284 738 0.41
TGF-beta1 X67 C9 201517 902 0.52
TGF-beta1 X68 D9 196065 563.5 0.28
TGF-beta1 X69 E9 181395 306
TGF-beta1 X70 F9 2O7729 1722 0.98
TGF-beta1 X71 G9 208570 352
TGF-beta1 X72 H9 206617 1129.5 0.65
TGF-beta1 X74 B10 209098 1122 0.65
TGF-beta1 Y75 C10 206168 1092.5 0.63
TGF-beta1 X76 D10 196516 611 0.35
TGF-beta1 X77 E10 201143 1624.5 0.92
TGF-beta1 Y79 G10 201517 1794 1.01
TGF-beta1 X80 H10 186600 5404 3.1
TGF-beta1 X81 A1l 132050 469.5 0.18
TGF-beta1 X82 B11 196065 2024 1.14
TGF-beta1 X83 C11 191409 616 0.33
TGF-beta1 X84 D11 166808 2060.5 1.15
表3  联合检测肝硬化collagen IV的浓度
分析物 类型 孔位 描述 荧光强度 浓度(μg/L)
C0llagen IV eS1 A12 标准品 57.5
C0llagen IV eS2 D12 标准品 ---
Collagen IV eS3 E12 标准品 863 11.1
Col1agen IV eS4 F12 标准品 1103 18.55
Collagen It「 eS5 G12 标准品 1585 39.22
Collagen IV eS6 H12 标准品 2323 85.3
Collagen IV X1 A1 对照 26
Collagen IV X2 B1 对照 90 0.2
Collagen IV X3 C1 对照 170 2.29
Collagen IV X4 Dl 对照 146 1.42
Col1agen IV X5 E1 对照 77 0.07
Collagen IV X6 F1 对照 214 4.39
Collagen IV X7 G1 对照 235.5 5.65
Col1agen IV X8 H1 对照 134.5 1.08
Collagen IV X9 A2 对照 137 1.15
Collagen IV X10 B2 对照 210.5 4.19
Col1agen IV X11 C2 对照 184.5 2.91
Col1agen IV X12 D2 对照 93 0.23
Collagen IV X13 E2 对照 101 0.35
Col1agen IV X15 G2 189431 184.5 2.91
Col1agen IV X16 H2 135982 535 39.59
Collagen IV H18 B3 140482 162 1.98
Collagen IV X19 C3 118998 61 0
Collagen IV X20 D3 213446 398 20.32
Col1agen IV X21 E3 213769 76 0.06
Col1agen IV X22 F3 197639 252 6.73
Col1agen IV X23 G3 127640 142.5 1.32
Collagen IV X24 H3 212391 185.5 2.95
Collagen IV X25 A4 212513 132.5 1.03
Co11agen IV X26 B4 145044 133.5 1.05
Collagen IV X27 C4 213178 110.5 0.52
Collagen IV X28 D4 212720 133 1.04
Collagen IV X29 E4 167267 108 0.47
Collagen IV X30 F4 197148 74 0.05
Co11agen IV X31 G4 212753 133 1.04
Collagen IV X32 H4 185091 289.5 9.53
Co11agen IV X33 A5 174871 94 0.25
Collagen IV X34 R5 212966 117 0.65
Col1agen IV X35 C5 179262 66.5 0.02
Collagen IV X36 D5 213193 88 0.17
Collagen IV X40 H5 1772125 32.5
Collagen IV X41 A6 213193 99 0.32
Col1agen IV X42 B6 187501 109 0.49
Co11agen IV X43 C6 180902 102.5 0.38
Collagen IV X44 D6 212358 244 6.2
Collagen IV X45 E6 196350 258.5 7.19
Collagen IV X46 F6 172994 440.5 25.63
Collagen IV X47 G6 102585 242 6.07
Collagen IV X48 H6 140482 482 31.39
Co11agen IV X49 A7 184922 171.5 2.35
Collagen IV X50 B7 100447 94.5 0.25
Collagen IV X51 C7 178846 207.5 4.03
Co11agen IV X52 D7 201345 313.5 11.58
Collagen IV X53 E7 135754 142 1.3
Collagen IV X54 F7 136506 282.5 8.98
Collagen IV X55 G7 207017 184.5 2.91
Col1agen IV X56 H7 153254 232.5 5.47
Collagen IV X57 A8 197639 253.5 6.84
Collagen IV X58 B8 132050 211 4.22
Collagen IV X59 C8 153254 120.5 0.73
Collagen IV X60 D8 132533 1503 351.79
Collagen IV X61 E8 207876 565.5 44.73
Collagen IV X62 F8 187501 195 3.4
Col1agen IV X64 H8 184699 282 8.94
Collagen IV X66 B9 104284 342.5 14.31
Collagen IV X69 E9 181395 104 0.4
Collagen IV X70 F9 207729 276 8.47
Collagen IV X71 G9 208571 214.5 4.41
Collagen IV X72 H9 206617 275 8.4
Collagen IV X74 b10 200890 204 3.85
Col1agen IV X76 D10 196516 194 3.35
Collagen IV X77 E10 201143 192.5 3.28
Col1agEn IV X78 F10 205603 186 2.97
Collagen IV X79 G10 201517 127 0.88
Collagen IV X80 H10 186600 515.5 36.46
Collagen IV X81 A11 132050 126 0.86
Collagen IV X82 B11 196065 116.5 0.64
Col1agen IV X83 C11 191409 103 0.38
Collagen IV X84 D11 166808 214 4.39
表4  同时ELISA法检测collagen IV的浓度
住院号 检测项目 数值 正常值
189431 IV型胶原 12.7 ＜30ng/ml
135982 IV型胶原 1.7 ＜30ng/ml
118998 IV型胶原 18.8 ＜30ng/ml
213446 IV型胶原 23.7 ＜30ng/ml
213769 IV型胶原 18.7 ＜30ng/ml
197639 IV型胶原 23.5 ＜30ng/ml
127640 IV型胶原 23.2 ＜30ng/ml
212391 IV型胶原 27.9 ＜30ng/ml
212513 IV型胶原 20.4 ＜30ngg/l
145044 IV型胶原 93 ＜30ng/ml
213178 IV型胶原 28.7 ＜30ng/ml
212720 IV型胶原 17 ＜30ng/ml
167267 IV型胶原 10.5 ＜30ng/ml
197148 IV型胶原 17.7 ＜30ng/ml
212753 IV型胶原 1.8 ＜30ng/ml
185091 IV型胶原 12.8 ＜30ng/ml
174871 IV型胶原 19 ＜30ng/ml
212966 IV型胶原 22.4 ＜30ng/ml
179262 IV型胶原 14.7 ＜30ng/ml
213193 IV型胶原 14.7 ＜30ng/ml
140482 IV型胶原 11.4 ＜30ng/ml
1772125 IV型胶原 82.6 ＜30ng/ml
213193 IV型胶原 62.6 ＜30ng/ml
187501 IV型胶原 23.2 可30ng/ml
180902 IV型胶原 18.7 ＜30ng/ml
212358 IV型胶原 14.7 ＜30ng/ml
172994 IV型胶原 10.5 ＜30ng/ml
102585 IV型胶原 19.5 ＜30ng/ml
184922 IV型胶原 5.7 ＜30ng/ml
100447 IV型胶原 19.3 ＜30ng/ml
178846 IV型胶原 10 ＜30ng/ml
201345 IV型胶原 22.9 ＜30ng/ml
135754 IV型胶原 21.6 ＜30ng/ml
136506 IV型胶原 14.3 ＜30ng/ml
207017 IV型胶原 22.4 ＜30ng/ml
167639 IV型胶原 3.8 ＜30ng/ml
153254 IV型胶原 0.9 ＜30ng/ml
132533 IV型胶原 9.4 ＜30ng/ml
207876 IV型胶原 0.9 ＜30ng/ml
196380 IV型胶原 2.2 ＜30ng/ml
184699 IV型胶原 0.9 ＜30ng/ml
206617 IV型胶原 5.2 ＜30ng/ml
104284 IV型胶原 22.1 ＜30ng/ml
201517 IV型胶原 10.1 ＜30ng/ml
196065 IV型胶原 53.5 ＜30ng/ml
181395 IV型胶原 0.7 ＜30ng/ml
207729 IV型胶原 4.6 ＜30ng/ml
208570 IV型胶原 4.8 ＜30ng/ml
206617 IV型胶原 5.2 ＜30ng/ml
206168 IV型胶原 22.1 ＜30ng/ml
196516 IV型胶原 10.1 ＜30ng/m1
201143 IV型胶原 26.3 ＜30ng/ml
205603 IV型胶原 l7.8 ＜30ng/ml
201517 IV型胶原 7.1 ＜30ng/ml
186600 IV型胶原 10.6 ＜30ng/ml
132050 IV型胶原 7.2 ＜30ng/ml
196065 IV型胶原 7.2 ＜30ng/ml
191419 IV型胶原 7.8 ＜30ng/ml
166808 IV型胶原 21.5 ＜30ng/ml
表5  联合检测肝硬化Laminin的浓度
分析物 类型 孔位 描述 荧光强度 浓度(μg/L)
Laminin eS1 G7 标准品 2312 127.62
Laminin eS2 G8 标准品 1600 55.04
Laminin eS3 G9 标准品 920.5 24.73
Laminin eS4 H7 标准品 ---
Laminin eS5 H8 标准品 727 18.68
Laminin eS6 F7，F8，F9 标准品 116.2 3.04
Laminin X1 Al 对照 20 *6.23
Laminin X2 B1 对照 169 42.95
Laminin X3 C1 对照 102 *26.95
Laminin X4 Dl 对照 50 *14.13
Laminin X5 El 对照 55 *15.40
Laminin X6 F1 对照 117 30.56
Laminin X7 G1 对照 163.5 41.64
Laminin X8 H1 对照 112 *29.36
Laminin X9 A2 对照 154 39.39
Laminin X10 B2 对照 137 35.34
Laminin X11 C2 对照 112 *29.36
Laminin X12 D2 对照 54.5 *15.27
Laminin X13 E2 对照 62 *17.l5
Laminin X15 G2 189431 296 73.23
Laminin X16 H2 135982 170.5 43.3
Laminin X17 A3 212966 70 *19.14
Laminin X19 C3 118998 100.5 *26.59
Laminin X20 D3 213446 362.5 89.41
Laminin X21 E3 213769 54 *15.15
Laminin X22 F3 197639 240.5 59.93
Laminin X23 G3 127640 105 *27.67
Laminin X24 H3 212391 72 *19.64
Lmainin X25 A4 212513 62.5 *17.28
Laminin X26 B4 145044 88 *23.56
Laminin x27 C4 213178 151.5 38.79
Laminin X28 D4 212720 155 39.62
Laminin X29 E4 167267 70.5 *19.27
Laminin X30 F4 197148 95.5 *25.38
Laminin X31 G4 212753 158.5 40.45
Laminin X32 H4 185091 87.5 *23.43
Laminin X33 A5 174871 126 32.71
Laminin X35 C5 179262 50 *14.13
Laminin X36 D5 213193 57.5 *16.03
Laminin X40 H5 1772125 35 *10.27
Laminin X41 A6 213193 58 *16.15
Laminin X42 B6 187501 69 *18.89
Laminin X43 C6 180902 82 *22.09
Laminin X44 D6 212358 139.5 35.94
Laminin X45 E6 196350 264.5 65.66
Laminin X46 F6 172994 1294 391.18
Laminin X47 G6 102585 247 61.48
Laminin X48 H6 140482 246.5 61.36
Laminin X49 A7 184922 509 126.5
Laminin X50 B7 100447 44 *12.60
Laminin X51 C7 178846 107.5 *28.28
Laminin X52 D7 201345 143.5 36.89
Laminin X53 E7 135754 251 62.43
Laminin X54 F7 136506 150 38.43
Laminin X55 G7 207017 134 34.62
Laminin X57 A8 l97639 82.5 *22.21
Laminin X59 C8 153254 143 36.77
Laminin X60 D8 132533 991.5 271.53
Laminin X61 E8 2O7876 273.5 67.82
Laminin X62 F8 187501 220 55.05
Laminin X63 G8 196380 144 37.01
Laminin X64 H8 484699 350.5 86.47
Laminin X65 A9 206617 50 *14.13
Laminin X66 B9 104284 225.5 56.36
Laminin X67 C9 201517 73 *19.88
Laminin X68 D9 196065 69 *18.89
Laminin X63 E9 181395 135.5 34.98
Laminin X70 F9 2O7729 189.5 47.81
Laminin X71 G9 208570 61 *16.90
Laminin X72 H9 206617 143.5 36.89
Laminin X74 B1O 200898 140 36.05
Laminin X76 D10 196516 95.5 *25.38
Laminin X77 E10 201143 96 *25.50
Laminin X79 G10 201517 109 *28.64
Laminin X80 H10 186600 174 44.13
Laminin X81 A11 132050 676 172.03
Laminin X82 B11 196065 91 *24.29
Laminin X83 C11 191409 141.5 36.41
Laminin X84 D11 166808 l57.5 40.22
表6  同时 ELISA法检测Laminin的浓度
住院号 检测顶目 数值 正常值
189431 LN 150.57 ＜150ug/L
135982 LN 87.89 ＜15Oug/L
118998 LN 76.79 ＜150ug/L
213445 LN 31.52 ＜150ug/L
213769 LN 83.29 ＜150ug/L
197639 LN 38.43 ＜150ug/L
127640 LN 96.65 ＜150ug/L
212391 LN 103.59 ＜150ug/L
212513 LN 102.74 ＜150ug/L
145044 LN 57.02 ＜150ug/L
213178 LN 35 ＜150ug/L
212720 LN 149.57 ＜150ug/L
167267 LN 145 ＜150ug/L
197148 LN 146.79 ＜150ug/L
212753 LN 183.8 (150ug/L
185091 LN 82.22 ＜150ug/L
174871 LN 28 ＜150ug/L
212966 LN 564.08 ＜150ug/L
179262 LN 121.83 ＜150ug/L
213196 LN 149.05 ＜150ug/L
140482 LN 478.5 ＜150ug/L
177212.5 LN 145.38 ＜150ug/L
213193 LN 55.54 ＜150ug/L
187501 LN 136.6 ＜150ug/L
18O902 LN 181.61 ＜150ug/L
212358 LN 215.6 ＜150ug/L
l72994 LN 139.44 ＜150ug/L
102585 LN 113.44 ＜150ug/L
184922 LN 74.09 ＜150ug/L
100447 LN 34.O5 ＜150ug/L
178846 LN 88.52 ＜150ug/L
201345 LN 143 ＜150ug/L
135754 LN 89.75 ＜150ug/L
136506 LN 87.85 ＜150ug/L
207017 LN 58.15 ＜150ug/L
197639 LN 85.14 ＜150ugL
153254 LN 160.52 ＜150ug/L
132533 LN 92.99 ＜150ug/L
207876 LN 89.84 ＜150ug/L
196380 LN 64.21 ＜150ug/L
184699 LM 18.6 ＜150ug/L
206617 LN 38.04 ＜150ug/L
104284 LN 66.61 ＜150ug/L
201517 LN 55.37 ＜150ug/L
196065 LN 115.13 ＜150ug/L
181395 LN 47.66 ＜150ug/L
207729 LN 90.66 ＜150ug/L
20857O LN 40.08 ＜150ug/L
206617 LN 62.63 ＜150ug/L
206168 LN 57.17 ＜150ug/L
196516 LN 50.58 ＜150ug/L
201143 LN 101.79 ＜150ug/L
205603 LN 148.68 ＜150ug/L
2015l7 LN 2.13 ＜150ug/L
186600 LN 141.89 ＜150ug/L
132050 LN 83.19 ＜150ug/L
196065 LN 25.99 ＜150ug/L
191409 LN 191.76 ＜l50ug/L
166809 LN 71.87 ＜150ug/L
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种检测肝纤维化程度的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，包括偶联抗体的微球，所述偶联抗体的微球包括早期微球、活动期微球和后期微球；其中，
所述早期微球为偶联了反映早期肝纤维化的标志物的捕获抗体的荧光微球，选自偶联了Ⅲ型前胶原肽捕获抗体的荧光微球、偶联了金属蛋白酶组织抑制因子-1捕获抗体的荧光微球中的一种或两种；
所述活动期微球为偶联了反映活动期肝纤维化的标志物的捕获抗体的荧光微球，选自偶联了Ⅳ型胶原肽捕获抗体的荧光微球、偶联了纤维连接蛋白捕获抗体的荧光微球、偶联了转化生长因子-β1捕获抗体的荧光微球、偶联了血小板衍化生长因子捕获抗体的荧光微球、偶联了肿瘤坏死因子α捕获抗体的荧光微球、偶联了血管紧张素II捕获抗体的荧光微球中的一种或多种；
所述后期微球为偶联了反映肝纤维化后期的标志物的捕获抗体的荧光微球，选自偶联了血清透明质酸捕获抗体的荧光微球、偶联了层粘蛋白捕获抗体的荧光微球中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述早期微球为偶联了金属蛋白酶组织抑制因子-1捕获抗体的荧光微球；所述活动期荧光微球由偶联了转化生长因子-β1捕获抗体的荧光微球、偶联了Ⅳ型胶原肽捕获抗体的荧光微球组成；所述后期荧光微球为偶联了层粘蛋白捕获抗体的荧光微球。
3.根据权利要求1或2所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为荧光色编码微球，每种荧光微球的荧光色均不相同。
4.根据权利要求1所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为羧基活化的乳胶颗粒。
5.根据权利要求1所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，还包括信号标记的检测抗体，每一种检测抗体分别抗一种肝纤维化的标志物且对应于微球上偶联的捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标记物的不同抗原表位。
6.根据权利要求5所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述信号标记的检测抗体为生物素标记的检测抗体。
7.根据权利要求5或6所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，还包括标准品和质控品，所述标准品为微球上偶联的捕获抗体对应的标志物的标准品或健康人血清标本；所述质控品包含阳性对照品和阴性对照品。
8.一种无创检测肝纤维化相关标志物的方法，其特征在于，采用权利要求1-7中任意一项所述的液相蛋白芯片试剂盒，包括以下步骤：
1）在实验板的相应孔中分别加入标准品、质控品和待测血清样品；
2）在实验板的相应孔中放入偶联抗体的微球的混合悬液；
3）孵育，使标志物与微球上偶联的捕获抗体发生免疫反应；
4）洗涤后，加入信号标记的检测抗体，孵育，使检测抗体与微球上捕获抗体捕获的标志物发生免疫反应；
5）洗涤后，检测分析得到检测结果；
其中，步骤1）和2）的顺序可交换。
9.一种权利要求1所述液相蛋白芯片试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，取荧光微球，对微球表面的羧基进行活化以利于偶联；
步骤2，向步骤1处理得到的活化微球加入相应的捕获抗体的缓冲液，孵育；
步骤3，封闭步骤2处理后得到的微球表面的未结合位点，即得捕获抗体的荧光微球。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括前处理步骤：清洁荧光微球。
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